JP6261031B2 - トルラ酵母由来グルコシルセラミドの大腸癌抑制剤としての利用 - Google Patents

Description

本発明は、食経験があり安全性が認められているトルラ酵母を使用し、菌体培養後に酵母エキスを抽出した酵母菌体から抽出し、得られたグルコシルセラミドを利用した大腸癌抑制効果に優れた組成物を提供するものである。

グルコシルセラミドとは、スフィンゴイド塩基と脂肪酸がアミド結合したセラミド骨格に、１分子のグルコースが結合したスフィンゴ糖脂質の一種である。動植物や微生物に幅広く分布し、サプリメント等で摂取した場合、肌機能の改善効果や、大腸癌の予防効果があることなどから近年、健康食品素材として注目を集めている。

大腸癌抑制剤及び抗腫瘍剤としてのグルコシルセラミドについては、これまで植物や真菌由来のグルコシルセラミドについて報告があった。

真菌由来グルコシルセラミドについては、酵母エキス抽出などの前処理を行わずに、菌体から直接溶剤で抽出を行うことを特徴とし、得られたグルコシルセラミド組成物に関する報告であった。

特開２００６−２９０８５６号公報 特開２００１−３２８０４１号公報

本発明の課題は、酵母エキスの抽出後に得られた酵母菌体という安全な産業廃棄物から抽出することで、安全性が高く、安価な酵母由来のグルコシルセラミドを利用することである。

本発明では酵母エキス抽出後の酵母菌体から抽出したグルコシルセラミド組成物に強い大腸癌抑制効果があることを見出した。

つまり、本発明は、以下のとおりである。
（１）、酵母エキス抽出後のトルラ酵母菌体から抽出されたグルコシルセラミドを含有する大腸癌抑制剤、
（２）、（１）の大腸癌抑制剤を含有する飲食品。

トルラ酵母から酵母エキスを抽出して得られた酵母菌体からは、夾雑物の少ない高品質のグルコシルセラミド組成物を得ることが可能であり、本発明ではこのようにして得られたトルラ酵母由来のセラミドについて、大腸癌抑制作用を調べたところ優れた効果が得られることを確認した。また本発明では酵母エキスの残渣であり産業廃棄物である酵母菌体を有効利用できるため、コスト、廃棄物削減の点でも、きわめて有利で安価な大腸癌抑制剤（結腸癌及び直腸癌）を提供することが可能である。

ヒト大腸癌細胞の増殖抑制作用（細胞試験） 発癌促進のプロトコール ヒト大腸癌細胞の増殖抑制作用（動物試験）

本発明で使用する酵母は、グルコシルセラミドを含有する酵母であればよい。特に好ましくは、一般名トルラ酵母と称されるCandida utilisである。酵母の培養形式はバッチ培養、あるいは連続培養のいずれかが用いられる。培地には炭素源として、ブドウ糖、酢酸、エタノール、グリセロール、糖蜜、亜硫酸パルプ廃液等が用いられ、窒素源としては、尿素、アンモニア、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸塩などが使用される。リン酸、カリウム、マグネシウム源も過リン酸石灰、リン酸アンモニウム、塩化カリウム、水酸化カリウム、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム等の通常の工業用原料でよく、その他亜鉛、銅、マンガン、鉄イオン等の無機塩を添加する。その他、ビタミン、アミノ酸、核酸関連物質等を添加したり、カゼイン、酵母エキス、肉エキス、ペプトン等の有機物を添加しても良い。培養温度は２１〜３７℃、好ましくは２５〜３４℃で、ｐＨは３．０〜８．０、特に３．５〜７．０が好ましい。培養条件によりアミノ酸や核酸の生産性が変動するため、目的とする酵母エキスの製品仕様に合わせて条件設定を行う。

酵母の培養は一般的な培地組成で行う。菌体培養後にエキス抽出を行う。本願では、エキス抽出後の酵母を酵母残渣としている。抽出法は、とくに制限がないが、一般的に、自己消化法、熱水抽出法、酵素抽出法、酸、若しくはアルカリ抽出法、又はこれらの組み合わせにより行うことが可能である。

自己消化により酵母エキスを抽出する場合は、例えば、５５℃で４時間攪拌する。酵素抽出法であれば、細胞壁溶解酵素又はプロテアーゼ等で攪拌抽出する。酸抽抽出法であれば、硫酸等で酸性に調整後、抽出する。アルカリ抽出法であれば、アルカリに調整後、抽出する。又は、自己消化後（例えば５５度で４時間攪拌）に、酵素抽出をする等の組み合わせも可能である。

上記の酵母中のエキス抽出により、タンパク質や核酸が抽出除去されると共に、ステロール配糖体など一部の脂溶性夾雑物が除去され、結果としてグルコシルセラミドが富化された酵母残渣が製造される。なお、本願では、夾雑物の除去及びグルコシルセラミドの定性分析をＴＬＣで、定量分析をＨＰＬＣ−ＥＬＳＤで行った。

エキス抽出後は遠心分離で酵母残渣を回収し、残渣を蒸留水に懸濁して遠心分離を繰り返すことで洗浄を行う。洗浄後の残渣を必要に応じて、凍結乾燥又は熱風乾燥することも可能である。得られた酵母残渣をトルラ酵母由来グルコシルセラミド原料とする。

続いて上記原料を用いてグルコシルセラミドの精製を行う。精製の方法に制限はないが、食品として用いることができる精製法が望ましい。例えば、特開２００２−２８１９３６に記載されている方法で精製することができる。アルコール抽出を行う場合は、トルラ酵母由来グルコシルセラミド原料に対して２倍量の９０％エタノールを使用し、攪拌によりグルコシルセラミドの抽出を行う。抽出後は抽出液を遠心分離で回収し、濃縮及び凍結乾燥または熱風乾燥させることでグルコシルセラミド組成物が得られる。

必要に応じて、グルコシルセラミド組成物をさらに精製することにより、グルコシルセラミド含有量の高い組成物を製造することもできる。精製法は、既知の方法により精製可能であり、例えば、シリカゲルやイオン交換樹脂などのカラム精製等を用いることができる。

本発明は、上記した本発明の組成物を含有することを特徴とする飲食品、化粧品、皮膚外用剤又は医薬品を提供するものである。

本発明における飲食品とは、上記組成物を配合した、食料品、飲料品、嗜好品、サプリメント等、経口で摂取するものを指す。その形態は特に限定されるものではなく、パン類、麺類等主菜となりうるもの、チーズ、ハム、ウインナー、魚介加工品等副菜となりうるもの、果汁飲料、炭酸飲料、乳飲料等の飲料、クッキー、ケーキ、ゼリー、プリン、キャンディー、ヨーグルト等の嗜好品等とすることができる。また、サプリメントとしての形態も特に限定されるものではなく、錠剤、カプセル、ソフトカプセル、栄養ドリンク状の形態をとることもできる。

飲食品におけるグルコシル組成物の配合量は特に限定されるものではなく、例えば酵母由来グルコシルセラミドが飲食品の質量１００ｇに対し１０ｐｇ〜１０ｇ含まれていればよい。中でも１００ｐｇ〜１ｇが好適であり、１０ｎｇ〜５００ｍｇは更に好適である。

以下に、実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。

（ＴＬＣ条件）
前処理としてグルコシルセラミド組成物２０ｍｇを２ｍｌの０．４Ｎ ＫＯＨ ＥｔＯＨに溶解し、３７℃で２時間インキュベートした。インキュベート後は０．４Ｎ ＨＣｌ ＥｔＯＨを２ｍｌ加えて中和し、遠心分離後の上清４μｌをＴＬＣに供した。ＴＬＣはシリカゲルプレート（メルク社製Ｓｉｌｉｃａｇｅｌ６０、層厚０．２５ｍ）を使用し、クロロホルム：エタノール：水＝６５：１６：２（容量比）で展開した。展開後はシリカゲルプレートを乾燥させ、アニスアルデヒド硫酸試液を噴霧して加熱することで発色させた。

（ＨＰＬＣ−ＥＬＳＤ条件）
前処理としてグルコシルセラミド組成物２０ｍｇを２ｍｌの０．４Ｎ ＫＯＨ ＥｔＯＨに溶解し、３７℃で２時間インキュベートした。インキュベート後は０．４Ｎ ＨＣｌ ＥｔＯＨを２ｍｌ加えて中和し、塩類をフィルター除去してからＨＰＬＣに供した。カラムにはＧＬサイエンス社製Ｉｎｅｒｔｓｉｌ １００Ａを用い、グルコシルセラミドの検出は蒸発光散乱検出器（島津製ＥＬＳＤ−ＬＴＩＩ）で行った。溶出溶媒にはクロロホルムとメタノール：水＝９５：５（容量比）のグラジエントを用いた。カラム温度は３５℃、流速は１ｍｌ／ｍｉｎ、ドリフトチューブ温度は４０℃で窒素ガス圧力は３５０ｋＰａであった。

（酵母の培養）
キャンディダ・ウチリスＣＳ７５２９株（ＦＥＲＭＰ−３３４０）を予めＹＰＤ培地（酵母エキス１％、ポリペプトン２％、グルコース２％）を含む三角フラスコで種母培養し、これを３０Ｌ容発酵槽に１８L培地に１〜２％植菌した。培地組成は、グルコース４％、燐酸一アンモニウム０．３％、硫酸アンモニウム０．１６１％、塩化カリウム０．１３７％、硫酸マグネシウム０．０８％、硫酸銅１．６ｐｐｍ、硫酸鉄１４ｐｐｍ、硫酸マンガン１６ｐｐｍ、硫酸亜鉛１４ｐｐｍを用いた。培養条件は、ｐＨ４．０、培養温度３０℃、通気量１ｖｖｍ、撹拌６００ｒｐｍで行い、アンモニアを添加しｐＨのコントロールを行った。１６時間菌体培養した後、培養液を回収し、遠心分離により集菌し、１８０gの湿潤酵母菌体を得た。

（酵母エキスの抽出）
菌体培養後の湿潤酵母菌体を蒸留水に懸濁して遠心分離を繰り返すことで洗浄した。洗浄後は湿潤菌体を蒸留水に再度懸濁するか、凍結乾燥または熱風乾燥させた乾燥菌体を蒸留水に懸濁し、以下の条件に調整することでエキス抽出を行った。
自己消化： １Ｎ ＨＣｌでｐＨ５．０に調整後、５５℃で４時間攪拌
酵素抽出：１Ｎ ＮａＯＨでｐＨ７に調整後、細胞壁溶解酵素（ツニカーゼ）或いはプロテアーゼで５５℃、４時間攪拌抽出（再現性確認中）
酸抽出：1N硫酸でｐＨ２以下に調整後、６５℃で２分間攪拌抽出
アルカリ抽出：２Ｎ ＮａＯＨでｐＨ１３に調整後、７０℃で２０分間攪拌抽出

実施例１
菌体培養後に洗浄し、熱風乾燥させたトルラ酵母の乾燥菌体５ｋｇを蒸留水５０Ｌに懸濁し、２Ｎ ＮａＯＨでｐＨ１３．０に調整した後、７０℃で３０分間エキス抽出した。抽出後は遠心分離で酵母残渣を回収し、酵母残渣の蒸留水への懸濁と遠心分離を３回繰り返すことで洗浄した。洗浄後は酵母残渣を真空乾燥することで３．３ｋｇのエキス抽出酵母残渣が得られた。得られた酵母残渣全量を２倍量の９０％エタノールに懸濁し、６０℃で１０時間攪拌してグルコシルセラミドを抽出した。遠心分離により抽出液を回収し、酵母残渣をエタノールで３回洗浄した洗浄液と合わせて濃縮した結果、抽出物３００ｇが得られた。これをグルコシルセラミド含有組成物とし、ＨＰＬＣ−ＥＬＳＤで分析した結果、グルコシルセラミドが２．１％含有されていた。またＴＬＣによる分析の結果、夾雑物のステロール配糖体は確認されなかった。大腸癌抑制効果の確認用のサンプルには、上記抽出物１５ｇをさらにシリカカラムで精製することで、グルコシルセラミド含量を３４％含有する組成物１１ｇが得られた。得られた酵母由来グルコシルセラミド組精製物を用いで大腸癌抑制作用の評価を行った。

試験例１〔癌細胞に対する増殖抑制作用〕
製造例１で得た酵母セラミドについて、癌細胞に対する増殖抑制作用を評価した。
酵母セラミドを９９．７％エタノールに溶解し、各濃度に調整して被検物質とした。

ヒト大腸癌細胞ＨＴ−２９を９６ｗｅｌｌプレートに５×１０^３／ｗｅｌｌとなるように播種し、２４時間前培養した（５％ＣＯ^２、３７℃）。培養液は１０％牛胎児血清を含むＭｃＣＯＹ’Ｓ培地を使用した。その後、酵母セラミドエタノール溶液を終濃度０．５、１、２．５、５、７．５、１０、２５、５０ μｇ／ｍｌになるように添加した新鮮な培地に交換した。培養開始７２時間後にＣｅｌｌ ｃｏｕｎｔｉｎｇ ｋｉｔ−８（同人化学製）を１０μｌ／ｗｅｌｌ添加し、３７℃、５％ＣＯ^２条件１時間静置した。その後、吸光度（４５０ｎｍ）を測定し、エタノールを加えた培地で培養したものをコントロールとし、コントロールを１００％とした時の細胞の生存率を算出した。

酵母セラミドについて、ヒト大腸癌細胞の生存率を図１に示した。

結果を図１に示す。セラミドの容量依存的にヒト大腸癌細胞の生存率が抑制された。また、２．５ μｇ／ｍｌ以上ではコントロール群と比較して有意に細胞増殖を抑制した。

試験例２〔大腸癌（結腸癌及び直腸癌）増殖抑制作用〕
発癌物質であるＡＯＭ（アゾキシメタン）を腹腔内投与後、腸炎誘発剤ＤＳＳ（デキストラン硫酸ナトリウム）で腸炎を起こさせ、発癌を促進させるモデル（Rosenberg, D.W. et al.. Carcinogenesis, (2009) 30 (2): 183-196）により、製造例１で得た酵母セラミドのマウスでの効果を確認した。

発癌促進は、Ｃ５７ＢＬ／６系統マウス６週齢 雄性にＡＯＭ（Ａ５４８６−２５ＭＧ（Ｓｉｇｍａ））を１２．５ｍｇ／ｋｇで腹腔投与後、ＤＤＳを２．５重量％含む飲料水を図２のような期間で与えた。ＡＯＭを投与しない群、セラミド投与群、コントロール群（セラミド未投与）を各群２ケージ（６〜７匹／ケージ）で評価した。なおＡＯＭを投与しない群は、コントロール群の発癌を確認するために作成した。セラミド投与群には、飼料にセラミド濃度として、０．０１重量％含有させた飼料を与えた。

ＤＤＳを与えた日から７０日飼育した後にマウスを解剖し、大腸癌の腫瘍個数を計測することで、セラミドの大腸癌の抑制効果を確認した。なお、ＡＯＭを投与しない群では、腫瘍形成は確認できなかった。

図１より、酵母セラミドはヒト大腸癌細胞に対して生存率の改善から顕著な増殖抑制作用を示すことが明らかとなった。また、図３より、セラミド投与により、腫瘍個数の減少傾向が確認され、さらに、癌細胞が確認できない個体もあった。

Claims (1)

1. 酵母エキス抽出後のトルラ酵母菌体からアルコール抽出工程により得られるグルコシルセラミド組成物を含有させる工程を有する大腸癌抑制剤の製造方法。