JP6208019B2 - 細胞コロニー領域特定装置、細胞コロニー領域特定方法およびプログラム - Google Patents

Description

本発明は、細胞を培養して得られる細胞コロニーを撮像して得られる画像において、細胞コロニーの領域を特定する技術に関する。

従来より、医療、食品、材料等の様々な分野において、細胞を培養する技術が利用されている。細胞培養では、多くの場合、細胞が密集したコロニーが形成される。多数の培養が行われる場合、コロニーを撮像して得られた画像を解析して、必要なコロニーだけを自動的に特定することが求められる。

例えば、特許文献１の画像処理装置では、培養容器の位相差顕微鏡画像である合成マクロ画像からユーザによりｉＰＳ細胞コロニーの候補が指定される。合成マクロ画像を二値化して二値化コロニー画像が得られ、二値化コロニー画像から指定された細胞コロニーの輪郭線が抽出される。その後、個々の細胞コロニーがその特徴量からｉＰＳ細胞であるか否か判別される。

特許文献２の細胞画像解析装置においても、輝度や輝度差を用いて対象物の境界要素が抽出される。このとき、輝度や輝度差の変化量が小さいために境界要素の一部が切れた状態となっている場合、予め設定された値以下の距離で離れている境界要素同士を同一の対象物の境界要素と認定し、これらの境界要素間が線分要素で結ばれる。

国際公開第２０１１／０１０４４９号 特開２０１１−２４４８５号公報

ところで、特許文献１では、輪郭線が明確であり、背景との区別がはっきりしている細胞コロニーがユーザにより指定されるため、細胞コロニーの輪郭線の抽出は比較的容易である。特許文献２では、ノイズ等による境界線の断線は考慮されているが、境界がぼけて太くなっているような状況は想定されていない。撮像時のぶれやフォーカスずれにより境界がぼけている場合、輪郭は誤って検出されやすい。

本発明は、上記課題に鑑みなされたものであり、画像中において細胞コロニーの境界がぼけている場合であっても、容易かつ効率よく細胞コロニーの領域を特定することを目的としている。

請求項１に記載の発明は、細胞コロニーを示すコロニー画像における前記細胞コロニーの領域を特定する細胞コロニー領域特定装置であって、細胞コロニーを撮像してコロニー画像を取得する撮像部と、演算処理により前記コロニー画像における前記細胞コロニーの領域を特定する演算部と、特定された前記領域を出力する出力部とを備え、前記演算部が、ａ）前記コロニー画像の各位置とその周囲との明度の相違を示す明度変化画像を得る工程と、ｂ）前記明度変化画像を２値化することにより、明度変化２値画像を得る工程と、ｃ）前記明度変化２画像における予め定められた面積以下の閉領域を塗りつぶして小領域塗りつぶし画像を得る工程と、ｄ）前記小領域塗りつぶし画像に細線化を施して細線画像を得る工程と、ｅ）前記細線画像における小突起を削除して修正済み細線画像を得る工程と、ｆ）前記修正済み細線画像における閉領域を塗りつぶしてコロニー塗りつぶし画像を得る工程と、ｇ）前記コロニー塗りつぶし画像と、前記明度変化２値画像、または、前記コロニー画像から他の方法にて得られる他の明度変化２値画像との論理積をとって得られる画像から、細胞コロニーの境界を示すコロニー境界画像を得る工程と、ｈ）前記コロニー境界画像に基づいて細胞コロニーの領域を特定する工程とを実行する。

請求項２に記載の発明は、請求項１に記載の細胞コロニー領域特定装置であって、前記明度変化画像が、前記コロニー画像の各位置から第１距離内に存在する画素の値の平均と、前記各位置から前記第１距離よりも離れ、第２距離よりも近い画素の値の平均との差に相当する値を、前記各位置の画素の値とする画像であり、前記明度変化２値画像が、細胞コロニーの周囲に現れる帯状領域の境界に沿って前記帯状領域の内側に近接する線状の領域を示す画像であり、前記ｇ）工程において、前記コロニー塗りつぶし画像と、前記他の明度変化２値画像との論理積が求められ、前記他の明度変化２値画像が、前記明度変化画像を、前記明度変化２値画像の場合とは異なる閾値にて２値化することにより得られ、前記帯状領域の境界に沿って前記帯状領域の外側に近接する線状の領域を示す画像である。

請求項３に記載の発明は、請求項２に記載の細胞コロニー領域特定装置であって、前記演算部が、前記ｇ）工程の前に、前記コロニー塗りつぶし画像および前記他の明度変化２値画像の少なくとも一方に太らせ処理を施す工程、をさらに実行する。

請求項４に記載の発明は、請求項２または３に記載の細胞コロニー領域特定装置であって、前記演算部が、前記ｂ）工程と、前記ｃ）工程との間に、前記明度変化２値画像に太らせ処理を施す工程、をさらに実行する。

請求項５に記載の発明は、細胞コロニーを示すコロニー画像における前記細胞コロニーの領域を特定する細胞コロニー領域特定装置であって、細胞コロニーを撮像してコロニー画像を取得する撮像部と、演算処理により前記コロニー画像における前記細胞コロニーの領域を特定する演算部と、特定された前記領域を出力する出力部とを備え、前記演算部が、ａ）細胞コロニーの領域と他の領域とを区別する閾値にて前記コロニー画像を２値化してコロニー２値画像を得る工程と、ｂ）前記細胞コロニーの周囲に現れる帯状領域と他の領域とを区別する閾値にて前記コロニー画像を２値化して周辺２値画像を得る工程と、ｃ）前記コロニー２値画像および前記周辺２値画像の少なくとも一方に太らせ処理を施す工程と、ｄ）前記ｃ）工程後の前記コロニー２値画像と前記周辺２値画像との論理積をとることにより、初期境界画像を得る工程と、ｅ）前記初期境界画像に基づいて細胞コロニーの領域を特定する工程とを実行する。

請求項６に記載の発明は、請求項５に記載の細胞コロニー領域特定装置であって、前記ｃ）において、前記コロニー２値画像および前記周辺２値画像に太らせ処理が施される。

請求項７に記載の発明は、請求項５または６に記載の細胞コロニー領域特定装置であって、前記演算部が、前記ａ）工程および前記ｂ）工程の前に、前記コロニー画像にシェーディング補正を行う工程、をさらに実行する。

請求項８に記載の発明は、細胞コロニーを示すコロニー画像における前記細胞コロニーの領域を特定する細胞コロニー領域特定方法であって、ａ）コロニー画像の各位置とその周囲との明度の相違を示す明度変化画像を得る工程と、ｂ）前記明度変化画像を２値化することにより、明度変化２値画像を得る工程と、ｃ）前記明度変化２画像における予め定められた面積以下の閉領域を塗りつぶして小領域塗りつぶし画像を得る工程と、ｄ）前記小領域塗りつぶし画像に細線化を施して細線画像を得る工程と、ｅ）前記細線画像における小突起を削除して修正済み細線画像を得る工程と、ｆ）前記修正済み細線画像における閉領域を塗りつぶしてコロニー塗りつぶし画像を得る工程と、ｇ）前記コロニー塗りつぶし画像と、前記明度変化２値画像、または、前記コロニー画像から他の方法にて得られる他の明度変化２値画像との論理積をとって得られる画像から、細胞コロニーの境界を示すコロニー境界画像を得る工程と、ｈ）前記コロニー境界画像に基づいて細胞コロニーの領域を特定する工程とを備える。

請求項９に記載の発明は、請求項８に記載の細胞コロニー領域特定方法であって、前記明度変化画像が、前記コロニー画像の各位置から第１距離内に存在する画素の値の平均と、前記各位置から前記第１距離よりも離れ、第２距離よりも近い画素の値の平均との差に相当する値を、前記各位置の画素の値とする画像であり、前記明度変化２値画像が、細胞コロニーの周囲に現れる帯状領域の境界に沿って前記帯状領域の内側に近接する線状の領域を示す画像であり、前記ｇ）工程において、前記コロニー塗りつぶし画像と、前記他の明度変化２値画像との論理積が求められ、前記他の明度変化２値画像が、前記明度変化画像を、前記明度変化２値画像の場合とは異なる閾値にて２値化することにより得られ、前記帯状領域の境界に沿って前記帯状領域の外側に近接する線状の領域を示す画像である。

請求項１０に記載の発明は、請求項９に記載の細胞コロニー領域特定方法であって、前記ｇ）工程の前に、前記コロニー塗りつぶし画像および前記他の明度変化２値画像の少なくとも一方に太らせ処理を施す工程、をさらに備える。

請求項１１に記載の発明は、請求項９または１０に記載の細胞コロニー領域特定方法であって、前記ｂ）工程と、前記ｃ）工程との間に、前記明度変化２値画像に太らせ処理を施す工程、をさらに備える。

請求項１２に記載の発明は、細胞コロニーを示すコロニー画像における前記細胞コロニーの領域を特定する細胞コロニー領域特定方法であって、ａ）細胞コロニーの領域と他の領域とを区別する閾値にてコロニー画像を２値化してコロニー２値画像を得る工程と、ｂ）前記細胞コロニーの周囲に現れる帯状領域と他の領域とを区別する閾値にて前記コロニー画像を２値化して周辺２値画像を得る工程と、ｃ）前記コロニー２値画像および前記周辺２値画像の少なくとも一方に太らせ処理を施す工程と、ｄ）前記ｃ）工程後の前記コロニー２値画像と前記周辺２値画像との論理積をとることにより、初期境界画像を得る工程と、ｅ）前記初期境界画像に基づいて細胞コロニーの領域を特定する工程とを備える。

請求項１３に記載の発明は、請求項１２に記載の細胞コロニー領域特定方法であって、前記ｃ）において、前記コロニー２値画像および前記周辺２値画像に太らせ処理が施される。

請求項１４に記載の発明は、請求項１２または１３に記載の細胞コロニー領域特定方法であって、前記ａ）工程および前記ｂ）工程の前に、前記コロニー画像にシェーディング補正を行う工程、をさらに備える。

請求項１５に記載の発明は、コンピュータに、細胞コロニーを示すコロニー画像における前記細胞コロニーの領域を特定させるプログラムであって、前記プログラムの前記コンピュータによる実行は、前記プログラムに、ａ）コロニー画像の各位置とその周囲との明度の相違を示す明度変化画像を得る工程と、ｂ）前記明度変化画像を２値化することにより、明度変化２値画像を得る工程と、ｃ）前記明度変化２画像における予め定められた面積以下の閉領域を塗りつぶして小領域塗りつぶし画像を得る工程と、ｄ）前記小領域塗りつぶし画像に細線化を施して細線画像を得る工程と、ｅ）前記細線画像における小突起を削除して修正済み細線画像を得る工程と、ｆ）前記修正済み細線画像における閉領域を塗りつぶしてコロニー塗りつぶし画像を得る工程と、ｇ）前記コロニー塗りつぶし画像と、前記明度変化２値画像、または、前記コロニー画像から他の方法にて得られる他の明度変化２値画像との論理積をとって得られる画像から、細胞コロニーの境界を示すコロニー境界画像を得る工程と、ｈ）前記コロニー境界画像に基づいて細胞コロニーの領域を特定する工程とを実行させる。

請求項１６に記載の発明は、コンピュータに、細胞コロニーを示すコロニー画像における前記細胞コロニーの領域を特定させるプログラムであって、前記プログラムの前記コンピュータによる実行は、前記プログラムに、ａ）細胞コロニーの領域と他の領域とを区別する閾値にてコロニー画像を２値化してコロニー２値画像を得る工程と、ｂ）前記細胞コロニーの周囲に現れる帯状領域と他の領域とを区別する閾値にて前記コロニー画像を２値化して周辺２値画像を得る工程と、ｃ）前記コロニー２値画像および前記周辺２値画像の少なくとも一方に太らせ処理を施す工程と、ｄ）前記ｃ）工程後の前記コロニー２値画像と前記周辺２値画像との論理積をとることにより、初期境界画像を得る工程と、ｅ）前記初期境界画像に基づいて細胞コロニーの領域を特定する工程とを実行させる。

本発明によれば、細胞コロニーの境界がぼけている場合であっても、容易かつ効率よく細胞コロニーの領域を特定することができる。

細胞コロニー領域特定装置の構成を示す図である。 コンピュータの構成を示す図である。 細胞コロニー領域特定装置における機能構成を示すブロック図である。 装置の動作の流れを示す図である。 暫定境界の取得の流れを示す図である。 境界の取得の流れを示す図である。 境界の取得の流れを示す図である。 細胞コロニー領域の特定の流れを示す図である。 コロニー画像を示す図である。 コロニー２値画像を示す図である。 周辺２値画像を示す図である。 太らせ後のコロニー２値画像を示す図である。 太らせ後の周辺２値画像を示す図である。 論理積をとる様子を示す図である。 初期境界画像を示す図である。 暫定境界画像を示す図である。 暫定境界細線画像を示す図である。 整形後の暫定境界細線画像を示す図である。 マスク画像を示す図である。 初期境界画像がマスクされる様子を示す図である。 更新された暫定境界画像を示す図である。 太らせ後の暫定境界画像を示す図である。 暫定境界細線画像を示す図である。 整形後の暫定境界細線画像を示す図である。 マスク画像を示す図である。 更新された暫定境界画像を示す図である。 太らせ後の暫定境界画像を示す図である。 暫定境界細線画像を示す図である。 整形後の暫定境界細線画像を示す図である。 特定された細胞コロニーの領域を示す図である。 細胞コロニー領域特定装置における機能構成を示すブロック図である。 暫定境界の取得の流れを示す図である。 暫定境界の取得の流れを示す図である。 明度変化画像を示す図である。 第１明度変化２値画像を示す図である。 第２明度変化２値画像を示す図である。 太らせ後の第１明度変化２値画像を示す図である。 太らせ後の第２明度変化２値画像を示す図である。 小領域塗りつぶし画像を示す図である。 細線画像を示す図である。 修正済み細線画像を示す図である。 コロニー塗りつぶし画像を示す図である。 論理積をとる様子を示す図である。 コロニー境界画像を示す図である。 修正されたコロニー境界画像を示す図である。 太らせ後のコロニー境界画像を示す図である。 細線化されたコロニー境界画像を示す図である。 最終的なコロニー境界画像を示す図である。

図１は本発明の一の実施の形態に係る細胞コロニー領域特定装置１（以下、単に「領域特定装置」という。）の構成を示す図である。領域特定装置１は、培養容器９中の細胞コロニーを撮像し、画像中の細胞コロニーの領域を特定する。領域特定装置１は、撮像部２、および、領域特定装置１の全体動作を制御するとともに、後述の画像処理を実現するコンピュータ５を備える。

撮像部２は、培養容器９を撮像して多階調の画像を取得する撮像デバイス２１、培養容器９が載置されるステージ２２、および、撮像デバイス２１に対してステージ２２を相対的に移動するステージ駆動部２３を有する。撮像デバイス２１は、照明光を出射する照明部２１１、培養容器９に照明光を導くとともに培養容器９からの光が入射する光学系２１２、および、光学系２１２により結像された像を電気信号に変換するエリアセンサ２１３を有する。ステージ駆動部２３はボールねじ、ガイドレール、モータ等により構成され、コンピュータ５がステージ駆動部２３および撮像デバイス２１を制御することにより、培養容器９上の一部の領域が撮像される。

図２はコンピュータ５の構成を示す図である。コンピュータ５は各種演算処理を行うＣＰＵ５１、基本プログラムを記憶するＲＯＭ５２および各種情報を記憶するＲＡＭ５３を含む一般的なコンピュータシステムの構成となっている。コンピュータ５は、情報記憶を行う固定ディスク５４、画像等の各種情報の表示を行うディスプレイ５５、操作者からの入力を受け付けるキーボード５６ａおよびマウス５６ｂ（以下、「入力部５６」と総称する。）、光ディスク、磁気ディスク、光磁気ディスク等のコンピュータ読み取り可能な記録媒体８から情報の読み取りを行う読取装置５７、並びに、領域特定装置１の他の構成との間で信号を送受信する通信部５８をさらに含む。

コンピュータ５では、事前に読取装置５７を介して記録媒体８からプログラム８０が読み出されて固定ディスク５４に記憶されている。ＣＰＵ５１は、プログラム８０に従ってＲＡＭ５３や固定ディスク５４を利用しつつ演算処理を実行する。

図３は領域特定装置１における機能構成を示すブロック図であり、図３では、コンピュータ５のＣＰＵ５１、ＲＯＭ５２、ＲＡＭ５３、固定ディスク５４等により実現される機能構成を、演算部５００として示している。演算部５００は、その機能として、制御部５１１と、シェーディング補正部５１２と、２値化部５２１と、太らせ処理部５２２と、論理積部５２３と、小領域削除部５２４と、細線化部５２５と、小突起削除部５２６と、マスク部５２７と、コロニー領域決定部５１３とを含む。演算部５００の機能は、その一部および全部がハードウェアとして構築されてもよい。出力部５３０は、特定されたコロニー領域をユーザまたは他の装置に対して出力する部位であり、ディスプレイ５５や通信部５８が対応する。

図４ないし図７は、領域特定装置１の一の動作例の流れを示す図である。以下の説明では、画像の取得および画像に対する処理は、正確には、画像のデータの取得および処理である。

まず、撮像部２が培養容器９内の細胞コロニーを撮像することにより、画像を取得する（図４：ステップＳ１１）。以下、取得された画像を「コロニー画像」という。演算部５００による演算処理により、コロニー画像における細胞コロニーの領域が特定され、特定された領域が出力部５３０から出力される。演算部５００による処理では、コロニー画像から細胞コロニーの暫定的な境界が取得され（ステップＳ１２）、この暫定的な境界から正確な境界が取得される（ステップＳ１３）。その後、得られた境界に基づいて細胞コロニー領域が特定される（ステップＳ１４）。

図５は、ステップＳ１２にて、コロニー画像から細胞コロニーの境界を暫定的に示す画像を取得する流れを示す図である。シェーディング補正部５１２は、コロニー画像にシェーディング補正を行う（ステップＳ１２１）。これにより、画像の全体的な濃淡ムラが低減され、後の処理にて細胞コロニーの境界をより正確に得ることが実現される。図８は、補正後のコロニー画像６１１を例示する図である。図８では、濃淡を簡略化して示している。図８に示す例では、実際の細胞コロニーの領域７１１は暗く、細胞コロニーの周囲には、明るい帯状領域７１２が現れる。その他の領域７１３は、他の物体の影響による濃淡を有するが、およそ細胞コロニーの領域７１１の明度と帯状領域７１２の明度との間の明度を有する。抽出したい細胞コロニーの境界は、細胞コロニーの領域７１１と帯状領域７１２との間の境界である。

これらの領域の明度は、撮像環境の変更により反転する。この場合、予め明暗を反転してからコロニー画像に以下の処理が実行される。または、以下の処理における明暗に係る処理が反転される。

シェーディング補正後のコロニー画像は、２値化部５２１により、細胞コロニーの領域と他の領域とを区別する第１閾値にて２値化される。ここでは、細胞コロニーの領域に画素値１が付与される。以下、得られた２値画像を「コロニー２値画像」という（ステップＳ１２２）。図９．Ａは、コロニー２値画像６１２を例示する図である。一方、シェーディング補正後のコロニー画像は、２値化部５２１により、細胞コロニーの周囲に現れる帯状領域７１２と他の領域とを区別する第２閾値によっても２値化される。ここでは、帯状領域に画素値１が付与される。以下、得られた２値画像を「周辺２値画像」という（ステップＳ１２３）。図９．Ｂは、周辺２値画像６１３を例示する図である。

コロニー２値画像６１２および周辺２値画像６１３を得る閾値は、コロニー画像の明度分布の標準偏差やヒストグラムを利用して決定される。コロニー２値画像６１２および周辺２値画像６１３には、図１０．Ａおよび図１０．Ｂに示すように、太らせ処理部５２２による太らせ処理が施される（ステップＳ１２４，Ｓ１２５）。なお、太らせ処理は、コロニー２値画像６１２および周辺２値画像６１３の一方のみに施されてもよい。

論理積部５２３は、太らせ処理後のコロニー２値画像６１２と周辺２値画像６１３との論理積、すなわち、図１１．Ａに示すように両画像において画素値が１の領域のうち、互いに重なる領域が求められ、図１１．Ｂに示す画像６１４が得られる（ステップＳ１２６）。画像６１４は、細胞コロニーの境界の少なくとも一部を含む画像であり、細胞コロニーの境界を暫定的に示す画像である。以下、画像６１４を「初期境界画像」という。ステップＳ１２５にてコロニー２値画像６１２および周辺２値画像６１３の双方に太らせ処理が行われる場合、初期境界画像６１４における境界の位置ずれが抑制される。

図６．Ａおよび図６．Ｂは、ステップＳ１３にて、初期境界画像６１４からより正確な細胞コロニーの境界を示す画像を取得する流れを示す図である。まず、小領域削除部５２４は、初期境界画像６１４から予め定められた値以下の面積を有する小領域を削除し、図１２に示す暫定境界画像６２１を得る（ステップＳ２１１）。これにより、ゴミやノイズに起因する不要な領域が削除される。容器の影等の大きすぎる領域が存在する場合は、規定されるコロニーより大きな領域を予め削除してもよい。

細線化部５２５は、暫定境界画像６２１に細線化を施し、図１３に示す画像６２２を取得する（ステップＳ２１２）。なお、細線化前に太らせ処理が行われてもよい。これにより、微小な窪みや穴が除去され、細線化後の線が滑らかになる。以下、画像６２２を「暫定境界細線画像」という。暫定境界細線画像６２２は、小突起削除部５２６により、予め定められた長さよりも短い微小な突起が削除され、図１４に示すように整形される（ステップＳ２１３）。微小突起の概念には、ごみやノイズに起因して単独で存在する微小な線が含まれてもよい。

太らせ処理部５２２は、暫定境界細線画像６２２に太らせ処理を施し、図１５に示すマスク画像６２３を取得する（ステップＳ２１４）。太らせ量は、想定される境界の破断長さに基づいて予め定められる。マスク部５２７は、図１６．Ａに示すように、図１２の初期境界画像６１４をマスク画像６２３にてマスクする（ステップＳ２１５）。これにより、更新された暫定境界画像６２１が得られる。図１２と図１６．Ｂとを比較して判るように、更新された暫定境界画像６２１では、境界の一部であるにも関わらずステップＳ２１１にて削除された小領域の一部が現れる。図１６．Ｂでは、復活した小領域に符号８１を付している。

次に、更新後の暫定境界画像６２１において互いに近接する端点を接続する処理が行われる（ステップＳ２１６）。接続処理としては様々な処理が採用されてよいが、本実施の形態では、図１７に示すように、太らせ処理部５２２が暫定境界画像６２１に太らせ処理を施すことにより、端点同士の接続が行われる。すなわち、太らせ処理部５２２が近接する端点を接続する接続処理部として機能する。これにより、復活した小領域８１が近接する境界要素と接続される。他の接続処理としては、近接する端点同士を直線で接続する手法が採用されてもよい。

ここで、制御部５１１により、予め定められた繰り返し終了条件が満たされるか否かが確認される（ステップＳ２１７）。繰り返し終了条件は、暫定境界画像６２１が細胞コロニーの境界を十分に表す画像であるか否かを判断する条件である。好ましくは、ステップＳ２１５において得られる暫定境界画像６２１が、前回のステップＳ２１５後の暫定境界画像６２１と一致することが繰り返し終了条件として用いられる。なお、この条件は、ステップＳ２１６にて得られる暫定境界画像６２１が前回のステップＳ２１６後の暫定境界画像６２１と一致することと同等である。他の繰り返し終了条件としては、好ましくは、ステップＳ２１５またはステップＳ２１６の実行回数が、予め定められた回数に達する条件が採用される。

最初のステップＳ２１７では、前回のステップＳ２１５は存在しないため、繰り返し終了条件が満たされないと判断され、ステップＳ２１２へと戻る。そして、細線化部５２５により図１７の暫定境界画像６２１に細線化が施されて図１８に示す暫定境界細線画像６２２が得られ（ステップＳ２１２）、図１９に示すように小突起削除部５２６により暫定境界細線画像６２２から小突起が削除され（ステップＳ２１３）、図２０に示すように太らせ処理部５２２が暫定境界細線画像６２２に太らせ処理を施すことにより、マスク画像６２３が得られる（ステップＳ２１４）。

さらに、マスク部５２７が初期境界画像６１４をマスク画像６２３にてマスクすることにより、図２１に示すように、さらに多くの小領域８１が復活した暫定境界画像６２１が得られ（ステップＳ２１５）、太らせ処理部５２２により図２２に示すように互いに近接する端点が接続される（ステップＳ２１６）。

図１６．Ｂの暫定境界画像６２１と図２１の暫定境界画像６２１とは一致しないため、制御部５１１は繰り返し終了条件が満たされていないと判断し（ステップＳ２１７）、ステップＳ２１２へと戻る。これにより、図２３に示す暫定境界細線画像６２２が得られ（ステップＳ２１２）、図２４に示す修正された暫定境界細線画像６２２が得られる（ステップＳ２１３）。

その後、図２４の暫定境界細線画像６２２に太らせ処理が施されてマスク画像６２３が得られ（ステップＳ２１４）、初期境界画像６１４がマスク画像６２３にてマスクされることにより図２１と同様の更新された暫定境界画像６２１が得られ（ステップＳ２１５）、図２２に示すように、端点の接続が行われる（ステップＳ２１６）。ステップＳ２１５にて得られる暫定境界画像６２１は、前回のステップＳ２１５にて得られる暫定境界画像６２１と一致するため、制御部５１１は、これ以上の繰り返し処理は不要と判断し、ステップＳ２１８へと移行する。

なお、繰り返し処理が必要か否かはステップＳ２１５の段階で判断できるため、図６．Ｂに示すように、ステップＳ２１５の後に繰り返し終了条件が満たされたか否かが確認されてもよい（ステップＳ２１７）。図６．Ｂでは、繰り返し終了条件が満たされない場合、互いに近接する端点の接続（ステップＳ２１６）を行ってからステップＳ２１２へと戻る。また、繰り返し終了条件が満たされる場合、互いに近接する端点の接続（ステップＳ２１６）を行ってからステップＳ２１８へと移行する。

細線化部５２５は、最終的な暫定境界画像６２１に細線化を施す（ステップＳ２１８）。以下、得られた画像を「境界細線画像」という。ただし、繰り返し終了条件によっては、前回のステップＳ２１１にて既に図２４に示す暫定境界細線画像６２２が得られるため、ステップＳ２１８は省略され、この暫定境界細線画像６２２がステップＳ２１６、Ｓ２１８後の境界細線画像とみなされて準備される。

次に、境界細線画像において完全な閉ループとして表されない細胞コロニーの境界が強制的に修復される（ステップＳ２１９）。すなわち、不完全な閉ループが強制的に閉じられる。具体的には、環状でない線の長さに対する当該線の両端間の距離の比が、予め定められた値以下の場合に、当該両端の接続が行われる。閉ループの完成は、例えば、太らせ処理部５２２による太らせ量を大きくすることにより実行される。この場合、太らせ処理部５２２がループ修復部として機能する。閉ループの完成は、両端を単純に直線で接続することにより実行されてもよい。ステップＳ２１７またはステップＳ２１８の段階で、細胞コロニーの境界が十分に抽出されている場合は、ステップＳ２１９は省かれてよい。

図７は、図４のステップＳ１４においてコロニー領域決定部５１３により実行される処理の流れを示す図である。まず、境界細線画像において閉領域のラベリングが行われ、線により囲まれる個々の閉領域が図２５に示すように区別可能となる（ステップＳ１４１）。これにより、細胞コロニーの領域（さらに後続の処理があるため、正確には、細胞コロニーの領域の候補）が特定される。さらに、必要に応じて様々な修正作業が行われる。例えば、閉領域と閉領域とを繋ぐ線が残存する場合、当該線が削除される（ステップＳ１４２）。

予め定められた面積よりも小さい閉領域は、細胞コロニーの領域として適切でないことから画像から削除される（ステップＳ１４３）。なお、大きすぎる閉領域が存在する場合は、このような領域も削除されてよい。適切な面積範囲は、想定される細胞コロニーの大きさから予め定められる。閉領域の真円度を用いて細胞コロニーの候補領域の選択が行われてもよい。

また、図８の例の場合、細胞コロニーは画像中に暗く現れるため、コロニー画像において明度が異常な領域は細胞コロニーの領域から除外される（ステップＳ１４４）。具体的には、コロニー画像において、境界細線画像にて線により囲まれる閉領域の内部の平均明度と、当該閉領域の周辺部、すなわち、帯状領域７１２よりも外側の領域７１３の平均明度との差が、予め定められた値以下の場合に、当該領域は細胞コロニーの領域ではないと決定される。ステップＳ１４３，Ｓ１４４により、より正確に細胞コロニーの領域を特定することが実現される。

以上に説明したように、コロニー画像では、細胞コロニーの周囲に、細胞コロニーとは明るさの異なる帯状領域が現れ、さらに、この帯状領域と細胞コロニーの領域との間の境界がぼけていることがある。領域特定装置１では、２つの閾値を用いて細胞コロニーの領域を含む２値画像と、帯状領域を含む２値画像とを生成し、これらの２値画像の少なくとも一方に太らせ処理を行うことにより、両２値画像の共通領域が初期境界画像として得られる。細胞コロニーの境界がぼけて広がった画像であっても、このようにして得られる初期境界画像を利用することにより、細線化にて境界の幅の影響を除去することができる。その結果、容易かつ効率よく細胞コロニーの領域を特定することができる。

また、初期境界画像において境界に相当する領域が破断していても、暫定境界細線画像に太らせ処理を施してマスク画像を生成する処理を繰り返すことにより、破断している箇所を容易に漸次繋げることができる。これによっても、容易かつ効率よく細胞コロニーの領域を特定することが実現される。

マスク画像を利用する破断箇所の修復が十分に行われた段階で、近接する端点同士が強制的に接続されるため、細胞コロニーの境界をさらに高い精度にて取得することができる。

図２６は、領域特定装置１の他の動作例における演算部５００の機能構成を示す図である。図２６の機能構成では、図３のシェーディング補正部５１２が明度変化取得部５１４に置き換えられ、塗りつぶし部５２８が追加される。他の構成要素は図３と同様である。以下の他の動作例においても、図４のステップＳ１１〜Ｓ１４が実行される。ステップＳ１１，Ｓ１３，Ｓ１４は、上述の動作と同様である。ステップＳ１２の動作は、図２７．Ａおよび図２７．Ｂに示すものに置き換えられる。

細胞コロニーの初期の暫定的な境界を示す初期境界画像を取得するステップＳ１２では、まず、明度変化取得部５１４により、コロニー画像の各位置とその周囲との明度の相違を示す明度変化画像が取得される（ステップＳ３１１）。明度変化画像は、様々な手法により取得されてよい。本実施の形態では、各位置からの距離と平均明度との関係を利用する簡便かつ情報量の多い画像を取得する方法が採用される。

具体的には、まず、コロニー画像における１つの画素が選択される。選択画素から予め定められた第１距離内に存在する画素の値の平均である第１平均値が求められる。また、第１距離よりも大きい第２距離が予め定められており、選択画素ら第１距離よりも離れ、第２距離よりも近い画素の値の平均である第２平均値が求められる。そして、第１平均値と第２平均値との符号付き差に相当する値が、明度変化画像の当該選択画素の位置における値として与えられる。選択画素を変更しつつ上記処理を繰り返し、明度変化画像が取得される。上記の「符号付き差に相当する値」とは、例えば、符号付き差を画素値範囲０〜２５５内の値に変換した値である。

図２８は、明度変化画像６４１を例示する図である。図２８では、画像の濃淡を簡略化して示している。明度変化画像６４１では、原則として、コロニー画像において明るい領域と暗い領域との間の境界で、明るい領域側が境界に沿って明るくなり、暗い領域側が境界に沿って暗くなる。明るい領域の内部、暗い領域の内部、その他の領域の内部等の濃淡の変化の少ない領域では、中間調（グレー）となる。

具体的には、細胞コロニーに対応する暗い領域（図８の符号７１１参照）とその周囲の明るい帯状領域（図８の符号７１２参照）との間の境界では、細胞コロニー側が境界に沿って暗くなり、帯状領域側が境界に沿って明るくなる。帯状領域と他の中間調の領域との間の境界では、帯状領域側が境界に沿って明るくなり、中間調の領域側では境界に沿って暗くなる。

明度変化画像６４１は、２値化部５２１により、明るい領域が適切に抽出される第１閾値にて２値化される（ステップＳ３１２）。これにより、明るい領域に画素値１が付与される。以下、この２値画像を「第１明度変化２値画像」と呼ぶ。図２９．Ａは、第１明度変化２値画像６４２を例示する図である。第１明度変化２値画像６４２は、細胞コロニーの周囲に現れる帯状領域の境界に沿って帯状領域の内側に近接する線状の領域を示す。

明度変化画像６４１は、２値化部５２１により、暗い領域が適切に抽出される第２閾値、すなわち、第１閾値よりも暗側の値にて２値化される（ステップＳ３１３）。これにより、暗い領域に画素値１が付与される。以下、この２値画像を「第２明度変化２値画像」と呼ぶ。図２９．Ｂは、第２明度変化２値画像６４３を例示する図である。第２明度変化２値画像６４３は、細胞コロニーの周囲に現れる帯状領域の境界に沿って帯状領域の外側に近接する線状の領域を示す。したがって、第２明度変化２値画像６４３では、細胞コロニーの周囲に略２重のリングが現れる。

太らせ処理部５２２は、図３０．Ａおよび図３０．Ｂに示すように、第１明度変化２値画像６４２および第２明度変化２値画像６４３に太らせ処理を施す（ステップＳ３１４，Ｓ３１５）。これらの太らせ処理は省略可能である。

塗りつぶし部５２８は、第１明度変化２値画像６４２において、予め定められた面積以下の面積を有する閉領域を塗りつぶす（ステップＳ３１６）。以下、小領域が塗りつぶされた画像を「小領域塗りつぶし画像」という。図３１は、小領域塗りつぶし画像６４４を例示する図である。細線化部５２５は、小領域塗りつぶし画像６４４に細線化を施し、図３２に例示する細線画像６４５を得る（ステップＳ３１７）。小突起削除部５２６は、細線画像６４５における小突起を削除して図３３に示す細線画像６４６を得る（ステップＳ３１８）。以下、細線画像６４６を「修正済み細線画像」という。

ステップＳ３１２の明度変化画像６４１の２値化では、細胞コロニーの周囲の明るい帯状の領域に対応する線がほぼ確実に抽出される第１閾値が用いられる。そのため、第１明度変化２値画像６４２を塗りつぶして細線化した画像では、高い確率にて細胞コロニーを囲む線が現れる。

塗りつぶし部５２８は、修正済み細線画像６４６の閉領域を塗りつぶして図３４に示す画像６４７を得る（ステップＳ３１９）。塗りつぶされた領域の外縁部は、細胞コロニーの境界を覆うと推定される。以下、画像６４７を「コロニー塗りつぶし画像」という。

次に、論理積部５２３は、図３５．Ａに示すように、コロニー塗りつぶし画像６４７と図３０．Ｂの第２明度変化２値画像６４３との論理積をとることにより、図３５．Ｂに示す画像６５１を得る（ステップＳ３２１）。ところで、第２明度変化２値画像６４３に現れる線は、明るい領域と暗い領域との境界に沿って暗い領域側に位置する。すなわち、第２明度変化２値画像６４３の線は、細胞コロニーの境界の内側や細胞コロニーの周囲の明るい帯状領域の外側に現れる。そのため、コロニー塗りつぶし画像６４７と第２明度変化２値画像６４３との論理積をとることにより、細胞コロニーの境界にほぼ沿って存在する領域のみが高い確率にて得られる。以下、論理積により得られる図３５．Ｂの画像６５１を「コロニー境界画像」という。

小領域削除部５２４は、図３６に示すように、コロニー境界画像６５１に存在する微小な領域を削除する（ステップＳ３２２）。太らせ処理部５２２は、図３７に示すように、コロニー境界画像６５１に太らせ処理を施して環状の領域を滑らかな形状とする（ステップＳ３２３）。細線化部５２５は、図３７のコロニー境界画像６５１に細線化を施して図３８に示す画像を取得し（ステップＳ３２４）、さらに、図３９に示すように小突起削除部５２６が細線画像中の小突起を削除することにより（ステップＳ３２５）、細胞コロニーの境界を示す最終的なコロニー境界画像６５１が得られる。

図３９の例では、環状の線が現れるが、実際には、不完全な環状の線がコロニー境界画像６５１に現れる場合がある。そこで、コロニー境界画像６５１を初期の暫定的な境界を示す初期境界画像として、図４のステップＳ１３へと移行し、図６．Ａまたは図６．Ｂに示す動作が実行される。これにより、破断した環状の線が修正され、境界細線画像が得られる。もちろん、図３９に示すように不完全な環状の線が存在しない場合は、ステップＳ１３の繰り返し処理はすぐに終了し、ステップＳ１４へと移行する。そして、図７に示す処理が実行されることにより、細胞コロニーの領域が特定される。最終的なコロニー境界画像にて不完全な環状の線がほとんど現れない場合は、ステップＳ１３は省かれてもよい。

図２７．Ａおよび図２７．Ｂの動作例では、明度変化画像６４１として、コロニー画像の明るい領域と暗い領域の間に明るい線と暗い線とが現れるものが利用されるが、明度の変化を表す画像であれば、他の画像も利用可能である。例えば、単純な微分画像が明度変化画像として利用されてもよい。

この場合、コロニー画像中のエッジ部分を抽出する閾値にて明度変化画像を２値化することにより、１つの明度変化２値画像が得られる。当該明度変化２値画像では、細胞コロニーの周囲に現れる明るい帯状領域のエッジが、略２重のリングとして抽出される。そして、図２７．Ａの処理における第１明度変化２値画像および第２明度変化２値画像を区別することなく、これらの明度変化２値画像に代えて上記１つの明度変化２値画像を利用される。すなわち、ステップＳ３２１において、コロニー塗りつぶし画像と、当該コロニー塗りつぶし画像の生成に利用された明度変化２値画像との論理積が求められ、論理積画像からコロニー境界画像が取得される。

領域特定装置１では、明度変化画像を利用することにより、シェーディング補正を行うことなく適切に細胞コロニーの領域を特定することができる。また、明度変化２値画像から、細胞コロニーの周囲に現れる帯状領域を細線化して得られる画像を塗りつぶしたコロニー塗りつぶし画像と、帯状領域のエッジをおよそ示す明度変化２値画像（または第２明度変化２値画像）との論理積を求めることにより、細胞コロニーの境界がぼけた画像であっても、容易かつ効率よく細胞コロニーの領域を特定することができる。

特に、第１明度変化２値画像および第２明度変化２値画像を利用する場合、第１閾値および第２閾値を調整することにより、適切なコロニー塗りつぶし画像および適切な第２明度変化２値画像を容易に得ることができる。

コロニー塗りつぶし画像と明度変化２値画像との重なりを確実に得るために、コロニー塗りつぶし画像に対して太らせ処理が行われてから論理積画像が求められてもよい。コロニー塗りつぶし画像および明度変化２値画像の少なくとも一方に太らせ処理が行われることが好ましい。なお、コロニー塗りつぶし画像および／または明度変化２値画像に施される太らせ処理の太らせ量を調整することにより、コロニー境界画像における境界位置を微調整することができる。

領域特定装置１では、ステップＳ３１６において（第１）明度変化２値画像の小領域を塗りつぶす前に、ステップＳ３１４の太らせ処理が行われる。これにより、細胞コロニーの周囲に現れる線の破断を抑制することができる。

領域特定装置１は様々に変更されてよい。

例えば、ステップＳ１３における境界の破断箇所の修復は、他の手法により取得された初期境界画像に利用することができる。また、ステップＳ１２にて得られる初期境界画像を利用して、他の手法により最終的な細胞コロニーの領域が特定されてもよい。

撮像部２にて取得される画像は、モノクロ画像であってもカラー画像であってもよい。様々な前処理を経て元画像からコロニー画像が生成される。撮像手法も、培養容器９からの反射光を利用するものでも透過光を利用するものでもよい。領域特定装置１では、ステージ駆動部２３は省かれてもよい。

演算部５００の機能は、複数台のコンピュータにより実現されてもよい。プログラム８０は、様々な媒体を介してコンピュータに導入可能である。

上記実施形態および各変形例における構成は、相互に矛盾しない限り適宜組み合わされてよい。

１ 細胞コロニー領域特定装置
５ コンピュータ
２１ 撮像部
８０ プログラム
５００ 演算部
５３０ 出力部
６１１ コロニー画像
６１２ コロニー２値画像
６１３ 周辺２値画像
６１４ 初期境界画像
６４１ 明度変化画像
６４２ 第１明度変化２値画像
６４３ 第２明度変化２値画像
６４４ 小領域塗りつぶし画像
６４５ 細線画像
６４６ 修正済み細線画像
６４７ コロニー塗りつぶし画像
６５１ コロニー境界画像
７１２ 帯状領域
Ｓ１１〜Ｓ１４，Ｓ２１１〜Ｓ２１９，Ｓ３１１〜Ｓ３１９，Ｓ３２１〜Ｓ３２５ ステップ

Claims (16)

1. 細胞コロニーを示すコロニー画像における前記細胞コロニーの領域を特定する細胞コロニー領域特定装置であって、
   細胞コロニーを撮像してコロニー画像を取得する撮像部と、
   演算処理により前記コロニー画像における前記細胞コロニーの領域を特定する演算部と、
   特定された前記領域を出力する出力部と、
   を備え、
   前記演算部が、
   ａ）前記コロニー画像の各位置とその周囲との明度の相違を示す明度変化画像を得る工程と、
   ｂ）前記明度変化画像を２値化することにより、明度変化２値画像を得る工程と、
   ｃ）前記明度変化２画像における予め定められた面積以下の閉領域を塗りつぶして小領域塗りつぶし画像を得る工程と、
   ｄ）前記小領域塗りつぶし画像に細線化を施して細線画像を得る工程と、
   ｅ）前記細線画像における小突起を削除して修正済み細線画像を得る工程と、
   ｆ）前記修正済み細線画像における閉領域を塗りつぶしてコロニー塗りつぶし画像を得る工程と、
   ｇ）前記コロニー塗りつぶし画像と、前記明度変化２値画像、または、前記コロニー画像から他の方法にて得られる他の明度変化２値画像との論理積をとって得られる画像から、細胞コロニーの境界を示すコロニー境界画像を得る工程と、
   ｈ）前記コロニー境界画像に基づいて細胞コロニーの領域を特定する工程と、
   を実行することを特徴とする細胞コロニー領域特定装置。
2. 請求項１に記載の細胞コロニー領域特定装置であって、
   前記明度変化画像が、前記コロニー画像の各位置から第１距離内に存在する画素の値の平均と、前記各位置から前記第１距離よりも離れ、第２距離よりも近い画素の値の平均との差に相当する値を、前記各位置の画素の値とする画像であり、
   前記明度変化２値画像が、細胞コロニーの周囲に現れる帯状領域の境界に沿って前記帯状領域の内側に近接する線状の領域を示す画像であり、
   前記ｇ）工程において、前記コロニー塗りつぶし画像と、前記他の明度変化２値画像との論理積が求められ、
   前記他の明度変化２値画像が、前記明度変化画像を、前記明度変化２値画像の場合とは異なる閾値にて２値化することにより得られ、前記帯状領域の境界に沿って前記帯状領域の外側に近接する線状の領域を示す画像であることを特徴とする細胞コロニー領域特定装置。
3. 請求項２に記載の細胞コロニー領域特定装置であって、
   前記演算部が、前記ｇ）工程の前に、前記コロニー塗りつぶし画像および前記他の明度変化２値画像の少なくとも一方に太らせ処理を施す工程、をさらに実行することを特徴とする細胞コロニー領域特定装置。
4. 請求項２または３に記載の細胞コロニー領域特定装置であって、
   前記演算部が、前記ｂ）工程と、前記ｃ）工程との間に、前記明度変化２値画像に太らせ処理を施す工程、をさらに実行することを特徴とする細胞コロニー領域特定装置。
5. 細胞コロニーを示すコロニー画像における前記細胞コロニーの領域を特定する細胞コロニー領域特定装置であって、
   細胞コロニーを撮像してコロニー画像を取得する撮像部と、
   演算処理により前記コロニー画像における前記細胞コロニーの領域を特定する演算部と、
   特定された前記領域を出力する出力部と、
   を備え、
   前記演算部が、
   ａ）細胞コロニーの領域と他の領域とを区別する閾値にて前記コロニー画像を２値化してコロニー２値画像を得る工程と、
   ｂ）前記細胞コロニーの周囲に現れる帯状領域と他の領域とを区別する閾値にて前記コロニー画像を２値化して周辺２値画像を得る工程と、
   ｃ）前記コロニー２値画像および前記周辺２値画像の少なくとも一方に太らせ処理を施す工程と、
   ｄ）前記ｃ）工程後の前記コロニー２値画像と前記周辺２値画像との論理積をとることにより、初期境界画像を得る工程と、
   ｅ）前記初期境界画像に基づいて細胞コロニーの領域を特定する工程と、
   を実行することを特徴とする細胞コロニー領域特定装置。
6. 請求項５に記載の細胞コロニー領域特定装置であって、
   前記ｃ）において、前記コロニー２値画像および前記周辺２値画像に太らせ処理が施されることを特徴とする細胞コロニー領域特定装置。
7. 請求項５または６に記載の細胞コロニー領域特定装置であって、
   前記演算部が、前記ａ）工程および前記ｂ）工程の前に、前記コロニー画像にシェーディング補正を行う工程、をさらに実行することを特徴とする細胞コロニー領域特定装置。
8. 細胞コロニーを示すコロニー画像における前記細胞コロニーの領域を特定する細胞コロニー領域特定方法であって、
   ａ）コロニー画像の各位置とその周囲との明度の相違を示す明度変化画像を得る工程と、
   ｂ）前記明度変化画像を２値化することにより、明度変化２値画像を得る工程と、
   ｃ）前記明度変化２画像における予め定められた面積以下の閉領域を塗りつぶして小領域塗りつぶし画像を得る工程と、
   ｄ）前記小領域塗りつぶし画像に細線化を施して細線画像を得る工程と、
   ｅ）前記細線画像における小突起を削除して修正済み細線画像を得る工程と、
   ｆ）前記修正済み細線画像における閉領域を塗りつぶしてコロニー塗りつぶし画像を得る工程と、
   ｇ）前記コロニー塗りつぶし画像と、前記明度変化２値画像、または、前記コロニー画像から他の方法にて得られる他の明度変化２値画像との論理積をとって得られる画像から、細胞コロニーの境界を示すコロニー境界画像を得る工程と、
   ｈ）前記コロニー境界画像に基づいて細胞コロニーの領域を特定する工程と、
   を備えることを特徴とする細胞コロニー領域特定方法。
9. 請求項８に記載の細胞コロニー領域特定方法であって、
   前記明度変化画像が、前記コロニー画像の各位置から第１距離内に存在する画素の値の平均と、前記各位置から前記第１距離よりも離れ、第２距離よりも近い画素の値の平均との差に相当する値を、前記各位置の画素の値とする画像であり、
   前記明度変化２値画像が、細胞コロニーの周囲に現れる帯状領域の境界に沿って前記帯状領域の内側に近接する線状の領域を示す画像であり、
   前記ｇ）工程において、前記コロニー塗りつぶし画像と、前記他の明度変化２値画像との論理積が求められ、
   前記他の明度変化２値画像が、前記明度変化画像を、前記明度変化２値画像の場合とは異なる閾値にて２値化することにより得られ、前記帯状領域の境界に沿って前記帯状領域の外側に近接する線状の領域を示す画像であることを特徴とする細胞コロニー領域特定方法。
10. 請求項９に記載の細胞コロニー領域特定方法であって、
    前記ｇ）工程の前に、前記コロニー塗りつぶし画像および前記他の明度変化２値画像の少なくとも一方に太らせ処理を施す工程、をさらに備えることを特徴とする細胞コロニー領域特定方法。
11. 請求項９または１０に記載の細胞コロニー領域特定方法であって、
    前記ｂ）工程と、前記ｃ）工程との間に、前記明度変化２値画像に太らせ処理を施す工程、をさらに備えることを特徴とする細胞コロニー領域特定方法。
12. 細胞コロニーを示すコロニー画像における前記細胞コロニーの領域を特定する細胞コロニー領域特定方法であって、
    ａ）細胞コロニーの領域と他の領域とを区別する閾値にてコロニー画像を２値化してコロニー２値画像を得る工程と、
    ｂ）前記細胞コロニーの周囲に現れる帯状領域と他の領域とを区別する閾値にて前記コロニー画像を２値化して周辺２値画像を得る工程と、
    ｃ）前記コロニー２値画像および前記周辺２値画像の少なくとも一方に太らせ処理を施す工程と、
    ｄ）前記ｃ）工程後の前記コロニー２値画像と前記周辺２値画像との論理積をとることにより、初期境界画像を得る工程と、
    ｅ）前記初期境界画像に基づいて細胞コロニーの領域を特定する工程と、
    を備えることを特徴とする細胞コロニー領域特定方法。
13. 請求項１２に記載の細胞コロニー領域特定方法であって、
    前記ｃ）において、前記コロニー２値画像および前記周辺２値画像に太らせ処理が施されることを特徴とする細胞コロニー領域特定方法。
14. 請求項１２または１３に記載の細胞コロニー領域特定方法であって、
    前記ａ）工程および前記ｂ）工程の前に、前記コロニー画像にシェーディング補正を行う工程、をさらに備えることを特徴とする細胞コロニー領域特定方法。
15. コンピュータに、細胞コロニーを示すコロニー画像における前記細胞コロニーの領域を特定させるプログラムであって、前記プログラムの前記コンピュータによる実行は、前記プログラムに、
    ａ）コロニー画像の各位置とその周囲との明度の相違を示す明度変化画像を得る工程と、
    ｂ）前記明度変化画像を２値化することにより、明度変化２値画像を得る工程と、
    ｃ）前記明度変化２画像における予め定められた面積以下の閉領域を塗りつぶして小領域塗りつぶし画像を得る工程と、
    ｄ）前記小領域塗りつぶし画像に細線化を施して細線画像を得る工程と、
    ｅ）前記細線画像における小突起を削除して修正済み細線画像を得る工程と、
    ｆ）前記修正済み細線画像における閉領域を塗りつぶしてコロニー塗りつぶし画像を得る工程と、
    ｇ）前記コロニー塗りつぶし画像と、前記明度変化２値画像、または、前記コロニー画像から他の方法にて得られる他の明度変化２値画像との論理積をとって得られる画像から、細胞コロニーの境界を示すコロニー境界画像を得る工程と、
    ｈ）前記コロニー境界画像に基づいて細胞コロニーの領域を特定する工程と、
    を実行させることを特徴とするプログラム。
16. コンピュータに、細胞コロニーを示すコロニー画像における前記細胞コロニーの領域を特定させるプログラムであって、前記プログラムの前記コンピュータによる実行は、前記プログラムに、
    ａ）細胞コロニーの領域と他の領域とを区別する閾値にてコロニー画像を２値化してコロニー２値画像を得る工程と、
    ｂ）前記細胞コロニーの周囲に現れる帯状領域と他の領域とを区別する閾値にて前記コロニー画像を２値化して周辺２値画像を得る工程と、
    ｃ）前記コロニー２値画像および前記周辺２値画像の少なくとも一方に太らせ処理を施す工程と、
    ｄ）前記ｃ）工程後の前記コロニー２値画像と前記周辺２値画像との論理積をとることにより、初期境界画像を得る工程と、
    ｅ）前記初期境界画像に基づいて細胞コロニーの領域を特定する工程と、
    を実行させることを特徴とするプログラム。