JP6745351B2 - 凝集型−形成ポリペプチドの凝集型を検出する方法 - Google Patents

Description

本特許出願は２０１６年３年１６日に大韓民国特許庁に提出された大韓民国特許出願第１０−２０１６−００３１５３４号に対して優先権を主張し、前記特許出願の開示事項は本明細書に参照として挿入される。

本発明は、生試料（ｂｉｏｓａｍｐｌｅ）の凝集型−形成ポリペプチドの凝集型を検出する方法またはキットに関するものである。

まず、タンパク質を構成するポリペプチドはマルチマーを形成して機能的なタンパク質をなす場合もあるが、正常な状態ではモノマーとして存在してから、正常でない状態（例えば、ミスフォールディング型に転換）になればマルチマーを形成して凝集されて疾病を誘発する場合が多い（非特許文献１〜２）。

例えば、タンパク質の正常でない凝集、またはミスフォールディングと関連した疾患または疾病はアルツハイマー疾患、クロイツフェルト−ヤコブ病、スポンジフォーム脳疾患（Ｓｐｏｎｇｉｆｏｒｍ ｅｎｃｅｐｈａｌｏｐａｔｈｉｅｓ）、パーキンソン疾患、ハンチントン疾患、筋萎縮性側索硬化症（Ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ ｌａｔｅｒａｌ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）、セルピン欠乏症（Ｓｅｒｐｉｎｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ）、肺気腫（ｅｍｐｈｙｓｅｍａ）、硬変症（ｃｉｒｒｈｏｓｉｓ）、第ＩＩ型糖尿病、一次全身性アミロイド症、二次全身性アミロイド症、前頭側頭葉性痴呆（Ｆｒｏｎｔｏ−ｔｅｍｐｏｒａｌ ｄｅｍｅｎｔｉａｓ）、老人全身性アミロイド症、家族性アミロイド多発神経病（ｆａｍｉｌｉａｌ ａｍｙｌｏｉｄ ｐｏｌｙｎｅｕｒｏｐａｔｈｙ）、遺伝性大脳アミロイド脈管病（ｈｅｒｅｄｉｔａｒｙ ｃｅｒｅｂｒａｌ ａｍｙｌｏｉｄ ａｎｇｉｏｐａｔｈｙ）、及び血透析−関連アミロイド症を含む。

このような疾患または疾病の有無または進行程度を測定するに当たって、抗原の量が試料の中に非常に少ないか、または抗原の大きさが非常に小さくて測定が困難であるか、または体の中の抗原の量と試料の中の抗原の量が比例しない場合に、例えば、アルツハイマー疾患に関与するＡβ（アミロイド−ベータ）も正常人に比べて非正常人でＡβオリゴマーレベルが高いと知られているが、血液試料内Ａβオリゴマー量の検出が難しいか、または血液試料内に非定型的にＡβオリゴマーが存在するとき、診断が難しいことがある。

また、測定しようとする抗原があまり小さいか、または量が少なくてサンドイッチＥＬＩＳＡを通じての疾患の診断が容易ではない場合がある。

ここに、本発明者らは患者と正常人との間の診断シグナルの差（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）を極大化した凝集型−形成ポリペプチドの凝集型検出方法の開発必要性を認識した。

Ｍａｓｓｉｍｏ Ｓｔｅｆａｎｉ， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｍｅｄ． ８１：６７８−６９９（２００３） Ｒａｄｆｏｒｄ ＳＥ， ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ． ９７：２９１−２９８（１９９９）

前記の背景下で、本発明者らは凝集型−形成ポリペプチドの凝集型を検出する新規方法を開発するために幅広い研究をしてきたものであり、その結果、ポリペプチドの凝集型形成を抑制する防御システム（ｃｌｅａｒｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ）の差を用いて患者と正常人との間の診断シグナルの差（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）を極大化した凝集型−形成ポリペプチドの凝集型検出方法を開発した。

したがって、本発明の目的は生試料（ｂｉｏｓａｍｐｌｅ）の凝集型−形成ポリペプチドの凝集型を検出する方法を提供することにある。

本発明の他の目的は、生試料（ｂｉｏｓａｍｐｌｅ）の凝集型−形成ポリペプチドの凝集型を検出するためのキットを提供することにある。

本発明の一態様によれば、本発明は次のステップを含む生試料（ｂｉｏｓａｍｐｌｅ）の凝集型−形成ポリペプチドの凝集型を検出する方法を提供する：（ａ）分析対象の生試料に前記凝集型−形成ポリペプチドのダイマー型をスパイキング（ｓｐｉｋｉｎｇ）するステップ；（ｂ）前記ステップ（ａ）の結果物をインキュベーションさせて前記凝集型−形成ポリペプチドの凝集型を追加的に形成させるステップ；（ｃ）前記ステップ（ｂ）の結果物に前記凝集型−形成ポリペプチドの凝集型に結合する結合剤にシグナル発生標識が結合された結合剤−標識を接触させるステップ；及び（ｄ）前記凝集型−形成ポリペプチドの凝集型に結合された結合剤−標識から発生するシグナルを検出するステップ、ここで、前記ステップ（ｂ）のインキュベーションは前記スパイキングした凝集型−形成ポリペプチドのダイマー型が前記生試料によりマルチマー化できる充分な時間の間実施する。

本発明は、ポリペプチドの凝集型形成を抑制する防御システム（ｃｌｅａｒｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ）の差を用いて患者と正常人との間の診断シグナルの差（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）を極大化した凝集型−形成ポリペプチドの凝集型検出方法に関するものである。

本明細書で、用語“凝集型−形成ポリペプチド”は、マルチマー型（オリゴマー型）が形成できるか、またはモノマーとの疎水性相互作用による凝集型が形成できるポリペプチドを意味する。特に、下記の構造的変化は多様な疾患を誘発する。例えば、アルツハイマー疾患、クロイツフェルト−ヤコブ病、スポンジフォーム脳疾患（Ｓｐｏｎｇｉｆｏｒｍ ｅｎｃｅｐｈａｌｏｐａｔｈｉｅｓ）、パーキンソン疾患、ハンチントン疾患、筋萎縮性側索硬化症（Ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ ｌａｔｅｒａｌ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）、セルピン欠乏症（Ｓｅｒｐｉｎ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ）、肺気腫（ｅｍｐｈｙｓｅｍａ）、硬変症（ｃｉｒｒｈｏｓｉｓ）、第ＩＩ型糖尿病、一次全身性アミロイド症、二次全身性アミロイド症、前頭側頭葉性痴呆（Ｆｒｏｎｔｏ−ｔｅｍｐｏｒａｌ ｄｅｍｅｎｔｉａｓ）、老人全身性アミロイド症、家族性アミロイド多発神経病（ｆａｍｉｌｉａｌ ａｍｙｌｏｉｄ ｐｏｌｙｎｅｕｒｏｐａｔｈｙ）、遺伝性大脳アミロイド脈管病（ｈｅｒｅｄｉｔａｒｙ ｃｅｒｅｂｒａｌ ａｍｙｌｏｉｄ ａｎｇｉｏｐａｔｈｙ）、及び血透析−関連アミロイド症を含む。

一般に、前記凝集型−形成ポリペプチドの非−凝集型は正常であり、凝集型は疾患、特にアルツハイマー疾患、クロイツフェルト−ヤコブ病、またはパーキンソン疾患のような神経退行性疾患を誘発する。

本発明の一具現例によれば、前記スパイキングした凝集型−形成ポリペプチドのダイマー型のマルチマー化をさせる前記生試料は、前記凝集型−形成ポリペプチドのマルチマー型が関与している疾患を有するヒトの生試料であり、より好ましくは前記生試料によりマルチマー化できる充分なインキュベーション時間は、凝集型−形成ポリペプチドのマルチマー型が関与している疾患を有するヒトの生試料を用いて発生したシグナルが正常のヒトの生試料を用いて発生したシグナルより１．３〜２０倍大きくすることに充分な時間である。

本発明の特徴及び利点を要約すると、次の通りである：
（ａ）本発明は生試料（ｂｉｏｓａｍｐｌｅ）の凝集型−形成ポリペプチドの凝集型を検出する方法またはキットを提供する。
（ｂ）本発明の方法は生試料の中に測定しようとする凝集型−形成ポリペプチドの凝集型（抗原）の量が非常に少ないか、または凝集型−形成ポリペプチドの凝集型（抗原）の大きさが非常に小さくて測定し難いか、または人体内凝集型−形成ポリペプチドの凝集型（抗原）の量と生試料の中の凝集型−形成ポリペプチドの凝集型（抗原）の量が比例しない場合に、ポリペプチドの凝集型形成を抑制する防御システム（ｃｌｅａｒｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ）の差を用いて患者と正常人との間の診断シグナルの差（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）を極大化した。
（ｃ）本発明は、便利で、迅速な方式により実施することができ、これは生試料（ｂｉｏｓａｍｐｌｅ）の凝集型−形成ポリペプチドの凝集型を検出する方法の自動化を可能にする。

本発明の実施例に従って、ｓ２６Ｃ−Ｂｅｔａ−アミロイド（Ａｍｙｌｏｉｄ）（１−４０）ダイマー（Ｄｉｍｅｒ）を処理した後、３日と４日の間インキュベーションされたサンプルでＭＤＳ（ｍｕｌｔｉｍｅｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ）（６Ｅ１０／ＦＦ５１ＨＲＰ ｓｅｔ）を用いたＡβオリゴマー（ｏｌｉｇｏｍｅｒ）検出結果を示す。 本発明の実施例に従って、ｓ２６Ｃ−Ｂｅｔａ−アミロイド（Ａｍｙｌｏｉｄ）（１−４０）ダイマー（Ｄｉｍｅｒ）を処理した後、３日と４日の間インキュベーションされたサンプルでＭＤＳ（ｍｕｌｔｉｍｅｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ）（６Ｅ１０／ＦＦ５１ＨＲＰ ｓｅｔ）を用いたＡβオリゴマー（ｏｌｉｇｏｍｅｒ）検出結果を示す。 本発明の実施例に従って、Ｓ２６Ｃ−Ｂｅｔａ−アミロイド（１−４０）ダイマーを処理した後、０日、１日、２日、３日、４日、５日の間インキュベーションされたサンプルでＭＤＳ（ｍｕｌｔｉｍｅｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ）（６Ｅ１０／ＦＦ５１ＨＲＰ ｓｅｔ）を用いたＡβオリゴマー（ｏｌｉｇｏｍｅｒ）検出結果を示す。 本発明の実施例に従って、Ｓ２６Ｃ−Ｂｅｔａ−アミロイド（１−４０）ダイマー ０．２５ｎｇを処理後、０日、５日インキュベーションしたサンプルと無処理した後、０日、５日の間インキュベーションされたサンプルでＭＤＳ（ｍｕｌｔｉｍｅｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ）（６Ｅ１０／ＦＦ５１ＨＲＰ ｓｅｔ）を用いたＡβオリゴマー（ｏｌｉｇｏｍｅｒ）検出結果を示す。 本発明の実施例に従って、Ｓ２６Ｃ−Ｂｅｔａ−アミロイド（１−４０）ダイマーを処理した後、１日と２日の間インキュベーションされたサンプルでＭＤＳ（ｍｕｌｔｉｍｅｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ）（６Ｅ１０／ＷＯ２ＨＲＰ ｓｅｔ）を用いたＡβオリゴマー（ｏｌｉｇｏｍｅｒ）検出結果を示す。 本発明の実施例に従って、Ｓ２６Ｃ−Ｂｅｔａ−アミロイド（１−４０）ダイマーを処理した後、１日と２日の間インキュベーションされたサンプルでＭＤＳ（ｍｕｌｔｉｍｅｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ）（６Ｅ１０／ＷＯ２ＨＲＰ ｓｅｔ）を用いたＡβオリゴマー（ｏｌｉｇｏｍｅｒ）検出結果を示す。 本発明の実施例に従って、Ｓ２６Ｃ−Ｂｅｔａ−アミロイド（１−４０）ダイマーを処理後、１日、２日、３日、４日の間インキュベーションされたサンプルでＭＤＳ（ｍｕｌｔｉｍｅｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ）（６Ｅ１０／ＷＯ２ＨＲＰ ｓｅｔ）を用いたＡβオリゴマー（ｏｌｉｇｏｍｅｒ）検出結果を示す。

以下、生試料（ｂｉｏｓａｍｐｌｅ）の凝集型−形成ポリペプチドの凝集型を検出するための本発明の方法をステップ別に詳細に説明すると、次の通りである：

（ａ）スパイキング（ｓｐｉｋｉｎｇ）するステップ
まず、本発明の方法は分析対象の生試料に前記凝集型−形成ポリペプチドのダイマー型をスパイキング（ｓｐｉｋｉｎｇ）するステップを含む。

本明細書で、用語“生試料（ｂｉｏｓａｍｐｌｅ）”は、分析しようとする有機体−由来試料を意味する。前記生試料は、生物原の細胞、組織、または生体液、または本発明に従って分析できる他のミディアム（ｍｅｄｉｕｍ）を意味し、これはヒトから採取した試料、動物から採取した試料、ヒトまたは動物のための食品から採取した試料を含む。好ましくは、分析対象の生試料は、血液、血清、血漿、リンパ液、牛乳、小便、大便、涙、唾液、精液、脳抽出物（例えば、脳均質液）、脊髄液（ＳＣＦ）、虫垂、腓腸、及び扁桃組織抽出物を含む体内流体試料である。より好ましくは、前記生試料は血液であり、最も好ましくは、血漿である。

本発明の他の具現例によれば、前記凝集型−形成ポリペプチドは、アルツハイマー疾患に関与するＡβペプチドとタウ（ｔａｕ）タンパク質、クロイツフェルト−ヤコブ病、及びスポンジフォーム脳疾患に関与するプリオン、パーキンソン疾患に関与するα−シヌクレイン、一次全身性アミロイド症に関与するＩｇ軽鎖、二次全身性アミロイド症に関与する血清アミロイドＡ、前頭側頭葉性痴呆に関与するタウタンパク質、老人全身性アミロイド症に関与するトランスサイレチン、家族性アミロイド多発神経病に関与するトランスサイレチン、遺伝性大脳アミロイド脈管病に関与するシスタチンＣ、血透析−関連アミロイド症に関与するβ２−マイクログロブリン、ハンチントン病に関与するハンチンチン、筋萎縮性側索硬化症に関与するスーパーオキシドディスムターゼ、セルピン欠乏症、肺気腫、及び硬変症に関与するセルピン、及び第ＩＩ型糖尿病に関与するアミリンを含む。より好ましくは、前記凝集型−形成ポリペプチドはアルツハイマー疾患に関与するＡβペプチドまたはタウタンパク質、またはパーキンソン疾患に関与するα−シヌクレインであり、最も好ましくはＡβペプチドである。

本明細書で、用語“スパイキング（ｓｐｉｋｉｎｇ）”は分析対象の生試料に凝集型−形成ポリペプチドのダイマー型を添加または添加後に混合する過程を意味する。

本明細書で、用語“マルチマー”にはオリゴマーも含まれる。

本明細書で、用語“ダイマー”は２つのモノマーが結合されて形成されるものである。

本発明によれば、分析対象の生試料に前記凝集型−形成ポリペプチドのダイマー型をスパイキング（ｓｐｉｋｉｎｇ）する場合は、凝集型−形成ポリペプチドの凝集型形成を抑制させる防御システム（ｃｌｅａｒｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ）の差を用いて患者と正常人との間の診断シグナルの差（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）を極大化するために、即ち患者の生試料は防御システム（ｃｌｅａｒｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ）の程度が低くて凝集型−形成ポリペプチドの凝集型形成が促進されることに反して、正常人の生試料では防御システム（ｃｌｅａｒｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ）の程度が高くて凝集型−形成ポリペプチドの凝集型形成が減少して診断シグナルの差（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）が極大化される。

本発明の更に他の具現例によれば、前記凝集型−形成ポリペプチドのダイマー型は前記凝集型−形成ポリペプチドのモノマー型である配列表の配列番号１のアミノ酸配列からなるＡβペプチド２つが、前記配列表の配列番号１のアミノ酸配列からなるＡβペプチドの２６番Ｃｙｓ残基によりジスルフィド結合されてなされる。

本発明の他の具現例によれば、前記ステップ（ａ）の結果物に緩衝液を追加的に添加する。より好ましくは、前記緩衝液は生試料に対して３〜１５倍（ｖ／ｖ）で添加され、さらに好ましくは５〜１３倍（ｖ／ｖ）で添加され、さらなる好ましくは７〜１１倍（ｖ／ｖ）で添加され、さらに好ましくは８〜１０倍（ｖ／ｖ）で添加される。

本発明に用いられる緩衝液は当業界に公知された多様な緩衝液を用いることができるが、好ましくは前記緩衝液は非イオン性界面活性剤−含有燐酸塩緩衝液である。

本発明に用いられる燐酸塩緩衝液に含まれる非イオン性界面活性剤は当業界に公知された多様な非イオン性界面活性剤を用いることができ、好ましくはアルコキシレイテッドアルキルエーテル、アルコキシレイテッドアルキルエステル、アルキルポリグリコシド、ポリグリセリルエステル、ポリソルベート類、及びシュガーエステルを含む。より好ましくは、Ｔｗｅｅｎ−２０またはＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００が使われて、最も好ましくはＴｗｅｅｎ−２０が使われる。

（ｂ）凝集型−形成ポリペプチドの凝集型を追加的に形成させるステップ
次に、本発明の方法は、（ｂ）前記ステップ（ａ）の結果物をインキュベーションさせて前記凝集型−形成ポリペプチドの凝集型を追加的に形成させるステップを含む。

本発明の最も大きい特徴の１つは、生試料の中に測定しようとする凝集型−形成ポリペプチドの凝集型（抗原）の量が非常に少ないか、または凝集型−形成ポリペプチドの凝集型（抗原）の大きさが非常に小さくて測定し難いか、または人体内凝集型−形成ポリペプチドの凝集型（抗原）の量と生試料の中の凝集型−形成ポリペプチドの凝集型（抗原）の量が比例しない場合に、前述した前記凝集型−形成ポリペプチドのダイマー型を生試料にスパイキング（ｓｐｉｋｉｎｇ）して凝集型−形成ポリペプチドの凝集型を追加的に形成させることによって、疾病または疾患の有無または進行程度が測定できるということである。

本発明の他の具現例によれば、前記ステップ（ｂ）の凝集型−形成ポリペプチドの凝集型の追加的な形成は、前記ステップ（ａ）の結果物を温度１〜５０℃でインキュベーション（ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ）させて実施し、より好ましくは温度３５〜５０℃でインキュベーション（ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ）させて実施し、さらに好ましくは温度３５〜４５℃で実施し、さらなる好ましくは温度３５〜４０℃で実施する。

本発明で、前記ステップ（ｂ）のインキュベーションは前記スパイキングした凝集型−形成ポリペプチドのダイマー型が前記生試料によりマルチマー化できる充分な時間の間実施し、より好ましくは前記生試料によりマルチマー化できる充分なインキュベーション時間は、凝集型−形成ポリペプチドのマルチマー型が関与している疾患を有するヒトの生試料を用いて発生したシグナルが正常のヒトの生試料を用いて発生したシグナルより１．３〜２０倍大きくすることに充分な時間である。

本発明の更に他の具現例によれば、ヒトの生試料を用いて発生したシグナルが正常のヒトの生試料を用いて発生したシグナルより１．３〜２０倍大きくすることに充分な時間の間実施するための、前記ステップ（ｂ）の凝集型−形成ポリペプチドの凝集型の追加的な形成は、前記ステップ（ａ）の結果物を１日〜１２日の間インキュベーション（ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ）させて実施し、より好ましくは１日〜１０日の間実施し、さらに好ましくは１日〜８日の間実施し、さらなる好ましくは１日〜６日の間実施し、さらに好ましくは２日〜６日の間実施し、最も好ましくは２日〜５日の間実施する。

本明細書で、用語“インキュベーション”は分析対象の生試料を所定の温度で一定期間の間スタンディングすること（ｋｅｐｔ ｔｏ ｓｔａｎｄ）またはシェーキング（ｓｈａｋｉｎｇ）することを意味し、シェーキングする場合には、好ましくはマイルドシェーキング（ｍｉｌｄ ｓｈａｋｉｎｇ）することを意味する。

本発明の最も大きい特徴の他の１つは、生試料を所定の温度で一定期間スタンディング（即ち、インキュベーション）することによって、生試料に存在するスパイキングされた凝集型−形成ポリペプチドのダイマー型と凝集型−形成ポリペプチドが互いによく凝集（ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ）されるようにして患者と正常人との間の診断シグナルの差（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）を極大化したという点である。

（ｃ）前記ステップ（ｂ）の結果物に前記凝集型−形成ポリペプチドの凝集型に結合する結合剤−標識の接触
そして、本発明の方法は（ｃ）前記ステップ（ｂ）の結果物に前記凝集型−形成ポリペプチドの凝集型に結合する結合剤にシグナル発生標識が結合された結合剤−標識を接触させるステップを経る。

本発明で、前記凝集型−形成ポリペプチドの凝集型に結合する結合剤は、抗体、ペプチドアプタマー、アドネクチン（ＡｄＮｅｃｔｉｎ）、アフィボディ（ａｆｆｉｂｏｄｙ、米国特許第５，８３１，０１２号）、アビマー（Ａｖｉｍｅｒ， Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ， Ｊ． ｅｔ ａｌ， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２３（１２）：１５５６（２００５））またはクニッツドメイン（Ｋｕｎｉｔｚ ｄｏｍａｉｎ， Ａｒｎｏｕｘ Ｂ ｅｔ ａｌ．， Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ． Ｄ Ｂｉｏｌ． Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ． ５８（Ｐｔ ７）：１２５２４（２００２））、及びＮｉｘｏｎ， ＡＥ， Ｃｕｒｒｅｎｔ ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ ｄｒｕｇ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ＆ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ９（２）：２６１８（２００６））である。

本発明で、前記凝集型−形成ポリペプチドの凝集型に結合する結合剤に結合されるシグナル発生標識は、化合物標識（例えば、ビオチン）、酵素標識（例えば、アルカリンホスファターゼ、フェロキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、及びβ−グルコシダーゼ）、放射能標識（例えば、Ｉ^１２５及びＣ^１４）、蛍光標識（例えば、フルオレセイン）、発光標識、化学発光標識、及びＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー伝達；ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｅｎｅｒｇｙ ｔｒａｎｓｆｅｒ）標識を含むが、これに限定されるものではない。

（ｄ）前記凝集型−形成ポリペプチドの凝集型に結合された結合剤−標識から発生するシグナルの検出
最後に、本発明の方法は、（ｄ）前記凝集型−形成ポリペプチドの凝集型に結合された結合剤−標識から発生するシグナルを検出するステップを含む。

前記凝集型−形成ポリペプチドの凝集型に結合された結合剤−標識から発生するシグナルの検出は当業界に公知された多様な方法により実施することができ、例えば抗原−抗体反応と関連した免疫分析法を用いて実施することができる。

本発明の更に他の具現例によれば、前記ステップ（ｃ）及び（ｄ）は次のステップを含む方法により実施される：（ｃ−１）前記凝集型を捕獲（ｃａｐｔｕｒｉｎｇ）する前記凝集型−形成ポリペプチド上のエピトープを認識する捕獲抗体に前記ステップ（ｂ）の結果物を接触させるステップ；（ｃ−２）前記凝集型−形成ポリペプチド上のエピトープを認識する検出抗体に前記捕獲された凝集型を接触させるステップ；及び（ｃ−３）凝集型−検出抗体複合体を検出するステップ。

このような検出方法は２つ形態の抗体、即ち捕獲抗体及び検出抗体を用いる。本明細書で、用語、“捕獲抗体”は生試料で検出しようとする凝集型−形成ポリペプチドに結合できる抗体を意味する。用語、“検出抗体”は前記捕獲抗体により捕獲された凝集型−形成ポリペプチドに結合できる抗体を意味する。“抗体”は抗原に結合できる免疫グロブリンタンパク質を意味する。本明細書に用いられた抗体は検出しようとするエピトープ、抗原または抗原断片に結合できる全体抗体だけでなく、抗体断片（例えば、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ）を含む。

前記検出方法は、凝集型−形成ポリペプチド上のエピトープを特異的に認識する１セットの捕獲抗体及び検出抗体を用いるものであって、前記捕獲抗体及び検出抗体が特異的に認識する前記エピトープは互いに同一またはオーバーラップしている。

捕獲抗体及び検出抗体に対するエピトープを言及しながら使われる用語、“オーバーラップ（ｏｖｅｒｌａｐｐｅｄ ｗｉｔｈ）”は完全にまたは部分的にオーバーラップするアミノ酸配列を含むエピトープを包括する。例えば、６Ｅ１０、ＦＦ５１、及びＷＯ２抗体に対するエピトープはヒトＡβペプチド配列の各々、アミノ酸３−８、１−４、及び４−１０からなるアミノ酸配列を有する。このようなエピトープは完全にオーバーラップするエピトープで説明できる。

本発明の他の具現例によれば、ヒトＡβペプチド配列を言及しながら表現する場合、前記エピトープはアミノ酸３−８、１−４、または４−１０からなるアミノ酸配列を有する。

本発明の更に他の具現例によれば、前記捕獲抗体が認識するエピトープは、前記凝集型−形成ポリペプチドで反復されない配列であり、前記検出抗体が認識するエピトープは前記凝集型−形成ポリペプチドで反復されない配列である。本発明の検出方法によれば、捕獲抗体に結合された凝集型−形成ポリペプチドは、検出抗体とこれ以上結合できず、これは検出抗体が認識する追加的なエピトープが存在しないためである。

本発明の他の具現例によれば、前記捕獲抗体及び検出抗体は互いに同一である。即ち、捕獲抗体及び検出抗体に特異的に結合されるエピトープは同一であるものが好ましい。

本発明の更に他の具現例によれば、前記捕獲抗体は固体基質に結合される。このような形態の公知の物質は、ポリスチレン及びポリプロピレン、ガラス、金属、及びジェルのような炭化水素重合体を含む。前記固体基質は、ディップスティック、マイクロタイタープレート、粒子（例えば、ビード）、親和性コラム、及びイムノブロットメンブレン（例えば、ポリビニリデンフルオライドメンブレン）形態でありうる（参照：米国特許第５，１４３，８２５号、第５，３７４，５３０号、第４，９０８，３０５号、及び第５，４９８，５５１号）。

本発明の他の具現例によれば、前記検出抗体は検出可能な信号を生成させる標識を有する。前記標識は化合物標識（例えば、ビオチン）、酵素標識（例えば、アルカリンホスファターゼ、フェロキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、及びβ−グルコシダーゼ）、放射能標識（例えば、Ｉ^１２５及びＣ^１４）、蛍光標識（例えば、フルオレセイン）、発光標識、化学発光標識及びＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー伝達；ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｅｎｅｒｇｙ ｔｒａｎｓｆｅｒ）標識を含むが、これに限定されるものではない。抗体を標識するための多様な標識及び方法は、当業界に公知されている（Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ， ｅｄｓ． Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ （１９８８） Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ．Ｙ．）。

本発明で、凝集型−形成ポリペプチドに結合できる抗体を融合方法（Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ， Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， ６：５１１−５１９（１９７６））、組換えＤＮＡ方法（米国特許第４，８１６，５６号）、またはファージ抗体ライブラリ（Ｃｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ， Ｎａｔｕｒｅ， ３５２：６２４−６２８（１９９１）；及びＭａｒｋｓ ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ２２２：５８， １−５９７（１９９１））のような従来技術によって免疫原に以前に記載されたエピトープを用いて準備することができる。前記抗体製造のための一般的な方法は、 Ｈａｒｌｏｗ， Ｅ． ａｎｄ Ｌａｎｅ， Ｄ．， Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９８８； Ｚｏｌａ， Ｈ．， Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．， Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ， Ｆｌｏｒｉｄａ， １９８４；及びＣｏｌｉｇａｎ， ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ， Ｗｉｌｅｙ／Ｇｒｅｅｎｅ， ＮＹ， １９９１に記載されている。

単一クローン抗体製造のためのハイブリドーマ細胞株の準備は不滅細胞株（ｉｍｍｏｒｔａｌ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ）及び抗体を生産するリンパ球の融合により実施される。前記単一クローン抗体の製造は当業界に公知された技術を用いて実施することができる。多クローン抗体は、前述した抗原を適した動物に注入し、抗体を含む抗血清を収集した後、公知された親和性技術により抗体を分離する方法により製造できる。

凝集型−検出抗体複合体の検出は、当業界の公知された多様な方法により実施することができる。凝集型−検出抗体複合体の形成は生試料に凝集型の存在を示す。前記ステップは従来の方法に従って、例えば、Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ， Ｅ． Ｔ． Ｍａｇｇｉｏ， ｅｄ．， ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ， Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ， Ｆｌｏｒｉｄａ， １９８０、及びＨａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ， ｅｄｓ． Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１９８８） Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ．Ｙに記載されたように、多様な検出することができる標識／基質対を用いて、定量的にまたは定性的に実施することができる。

前記検出抗体をアルカリンホスファターゼで標識する場合には、ブロモクロロインドリルホスフェート（ＢＣＩＰ）、ニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）及びＥＣＦを発色反応のための基質として用いることができる；ホースラディッシュフェロキシダーゼで表示する場合、基質としてクロロナフトール、アミノエチルカルバゾール、ジアミノベンジジン、Ｄ−ルシフェリン、ルシゲニン（ビス−Ｎ−メチルアクリジニウムナイトレート）、レゾルフィンベンジルエーテル、ルミノール、アムプレクスレッド試薬（１０−アセチル−３，７−ジヒドロキシフェノキサジン）、ＴＭＢ（３，３，５，５−テトラメチルベンズイジン）、ＥＣＬ（ｅｎｈａｎｃｅｄ ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ）及びＡＢＴＳ（２，２−アジン−ジ［３−エチルベンゾチアゾリンスルホネート］）などが用いられる。

このような方法により凝集型−形成ポリペプチドのマルチマー型が関与している疾患を有するヒトの生試料を用いて発生したシグナルが正常のヒトの生試料を用いて発生したシグナルより１．３〜２０倍大きくすることができ、より好ましくは１．５〜１０倍、さらに好ましくは１．６倍〜１０倍大きくすることができる。

本発明の他の様態によれば、本発明は凝集型−形成ポリペプチドのダイマー型を含む生試料（ｂｉｏｓａｍｐｌｅ）の凝集型−形成ポリペプチドの凝集型を検出するためのキットを提供する。

本発明のキットは前述した本発明の生試料（ｂｉｏｓａｍｐｌｅ）の凝集型−形成ポリペプチドの凝集型を検出する方法を用いるものであって、この両者に共通する内容は反復記載に従う明細書の過度な複雑性を避けるために、その記載を省略する。

本発明の他の具現例によれば、前記キットは凝集型−形成ポリペプチド上のエピトープを認識する捕獲抗体；及び前記捕獲抗体が認識する前記エピトープを認識する検出抗体を追加的に含む。

以下、実施例を通じて本発明をより詳細に説明する。これら実施例は本発明をより具体的に説明するためのものであって、本発明の要旨に従って本発明の範囲がこれら実施例により制限されないということは当業界で通常の知識を有する者において自明である。

実施例
実施例１：実験材料の準備
コーティングバッファ（Ｃａｒｂｏｎａｔｅ−Ｂｉｃａｒｂｏｎａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒ）、ＰＢＳＴ、ＴＢＳＴ、及びＰＢＳはｓｉｇｍａ社から購入した。Ｂｌｏｃｋ ＡｃｅはＢｉｏ−ｒａｄ社から購入した。バッファＡはＴＢＳＴにＢｌｏｃｋ Ａｃｅを０．４％に希釈して製造した。ブロッキング（ｂｌｏｃｋｉｎｇ）バッファはＤ．Ｗに１％のＢｌｏｃｋ Ａｃｅが希釈されるように製造した。ＨＢＲ１はＳｃａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ社から購入した。６Ｅ１０抗体はＢｉｏｌｅｇｅｎｄ社から購入した。ＷＯ２−ＨＲＰ抗体はＡｂｓｏｌｕｔｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ社から購入した。ＦＦ５１−ＨＲＰは（株）Ｔｈｅ Ｈ ｌａｂから購入した。ＷＯ２−ＨＲＰ抗体はＡｂｓｏｌｕｔｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ社から購入した。組換え（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ）Ａβ１−４２はＢｉｏｌｅｇｅｎｄ社から購入した。組換えＳ２６Ｃ−Ｂｅｔａ−アミロイド（Ａｍｙｌｏｉｄ）（１−４０）ダイマー（Ｄｉｍｅｒ）はＪＰＴ社から購入した。血漿（ｐｌａｓｍａ）サンプルは盆唐ソウル大学校病院及び中央大学校病院から提供を受けた。ＥＣＬ溶液はＲｏｃｋｌａｎｄ社から購入した。プレートはＮｕｎｃ社から購入した。６Ｅ１０、ＦＦ５１、及びＷＯ２抗体に対するエピトープはヒトＡβペプチド配列の各々、アミノ酸３−８、１−４、及び４−１０からなるアミノ酸配列を有する。Ｓ２６Ｃ−Ｂｅｔａ−アミロイド（１−４０）ダイマーのシーケンスはＤＡＥＦＲＨＤＳＧＹＥＶＨＨＱＫＬＶＦＦＡＥＤＶＧＣＮＫＧＡＩＩＧＬＭＶＧＧＶＶであり、各単量体の２６番システイン残基によってジスルフィド結合したダイマー（Ｄｉｍｅｒ）形態をなしている。

実施例２：６Ｅ１０プレート製造
６Ｅ１０抗体（抗Ａβタンパク質、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）３０μｇをコーティングバッファ（ｓｉｇｍａ）１０ｍｌに希釈し、プレート（Ｎｕｎｃ）に１００μｌを各ウェルに分注後、４℃冷蔵庫に一日間反応させた。前記プレートをＰＢＳに３回洗浄し、Ｄ．Ｗに１％Ｂｌｏｃｋ Ａｃｅが溶けているブロッキングバッファ２４０μｌを分注後、室温で２時間反応させた。前記プレートはＰＢＳで３回洗浄し、室温に３０分間乾燥させた後、使用した。

実施例３：対照群準備
陽性対照群（ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ）は組換えＡβ１−４２（ｒｅｃ．Ａβ）（１μｇ／ｍｌ）１０μｌにＰＢＳＴ ９９０μｌを添加して１００μｌを使用した。陰性対照群（ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ）はＰＢＳ １００μｌを使用した。

実施例４：サンプル準備
サンプルは２サンプルを基準として準備した。凍らせた血漿サンプルを３７℃ヒートブロック（ｈｅａｔ ｂｌｏｃｋ）に１５分間溶かした後、３０秒間ボルテックスした（ｖｏｒｔｅｘｉｎｇ）後、使用した。Ｓ２６Ｃ−Ｂｅｔａ−アミロイド（１−４０）ダイマー ０．２５ｎｇがスパイキング（ｓｐｉｋｉｎｇ）されたサンプルは、血漿２０μｌにＨＢＲ１（０．１２３ｍｇ／ｍｌ）８．０８μｌとＰＢＳＴ １８０μｌ、Ｓ２６Ｃ−Ｂｅｔａ−アミロイド（１−４０）ダイマー（０．２５ｎｇ／１０μｌ）２０μｌを混合して全体２２８．０８μｌになるように準備した。また、組換えペプチドをスパイキングしないサンプルは、血漿２０μｌにＨＢＲ１（０．１２３ｍｇ／ｍｌ）８．０８μｌとＰＢＳＴ ２００μｌを混合して全体２２８．０８μｌになるように準備した。

実施例５：インキュベーション（ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ）
前記実施例４で、Ｓ２６Ｃ−Ｂｅｔａ−アミロイド（１−４０）ダイマーが処理されて準備されたサンプルは３７℃インキュベーターで各０日、１日、２日、３日、４日、５日の間インキュベーションさせた（６Ｅ１０／ＦＦ５１ＨＲＰ ｓｅｔ）。また、前記実施例４でＳ２６Ｃ−Ｂｅｔａ−アミロイド（１−４０）ダイマーが無処理されて準備されたサンプルは、３７℃インキュベーターで０日、５日の間インキュベーションさせた（６Ｅ１０／ＦＦ５１ＨＲＰ ｓｅｔ）。そして、前記実施例４で、Ｓ２６Ｃ−Ｂｅｔａ−アミロイド（１−４０）ダイマーが処理されて準備されたサンプルは３７℃インキュベーターで各１日、２日、３日、４日の間インキュベーションさせた（６Ｅ１０／ＷＯ２ＨＲＰ ｓｅｔ）。

実施例６：６Ｅ１０／ＦＦ５１ＨＲＰ ｓｅｔ：Ｓ２６Ｃ−Ｂｅｔａ−アミロイド（１−４０）ダイマーを処理した後、３日と４日の間インキュベーションされたサンプルでＭＤＳ（ｍｕｌｔｉｍｅｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ）を用いたＡβオリゴマー（ｏｌｉｇｏｍｅｒ）検出
６Ｅ１０コーティングプレート（３μｇ／ｍｌ）に陽性対照群及び、陰性対照群にＳ２６Ｃ−Ｂｅｔａ−アミロイド（１−４０）ダイマーが０．２５ｎｇ処理されて３日と４日の間インキュベーションされたサンプルを各々１００μｌずつ分注した後、室温で１時間反応させた。前記プレートをＴＢＳＴで３回洗浄し、ＦＦ５１−ＨＲＰ抗体をバッファＡに０．５μｇ／ｍｌになるように製造後、１００ｕｌずつ分注した。前記プレートをＴＢＳＴで３回洗浄後、ＥＣＬ溶液を１００μｌ分注した。ＥＣＬと反応されたプレートはルミノメーター機器（ｐｅｒｋｉｎｅｌｍｅｒ）に挿入し、発光（ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ）シグナルを測定した。その結果は、以下の図１、２の通りである。

図１及び図２は、Ｓ２６Ｃ−Ｂｅｔａ−アミロイド（１−４０）ダイマーを添加後、インキュベーション時間に従ってＡＤサンプルとＮｏｎ ＡＤサンプルとの間のシグナルの変化を示す。３日と４日インキュベーションされた各条件でＡＤとＮｏｎ ＡＤとの間に差を示す。

図１及び図２を通じて見ると、Ｎｏｎ ＡＤ患者サンプルと比較時、ＡＤ患者のサンプルでのＡβオリゴマーのシグナルが高く出ることは、ＡＤ患者サンプルでＡβオリゴマー形成を抑制させる防御システムがＮｏｎ ＡＤ患者でより少なく活性化されると判断される。

実施例７：６Ｅ１０／ＦＦ５１ＨＲＰ ｓｅｔ：Ｓ２６Ｃ−Ｂｅｔａ−アミロイド（１−４０）ダイマーを処理した後、０日、１日、２日、３日、４日、５日の間インキュベーションされたサンプルでＭＤＳ（ｍｕｌｔｉｍｅｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ）を用いたＡβオリゴマー（ｏｌｉｇｏｍｅｒ）検出
６Ｅ１０コーティングプレート（３μｇ／ｍｌ）に陽性対照群及び、陰性対照群にＳ２６Ｃ−Ｂｅｔａ−アミロイド（１−４０）ダイマーが０．２５ｎｇ処理されて０日、１日、２日、３日、４日、５日の間インキュベーションされたサンプルを各々１００μｌずつ分注した後、室温で１時間反応させた。前記プレートをＴＢＳＴで３回洗浄し、ＦＦ５１−ＨＲＰ抗体をバッファＡに０．５μｇ／ｍｌになるように製造後、１００ｕｌずつ分注した。前記プレートをＴＢＳＴで３回洗浄後、ＥＣＬ溶液を１００μｌ分注した。ＥＣＬと反応されたプレートはルミノメーター機器（ｐｅｒｋｉｎｅｌｍｅｒ）に挿入し、発光（ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ）シグナルを測定した。その結果は、以下の図３の通りである。

図３は、Ｓ２６Ｃ−Ｂｅｔａ−アミロイド（１−４０）ダイマーを添加後、インキュベーション時間に従ってＡＤサンプルとＮｏｎ ＡＤサンプルとの間のシグナルの変化を確認したグラフであって、インキュベーション時間が増加するにつれてＡＤサンプルのシグナルがＮｏｎ ＡＤサンプルのシグナルに比べて１．１５倍、１．３４倍、１．６４倍、２．１４倍、３．０１倍、３．３５倍に増加することを示す。

図３を通じて見ると、Ｎｏｎ ＡＤ患者サンプルと比較時、ＡＤ患者のサンプルでのＡβオリゴマーのシグナルが高く出ることは、ＡＤ患者サンプルでＡβオリゴマー形成を抑制させる防御システムがＮｏｎ ＡＤ患者でより少なく活性化されると判断される。

実施例８：６Ｅ１０／ＦＦ５１ＨＲＰ ｓｅｔ：Ｓ２６Ｃ−Ｂｅｔａ−アミロイド（１−４０）ダイマー ０．２５ｎｇを処理後、０日、５日インキュベーションしたサンプルと無処理した後、０日、５日の間インキュベーションされたサンプルでＭＤＳ（ｍｕｌｔｉｍｅｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ）を用いたＡβオリゴマー（ｏｌｉｇｏｍｅｒ）検出
６Ｅ１０コーティングプレート（３μｇ／ｍｌ）に陽性対照群及び、陰性対照群にＳ２６Ｃ−Ｂｅｔａ−アミロイド（１−４０）ダイマーが０．２５ｎｇ処理された後、０日、５日処理されない各０日、５日の間インキュベーションされたサンプルを各々１００μｌずつ分注した後、２７℃インキュベーター（ｉｎｃｕｂａｔｏｒ）で静置状態で１時間反応させた。前記プレートをＴＢＳＴで３回洗浄し、ＦＦ５１−ＨＲＰ抗体をバッファＡに０．５μｇ／ｍｌになるように製造後、１００ｕｌずつ分注した。前記プレートをＴＢＳＴで３回洗浄後、ＥＣＬ溶液を１００μｌ分注した。ＥＣＬと反応されたプレートはルミノメーター機器（ｐｅｒｋｉｎｅｌｍｅｒ）に挿入し、発光（ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ）シグナルを測定した。その結果は、以下の図４の通りである。

図４は、Ｓ２６Ｃ−Ｂｅｔａ−アミロイド（１−４０）ダイマーを添加せず、０日と５日、添加した後、０日と５日の間インキュベーションされたサンプルでＡβオリゴマーを測定したデータであって、Ｓ２６Ｃ−Ｂｅｔａ−アミロイド（１−４０）ダイマーをスパイキングしなかったときとスパイキングしたとき、時間に従ってＡＤサンプルのシグナルがＮｏｎ ＡＤサンプルよりシグナルが増加することを示した。

Ｓ２６Ｃ−Ｂｅｔａ−アミロイド（１−４０）ダイマーをスパイキングせず、０日と５日間インキュベーションしたサンプルの場合は、ＡＤのシグナルがＮｏｎ ＡＤのシグナルより各々１．０９倍、１．９７倍の差を示しており、０日から５日間Ａβオリゴマー（ｏｌｉｇｏｍｅｒ）の変化量は１．８倍増加した。一方、Ｓ２６Ｃ−Ｂｅｔａ−アミロイド（１−４０）ダイマーを０．２５ｎｇスパイキングした後、０日と５日間インキュベーションしたサンプルの場合は、ＡＤのシグナルがＮｏｎ ＡＤのシグナルより各々１．１倍、３．４７倍の差を示し、０日から５日間Ａβオリゴマー（ｏｌｉｇｏｍｅｒ）の変化量は３．１５倍増加することを示す。

図４を通じて見ると、Ｎｏｎ ＡＤ患者サンプルと比較時、ＡＤ患者のサンプルでのＡβオリゴマーのシグナルが高く出ることは、ＡＤ患者サンプルでＡβオリゴマー形成を抑制させる防御システムがＮｏｎ ＡＤ患者でより少なく活性化されると判断される。

実施例９：６Ｅ１０／ＷＯ２ＨＲＰ ｓｅｔ：Ｓ２６Ｃ−Ｂｅｔａ−アミロイド（１−４０）ダイマーを処理した後、１日と２日の間インキュベーションされたサンプルでＭＤＳ（ｍｕｌｔｉｍｅｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ）を用いたＡβオリゴマー（ｏｌｉｇｏｍｅｒ）検出
６Ｅ１０コーティングプレート（３μｇ／ｍｌ）に陽性対照群及び、陰性対照群にＳ２６Ｃ−Ｂｅｔａ−アミロイド（１−４０）ダイマーが０．２５ｎｇ処理されて１日と２日の間インキュベーションされたサンプルを各々１００μｌずつ分注した後、室温で１時間反応させた。前記プレートをＴＢＳＴで３回洗浄し、ＷＯ２−ＨＲＰ抗体をバッファＡに０．２５μｇ／ｍｌになるように製造後、１００ｕｌずつ分注した。前記プレートをＴＢＳＴで３回洗浄後、ＥＣＬ溶液を１００μｌ分注した。ＥＣＬと反応されたプレートはルミノメーター機器（ｐｅｒｋｉｎｅｌｍｅｒ）に挿入し、発光（ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ）シグナルを測定した。その結果は、以下の図５、６の通りである。

図５及び図６は、Ｓ２６Ｃ−Ｂｅｔａ−アミロイド（１−４０）ダイマーを添加後、インキュベーション時間に従ってＡＤサンプルとＮｏｎ ＡＤサンプルとの間のシグナルの変化を示す。１日と２日インキュベーションされた各条件でＡＤとＮｏｎ ＡＤとの間に差を示す。

図５及び６を通じて見ると、Ｎｏｎ ＡＤ患者サンプルと比較時、ＡＤ患者のサンプルでのＡβオリゴマーのシグナルが高く出ることは、ＡＤ患者サンプルでＡβオリゴマー形成を抑制させる防御システムがＮｏｎ ＡＤ患者でより少なく活性化されると判断される。

実施例１０：６Ｅ１０／ＷＯ２ＨＲＰ ｓｅｔ：Ｓ２６Ｃ−Ｂｅｔａ−アミロイド（１−４０）ダイマーを処理後、１日、２日、３日、４日の間インキュベーションされたサンプルでＭＤＳ（ｍｕｌｔｉｍｅｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ）を用いたＡβオリゴマー（ｏｌｉｇｏｍｅｒ）検出
６Ｅ１０コーティングプレート（３μｇ／ｍｌ）に陽性対照群及び、陰性対照群にＳ２６Ｃ−Ｂｅｔａ−アミロイド（１−４０）ダイマーが０．２５ｎｇ処理されて１日、２日、３日、４日の間インキュベーションされたサンプルを各々１００μｌずつ分注した後、室温で１時間反応させた。前記プレートをＴＢＳＴで３回洗浄し、ＷＯ２−ＨＲＰ抗体をバッファＡに０．２５μｇ／ｍｌになるように製造後、１００ｕｌずつ分注した。前記プレートをＴＢＳＴで３回洗浄後、ＥＣＬ溶液を１００μｌ分注した。ＥＣＬと反応されたプレートはルミノメーター機器（ｐｅｒｋｉｎｅｌｍｅｒ）に挿入し、発光（ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ）シグナルを測定した。その結果は、以下の図７の通りである。

図７は、Ｓ２６Ｃ−Ｂｅｔａ−アミロイド（１−４０）ダイマーを添加後、インキュベーション時間に従ってＡＤサンプルとＮｏｎ ＡＤサンプルとの間のシグナルの変化を確認したグラフである。その結果として、インキュベーション１日目ではＡＤサンプルの平均シグナルがＮｏｎ ＡＤの平均シグナルより１．１９倍高いし、全体的にサンプルシグナルが上昇した。一方、２日目、３日目、４日目では、全体的に高まったサンプルのシグナル値が落ちるにつれてＡＤサンプルがＮｏｎ ＡＤサンプルより１．６９倍、１．５０倍、１．４１倍の差を示すことを確認した。

図７を通じて見ると、Ｎｏｎ ＡＤ患者サンプルと比較時、ＡＤ患者のサンプルでのＡβオリゴマーのシグナルが高く出ることは、ＡＤ患者サンプルでＡβオリゴマー形成を抑制させる防御システムがＮｏｎ ＡＤ患者でより少なく活性化されると判断される。

Claims (24)

1. 次のステップを含む生試料（ｂｉｏｓａｍｐｌｅ）のＡβペプチドの凝集型を検出する方法：
   （ａ）分析対象の生試料に前記Ａβペプチドのダイマー型をスパイキング（ｓｐｉｋｉｎｇ）するステップ；
   （ｂ）前記ステップ（ａ）の結果物をインキュベーションさせて前記Ａβペプチドの凝集型を追加的に形成させるステップ；
   （ｃ）前記ステップ（ｂ）の結果物に前記Ａβペプチドの凝集型に結合する結合剤にシグナル発生標識が結合された結合剤−標識を接触させるステップ；及び
   （ｄ）前記Ａβペプチドの凝集型に結合された結合剤−標識から発生するシグナルを検出するステップ、
   ここで、前記ステップ（ｂ）のインキュベーションは前記スパイキングしたＡβペプチドのダイマー型が前記生試料によりマルチマー化できる充分な時間の間実施し、
   前記Ａβペプチドのダイマー型は、配列表の配列番号１のアミノ酸配列からなるＡβペプチドの２６番Ｃｙｓ残基によりジスルフィド結合されてなるダイマー型である。
2. 前記スパイキングしたＡβペプチドのダイマー型のマルチマー化をさせる前記生試料は、前記Ａβペプチドのマルチマー型が関与している疾患を有するヒトの生試料であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
3. 前記生試料によりマルチマー化できる充分なインキュベーション時間は、Ａβペプチドのマルチマー型が関与している疾患を有するヒトの生試料を用いて発生したシグナルが正常のヒトの生試料を用いて発生したシグナルより１．３〜２０倍大きくすることに充分な時間であることを特徴とする、請求項２に記載の方法。
4. 前記生試料（ｂｉｏｓａｍｐｌｅ）は血液であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
5. 前記血液試料は、血漿（ｐｌａｓｍａ）であることを特徴とする、請求項４に記載の方法。
6. 前記ステップ（ａ）の結果物に緩衝液を追加的に添加することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
7. 前記緩衝液は生試料に対して３〜１５倍（ｖ／ｖ）で添加されることを特徴とする、請求項６に記載の方法。
8. 前記緩衝液は非イオン性界面活性剤−含有燐酸塩緩衝液であることを特徴とする、請求項７に記載の方法。
9. 前記ステップ（ｂ）のＡβペプチドの凝集型の追加的な形成は、前記ステップ（ａ）の結果物を温度１〜５０℃でインキュベーション（ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ）させて実施することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
10. 前記ステップ（ｃ）及び（ｄ）は、次のステップを含む方法により実施されることを特徴とする、請求項１に記載の方法：
    （ｃ−１）前記凝集型を捕獲（ｃａｐｔｕｒｉｎｇ）する前記Ａβペプチド上のエピトープを認識する捕獲抗体に前記ステップ（ｂ）の結果物を接触させるステップ；
    （ｃ−２）前記Ａβペプチド上のエピトープを認識する検出抗体に前記捕獲された凝集型を接触させるステップ；及び
    （ｃ−３）凝集型−検出抗体複合体を検出するステップ。
11. 前記検出抗体は、前記ステップ（ｃ−１）のエピトープと同一なまたはオーバーラップするエピトープを認識する検出抗体であることを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
12. 前記捕獲抗体は固体基質に結合されたことを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
13. 前記検出抗体は検出可能な信号を生成させる標識を有することを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
14. 前記検出抗体に結合された標識は、化合物標識、酵素標識、放射能標識、蛍光標識、発光標識、化学発光標識、又はＦＲＥＴ標識であることを特徴とする、請求項１３に記載の方法。
15. Ａβペプチドのダイマー型を含む生試料（ｂｉｏｓａｍｐｌｅ）のＡβペプチドの凝集型を検出するためのキットであって、
    前記Ａβペプチドのダイマー型は、配列表の配列番号１のアミノ酸配列からなるＡβペプチドの２６番Ｃｙｓ残基によりジスルフィド結合されてなるダイマー型である、キット。
16. 前記生試料（ｂｉｏｓａｍｐｌｅ）は血液であることを特徴とする、請求項１５に記載のキット。
17. 前記血液試料は血漿（ｐｌａｓｍａ）であることを特徴とする、請求項１６に記載のキット。
18. 前記キットは緩衝液を追加的に含むことを特徴とする、請求項１５に記載のキット。
19. 前記緩衝液は非イオン性界面活性剤−含有燐酸塩緩衝液であることを特徴とする、請求項１８に記載のキット。
20. 前記キットはＡβペプチド上のエピトープを認識する捕獲抗体；及び前記捕獲抗体が認識する前記エピトープを認識する検出抗体を追加的に含むことを特徴とする、請求項１５に記載のキット。
21. 前記検出抗体は前記捕獲抗体が認識する前記エピトープと同一なまたはオーバーラップするエピトープを認識する検出抗体であることを特徴とする、請求項２０に記載のキット。
22. 前記捕獲抗体は固体基質に結合されたことを特徴とする、請求項２０に記載のキット。
23. 前記検出抗体は検出可能な信号を生成させる標識を有することを特徴とする、請求項２０に記載のキット。
24. 前記検出抗体に結合された標識は、化合物標識、酵素標識、放射能標識、蛍光標識、発光標識、化学発光標識、又はＦＲＥＴ標識であることを特徴とする、請求項２３に記載のキット。