JP6580581B2 - 注射用医薬組成物 - Google Patents

Description

本発明は、癌免疫療法の分野に属し、細胞傷害性Ｔ細胞誘導活性を有するＷＴ１タンパク質由来癌抗原ペプチドを含有する注射用医薬組成物に関する。

一般にＷＴ１タンパク質由来癌抗原ペプチドとは、４４９個のアミノ酸からなるヒトのＷＴ１タンパク質（配列番号：２）由来の部分ペプチドであり、具体的にはアミノ酸数８〜１２のペプチドまたはそのダイマーであり、主要組織適合抗原（Ｍａｊｏｒ Ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ Ｃｏｍｐｌｅｘ、ＭＨＣ）クラスＩ抗原に提示されかつ細胞傷害性Ｔ細胞（細胞傷害性Ｔリンパ球、Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ−ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ、Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ−ｃｅｌｌ。以下、ＣＴＬと称する）により抗原認識されるペプチドを含有するものである。ＭＨＣは、ヒトではヒト白血球型抗原（ＨＬＡ）と呼ばれる。

ＷＴ１タンパク質由来の部分ペプチドの内、Arg-Met-Phe-Pro-Asn-Ala-Pro-Tyr-Leu（配列番号：３）で表されるアミノ酸配列からなる部分ペプチド（ＷＴ１_{１２６−１３４}ペプチド）と、Cys-Met-Thr-Trp-Asn-Gln-Met-Asn-Leu（配列番号：６）で表されるアミノ酸配列からなる部分ペプチド（ＷＴ１_{２３５−２４３}ペプチド）のＮ末端から２番目のアミノ酸をメチオニンからチロシンに改変した改変ペプチド（即ち、Cys-Tyr-Thr-Trp-Asn-Gln-Met-Asn-Leu（配列番号：５）で表されるアミノ酸配列からなるペプチド）とが、ＨＬＡに結合しＣＴＬを誘導するペプチドとして有用であることが報告されている（特許文献１〜４参照）。しかしながら、これら２つのペプチドをシステイン残基間のジスルフィド結合を介してコンジュゲート化した改変型ペプチドは知られておらず、これに最適な癌ワクチン組成物も知られていなかった。

一方、ＷＴ１タンパク質由来の部分ペプチドの内、Trp-Ala-Pro-Val-Leu-Asp-Phe-Ala-Pro-Pro-Gly-Ala-Ser-Ala-Tyr-Gly-Ser-Leu（配列番号：１）で表されるアミノ酸配列からなる部分ペプチド（ＷＴ１_{３４−５１}ペプチド）は、それだけでもＨＬＡに結合しＣＴＬを誘導するペプチドとして有用であり、さらに上述のペプチドと併用して用いることで、ヘルパーペプチドとしての効果があることが報告されている（特許文献５参照）。しかしながら、本ペプチドを含む最適な癌ワクチン組成物は知られていなかった。

ＷＴ１_{１２６−１３４}ペプチドおよび／または改変ＷＴ１_{２３５−２４３}ペプチドと、ＷＴ１_{３４−５１}ペプチドとを含む最適な癌ワクチン組成物は、癌ワクチンとして有用であることから、これらのペプチドの安定性を確保した製剤を開発することが期待されていた。

国際公開第００／０６６０２号 国際公開第０２／０７９２５３号 国際公開第２００４／０６３２１７号 国際公開第２００７／０６３９０３号 国際公開第２０１０／１２３０６５号

本発明の課題は、式（１）で表されるペプチドまたはTrp-Ala-Pro-Val-Leu-Asp-Phe-Ala-Pro-Pro-Gly-Ala-Ser-Ala-Tyr-Gly-Ser-Leu（配列番号１）で表されるアミノ酸配列からなるＷＴ１部分ペプチドを含有する癌ワクチン製剤の調製に用いることが可能な、該ペプチドの安定な注射用医薬組成物を提供することにある。

（式中、ＣｙｓとＣｙｓの間の結合はジスルフィド結合を表し、Ｌｅｕ−ＯＨはＬｅｕのＣ末端がフリーのカルボキシル基であることを示し、他の結合はペプチド結合を示す。）

本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、式（１）で表されるペプチドまたは配列番号１で表される配列を持つＷＴ１部分ペプチドを含有する液剤において、トレハロースおよびｐＨ調整剤を含有することにより、製剤安定性に優れた液剤および／または凍結乾燥製剤を得ることを見出し、本発明を完成した。

すなわち、本発明は、以下のものに関する。

項１．以下の成分を含む注射用医薬組成物
（ａ）式（１）：

（式中、ＣｙｓとＣｙｓの間の結合はジスルフィド結合を表し、Ｌｅｕ−ＯＨはＬｅｕのＣ末端がフリーのカルボキシル基であることを示し、他の結合はペプチド結合を示す。）
で表されるペプチド、Trp-Ala-Pro-Val-Leu-Asp-Phe-Ala-Pro-Pro-Gly-Ala-Ser-Ala-Tyr-Gly-Ser-Leu（配列番号：１）で表されるアミノ酸配列からなるペプチドおよびそれらの塩から選択される１種以上のペプチド、
（ｂ）トレハロースまたはトレハロース水和物、および
（ｃ）ｐＨ調整剤。

項２．成分（ａ）が式（１）で表されるペプチドおよびその塩から選択される１種以上のペプチドである、項１に記載の組成物。

項３．さらにマンニトールを含むことを特徴とする、項２に記載の組成物。

項４．マンニトールがＤ−マンニトールである、項３に記載の組成物。

項５．さらにメチオニンを含むことを特徴とする、項２〜４のいずれか一項に記載の組成物。

項６．メチオニンがＬ−メチオニンである、項５に記載の組成物。

項７．ｐＨが１〜３であることを特徴とする、項２〜６のいずれか一項に記載の組成物。

項８．組成物が液剤または懸濁液剤であり、成分（ｂ）の含有量が１〜１００ｍｇ／ｇであることを特徴とする、項２〜７のいずれか一項に記載の組成物。

項９．組成物が液剤または懸濁液剤であり、マンニトールの含有量が１〜５０ｍｇ／ｇであることを特徴とする、項３〜８のいずれか一項に記載の組成物。

項１０．組成物が液剤または懸濁液剤であり、メチオニンの含有量が１〜３０ｍｇ／ｇであることを特徴とする、項５〜９のいずれか一項に記載の組成物。

項１１．成分（ａ）がTrp-Ala-Pro-Val-Leu-Asp-Phe-Ala-Pro-Pro-Gly-Ala-Ser-Ala-Tyr-Gly-Ser-Leu（配列番号：１）で表されるアミノ酸配列からなるペプチドおよびその塩から選択される１種以上のペプチドである、項１に記載の組成物。

項１２．さらに溶解補助剤を含むことを特徴とする、項１１に記載の組成物。

項１３．溶解補助剤がクエン酸、乳酸、酒石酸、酢酸、またはトリフルオロ酢酸である、項１２に記載の組成物。

項１４．溶解補助剤が酒石酸である、項１２に記載の組成物。

項１５．ｐＨが２〜３であることを特徴とする、項１２〜１４のいずれか一項に記載の組成物。

項１６．ｐＨが５〜１０であることを特徴とする、項１１に記載の組成物。

項１７．組成物が液剤または懸濁液剤であり、成分（ｂ）の含有量が１〜１００ｍｇ／ｇであることを特徴とする、項１１〜１６のいずれか一項に記載の組成物。

項１８．組成物が液剤または懸濁液剤であり、溶解補助剤の含有量が０.１〜１０ｍｇ／ｇであることを特徴とする、項１２〜１５のいずれか一項に記載の組成物。

項１９．ｐＨ調整剤として用いる酸が弱酸であることを特徴とする、項１１〜１８のいずれか一項に記載の組成物。

項２０．成分（ａ）が、式（１）で表されるペプチドおよびその塩から選択される１種以上のペプチドと、Trp-Ala-Pro-Val-Leu-Asp-Phe-Ala-Pro-Pro-Gly-Ala-Ser-Ala-Tyr-Gly-Ser-Leu（配列番号：１）で表されるアミノ酸配列からなるペプチドおよびその塩から選択される１種以上のペプチドとを含むことを特徴とする、項１に記載の組成物。

項２１．さらにマンニトールを含むことを特徴とする、項２０に記載の組成物。

項２２．さらにメチオニンを含むことを特徴とする、項２０または２１に記載の組成物。

項２３．さらに溶解補助剤を含むことを特徴とする、項２０〜２２のいずれか一項に記載の組成物。

項２４．ｐＨが２〜３であることを特徴とする、項２０〜２３のいずれか一項に記載の組成物。

項２５．組成物が液剤または懸濁液剤であり、成分（ｂ）の含有量が１〜１００ｍｇ／ｇであることを特徴とする、項２０〜２４のいずれか一項に記載の組成物。

項２６．組成物が液剤または懸濁液剤であり、マンニトールの含有量が１〜５０ｍｇ／ｇであることを特徴とする、項２１〜２５のいずれか一項に記載の組成物。

項２７．組成物が液剤または懸濁液剤であり、メチオニンの含有量が１〜３０ｍｇ／ｇであることを特徴とする、項２２〜２６のいずれか一項に記載の組成物。

項２８．組成物が液剤または懸濁液剤であり、溶解補助剤の含有量が０．１〜１０ｍｇ／ｇであることを特徴とする、項２３〜２７のいずれか一項に記載の注射用医薬組成物。

項２９．項８〜１０、１７、１８、および２５〜２８のいずれか一項に記載の組成物を凍結乾燥した凍結乾燥製剤。

項３０．組成物が液剤、懸濁液剤、または凍結乾燥製剤であることを特徴とする、項１〜１８のいずれか一項に記載の組成物。

項３１．組成物が液剤、または懸濁液剤であることを特徴とする、項１〜７、１１〜１６、１９〜２４、および３０のいずれか一項に記載の医薬組成物。

項３２．凍結乾燥製剤の形態である項２〜７のいずれか一項に記載の組成物に、液剤の形態である項１１〜１５のいずれか一項に記載の組成物を加えることにより製造される、項２０〜２４のいずれか一項に記載の組成物。

項３３．液剤または懸濁液剤であることを特徴とする、項３２に記載の組成物。

項３４．項１〜２８、および３０〜３３のいずれか一項に記載の組成物を含む癌ワクチン組成物。

項３５．さらにアジュバントを含有することを特徴とする、項３４に記載の癌ワクチン組成物。

項３６．アジュバントがモンタナイドである、項３５に記載の癌ワクチン組成物。

項３７．注射用医薬組成物中における成分（ａ）：
（ａ）式（１）：

（式中、ＣｙｓとＣｙｓの間の結合はジスルフィド結合を表し、Ｌｅｕ−ＯＨはＬｅｕのＣ末端がフリーのカルボキシル基であることを示し、他の結合はペプチド結合を示す。）
で表されるペプチド、Trp-Ala-Pro-Val-Leu-Asp-Phe-Ala-Pro-Pro-Gly-Ala-Ser-Ala-Tyr-Gly-Ser-Leu（配列番号：１）で表されるアミノ酸配列からなるペプチドおよびそれらの塩から選択される１種以上のペプチド
の安定性を向上させる方法であって、上記成分（ａ）、ならびに以下の成分（ｂ）および（ｃ）：
（ｂ）トレハロースまたはトレハロース水和物
（ｃ）ｐＨ調整剤
を該組成物中に配合させることを含む、方法。

項３８．癌ワクチン組成物中におけるペプチド（ａ）：
（ａ）式（１）：

（式中、ＣｙｓとＣｙｓの間の結合はジスルフィド結合を表し、Ｌｅｕ−ＯＨはＬｅｕのＣ末端がフリーのカルボキシル基であることを示し、他の結合はペプチド結合を示す。）
で表されるペプチド、Trp-Ala-Pro-Val-Leu-Asp-Phe-Ala-Pro-Pro-Gly-Ala-Ser-Ala-Tyr-Gly-Ser-Leu（配列番号：１）で表されるアミノ酸配列からなるペプチドおよびそれらの塩から選択される１種以上のペプチド
の安定性を向上させる方法であって、上記成分（ａ）、ならびに以下の成分（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）：
（ｂ）トレハロースまたはトレハロース水和物
（ｃ）ｐＨ調整剤
（ｄ）メチオニン
を該組成物中に配合させることを含む、方法。

項３９．凍結乾燥製剤の形態である項２〜７のいずれか一項に記載の組成物に、液剤の形態である項１１〜１５のいずれか一項に記載の組成物を加えることを特徴とする、項２０〜２４のいずれか一項に記載の組成物の製造方法。

項４０．項３９に記載の方法により得られる組成物を、アジュバントに添加することを特徴とする、癌ワクチン組成物の製造方法。

項４１．成分（ｂ）の含有量が１〜１００ｍｇ／ｇである、項１８に記載の組成物。

項４２．ｐＨ調整剤が塩酸および／または水酸化ナトリウムであることを特徴とする、項１〜１８のいずれか一項に記載の注射用医薬組成物。

本発明の注射用医薬組成物を用いることにより、細胞傷害性Ｔ細胞誘導活性を有する本発明のペプチドを安定に含有する癌ワクチン組成物を製造することができ、製剤安定性に優れた癌ワクチンを調製することができる。また、注射用医薬組成物を凍結乾燥した凍結乾燥製剤にした場合、ペプチドが安定に維持される凍結乾燥製剤を調製することができる。

図１は、試験例４の結果を示すグラフである。縦軸は播種細胞数中に反応した細胞数を、横軸はｉｎ ｖｉｔｒｏでパルスしたペプチドを示す。図１の黒棒はＨＬＡ−Ａ＊０２：０１遺伝子導入マウス由来の脾細胞を配列番号：３で表されるペプチドをパルスしながら培養した結果を示し、白棒は非パルスで培養した結果を示す。 図２は、試験例４の結果を示すグラフである。縦軸は播種細胞数中に反応した細胞数を、横軸はｉｎ ｖｉｔｒｏでパルスしたペプチドを示す。図２の黒棒はＨＬＡ−Ａ＊２４：０２遺伝子導入マウス用いた由来の脾細胞を配列番号：５で表されるペプチドをパルスしながら培養した結果を示し、白棒は非パルスで培養した結果を示す。

以下、本発明の実施形態について詳細に説明する。

本明細書において、各例示の好ましい態様は、他の例示の好ましい態様と組み合わせてもよく、上述の項１〜項４２に記載される対応する例示に組み込んでもよい。

本発明における「注射用医薬組成物」とは、本発明のペプチドおよび該ペプチドを除く１以上の成分を含む組成物のことである。注射用医薬組成物とさまざまなアジュバントとを混合することで、癌ワクチン組成物を調製することができる。

本発明の注射用医薬組成物は、溶液、懸濁液、凍結乾燥製剤等の形態で提供され得る。

本発明における「液剤」とは、「注射用医薬組成物」に含まれる各成分を溶媒に溶解したものである。本発明における「溶媒」としては、通常水が挙げられるが、発明の効果に影響されない範囲で、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等の薬理学的に許容された溶媒を水に一部混合することができる。好ましくは水である。また、後述の「凍結乾燥製剤」を復水し、溶解したものも、本発明における「液剤」に含まれる。

本発明における「懸濁液剤」とは、「注射用医薬組成物」に含まれる各成分を分散媒に混合し、懸濁したものである。本発明における「分散媒」としては、通常水が挙げられるが、発明の効果に影響されない範囲で、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等の薬理学的に許容された溶媒を水に一部混合することができる。好ましくは水である。また、後述の「凍結乾燥製剤」を復水し、懸濁したものも、本発明における「懸濁液剤」に含まれる。

本発明における「凍結乾燥製剤」とは、本発明における「液剤」または「懸濁液剤」を凍結乾燥したものである。通常「液剤」または「懸濁液剤」におけるペプチドの化学的、物理的安定性を向上させるために行う。癌ワクチンとして使用する場合は、適量の水を添加し、攪拌することで液剤または懸濁液剤としてから、さまざまなアジュバントと混合し、癌ワクチン組成物を調製する。

本発明における「ペプチド」とは、癌ワクチンを調製するための癌抗原ペプチドであり、式（１）で表されるペプチド、およびTrp-Ala-Pro-Val-Leu-Asp-Phe-Ala-Pro-Pro-Gly-Ala-Ser-Ala-Tyr-Gly-Ser-Leu（配列番号：１）で表されるアミノ酸配列からなるペプチドからなる群より選択されるペプチド、あるいはそれらの塩のことである。

（式中、ＣｙｓとＣｙｓの間の結合はジスルフィド結合を表し、Ｌｅｕ−ＯＨはＬｅｕのＣ末端がフリーのカルボキシル基であることを示し、他の結合はペプチド結合を示す。）

本明細書において、ペプチドは左側がＮ末端であり、各アミノ酸記号はそれぞれ以下のアミノ酸残基であることを示している。
AlaまたはＡ：アラニン残基
ArgまたはＲ：アルギニン残基
AsnまたはＮ：アスパラギン残基
AspまたはＤ：アスパラギン酸残基
CysまたはＣ：システイン残基
GlnまたはＱ：グルタミン残基
GluまたはＥ：グルタミン酸残基
GlyまたはＧ：グリシン残基
HisまたはＨ：ヒスチジン残基
IleまたはＩ：イソロイシン残基
LeuまたはＬ：ロイシン残基
LysまたはＫ：リジン残基
MetまたはＭ：メチオニン残基
PheまたはＦ：フェニルアラニン残基
ProまたはＰ：プロリン残基
SerまたはＳ：セリン残基
ThrまたはＴ：スレオニン残基
TrpまたはＷ：トリプトファン残基
TyrまたはＹ：チロシン残基
ValまたはＶ：バリン残基

「式（１）で表されるペプチド」とは、Arg-Met-Phe-Pro-Asn-Ala-Pro-Tyr-Leu（配列番号：３）のＮ末端にシステイン残基を結合した、Cys-Arg-Met-Phe-Pro-Asn-Ala-Pro-Tyr-Leu（配列番号：４）で表されるアミノ酸配列からなるペプチドと、Cys-Tyr-Thr-Trp-Asn-Gln-Met-Asn-Leu（配列番号：５）で表されるペプチドのシステイン残基同士をジスルフィド結合したものである。
Arg-Met-Phe-Pro-Asn-Ala-Pro-Tyr-Leu（配列番号：３）で表されるアミノ酸配列からなるペプチドとは、ウィルムス腫瘍の癌抑制遺伝子ＷＴ１の遺伝子産物であるタンパク質（具体的には、４４９個のアミノ酸からなるヒトのＷＴ１タンパク質（配列番号：２））のＮ末端から１２６番目のアルギニン（Ａｒｇ）から１３４番目のロイシン（Ｌｅｕ）までの９個の連続するアミノ酸からなる部分ペプチド（ＷＴ１_{１２６−１３４}ペプチド）である。当該ペプチドは、ＭＨＣクラスＩ抗原に提示されかつＣＴＬにより抗原認識されるペプチドである。
Cys-Tyr-Thr-Trp-Asn-Gln-Met-Asn-Leu（配列番号：５）で表されるアミノ酸配列からなるペプチドとは、ＷＴ１タンパク質のＮ末端から２３５番目のシステイン（Ｃｙｓ）から２４３番目のロイシン（Ｌｅｕ）までの９個の連続するアミノ酸からなる部分ペプチド（ＷＴ１_{２３５−２４３}ペプチド）において、そのＮ末端から２番目のアミノ酸をメチオニン（Ｍｅｔ）からチロシン（Ｔｙｒ）に改変した改変ペプチドである。当該ペプチドは、ＭＨＣクラスＩ抗原に提示されかつＣＴＬにより抗原認識されるペプチドである。

「Trp-Ala-Pro-Val-Leu-Asp-Phe-Ala-Pro-Pro-Gly-Ala-Ser-Ala-Tyr-Gly-Ser-Leu（配列番号：１）で表されるアミノ酸配列からなるペプチド」とは、ＷＴ１タンパク質のＮ末端から３４番目のトリプトファン（Ｔｒｐ）から５１番目のロイシン（Ｌｅｕ）までの１８個のアミノ酸からなる部分ペプチド（ＷＴ１_{３４−５１}ペプチド）である。当該ペプチドは、ＭＨＣクラスＩＩ抗原に提示されかつＷＴ１特異的なヘルパーＴ細胞を誘導するペプチドである。

式（１）で表されるペプチド、配列番号：１で表されるアミノ酸配列からなるペプチドの塩としては、薬学上許容される塩であれば特に制限されない。本発明における「塩」としては、酸付加塩および塩基付加塩が挙げられる。例えば、酸付加塩としては、塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、ヨウ化水素酸塩、硝酸塩、リン酸塩などの無機酸塩、クエン酸塩、シュウ酸塩、酢酸塩、ギ酸塩、プロピオン酸塩、安息香酸塩、トリフルオロ酢酸塩、マレイン酸塩、酒石酸塩、メタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、パラトルエンスルホン酸塩などの有機酸塩が挙げられ、塩基付加塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、アンモニウム塩などの無機塩基塩、トリエチルアンモニウム塩、トリエタノールアンモニウム塩、ピリジニウム塩、ジイソプロピルアンモニウム塩などの有機塩基塩などが挙げられ、さらにはアルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸などの塩基性あるいは酸性アミノ酸といったアミノ酸塩が挙げられる。

式（１）で表されるペプチドまたはその塩、配列番号：１で表されるアミノ酸配列からなるペプチドまたはその塩の水和物、エタノール溶媒和物などの溶媒和物も、本発明のペプチドに含まれる。さらに、本発明のペプチドには、式（１）で表されるペプチドのあらゆるジアステレオマー、エナンチオマーなどの存在し得るあらゆる立体異性体またはその塩、およびあらゆる態様の結晶形も包含される。

式（１）で表されるペプチドまたはその塩は、本明細書の実施例に記載された方法、または公知の方法で製造することができる（特許文献２〜４等参照、）。一方、配列番号：１で表されるアミノ酸配列からなるペプチドまたはその塩は、公知の方法で製造することができる（特許文献５参照）。また、本発明のペプチドは、当該技術分野において通常用いられる方法によって製造され得る。例えば、Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９６６； Ｔｈｅ ｐｒｏｔｅｉｎｓ， Ｖｏｌ ２， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９７６； ペプチド合成、丸善（株）、１９７５； ペプチド合成の基礎と実験、丸善（株）１９８５； 医薬品の開発 続 第１４巻・ペプチド合成、廣川書店、１９９１等に記載されているペプチド合成方法によって合成することができる。
上記方法で得られる本発明のペプチドが遊離体である場合には、該遊離体を公知の方法あるいはそれに準じる方法によって適当な塩に変換することができるし、逆に本発明のペプチドが塩として得られた場合には、該塩を公知の方法あるいはそれに準じる方法によって遊離体または他の塩に変換することができる。

本発明の注射用医薬組成物は、式（１）で表されるペプチド、その１種の塩をそれぞれ単独で含有してもよいし、該ペプチドと１種以上のその塩、あるいは２種以上の該ペプチドの塩を含有してもよい（以下、包括して「ペプチド（１）」という場合がある）。同様に、本発明の注射用医薬組成物は、配列番号：１で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、その１種の塩をそれぞれ単独で含有してもよいし、該ペプチドと１種以上のその塩、あるいは２種以上の該ペプチドの塩を含有してもよい（以下、包括して「ペプチド（２）」という場合がある）。さらに、本発明の注射用医薬組成物は、ペプチド（１）とペプチド（２）の両方を含有していてもよい。

本発明の注射用医薬組成物が液剤または懸濁液剤（以下、「本発明の液状製剤」という場合がある。）である場合、本発明のペプチドの本発明の液状製剤重量あたりの含有量は特に規定されず、薬理学的または物性的に許容される含有量であればよい。本発明のペプチドのうち、例えば、ペプチド（１）の好ましい含有量（２種以上のペプチドを含む場合はそれらの全体量として）としては、０．５ｍｇ〜２００ｍｇ／ｇ、さらに好ましくは、０．５ｍｇ〜１００ｍｇ／ｇ、０．５ｍｇ〜５０ｍｇ／ｇ、および１ｍｇ〜２５ｍｇ／ｇを挙げることができ、目的に応じて選択すればよい。一方、ペプチド（２）の好ましい含有量（２種以上のペプチドを含む場合はそれらの全体量として）としては、例えば、０．０５ｍｇ〜２００ｍｇ／ｇ、さらに好ましくは、０．０５ｍｇ〜１００ｍｇ／ｇ、０．０５ｍｇ〜５０ｍｇ／ｇ、および０．１ｍｇ〜２５ｍｇ／ｇを挙げることができ、目的に応じて選択すればよい。本発明の液状製剤がペプチド（１）とペプチド（２）の両方を含有する場合、ペプチド（１）とペプチド（２）の重量比は、１：０．１〜１：５の範囲で適宜選択され得る。

本発明の注射用医薬組成物が凍結乾燥製剤（以下、「本発明の凍結乾燥製剤」という場合がある）である場合、本発明のペプチドの体積あたりの含有量は特に規定されない。本発明の凍結乾燥製剤は本発明の液状製剤を凍結乾燥したものであり、ペプチドの含有量は該液状製剤の含有量を満たすものであればよい。尚、本発明の凍結乾燥製剤を復水する際に、凍結乾燥前の本発明の液状製剤の液量より少量の水等で溶解もしくは分散させることにより、凍結乾燥前より高濃度の本発明の液状製剤を得ることができる。

本発明の注射用医薬組成物は、上記した本発明のペプチド（成分（ａ））に加えて、以下の成分（ｂ）および（ｃ）：
（ｂ）トレハロースまたはトレハロース水和物
（ｃ）ｐＨ調整剤
を含有することを特徴とする。

本発明における「トレハロース」とは、グルコースが１，１−グリコシド結合してできた二糖の一種を表す。トレハロースとしては、無水物であっても良く、あるいはその水和物であっても良い。好ましくはトレハロース水和物である。本発明の注射用医薬組成物は、トレハロースを、無水物、その水和物のいずれか単独の形態で含有してもよいし、それらの２種以上を組み合わせて含有してもよい。本発明の注射用医薬組成物において、トレハロースの組成物における重量あたりの含有量は特に規定はないが、本発明の液状製剤における重量あたりの含有量（２種以上の形態で含有する場合はそれらの全体量として）としては、１〜５０ｍｇ／ｇ、１〜７０ｍｇ／ｇ、１〜１００ｍｇ／ｇ、１〜１５０ｍｇ／ｇ、１〜２００ｍｇ／ｇ、３〜５０ｍｇ／ｇ、３〜７０ｍｇ／ｇ、３〜１００ｍｇ／ｇ、３〜１５０ｍｇ／ｇ、３〜２００ｍｇ／ｇ、５〜５０ｍｇ／ｇ、５〜７０ｍｇ／ｇ、５〜１００ｍｇ／ｇ、５〜１５０ｍｇ／ｇ、および５〜２００ｍｇ／ｇ等が挙げられる。

本発明における「ｐＨ調整剤」とは、一般に医薬品製剤に用いられるｐＨ調整剤を表す。具体的には、塩酸、硫酸、リン酸、リン酸二ナトリウム、リン酸二カリウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸二水素カリウムおよびリン酸三ナトリウムなどの無機酸またはその塩、硝酸、酢酸、クエン酸、酒石酸、乳酸、マレイン酸、酢酸ナトリウム水和物、無水酢酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム水和物、クエン酸二水素ナトリウム、酒石酸ナトリウムなどの有機酸またはその塩、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニア水等の無機塩基、あるいはトロメタモール、ヒスチジン、Ｌ−アルギニン、およびメグルミン等の有機塩基が挙げられる。好ましくはクエン酸、乳酸、酒石酸、塩酸、硫酸、硝酸、水酸化ナトリウムおよび水酸化カリウム、あるいはトリメタモール、ヒスチジン、Ｌ−アルギニン、およびメグルミンであり、さらに好ましくは酒石酸、塩酸、および水酸化ナトリウム、あるいはトロメタモール、Ｌ−アルギニン、およびメグルミンである。
また、別の観点から、成分（ａ）がペプチド（２）である場合、ｐＨ調整剤において酸としては弱酸が好ましい。

ｐＨ調整剤は、本発明の液状製剤のｐＨを、本発明のペプチドの安定性を担保し得るｐＨ範囲に調整するために添加される。本発明のペプチドの安定性を担保し得るｐＨ範囲は、後述するとおり、液状製剤中に含有される本発明のペプチドの種類によって変動するため、それぞれに応じたｐＨ調整剤が用いられる。
本発明の注射用医薬組成物がペプチド（１）のみを含有する場合、本発明の液状製剤のｐＨは１〜１０である。液状製剤が液剤の場合、溶解度および安定性の観点から好ましいｐＨは１〜４であり、さらに好ましくは１〜３であり、最も好ましいのは２〜３である。液状製剤が懸濁液剤の場合、溶解度の関係からｐＨ５〜１０が好ましい。上記以外のその他の態様では、液状製剤が液剤の場合、好ましいｐＨとして、１．５〜４．５、１．５〜３．５、１．５〜３．０、２．０〜３．０が挙げられ、懸濁液剤の場合、好ましいｐＨとして、４〜９、４〜６、５〜９が挙げられる。
一方、本発明の注射用医薬組成物がペプチド（２）のみを含有する場合、本発明の液状製剤のｐＨは２〜１０であり、より具体的な範囲として、２〜３、３〜９、６〜９、７である。安定性の観点から好ましいｐＨは５〜１０であり、さらに好ましくは６〜８である。
さらに、本発明の注射用医薬組成物がペプチド（１）とペプチド（２）とを含有する場合、本発明の液状製剤のｐＨは２〜１０である。液状製剤が液剤の場合、安定性の観点から好ましいｐＨは２〜４、２〜３、１．７〜３．２、および１．５〜３．５が挙げられる。
本明細書における数字は記載している数字の一つ下の桁を四捨五入して表す。例えば、２であれば１．５以上２．５未満をさす。

本発明の液状製剤がｐＨ調整剤を含まない場合に、所望のｐＨ範囲より高いｐＨ値を示す場合、ｐＨ調整剤として無機酸もしくは有機酸などを添加することで、所望のｐＨに調整することができる。無機酸および有機酸としては、上記のものを用いることができる。
本発明の液状製剤がｐＨ調整剤を含まない場合に、所望のｐＨ範囲より低いｐＨ値を示す場合、ｐＨ調整剤として無機塩基または有機塩基を用いることができる。無機塩基および有機塩基としては、上記のものを用いることができる。本発明の注射用医薬組成物がペプチド（２）のみを含有する場合には、ｐＨ調整剤として無機塩基または有機塩基を用いることが好ましい。具体的には、リン酸水素二ナトリウム、トロメタモール、ヒスチジン、Ｌ−アルギニン、およびメグルミン等が挙げられる。好ましくはリン酸水素二ナトリウム、トロメタモール、Ｌ−アルギニン、およびメグルミンである。本発明の注射用医薬組成物において、有機塩基の組成物における重量あたりの含有量は特に規定はないが、本発明の液状製剤における重量あたりの含有量としては、１〜１００ｍｇ／ｇ、１〜５０ｍｇ／ｇ、１〜１５０ｍｇ／ｇ、５〜１００ｍｇ／ｇ、５〜５０ｍｇ／ｇ、５〜１５０ｍｇ／ｇ、１０〜１００ｍｇ／ｇ、１０〜５０ｍｇ／ｇ、および１０〜１５０ｍｇ／ｇ等が挙げられる。

本発明の注射用医薬組成物が成分（ａ）としてペプチド（１）を含有する場合、該組成物はマンニトールを含有してもよい。
本発明における「マンニトール」とは、糖アルコールの一種であり、ヘキシトールに分類され、マンノースの還元体に相当するものを表す。マンニトールには光学異性体が存在し、Ｄ体、Ｌ体またはＤＬ体があるが、これらのうちのどれを使用しても本発明の効果に影響はない。好ましくは天然に多く存在するＤ−マンニトールである。また、マンニトールには複数の結晶系があるが、これらのうちのどれを使用しても本発明の効果に影響はない。本発明の注射用医薬組成物において、マンニトールの組成物における重量あたりの含有量は特に規定はないが、本発明の液状製剤における重量あたりの含有量としては、１〜２０ｍｇ／ｇ、１〜３０ｍｇ／ｇ、１〜５０ｍｇ／ｇ、３〜２０ｍｇ／ｇ、３〜３０ｍｇ／ｇ、５〜２０ｍｇ／ｇ、および５〜３０ｍｇ／ｇ等が挙げられる。

本発明の注射用医薬組成物が成分（ａ）としてペプチド（２）を含有する場合、該ペプチドの溶解性が不安定になるため、該組成物は溶解補助剤をさらに含有することが好ましい。「溶解補助剤」としては、例えば有機酸を用いることができる。溶解補助剤を用いることで、液剤のペプチド（２）の溶解工程において、速やかに溶解させることができる。さらに、本発明の液状製剤を凍結乾燥した凍結乾燥製剤において、凍結乾燥製剤に注射用水を用いて、復水する場合、速やかに再溶解させることができる。溶解補助剤としては、具体的には、クエン酸、乳酸、酒石酸、酢酸、およびトリフルオロ酢酸等が挙げられる。好ましくはクエン酸、乳酸、および酒石酸であり、さらに好ましくは酒石酸である。本発明の注射用医薬組成物において、溶解補助剤の組成物における重量あたりの含有量は特に規定はないが、本発明の液状製剤における重量あたりの含有量としては、１〜５ｍｇ／ｇ、１〜１０ｍｇ／ｇ、１〜１５ｍｇ／ｇ、１〜２０ｍｇ／ｇ、３〜１０ｍｇ／ｇ、３〜１５ｍｇ／ｇ、３〜２０ｍｇ／ｇ、５〜１０ｍｇ／ｇ、５〜１５ｍｇ／ｇ、５〜２０ｍｇ／ｇ、０．１〜５ｍｇ／ｇ、０．１〜１０ｍｇ／ｇ、０．１〜１５ｍｇ／ｇ、０．１〜２０ｍｇ／ｇ、０．３〜１０ｍｇ／ｇ、０．３〜１５ｍｇ／ｇ、０．３〜２０ｍｇ／ｇ、０．５〜１０ｍｇ／ｇ、０．５〜１５ｍｇ／ｇ、および０．５〜２０ｍｇ／ｇが挙げられる。

本発明の注射用医薬組成物が成分（ａ）としてペプチド（１）を含有する場合、癌ワクチン組成物として調製したときの該ペプチドの安定性の観点から、該組成物はメチオニンをさらに含有することが望ましい。メチオニンを配合させることで、癌ワクチン組成物として調製したときに、ペプチド（１）に含まれるメチオニン残基の酸化を抑えることができる。
本発明の「メチオニン」は必須アミノ酸のひとつで、側鎖に硫黄原子を含んだ疎水性のアミノ酸である。「メチオニン」には光学異性体が存在し、Ｄ体、Ｌ体またはＤＬ体があるが、これらのうちのどれを使用しても本発明の効果に影響はない。医薬品に多くの添加物としての使用前例があり、日本薬局方（第１６改正）に記載されているＬ体が好ましい。本発明の注射用医薬組成物において、メチオニンの組成物における重量あたりの含有量は特に規定はないが、好ましくは本発明の液状製剤における重量あたりの含有量としては、１〜５ｍｇ／ｇ、１〜１０ｍｇ／ｇ、１〜２０ｍｇ／ｇ、１〜３０ｍｇ／ｇ、３〜１０ｍｇ／ｇ、３〜２０ｍｇ／ｇ、３〜３０ｍｇ／ｇ、５〜１０ｍｇ／ｇ、５〜２０ｍｇ／ｇ、および５〜３０ｍｇ／ｇ等が挙げられる。

また、本発明の注射用医薬組成物には、上記の成分のほか、本発明の効果に影響を与えない範囲で適宜、安定剤、可溶化剤、緩衝剤、等張化剤等、医薬品製剤に一般に用いられる添加剤を使用することができる。

本発明の注射用医薬組成物は、医薬品製造等で一般的に用いられる方法で製造することができる。具体的には、例えば、５〜２５℃の一定温度に維持された環境下で、適当な容器に注射用水を仕込み、緩やかに攪拌しながら、あらかじめ秤量されたペプチドおよび添加剤を加え、最終的に所望のｐＨに調整することにより調製することができ、調製後にフィルターろ過等により滅菌し、ガラス製バイアル等の容器に充填し、ゴム栓等で密封すればよい。凍結乾燥製剤とする場合は、自体公知の方法により、得られた本発明の液状製剤を凍結乾燥すればよい。

本発明のペプチドは、それぞれ単独で癌ワクチン用の抗原ペプチドとして用いることも可能であるが、ペプチド（１）とペプチド（２）の両方を癌ワクチン組成物に含有させることもできる。ペプチド（２）は、自体単独でＨＬＡに結合し、ＣＴＬを誘導するとともに、ペプチド（１）と併用することでヘルパーペプチドとしての効果をも奏するので、ペプチド（１）とペプチド（２）の両方を含有する癌ワクチン組成物は、相乗的なワクチン効果が期待される。癌ワクチン組成物に両ぺプチドを配合させる場合、両ペプチドを含有する１つの本発明の注射用医薬組成物をアジュバントと混合しても良いし、それぞれのペプチドを含有した２つの本発明の注射用医薬組成物をアジュバントと三者混合しても良い。
ペプチド（１）とペプチド（２）の両方を含有する本発明の液状製剤は、両ペプチドを上記の製法に供することで、直接（一段階で）調製することもできるし、各ペプチドを上記の製造に供して、別個の液剤または懸濁液剤として調製した後、両者を混合することにより得ることもできる。好ましい一実施態様においては、ペプチド（１）を含有する液剤または懸濁液剤を凍結乾燥し、これにペプチド（２）を含有する液剤または懸濁液剤を加えて、ペプチド（１）を含有する凍結乾燥製剤を溶解もしくは懸濁する方法が挙げられる。あるいは、各ペプチドを含有する２種の凍結乾燥製剤を調製した後、ペプチド（２）を含有する凍結乾燥製剤を凍結乾燥前の液剤または懸濁液剤よりも少量の水等で再溶解もしくは再懸濁し、該溶液または懸濁液を、ペプチド（１）を含有する凍結乾燥製剤に添加して溶解もしくは懸濁することで、凍結乾燥前の液剤または懸濁液剤よりも高濃度の液剤または懸濁液剤として調製することができる。

本発明の注射用医薬組成物を用いて癌ワクチンを調製する方法は特に限定されないが、例えば、適切なアジュバントと混合し、癌ワクチンを調製する方法；予め適切なアジュバントと混合した後、さらに凍結乾燥等により癌ワクチン製剤を調製する方法；本発明の液状製剤を用時調製により種々のアジュバントと混合し、癌ワクチンとする方法等が挙げられる。アジュバントとしては、沈降性アジュバントおよび油性アジュバント等が挙げられる。沈降性アジュバントは、ペプチドが吸着する無機物の懸濁剤を表す。沈降性アジュバントとしては、具体的には、水酸化ナトリウム、水酸化アルミニウム（アラム、Alum）、リン酸カルシウム、リン酸アルミニウム、ミョウバン、ペペス、カルボキシビニルポリマー等が挙げられる。油性アジュバントは、ペプチドを含む水溶液を鉱油で包みミセルをつくり乳化する油乳剤を表す。油性アジュバントとしては、具体的には、流動パラフィン、ラノリン、フロイントアジュバント（完全フロイントアジュバント、不完全フロイントアジュバント）、モンタナイド、Ｗ／Ｏエマルション（ＷＯ２００６／０７８０５９参照）等が挙げられる。

本発明の注射用医薬組成物を用いて調製される癌ワクチンは、ＷＴ１遺伝子の発現レベルの上昇を伴う癌、例えば白血病、骨髄異形成症候群、多発性骨髄腫、悪性リンパ腫等の血液の癌、胃癌、大腸癌、肺癌、乳癌、胚細胞癌、肝癌、皮膚癌、膀胱癌、前立腺癌、子宮癌、子宮頚癌、卵巣癌、脳腫瘍等の固形癌の予防又は治療のために使用することができる。

本発明の注射用医薬組成物は、有効成分である癌抗原ペプチドを安定に保持できることから、種々の投与形態を選択することができる。具体的には、経口、経鼻、経肺、経皮、皮内、皮下、筋肉内、静脈内、腹腔内等が挙げられ、上記の方法により、目的に応じて癌ワクチンを調製すればよい。一般に、癌ワクチンとして、免疫賦活するのに好ましい投与経路としては非経口投与が知られており、例えば、腹腔内投与、皮下投与、皮内投与、筋肉内投与、静脈内投与のほか、経鼻投与や経皮投与等が挙げられる。このうち、好ましくは皮下投与、皮内投与、腹腔内投与、筋肉内投与等の注射的投与が挙げられる。

以下に、実施例、比較例、試験例等を挙げて本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらに限定されない。
Trp-Ala-Pro-Val-Leu-Asp-Phe-Ala-Pro-Pro-Gly-Ala-Ser-Ala-Tyr-Gly-Ser-Leu（配列番号：１）で表されるアミノ酸配列からなるペプチド（ペプチド（２））として、特許文献（ＷＯ２０１０／１２３０６５号）に記載されている方法で製造したペプチドを用い、トレハロースとして、トレハロース水和物である「トレハロースＳＧ（林原生物化学研究所製）」を用い、Ｄ−マンニトールとして「マンニットＳ（三菱商事フードテック社製）もしくはＤ−（−）−Ｍａｎｎｉｔｏｌ ｌｏｗ ｉｎ ｅｎｄｏｔｏｘｉｎｓ（メルク社製）」を用いた。トロメタモールとして「トロメタモール（ナカライテスク社製）」を用い、ヒスチジンとして「ヒスチジン（ナカライテスク社製）」を用い、Ｌ−アルギニンとして「Ｌ−アルギニン塩酸塩（ナカライテスク社製）」を用い、メグルミンとして「メグルミン（ナカライテスク社製）」を用いた。乳酸として「乳酸（ナカライテスク社製）」を用い、酒石酸として「Ｌ（＋）−Ｔａｒｔａｒｉｃ ａｃｉｄ， ｐｏｗｄｅｒ（メルク社製）」を用い、クエン酸として「くえん酸一水和物（ナカライテスク社製）」を用いた。メチオニンとして「Ｌ−メチオニン（協和発酵バイオ社製）」を用いた。ｐＨ調整剤として、塩酸としては「１ｍｏｌ／ｌ−塩酸（ナカライテスク社製）」を用い、水酸化ナトリウムとしては「１ｍｏｌ／ｌ−水酸化ナトリウム溶液（ナカライテスク社製）」を用い、リン酸二水素ナトリウムとして「りん酸二水素ナトリウム二水和物（ナカライテスク社製）」を用いた。モンタナイドとして「（Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ ＩＳＡ ５１ ＶＧ（ＳＥＰＰＩＣ社製）」を用いた。

〔ペプチドの合成〕
式（１）で表されるペプチド（ペプチド（１））の合成

工程１． H-Cys(Npys)-Arg-Met-Phe-Pro-Asn-Ala-Pro-Tyr-Leu-OHの合成
（Ｃ(Npys)ＲＭＦＰＮＡＰＹＬの合成）
Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−Ａｌｋｏ−樹脂（Ａｌｋｏはｐ−アルコキシベンジルアルコール）２８２ｍｇ（渡辺化学製；０．７１ｍｍｏｌ／ｇ、０．２ｍｍｏｌ）を出発原料としＦｍｏｃ／ｔＢｕ法による固相合成によりペプチド鎖の組上げを行った。固相合成にはＣＳ Ｂｉｏ社製ＣＳ３３６Ｘ型ペプチド合成機を用い、Ｆｍｏｃ基の脱保護は２０％ピペリジンのＤＭＦ溶液で５分間および２０分間処理することにより行った。保護アミノ酸のカップリングは１．０５ｍｍｏｌの保護アミノ酸、１ｍｍｏｌのＨＢＴＵ、２ｍｍｏｌのＤＩＰＥＡのＤＭＦ溶液と１時間反応させることにより行った。得られた樹脂をＤＭＦおよびエーテルで洗浄後減圧乾燥することにより、Boc-Cys(Npys)-Arg(Pmc)-Met-Phe-Pro-Asn(Trt)-Ala-Pro-Tyr(tBu)-Leu-Alko-樹脂６３０ｍｇを得た。このペプチド樹脂にＴＦＡ／Ｈ_２Ｏ／ＴＩＳ＝９５／２．５／２．５の混合液１０ｍｌを加え、室温にて２時間振とうした。樹脂を濾去後、反応液を減圧濃縮した。反応液を氷冷しジエチルエーテル５０ｍｌを加えた。生じた沈殿物を濾取しエーテルで洗浄後減圧乾燥することにより粗ペプチド２１７ｍｇを得た。得られた粗ペプチド溶液を２０％酢酸水７ｍｌとアセトニトリル１ｍｌの混合液に溶解し逆相ＨＰＬＣにて精製した。
ポンプ：Ｓｈｉｍａｚｕ製；ＬＣ−８Ａ型
カラム：ＹＭＣ ＯＤＳ−Ａ ３ｃｍφ×２５ｃｍＬ, １０μｍ
溶出液１：Ｈ_２Ｏ／０．１％ＴＦＡ
溶出液２：ＣＨ_３ＣＮ／０．１％ＴＦＡ
流速：２０ｍｌ／ｍｉｎ
検出：ＵＶ２２０ｎｍ
２液濃度１５％で平衡化させたカラムに粗ペプチド溶液を注入した。その後２液濃度を１０分間で３７％に上昇させ、その後１分間あたり０．２４％の割合で上昇させた。目的物を含む画分を集め凍結乾燥することにより、H-Cys(Npys)-Arg-Met-Phe-Pro-Asn-Ala-Pro-Tyr-Leu-OH ５３ｍｇを得た。
質量分析：ＬＣ−ＥＳＩ／ＭＳ ｍ／ｚ ＝１３６６．１ [Ｍ＋１]＋ （理論値＝１３６６．６）

工程２． (H-Cys-Tyr-Thr-Trp-Asn-Gln-Met-Asn-Leu-OH)(H-Cys-Arg-Met-Phe-Pro-Asn-Ala-Pro-Tyr-Leu-OH) disulfide bondの合成
〔すなわち式（１）：

（式中、ＣｙｓとＣｙｓの間の結合はジスルフィド結合を表し、Ｌｅｕ−ＯＨはＬｅｕのＣ末端がフリーのカルボキシル基であることを示し、他の結合はペプチド結合を示す。）
で表される化合物の合成〕
工程１で得たH-Cys(Npys)-Arg-Met-Phe-Pro-Asn-Ala-Pro-Tyr-Leu-OH ５０ｍｇと公知の方法(例えばＷＯ０７／０６３９０３)で合成したH-Cys-Tyr-Thr-Trp-Asn-Gln-Met-Asn-Leu-OH（すなわちＣＹＴＷＮＱＭＮＬ（配列番号：４）） ４３ｍｇを混合し、ＤＭＳＯ １ｍＬを加え、室温にて２０分間攪拌した。反応液を０．１％ＴＦＡ水 ５ｍｌで希釈し逆相ＨＰＬＣにて精製した。
ポンプ：Ｓｈｉｍａｚｕ製；ＬＣ−８Ａ型
カラム：ＹＭＣ ＯＤＳ−Ａ ３ｃｍφ×２５ｃｍＬ, １０μｍ
溶出液１：Ｈ_２Ｏ／０．１％ＴＦＡ
溶出液２：ＣＨ_３ＣＮ／０．１％ＴＦＡ
流速：２０ｍｌ／ｍｉｎ
検出：ＵＶ２２０ｎｍ
２液濃度２５％で平衡化させたカラムに当該反応液を注入した。その後２液濃度を１分間あたり０．２５％の割合で上昇させた。目的物を含む画分を集め凍結乾燥した後、逆相ＨＰＬＣによる再精製、凍結乾燥を行うことにより、(H-Cys-Tyr-Thr-Trp-Asn-Gln-Met-Asn-Leu-OH)(H-Cys-Arg-Met-Phe-Pro-Asn-Ala-Pro-Tyr-Leu-OH) disulfide bond（すなわち式（１）で示されるペプチド（ペプチド（１）） ２１ｍｇを得た。
質量分析：ＬＣ−ＥＳＩ／ＭＳ ｍ／ｚ ＝１１９１．８ [Ｍ＋２]２＋ （理論値＝１１９１．９）

（式中、ＣｙｓとＣｙｓの間の結合はジスルフィド結合を表し、Ｌｅｕ−ＯＨはＬｅｕのＣ末端がフリーのカルボキシル基であることを示し、他の結合はペプチド結合を示す。）

〔液剤または懸濁液剤の調製〕
〔実施例１〕
ペプチド（成分（ａ））として上記ペプチド（１）、成分（ｂ）としてトレハロースを表１に記載の量となるよう注射用水に溶解させ、ｐＨ調整剤（成分（ｃ））として、塩酸および／または水酸化ナトリウムでｐＨを１に調整した。０．２μｍの滅菌フィルターを通してろ過した後、ガラス製バイアルに１ｍＬずつ充填し、ブチルゴム栓で密封した。これにより、実施例１の液剤を得た。

〔実施例２〜１０〕
実施例１と同様に、ペプチド（１）、トレハロース、ｐＨ調整剤（塩酸および／または水酸化ナトリウム）、注射用水を表１または２に記載の量で調製し、バイアルに充填し、ブチルゴム栓で密封することにより実施例２、３、５〜８および１０の液剤を得た。
実施例１と同様に、ペプチド（１）、トレハロース、ｐＨ調整剤（塩酸および／または水酸化ナトリウム）、注射用水を表１または２に記載の量で調製し、バイアルに充填し、ブチルゴム栓で密封することにより実施例４および９の液剤を得る。

〔実施例１１〜１９〕
実施例１と同様に、成分（ａ）として配列番号：１（ＷＡＰＶＬＤＦＡＰＰＧＡＳＡＹＧＳＬ）で示されるペプチド（以下、ペプチド（２））、トレハロース、ｐＨ調整剤（塩酸および／または水酸化ナトリウム）、注射用水を表３または４に記載の量で調製し、バイアルに充填し、ブチルゴム栓で密封することにより実施例１２、１５および１８の液剤を得た。
実施例１と同様に、成分（ａ）として配列番号：１（ＷＡＰＶＬＤＦＡＰＰＧＡＳＡＹＧＳＬ）で示されるペプチド（以下、ペプチド（２））、トレハロース、ｐＨ調整剤（塩酸および／または水酸化ナトリウム）、注射用水を表３または４に記載の量で調製し、バイアルに充填し、ブチルゴム栓で密封することにより実施例１１、１３、１４、１６、１７および１９の液剤を得る。

〔実施例２０〜２４〕
実施例１と同様に、ペプチド（１）、トレハロース、Ｄ−マンニトール、注射用水、ｐＨ調整剤（塩酸および／または水酸化ナトリウム）を表５に記載の量で調製し、バイアルに充填し、ブチルゴム栓で密封することにより実施例２０〜２４の液剤を得た。

〔実施例２５〕
適量の注射用水にペプチド（１）、トレハロースを表６に記載の量で調製し、加えて攪拌機で分散後、ｐＨ調整剤として、塩酸および／または水酸化ナトリウムでｐＨを４に調整することで実施例２５の懸濁液剤を得た。

〔実施例２６〜２９〕
実施例２５と同様に、適量の注射用水にペプチド（１）、トレハロースを表６に記載の量で調製し、表６に記載のｐＨ調整剤を用いて、表６のｐＨに調整することで実施例２６〜２９の懸濁液剤を得た。

〔実施例３０〕
ペプチド（成分（ａ））としてペプチド（２）、トレハロース（成分（ｂ））、ｐＨ調整剤（成分（ｃ））として、トロメタモールを表７に記載の量となるよう注射用水に溶解させる。０．２μｍの滅菌フィルターを通してろ過した後、ガラス製バイアルに１ｍＬずつ充填し、ブチルゴム栓で密封する。これにより、実施例３０の液剤を得た。

〔実施例３１〜３４〕
実施例３０と同様に、ペプチド（２）、トレハロース、ｐＨ調整剤、注射用水を表７に記載の量で調製し、バイアルに充填し、ブチルゴム栓で密封することにより実施例３１〜３４の液剤を得た。

〔実施例３５〜３７〕
実施例１と同様に、ペプチド（２）、トレハロース、溶解補助剤（クエン酸、乳酸、酒石酸）、ｐＨ調整剤（塩酸）、注射用水を表８に記載の量で調製し、バイアルに充填し、ブチルゴム栓で密封することにより実施例３５〜３７の液剤を得た。

〔実施例３８〜４３〕
実施例１と同様に、ペプチド（２）、トレハロース、溶解補助剤（酒石酸）、ｐＨ調整剤（塩酸）、注射用水を表９または１０に記載の量で調製し、バイアルに充填し、ブチルゴム栓で密封することにより実施例３８〜４３の液剤を得た。

〔実施例４４〜４７〕
実施例１と同様に、ペプチド（２）、トレハロース、溶解補助剤（酒石酸）、ｐＨ調整剤（塩酸）、注射用水を表１１に記載の量で調製し、バイアルに充填し、ブチルゴム栓で密封することにより実施例４４〜４７の液剤を得た。

〔実施例４８〜５０〕
実施例１と同様に、ペプチド（１）、トレハロース、Ｄ−マンニトール、注射用水、ｐＨ調整剤（塩酸）を表１２に記載の量で調製し、バイアルに充填し、ブチルゴム栓で密封することにより実施例４８〜５０の液剤を得た。

〔実施例５１〜５４〕
実施例１と同様に、ペプチド（１）、トレハロース、Ｄ−マンニトール、メチオニン、注射用水、ｐＨ調整剤（塩酸）を表１３に記載の量で調製し、バイアルに充填し、ブチルゴム栓で密封することにより実施例５２の液剤を得た。
実施例１と同様に、ペプチド（１）、トレハロース、Ｄ−マンニトール、メチオニン、注射用水、ｐＨ調整剤（塩酸）を表１３に記載の量で調製し、バイアルに充填し、ブチルゴム栓で密封することにより実施例５１、５３および５４の液剤を得る。

〔実施例５５〜５８〕
実施例１と同様に、ペプチド（２）、トレハロース、酒石酸、注射用水、ｐＨ調整剤（塩酸）を表１４に記載の量で調製し、バイアルに充填し、ブチルゴム栓で密封することにより実施例５５および５６の液剤を得た。
実施例１と同様に、ペプチド（２）、トレハロース、酒石酸、注射用水、ｐＨ調整剤（塩酸）を表１４に記載の量で調製し、バイアルに充填し、ブチルゴム栓で密封することにより実施例５７および５８の液剤を得る。

〔実施例５９〜６６〕
実施例１と同様に、ペプチド（１）、ペプチド（２）、トレハロース、Ｄ−マンニトール、Ｌ−メチオニン、酒石酸、注射用水、ｐＨ調整剤（塩酸）を表１５または１６に記載の量で調製し、バイアルに充填し、ブチルゴム栓で密封することにより実施例５９〜６６の液剤を得る。

〔凍結乾燥製剤の調製〕
〔実施例１Ａ〜６６Ａ〕
実施例１、４、６、９、１１、１３、１４、１６、１７、１９、２０、５１、５３、５４および５７〜６６で製造した液剤または懸濁液剤をガラスバイアルに充填後、凍結乾燥機に入れ、凍結乾燥を行い、実施例１Ａ、４Ａ、６Ａ、９Ａ、１１Ａ、１３Ａ、１４Ａ、１６Ａ、１７Ａ、１９Ａ、２０Ａ、５１Ａ、５３Ａ、５４Ａおよび５７Ａ〜６６Ａの凍結乾燥製剤を得る。なお、凍結乾燥は、−４０℃付近で液体または懸濁液剤を凍結させた後、庫内を真空に減圧し、同時に、庫内の温度を−２０℃付近に上昇させて２０時間程度乾燥させ、さらに、庫内の温度を３０℃付近に上昇させて１２時間程度乾燥させる条件により、実施する。
実施例２、３、５、７、８、１０、１２、１５、１８、２１〜５０、５２、５５および５６で製造した液剤をガラスバイアルに充填後、凍結乾燥機に入れ、凍結乾燥を行い、実施例２Ａ、３Ａ、５Ａ、７Ａ、８Ａ、１０Ａ、１２Ａ、１５Ａ、１８Ａ、２１Ａ〜５０Ａ、５２Ａ、５５Ａおよび５６Ａの凍結乾燥製剤を得た。なお、凍結乾燥は、−４０℃付近で液剤を凍結させた後、庫内を真空に減圧し、同時に、庫内の温度を−２０℃付近に上昇させて２０時間程度乾燥させ、さらに、庫内の温度を３０℃付近に上昇させて１２時間程度乾燥させる条件により、実施した。

〔試験例１〕液剤および懸濁液剤の安定性の評価
実施例２、３、５、７、８、１０、１２、１５、１８、２１〜２６、３０〜３４および５２の液剤を２５℃で１週間保存後、純度を評価した。純度は、Ｃ１８逆相カラム（２．１ｍｍ×１５０ｍｍ、１．７μｍまたは４．６ｍｍ×１５０ｍｍ、５μｍ）を用い、純水、アセトニトリル、トリフルオロ酢酸を移動相に用いた逆相高速液体クロマトグラフィー法（検出波長：２２０ｎｍ）により測定した。本法で測定したピーク面積を用いて、以下の式によりペプチド純度および開始時の純度を１００％とした場合の相対純度（対ｉｎｉｔｉａｌ値）を算出した。
ペプチド純度（％）＝ペプチドのピーク面積／類縁物質を含む総ピーク面積×１００
相対純度（対ｉｎｉｔｉａｌ値）（％）＝保存時点のペプチド純度／開始時のペプチド純度×１００
結果を表１７に示す。どの製剤も２５℃１週間で８０％以上あり、安定な製剤を得ることができた。

〔試験例２〕凍結乾燥製剤の安定性の評価
実施例５Ａ、１０Ａ、１２Ａ、１５Ａ、１８Ａ、２３Ａ〜２６Ａ、３０Ａ〜４３Ａ、４８Ａ〜５０Ａ、５２Ａ、５５Ａおよび５６Ａの凍結乾燥製剤を６０℃で２週間保存後、注射用水を加え、液剤にした後、純度を評価した。純度は試験例１と同様に測定し算出した。
結果を表１８に示す。どの製剤も６０℃２週間で８０％以上あり、安定な製剤を得ることができた。

〔試験例３〕凍結乾燥製剤の再溶解性の評価
実施例４４Ａ〜４７Ａの凍結乾燥製剤を４０℃で１ヶ月保存後、注射用水を加えて復水した時の溶解性を目視にて確認した。結果を表１９に示す。表１９の結果から、溶解補助剤である酒石酸を予め添加しておくことで再溶解性が向上することが示唆された。

〔試験例４〕特異的ＣＴＬ誘導活性の確認
実施例５１と同一の組成比からなる、ペプチド（１）、トレハロース、Ｄ−マンニトール、メチオニン、注射用水、ｐＨ調整剤（塩酸）を含み、ｐＨを２．７に調整した実施例６７の液剤を得た。実施例６７の液剤をバイアルに２ｍＬ充填し、凍結乾燥機に入れ、凍結乾燥を行い、実施例６７Ａの凍結乾燥製剤を得た。ペプチド（１）を含む実施例６７Ａの凍結乾燥製剤およびペプチド（２）を含む実施例５５Ａの凍結乾燥製剤を用いて、アジュバントと混合することにより癌ワクチン組成物を調製した。また、実施例６７Ａの凍結乾燥製剤の安定性を試験例２と同様に評価したところ、２５℃で３ヶ月保存後の相対純度（対ｉｎｉｔｉａｌ値）は１００％であり、安定な製剤を得ることができた。

１）癌ワクチン組成物の調製
ペプチド（２）を含む実施例５５Ａの凍結乾燥製剤を１．２ｍＬの注射用水で再溶解した。再溶解した製剤を１ｍＬ採取し、ペプチド（１）を含む実施例６７Ａの凍結乾燥製剤に加え、再溶解し、実施例６８の液剤を作製した。この液剤０．９ｍＬにアジュバントであるモンタナイドを０．９ｍＬ混合・乳化し、実施例６７の癌ワクチン組成物とした。

２）ＣＴＬ誘導活性評価
上記癌ワクチン組成物のＣＴＬ誘導能を、ＨＬＡ−Ａ^＊０２：０１遺伝子導入マウスおよびＨＬＡ−Ａ^＊２４：０２遺伝子導入マウスを用いたｉｎ ｖｉｖｏＣＴＬ誘導試験によって評価した。
ＨＬＡ−Ａ^＊０２：０１遺伝子導入マウス（Ｃ５７ＢＬ／６ＣｒＨＬＡ−Ａ２．１ＤＲ１）は、マウスのＭＨＣを欠損し、ヒトのＭＨＣであるＨＬＡ−Ａ^＊０２：０１とマウスＭＨＣであるＨ−２Ｄ^ｂのキメラＨＬＡ、およびＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０１：０１を発現するマウスであり、本マウスを用いることで、ＨＬＡ−Ａ^＊０２陽性のヒトでＣＴＬを誘導し得るペプチドの選択が可能である（Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００４；３４：３０６０−９）。一方、ＨＬＡ−Ａ^＊２４：０２遺伝子導入マウス (Ｃ５７ＢＬ／６ＣｒＨＬＡ−Ａ２４０２／Ｋ^ｂ)は、ヒトのＭＨＣであるＨＬＡ−Ａ^＊２４：０２とマウスＭＨＣであるＨ−２Ｋ^ｂのキメラＨＬＡを発現するマウスであり、本マウスを用いることで、ＨＬＡ−Ａ^＊２４陽性のヒトでＣＴＬを誘導し得るペプチドの選択が可能である（Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ．２００２；１００：５６５−７０）。
上記癌ワクチン組成物を、マウスの尾根部皮内に５０μＬ／ｓｉｔｅで２箇所に投与した。癌ワクチン組成物のペプチド特異的Ｔ細胞誘導評価では、ＩＦＮγ ＥＬＩＳＰＯＴ ａｓｓａｙ ｋｉｔを用いた。投与１週間後に、マウスをＣＯ_２ガスにより安楽死させたのち脾臓を摘出し、脾細胞を調製した。脾細胞調製の前日に、ＥＬＩＳＰＯＴプレートを抗マウスＩＦＮγ抗体で処理し、当日に１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地でブロッキングした。調製したＨＬＡ−Ａ^＊０２：０１遺伝子導入マウス由来の脾細胞を１．２５×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで、調製したＨＬＡ−Ａ^＊２４：０２遺伝子導入マウス由来の脾細胞を５×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで、それぞれブロッキングしたＥＬＩＳＰＯＴプレートに播種した。ペプチド（配列番号：３、５）をＤＭＳＯで４０ｍｇ／ｍＬに溶解し、さらに１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地で４０μｇ／ｍＬに希釈した。希釈したペプチドを最終濃度１０μｇ／ｍＬで、ＥＬＩＳＰＯＴプレートに播種したＨＬＡ−Ａ^＊０２：０１遺伝子導入マウス由来の脾細胞（配列番号：３）あるいはＨＬＡ−Ａ^＊２４：０２遺伝子導入マウス由来の脾細胞（配列番号：５）に添加した。その後、１８〜２０時間、３７℃、５％ ＣＯ_２下で培養することで、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるペプチド再刺激を加えた。培養後に上清を除き、ＥＬＩＳＰＯＴプレートを、添付のプロトコールに従って発色させた。発色したスポット数は、ＩｍｍｕｎｏＳｐｏｔ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｃ.Ｔ.Ｌ.社製）によって測定した。
ＨＬＡ−Ａ^＊０２：０１遺伝子導入マウスを用いたＩＦＮγ ＥＬＩＳＰＯＴ ａｓｓａｙの結果を図１、ＨＬＡ−Ａ^＊２４：０２遺伝子導入マウス用いたＩＦＮγ ＥＬＩＳＰＯＴ ａｓｓａｙの結果図２に示す。
図１および２において、縦軸は播種細胞数中に反応した細胞数を、横軸はｉｎ ｖｉｔｒｏでパルスしたペプチドを示す。図１の黒棒はＨＬＡ−Ａ^＊０２：０１遺伝子導入マウス由来の脾細胞を配列番号：３で表されるペプチドをパルスしながら培養した結果を示し、白棒は非パルスで培養した結果を示す。即ち、黒棒と白棒の値の差がペプチド特異的ＣＴＬの数を示し、上記癌ワクチン組成物の投与によってマウス生体内において配列番号：３で表されるペプチドに特異的なＣＴＬが誘導されたことを示す。図１において白棒の値は認められていない。このことは目的のペプチドをパルスしない場合にはＨＬＡ−Ａ^＊０２：０１遺伝子導入マウスの脾細胞は全く反応しなかったことを示している。本試験の結果、ＨＬＡ−Ａ^＊０２：０１遺伝子導入マウス由来の脾細胞において配列番号：３で表されるペプチドに特異的なＩＦＮγの産生が確認された。
さらに、図２の黒棒はＨＬＡ−Ａ^＊２４：０２遺伝子導入マウス用いた由来の脾細胞を配列番号：５で表されるペプチドをパルスしながら培養した結果を示し、白棒は非パルスで培養した結果を示す。即ち、黒棒と白棒の値の差がペプチド反応性細胞の数を示し、上記癌ワクチン組成物の投与によってマウス生体内において配列番号：５で表されるペプチドに特異的なＣＴＬが誘導されたことを示す。図２において白棒の値は認められていない。このことは目的のペプチドをパルスしない場合にはＨＬＡ−Ａ^＊２４：０２遺伝子導入マウスの脾細胞は全く反応しなかったことを示している。本試験の結果、ＨＬＡ−Ａ^＊２４：０２遺伝子導入マウス由来の脾細胞において配列番号：５で表されるペプチドに特異的なＩＦＮγの産生が確認された。
これにより、上記癌ワクチン組成物はｉｎ ｖｉｖｏで配列番号：３および配列番号：５で表されるペプチド特異的なＣＴＬを誘導し得ることが明らかとなった。したがって、ペプチド（１）を含むペプチドが安定な製剤とペプチド（２）を含むペプチドが安定な製剤を再調製した製剤は、癌ワクチンとして使用できることが示唆される。

本発明により、ＷＴ１タンパク質由来癌抗原ペプチドを含有する良好な懸濁性を持つ懸濁液剤、および懸濁液剤を凍結乾燥した安定性の高い凍結乾燥製剤を提供することが可能になり、当該ペプチドは癌ワクチンとして使用できる。

本出願は、日本で出願された特許出願特願２０１４−１９７６６７（出願日：２０１４年９月２７日）を基礎としており、その内容は本明細書に全て包含されるものである。

Claims (14)

1. 以下の成分を含む注射用医薬組成物
   （ａ）式（１）：
   （式中、ＣｙｓとＣｙｓの間の結合はジスルフィド結合を表し、Ｌｅｕ−ＯＨはＬｅｕのＣ末端がフリーのカルボキシル基であることを示し、他の結合はペプチド結合を示す。）で表されるペプチドおよびその塩から選択される１種以上のペプチド、
   （ｂ）トレハロースまたはトレハロース水和物、および
   （ｃ）ｐＨ調整剤。
2. さらにマンニトールを含むことを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
3. マンニトールがＤ−マンニトールである、請求項２に記載の組成物。
4. さらにメチオニンを含むことを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
5. ｐＨが１〜３であることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組成物。
6. 成分（ａ）が、式（１）で表されるペプチドおよびその塩から選択される１種以上のペプチドと、Trp-Ala-Pro-Val-Leu-Asp-Phe-Ala-Pro-Pro-Gly-Ala-Ser-Ala-Tyr-Gly-Ser-Leu（配列番号：１）で表されるアミノ酸配列からなるペプチドおよびその塩から選択される１種以上のペプチドとを含むことを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
7. さらにマンニトールを含むことを特徴とする、請求項６に記載の組成物。
8. さらにメチオニンを含むことを特徴とする、請求項６または７に記載の組成物。
9. さらに溶解補助剤を含むことを特徴とする、請求項８に記載の組成物。
10. 溶解補助剤が酒石酸である、請求項９に記載の組成物。
11. ｐＨが２〜３であることを特徴とする、請求項９または１０に記載の組成物。
12. ｐＨ調整剤が塩酸および／または水酸化ナトリウムであることを特徴とする、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の組成物。
13. 組成物が液剤、懸濁液剤、または凍結乾燥製剤であることを特徴とする、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の組成物。
14. 請求項１〜１３のいずれか一項に記載の組成物を含む癌ワクチン組成物。