JP6664315B2 - セロトニン分泌促進剤 - Google Patents

Description

本発明は、セロトニン分泌促進剤に関する。

ラクトバチラス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）ＳＢＣ８８０３（以下、「ＳＢＬ８８」とも称する。）は、抗アレルギー作用を有すること（特許文献１）、アルコール性肝障害抑制作用を有すること（特許文献２）、腸管保護作用を有すること（特許文献３）が知られている。

国際公開第２００８／０２３６６３号 国際公開第２００９／０９０９６１号 特開２０１０−８３８８１号公報

本発明は、ラクトバチラス・ブレビスＳＢＣ８８０３の新規な用途を提供することを課題とする。

本発明は、ラクトバチラス・デルブリッキィー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ）グループに属する乳酸菌以外のラクトバチラス属に属する乳酸菌、及びペディオコッカス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）属に属する乳酸菌からなる群より選ばれる菌株の菌体又はその処理物を有効成分として含有するセロトニン分泌促進剤を提供する。

本発明者らは、上記乳酸菌群から選択される菌株の菌体又は菌体処理物は、モノアミン神経伝達物質であるセロトニンの細胞からの分泌を促進する作用を有する、との新規な知見を得た。本発明はこの知見に基づいており、ラクトバチラス・ブレビスＳＢＣ８８０３を含む上記菌株の新規な用途を提供するものである。

セロトニンは人の精神面に大きな影響を与える神経伝達物質で、不足すると「うつ病」などの精神疾患に陥り易いといわれている。また、体内セロトニンの約９０％は、腸管に存在している腸クロム親和性細胞（Ｅｎｔｅｒｏｃｈｒｏｍａｆｆｉｎ（ＥＣ）細胞）により産生されおり、腸の蠕動運動等に重要な役割を果たしていると考えられている。従って、セロトニン産生を制御することは、ストレス社会における健康感（生活リズム改善）において、極めて重要である。

上記セロトニン分泌促進剤は、ラクトバチラス・ブレビスに属する菌株の菌体又は菌体処理物を有効成分として含有することが好ましく、ラクトバチラス・ブレビスＳＢＣ８８０３の菌体又は菌体処理物を有効成分として含有することがより好ましい。これにより、より一層優れたセロトニン分泌促進作用を奏する。

なお、ラクトバチラス・ブレビスＳＢＣ８８０３は、２００６年６月２８日に独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６（郵便番号３０５−８５６６））に寄託された、受託番号がＦＥＲＭ ＢＰ−１０６３２の菌株である。

上記セロトニン分泌促進剤は、セロトニンの分泌を介して自律神経に作用し、例えば、胃迷走神経亢進作用、皮膚動脈交感神経抑制作用及び褐色脂肪組織交感神経亢進作用を発揮する。したがって、上記セロトニン分泌促進剤は、自律神経調節剤として使用することもできる。

上記セロトニン分泌促進剤は、血流量増加作用（血流促進作用）及び経皮水分蒸散量低下作用（経皮水分蒸散抑制作用）を有しているため、皮膚の保湿度を高めることができ、保湿剤として使用することもできる。また、上記セロトニン分泌促進剤は、血流促進剤として使用することもできる。

上記セロトニン分泌促進剤による血流促進効果及び保湿効果は、少なくともその一部はセロトニン分泌促進作用に基づいており、セロトニンの分泌を介して皮膚動脈交感神経が抑制されることにより生じる。

上記菌株は、古くから発酵食品に利用されており、生体への安全性が確立されている。したがって、上記セロトニン分泌促進剤、上記自律神経調節剤、上記保湿剤又は上記血流促進剤は、生体への安全性が高く、長期間継続的に摂取することができるため、医薬品成分、飲食品成分、飲食品添加物、飼料成分、飼料添加物等として使用することができる。また、医薬品、飲食品又は飼料に添加して使用（摂取）することもできる。

本発明はまた、飲食品の製造における上記セロトニン分泌促進剤、上記自律神経調節剤、上記保湿剤又は上記血流促進剤の使用ということもできる。

本発明によれば、生体への安全性が高く、飲食品の成分としても使用可能な新規のセロトニン分泌促進剤が提供される。また、当該セロトニン分泌促進剤を含有する医薬品、飲食品、飲食品添加物等が提供される。

現在のストレス社会においては、生活リズムが乱れ易い状況下にあり、これが体調不良、睡眠障害、疲労、生活習慣病等々に導く要因の１つとなっている。ストレスが続くと交感神経が強く刺激され、血流循環障害が起こり皮膚の状態が悪くなったり、睡眠不足になったりすると言われている。一方、副交感神経活動が抑えられるため、副交感神経の支配下にある消化管では、消化液の分泌が抑制され、蠕動運動も抑制されるので、食欲不振、便秘などの症状が起きる。本発明のセロトニン分泌促進剤は、胃迷走神経の活動を亢進する作用を有するため、整腸効果、並びに便通及び食欲を促進する効果が期待できる。

また、本発明のセロトニン分泌促進剤は、皮膚動脈交感神経の活動を抑制する作用を有しており、皮膚動脈を弛緩させて血流を促進し（血流量増加作用）、皮膚細胞への酸素及び栄養素の供給を高め、経皮水分蒸散量を低下させ（経皮水分蒸散量低下作用）、皮膚の保湿度を高めることができる。これにより、美容効果が期待できる。また、入眠を促進する効果も期待できる。

また、本発明の自律神経調節剤によれば、神経伝達物質であるセロトニンを介して、少なくとも胃迷走神経亢進作用、皮膚動脈交感神経抑制作用及び褐色脂肪組織交感神経亢進作用が奏される。セロトニンによる各臓器の自律神経活動への更なる影響を勘案すれば、健康的な生活リズムの基本となる内臓活動のリズムを維持する効果が期待できる。

ラクトバチラス属及びペディオコッカス属に属する乳酸菌の１６Ｓ ｒＤＮＡ配列に基づく系統的位置関係を示す図である。 ＳＢＬ８８株のセロトニン分泌促進作用を示すグラフである。 ＳＢＬ８８株の胃迷走神経活動への作用を示すグラフである。 ＳＢＬ８８株の皮膚動脈交感神経活動への作用を示すグラフである。 ＳＢＬ８８株の褐色脂肪組織交感神経活動への作用を示すグラフである。 ＳＢＬ８８株の胃迷走神経亢進作用に対するセロトニン受容体阻害剤の影響を示すグラフである。 各種乳酸菌及びビフィズス菌のセロトニン分泌促進作用を示すグラフである。 各種乳酸菌及びビフィズス菌のセロトニン分泌促進作用を示すグラフである。 ＳＢＬ８８株の血流量への作用を示すグラフである。 ＳＢＬ８８株の経皮水分蒸散量への作用を示すグラフである。 ＳＢＬ８８株の皮膚動脈交感神経抑制作用に対するセロトニン受容体阻害剤の影響を示すグラフである。

本実施形態に係るセロトニン分泌促進剤は、ラクトバチラス・デルブリッキィー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ）グループに属する乳酸菌以外のラクトバチラス属に属する乳酸菌、及びペディオコッカス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）属に属する乳酸菌からなる群（以下、「本実施形態に係る乳酸菌群」ともいう。）より選ばれる菌株の菌体又はその処理物を有効成分として含有する。

ラクトバチラス・デルブリッキィーグループに属する乳酸菌とは、ラクトバチラス属に属する乳酸菌、及びペディオコッカス属に属する乳酸菌を１６Ｓ ｒＤＮＡの塩基配列に基づいて近隣結合（Ｎｅｉｇｈｂｏｒ-ｊｏｉｎｉｎｇ）法により系統樹を作成したときに、ラクトバチラス・デルブリッキィーが含まれる系統群に分類される乳酸菌である（図１参照。出典：Ｊａｐａｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｌａｃｔｉｃ Ａｃｉｄ Ｂａｃｔｅｒｉａ，２００８年，Ｖｏｌ．１９，Ｎｏ．３，ｐｐ．１５４）。本実施形態に係る乳酸菌群は、図１に示すラクトバチラス属及びペディオコッカス属に属する乳酸菌から、図１に示すラクトバチラス・デルブリッキィーグループに属する乳酸菌を除いた乳酸菌からなる群である。

本実施形態に係る乳酸菌群としては、具体的には例えば、ラクトバチラス・ブッヒネリ（ｂｕｃｈｎｅｒｉ）グループに属する乳酸菌、ペディオコッカスグループに属する乳酸菌、ラクトバチラス・アリメンタリウス（ａｌｉｍｅｎｔａｒｉｕｓ）−ラクトバチラス・ファルシミニス（ｆａｒｃｉｍｉｎｉｓ）グループに属する乳酸菌、ラクトバチラス・プランタルム（ｐｌａｎｔａｒｕｍ）グループに属する乳酸菌、ラクトバチラス・ロイテリ（ｒｅｕｔｅｒｉ）グループに属する乳酸菌、ラクトバチラス・カゼイ（ｃａｓｅｉ）グループに属する乳酸菌、ラクトバチラス・サケイ（ｓａｋｅｉ）グループに属する乳酸菌、ラクトバチラス・サリヴァリゥス（ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）グループに属する乳酸菌が挙げられる。

本実施形態に係る乳酸菌群から選択される菌株としては、セロトニンの分泌がより一層促進されることから、ラクトバチラス・ブッヒネリグループに属する菌株が好ましく、ラクトバチラス・ブレビスに属する菌株がより好ましく、ラクトバチラス・ブレビスＳＢＣ８８０３が更に好ましい。

本実施形態に係るセロトニン分泌促進剤における菌株は、例えば、自然界から分離可能なもの、又はＡＴＣＣ等の細胞バンクから入手可能なものであってもよい。本実施形態に係るセロトニン分泌促進剤は、本実施形態に係る乳酸菌群より選ばれる菌株の菌体又はその処理物を有効成分とする。上記菌株は１種単独であってもよく、２種以上の組み合わせであってもよい。

菌株の菌体は、生菌体及び死菌体のいずれであってもよい。菌体は、生菌体を培養することにより大量に生産することができる。培地は、液体培地及び固体培地のいずれでもよいが、窒素源及び炭素源を含有するものが好ましい。窒素源としては、肉エキス、ペプトン、グルテン、カゼイン、酵母エキス、アミノ酸等を、また、炭素源としては、グルコース、キシロース、フルクトース、イノシトール、マルトース、水アメ、麹汁、デンプン、バカス、フスマ、糖蜜、グリセリン等を用いることができる。また、無機質として、硫酸アンモニウム、リン酸カリウム、塩化マグネシウム、食塩、鉄、マンガン、モリブデン等を添加することができ、更にビタミン等を添加することができる。好適な培地としては、ＭＲＳ培地、ＬＢＳ培地、Ｒｏｇｏｓａ培地、ＷＹＰ培地、ＧＹＰ培地等が挙げられる。

生菌体の培養条件は、各乳酸菌に適した条件を採用すればよいが、例えば、培養温度は通常２０〜５０℃、好ましくは２５〜４０℃、より好ましくは３０℃である。培養時間は通常６〜６２時間であり、好ましくは１２〜４８時間であり、より好ましくは１５〜３０時間である。培地のｐＨは通常３〜８、好ましくは４〜７であり、より好ましくは６〜７である。培養はインキュベーター中で行ってもよく、また、培養の際は通気振とうしてもよい。

菌体の処理物としては、上記菌体（生菌体又は死菌体）に、加熱、加圧、乾燥、粉砕、破壊又は自己溶解等の処理を行って得られる処理物が挙げられる。これらの処理は２種以上を組み合わせてもよい。菌体の処理物としては、例えば、菌体を１００℃以上で数分以上加熱して得られる処理物（例えば、菌体に、１０５〜１２５℃の温度で１０分以上、オートクレーブ処理を施して得られる処理物）、菌体に対して凍結乾燥、噴霧乾燥等を行って得られる処理物、菌体を有機溶媒（アセトン、エタノール等）に接触させて得られる処理物、菌体を酸若しくはアルカリ溶液に接触させて得られる処理物、菌体を酵素的に破砕して得られる処理物、又は菌体を超音波、フレンチプレス等で物理的に破壊して得られる処理物が挙げられる。このような菌体処理物は、未処理菌体（特に生菌体）と比較して、取り扱いが容易な点で好適である。

セロトニンは、５−ヒドロキシトリプタミン（５−ｈｙｄｒｏｘｙｔｒｙｐｔａｍｉｎｅ）とも呼ばれ、モノアミン神経伝達物質の一つである。本実施形態に係るセロトニン分泌促進剤は、セロトニンの分泌を介して自律神経（特に、脳から各臓器へ向かう神経である遠心枝）に作用し、例えば、胃迷走神経亢進作用、皮膚動脈交感神経抑制作用及び褐色脂肪組織交感神経亢進作用を発揮することができるため、自律神経調節剤として使用してもよい。また、本実施形態に係る自律神経調節剤は、生活リズム改善剤として使用することもできる。

本実施形態に係るセロトニン分泌促進剤は、皮膚動脈交感神経抑制作用を介して、皮膚動脈を弛緩させて血流を促進することができるため、血流促進剤として使用することもできる。またこのような作用に基づいているため、本実施形態に係る血流促進剤は、手足の冷え、肩凝り及び糖尿病性血管障害等の血管狭窄症状に対して有効である。

本実施形態に係るセロトニン分泌促進剤は、血流促進作用により、皮膚細胞への酸素及び栄養素の供給を高め、経皮水分蒸散量を低下させ（経皮水分蒸散量低下作用）、皮膚の保湿度を高めることができるため、保湿剤として使用することもできる。

本実施形態に係るセロトニン分泌促進剤は、固体（例えば、凍結乾燥させて得られる粉末）、液体（水溶性又は脂溶性の溶液又は懸濁液）、ペースト等のいずれの形状であってもよく、また、散剤、丸剤、顆粒剤、錠剤、シロップ剤、トローチ剤、カプセル剤等のいずれの剤形であってもよい。

上述の各種製剤は、有効成分である上記菌株の菌体又はその処理物のみからなるものであってもよく、例えば、当該菌株の菌体又はその処理物を上記剤形に成形することによって調製することができる。上述の各種製剤はまた、上記有効成分と、薬学的に許容される添加剤（賦形剤、結合剤、滑沢剤、崩壊剤、乳化剤、界面活性剤、基剤、溶解補助剤、懸濁化剤等）とを混和し、成形することによって調製することもできる。この場合の上記有効成分の含有量は、製剤全量を基準として、０．５〜５０質量％である。

例えば、賦形剤としては、ラクトース、スクロース、デンプン、デキストリン等が挙げられる。結合剤としては、ポリビニルアルコール、アラビアゴム、トラガント、ゼラチン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリビニルピロリドン等が挙げられる。滑沢剤としては、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、タルク等が挙げられる。崩壊剤としては、結晶セルロース、寒天、ゼラチン、炭酸カルシウム、炭酸水素ナトリウム、デキストリン等が挙げられる。乳化剤又は界面活性剤としては、Ｔｗｅｅｎ６０、Ｔｗｅｅｎ８０、Ｓｐａｎ８０、モノステアリン酸グリセリン等が挙げられる。基剤としては、セトステアリルアルコール、ラノリン、ポリエチレングリコール、米糠油、魚油（ＤＨＡ、ＥＰＡ等）、オリーブ油等が挙げられる。溶解補助剤としては、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、炭酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、Ｔｗｅｅｎ８０等が挙げられる。懸濁化剤としては、Ｔｗｅｅｎ６０、Ｔｗｅｅｎ８０、Ｓｐａｎ８０、モノステアリン酸グリセリン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム等が挙げられる。

本実施形態に係るセロトニン分泌促進剤は、ヒトに投与しても、非ヒト哺乳動物に投与してもよい。投与量及び投与方法は、投与される個体の状態、年齢等に応じて適宜決定することができる。投与方法（投与経路）としては、例えば、注腸投与、経口投与、経管栄養、経静脈投与が挙げられる。好適な投与方法としては、例えば、経口投与が挙げられる。投与量及び投与方法の一例として、本実施形態に係るセロトニン分泌促進剤を有効成分量が０．５ｍｇ〜５００ｍｇとなる量を１日１回経口で投与する方法を挙げることができる。

本実施形態に係るセロトニン分泌促進剤は、医薬品成分、飲食品成分、飲食品添加物、飼料成分、飼料添加物等として使用することができる。

例えば、本実施形態に係るセロトニン分泌促進剤は、水、清涼飲料水、果汁飲料、乳飲料、アルコール飲料、パン類、麺類、米類、豆腐、乳製品、醗酵食品、発酵乳、醤油、味噌、菓子類等の飲食品への添加物として使用することができる。これらの飲食品は、当分野で通常使用される他の添加物を更に含有してもよく、そのような添加物としては、例えば、苦味料、香料、リンゴファイバー、大豆ファイバー、肉エキス、黒酢エキス、ゼラチン、コーンスターチ、蜂蜜、動植物油脂；グルコース、フルクトース等の単糖類；スクロース等の二糖類；デキストロース、デンプン等の多糖類；エリスリトール、キシリトール、ソルビトール、マンニトール等の糖アルコール類；ビタミンＣ等のビタミン類、が挙げられる。本実施形態に係るセロトニン分泌促進剤はまた、特定保健用食品、特別用途食品、栄養補助食品、健康食品、機能性食品、病者用食品等の成分として使用することもできる。本実施形態に係るセロトニン分泌促進剤を含有する飲食品は、本実施形態に係る乳酸菌群より選択される菌株で牛乳、脱脂乳、豆乳等を発酵させて得られる発酵物であってもよい。

以下、実施例等に基づいて本発明をより具体的に説明する。

〔実施例１：ＳＢＬ８８株のセロトニン分泌促進作用〕
＜菌体処理物の調製＞
ＳＢＬ８８株をＭＲＳ液体培地１０ｍＬ中で、１〜２日間、３０℃、静置培養した。培養液を１０，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、菌体の沈殿を滅菌生理食塩水（１０ｍＬ）で２回洗浄した。得られた菌体は、５ｍＬの滅菌水に懸濁し、凍結乾燥させた。凍結乾燥した菌体を１０ｍｇ／ｍＬになるように滅菌水に懸濁した後、１０５℃で１０分間加熱処理し、菌体溶液を得た。

＜大腸細胞ＣＯＬＯ−３２０ＤＭの培養＞
ＣＯＬＯ−３２０ＤＭ（ＪＣＲＢ０２２５）は（財）ヒューマンサイエンス振興財団より購入した。１０％ＦＢＳ含有Ｄ’ＭＥＭ培地を使用し、５％ＣＯ_２インキュベーター内で、ＣＯＬＯ−３２０ＤＭを３日おきに継代しながら培養した。

＜ＣＯＬＯ−３２０ＤＭのセロトニン分泌促進アッセイ＞
１０％ＦＢＳ含有Ｄ’ＭＥＭ培地で３日間培養したＣＯＬＯ−３２０ＤＭ培養液を、１，０００ｒｐｍで５分間遠心分離して細胞を回収した。回収した細胞を、約２×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように無血清ＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁して２４穴マイクロプレートに播種した後（０．５ｍＬ／ウェル）、菌体の濃度が１００質量ｐｐｍとなるように菌体溶液を添加した（１％添加）。５％ＣＯ_２インキュベーター内で２時間培養した後、培養液を遠心分離して菌体及び細胞を除去した。得られた上清中のセロトニン濃度を、セロトニンＥＩＡキット（品番９００−１７５、コスモバイオ）を使用して測定した。菌体を添加せずに同様の操作を行った対照（菌体非添加）との比較から、ＳＢＬ８８株のセロトニン分泌促進作用を評価した。

図２に、セロトニン分泌促進アッセイの結果を示す。図２中、Ｂｌａｎｋは、菌体非添加のウェル中のセロトニン濃度（ｎＭ／ウェル）の測定結果を示す。図２から明らかなように、ＳＢＬ８８株の菌体を添加することによって、ＣＯＬＯ−３２０ＤＭのセロトニン分泌が強く促進された（図２）。すなわち、ＳＢＬ８８株は、セロトニン分泌を促進する作用を有する。

〔実施例２：ＳＢＬ８８株の自律神経への作用〕
ＳＢＬ８８株の胃迷走（副交感）神経活動、皮膚動脈交感神経活動及び褐色脂肪組織交感神経活動への作用を解析した。

＜菌体処理物の調製＞
ＳＢＬ８８株を培地（マルトース２質量％，酵母エキス１．４質量％，酢酸ナトリウム０．５質量％，硫酸マンガン０．００５質量％，ｐＨ６．５〜７．０）に植菌し、３０℃で１日間静置培養した。得られた培養液（約８×１０^８ｃｆｕ／ｍＬ）を、８，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して菌体を回収した。回収した菌体を蒸留水に懸濁し、８，０００ｒｐｍで１０分遠心分離して菌体を回収した。この操作を２度繰り返した後、蒸留水に懸濁した菌体を１０５℃で１０分間加熱処理した後、凍結乾燥して加熱処理菌体粉末を得た。

＜胃迷走神経活動、皮膚動脈交感神経活動及び褐色脂肪組織交感神経活動の測定＞
１２時間毎の明暗周期（８時〜２０時まで点灯）下で、２４℃の恒温動物室にて１週間以上飼育した体重約３００ｇのＷｉｓｔａｒ系雄ラット（約９週齢）を試験に使用した。試験当日は３時間絶食させた後、ウレタン麻酔し、十二指腸に菌体投与用のカニューレを挿入した。その後、胃迷走神経の遠心枝、右大腿部の皮膚動脈交感神経の遠心枝、又は背甲間の褐色脂肪組織交感神経の遠心枝を銀電極で吊り上げて、これらの神経の電気活動を測定した。測定値が落ち着いた段階（１３時頃）でカニューレを使用して、加熱処理菌体粉末の懸濁液１ｍＬ（８×１０^７ｃｆｕ／ｍＬ）を十二指腸に投与し、胃迷走神経活動、皮膚動脈交感神経活動又は褐色脂肪組織交感神経活動の変化を測定した。対照として、加熱処理菌体粉末の懸濁液１ｍＬに代えて水１ｍＬを十二指腸に投与し、これらの神経活動の変化を測定した。測定の間、体温維持装置で体温（ラット直腸温）を３５．０±０．５℃に保った。神経活動の測定データは、５分間毎の５秒あたりの発火頻度（ｐｕｌｓｅ／５秒）の平均値をとり、菌体（又は水）投与前５分間の平均値（０分値）を１００％とした百分率で表した。なお、測定データから平均値±標準誤差を計算すると共に、群としての統計学的有意差の検定を、反復測定分散分析（ＡＮＯＶＡ ｗｉｔｈ ｒｅｐｅａｔｅｄ ｍｅａｓｕｒｅｓ）により行った。また、菌体（又は水）投与前（０分）の電気活動の測定値（絶対値）間の統計学的有意差の検定は、マン・ホイットニーのＵ検定（Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ−ｔｅｓｔ）により行った。なお、各群それぞれ３匹のラットを用いた。

図３に、胃迷走神経活動（ｇａｓｔｒｉｃ ｖａｇａｌ ｎｅｒｖｅ ａｃｉｔｉｖｉｔｙ：ＧＶＮＡ）の測定結果を示す。ＳＢＬ８８株の菌体を投与した群（以下「ＳＢＬ８８群」という。）では、投与直後からＧＶＮＡが上昇し続け、投与６０分後には３２５．８％に達した（図３）。一方、対照として水を投与した群（以下「対照群」という。）では、ＧＶＮＡはほとんど変化せず、最低値９７．６％（投与１５分後）及び最高値１１１．８％（投与５５分後）の間でほぼ一定の値を維持した（図３）。

投与５分後から９０分後までの間のＧＶＮＡを、対照群及びＳＢＬ８８群の２群間で分散分析（ＡＮＯＶＡ）法により統計学的に検討した結果、ＳＢＬ８８群のＧＶＮＡは対照群のＧＶＮＡより有意に（Ｐ＜０．０００５，Ｆ＝３１．０（反復測定分散分析））高かった。また、これら２群の菌体（又は水）投与前（０分）の電気活動は、対照群が１３０±１８、ＳＢＬ８８群が２５３±３２であった。マン・ホイットニーのＵ検定の結果、これら２群の菌体（又は水）投与前（０分）の電気活動には、有意差は認められなかった。

すなわち、ＳＢＬ８８株は胃迷走（副交感）神経の活動を亢進する作用を有する。この胃迷走神経亢進作用により、整腸効果、並びに便通及び食欲を促進する効果が期待できる。

図４に、皮膚動脈交感神経活動（ｃｕｔａｎｅｏｕｓ ａｒｔｅｒａｌ ｓｙｍｐａｔｈｅｔｉｃ ｎｅｒｖｅ ａｃｉｔｉｖｉｔｙ：ＣＡＳＮＡ）の測定結果を示す。ＳＢＬ８８群は、投与直後ＣＡＳＮＡがやや上昇し、投与５分後に最高値１２４．４％に達したものの、その後はＣＡＳＮＡが低下し続け、投与６０分後には６３．３％に達した（図４）。一方、対照群では、投与２５分後以降ＣＡＳＮＡが徐々に上昇し、投与６０分後には１２２．４％に達した（図４）。

投与５分後から９０分後までの間のＣＡＳＮＡを、対照群及びＳＢＬ８８群の２群間で、ＡＮＯＶＡ法により統計学的に検討した結果、ＳＢＬ８８群のＣＡＳＮＡは対照群のＣＡＳＮＡより有意に（Ｐ＜０．０００５，Ｆ＝２９．０（反復測定分散分析））低かった。また、これら２群の菌体（又は水）投与前（０分）の電気活動は、対照群が３１６±７０、ＳＢＬ８８群が２５０±４であった。マン・ホイットニーのＵ検定の結果、これら２群の菌体（又は水）投与前（０分）の電気活動には、有意差は認められなかった。

すなわち、ＳＢＬ８８株は皮膚動脈交感神経の活動を抑制する作用を有する（投与６０分後において、投与前の約６０％にまで神経活動を抑制した）。この皮膚動脈交感神経抑制作用により、皮膚への血流を増加させて皮膚の保湿度を高めるという美容効果、及び入眠を促進する効果が期待できる。

図５に、褐色脂肪組織交感神経活動（ｂｒｏｗｎ ａｄｉｐｏｓｅ ｔｉｓｓｕｅ ｓｙｍｐａｔｈｅｔｉｃ ｎｅｒｖｅ ａｃｉｔｉｖｉｔｙ：ＢＡＴ−ＳＮＡ）の測定結果を示す。ＳＢＬ８８群は、投与直後からＢＡＴ−ＳＮＡが上昇し続け、投与５５分後には１６７．２％に達した（図５）。一方、対照群では、ＢＡＴ−ＳＮＡはほとんど変化せず、最低値９１．０％（投与１５分後）及び最高値１０１．１％（投与５５分後）の間でほぼ一定の値を維持した（図５）。

投与５分後から９０分後までの間のＢＡＴ−ＳＮＡを、対照群及びＳＢＬ８８群の２群間で、ＡＮＯＶＡ法により統計学的に検討した結果、ＳＢＬ８８群のＢＡＴ−ＳＮＡは対照群のＢＡＴ−ＳＮＡより有意に（Ｐ＜０．０００５，Ｆ＝４８．６（反復測定分散分析））高かった。また、これら２群の菌体（又は水）投与前（０分）の電気活動は、対照群が１８３±１９、ＳＢＬ８８群が２４３±９であった。マン・ホイットニーのＵ検定の結果、これら２群の菌体（又は水）投与前（０分）の電気活動には、有意差は認められなかった。

すなわち、ＳＢＬ８８株は褐色脂肪組織交感神経の活動を亢進する作用を有する。この褐色脂肪組織交感神経亢進作用により、褐色脂肪組織でのエネルギー消費及び熱産生を高める効果が期待できる。

〔参考例１：胃迷走神経亢進作用に対するセロトニン受容体阻害剤の影響〕
ＳＢＬ８８株の胃迷走神経亢進作用に関して、セロトニン受容体阻害剤による影響を解析した。

＜菌体処理物の調製＞
実施例２と同様にして、ＳＢＬ８８株の加熱処理菌体粉末を得た。

＜セロトニン受容体阻害剤の影響＞
１２時間毎の明暗周期（８時〜２０時まで点灯）下で、２４℃の恒温動物室にて１週間以上飼育した体重約３００ｇのＷｉｓｔａｒ系雄ラット（約９週齢）を試験に使用した。試験当日は３時間絶食させた後、ウレタン麻酔し、十二指腸に菌体投与用のカニューレを挿入した。その後、胃迷走神経の遠心枝を銀電極で吊り上げて、胃迷走神経の電気活動を測定した。測定値が落ち着いた段階（１３時頃）でカニューレを使用して、加熱処理菌体粉末の懸濁液１ｍＬ（８×１０^７ｃｆｕ／ｍＬ）を十二指腸に投与した。なお、菌体投与の５分前に、ウレタン麻酔下で、頚静脈にカニューレを挿入し、０．１ｍＬのセロトニン受容体阻害剤（後述のセロトニン受容体アンタゴニスト）溶液、又は当該溶液の溶媒を静脈内に投与した。なお、各群それぞれ１匹のラットを用いた。

セロトニン受容体阻害剤：
Ｋｅｔａｎｓｅｒｉｎｅ（シグマ社製，５−ＨＴ２Ａアンタゴニスト：生理食塩水に溶解させ、１０μｇ／ｋｇを静脈投与）
Ｇｒａｎｉｓｅｔｒｏｎ（シグマ社製，５−ＨＴ３アンタゴニスト：生理食塩水に溶解させ、１０μｇ／ｋｇを静脈投与）
ＧＲ１１３８０８（シグマ社製，５−ＨＴ４アンタゴニスト：ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解させ、１０μｇ／ｋｇ及び１００μｇ／ｋｇを静脈投与）

測定の間、体温維持装置で体温（ラット直腸温）を３５．０±０．５℃に保った。神経活動の測定データは、５分間毎の５秒あたりの発火頻度（ｐｕｌｓｅ／５秒）の平均値をとり、菌体投与前５分間の平均値（０分値）を１００％とした百分率で表した。

図６に、胃迷走神経活動（ＧＶＮＡ）の測定結果を示す。セロトニン受容体５−ＨＴ３に対するアンタゴニストであるＧｒａｎｉｓｅｔｒｏｎを直前に投与することで、ＳＢＬ８８株の胃迷走神経亢進作用が顕著に阻害された（図６（Ａ））。また、セロトニン受容体５−ＨＴ４に対するアンタゴニストであるＧＲ１１３８０８を高濃度（１００μｇ／ｋｇ）で投与した場合にも同様に、胃迷走神経亢進作用が阻害された（図６（Ｂ））。この結果は、ＳＢＬ８８株の胃迷走神経亢進作用は、セロトニンを介した作用であることを示している。

また、５−ＨＴ３受容体は抹消神経及び最終野で、５−ＨＴ４受容体は海馬及び胃腸管で、５−ＨＴ２Ａ受容体は血小板、平滑筋及び小脳皮質で発現していることが知られている。これらセロトニン受容体の発現部位と、セロトニン受容体阻害剤による胃迷走神経亢進作用の阻害（図６）との関係から、ＳＢＬ８８株の投与により腸管上皮細胞（例：ＥＣ細胞等）がセロトニンを分泌し（ＳＢＬ８８株のセロトニン分泌促進作用）、分泌されたセロトニンにより腸管の末梢神経（５−ＨＴ３受容体）が興奮して脳が刺激を受け、脳から各臓器に繋がる自律神経系へ指令が出されるものと考えられる。

〔実施例３：他の乳酸菌株によるセロトニン分泌促進作用〕
各種乳酸菌及びビフィズス菌の菌体調製は、実施例１の＜菌体処理物の調製＞と同様に行った。また、それら菌体調製液について、＜ＣＯＬＯ−３２０ＤＭのセロトニン分泌促進アッセイ＞を実施例１と同様に行った。その結果を図７及び８並びに表１及び２に示した。表１及び２中、セロトニン濃度が０．０のものは、測定値が検出限界（３ｎＭ／ウェル以下）以下であったことを意味する。

図７及び８中の略号と乳酸菌及びビフィズス菌との対応を表１及び２に示す。

ラクトバチラス・デルブリッキィー、ラクトバチラス・アシドフィルス（ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）、ラクトバチラス・ガセリ（ｇａｓｓｅｒｉ）、ラクトバチラス・ジョンソニー（ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）等のラクトバチラス・デルブリッキィーグループに属する乳酸菌等には、セロトニン分泌促進作用は認められなかった（図７）。

一方、ラクトバチラス・デルブリッキィーグループに属する乳酸菌以外のラクトバチラス属に属する乳酸菌には、セロトニン分泌促進作用が認められた（図８）。特に、ＳＢＬ８８株は、強いセロトニン分泌促進作用を有していた（図８）。

〔実施例４：ＳＢＬ８８株の血流量への作用〕
＜菌体処理物の調製＞
実施例２と同様にして、ＳＢＬ８８株の加熱処理菌体粉末を得た。

＜血流量の測定＞
１２時間毎の明暗周期（８時〜２０時まで点灯）下で、２４℃の恒温動物室にて１週間飼育した体重約３００ｇのＷｉｓｔａｒ系雄ラット（約９週齢）を試験に使用した。試験当日は３時間絶食させた後、ウレタン麻酔し、十二指腸に菌体投与用のカニューレを挿入した。その後、ラットの尾の背部表面の起始部に近い所にレーザー血流計（ＡＬＦ２１、アドバンス社製）のプローブ（径１ｃｍ）を外科用テープで固定し、血流の測定を開始した。測定値が安定した段階でカニューレを使用して、加熱処理菌体粉末の懸濁液１ｍＬ（８×１０^７ｃｆｕ／ｍＬ）又は水１ｍＬを十二指腸に投与した。なお、各群それぞれ４匹のラットを用いた。

血流量のデータはＰｏｗｅｒ−Ｌａｂ ａｎａｌｏｇ−ｔｏ−ｄｉｇｉｔａｌ ｃｏｎｖｅｒｔｅｒを用いて採取した。得られたデータから５分間毎の血流量（ｍＬ／分／組織１００ｇ）の平均値をとり、加熱処理菌体粉末の投与前５分間の平均値（０分値）を１００％とした百分率で表した。なお、測定データから平均値±標準誤差を計算すると共に、群としての統計学的有意差の検定を、反復測定分散分析により行った。また、菌体（又は水）投与前（０分）の血流量の測定値（絶対値）間の統計学的有意差の検定は、マン・ホイットニーのＵ検定により行った。

図９に、血流量（ラットの尾の皮膚血流量）の測定結果を示す。ＳＢＬ８８株の菌体を投与した群（以下「ＳＢＬ８８群」という。）では、投与直後に血流量がやや上昇し、投与１０分後には最高値の１１４．０％に達した（図９）。その後、血流量は徐々に低下したが、投与６０分後の血流量は９４．８％であった（図９）。一方、対照として水を投与した群（以下「対照群」という。）では、投与直後から血流量が徐々に低下し、投与３０分後には７１．７％にまで減少した。その後、血流量はゆっくりと低下し、投与５５分後には、６７．７％の最低値に達した（図９）。

投与５分後から６０分後までの間の血流量を、対照群及びＳＢＬ８８群の２群間で分散分析（ＡＮＯＶＡ）法により統計学的に検討した結果、ＳＢＬ８８群の血流量は対照群の血流量より有意に（Ｐ＜０．０００５，Ｆ＝１９１（反復測定分散分析））高かった。また、これら２群の菌体（又は水）投与前（０分）の血流量は、対照群が４．５２±０．７［ｍＬ／分／組織１００ｇ］、ＳＢＬ８８群が３．６２±０．５［ｍＬ／分／組織１００ｇ］であった。マン・ホイットニーのＵ検定の結果、これら２群の菌体（又は水）投与前（０分）の血流量には、有意差は認められなかった。

実施例４の結果により、ＳＢＬ８８株による血流量増加作用（血流促進作用）が確認された。

〔実施例５：ＳＢＬ８８株の経皮水分蒸散量への作用〕
＜菌体処理物の調製＞
実施例２と同様にして、ＳＢＬ８８株の加熱処理菌体粉末を得た。

＜経皮水分蒸散量の測定＞
１２時間毎の明暗周期（８時〜２０時まで点灯）下で、２４℃の恒温動物室にて１週間飼育した体重約３００ｇの雄性ＨＷＹヘアレスラットを試験に使用した。試験期間中、ラットには、加熱処理菌体粉末の懸濁液（８×１０^７ｃｆｕ／ｍＬ）又は水を自由摂取させた。毎日１３時に、背中の部位における経皮水分蒸散量（ｔｒａｎｓｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｗａｔｅｒ ｌｏｓｓ：ＴＥＷＬ）を、ケタミン麻酔下で、ＶａｐｏＭｅｔｅｒ Ｄｅｌｆｉｎｅ，Ｆｉｎｌａｎｄ）を用いて測定した。なお、各群それぞれ５匹のラットを用いた。

得られたデータから経皮水分蒸散量の平均値をとり、加熱処理菌体粉末の懸濁液、又は水の自由摂取開始前（０日目）の平均値を１００％とした百分率で表した。なお、測定データから平均値±標準誤差を計算すると共に、群としての統計学的有意差の検定を、反復測定分散分析により行った。また、自由摂取開始前（０日目）の経皮水分蒸散量の測定値（絶対値）間の統計学的有意差の検定は、マン・ホイットニーのＵ検定により行った。

図１０に、経皮水分蒸散量の測定結果を示す。対照として水を自由摂取させた群（以下「対照群」という。）では、ＴＥＷＬ値はわずかに低下したもののほとんど変化せず、試験開始から３日目の値が９７．３％であった（図１０）。これに対し、ＳＢＬ８８株の菌体懸濁液を自由摂取させた群（以下「ＳＢＬ８８群」という。）では、ＴＥＷＬ値が徐々に低下していき、試験開始から３日目には、７６．４％にまで低下した（図１０）。

自由摂取開後１日目から３日目までの間のＴＥＷＬ値を、対照群及びＳＢＬ８８群の２群間で分散分析（ＡＮＯＶＡ）法により統計学的に検討した結果、ＳＢＬ８８群のＴＥＷＬ値は対照群のＴＥＷＬの値より有意に（Ｐ＜０．０００５，Ｆ＝４６．１（反復測定分散分析））低かった。また、これら２群の自由摂取開始前（０日目）の経皮水分蒸散量は、対照群が１１．１±０．２［ｇ／ｍ^２／時間］、ＳＢＬ８８群が１１．７±０．４［ｇ／ｍ^２／時間］であった。マン・ホイットニーのＵ検定の結果、これら２群の自由摂取開始前（０日目）の経皮水分蒸散量には、有意差は認められなかった。

実施例５の結果により、ＳＢＬ８８株による経皮水分蒸散量低下作用（経皮水分蒸散抑制作用）が確認された。

〔参考例２：皮膚動脈交感神経抑制作用に対するセロトニン受容体阻害剤の影響〕
ＳＢＬ８８株の皮膚動脈交感神経抑制作用に関して、セロトニン受容体阻害剤による影響を解析した。

＜菌体処理物の調製＞
実施例２と同様にして、ＳＢＬ８８株の加熱処理菌体粉末を得た。

＜セロトニン受容体阻害剤の影響＞
１２時間毎の明暗周期（８時〜２０時まで点灯）下で、２４℃の恒温動物室にて１週間以上飼育した体重約３００ｇのＷｉｓｔａｒ系雄ラット（約９週齢）を試験に使用した。試験当日は３時間絶食させた後、ウレタン麻酔し、頚静脈及び十二指腸に菌体投与用のカニーレを挿入した。その後、左大腿部の皮膚動脈交感神経の遠心枝を銀電極で吊り上げて、皮膚動脈交感神経の電気活動を測定した。測定値が落ち着いた段階（１３時頃）で、０．１ｍＬのセロトニン受容体阻害剤（上述のＧｒａｎｉｓｅｔｒｏｎ）又は０．１ｍＬの生理食塩水を静脈内に投与した。投与から５分後に加熱処理菌体粉末の懸濁液（８×１０^７ｃｆｕ／ｍｌ）を十二指腸に投与した。なお、各群それぞれ３匹のラットを用いた。

測定の間、体温維持装置で体温（ラット直腸温）を３５．０±０．５℃に保った。神経活動のデータは、５分間毎の５秒あたりの発火頻度（ｐｕｌｓｅ／５秒）の平均値をとり、菌体投与前５分間の平均値（０分値）を１００％とした百分率で表した。なお、測定データから平均値±標準誤差を計算すると共に、群としての統計学的有意差の検定を、反復測定分散分析により行った。また、菌体投与前（０分）の電気活動の絶対値の統計学的有意差の検定は、マン・ホイットニーのＵ検定により行った。

図１１に、皮膚動脈交感神経活動（ｃｕｔａｎｅｏｕｓ ａｒｔｅｒｉａｌ ｓｙｍｐａｔｈｅｔｉｃ ｎｅｒｖｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ：ＣＡＳＮＡ）の測定結果を示す。生理食塩水のみを直前に投与した群（以下、「生理食塩水＋ＳＢＬ８８群」という。）では、菌体投与直後からＣＡＳＮＡは徐々に減少していき、菌体投与５５分後には最低値の５３．５％に達した（図１１）。一方、セロトニン受容体５−ＨＴ３に対するアンタゴニストであるＧｒａｎｉｓｅｔｒｏｎを直前に投与した群（以下、「Ｇｒａｎｉｓｅｔｒｏｎ＋ＳＢＬ８８群」という。）では、ＣＡＳＮＡは、菌体投与１０分後に一時的に９５．８％まで減少したものの、その後は徐々に上昇し、菌体投与６０分後には１２８．１％に達し、ＳＢＬ８８株の皮膚動脈交感神経抑制作用が顕著に阻害された（図１１）。

菌体投与５分後から６０分後までの間のＣＡＳＮＡを、生理食塩水＋ＳＢＬ８８群及びＧｒａｎｉｓｅｔｒｏｎ＋ＳＢＬ８８群の２群間で分散分析法により統計学的に検討した結果、Ｇｒａｎｉｓｅｔｒｏｎ＋ＳＢＬ８８群のＣＡＳＮＡは、生理食塩水＋ＳＢＬ８８群のＣＡＳＮＡより有意に（Ｐ＜０．０００５，Ｆ＝４５．８（反復測定分散分析））高かった。また、これら２群の菌体投与前の電気活動（０分値）は、生理食塩水＋ＳＢＬ８８群が２１１±５３（ｓｐｉｋｅｓ／５秒）、Ｇｒａｎｉｓｅｔｒｏｎ＋ＳＢＬ８８群が２５９±１１（ｓｐｉｋｅｓ／５秒）であった。マン・ホイットニーのＵ検定の結果、これら２群の菌体投与前の電気活動（０分値）には、有意差は認められなかった。

この結果は、ＳＢＬ８８株の皮膚動脈交感神経抑制作用は、セロトニンを介した作用であることを示している。

Claims (6)

1. ラクトバチラス・ブッヒネリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｕｃｈｎｅｒｉ）グループに属する乳酸菌、ペディオコッカス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）グループに属する乳酸菌、ラクトバチラス・プランタルム（ｐｌａｎｔａｒｕｍ）グループに属する乳酸菌、ラクトバチラス・ロイテリ（ｒｅｕｔｅｒｉ）グループに属する乳酸菌及びラクトバチラス・カゼイ（ｃａｓｅｉ）グループに属する乳酸菌からなる群より選ばれる菌株の菌体又はその処理物を有効成分として含有するセロトニン分泌促進剤（但し、以下の式（Ｉ）：
   

   

   
   の化合物を有効成分として含有するものを除く。）。
2. 前記菌株が、ラクトバチラス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）に属する菌株である、請求項１に記載のセロトニン分泌促進剤。
3. 皮膚血流促進剤である、請求項１又は２に記載のセロトニン分泌促進剤。
4. 請求項１〜３のいずれか一項に記載のセロトニン分泌促進剤を含有するセロトニン分泌促進用医薬品（但し、前記式（Ｉ）の化合物を有効成分として含有するものを除く。）。
5. 請求項１〜３のいずれか一項に記載のセロトニン分泌促進剤を含有するセロトニン分泌促進用飲食品（但し、前記式（Ｉ）の化合物を有効成分として含有するものを除く。）。
6. 請求項１〜３のいずれか一項に記載のセロトニン分泌促進剤を含有するセロトニン分泌促進用飲食品添加物（但し、前記式（Ｉ）の化合物を有効成分として含有するものを除く。）。

Images