JP6644731B2 - 気分障害および自殺を誘発する、薬剤の潜在的なリスクの評価：専用プラットフォームの使用 - Google Patents

Description

発明の背景

本発明は、試験化合物の潜在的な毒性を決定するためのイン・ビトロの方法に関する。本発明は、また、セロトニン２Ｃ受容体（５ＨＴＲ２Ｃ）のＡＤＡＲ依存性Ａ−ｔｏ−Ｉ ｍＲＮＡ編集のｍＲＮＡ編集メカニズムの変化に関連する病状の処置に有用な治療化合物を選択するためのイン・ビトロの方法に関する。最後に、本発明は、これらの方法を実施するためのキットおよびツールに関する。本発明は、薬剤開発および／または医薬組成物における毒性の分析または化合物のスクリーニングのための医薬産業において特に有用である。

毒性は、前臨床および臨床開発中の候補治療分子を断念する主要な理由である。確かに、現在は、ヒトにおける化合物の毒性を素早く決定する試験を提供することが必要である。一般的に、そのような試験は長くかかるものであり、高価であり、部分的にしか満足いかないものである。例えば、動物毒性は、ヒト毒性を少しも反映しない。さらに、臨床試験に参加する患者数が少ないことにより、小さい特異的な集団に付随する毒性を体系的に同定することができない。そのような試験の開発、完成および使用により、より上流で毒性化合物を同定し、開発工程から除くことが可能となる。この方法により、新薬をより早く、製薬会社のコストを、そして次々に、医療機関や消費者のコストを低減させて、市場に出すことができる。加えて、そのような試験は、また、現在のところ市販後にのみ明るみに出るいくつかの毒性を検出することを可能にする。

遺伝子関連解析、ノックアウトマウスおよび死後分析により、精神神経性障害におけるセロトニン２Ｃ受容体（ＨＴＲ２Ｃ）の関与が示唆されている。第一に、ＨＴＲ２Ｃの対立遺伝子の機能多型（Ｃｙｓ２３Ｓｅｒ）が、うつ病や双極性障害に関連している（Lerer et al., 2001, MoI. Psychiatry, 6: 579-585）。第二に、５−ＨＴ２Ｃセロトニン受容体欠損マウスが、自発的痙攣、認知障害および摂食行動の異常制御を示す（Tecott et al., 1995, Nature, 374:542-546）。これらの動物は、また、繰り返しストレスに対して過敏反応性である（Chou-green et al., 2003, Physiol. Behav., 79:217-226）。第三に、双極性障害または統合失調症に冒された患者の死後の脳において、５−ＨＴ２Ｃセロトニン受容体のＲＮＡ発現が下方制御されている（Iwamoto et al., 2004, MoI. Psychiatry, 9: 406-416; Castensson et al., 2003, Biol. Psychiatry, 54: 1212-1221）。ＨＴＲ２ＣのＲＮＡ編集は、また、精神疾患の病態生理学および抗うつ剤の作用に関与していると考えられている（Seeburg, 2002, Neuron, 35: 17-20）。５−ＨＴ２Ｃセロトニン受容体の二番目の細胞内ループをコードする領域内において、（Ａ、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥまたはＣ’と命名された）５つのアデノシン残基が編集され、受容体配列の異なる３つの位置でアミノ酸の置換が生じうる。これらのアミノ酸残基の置換の組み合わせにより、様々なＧ共役効率を有する２４の異なるＨＴＲ２Ｃタンパク質アイソフォームが生み出される（Price et al., 2001, J. Biol. Chem., 276: 44663-44668）。マウスでは、Ｃ５７ＢＬ／６および１２９ｓｖの近交系の系統と比較した場合に、ＢＡＬＢ／ｃ系統は、ストレス応答における違いの基礎となる、前脳基底核新皮質の異なる５−ＨＴ２Ｃ プレｍＲＮＡ編集パターンを見せる。さらに、ＢＡＬＢ／ｃマウスは、自殺したうつ病の罹病者の脳で検出される変化に似た、５−ＨＴ２Ｃ プレｍＲＮＡ編集のストレス誘発性の変化を見せる（Englander et al., 2005, J. Neurosci., 25: 648-651）。実際、死後の脳におけるＨＴＲ２ＣのＲＮＡ編集の変化が、統合失調症およびうつ病の患者ならびに自殺者において報告されている（Niswender et al., 2001, Neuropsychopharmacology, 24: 478-491; Sodhi et al., 2001, MoI. Psychiatry, 6:373-379; Gurevich et al., 2002, Neuron, 34: 349- 356; Dracheva S. et al. 2008, Molecular Psychiatry 13, 1011-10）。加えて、インターフェロンａがＣ型肝炎の処置に用いられ、しばしば、うつ病の兆候がこの分子の副作用として表われるが、Ｙａｎｇらは、この分子が５ＨＴ２Ｃ受容体の編集を強力に変化させることを明らかにした（Tohda et al., 2006, J. Pharmacol Sci, 100, 427-432の参照文献を参照）。

５−ＨＴ２Ｃセロトニン受容体が、主に脳、特に脈絡叢、前頭前野皮質、辺縁系領域、大脳基底核および視床下部において発現していることが最近の研究で示されている（Tohda et al., 1996, Neurosci. Res., 24: 189-193; Julius et al., 1988, 241 : 558-564; Pasqualetti et al., 1999, Neuroscience, 92: 601-611）。この脳特異的な発現パターンが、ＨＴＲ２ＣＲＮＡ編集と精神医学的状況との間に存在する潜在的なつながりの研究を検死の研究に制限する。

最近、全組織ＲＮＡに由来する５−ＨＴ２ＣＲの完全な編集プロフィールを、１回のアッセイで定量できる新しい方法が開発された（Poyau et al, 2007, Electrophoresis, 28, 2843-52）。それは、組織サンプル中に含まれる特異的なｍＲＮＡ分画における編集および非編集アイソフォームの各々のパーセンテージを決定する。それは、マウス、ラットおよびヒトの特異的な脳領域における編集の変動の評価によく適合する。この種の技術により、初代培養神経細胞における編集プロフィールの分析に成功してきた（Chanrion B., et al., Molecular Pharmacol, 2008, 73, 748-57）。

ＡＤＡＲ１イソ酵素が部位Ａ、Ｂ並びに同様にＣおよびＥを編集し、ＡＤＡＲ２が部位ＤおよびＣおよびＥを編集するから、この評価における本発明者の主要な関心は、編集イソ酵素ＡＤＡＲ１ａ、１ｂ、ＡＤＡＲ２の活性の指数をその特性から抽出することを可能にすることである。従って、部位Ａおよび／またはＢが編集されているアイソフォームは、Ｄ部位が編集されていない場合（編集されたアイソフォーム：Ａ、ＡＢ、ＡＢＣ、ＡＢＣＥ、ＡＢＥ、ＡＣ、ＡＣＥ、ＡＥ、Ｂ、ＢＣ、ＢＣＥ、ＢＥ）には単独で働き、あるいは、アイソフォームが編集されたＤ部位を提示する場合（編集されたアイソフォーム：ＡＢＣＤ、ＡＢＣＤＥ、ＡＢＤ、ＡＢＤＥ、ＡＣＤ、ＡＣＤＥ、ＡＤ、ＡＤＥ、ＢＣＤ、ＢＣＤＥ、ＢＤ、ＢＤＥ、Ｃ、ＣＥ、Ｅ）にはＡＤＡＲ２と共に働くＡＤＡＲ１イソ酵素により変換されることが実際に認められる。

部位Ａおよび／またはＢが編集されておらず、Ｄ部位が編集されたアイソフォームは、ＡＤＡＲ２単独の働きの結果であると考えられる。

この５ＨＴ２ＣＲの完全な編集プロフィールの分析と共に、本発明者らは相補的なアプローチとしてのＡＤＡＲイソ酵素の発現の評価が、特に、編集装置の調節不全の一般的編集状況の評価に良く適していることを明らかにした。それはＡＤＡＲイソ酵素の発現の量的および質的分析を含む（ｍＲＮＡ、すなわち、定量的ＲＴ−ＰＣＲにより、および／または、対応するコードされたタンパク質、すなわち、ウェスタンブロットにより）。

てんかん薬に対する、抗うつ剤および抗精神病薬に対する自殺リスクに関する米国食品医薬品局（ＦＤ）の特別な警告の考慮。例えば、最近、抗肥満薬アコンプリア（商標）（リモナバン）が、一部の患者で自殺行動および他の心理学的副作用の引き金を引くことが明らかとなり、これらの公知の神経精神医学的副作用は、ＦＤＡおよび欧州医薬品庁がこの新薬の肯定的なリスク−ベネフィットの比率を理解することを困難にしており、最終的にその副作用のために市場から新薬を引き下げることが忠告された。

上述のように、特に市販前に、ヒトにおける薬剤の毒性や潜在的な副作用の特性を迅速に決定できる試験を提供する必要がある。

これが、例えば、前臨床の段階で、新しい治療分子の編集調節に対する潜在的な影響を評価しようとする専用プラットフォームを開発することを本発明者らが決意した理由であるが、それは、うつ病、精神病に苦しむ患者、または自殺した患者において編集が変化していることが既に見いだされていたからである。

本発明者らは、
−編集酵素ＡＤＡＲ１ａ、ＡＤＡＲ１ｂおよびＡＤＡＲ２並びに５−ＨＴ２Ｃ受容体を発現する特定の哺乳類細胞株、特にヒト細胞株を用いて、および
−対照細胞および試験化合物で処理した細胞の間で、
ａ）これらの編集酵素の活性（細胞ＲＮＡ抽出物中で測定された５−ＨＴ２ＣＲｍＲＮＡの同定された各アイソフォームの平均比率を与える編集プロフィールの分析により得られる）；および／または
ｂ）これら編集酵素ＡＤＡＲ１ａ、ＡＤＡＲ１ｂおよびＡＤＡＲ２の定量的な発現（すなわち、Ｑ−ＰＣＲによる、またはウェスタンブロットによる）
を比較することにより、
これらの化合物が５−ＨＴ情報伝達の慢性的な変化により精神状態が変わる起こり得るリスクを予想できることを明らかにした。

ここで、本発明は、試験化合物の効率の潜在的な毒性を決定するための迅速かつ効果的な方法、ならびにそのような方法を実施するためのツールおよびキットを開示する。

従って、本発明は、患者への試験化合物の投与後に起こりうる試験化合物の潜在的な毒性若しくは副作用の決定または予測のためのイン・ビトロの方法であって、
ａ）哺乳類細胞を含む生体サンプルを得る工程（ここで、前記哺乳類細胞は、編集酵素ＡＤＡＲ１ａ、ＡＤＡＲ１ｂおよびＡＤＡＲ２ならびにセロトニン２Ｃ受容体（５ＨＴＲ２Ｃ）を発現する）；
ｂ）前記哺乳類細胞と試験化合物とを接触させる工程；
ｃ）同一の細胞抽出物において、
−細胞ＲＮＡ抽出物中で測定される５−ＨＴ２ＣＲ ｍＲＮＡの同定された各アイソフォームの平均比率を与える編集プロフィール、および／または
−前記編集酵素ＡＤＡＲ１ａ、ＡＤＡＲ１ｂおよびＡＤＡＲ２の定量的発現
を決定する工程；
ｄ）試験化合物で処理した前記細胞と、非処理の対照細胞または対照化合物に接触させた細胞との間で、工程ｃ）において得られた結果を比較する工程
を含んでなる方法に関する。

発明の具体的説明

本発明の文脈において、用語「毒性」とは、細胞または組織の代謝に対する化合物の有害な作用および／または副作用を指し、より一般的には、患者に対して化合物の有害な効果を引き起こす代謝の変化、特に、本発明の文脈では、気分障害および自殺を誘発する薬剤の潜在的なリスクを指す。

用語「試験化合物」とは、一般的に、試験対象にさらす化合物を指す。典型的な試験化合物は、小有機分子であり、典型的には薬剤および／または期待される薬学上のリード化合物であるが、タンパク質、ペプチド、ポリヌクレオチド、異種遺伝子（発現系における）、プラスミド、ポリヌクレオチド類似体、ペプチド類似体、脂質、炭化水素、ウイルス、ファージ、寄生生物などを包含する。

用語「対照化合物」とは、試験化合物とは如何なる生理活性を共有することも知られていない化合物を指し、本発明の実施において、グループシグネチャとドラッグシグネチャ（Group Signatures and Drug Signatures）を得る際に、「活性」（試験）化合物と「不活性」（対照）化合物とを対比させるために用いられる。典型的な対照化合物としては、以下に限定されないが、試験化合物の適応症とは全く異なった障害の処置に用いる薬剤、賦形剤、試験作用剤の不活化版、既知の不活性化合物などが挙げられる。

第二の側面では、本発明は、また、５−ＨＴＲ２ＣのＡＤＡＲ依存性Ａ−ｔｏ−Ｉ ｍＲＮＡ編集のｍＲＮＡ編集メカニズムの変化に関連する病状の処置に有用な治療薬を選択するイン・ビトロの方法であって、
ａ）哺乳類細胞を含む生体サンプルを得る工程（ここで、前記哺乳類細胞は、編集酵素ＡＤＡＲ１ａ、ＡＤＡＲ１ｂおよびＡＤＡＲ２並びに５−ＨＴ２Ｃ受容体を発現している）；
ｂ）前記哺乳類細胞と試験化合物とを接触させる工程；
ｃ）同一の細胞抽出物において：
−細胞ＲＮＡ抽出物において測定される５−ＨＴ２ＣＲ ｍＲＮＡの同定された各アイソフォームの平均比率を与える編集プロフィール、および／または、
−前記編集酵素ＡＤＡＲ１ａ、ＡＤＡＲ１ｂおよびＡＤＡＲ２の定量的な発現
を決定する工程；
ｄ）試験化合物で処理した前記細胞と未処理の対照細胞または対照化合物と接触させた細胞との間で、工程ｃ）で得られた結果を比較する工程；
ｅ）試験化合物が、得たいと望まれるＨＴ２ＣＲ編集プロフィールおよび／または編集酵素ＡＤＡＲ１ａ、ＡＤＡＲ１ｂおよびＡＤＡＲ２活性に変化を示すか、示さないかで、試験化合物を選択する工程
を含んでなる方法に関する。

好ましい態様では、本発明は、試験化合物の潜在的な毒性若しくは副作用を決定するための若しくは予測するための、または治療化合物を選択するためのイン・ビトロの方法であって、工程ｃ）が同一細胞抽出物中で、
−細胞ＲＮＡ抽出物中で測定される５−ＨＴ２ＣＲ ｍＲＮＡの同定された各アイソフォームの平均比率を与える編集プロフィール、および、場合によって、
−前記編集酵素ＡＤＡＲ１ａ、ＡＤＡＲ１ｂおよびＡＤＡＲ２の定量的発現
を決定することを含んでなる、方法に関する。

さらにより好ましい態様では、本発明は、試験化合物の潜在的な毒性若しくは副作用を決定するための若しくは予測するための、または治療化合物を選択するためのイン・ビトロの方法であって、工程ｃ）が同一細胞抽出物中で、
−細胞ＲＮＡ抽出物中で測定される５−ＨＴ２ＣＲ ｍＲＮＡの同定された各アイソフォームの平均比率を与える編集プロフィール、および、
−前記編集酵素ＡＤＡＲ１ａ、ＡＤＡＲ１ｂおよびＡＤＡＲ２の定量的発現
を決定することを含んでなる、方法に関する。

好ましい態様では、本発明の方法の工程ａ）において、前記哺乳細胞が、５ＨＴ２ＣＲ
ｍＲＮＡのかなりの数の編集アイソフォームを発現する能力を有し、これらの細胞において、これらのＡＤＡＲ１ａ、ＡＤＡＲ１ｂおよびＡＤＡＲ２酵素が受容体の様々な編集アイソフォームの産生を活発に制御することを示す。

より好ましくは、これらの哺乳類細胞は、少なくとも編集を受けた部位Ａ、Ｂ並びに同様にＣおよびＥを提示することができ、Ａ、ＡＢ、ＡＢＣ、ＡＢＣＥ、ＡＢＥ、ＡＣ、ＡＣＥ、ＡＥ、Ｂ、ＢＣ、ＢＣＥ、ＢＥの編集アイソフォームからなる群から選択される、少なくとも１、好ましくは、２、３、４、５、６、７、６、９、１０、１１および１２の編集ＡＤＡＲ１アイソフォームを、編集アイソフォームＡＢＣＤ、ＡＢＣＤＥ、ＡＢＤ、ＡＢＤＥ、ＡＣＤ、ＡＣＤＥ、ＡＤ、ＡＤＥ、ＢＣＤ、ＢＣＤＥ、ＢＤ、ＢＤＥ、Ｃ、ＣＥ、Ｅの群から選択される編集されたＤ部位をも提示する、少なくとも１，好ましくは、２、３、４、５、６、７、６、９、１０、１１、１２、１３、１４および１５のアイソフォームと共に提示することができる哺乳類細胞がより好ましい。

工程ａ）における本発明の方法の好ましい態様では、前記哺乳類細胞は細胞株、特にヒト、マウスまたはラット由来の細胞株である。

工程ａ）における本発明の方法のより好ましい態様では、前記哺乳類細胞は５ＨＴ２ＣＲ、ＡＤＡＲ１およびＡＤＡＲ２酵素、好ましくは、ＡＤＡＲ１ａ、ＡＤＡＲ１ｂおよびＡＤＡＲ２酵素の一定かつ構成的な発現を示す哺乳類細胞株、特にヒト、マウスまたはラット由来の哺乳類細胞株である。

「５ＨＴ２ＣＲ、ＡＤＡＲ１およびＡＤＡＲ２酵素、好ましくは、ＡＤＡＲ１ａ、ＡＤＡＲ１ｂおよびＡＤＡＲ２酵素の一定かつ構成的な発現を示す」特徴は、処理した細胞との信頼できる比較データを得るために細胞（対象細胞）を培養し、処理しないときに、５ＨＴ２ＣＲ、ＡＤＡＲ１およびＡＤＡＲ２酵素の内容の発現が一定であるという意味においてとても重要である。

例えば、本発明者らは、驚くべきことに、ＨＴＢ−１４細胞（神経膠腫細胞株）が、一定かつ構成的な５ＨＴ２ＣＲを十分に発現しないこと、および本発明の方法において哺乳類細胞株として用いることができないことを示している（実施例５ 表５参照）。

試験化合物の潜在的な毒性若しくは副作用を予想したり、若しくは本発明による治療化合物を選択したり、または、５ＨＴ２ＣＲ編集の変化に対する試験化合物の効果を比較して新しい基準化合物（インターフェロンアルファのような）を見つけ、これらの基準化合物（本発明の方法で用いられる哺乳類細胞株（神経芽細胞腫細胞株（すなわち、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ）などが挙げられ、潜在的な毒性または副作用が知られている）について、これらの基準化合物の既知の変化および毒性／副作用の観点から、５ＨＴ２ＣＲの編集の変化に対する影響が研究されている基準化合物のパネル）の既知の変化および毒性／副作用の観点で潜在的な毒性若しくは副作用を予想したりするには、編集酵素ＡＤＡＲ単独の発現では不十分である。

実際、ＡＤＡＲの定量的な発現は、５ＨＴ２Ｃの編集に対するそれらの組み合わされた効果を予測するには不十分である。ＡＤＡＲの定量アッセイは、活性のアッセイではなく、５ＨＴ２Ｃの編集が実際に変化する場合は、すべての５ＨＴ２Ｃアイソフォームの分布を決定することだけが重要であることを本発明者らは示している。これが、編集酵素の作用と関連したすべての５ＨＴ２Ｃアイソフォームの分布を決定することが好ましい理由である。

工程ａ）における本発明の方法のさらにより好ましい態様では、前記哺乳類細胞は哺乳類細胞株、特にヒト、マウスまたはラット由来の哺乳類細胞株であって、以下の特徴を有する哺乳類細胞株である：
１）５ＨＴ２ＣＲ、ＡＤＡＲ１およびＡＤＡＲ２酵素、好ましくは、ＡＤＡＲ１ａ、ＡＤＡＲ１ｂおよびＡＤＡＲ２酵素の一定かつ構成的な発現を有し、
２）前記哺乳類細胞が、５ＨＴ２ＣＲの編集を変化させる能力を有する薬剤で処理されたときに、
−かなりの数の５ＨＴ２ＣＲの編集アイソフォームを発現させる能力を有し、
−好ましくは、前記哺乳類細胞を５ＨＴ２ＣＲの編集を変化させる能力を有する薬剤で処理したときに、少なくとも編集を受けた編集部位Ａを示す少なくとも１種の５ＨＴ２ＣＲアイソフォームを、少なくとも編集を受けた編集部位Ｂを示す少なくとも１種の５ＨＴ２ＣＲアイソフォームを、少なくとも編集を受けた編集部位Ｃを示す少なくとも１種の５ＨＴ２ＣＲアイソフォームを、少なくとも編集を受けた編集部位Ｄを示す少なくとも１種の５ＨＴ２ＣＲアイソフォームを、および少なくとも編集を受けた編集部位Ｅを示す少なくとも１種の５ＨＴ２ＣＲアイソフォームを、好ましくは、非編集の５ＨＴ２ＣＲアイソフォームと共に発現する能力を有し、
−より好ましくは、すべての５ＨＴ２ＣＲの編集および非編集アイソフォームを発現することができる。

特定の態様では、５ＨＴ２ＣＲ薬の存在下で、５ＨＴ２ＣＲの変化を示し、かつある５ＨＴ２ＣＲを発現するその能力で、前記細胞株を試験し、選択しなければならないときに、５ＨＴ２ＣＲの編集を変化させる能力を有する前記薬剤は、インターフェロンアルファである。

工程ａ）における本発明の方法のより好ましい態様では、前記哺乳類細胞は、５ＨＴ２ＣＲ、ＡＤＡＲ１およびＡＤＡＲ２酵素、好ましくは、ＡＤＡＲ１ａ、ＡＤＡＲ１ｂおよびＡＤＡＲ２酵素の一定かつ構成的な発現を示す哺乳類細胞株、特にヒト、マウスまたはラット由来の哺乳類細胞株である。

工程ａ）における本発明の方法のさらにより好ましい態様では、前記哺乳類細胞は、哺乳類細胞株、特にヒト、マウスまたはラット由来の哺乳類細胞株であって、以下の特徴を有する哺乳類細胞株である：
ａ）５ＨＴ２ＣＲ、ＡＤＡＲ１およびＡＤＡＲ２酵素、好ましくは、ＡＤＡＲ１ａ、ＡＤＡＲ１ｂおよびＡＤＡＲ２酵素の一定かつ構成的な発現を有し、
ｂ）−前記哺乳類細胞を５ＨＴ２ＣＲの編集を変化させる能力を有する薬剤で処理したときに、かなりの数の５ＨＴ２ＣＲ編集アイソフォーム、好ましくは、すべての５ＨＴ２ＣＲ編集アイソフォームを発現する能力を有する｛ここで、５ＨＴ２ＣＲの編集を変化させる能力を有する薬剤が、科学者の共同体および／または米国食品医薬局（ＦＤ）から、精神のまたは精神神経性の副作用などの、前記薬剤を与えられた一部の患者における副作用のリスクについての警告を呈する既知の薬剤であって、この変化がこの警告と関連しうる｝。

工程ａ）における本発明の方法のさらにより好ましい態様では、前記哺乳類細胞は、神経芽細胞腫細胞株由来であり、特にヒト神経芽細胞腫細胞株由来である。

工程ａ）における本発明の方法の好ましい態様では、前記哺乳類細胞は、ヒト、マウスまたはラット由来であり、より好ましくは、前記哺乳類細胞は、神経芽細胞腫細胞株由来、特にヒト神経芽細胞腫細胞株由来の細胞である。

工程ａ）における本発明の方法のより好ましい態様では、前記哺乳類細胞は、ヒト神経芽細胞腫ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞株由来、特に欧州細胞培養コレクション（European Collection of Cell Cultures）（ＥＣＡＣＣ）のＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞株番号ＥＣ９４０３０３０４である。

好ましい態様では、本発明の方法の工程ｃ）では、５−ＨＴ２ＣＲ ｍＲＮＡの同定された各アイソフォームの編集プロフィール、並びに前記編集酵素ＡＤＡＲ１ａ、ＡＤＡＲ１ｂおよびＡＤＡＲ２の定量的な発現は、同一の細胞抽出物中で決定される。

工程ｃ）における本発明の方法の好ましい態様では、５−ＨＴ２ＣＲ ｍＲＮＡの同定された各アイソフォームの編集プロフィール、並びに前記編集酵素ＡＤＡＲ１ａ、ＡＤＡＲ１ｂおよびＡＤＡＲ２の定量的な発現を同一の細胞抽出物中で決定する場合には、それらは同一の全ＲＮＡ細胞抽出物中で決定される。

工程ｃ）における本発明の方法の好ましい態様では、編集プロフィールの決定結果の分析により、これら編集酵素ＡＤＡＲ１ａ、ＡＤＡＲ１ｂおよびＡＤＡＲ２の活性指数を得ることができる。

より好ましい態様では、これら編集酵素の前記活性指数は以下の工程を含んでなる方法により算出される：
ａ）細胞ＲＮＡにおいて測定される５−ＨＴ２ｃＲ ｍＲＮＡの同定された各アイソフォームの平均比率（％）、好ましくは±ＳＥＭ（ｎ≧３、４、５および６）、または、少なくとも、工程ｃ）におけるシグネチャと関連して選ばれる編集部位（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄおよび／またはＥ編集部位）に対応するアイソフォームのセットの平均比率、または、少なくとも、対照および／または基準で処理したサンプルにおいて見いだされ、かつ、工程ｃ）におけるシグネチャと関連して選ばれる編集部位（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄおよび／またはＥ編集部位）に対応する主要なアイソフォームの平均的比率を決定する工程；
ｂ）場合によって、対照群および場合によって基準群、好ましくは基準の薬剤で処理した群と比較したときに、代数学的なデルタの関数においてこれらのアイソフォームを分類する工程；
ｃ）編集酵素の活性に関連する重要なシグネチャを、好ましくは、酵素活性の産物の分類によって、より好ましくは、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、およびＥ編集部位から選択される少なくとも、２、好ましくは、３、または４の編集部位の編集のパーセンテージを算出し、関連づける方法によって、より好ましくは、そのシグネチャの各部において見いだされるそれぞれの編集部位の編集のパーセンテージを算出し、関連づける方法によって、決定する工程；並びに
ｄ）場合によって、ＡＤＡＲ１の作用（ＡＤＡＲ Ｉ）またはＡＤＡＲ２（ＡＤＡＲ ＩＩ）と関連した、すべてのアイソフォームまたは選択されたアイソフォームにより表される％を測定することによって、発現した活性を分類する工程。

工程ａ）に関しては、それは、ある特定の編集作用だけを評価するため、例えば、部位ＣとＥのみ、ＡとＣのみ、ＡとＢのみ、または、ＡとＢとＣのみが編集されていると分かっている、酵素活性の産物の比率を同定するために選ばれうる。非編集アイソフォーム（ＮＥ）もまた、重要であり、その結果、選ばれる。

例えば、薬剤で処理された基準サンプルと比較したときに、対照サンプルと比較してこの処理により変化を受けると示された特定の編集作用（部位ＣとＥのみ、または、ＡとＣのみ、ＡとＢのみ、ＡとＢとＣのみが変化すると分かっている酵素活性）のみを評価するため、および従って、これらの特異的な酵素の対応する産物の比率のみを同定するために選ばれる。

なお一層より好ましい態様では、これらの編集酵素の前記活性指数は、少なくともＡＤＡＲ１単独の作用（ＡＤＡＲ１）およびＡＤＡＲ２の作用（ＡＤＡＲ２）による編集アイソフォームから算出される。

さらにより好ましい態様では、これらの編集酵素の前記活性指数は、ＡＤＡＲ１単独の作用による編集アイソフォームから、並びに、ＡＤＡＲ１およびＡＤＡＲ２の組み合わさった作用（ＡＤＡＲ１＋２）による編集アイソフォームから、および、ＡＤＡＲ２の排他的作用（ＡＤＡＲ２）から算出することができる。

なお一層より好ましい態様では、これらの編集酵素の前記活性指数を算出する方法の工程ａ）は、試験化合物と接触させた後の細胞ＲＮＡ抽出物中に存在し得る３２種の５−ＨＴ２ｃＲ ｍＲＮＡのすべてのアイソフォームの平均比率（％）、好ましくは±ＳＥＭ（ｎ≧３、４、５および６）を決定する工程を含んでなる。

工程ｃ）における本発明の方法の好ましい態様は、前記編集酵素ＡＤＡＲ１ａ、ＡＤＡＲ１ｂおよびＡＤＡＲ２の定量的な発現が、細胞抽出物中に発現する前記編集酵素のｍＲＮＡ発現の測定により、または、前記編集酵素タンパク質の測定により決定される。

本発明の方法の好ましい態様では、前記試験化合物の決定されるべき潜在的な毒性または副作用は、気分障害および自殺、特に精神障害、統合失調症、うつ病、うつ病による自殺または異常摂食行動を誘発する薬剤の潜在的なリスクである。

本発明の有望な薬剤化合物をスクリーニング、および／または選択する方法の好ましい態様では、投与後に５−ＨＴＲ２ＣのｍＲＮＡ編集の変化に関連する病状を処置するために、病状は、精神疾患、統合失調症、うつ病、うつ病による自殺または異常摂食行動から選択される。

工程ｂ）における本発明の方法の好ましい態様では、前記哺乳類細胞は、前記哺乳類細胞の培養に適したまたは好都合の培地、より好ましくは、５−ＨＴＲ２Ｃならびに編集酵素ＡＤＡＲ１（１ａおよび１ｂ）およびＡＤＡＲ２の発現に好都合な培地で試験化合物の存在下で培養される。

好ましくは、工程ｂ）において、前記哺乳類細胞は、５ＨＴ２ＣＲの編集アイソフォーム、および／またはＡＤＡＲ１ａ、ＡＤＡＲ１ｂおよびＡＤＡＲ２酵素が、試験化合物により修飾されるか否かによらず、それらの発現を変化させるために少なくとも十分な時間試験化合物の存在下で培養される。

好ましくは、工程ｂ）において、前記哺乳類細胞は、５−ＨＴ２ＣＲ ｍＲＮＡの同定された各アイソフォームの編集プロフィールおよび／または前記編集酵素ＡＤＡＲ１ａ、ＡＤＡＲ１ｂおよびＡＤＡＲ２の定量的発現を同一細胞抽出物中で決定する工程ｃ）の前に少なくとも１時間、より好ましくは、少なくとも５、１０、１６、２４および４８時間試験化合物の存在下で培養される。

編集の定常状態を決定する方法は、細胞抽出物中に発現するＡＤＡＲアイソフォームの正確な分布を決定することを可能とするネステッドＰＣＲ（nested type PCR）を伴って、細胞ＲＮＡ抽出物中で測定される５−ＨＴ２ＣＲ ｍＲＮＡの同定された各アイソフォームのプロフィールを決定すること、並びに、同一の抽出物中で、編集酵素の発現の定常状態を推定することを含む。これらは２００８年６月１３日にＰＣＴ／ＥＰ２００８０５７５１９として出願され、２００８年１２月１８日に公開された（国際公開第２００８／１５２１４６）、ＰＣＴ特許出願「Peripherical tissue sample containing cells expressing the 5HTR2C and/or ADARs as markers of the alteration of the mechanism of the 5HTR2C mRNA editing and its applications」においても見いだすことができる。

工程ｃ）における本発明の方法の好ましい実施態様では、細胞ＲＮＡ抽出物中で測定される５−ＨＴ２ＣＲの同定された各アイソフォームの平均比率を与える編集プロフィールが、２段階のＰＣＲを含んでなるネステッドＰＣＲにより決定され、ここで、１段階目のＰＣＲは以下のプライマーセットにより行われ：
マウスまたはラット哺乳類細胞株の場合：
順方向：５’−ＴＧＴＣＣＣＴＡＧＣＣＡＴＴＧＣＴＧＡＴＡＴＧＣ−３’（配列番号１）、
逆方向：５’−ＧＣＡＡＴＣＴＴＣＡＴＧＡＴＧＧＣＣＴＴＡＧＴＣ−３’（配列番号２）；
ヒト細胞株の場合：
順方向：５’−ＴＧＴＣＣＣＴＡＧＣＣＡＴＴＧＣＴＧＡＴＡＴＧＣ−３’（配列番号１）、
逆方向：５’−ＧＣＡＡＴＣＴＴＣＡＴＧＡＴＧＧＣＣＴＴＡＧＴＣ−３’（配列番号２）；
かつ、２段階目のＰＣＲは以下のプライマーセットにより行われる：
マウスまたはラット哺乳類細胞株の場合：
順方向：５’−ＴＴＴＧＴＧＣＣＣＣＧＴＣＴＧＧＡＴ−３’（配列番号５）、
逆方向：５’−ＧＣＣＴＴＡＧＴＣＣＧＣＧＡＡＴＴＧ−３’（配列番号６）；
ヒト細胞株の場合：
順方向：５’−ＡＴＧＴＧＣＴＡＴＴＴＴＣＡＡＣＡＧＣＧＴＣＣＡＴＣ−３’（配列番号３）、
逆方向：５’−ＧＣＡＡＴＣＴＴＣＡＴＧＡＴＧＧＣＣＴＴＡ−３’（配列番号４）。

本発明による方法の好ましい態様では、前記５ＨＴＲ２Ｃ ｍＲＮＡの編集および非編集の各形態の編集比率が、以下の工程を含んでなる方法により決定される：
Ａ）前記哺乳類細胞から全ＲＮＡを抽出する工程（適切な場合にはその後ｍＲＮＡの精製を行う）；
Ｂ）工程Ａ）で抽出されたＲＮＡを逆転写する工程；および
Ｃ）編集されうる編集部位を含む５ＨＴＲ２Ｃ ｍＲＮＡ断片に特異的な少なくとも１対のプライマーであって、ＲＮＡ抽出物中に存在しうるすべての編集形態および非編集形態を増幅できるように選択されたプライマーを用いて、工程Ｂ）で得られたｃＤＮＡをＰＣＲ増幅する工程。

本発明による方法の好ましい態様では、前記５ＨＴＲ２Ｃ ｍＲＮＡの編集および非編集の各形態の編集比率が、以下の工程を含んでなる方法により決定される：
Ａ）前記哺乳類細胞から全ＲＮＡを抽出する工程（適切な場合にはその後ｍＲＮＡの精製を行う）；
Ｂ）工程Ａ）で抽出されたＲＮＡを逆転写する工程；および
Ｃ）編集されうる編集部位を含む５ＨＴＲ２Ｃ ｍＲＮＡ断片に特異的な少なくとも１対のプライマーであって、ＲＮＡ抽出物中に存在しうるすべての編集形態および非編集形態を増幅できるように選択されたプライマーを用いて、工程Ｂ）で得られたｃＤＮＡをＰＣＲ増幅する工程
｛ここで逆転写の工程Ｂ）は、５ＨＴＲ２Ｃ遺伝子に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを用いて行われる｝。

本発明による方法の好ましい態様では、工程Ｃ）において、ＰＣＲ増幅工程（ネステッドＰＣＲの場合は２段階目）で用いられるプライマーは、標識されており、好ましくは、蛍光物質で標識されている。

工程ｃ）における本発明の方法の好ましい態様では、５−ＨＴ２ＣＲ ｍＲＮＡの同定された各アイソフォームの平均比率を与える編集プロフィールは、前記ｍＲＮＡの編集および非編集の個々の形態の各々に編集プロフィールを与える能力を有するＣＥ−ＳＳＣＰ法により決定され、ＣＥ−ＳＳＣＰ法は、工程Ａ）、Ｂ）およびＣ）の後に以下の工程を含んでなる：
Ｄ）適切な場合には、工程Ｃ）で得られたＰＣＲ産物を精製する工程；
Ｅ）適切な場合には、工程Ｄ）で得られたＰＣＲ産物を定量する工程；
Ｆ）二本鎖ｃＤＮＡを、具体的には加熱およびその後の急激な冷却により、一本鎖ｃＤＮＡに解離させる工程；
Ｇ）一本鎖ｃＤＮＡをキャピラリー電気泳動により分離する工程；並びに
Ｈ）蛍光の読み取りにより編集プロフィールを得る工程、および適切な場合には、蛍光リーダーに付随したオペレーティングシステムを用いてプロフィールデータを取得する工程。

工程ｃ）における本発明の方法の好ましい態様では、ＡＤＡＲ ｍＲＮＡのＰＣＲ増幅に特異的なプライマー対は、下記からなる群から選択される：
−ヒトＡＤＡＲ１−１５０アイソフォームｍＲＮＡ増幅：
順方向：５’−ＧＣＣＴＣＧＣＧＧＧＣＧＣＡＡＴＧＡＡＴＣＣ−３’（配列番号７）、
逆方向：５’−ＣＴＴＧＣＣＣＴＴＣＴＴＴＧＣＣＡＧＧＧＡＧ−３’（配列番号８）；
−ヒトＡＤＡＲ１−１１０アイソフォームｍＲＮＡ増幅：
順方向：５’−ＣＧＡＧＣＣＡＴＣＡＴＧＧＡＧＡＴＧＣＣＣＴＣＣ−３’（配列番号９）、
逆方向：５’−ＣＡＴＡＧＣＴＧＣＡＴＣＣＴＧＣＴＴＧＧＣＣＡＣ−３’（配列番号１０）；
−ヒトＡＤＡＲ２ ｍＲＮＡ増幅：
順方向：５’−ＧＣＴＧＣＧＣＡＧＴＣＴＧＣＣＣＴＧＧＣＣＧＣ−３’（配列番号１１）、
逆方向：５’−ＧＴＣＡＴＧＡＣＧＡＣＴＣＣＡＧＣＣＡＧＣＡＣ−３’（配列番号１２）；
−マウスＡＤＡＲ１−１５０アイソフォームｍＲＮＡ増幅：
順方向：５’−ＧＴＣＴＣＡＡＧＧＧＴＴＣＡＧＧＧＧＡＣＣＣ−３’（配列番号１３）、
逆方向：５’−ＣＴＣＣＴＣＴＡＧＧＧＡＡＴＴＣＣＴＧＧＡＴＡＣ−３’（配列番号１４）；
−マウスＡＤＡＲ１−１１０アイソフォームｍＲＮＡ増幅：
順方向：５’−ＴＣＡＣＧＡＧＴＧＧＧＣＡＧＣＧＴＣＣＧＡＧＧ−３’（配列番号１５）、
逆方向：５’−ＣＴＣＣＴＣＴＡＧＧＧＡＡＴＴＣＣＴＧＧＡＴＡＣ−３’（配列番号１４）；および
−マウスＡＤＡＲ２ ｍＲＮＡ増幅：
順方向：５’−ＧＣＴＧＣＡＣＡＧＴＣＴＧＣＣＴＴＧＧＣＴＡＣ−３’（配列番号１６）、
逆方向：５’−ＧＣＡＴＡＡＡＧＡＡＡＣＣＴＧＡＧＣＡＧＧＧＡＣ−３’（配列番号１７）。

本発明の方法の好ましい態様では、試験化合物は、同一の化合物を試験するに適した動物モデル、好ましくは、マウスまたはラットにイン・ビボで更に投与され、ここで、その動物モデルへの投与後のこの試験化合物の潜在的な毒性または副作用が、特に、全血液および皮膚サンプル、または脳に発現する５ＨＴＲ２Ｃおよび／またはＡＤＡＲアイソフォームのｍＲＮＡ編集の変化を評価することによって評価されうる（２００８年６月１３日にＰＣＴ／ＥＰ２００８０５７５１９として出願され、２００８年１２月１８日に国際公開第２００８／１５２１４６号公報として公開されたＰＣＴ国際特許出願に開示されているように評価されうる）。

もうひとつの側面では、本発明は、患者への試験化合物の投与後に試験化合物の潜在的な毒性若しくは副作用を決定するための、または５ＨＴＲ２ＣのＡＤＡＲ依存性Ａ−ｔｏ−Ｉ ｍＲＮＡ編集のｍＲＮＡ編集メカニズムの変化に関連する病状の処置に有用な治療化合物の選択のためのキットであって、
ａ）細胞株由来の哺乳類細胞であって、編集酵素ＡＤＡＲ１ａ、ＡＤＡＲ１ｂおよびＡＤＡＲ２並びにセロトニン２Ｃ受容体（５ＨＴＲ２Ｃ）を発現する哺乳類細胞；並びに
ｂ）前記哺乳類細胞のＲＮＡ抽出物中に存在しうる５−ＨＴ２ＣＲ ｍＲＮＡの各アイソフォームを、２段階のＰＣＲを含んでなるネステッドＰＣＲを伴うＣＥ−ＳＳＣＰ法により測定するための２セットのプライマー；および／または
ｃ）編集酵素ＡＤＡＲ１ａ、ＡＤＡＲ１ｂおよびＡＤＡＲ２の定量的発現を、定量的Ｑ−ＰＣＲにより測定するための１セットのプライマー
を含んでなるキットに関する。

本発明のキットの好ましい態様では、前記哺乳類細胞は、これらのＡＤＡＲ１ａ、ＡＤＡＲ１ｂおよびＡＤＡＲ２酵素がこれらの細胞内で受容体の様々な編集アイソフォームの産生をアクティブに制御していることを示す、かなりの数の５ＨＴ２ＣＲ ｍＲＮＡの編集アイソフォームを発現する能力を有する。

より好ましくは、これらの哺乳類細胞は、少なくとも編集された部位Ａ、Ｂ並びに同様にＣおよびＥを提示することができ、Ａ、ＡＢ、ＡＢＣ、ＡＢＣＥ、ＡＢＥ、ＡＣ、ＡＣＥ、ＡＥ、Ｂ、ＢＣ、ＢＣＥ、ＢＥの編集アイソフォームからなる群から選択される、少なくとも１、好ましくは、２、３、４、５、６、７、６、９、１０、１１および１２の編集ＡＤＡＲ１アイソフォームを、編集アイソフォームＡＢＣＤ、ＡＢＣＤＥ、ＡＢＤ、ＡＢＤＥ、ＡＣＤ、ＡＣＤＥ、ＡＤ、ＡＤＥ、ＢＣＤ、ＢＣＤＥ、ＢＤ、ＢＤＥ、Ｃ、ＣＥ、Ｅの群から選択される編集されたＤ部位を提示する、少なくとも１，好ましくは、２、３、４、５、６、７、６、９、１０、１１、１２、１３、１４および１５のアイソフォームと共に提示する哺乳類細胞である。

本発明のキットの好ましい態様では、前記哺乳類細胞は、ヒト、マウスまたはラット由来であり、より好ましくは、前記哺乳類細胞は、神経芽細胞腫細胞株由来の細胞、特にヒト神経芽細胞腫細胞株由来の細胞である。

本発明のキットのより好ましい態様では、前記哺乳類細胞は、ヒト神経芽細胞腫ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞株由来である。

特定の態様では、本発明は、特にＨＣＶ（Ｃ型肝炎ウイルス）に感染した患者のための、患者へのインターフェロンアルファ（ＩＦＮα）投与後のその処置の潜在的な毒性若しくは副作用を決定するための、または予測するためのイン・ビトロの方法であって、
ａ）前記処置患者由来の哺乳類白血球、好ましくは、白血球または単球細胞を含む生体サンプルを得る工程；
ｂ）ヒト白血球を含む前記生体サンプルの細胞抽出物中で、各編集酵素ＡＤＡＲ１ａ、ＡＤＡＲ１ｂおよびＡＤＡＲ２の定量的な発現、並びに、場合によって、細胞ＲＮＡ抽出物中に存在抽出物中で測定される５−ＨＴ２ＣＲ ｍＲＮＡの同定された各アイソフォームの平均比率を与える編集プロフィールを決定する工程；
ｄ）前記ＩＦＮα処理患者由来の前記細胞と、非処理対照細胞または対照化合物で処理した細胞との間で、工程ｂ）で得られた結果を比較する工程（ＩＦＮα処理細胞は、事前にＩＦＮα処理の最初にまたは最中に同一の患者から得た）
を含んでなる方法に関する。事前にＩＦＮαで処理した細胞は、ＩＦＮα処置の初期の、または処置中の同一の患者から取得した。

本発明は、試験化合物の潜在的な毒性を予測するための、またはセロトニン２Ｃ受容体（５ＨＴＲ２Ｃ）のＡＤＡＲ依存性Ａ−ｔｏ−Ｉ ｍＲＮＡ編集のｍＲＮＡ編集メカニズムの変化に関連する病状の処置に有用な治療化合物の選択のためのイン・ビトロの方法であって、
（ａ）哺乳類細胞株（好ましくは、本発明の方法のために描写された特徴を有するこれらの細胞株）、好ましくは、神経芽細胞細胞株、より好ましくは、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞株上で、５ＨＴ２ＣＲの編集を変化させるそれらの能力に基づいて、心理学的または神経心理学的な効果などの毒性若しくは副作用を有する、または有しないと知られている化合物をスクリーニングする工程；
（ｂ）前記スクリーニングに基づいて、基準パネルのメンバーを選択する工程であって、前記パネルが、５ＨＴ２ＣＲの編集を変化させるそれらの能力に関して異なっており、かつ、場合によって、それらの毒性または副作用に関して異なっていても良いメンバーを含んでなる、工程；
（ｃ）前記５ＨＴ２ＣＲの編集に関して未知の活性の試験化合物をスクリーニングし、５ＨＴ２ＣＲの編集の変化に対するその影響を決定し、それにより前記試験化合物に対する５ＨＴ２ＣＲの編集プロフィールと、場合によって、ＡＤＡＲの発現とを得る工程；
（ｄ）前記試験化合物と前記基準パネルとに対する５ＨＴ２ＣＲの編集プロフィールおよび、場合によって、ＡＤＡＲの発現を比較する工程；
（ｅ）試験化合物により引き起こされる５ＨＴＲ２Ｃの編集の変化が基準化合物の変化と同じであるとの推定に基づいて、試験化合物の潜在的な毒性を予測し、または５ＨＴＲ２ＣのｍＲＮＡ編集メカニズムの変化に関連する病状の処置に有用な有望な治療化合物として試験化合物を選択する工程であって、５ＨＴ２ＣＲの編集プロフィールおよび場合によってＡＤＡＲの発現を変化させるそれらの能力に基づいて前記哺乳類細胞上でスクリーニングする工程が、請求項１〜１５におけるような、上記の本発明の方法のために描写されたイン・ビトロの細胞ベースアッセイである点で同じである、工程
を含んでなる、方法にも関する。

最後に、本発明は、本発明によるキットを含んでなり、前記キットは、上記方法の工程ｂ）で選択される基準パネルおよび／または前記基準パネルに対する５ＨＴ２ＣＲの編集プロフィールおよび、場合によってＡＤＡＲの発現を更に含んでなる。

下記の実施例および下記の図面、説明文は、本発明を実施し用いることができるように、当業者に完全な記載を提供するために選ばれている。これらの実施例は、本発明者が発明であると考えるものの範囲を制限するためのものではなく、下記の実験のみが実施されることを示すことを意図したものでもない。

図１Ａおよび１Ｂは、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞のＡＤＡＲ１ａ ｍＲＮＡ濃度に対する、２４時間のヒトインターフェロンの使用の効果：ＥＣ５０％の決定を示す図である。 ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞中のＡＤＡＲ１ａ ＲＮＡの発現（Ｑ−ＰＣＲ、Ａｐｐｌｉｅｄ ＴａｑＭａｎプローブ 参照番号：Ｈｓ０１０２０７８０＿ｍ１）。 基準遺伝子：ＧＡＰＤＨ。 図２Ａ〜２Ｃは、ＩＮＦαで処理したＳＨ−ＳＹ５Ｙ培養細胞における編集プロフィールの変化が、ＡＤＡＲ１ａの発現の変化を反映していることを示す図である。 図２Ａ．対照（ｎ＝８）に対する処理皿（ｎ＝８）のＡＤＡＲ１ａ ｍＲＮＡのΔΔＣＴを、使用したＩＦＮα濃度のＬＯＧ１０に対してプロットした。最小二乗法により調整した双曲線関係の最適なフィッティングにより、最大効果とその平均±ＳＤ（ｎ＝４０）として見積もられるＩＣ５０％とを算出することが可能となる。 図２Ｂ．同じ実験を５−ＨＴ２ｃＲ ｍＲＮＡの増幅により行い、個別の各編集プロフィールの同定の後に、編集の変化の増加に続いてＮＥアイソフォームの顕著な減少がおこった。結果は、Ａに関しては、個々の値（ｎ＝４０）から算出した。 図２Ｃ．結果は、３種の編集アイソフォームＡＢ、ＡＢＣおよびＡＣの合計のプロフィールの分布により表される正の変動のパーセンテージの、ＩＮＦα濃度に対する関係に関する。ＡおよびＢにおけるような、最適なフィッティングにより、測定の個別の値（ｎ＝４０）から最大効果とＩＣ５０％とを見積もった。ＩＣ５０％は、培地のＩＵ／ｍｌとして表現される。対照に対して標準化されたΔΔＣＴとしてＡＤＡＲ１ａ ｍＲＮＡに対して決定された最大効果は、対象の平均を標準化して１とした場合、１０．５６のＱＲの平均算出値を与える。図２Ｂおよび２Ｃにおいて、Ｙ軸は、対照±ＳＥＭに対する絶対的な変動の平均値に対応する。最適なフィッティングの許容されるエラーは０．０１％であった。 図３は、可能性のある精神医学的リスクを評価するための基礎としての細胞モデルを示す図である。 受容体（５−ＨＴ２ｃＲ）ｍＲＮＡ編集＜シグネチャ＞が、うつ病／自殺患者の３つの大脳辺縁系（背側前頭前野（ＤＰＦＣｘ））、前帯状皮質（ＡＣＣｘ）および嗅内皮質（嗅内Ｃｘ）において評価された。このシグネチャは、平均値を対照群の患者における平均値と比べたときに、同定された各編集アイソフォームのそれぞれの比率の分布の変動に対応した（表７参照）。これらは、まず、個々のデルタの代数学的平均により分類され、その後、統計学的な成分分析により処理された。各成分は各アイソフォームの比率として定義され、その中では、例えばＡおよびＢ部位、ＡおよびＣ部位またはＡ、ＢおよびＣ部位などが編集されていることが見いだされた。黒およびグレーの三角は、それぞれ、有意であると認定された場合（ｐ＜０．０５）に、定義された成分の正のおよび負の平均変動を表す。 図４は、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ培養細胞における５−ＨＴ２ｃＲ ｍＲＮＡの編集プロフィールの一定の統計学的な成分分析から検出される編集活性の変化を引き起こす薬剤のイン・ビトロのプロファイリングの典型例を示す図である。各試験分子に対して有意と判明したシグネチャの成分が黒（正の変動）およびグレー（負の変動）により表される。各成分に対して、変化は、シグネチャの正のおよび／または負の部分に影響し、その総計を変化させることが見いだされ得る。成分の選択は、図３で表される自殺患者とＩＦＮαで処理したＳＨ−ＳＹ５Ｙ培養細胞とにおいて行われた分析の比較から直接的に得られる。＊は、対応する分子が、処置の間、気分障害および自殺のリスクに対するＦＤＡの精神医学的警告の対象であることを示す。 図５は、ＩＦＮαで処理したＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞におけるＡＤＡＲ１ａ ｍＲＮＡおよびタンパク質の発現を示す図である。 タンパク質抽出物ＳＤＳは、ニトロセルロース膜に転写された。構成的（ｐ１１０）および誘導性（ｐ１５０）ＡＤＡＲ１アイソフォームの両方に対応するバンドは、矢印で示した。タンパク質スタンダードも同様に描かれている（ＭＷ２５０、１５０および１００ｋＤ）。

実施例１．細胞培養および薬物処理
１０種の異なる細胞株から、下記の条件で用いたときに最も興味深いものとしてＳＨ−ＳＹ５Ｙヒト神経芽細胞腫細胞株を選択した。

ＳＨ−ＳＹ５Ｙヒト神経芽細胞腫細胞株は、ＥＣＡＣＣ（欧州細胞培養コレクション（ＥＣＡＣＣ）のＥＣ９４０３０３０４）から購入した。細胞株ＳＨ−ＳＹ５Ｙは、１９７８年に最初に報告され、元々はＳＫ−Ｎ−ＳＨから三回クローンした神経芽細胞腫である。ＳＨ−ＳＹと呼ばれるＳＫ−Ｎ−ＳＨの神経芽細胞様サブクローンは、ＳＨ−ＳＹ５としてサブクローンされ、さらにＳＨ−ＳＹ５Ｙとしてサブクローンされた（Biedler JL et al. Cancer Res. 1978; 38:3751-7）。１０％透析ＦＣＳ（ＰＡＡ、参照番号：Ａ１５−５０７、ロット：Ａ５０７０８−００５０）、２ｍＭグルタミン（シグマ社製、Ｇ７５１３）および１×の抗生−抗真菌安定化（Antibiotic- Antimycotic Stabilized）（シグマ社製、参照番号：Ａ５９５５）混合物を補填した高グルコースＤ−ＭＥＭ培地（シグマ社製、参照番号：６５４６）で、５％ＣＯ_２の加湿雰囲気下３７℃で、細胞を培養した。
薬剤またはｈＩＦＮα処理の前日に、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞を６ウェルプレートに１０^６細胞／ウェルの濃度で播種した。一つの６ウェルプレートを一つの実験条件で用いた（濃度または処理時間）。播種の翌日に、培地を取り除き、細胞を１０μＭの試験化合物溶液または１０００ＩＵ／ｍｌのｈＩＦＮα（ＰＢＬバイオメディカルラボラトリーズ社製）溶液で２４時間インキュベートした。ｈＩＦＮαの用量応答実験のために、細胞を１、１０、１００および１０００ＩＵ／ｍｌのｈＩＦＮα溶液でインキュベートした。ｈＩＦＮαのタイムコース実験のために、細胞を１０００ＩＵ／ｍｌのｈＩＦＮα溶液で２４、４８および７２時間処理した。様々な処理の後で、細胞をＲＬＴ溶解緩衝液内に直接溶解し、全ＲＮＡを製造者のプロトコルに従って精製した（キアゲン社製、ＲＮｅａｓｙ Ｐｌｕｓ ｍｉｎｉキット、参照番号：７４１３４）。その後、Ｔｈｅｒｍｏｓｃｒｉｐｔ ＲＴ−ＰＣＲシステムＰｌｕｓＴａｑ（インビトロジェン社製、１１１４６−０３２）で全ＲＮＡを逆転写し、得られたｃＤＮＡをＣＥ−ＳＳＣＰおよび定量的リアルタイムＰＣＲに用いた。

実施例２．ｍＩＦＮαおよび薬剤処理用のイン・ビボ プロトコル
ｍＩＦＮαの実験のために、８匹の雄（Ｂａｌｂ／ｃＪマウス、チャールズ・リバー社製）に１００００ＩＵのｍＩＦＮα（ＰＢＬバイオメディカルラボラトリーズ社製）を一度にｉ．ｐ．経路で注射した。対照マウスは、滅菌リン酸緩衝生理食塩水で同じ経路で注射した。注射の８時間後に、動物を断頭し、全血液、腹側の皮膚および脳を回収した。全ＲＮＡを、血液の場合は、マウスＲｉｂｏＰｕｒｅ血液ＲＮＡ単離キット（Ａｍｂｉｏｎ社製、参照番号：１９５１）で、皮膚の場合は、組織破壊後にＴＲＩｚｏｌ試薬（インビトロジェン社製、参照番号：１５５９６−０２６）で、脳の場合は、ＲＮｅａｓｙ 脂質ｍｉｎｉキット（キアゲン社製、参照番号：７４８０４）を用いて精製した。その後、全ＲＮＡをＴｈｅｒｍｏｓｃｒｉｐｔＲＴ−ＰＣＲシステムＰｌｕｓＴａｑ（インビトロジェン社製、１１１４６−０３２）を用いて逆転写し、得られたｃＤＮＡをＣＥ−ＳＳＣＰおよび定量的リアルタイムＰＣＲに用いた。ＳＳＣＰ決定に用いた方法は、マウスおよびヒトサンプルに関して既に記載されている（２００８年６月１３日に出願された特許ＰＣＴ／ＥＰ２００８／０５７５１９）。

抗精神病薬、抗うつ薬および自殺警戒薬の場合は、様々な化合物を最初は溶媒（ＤＭＳＯ／エタノール／水：５０％／１５％／３５％）に溶かして、継続的かつ均一なドラッグデリバリーのためにＡｌｚｅｔポンプ（Ａｌｚｅｔ社製、参照番号２００２、チャールズ・リバー社、フランスから注文した）を用いて雄Ｂａｌｂ／ｃＪマウスに投与した。対照群では、８匹のマウスを溶媒単独で処理した。試験群では、８匹のマウスを３．５または７．０ｍｇ／ｋｇ／日で溶媒で即時に溶かした化合物で処理した。Ａｌｚｅｔポンプでのドラッグデリバリーの１５日の後に、動物を断頭した。上記のように全血液および皮膚のサンプル並びに脳を回収した。全ＲＮＡを精製し、上記のように逆転写した。

実施例３．５−ＨＴ２ｃＲ ｍＲＮＡの発現しているすべての編集および非編集アイソフォームの分布の全プロフィール；リアルタイムＰＣＲ分析による５−ＨＴ２ｃＲ（全体）とＡＤＡＲ ｍＲＮＡの発現の定量

３Ａ）一本鎖高次構造多型による非変性キャピラリー電気泳動（ＣＥ−ＳＳＣＰ）による５−ＨＴ２ｃＲ ｍＲＮＡの発現しているすべての編集および非編集アイソフォームの分布の全プロフィール（ＰＣＴ国際特許出願 国際公開第２００８／１５２１４６、実施例２および図１参照）

ａ）：脳組織の１サンプルからの完全な編集プロフィールの取得
製造者の説明書に従って、全ＲＮＡを組織または細胞抽出物から抽出し、精製した（キアゲン社製 ＲＮｅａｓｙ、Ｍｉｎｉキット）。ＧｅｎｅＱｕａｎｔ分光光度計（ファルマシアバイオテク社製）を用いて２６０ｎｍでの吸光度および２６０／２８０ｎｍの比率の両方を測定し、抽出したＲＮＡの量と純度を評価した。ゲノムＤＮＡによるコンタミネーションの可能性を排除するために、その後、８μｌのＲＮＡ（８８ｎｇ〜１．３μｇ）の各々を、１ユニットのＤＮａｓｅＩ（インビトロジェン社製）で、最終容量１０μｌで室温で１５分間処理した。反応は、１μｌの２５ｍＭ ＥＤＴＡを添加することにより停止させ、その後、６５℃で１０分間加熱した。１５ユニットのＴｈｅｒｍｏＳｃｒｉｐｔ逆転写酵素（ＴｈｅｒｍｏＳｃｒｉｐｔ ＲＴ−ＰＣＲシステム、インビトロジェン社製）および最終濃度２．５μＭのオリコ（ｄＴ）プライマーを用いて、ＤＮａｓｅＩで処理したＲＮＡ（１０μｌ）の逆転写を行った。

１段階目のＰＣＲ反応（最終容量２５μｌ）は、１μｌの逆転写反応産物と０．２ユニットのプラチナＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（ＴｈｅｒｍｏＳｃｒｉｐｔ ＲＴ−ＰＣＲシステム、インビトロジェン社製）、および、それぞれヒト５−ＨＴ２ｃＲ ｃＤＮＡのエキソンＩＶおよびエキソンＶ上に設けられた特異的プライマー（順方向プライマー：５’−ＴＧＴＣＣＣＴＡＧＣＣＡＴＴＧＣＴＧＡＴＡＴＧＣ−３’（配列番号１）および逆方向プライマー：５’−ＧＣＡＡＴＣＴＴＣＡＴＧＡＴＧＧＣＣＴＴＡＧＴＣ−３’（配列番号２）；最終濃度各０．２μＭ）とを用いて行われ、２５０ｂｐの断片を得た。９５℃で３分間の変性工程の後に、ＰＣＲを３５サイクル（９５℃で１５秒；６０℃で３０秒；７２℃で２０秒）行い、最後に７２℃で２分の伸長工程を行った。増幅産物の一定量を用いて、２％アガロース分析ゲル上で産物を確認した。

ｂ）２段階目のＰＣＲおよびキャピラリー電気泳動（ＣＥ）による一本鎖ＤＮＡ断片の分離
１μｌの５０分の１希釈のＲＴ−１段階目ＰＣＲ産物、または、ヒト５−ＨＴ２ｃＲ（若しくは５ＨＴ２ＣＲ）のアイソフォームの３２種のスタンダードを持つプラスミドから増幅した２５０ｂｐのｃＤＮＡを、追加のネステッドＰＣＲ用のテンプレートとして用いた。これら３２のスタンダードは、ヒト５−ＨＴ２ｃＲの非編集（ＮＥ）および編集アイソフォームに対応する。ＨＰＬＣ精製した蛍光プライマー（順方向プライマー：ＦＡＭ−ＡＴＧＴＧＣＴＡＴＴＴＴＣＡＡＣＡＧＣＧＴＣＣＡＴＣ−３’（配列番号３）、逆方向プライマー：ＶＩＣ−ＧＣＡＡＴＣＴＴＣＡＴＧＡＴＧＧＣＣＴＴＡ−３’（配列番号４）；最終濃度各０．２μＭ）および０．２ユニットのプラチナｐｆｘＤＮＡポリメラーゼ（インビトロジェン社製）を用いて、最終容量２０μｌで増幅を行った。

ＶＩＣ標識逆方向プライマーは、ヒト、マウスおよびラットにおいて同一の５−ＨＴ２ｃ受容体の相補配列にハイブリダイズする。一方で、ヒトサンプルで用いられたにも関わらず、ＦＡＭ標識順方向プライマーの配列は、マウスの配列と可能な限り近づけてデザインされた。より正確には、ヒトオリゴヌクレオチド配列の５および６位のＴ残基（ヒト参照番号：Ｕ４９５１６の１１３３および１１３４位）が、それぞれＧおよびＣへと変えられた。

上記の２つのプライマーを用いて得られたＰＣＲ産物の両鎖の確率的な折りたたみ経路のシミュレーションは、Ｋｉｎｅｆｏｌｄサーバー（Ｋｉｎｅｆｏｌｄ．ｃｕｒｉｅ．ｆｒ）を用いて行った。これにより、順方向および逆方向の鎖に対して得られる最小の自由エネルギーの構造−ステム-ループ構造のループに埋め込まれ、ステムの折りたたみ後に全体の構造の他の場所に位置する相補的な配列とハイブリダイズすることができる編集領域−が、マウスサンプルで成功裏に用いられているマウスのネステッドＰＣＲ産物に対して算出された構造と非常に近いことが示された。このプライマーセットは、一本鎖高次構造多型による非変性キャピラリー電気泳動（ＣＥ−ＳＳＣＰ）によるヒト５ＨＴＲ２Ｃ ｍＲＮＡ編集の高次構造分析に最適であることが示された。

増幅断片は１２７ｂｐ長である。ＲＴ−ＰＣＲに関しては、９４℃５分間の最初の変性工程の後に、増幅反応を３５サイクル（９４℃で１５秒、５５℃で３０秒、６８℃で２０秒）行い、最後に６８℃２分間の伸長工程を行った。３１００ Ａｖａｎｔ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｓｅｒ（アプライドバイオシステムズ社製）での後の解析の前に、１２７ｂｐ長の増幅断片の質を、再度、２％アガロースゲル上で評価した。

１１μｌの脱イオン化ホルムアミドに希釈したスタンダードアイソフォーム（ＤＥＰＣ処理水による１００分の１希釈物の１μｌ）およびサンプル（３０分の１希釈物の１μｌ）に対応する蛍光ＰＣＲ産物を電気泳動図の保持時間のすべての範囲をカバーするＲＯＸ標識泳動スタンダード（ＭＷＧ−バイオテク社製、ＡＧ）（各５μｌ）の混合物に加えた。これらのＲＯＸスタンダードは、ＣＥキャリブレーションに用いられ、続いてスタンダードとサンプルピークの正確な重ね合せ画像を得るために用いられる。９５℃での２分間の変性の後に、サンプルを即座に氷上で冷却した。非変性ＣＥは、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３１００−Ａｖａｎｔ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｓｅｒ（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて、グリセロールを用いずに７％ＰＯＰ高次構造解析ポリマー（ＰＯＰ Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｏｌｙｍｅｒ）（アプライドバイオシステムズ社製）および１×ＴＢＥで満たした８０ｃｍ長のキャピラリーで行った。１５ｋＶで３分間プレランを行った後に、サンプルを２ｋＶで１５秒間注入し、２０度の温度制御下で１５ｋＶで１０５分間電気泳動を行った。これらの条件下では、ＦＡＭ標識またはＶＩＣ標識鎖のいずれかで得られた一本ｓｓＤＮＡの高次構造の結果として、可能性のある３２のアイソフォームが明確に分離した。アイソフォームの明快な同定のために、様々な保持時間を用いた。

ｃ）各脳サンプルにおける各アイソフォームの同定と相対的定量
電気泳動シグナルは、その後、社内ソフトウェアを用いて処理した。最初に、各サンプルの電気泳動プロフィールの時間の基準を、泳動スタンダードであるＲＯＸ標識スタンダードを用いて調整した。これにより、ＦＡＭ−およびＶＩＣ標識鎖で、特有の時間の基準でスタンダードとサンプルのシグナルを正確に逆重畳積分することが可能となる。その後、バックグラウンドを調整し、差し引いて、各シグナルの下で全領域を標準化した。

各アイソフォームの相対的な比率は、逆重畳積分され、かつ標準化された脳サンプルの各分析用シグナルの最適なフィッティングにより、処理した。それは、同様に逆重畳積分され、かつ標準化された３２のスタンダード分析用シグナルにより表される統合シグナルの反復した調整により行われた。計算は、ＳＳＣＰシグナルが、
｛ここで、ｉ∈｛１、．．．、Ｎ｝を有するＲ_ｉ（ｔ）はスタンダードシグナルであり、ｇ_ｉはシグナル中のそれらの各々の％である。｝
であるとの仮定に基づいて行われた。最適なフィッティングは、エラー（ＳＳＥ）
による平方和を最小化し、最小二乗統計分析で正確さを確認した。この最適なフィッティングの結果は、
｛ここで、ＳＳＭは、
などの平均に関する平方和（Sum of Square about Mean）である。｝
で表されるｒ^２値の算出の後に統計的に評価された。最高の理論上最適なフィッティングであれば、ｒ^２＝１が得られる。

すべての実験は、ブラインドテスト条件下で行われ、すべてのサンプルは、ＲＴ−ＰＣＲおよび２段階目のＰＣＲ反応に関しては、同一のバッチで分析評価した。最適なフィッティングの結果は、個々のサンプルそれぞれに対する特異的な編集プロフィールを生み出し、全分析用シグナルの編集および非編集の各形態のパーセンテージにより決定される。
これらの初期値が、統計分析に用いられた。

この方法により、抽出物中に存在する全５−ＨＴ２ｃ受容体のパーセンテージとして表される発現した各ｍＲＮＡアイソフォームの比率が得られる。

３Ｂ）リアルタイムＰＣＲ分析による５−ＨＴ２ＣＲおよびＡＤＡＲ ｍＲＮＡの発現の定量

ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞、またはＢＡＬＢ／ｃマウスの前頭前野皮質、全血液および皮膚における５−ＨＴ２ＣＲ、ＡＤＡＲ１およびＡＤＡＲ２ ｍＲＮＡの発現レベルを定量するために、ファーストストランドｃＤＮＡを逆転写により合成し、ＴａｑＭａｎ定量的リアルタイムＰＣＲ分析（アプライドバイオシステムズ社製）を行った。定量的ＰＣＲに用いたすべてのプローブおよびプライマーは、アプライドバイオシステムズ社製（Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｓｓａｙ、Ａｓｓａｙ−Ｏｎ−Ｄｅｍａｎｄ）から入手した（表１、アプライドバイオシステムズ社製プライマーおよびプローブを参照）。

これらのプローブおよびプライマーは、５−ＨＴ２ｃＲ、ＡＤＡＲ１、構成的および誘導性アイソフォーム、並びにＡＤＡＲタンパク質をコードするヒトおよびマウス遺伝子の周知のかつ開示された核酸配列を考慮すれば、必要であろうとなかろうと、当業者によって簡単にデザインすることができるであろう。

ヒトＧＡＰＤＨ（製品番号：４３２６３１７Ｅ；アプライドバイオシステムズ社製）またはマウスＧＡＰＤＨ（製品番号：４３５２３３９Ｅ；アプライドバイオシステムズ社製）が、各マルチプレックスＰＣＲにインターナルコントロールとして含まれていた。リアルタイムＰＣＲおよびその後の分析は、４８ウェルブロックＳｔｅｐＯｎｅ ＲＴ ＰＣＲシステム（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて行われた。すべてのサンプルにおける標的遺伝子の発現の定量は、等式Ｃｔ（標的）−Ｃｔ（ＧＡＰＤＨ）＝ΔＣｔ｛ここで、Ｃｔはサイクル数の閾値である｝により、ＧＡＰＤＨの発現に対して標準化した。
非処理マウスまたは細胞からのサンプルのΔＣｔの平均値が決定され、処理された動物または細胞に対応するサンプルのための基準点として用いられた。個々の変動を含む、未処理と処理の動物または細胞との差異は、等式（ΔＣｔ（処理された個々のサンプル）−ΔＣｔ（未処理サンプルの平均）＝ΔΔＣｔ）により算出した。各サンプルにおける標的遺伝子の発現の変化（ｎ倍）は、２^{−ΔΔＣｔ}により算出され、平均と標準偏差（ＳＤ）はここから導出した。

選択された細胞株の感度を改善し、編集過程の重大な変動を検出するために、その過程をヒトインターフェロンおよびＦＤＡが警告枠を集中させる１７の分子の評価に適用した。

実施例４．ＡＤＡＲ１ａの発現に対する、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞に２４時間暴露したヒトインターフェロンの濃度効果の関係（図１Ａおよび１Ｂ参照）

対照細胞とインターフェロン処理細胞における編集アイソフォームの分布のさらなる評価のために、１０００ＵＩ／ｍｌの濃度を選択した。結果は表２の通りであった。

表２：１０００ＩＵのヒトインターフェロンαによる処理の２４時間後に得られた編集プロフィールの分析

この編集プロフィールから、細胞ＲＮＡ中で測定された５−ＨＴ２ｃＲ ｍＲＮＡ（＝１００％）の同定された各アイソフォームの平均比率（％）±ＳＥＭ（ｎ＝６）が得られる。これらのアイソフォームは、対照とＩＮＦ処理群とを比較した場合に、代数学的なデルタの関数で分類される。得られたシグネチャは有意差検定を受け、その後、編集酵素の活性の多次元評価が、酵素活性の産物の分類によりなされる。最初の分類（編集部位）は、シグネチャの各部において見いだされる編集部位：Ａ、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥのそれぞれの編集のパーセンテージを算出する。全分布が用いられる場合は、「総計」中に与えられる結果は、実際に、プライマー伸長法により得ることができる結果と対応する。ＡＤＡＲ１単独の作用による（ＡＤＡＲ１）、ＡＤＡＲ１およびＡＤＡＲ２の組み合わさった作用による（ＡＤＡＲ１＋２）編集アイソフォームから、ＡＤＡＲ２の排他的な作用から（ＡＤＡＲ２）、酵素指数が算出された。最後の分類は、ＡＤＡＲ１の作用（ＡＤＡＲ Ｉ）またはＡＤＡＲ２（ＡＤＡＲ ＩＩ）が関連するすべてのアイソフォームにより表される％を測定することによる活性を表した。その他の分類は、いくつかの特異的な編集作用（例えば、部位ＣおよびＥ、ＡおよびＣ、ＡおよびＢ、または、ＡおよびＢおよびＣなどが編集されていることが判明した酵素活性の産物の比率を同定するため）の評価に対して可能である（ここでは示されない）。非編集アイソフォーム（ＮＥ）がまた、有意に減少していることは興味深い。

ＩＮＦ処理が、予想通りにＡＤＡＲ１活性の重要な増加とＡＤＡＲ２活性の低下を示す編集プロフィールの強力かつ有意な変化を引き起こすことは明らかである。

同一のサンプルにおいて、ＡＤＡＲの発現レベルが、ＱＰＣＲにより測定され、結果は下記の表３に要約されており、編集プロフィールの評価の後に得られたものと比較された。

表３：選択された細胞株のＩＮＦ処理後のＡＤＡＲ１およびＡＤＡＲ２酵素の発現と活性指数の比較。結果は、対照（ｎ＝６）に対する変動の％により示される。アスタリスク（＊）で目印を付けた領域および太字の数字は、有意な変動（Ｐ＜．０５）を示す。

次の表は、長期にわたり用いられたときに、自殺を誘発するリスクを示すとしてＦＤＡの警告により指摘されてきた１７種の分子の１０通りのマイクロモル濃度での２４時間の使用の後に結果として生じた編集の変化を決定する同一のプロトコルを用いて同様の実験を行った後の結果を要約している。これらの分子は、いくつかの化合物および様々なファミリーに属している。しかし、それらは、５−ＨＴ２ｃＲの編集の有意な変化を引き起こす。これら分子のうち１１種は、編集酵素の発現の有意な変化を引き起こす。その他は、同一の細胞サンプルを用いて簡単に検出しうるこれらの酵素の活性に有意な変化を引き起こす（表４参照）。

表４：ＦＤＡにより自殺リスクを示すとして指摘されている分子が、編集酵素の発現および／または５−ＨＴ２ｃＲ ｍＲＮＡに対するその編集作用を有意に変化させる。このことは、専用の細胞株（ＳＨ−ＳＹ５Ｙ）に対してこれらを適用することにより簡単に検出できる。

これらのパラメータの迅速かつ完全な測定を可能とする技術一式で観察した場合に、この専用の細胞株が、５−ＨＴ伝達の長期にわたる変化による気分の変化を生ずるこれら分子の結果として生じるリスクの前臨床での評価のための新しいモデルを表すことが明らかとなる。

実施例５．イン・ビトロにおける分子の予測的な効果のための細胞株の選択
ａ−選択の判断基準 分子のイン・ビトロでのスクリーニングに相応しいものとするために、細胞株を下記の主要な点で確認しなければならない：
−ヒト起源であること；
−対照の条件において、編集プロフィールの再現性のある評価を可能とする範囲で５−ＨＴ２ｃＲ受容体を発現すること；
−比較的定常状態において、ヒト脳における通常の皮質構造で見られるものと類似した編集酵素を発現すること。

ｂ−最善の選択のための提案
様々な１０種の細胞株の中で、下記の条件で用いるときに最も興味深いものとしてＳＨ−ＳＹ５Ｙヒト神経芽細胞腫細胞株を選択した。

ＳＨ−ＳＹ５Ｙヒト神経芽細胞腫細胞株はＥＣＡＣＣから購入した。細胞を１０％透析済みＦＣＳ（ＰＡＡ社製、参照番号：Ａ１５−５０７、ロットＡ５０７０８−００５０）、２ｍＭグルタミン（シグマ社製、参照番号：Ｇ７５１３）および１×の抗生−抗真菌安定化（Antibiotic- Antimycotic Stabilized）（シグマ社製、参照番号：Ａ５９５５）混合物を補填した高グルコースＤ−ＭＥＭ培地（シグマ社製、参照番号：６５４６）で、５％ＣＯ_２の加湿した雰囲気下３７℃で、細胞を培養した。ｈＩＦＮαまたは薬剤処理の前日に、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞を５；７または９×１０^６細胞／ウェルの密度で、それぞれ７２、４８または２４時間の処理のために、６ウェルプレート（コーニング社製、マルチウェルプレート、６ウェル、Ｃｏｒｎｉｎｇ ＣｅｌｌＢＩＮＤ Ｓｕｒｆａｃｅ、参照番号：３３３５）に播種した。１実験条件（対照、濃度または処理時間）ごとに、６ウェルプレートの６または８ウェルを用いた。播種の翌日に、培地を取り除き、細胞を１０μＭの試験分子溶液または１０００ＩＵ／ｍｌのｈＩＦＮα溶液（ＰＢＬバイオメディカルラボラトリーズ社製）で、２４または４８時間処理した。ｈＩＦＮαの用量応答実験のために、１、１０、１００、１０００または１００００ＩＵ／ｍｌのｈＩＦＮα溶液で細胞を処理した。［ｈＩＦＮαのタイムコース実験のために、１０００ＩＵ／ｍｌのｈＩＦＮα溶液で２４、４８または７２時間細胞を処理した。７２時間処理の場合には、培養の４８時間後に対照およびｈＩＦＮα処理細胞の両方で培地を交換した。］その後、ＲＬＴ溶解緩衝液内で細胞を直接溶解し、全ＲＮＡを製造者の説明書に従って精製した（（キアゲン社製、ＲＮｅａｓｙ Ｐｌｕｓ Ｍｉｎｉキット、参照番号：７４１３４）。その後、全ＲＮＡをＴｈｅｒｍｏＳｃｒｉｐｔＲＴ−ＰＣＲシステムＰｌｕｓＴａｑ（インビトロジェン社製、参照番号：１１１４６−０３２）を用いて逆転写し、得られたｃＤＮＡをＣＥ−ＳＳＣＰおよび定量的リアルタイムＰＣＲに用いた。

可能な場合には、全タンパク質抽出物をウェスタンブロット用にも調製した。簡潔には、対照または処理手順に対応する８ウェルの細胞を、１ｍＭ ＰＭＳＦおよびコンプリートミニプロテアーゼインヒビターカクテル（ロッシュ社製、参照番号：１１８３６１５３００１）を補充した６００μｌのＲＩＰＡ緩衝液（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８、５ｍＭ ＥＤＴＡ、１％ Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ １００、０．１％デオキシコール酸ナトリウム）で溶解した。細胞溶解物は、氷上で３×１５秒間の超音波処理を行い、少なくとも４℃で２時間保持した後に、４℃で１０分間１００ｇで遠心分離した。不溶性のペレットを、４０μｌの２×Ｌａｅｍｍｌｉローディングバッファーに再懸濁して、タンパク質濃度をＱｕａｎｔ−ＩＴ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ ｋｉｔ（インビトロジェン社製、参照番号：Ｑ３３２１１）を用いて定量した。超音波処理と７０℃５分間の変性の後に、Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝液中の７５μｇの不溶性タンパク質抽出物を、１２％変性ポリアクリルアミドゲルにロードした。標準的な手順に従ってさらにタンパク質抽出物の泳動および電気的転写を行った。ＡＤＡＲ１タンパク質の検出（構成的および誘導性形態の両方）用に、ニトロセルロース膜をＬ−１５アフィニティー精製済みヤギポリクローナル抗体（サンタクルーズ社製、参照番号：ｓｃ−１９０７７）でブロットした。

ｃ−対照の条件におけるＳＨ−ＳＹ５Ｙ中の編集酵素および４−ＨＴ２ｃＲの発現の定常状態。これは表５に示される通りである。

表５：ＳＨ−ＳＹ５Ｙ神経芽細胞腫およびＨＴＢ−１４星状細胞腫細胞株における、ならびにヒト脳の大脳皮質の全ＲＮＡプールにおける、ＡＤＡＲ１ａ、ＡＤＡＲ１ｂ、ＡＤＡＲ２および５−ＨＴ２ｃＲの相対的発現。細胞株は、ＥＣＡＣＣ（ＳＨ−ＳＹ５Ｙ，参照番号：９４０３０３０４）およびＡＴＣＣ（ＨＴＢ−１４、参照番号：ＨＴＢ−１４）から購入した。大脳皮質の全ＲＮＡはクロンテック社（参照番号：６３６５６１）から購入した。発現ｍＲＮＡレベルの定量は、アプライドバイオシステムズ社製のＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓ（商標）９６ウェル装置（アプライドバイオシステムズ社製、参照番号：４３７６５９２）を用いたＴａｑＭａｎ定量的リアルタイムＰＣＲ分析により行った。Ｑ−ＰＣＲに用いたすべてのプローブおよびプライマーは、アプライドバイオシステムズ社からのものであった（遺伝子発現アッセイ、Ａｓｓａｙ−Ｏｎ−Ｄｅｍａｎｄ）：５−ＨＴ２ｃＲ（Hs 00968672_ml）、ＡＤＡＲ１ ｐ１１０構成的アイソフォーム（Hs 01017596_ml）、ＡＤＡＲ１ ｐ１５０誘導性アイソフォーム（Hs 01020780_ml）、ＡＤＡＲ２（Hs 00210562_ml）。内部標準として、ヒトＧＡＰＤＨ（アプライドバイオシステムズ社製、参照番号：４３２６３１７Ｅ）を各マルチプレックスＱ−ＰＣＲに含ませた。ＲＱ（相対的定量）は、供給者により記載された通りに算出した。各組織または細胞株において、ＡＤＡＲ１ａ遺伝子の発現を基準として取得し、そのＲＱを１とした。

重要なことに、ＡＤＡＲ１の誘導性アイソフォームであるＡＤＡＲ１ａアイソフォーム（ここでは基準として用いる）と比較したときに、ＡＤＡＲ１のｍＲＮＡの構成的アイソフォーム（ＡＤＡＲ１ｂ）は４８倍多く発現し、ヒト大脳皮質においても同じ比率が見いだされた。ヒト大脳皮質の全ＲＮＡのように、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞においても、５−ＨＴ２ｃＲをコードする特異的ｍＲＮＡの再現性のある量を同定することができる。このことは、受容体をコードするｍＲＮＡが定常的な発現を可能にする範囲で発現していないＨＴＢ１４細胞には当てはまらなかった。

もう一つのポイントは、選択的誘導の古典的モデルに応答するこれらの酵素の能力を検証すること、および複合体の協調的な活性を明らかにし、編集プロフィールの産物を生成することである。これらの判断基準は下記の２つの表で説明されている。

表６：ＩＦＮα処理したＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞におけるＡＤＡＲ１ ｍＲＮＡおよびタンパク質の発現。１０００ＩＵ／ｍｌの濃度のＩＦＮαの存在下で、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞を４８時間培養した。処理後、全ＲＮＡおよびタンパク質の抽出物は、「材料と方法」に記載の通りに調製した。発現ｍＲＮＡレベルの定量は、アプライドバイオシステムズ社製のＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓ（商標）９６ウェル装置（アプライドバイオシステムズ社製、参照番号：４３７６５９２）を用いたＴａｑＭａｎ定量的リアルタイムＰＣＲ分析により行った。Ｑ−ＰＣＲに用いたすべてのプローブは、アプライドバイオシステムズ社からのものであった（遺伝子発現アッセイ、Ａｓｓａｙ−Ｏｎ−Ｄｅｍａｎｄ）：ＡＤＡＲ１ ｐ１１０構成的アイソフォーム（Hs 01017596_ml）、ＡＤＡＲ１ ｐ１５０誘導性アイソフォーム（Hs 01020780_ml）。内部標準として、ヒトＧＡＰＤＨ（アプライドバイオシステムズ社製、参照番号：４３２６３１７Ｅ）を各マルチプレックスＱ−ＰＣＲに含ませた。
ＲＱ（相対的定量）は、供給者により記載された通りに算出した。各組織または細胞株において、ＡＤＡＲ１ａ遺伝子の発現を基準として取得し、そのＲＱを１とした。
タンパク質抽出物を、１２％アクリルアミド変性ゲル上でＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、ＰＲＯＴＲＡＮ ＢＡ８５ニトロセルロース膜（ワットマン社製、参照番号：１０ ４０１ １９７）に転写した。ＡＤＡＲ１タンパク質の検出のために、ニトロセルロース膜をＬ−１５アフィニティー精製済みヤギポリクローナル抗体（サンタクルーズ社製、参照番号：ｓｃ−１９０７７）でブロットした。構成的（ｐ１１０）および誘導性（ｐ１５０）ＡＤＡＲ１アイソフォームの両方に対応するバンドを矢印で示す。タンパク質スタンダード（プレシジョンＰｌｕｓタンパク質スタンダード、バイオラッド社製、参照番号：１６１−０３６３）が、同様に示されている。目的のタンパク質に対応するバンドは、Ｌｉ−Ｃｏｒ Ｏｄｉｓｓｅｙ装置によりスキャンし、ＭＣＩＤソフトウェアを用いて更に定量した（図５参照）。各スキャンおよび各実験条件で得られた光学密度を括弧内に示す（表６参照）。変換により、未処理細胞におけるＡＤＡＲ１ａアイソフォームのＯＤを基準として取得し、１とした。

この実験は、上記の培養条件において、ＩＮＦαにより生じる誘導に応答する選択された上記細胞株が、ｍＲＮＡの定量により予測されるものと同等の特異性および増幅比率を伴って酵素タンパク質レベルで観察することができることを明らかに示している。

これらの編集酵素の産物の分布（それらの活性指数）の解析は、上記の実施例３Ａにおいて記載されたＳＳＣＰ−ＣＥ技術を用いて行われ、これにより、全ＲＮＡのサンプルから１回のアッセイで、５−ＨＴ２ｃＲ ｍＲＮＡの発現したすべての編集および非編集アイソフォームの分布の全プロフィールを定量することができた。表８は、対照の条件における３種の大脳辺縁皮質構造およびＳＨＳＹ５Ｙ細胞株から得られた編集プロフィールの例を示す。

表８：対照となる対象のヒト脳の３領域において、および対照条件下での培養されたＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞において、決定された５−ＨＴ２ｃＲの編集プロフィールの比較。本発明者らは、個々の培養皿（ｎ＝８）から再現性のある編集プロフィールを得ることができることを示すことができる。本発明者らは、細胞株における編集アイソフォームの数は少ないが、≧１％の範囲のアイソフォームの平均比率は同様であり、このことから、定量に用いた分析手順が同様の効率であることが示されることを示す。影付きのセルは、ＮＥアイソフォームの比率および１％の上限に満たないアイソフォーム群を示した。結果は、全特異的ｍＲＮＡの平均％±ＳＥＭ（ｎ＝６ 対照ヒト対象、および８つの対照条件における培養皿）として表されている。

これらの分布を迅速に測定する能力が、病理学的状況または分子の使用により生じうる編集酵素の活性の変更を正確に調査するための前提条件である。

実施例６．インターフェロンモデル：特定の戦略を試験分子の比較に向けることの重要性
上記で示されたように、主にＣ型肝炎を処置するためのインターフェロンアルファの処置は、多くの患者（３０〜５０％）において深刻な気分の変化を引き起こしうる。従って、この分子はＡＤＡＲ１のＡＤＡＲ１ａ誘導性アイソフォームの強力な誘導剤であることが知られているので、本発明者らが選択した細胞株でＩＮＦαの効果を分析することは興味深い。

第一の工程において、その特異的なｍＲＮＡのＱＰＣＲによるこの酵素の発現の度合いを測定することにより、濃度の範囲の効果を評価した。編集酵素活性の強力な指標と考えられる編集プロフィールに対する産物の効果を分析するために、追加実験を行った。結果は図１および表４に要約されている（表７も参照）。

ＡＤＡＲ１ａの誘導が選択的であり、主にＡＢ、ＡＢＣおよびＣアイソフォームに集中した編集プロフィールの重大な変化を引き起こすことがこれらの結果から明らかに示された。対照の条件において、これらのアイソフォームは全特異的５−ＨＴ２ｃＲの７．５％に相当した（表７参照）。１０００ＩＵ／ｍｌが培地に４８時間使用されたとき、この比率は２６％であることが分かった。従って、ＡＤＡＲ１ａの誘導が主にこれらアイソフォームの産生に影響することが明らかであった。

これらのプロフィールの変化を統計学的に分析するために、および、比較が実際に標準化された分布の変化に限られるという事実を調べるために、本発明者らはまず、観察された発現アイソフォームの平均比率の変動を、その代数学的平均のデルタの関数で分類した。この分類は、観察された全体的な変更の「シグネチャ」として定義された。その後、このシグネチャの２つの部分の変動を分散分析により試験した。その後、分析は、比率の重要な変動が検出されたアイソフォームの群を考慮した成分分析により完了させた。

この工程の例として、本発明者らは、対照の対象およびうつ病の自殺患者の編集プロフィールから得られたシグネチャの比較の分析から求められる重要な成分の群を基準として用いることを決定した。

そのような分析の結果は、図３に示されている。

この分析から４つの成分が３つのヒト脳構造において有意差を持ってはっきりと変化し、９つの成分が２つの前頭前野皮質においてはっきりした有意な変動を共有した。表の最後の列は、１０００ＩＵ／ｍｌの濃度でヒトＩＮＦαを４８時間適用した後のＳＨ−ＳＹ５Ｙ培養細胞（ヒト起源）において行われた同一の分析の結果を示す。うつ病の自殺患者の３つの大脳皮質構造において変化していることがみいだされた成分と比較したときに、シグネチャの類似性に気づくことは興味深い。従って、ＩＮＦα適用後に観察される５−ＨＴ２ｃ編集ｍＲＮＡの類似した変化を引き起こす能力を、それらのいくつかが有するかどうかを調べるために基準分子の編集プロフィールを作成した後で、同一の判断基準を用いることを適切に提案することが可能であった。

実施例７．ＩＮＦα処理後に見られるのと同様の編集プロフィールの変化を引き起こす基準分子を検出するためのイン・ビトロ プラットフォームの使用
本発明者らは、気分変化および自殺リスクに関するＦＤＡの警告の対象となっている、またはなっていない様々なクラスの典型的な分子にこの種の成分分析を用いることを決定した。培養したＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞に対して、それらの各々を１０μＭの濃度で４８時間適用した後に、編集プロフィールのイン・ビトロ スクリーニングを行った。５−ＨＴ２ｃ ｍＲＮＡの編集プロフィールの分析は、上記と同じ成分のセットを用いて行い、分析した（図３参照）。

そのような分類の例が図４に示され、５−ＨＴ２ｃＲ ｍＲＮＡ編集の活性が同様に変化し、同様の副次的な精神医学的効果を誘発する潜在的リスクを潜在的に有する異なる治療的なクラスに属する様々な分子を同定することができる。リモナバン（Ｒｉｍｏｎａｂａｎｔ）およびタラナバン（Ｔａｒａｎａｂａｎｔ）が、同じ抗うつ剤、抗精神剤および抗痙攣剤分子と共にこのファミリーに属することに注意。

この種の編集プロフィールの分析により、特定の標的のｍＲＮＡ編集の共通の変化を共有する分子を「イン・ビトロ」スクリーニングにより分類することを可能とする最も感度の良い判断基準が与えられる。成分の選択は制限されず、様々な判断基準に適用させてよい。このターゲット（ここでは５−ＨＴ２ｃＲ）が、気分、概日リズム、痛み、摂食行動などの制御に直接的に関与している場合、この評価は、前臨床試験のもとで新規分子の有害な副次的効果の予想されるリスクを試験するための有効なツールと考えられる。

Claims (6)

1. 試験化合物の患者への投与の後の、試験化合物の潜在的な毒性または副作用を決定するためのイン・ビトロの方法であって、
   ａ）哺乳類細胞と試験化合物とを接触させる工程（ここで、哺乳類細胞は細胞株であって、かつ、編集酵素ＡＤＡＲ１ａ、ＡＤＡＲ１ｂおよびＡＤＡＲ２並びにセロトニン２Ｃ受容体（５ＨＴＲ２Ｃ）の一定かつ構成的な発現を示す）、
   ｂ）前記細胞の抽出物において測定される５ＨＴＲ２Ｃ ｍＲＮＡの各編集アイソフォームの分布比率を決定する工程、
   ｃ）試験化合物で処理した前記細胞と非処理の対照細胞との間で、工程ｂ）で得られた結果を比較する工程
   を含んでなり、ここで、以下の検出が潜在的な毒性または副作用を示し、
   −試験化合物で処理した前記細胞と非処理の対照細胞の間での５ＨＴＲ２Ｃ ｍＲＮＡの編集アイソフォームの分布比率の統計学的に有意な増加または減少の検出、
   かつ、前記哺乳類細胞がヒト神経芽細胞腫ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞株由来である、方法。
2. 前記哺乳類細胞が、５ＨＴＲ２Ｃの編集を変化させる能力を有する薬剤で処理されたときに、少なくとも編集部位Ａが編集された少なくとも１種の５ＨＴＲ２Ｃアイソフォーム、少なくとも編集部位Ｂが編集された少なくとも１種の５ＨＴＲ２Ｃアイソフォーム、少なくとも編集部位Ｃが編集された少なくとも１種の５ＨＴＲ２Ｃアイソフォーム、少なくとも編集部位Ｄが編集された少なくとも１種の５ＨＴＲ２Ｃアイソフォームおよび少なくとも編集部位Ｅが編集された少なくとも１種の５ＨＴＲ２Ｃアイソフォームを発現する能力を更に有する細胞株である、請求項１に記載の方法。
3. 前記哺乳類細胞が、５ＨＴＲ２Ｃの編集を変化させる能力を有する薬剤で処理されたときに、編集された５ＨＴＲ２Ｃのすべてのアイソフォームを発現する能力を更に有する細胞株である、請求項２に記載の方法。
4. 前記試験化合物の投与後の患者における潜在的な毒性若しくは副作用、または５ＨＴＲ２ＣのｍＲＮＡ編集の変化に関連する処置された病状が、精神疾患、統合失調症、うつ病、うつ病による自殺または異常摂食行動からなる群から選択される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
5. 工程ｂ）において、細胞ＲＮＡ抽出物において測定される５ＨＴＲ２Ｃ ｍＲＮＡの各編集アイソフォームの分布比率が、２段階ＰＣＲを含んでなるネステッドＰＣＲを伴うＣＥ−ＳＳＣＰ法により測定され、かつ、１段階目のＰＣＲが、
   ヒト細胞株の場合：
   順方向：５’−ＴＧＴＣＣＣＴＡＧＣＣＡＴＴＧＣＴＧＡＴＡＴＧＣ−３’、および
   逆方向：５’−ＧＣＡＡＴＣＴＴＣＡＴＧＡＴＧＧＣＣＴＴＡＧＴＣ−３’
   のプライマーセットにより行われ、かつ、
   ２段階目のＰＣＲが、
   ヒト細胞株の場合：
   順方向：５’−ＡＴＧＴＧＣＴＡＴＴＴＴＣＡＡＣＡＧＣＧＴＣＣＡＴＣ−３’、
   逆方向：５’−ＧＣＡＡＴＣＴＴＣＡＴＧＡＴＧＧＣＣＴＴＡ−３’
   のプライマーセットで行われる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
6. 化合物を試験するのに適した非ヒト動物モデルにイン・ビボでその試験化合物を更に投与し、かつ、全血液および／または皮膚サンプル、または脳における５ＨＴＲ２ＣのｍＲＮＡ編集の変化を決定することにより、この動物モデルにおけるその投与の後のこの試験化合物の潜在的な毒性または副作用が評価されうる、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。