JP6193761B2 - 富化ライブラリーを作製する方法 - Google Patents

Description

本発明は、生体外のディスプレイライブラリー内に存在する、少なくとも１つの標的に結合する少なくとも１つの結合体について、その同定を可能にする特定の核酸配列情報を含む富化ライブラリーを作製する方法に関する。

ディスプレイ技術は、核酸の情報記憶及び増幅の能力を、他の化合物の機能活性と組み合わせるために開発された技術である。ディスプレイ技術は、機能的な結合体（すなわち表現型）と、結合体の構造物に関する情報を与える核酸配列（遺伝子型）との間の関連性に依存する。注：核酸アプタマー技術はディスプレイ技術と考えられるが、表現型と遺伝子型とが同じ分子（ＤＮＡ又はＲＮＡ）からなるという点で、特殊なケースといえる。

斯かる方法の利点は、機能的な結合体の所望の活性のために、非常に大きなライブラリーを構築し調査することができるという点である。その後、所望の活性を有するライブラリ・メンバーを、所望の活性を有していないライブラリ・メンバーから分割することにより、所望の活性を有するメンバーをより高い割合で含む富化されたライブラリーを作ることができる。この手順は選択（selection）又は富化（enrichment）と呼ばれる。ディスプレイ技術の中には、複数ラウンドの選択が可能なものもある。この場合、あるラウンドで得られた富化ライブラリーを増幅して用い、新たな富化ディスプレイライブラリーを調製し、これを次のラウンドの選択に用いる、という手順で進行する。その後、富化ライブラリーのライブラリ・メンバーの構造物を、その同族の核酸配列に基づいて同定することができ、これにより、微小量の材料からでも識別が可能となる。

本明細書では、このようなライブラリーを、本技術分野に倣って「インビトロディスプレイライブラリー」（in vitro display libraries）と呼ぶ場合がある。

本願明細書において、用語「インビトロディスプレイライブラリー」は、本技術分野に従って理解されるものとする。すなわち、多数の異なる結合体を含むライブラリーであって、各結合体が核酸分子に連結され、核酸分子が、結合体を同定することを可能にする特定の核酸配列情報を含み、これにより、核酸分子の特定の核酸配列情報が既知であれば、核酸分子に連結された特定の結合体の構造物を直接知ることが可能なライブラリーを意味する。本願明細書では、核酸分子（遺伝子型）に連結された結合体（すなわち表現型）の構造物を、Ｂ構造物と呼ぶ。

斯かるインビトロディスプレイライブラリーを作製するための方法は、先行技術文献に種々記載されている。本願発明において好適な例を以下に挙げる。EP1809743B1 (Vipergen), EP1402024B1 (Nuevolution), EP1423400B1 (David Liu), Nature Chem. Biol. (2009), 5:647-654 (Clark), WO 00/23458 (Harbury), Nature Methods (2006), 3(7), 561-570, 2006 (Miller), Nat. Biotechnol. 2004; 22, 568-574 (Melkko), Nature. (1990); 346(6287), 818-822 (Ellington), Proc Natl Acad Sci USA (1997). 94 (23): 12297-302 (Roberts), WO06053571A2 (Rasmussen).

上記先行技術文献等に記載のように、現在では極めて多数（例えば１０¹⁵）の特定の結合体（例えば１０¹⁵の異なる化合物）を含むインビトロディスプレイライブラリーを作製することができる。

ここから明らかなように、斯かるライブラリーを選択/富化して富化ライブラリーを作製する工程を改善することができれば、非常に興味深い。例えば、興味のある標的(例えば医学的に重要な受容体分子)に結合する特定の結合体(例えば化合物)の構造物を、より効率的に同定できると好ましい。

図３に、欧州特許第１８０９７４３号（Vipergen）等に記載のインビトロのディスプレイ技術の例を示す。図３から明らかなように、斯かる例の選択工程は、固体表面（例えばビーズやガラス板等）へ標的（例えば受容体等）を固定化して行なわれる。

理論に束縛されるものではないが、本発明者等の知る限りでは、図３の例は、本発明と関連するインビトロディスプレイの先行技術（例えば上述の先行技術文献）の例と考えてもよい。本発明者等の知る限りでは、先行技術において、インビトロディスプレイライブラリー内に存在する適切な結合体の選択は通常、ディスプレイライブラリー結合事象の前又は後に、固体支持体（例えばガラス板、カラム、ビーズ、ニトロセルロース膜、細胞など）に標的（例えば受容体）を固定化することにより行われる。非結合物質及び低親和性結合物質は概ね洗い流されるため、結合物質が富化された集合物が固体支持体から回収される。

先行技術では、表現型と遺伝子型との連関に基づいてライブラリーの照合を行う技術として、インビトロコンパートメント化（in vitro compartmentalization：ＩＶＣ）が提案されてきた。斯かる先行技術は二群に分類される。即ち、ａ）表現型と遺伝子型と正確な連関の確立を促進し、これにより後の機能選択（例えば特異的標的結合）を可能にするべく用いられるＩＶＣ（後コンパートメント破壊：post compartment disruption）、及び、ｂ）コンパートメント内の表現型の活性に基づいて表現型と遺伝子型との正確な連関の確立を促進するＩＶＣ、即ち、コンパートメント内で遺伝子の転写及び翻訳を生じさせ、その結果としてコンパートメント内に生じたタンパク質の機能を直接又は間接的に利用して分類、生死による選別、又は増幅を行うＩＶＣである。

言い換えれば、本発明に関連する所謂ＩＶＣの先行技術は、例えば以下のように記載することができる。
グループａ）コンパートメント化工程の後に表現型の活性を照合する技術。
グループｂ）コンパートメント化工程の間に表現型の活性を照合する技術。

グループａ）に属するＩＶＣの先行技術の例：
Bertschinger et al,(2007) Protein Engineering, Design & Selection vol. 20 no. 2 pp. 57-68;
Miller OJ, Bernath K, Agresti JJ, Amitai G, Kelly BT, Mastrobattista E, Taly
V, Magdassi S, Tawfik DS, Griffiths AD. Directed evolution by in vitro
compartmentalization. Nat Methods. 2006 Jul;3(7):561-70;
Doi,N. and Yanagawa,H. (1999) FEBS Lett., 457, 227-230; and
Yonezawa,M., Doi,N., Kawahashi,Y., Higashinakagawa,T. and Yanagawa,H.
(2003) Nucleic Acids Res., 31, e118.

グループｂ）に属するＩＶＣの先行技術の例：
Tawfik,D.S. and Griffiths,A.D. (1998) Man-made cell-like compartments for molecular evolution. Nat. Biotechnol., 16, 652-656;
Ghadessy,F.J., Ong,J.L. and Holliger,P. (2001) Proc. Natl Acad. Sci. USA, 98, 4552-4557;
Tay Y, Ho C, Droge P, Ghadessy FJ. Selection of bacteriophage lambda
integrases with altered recombination specificity by in vitro compartmentalization. Nucleic Acids Res. 2010 Mar;38(4):e25. Epub 2009 Dec 4;
Zheng Y, Roberts RJ. Selection of restriction endonucleases using artificial
cells. Nucleic Acids Res. 2007;35(11):e83. Epub 2007;
Mastrobattista E, Taly V, Chanudet E, Treacy P, Kelly BT, Griffiths AD.
High-throughput screening of enzyme libraries: in vitro evolution of a
beta-galactosidase by fluorescence-activated sorting of double emulsions. Chem
Biol. 2005 Dec;12(12):1291-300;
Levy M, Griswold KE, Ellington AD. Direct selection of trans-acting ligase
ribozymes by in vitro compartmentalization. RNA. 2005 Oct;11(10):1555-62. Epub
2005 Aug 30;
Sepp A, Choo Y. Cell-free selection of zinc finger DNA-binding proteins using
in vitro compartmentalization. J Mol Biol. 2005 Nov 25;354(2):212-9. Epub 2005
Oct 3;
Bernath K, Magdassi S, Tawfik DS. Directed evolution of protein inhibitors of
DNA-nucleases by in vitro compartmentalization (IVC) and nano-droplet delivery. J
Mol Biol. 2005 Feb 4;345(5):1015-26. Epub 2004 Dec 7.

更なるＩＶＣの先行技術の例としては、以下が挙げられる。
Bertschinger et al, (2004) Protein Engineering, Design & Selection vol. 20 no. 2 pp. 699-707;
Chen Yu et al, (November 2008) Nucleic Acid Research, Vol. 36, Nr. 19, Pages: Article No. E128;
Hansen et al. J. Am. Chem. Soc., 2009, 131 (3), pp 1322-1327.

本発明が解決しようとする課題は、例えば、興味のある標的（例えば医薬関連受容体等）に結合する少なくとも１つの結合体（例えば化合物等）を含む富化ライブラリーを作製するための、インビトロディスプレイに基づく改善された方法を提供することである。

多くの場合、治療薬の開発で最も顕著であるが、結合体（薬物）に関する２つのパラメーターが特に重要である。即ち、力価（potency）（親和性）及びオフ比（off rate）（薬物：標的複合体の解離半減期）である。本発明は、これらの重要な結合パラメーターの双方を富化するためのインビトロディスプレイ法について、より優れた解決策を提供する。

他の場合では、結合同一性のオン比特性（on-rate characteristic）が望ましい。本発明は、結合同一性のオン比特性を富化するインビトロディスプレイ方法について、より優れた解決策を提供する。

解決策として、例えば以下が挙げられる。
（ｉ）核酸分子(遺伝子型)に連結された結合体(すなわち表現型)のインビトロディスプレイライブラリーの作製。この工程は例えば、斯かるインビトロディスプレイライブラリーを作製する既知の先行技術に基づいて実施することができる。
（ii）核酸分子（遺伝子型）に連結された標的（すなわち表現型）を含む構造物の作製。この工程は例えば、斯かる構造物を作製する既知の先行技術について実施することができる。
本発明において記載する方法は、更に以下を有することを特徴とする。
（iii）結合工程を溶液中（例えば水性条件下）で行う。
（iv）適切なインビトロコンパートメント化系（例えば油中水滴型エマルション系）を用いて、標的分子より多くの個別コンパートメントを作製する。
（ｖ）共コンパートメント化された標的及び結合体遺伝子型を融合する。
（vi）コンパートメントを解消する。融合された遺伝子型を富化する（インビトロディスプレイライブラリー中の陽性の結合物質は、非結合物質よりも融合され易い傾向を有する）。
（vii）更に任意により、例えば融合した遺伝子型を精製し、及び／又は、優先的に増幅する。

当業者であれば、本明細書の詳細な説明及び技術常識に基づいて、種々の異なる方法で工程（iii）から工程（vi）を実施することが可能である。

工程（vii）は任意の工程である。本明細書で記載するように、工程（vii）の富化ライブラリーが得られたら、このライブラリーを本技術分野に従って様々な方法で用いることができる。例えば、富化ライブラリーを富化されたインビトロディスプレイライブラリーとして、例えば選択/富化の第２ラウンドに使用してもよい。或いは、工程（vi）の富化ライブラリーから、興味ある特定の結合体の構造物を直接同定してもよい。

上述したように、本発明に関連する所謂ＩＶＣの先行技術は、以下のように分けることができる。
グループａ）コンパートメント化工程の後に表現型の活性を照合する技術。
グループｂ）コンパートメント化工程の間に表現型の活性を照合する技術。

上記から明らかなように、また、本明細書において更に議論するように、本発明に記載される方法は、これらの所謂ＩＶＣの先行技術とは概念的に異なる。例えば、表現型活性は第１の観点の工程（iii）において照合されるが、これは、第１の観点のコンパートメント化工程（iv）の前に行われる。

本明細書に記載の新規な方法の原理を簡単に説明すれば、以下のとおりである。ディスプレイライブラリー中の非結合物質は、コンパートメントに無作為に分配され、惹いてはコンパートメント数と標的分子数との比率に応じた頻度で、標的と一緒に無作為に共コンパートメント化される。対照的に、結合物質はその結合活性ゆえに、コンパートメント数と標的分子数との比率とは無関係に、標的分子と一緒に共コンパートメント化される。従って、コンパートメント数と標的分子数との比率が１よりも大きければ、結合物質は富化されることになる。比率が高いほど、より富化されることになる。

本明細書に記載の新規な方法の例を図１及び２に示す。

本発明に関連する多数の結合体及び所定の標的の例を実施例１及び２に示す。実施例１及び２の結論から明らかなように、本明細書に記載の方法を用いれば、例えばライブラリーに含まれる結合物質を１０００倍に富化することができる。

従って、本発明の第1の観点は、少なくとも１つの標的に結合する少なくとも１つの結合体（binding entity）の同定を可能にする特定の核酸配列情報を含む富化ライブラリーを作製する方法であって、前記特定の結合体はインビトロディスプレイライブラリー内に存在し、前記方法は、
（ｉ）少なくとも１００種類の異なる結合体Ｂ_n（ｎ＝１００以上）のインビトロディスプレイライブラリーを作製し、ここで各結合体は核酸分子に連結され、前記核酸分子は前記結合体の同定を可能にする特定の核酸配列情報を含み、これにより前記核酸分子の特定の核酸配列情報から、前記核酸分子に連結された前記特定の結合体の構造物が直接同定され（前記核酸分子（遺伝子型）に連結された前記結合体の構造物（即ち表現型）を以下「Ｂ構造物」（B-structure）と呼ぶ。）、
（ii）少なくとも１種類の標的Ｔ_n（ｎ＝１以上）が連結された核酸分子を作製し、ここで前記核酸分子は特異的標的の同定を可能にする特定の核酸配列情報を含み、ここで前記標的は工程（ｉ）のライブラリーに存在する結合体の少なくとも１つに結合する能力を有し（前記核酸分子（遺伝子型）に連結された前記標的の構造物（即ち表現型）を以下「Ｔ構造物」（T-structure）と呼ぶ。）、
（iii）工程（ｉ）のライブラリーの総数Ｘ（ここでＸは１０⁴よりも大きな数である）個のＢ構造物を含む溶液を、工程（ii）のＹ（ここでＹは１０²よりも大きな数である）個のＴ構造物を含む溶液と、結合条件下で混合し、ここで結合条件は、標的分子に結合する能力を有する結合体を含むＢ構造物が、同じ標的に結合する能力を有しない結合体を含むＢ構造物と比べて、対応するＴ構造物により効率的に結合する条件であり、これにより前記結合体の少なくとも１つが少なくとも１つの標的に結合して、Ｔ構造物に結合したＢ構造物を含む複合体が生成され（これを以下「Ｂ_結合Ｔ構造物」（B_BoundToT-structure）と呼ぶ）、
（iv）インビトロのコンパートメント化系を結合条件下で適用し、ここで結合条件は、標的分子に結合する能力を有する結合体を含むＢ構造物が、同じ標的に結合する能力を有しない結合体を含むＢ構造物と比べて、対応するＴ構造物より効率的に結合する条件であり、ここで前記コンパートメント化系は、Ｂ構造物、Ｔ構造物及びＢ_結合Ｔ構造物が個別コンパートメント内に無作為に入る条件下で、工程（iii）で存在するＹ個のＴ構造物と比べて、少なくとも２倍の個別コンパートメントを含み、
（ｖ）同じ個別コンパートメント内に存在するＢ構造物とＴ構造物との核酸分子を融合し、即ち、Ｂ構造物の核酸分子をＴ構造物の核酸分子に融合し（この構造物を以下「ＢＴ_融合 構造物」（BT_Fused-structure）と呼ぶ）、前記ＢＴ_融合 構造物は、工程（ｉ）の結合体の同定を可能にする特定の核酸配列情報と、工程（ii）の特異的標的の同定を可能にする特定の核酸配列情報とを含み、
（vi）Ｂ構造物の核酸分子とＴ構造物の核酸分子との融合がない条件、即ち、工程（ｖ）で形成されなかった新たなＢＴ_融合 構造物が形成されない条件下で、工程（ｖ）の個別コンパートメントの内容物を併合することにより、ＢＴ_融合 構造物のライブラリーを取得し、ここで前記ライブラリーは、標的と結合実体（binder entity）との非結合対に由来するＢＴ_融合 構造物に比べて、標的と結合実体との結合対に由来するＢＴ_融合 構造物の種が富化されたライブラリーである、方法に関する。

本明細書に記載の第１の観点の方法は、共コンパートメント化による富化（Enrichment by Co-Compartmentalization：ＥＣＣ）と呼ぶことができる。

本明細書に記載のＥＣＣ法の利点は、重要な結合特性の富化を分離して最適化できる点である。ＥＣＣは均質アッセイであるので、標的を固体支持体に固定化する必要がない。先行技術の方法は不均質系であり、固体支持体（例えばビーズ、カラム、細胞、プラスチック、ろ過器など）への標的固定化に依存する。不均質アッセイは、例えばアビディティー作用（avidity effects）、被膜の密度、アッセイに対する固体支持体自体の干渉等により、均質アッセイと比べて遥かに制御が困難である。

上に議論されたように、本発明に関連するインビトロディスプレイの先行技術（例えば上述の先行技術等）では、インビトロディスプレイライブラリー内に存在する適切な結合体の選択は通常、ディスプレイライブラリー結合事象の前又は後に、固体支持体（例えばガラス板、カラム、ビーズ、ニトロセルロースフィルター、細胞など）に標的（例えば受容体）を固定化することにより行われる。非結合物質及び低親和性結合物質は概ね洗い流されるため、結合物質が富化された集合物が固体支持体から回収される。

従って、当業者であれば理解するように、本発明に関連する上述の先行技術の方法が「固体支持体への標的固定化に依存する」方法であるとすれば、適切な結合体の選択は固体支持体への標的の固定化に依存し、これは適切な結合体を選択するための必須要素となる。

当業者に明らかなように、第１の観点の方法は、斯かる固体支持体への標的固定化に依存する先行技術の方法とは異なる。第１の観点の工程（iv）で規定するように、結合体の選択は、個別コンパートメント内へのＢ_結合Ｔ構造物の分離に基づいて行われるからである。

上記に従い、また、当業者であれば理解するように、第１の観点の方法において、理論的には例えば、工程（ii）における標的Ｔ構造物がビーズを含む場合を想定することができる。それは理論上、標的がビーズに結合されたＴ構造物であってもよい。更には、工程（ii）におけるＴ構造物の特定の標的の同定を可能にする特定の核酸配列情報を含む核酸分子が、ビーズに結合されていてもよい。

当業者に明らかなように、ビーズを含む斯かる特別なT構造物は、第1の観点の方法が、固体支持体への標的の固定化に依存して適切な結合体を選択する方法ではない、という事実を変更することはない。

上記に従い、また、当業者であれば理解するように、本発明との関連において、第１の観点の方法は、第１の観点の工程（iv）の個別の／分離されたコンパートメント内の溶液にＢ_結合Ｔ構造物（すなわち標的結合体複合体）が懸濁された状態で維持されることを示唆する方法と考えてもよい。

ＥＣＣによれば、標的に結合体を結合するための主な結合特性を独立して最適化することが可能となる。例えば、力価（親和性）、会合率（オン比）、結合体と標的の解離半減期（オフ比）等である。

親和性に基づいた選択は、均衡条件を用いることにより達成され、混合工程（結合工程）の標的濃度により制御される。親和性に基づいた選択は、均衡条件を用いることにより達成され、混合工程（結合工程）の標的濃度により制御される。すなわち、標的濃度の１０分の１に等しいＫ_dを有するディスプレイライブラリー中の結合体分子は、９０％が標的に結合される。一方、標的濃度と同程度のＫ_dを有している結合体分子は、５０％が標的に結合し、標的濃度の１０倍に等しいＫ_dを有する結合体分子は、１０％が標的に結合される。従って、親和性の富化は、混合工程の標的濃度によって容易に制御することができる。

本発明の別の観点は、第１の観点の工程（vi）の富化ライブラリーに関連し、かつ第１の観点の方法によって、或いは本発明に関連する第１の観点の態様から得られる。

本発明の態様を以下に記載するが、これらはあくまでも例示にすぎない。

本明細書に記載の方法の原理を示す例。 本明細書に記載の方法の原理を示す例。第１の態様の融合工程（ｖ）でエマルジョンＰＣＲを用いた例。 欧州特許第１８０９７４３号（Vipergen）等に記載のインビトロディスプレイ技術の例。図から明らかなように、斯かる例の選択工程は、固体表面（例えばビーズ又はガラス板）に標的（例えば受容体）を固定化することにより行なわれる。 実施例３の１０％ＴＢＥ ＰＡＧＥの結果。低域ＤＮＡマーカー（Fermentas）をレーンＭにロードした。レーン１には、ビオチンとのプレインキュベーションを行わない結合反応に由来するＰＣＲ産物をロードした。レーン２には、ビオチンとのプレインキュベーションを行った結合反応に由来するＰＣＲ産物をロードした。 実施例４のＤＮＡ塩基配列決定の結果 実施例５で計算されたｑＰＣＲ反応物の融合分子数を示すグラフ 実施例６のＤＮＡ塩基配列決定の結果

インビトロディスプレイライブラリー 〜 第１の観点の工程（ｉ）
「インビトロディスプレイライブラリー」（in vitro display library）という語は、本技術分野に従い理解される。すなわち、多数の異なる結合体を含むライブラリーであって、各結合体が核酸分子に連結され、核酸分子が、結合体を同定することを可能にする特定の核酸配列情報を含むライブラリーを意味する。すなわち、多数の異なる結合体を含むライブラリーであって、各結合体が核酸分子に連結され、核酸分子が、結合体を同定することを可能にする特定の核酸配列情報を含むライブラリーを意味する。本願明細書では、核酸分子（遺伝子型）に連結された結合体（すなわち表現型）の構造物を、Ｂ構造物と呼ぶ。

本明細書で議論するように、先行技術には、斯かるインビトロディスプレイライブラリー（すなわち工程（ｉ）のインビトロディスプレイライブラリー）を作製する、多くの異なる方法が記載されている。

換言すれば、核酸分子（遺伝子型）に結合体（すなわち表現型）が連結された構造物（本明細書ではこれを「Ｂ構造物」と呼ぶ）は、現在では当業者であれば定型的な作業によって適切に作製することが可能である。

本技術分野では周知のように、結合体(すなわち表現型)の核酸分子(遺伝子型)への連結は、共有結合等によるものでもよく、高親和性非共有結合等によるものでもよい。

本発明では、結合体（すなわち表現型）が共有結合によって核酸分子（遺伝子型）に連結されることが好ましい。

工程（ｉ）のインビトロディスプレイライブラリーは多くの異なるＢ構造物を含む。即ち、上述の通り、工程（ｉ）のインビトロディスプレイライブラリーを作製することは、当業者にとっては定型的な作業である。

好ましい例としては、EP1809743B1 (Vipergen), EP1402024B1 (Nuevolution), EP1423400B1 (David Liu), Nature Chem. Biol. (2009), 5:647-654 (Clark), WO 00/23458 (Harbury), Nature Methods (2006), 3(7), 561-570, 2006 (Miller), Nat. Biotechnol. 2004; 22, 568-574 (Melkko), Nature. (1990); 346(6287), 818-822 (Ellington), or Proc Natl Acad Sci USA (1997). 94 (23): 12297-302 (Roberts)等が挙げられる。

言い換えれば、第１の態様の工程（ｉ）のインビトロディスプレイライブラリーは、先行技術に記載されるような様々な方法で作製することができる。

理論に束縛されるものではないが、本発明において適切なインビトロディスプレイライブラリー技術の例としては、ＤＮＡコード化化合物ライブラリー（DNA Encoded Chemical Library）技術、アプタマー技術、ＣＩＳディスプレイ等のＲＮＡ／ＤＮＡディスプレイ技術、リボソームディスプレイ、ｍＲＮＡディスプレイ、又は（コード化に核酸を用いた）ビーズディスプレイ系が挙げられる。

先行技術に記載されるように（例えば欧州特許第１８０９７４３号（Vipergen）参照）、Ｂ構造物の核酸分子としては、ＰＮＡ、ＬＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ又はその組み合わせが挙げられる。好ましくは、Ｂ構造物の核酸分子はＤＮＡである。

本発明の好ましい態様によれば、Ｂ構造物の結合体（表現型）に連結された核酸分子（遺伝子型）は、二本鎖核酸分子である。

本発明の好ましい態様によれば、Ｂ構造物の結合体（表現型）に連結された核酸分子（遺伝子型）は、少なくとも０％二本鎖（すなわち一本鎖）、少なくとも１０％二本鎖、少なくとも２０％二本鎖、二本鎖、少なくとも３０％二本鎖、少なくとも４０％二本鎖、少なくとも５０％二本鎖、少なくとも６０％二本鎖、少なくとも７０％二本鎖、少なくとも８０％二本鎖％二本鎖、少なくとも９０％二本鎖、あるいは１００％二本鎖である。

本発明の好ましい態様によれば、Ｂ構造物の結合体（表現型）に連結された核酸分子（遺伝子型）は、ＰＣＲプライミング部位又はその断片を含んでいてもよい。

本発明の好ましい態様によれば、Ｂ構造物の結合体（表現型）に連結された核酸分子（遺伝子型）は、２つのＰＣＲプライミング部位又はその断片を含んでいてもよい。

本発明の好ましい態様によれば、Ｂ構造物の結合体（表現型）に連結された核酸分子（遺伝子型）は、少なくとも３つのＰＣＲプライミング部位又はその断片を含んでいてもよい。

本発明のある態様によれば、ＰＣＲプライミング部位の断片は、少なくとも５つのヌクレオチド、少なくとも６つのヌクレオチド、少なくとも７つのヌクレオチド、少なくとも８つのヌクレオチド、少なくとも９つのヌクレオチド、少なくとも１０のヌクレオチド、少なくとも１１のヌクレオチド、少なくとも１２のヌクレオチド、少なくとも１３のヌクレオチド、少なくとも１４のヌクレオチド、少なくとも１５のヌクレオチド、少なくとも１６のヌクレオチド、少なくとも１７のヌクレオチド、少なくとも１８のヌクレオチド、少なくとも１９のヌクレオチド、又は少なくとも２０のヌクレオチドを含む。

本発明のある態様によれば、Ｂ構造物で結合体（表現型）に連結された核酸分子（遺伝子型）は、Ｂ構造物の遺伝子型の一本鎖オーバーハングに対して逆相補的な一本鎖オーバーハングを含んでいてもよい。

本発明のある態様によれば、Ｂ構造物において結合体（表現型）に連結された核酸分子（遺伝子型）は、Ｂ構造物の遺伝子型の一本鎖オーバーハングに対して逆相補的な一本鎖オーバーハングを含んでいてもよい。オーバーハングは、好ましくは１ヌクレオチド、２ヌクレオチド、３ヌクレオチド、４ヌクレオチド、５ヌクレオチド、６ヌクレオチド、７ヌクレオチド、８ヌクレオチド、９ヌクレオチド又は１０ヌクレオチド長である。

結合体
結合体としては興味のある任意の結合体が用いられる。

第１の観点の工程（ｉ）では、「少なくとも１００種類の異なる結合体Ｂ_n（ｎ＝１００以上）」と規定する。

実際には、工程（ｉ）のライブラリーには、遥かに多くの異なる結合体が存在していてもよい。例えば、少なくとも１０⁴、少なくとも１０⁵、又は少なくとも１０⁶の、異なる結合体（即ち、ｎ＝少なくとも１０⁴、ｎ＝少なくとも１０⁵又はｎ＝少なくとも１０⁶）が存在していてもよい。

従って、理論的な状況として、仮にライブラリーがちょうど１０⁴の異なる結合体を含む場合、本明細書ではこれをＢ_n（ｎ＝１０⁴）又はＢ₁₀ ⁴と表現する。

理論に束縛されるものではないが、１０²⁰を超える異なる結合体を有するライブラリーを作製するのは難しいであろう。

適切な例として、結合体は、タンパク質、ポリペプチド、核酸及び化合物（好ましくは平均分子量ＭＷ１００００ダルトン未満、より好ましくは平均分子量ＭＷ５０００ダルトン未満、より一層好ましくは平均分子量ＭＷ１０００ダルトン未満の小化合物）からなる群より選択される、少なくとも１つの結合体である。

本発明に関連する結合体(例えば化合物等)の適切な例は、先行技術に記載されている。例えば、EP1809743B1 (Vipergen), EP1402024B1 (Nuevolution), EP1423400B1 (David Liu), Nature Chem. Biol. (2009), 5:647-654 (Clark), WO 00/23458 (Harbury), Nature Methods (2006), 3(7), 561-570, 2006 (Miller), Nat. Biotechnol. 2004; 22, 568-574 (Melkko), Nature. (1990); 346(6287), 818-822 (Ellington), or Proc Natl Acad Sci USA (1997). 94 (23): 12297-302 (Roberts)等を参照。

要するに、当業者であれば、本発明との関連において興味ある結合体となり得る膨大な数の物質を挙げることができるであろう。

第１の観点の工程（ii）
本明細書で議論するように、標的は、工程（ｉ）のライブラリー中にある結合体の少なくとも１つに結合することができるものとする。そうでなければ、少なくとも１つの標的に結合する特異的結合実体を同定するために使用できる適切な標的にはならない。

上述のように、核酸分子（遺伝子型）に適切に標的（すなわち表現型）を連結することにより、核酸分子（遺伝子型）に連結された標的（すなわち表現型）の構造物（すなわち本発明にいう「Ｔ構造物」）を作製することは、現在では当業者にとって定型的な作業である。

言い換えれば、例えば工程（ｉ）のインビトロディスプレイライブラリーの作製との関連で先に議論した先行技術文献等に基づいて、本発明に関連する「Ｔ構造物」を作製してもよい。

本技術分野では周知のように、標的（すなわち表現型）の核酸分子（遺伝子型）への連結は、共有結合等によるものでもよく、高親和性非共有結合等によるものでもよい。

本発明では、標的（すなわち表現型）が共有結合によって核酸分子（遺伝子型）に連結されることが好ましい。

第１の観点の工程（ｉ）は、「少なくとも１種類の標的Ｔ_n（ｎ＝１以上）」と記載する。

本明細書で議論するように、本発明に記載の方法の利点の一つは、例えば、２つ以上の標的に結合し得る結合体を同時に、効率的且つ迅速に選別することができるという点にある。

例えば、標的は２種類の異なる受容体分子であってもよく、この場合、本発明に記載の方法は、一方の受容体に結合する１種類の結合体と、別の受容体に結合する別の種類の結合体とを、同時に同定することができる。

上述の例（２種類の異なる受容体標的の例）では、標的はＴｎ（ｎ＝２）或いはＴ₂と表現される。

即ち、工程（ii）には少なくとも２種類の異なる標的が存在してもよく（即ちＴｎ（ｎ＝２以上）、工程（ii）に少なくとも３種類の異なる標的が存在してもよく（即ちＴｎ（ｎ＝３以上）、工程（ii）に少なくとも１０種類の異なる標的が存在してもよく（即ちＴｎ（ｎ＝１０以上）、工程（ii）に少なくとも１００種類の異なる標的が存在してもよい（即ちＴｎ（ｎ＝１００以上）。

理論に束縛されるものではないが、工程（ii）において、１００，０００を超える異なる標的（すなわち１００，０００を超える異なるＴ構造物）を有するのは難しいであろう。

先行技術に記載されるように（例えば欧州特許第１８０９７４３号（Vipergen）参照）、Ｔ構造物の核酸分子としては、ＰＮＡ、ＬＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ又はその組み合わせが挙げられる。好ましくは、Ｔ構造物の核酸分子はＤＮＡである。

本発明の好ましい態様によれば、Ｔ構造物の結合体（表現型）に連結された核酸分子（遺伝子型）は、少なくとも５ヌクレオチド長、少なくとも１０ヌクレオチド長、少なくとも２０ヌクレオチド長、少なくとも３０ヌクレオチド長、少なくとも４０ヌクレオチド長、少なくとも５０ヌクレオチド長、少なくとも６０ヌクレオチド長、少なくとも７０ヌクレオチド長、少なくとも８０ヌクレオチド長、少なくとも９０ヌクレオチド長、少なくとも１００のヌクレオチド長、少なくとも２００ヌクレオチド長、少なくとも３００ヌクレオチド長、少なくとも４００ヌクレオチド長、又は少なくとも５００ヌクレオチド長である。

本発明の好ましい態様によれば、Ｔ構造物の標的（表現型）に連結された核酸分子（遺伝子型）は、二本鎖核酸分子である。

本発明の好ましい態様によれば、Ｔ構造物の標的（表現型）に連結された二本鎖核酸分子（遺伝子型）は、少なくとも５塩基対長、少なくとも１０塩基対長、少なくとも２０塩基対長、少なくとも３０塩基対長、少なくとも４０塩基対長、少なくとも５０塩基対長、少なくとも６０塩基対長、少なくとも７０塩基対長、少なくとも８０塩基対長、少なくとも９０塩基対長、少なくとも１００の塩基対長、少なくとも２００塩基対長、少なくとも３００塩基対長、少なくとも４００塩基対長、又は少なくとも５００塩基対長である。

本発明の好ましい態様によれば、Ｔ構造物の標的（表現型）に連結された核酸分子（遺伝子型）は、少なくとも０％二本鎖（すなわち一本鎖）、少なくとも１０％二本鎖、少なくとも２０％二本鎖、二本鎖、少なくとも３０％二本鎖、少なくとも４０％二本鎖、少なくとも５０％二本鎖、少なくとも６０％二本鎖、少なくとも７０％二本鎖、少なくとも８０％二本鎖％二本鎖、少なくとも９０％二本鎖、あるいは１００％二本鎖である。

本発明の好ましい態様によれば、Ｔ構造物の標的（表現型）に連結された核酸分子（遺伝子型）は、ＰＣＲプライミング部位又はその断片を含んでいてもよい。

本発明の好ましい態様によれば、Ｔ構造物の標的（表現型）に連結された核酸分子（遺伝子型）は、２つのＰＣＲプライミング部位又はその断片を含んでいてもよい。

本発明の好ましい態様によれば、Ｔ構造物の標的（表現型）に連結された核酸分子（遺伝子型）は、少なくとも３つのＰＣＲプライミング部位又はその断片を含んでいてもよい。

本発明のある態様によれば、ＰＣＲプライミング部位の断片は、少なくとも５つのヌクレオチド、少なくとも６つのヌクレオチド、少なくとも７つのヌクレオチド、少なくとも８つのヌクレオチド、少なくとも９つのヌクレオチド、少なくとも１０のヌクレオチド、少なくとも１１のヌクレオチド、少なくとも１２のヌクレオチド、少なくとも１３のヌクレオチド、少なくとも１４のヌクレオチド、少なくとも１５のヌクレオチド、少なくとも１６のヌクレオチド、少なくとも１７のヌクレオチド、少なくとも１８のヌクレオチド、少なくとも１９のヌクレオチド又は少なくとも２０のヌクレオチドを含む。

本発明のある態様によれば、Ｔ構造物の結合体（表現型）に連結された核酸分子（遺伝子型）は、Ｂ構造物の遺伝子型の一本鎖オーバーハングに対して逆相補的な一本鎖オーバーハングを含んでいてもよい。

本発明のある態様によればＴ構造物の結合体（表現型）に連結された核酸分子（遺伝子型）は、Ｂ構造物の遺伝子型の一本鎖オーバーハングに対して逆相補的な一本鎖オーバーハングを含んでいてもよい。オーバーハングは、好ましくは１ヌクレオチド、２ヌクレオチド、３ヌクレオチド、４ヌクレオチド、５ヌクレオチド、６ヌクレオチド、７ヌクレオチド、８ヌクレオチド、９ヌクレオチド又は１０ヌクレオチド長である。

本発明のある態様によれば、Ｔ構造物において標的（表現型）に連結された核酸分子（遺伝子型）は、各標的分子について独自の特定配列（Unique Molecule Identifier：ＵＭＩ）を含んでいてもよい。

本発明のある態様によれば、Ｔ構造物に標的（表現型）に連結された核酸分子（遺伝子型）は、各標的分子について、少なくとも１６のＮ（Ｎ＝Ａ、Ｃ、Ｇ又はＴ）（少なくとも１７のＮ）、少なくとも１８のＮ、少なくとも１９のＮ、少なくとも２０のＮ、少なくとも２１のＮ、少なくとも２２のＮ、少なくとも２３のＮ、少なくとも２４のＮ、少なくとも２５のＮ、少なくとも２６のＮ、少なくとも２７のＮ、少なくとも２８のＮ、少なくとも２９のＮ又は少なくとも３０のＮからなる、独自の特定配列（Unique Molecule Identifier：ＵＭＩ）を含んでいてもよい。

本発明のある態様によれば、Ｔ構造物において標的（表現型）に連結された核酸分子（遺伝子型）は、各標的分子について、連続的な配列からなる独自の特定配列（Unique Molecule Identifier：ＵＭＩ）を含んでいてもよい。

本発明のある態様によれば、Ｔ構造物において標的（表現型）に連結された核酸分子（遺伝子型）は、各標的分子について、不連続な配列からなる独自の特定配列（Unique Molecule Identifier：ＵＭＩ）を含んでいてもよい。

本発明のある態様によれば、Ｔ構造物において第１の標的（表現型）に連結された核酸分子（遺伝子型）は、第２の標的の第２の遺伝子型配列と異なる（多重化を可能にする）第１の配列を含んでいてもよい。

本発明のある態様によれば、Ｔ構造物において第１の標的（表現型）に連結された核酸分子（遺伝子型）は、第２の標的の第２の遺伝子型配列と異なる（多重化を可能にする）第１の配列を含んでいてもよく、ここで第１及び第２の標的遺伝子型は、異なるＰＣＲプライミング部位を含んでいてもよい。

標的
標的としては興味のある任意の標的が用いられる。

本発明の好ましい態様によれば、所望の特性を有する結合体の同定を促進するための具体的な富化方法としては、限定されるものではないが、標的分子に連結された核酸の富化が挙げられる。この手法によれば、標的分子は例えばＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、炭水化物、有機又は無機分子である。

本技術分野では周知のように、適切な標的としては、例えばヒト等の体内の受容体分子が挙げられる。受容体に結合し得る結合体（例えば化合物）の同定は興味深い。

先行技術によれば、好適な例として、標的はＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、炭水化物、有機若しくは無機分子、又はその断片である。

先行技術によれば、好適な例として、標的は、自己抗原、細菌タンパク質、血液タンパク質、細胞接着タンパク質、サイトカイン、細胞骨格タンパク質、ＤＮＡ結合性タンパク質、発生関連タンパク質、遺伝子改変タンパク質、酵素、細胞外基質タンパク質、ＧＴＰ結合タンパク質調節因子、糖タンパク質、発育因子、熱ショックタンパク質、リポタンパク質、膜タンパク質、金属タンパク質、運動タンパク質、リンタンパク質、プリオン、タンパク質複合体、タンパク質ドメイン、ＲＮＡ結合タンパク質、受容体、組換タンパク質、種子貯蔵タンパク質、構造タンパク質、転写共調節因子タンパク質、輸送タンパク質、ウィルスタンパク質、又はその断片である。

要するに、当業者であれば、本発明との関連において興味ある標的となり得る膨大な数の物質を挙げることができるであろう。

第１の観点の工程（iii）：
図１に示す例において、この工程（iii）は、「１．結合」に相当する。

上に議論したように、工程（iii）は、「工程（ｉ）のライブラリーの総数Ｘ（Ｘは１０⁴よりも大きな数である）個のＢ構造物を含む溶液を・・・混合し」と記載する。

Ｂ構造物の数に関する記号「Ｘ」は、工程（ｉ）のライブラリーにおけるＢ構造物の総数を表すと理解するものとする。

例えば、ライブラリーが１００の異なる結合体を有し（Ｂ_n（ｎ＝１００））、これら１００の異なるＢ構造物が各々１００コピーずつ存在する場合には、「Ｘ」は１００×１００＝１０⁴に等しい数となる。

実際には、Ｘは遥かに大きな数でもよい。例えば、ライブラリーが１０⁶の異なる結合体を有し（Ｂ_n（ｎ＝１０⁶））、これら１０⁶の異なるＢ構造物が各々１０⁴コピーずつ存在する場合には、「Ｘ」は１０⁶×１０⁴＝１０¹⁰に等しい数となる。

上に議論したように、工程（iii）は、「工程（ii）のＹ（Ｙは１０²よりも大きな数である）個のＴ構造物を含む溶液」と記載する。

Ｔ構造物の数に関する記号「Ｙ」は、工程（ii）のライブラリーにおけるＴ構造物の総数を表すと理解するものとする。

例えば、工程（ii）において標的が１種類しかなく（Ｔ_n（ｎ＝１））、このＴ構造物が１０²コピー存在する場合には、「Ｙ」は１×１０²＝１０²に等しい数となる。

上に議論したように、例えば２種類の異なる標的（例えば２種類の異なる受容体分子）が存在してもよい。この場合、工程（ii）において２種類の標的［Ｔ_n（ｎ＝２）］が存在し、それに対応する２つの異なるＴ構造物が各々１０²コピーずつ存在する場合には、「Ｙ」は２×１０²＝２００に等しい数となる。

実際には、多くの場合、関連するＴ構造物のコピー数は、遥かに大きな数となる。その理由は、構造物の標的がＢ構造物の結合体に結合する可能性をできるだけ高くするために、関連するＴ構造物のコピー数をできるだけ多くすることが好ましいからである。

従って、好ましい態様によれば、興味あるＴ構造物のコピー数は、少なくとも１０⁰、少なくとも１０¹、少なくとも１０²、少なくとも１０³、少なくとも１０⁴、少なくとも１０⁵、少なくとも１０⁶、少なくとも１０⁷少なくとも１０⁸、少なくとも１０⁹、少なくとも１０¹⁰、少なくとも１０¹¹、少なくとも１０¹²、少なくとも１０¹³、少なくとも１０¹⁴、少なくとも１０¹⁵、又は少なくとも１０¹⁶である。

本明細書に記載のＥＣＣ法の利点は、重要な結合特性の富化を独立に最適化できるという点にある。ＥＣＣは均質アッセイであるので、標的を固体支持体に固定化する必要がない。先行技術の方法は不均質系であり、固体支持体（例えばビーズ、カラム、細胞、プラスチック、ろ過器など）への標的固定化に依存する。不均質アッセイは、例えばアビディティー作用（avidity effects）、被膜の密度、アッセイに対する固体支持体自体の干渉等により、均質アッセイと比べて遥かに制御が困難である。

ＥＣＣによれば、標的に結合体を結合するための主な結合特性を独立して最適化することが可能となる。例えば、力価（親和性）、会合率（オン比）、結合体と標的の解離半減期（オフ比）等である。

工程(iii)において、親和性に基づく選択は、例えば、平衡条件を用いることで達成され、また、混合工程(結合工程)の標的濃度によって制御される。即ち、標的濃度の１０分の１に等しいＫ_dを有するディスプレイライブラリー結合体分子は、９０％が標的に結合される。一方、標的濃度と同程度のＫ_dを有する結合体分子は、５０％が標的に結合し、標的濃度の１０倍に等しいＫ_dを有する結合体分子は、１０％が標的に結合される。従って、親和性の富化は、混合工程の標的濃度によって容易に制御することができる。

本発明の好ましい態様によれば、「混合工程（iii）」におけるＴ構造物の濃度は、少なくとも１０^-15Ｍ、少なくとも１０^-14Ｍ、少なくとも１０^-13Ｍ、少なくとも１０^-12Ｍ、少なくとも１０^-11Ｍ、少なくとも１０^-10Ｍ、少なくとも１０^-9Ｍ、少なくとも１０^-8Ｍ、少なくとも１０^-7Ｍ、少なくとも１０^-6Ｍ、少なくとも１０^-5Ｍ、少なくとも１０^-4Ｍ、又は少なくとも１０^-3Ｍである。

あるいは、会合比率に基づく選択は、混合工程（iii）に割り当てられる時間を制御することでも達成される。即ち、「混合工程」を、結合平衡条件に達する所要時間より短い時間で行ってもよい。

工程（iii）は更に、「結合条件は、標的分子に結合する能力を有する結合体を含むＢ構造物が、同じ標的に結合する能力を有しない結合体を含むＢ構造物と比べて、対応するＴ構造物により効率的に結合する条件であり、これにより前記結合体の少なくとも１つが少なくとも１つの標的に結合して、Ｔ構造物に結合したＢ構造物を含む複合体が生成され（これを以下「Ｂ_結合Ｔ構造物」（B_BoundToT-structure）と呼ぶ。）」と記載する。

「より効率的に結合する」（binds more efficiently）との記載は、技術常識に従って、例えば、より高い親和性、より速いオン比、又は、より遅い解離速度として理解されるものとする。

当業者には周知のように、本発明との関連において、「より効率的に結合する」条件下で工程（iii）を実施することは、当業者であれば定型的な作業で可能である。

例えば、この「より効率的に結合する」作用は、例えば、工程（iii）の結合条件下で（ハイブリダイゼーションによる塩基対形成等により）実質的に結合しないＢ及びＴ構造物遺伝子型を用いることによって、容易に達成することができる。当業者には明らかなように、Ｂ及びＴ構造物の遺伝子型として、一本鎖塩基対のオーバーラップが殆ど又は全く存在しない二本鎖ＤＮＡを使用することにより、これを達成することができる。

工程（iii）において所望の「より効率的に結合する」作用を得る目的で、工程（iii）の結合条件を最適化することは、当業者であれば定型的な作業で可能である。

当業者には周知のように、本発明に関連する最適化パラメーターとしては、例えばイオン強度、温度等が挙げられる。

従って、本発明に関連する現実の環境において、工程（iii）の結合条件を（例えば結合条件に適宜、定型的な調節を加えることにより）達成できることは、当業者であれば些かの合理的な疑いも抱かないであろう。

好ましい態様では、工程（iii）は、標的分子に結合する能力を有する結合体を含むＢ構造物が、同じ標的に結合する能力を有しない結合体を含むＢ構造物よりも、１０倍（より好ましくは１００倍、更に好ましくは１０００倍）効率的に、対応するＴ構造物に結合するような結合条件の下で行なわれる。

工程（iii−ｂ） 〜 希釈工程 〜 好ましい態様：
図１に示す例において、任意の工程（iii−ｂ）は「２．稀釈」工程に相当する。

本発明では、混合工程（iii）に続いて希釈段階を行うことが好ましい。これは工程（iii−ｂ）と呼ばれ、第１の態様の工程（iv）の前に行なわれる。

即ち、好ましい態様によれば、第１の観点の方法は、第１の観点の工程（iv）の前に実施される追加の工程（iii−ｂ）、即ち、（iii−ｂ）結合条件、即ち、標的分子に結合する能力を有する結合体を含むＢ構造物が、同じ標的に結合する能力を有しない結合体を含むＢ構造物と比べて、対応するＴ構造物により効率的に結合する結合条件下で、少なくとも２倍に希釈する工程を含む。

希釈工程（iii−ｂ）において採用される希釈溶液や希釈条件（温度等）は、混合工程（iii）での結合条件等に応じて異なる。しかし、上述の作用は、希釈工程（iii−ｂ）でも維持されるようにする。

工程（iii−ｂ）では、工程（iii）の溶液を少なくとも１０²倍に、工程（iii）の溶液を少なくとも１０³倍に、工程（iii）の溶液を少なくとも１０⁴倍に、工程（iii）の溶液を少なくとも１０⁵倍に、工程（iii）の溶液を少なくとも１０⁶倍に、工程（iii）の溶液を少なくとも１０⁷倍に、工程（iii）の溶液を少なくとも１０⁸倍、又は工程（iii）の溶液を少なくとも１０⁹倍に希釈することが好ましい。

この希釈工程の利点は、富化がＢＴ構造物の解離半減期に基づいて行われるため、希釈度及びインキュベーション時間によって、富化を容易に制御することができる、という点である。工程（iii）の混合溶液を希釈すると、結合体と標的との結合が生じる可能性は低くなるのに対して、「非結合事象」（un-binding event）であるオフ比（解離半減期）は稀釈に依存せずに生じる。その結果、非常に希薄された溶液（Ｔ構造物濃度＜＜Ｋｄ）では、実質的に解離のみが生じることになる。従って、ＢＴ構造物の解離半減期の富化は、希釈度及びインキュベーション時間によって容易に制御することができる。

解離半減期は、親和性と並んで、結合体の有用性にとって最も高い重要性を有する。とりわけ、有効な新医薬品の開発においては、高い親和性及び長い解離半減期を有することが、薬理効果を発揮する上で臨界的なパラメーターとなる（Nature Reviews Drug Discovery (2006) 5, 730-739, (Copeland)）。本発明の新たな方法は、先例がない有効且つ制御可能な手法で、これらの２つのパラメーターの富化を可能とする。さらに、これら２つのパラメーターは、相互に独立に制御することができる。

第１の観点の工程（iv）：
この工程を簡単に言えば、工程（iii）の結合体と標的との結合が、Ｂ構造物とＴ構造物との共コンパートメント化に「転換される」工程である。

この工程（iv）の条件は、工程（iii）の作用に対応する作用を与えるような「結合条件」とするものとする。上記参照。

図１に示す例において、この工程（ｉｖ）は、工程「３．エマルジョンｗ／ｏ」に相当する。

第１の観点の工程（iv）は、更に「前記コンパートメント化系は・・・工程（iii）で存在するＹ個のＴ構造物と比べて、少なくとも２倍の個別コンパートメントを含み」と記載する。

これは、本発明では必須の工程である。即ち、「工程（iii）で存在するＹ個のＴ構造物と比べて、少なくとも２倍の個別コンパートメント」を有することは必須である。

図１におけるインビトロコンパートメント化系は、例えば油中水滴型エマルション系である。以下に更に議論するように、本発明に適した油中水乳剤系は、本技術分野では周知である。

図１に示す理論上の仮想例によれば、工程（ii）では標的は１種しか存在せず（Ｔ_n（ｎ＝１））、そのＴ構造物は３コピー存在する。即ち、「Ｙ」は３となる。

従って、この図１の理論上の例では、インビトロコンパートメント化系には少なくとも（２×３）＝６つの個別コンパートメント（例えば油滴）が存在することになる。なお、図１には３０未満の個別コンパートメントが存在することに留意されたい（即ち、図１は、本明細書に記載の方法の一部の要素を例示するものに過ぎない）。

上に議論したように、実際には、例えば少なくとも１０⁴コピーのＴ構造物が存在してもよい。この場合、Ｙは１０⁴となり、インビトロのコンパートメント化系には、少なくとも（２×１０⁴）＝２×１０⁴の個別コンパートメント（例えば油滴）が存在することになる。

「Ｙ個のＴ構造物と比べて、少なくとも２倍の個別コンパートメント」を有することによる利点は、以下のとおりである。即ち、ディスプレイライブラリー中の非結合物質は、コンパートメント数と標的分子数との比率（この場合１対１０）に応じた頻度で、コンパートメントに無作為に分配され、標的と一緒に共コンパートメント化される。一方、結合物質は、その結合活性ゆえに、コンパートメント数と標的分子数との比率（理想的には１対１）とは無関係に、標的分子と一緒に共コンパートメント化される。従ってこの場合、結合物質は非結合物質に比べて２倍に富化されることになる。

従って、インビトロコンパートメント化系における個別コンパートメントが多いほど、より富化を好適に行うことができる。好ましい態様によれば、「工程（iii）で存在するＹ個のＴ構造物と比べて、少なくとも１０倍の個別コンパートメント」が存在し、より好ましくは「工程（iii）で存在するＹ個のＴ構造物と比べて、少なくとも１００倍の個別コンパートメント」が存在し、より好ましくは「工程（iii）で存在するＹ個のＴ構造物と比べて、少なくとも１００００倍の個別コンパートメント」が存在し、より好ましくは「工程（iii）で存在するＹ個のＴ構造物と比べて、少なくとも１０００００倍の個別コンパートメント」が存在し、より好ましくは「工程（iii）で存在するＹ個のＴ構造物と比べて、少なくとも１００００００倍の個別コンパートメント」が存在する。

本発明の好ましい態様によれば、コンパートメントの数は、工程（iii）のＴ構造物の数Ｙの２倍、５倍、１０倍、５０倍、１００倍、１０００倍、５０００倍、１００００倍、５００００倍、１０００００倍、５０００００倍、１００００００倍、５００００００倍、又は１０００００００倍である。

第１の観点の工程（iv）は、更に、「Ｂ構造物、Ｔ構造物及びＢＴ構造物が個別コンパートメント内に無作為に入る条件下」と記載する。

本文言は、本明細書の文脈において当業者が当然理解するように理解すべきである。この点に関して、本発明において有利な富化を行うには、Ｂ構造物、Ｔ構造物及びＢＴ構造物が個別コンパートメント内に無作為に入る条件を得る必要がある。

言い換えれば、Ｂ構造物、Ｔ構造物及びＢＴ構造物が所与のコンパートメントにコンパートメント化される傾向は、前記コンパートメントの体積及び全体積に依存する。

言い換えれば、Ｂ構造物、Ｔ構造物及びＢＴ構造物が事実上全て、ある特定の単一の個別コンパートメントに入ってしまうと、本明細書で議論するような有利な富化が得られないのは明らかである。

以下に議論するように、例えば適切な油中水エマルション系をインビトロのコンパートメント化系として用いれば、Ｂ構造物、Ｔ構造物及びＢＴ構造物が個別コンパートメント（例えば個々の油滴）内に無作為に入る条件を容易に特定することができるであろう。実際には、Ｂ構造物、Ｔ構造物及びＢＴ構造物が事実上全て、ある特定の単一の個別コンパートメント（例えば個々の油滴）に入ってしまうような条件を特定する方が、遥かに困難であろう。

工程（iv）の好ましい態様によれば、工程（iii）のＢ構造物の個数Ｘに対して、少なくとも１０の平方根（３．１６）倍の個別コンパートメントが存在する。

コンパートメントのＢ構造物の分布がポアソン分布によって記述されると仮定する。これは、すべてのコンパートメントが等容積であることを前提とする。コンパートメントにｎ＝０、１又は２以上のＢ構造物物分子がある可能性は、下記式から計算することができる。

ここでλは、Ｂ構造物の総数Ｘとコンパートメント数との比率である。λが平方根１０（３．１６）である場合、２以上のＢ構造物を有するコンパートメントの比率は５％未満（４．１％）となる。これはすなわち、富化されない陽性結合体の比率が５％未満であることを意味する。これは多くの場合、問題にならない比率である。

上に議論したように当業者であれば理解するように、本発明との関連において、第１の態様の方法は、第１の態様の工程（iv）の個別の／分離されたコンパートメント内の溶液に、Ｂ_結合Ｔ構造物（すなわち標的結合体複合体）が懸濁された状態で維持されることを含意しているということができる。

従って、これを１００％明確にするには、第１の観点の方法、及び、本発明に関連するこの方法の各種態様は、第１の観点の工程（iv）の個別コンパートメント内の溶液内に、Ｂ_結合Ｔ構造物が懸濁された状態で維持される方法である、と言い換えてもよい。

言い換えれば、この方法は、上に議論されるような本発明に関連する先行技術の方法とは異なり、標的の固体支持体への固定化に依存しないのである。

インビトロのコンパートメント化系
上に議論したように、本発明において適切なインビトロコンパートメント化系として、例えば油中水滴型エマルション系が挙げられる。

インビトロのコンパートメント化系が油中水エマルション系である場合、工程（iv）の「インビトロのコンパートメント化系を工程（iii）の溶液に適用し」は、「工程（iii）の溶液を油中水エマルション系に加え」と言い換えてもよい。

本発明における適切な油中水滴型エマルション系は、公知文献に記載されている。例えば、Nat Methods. 2006 Jul;3(7):545-50 (Williams et al), Nat Methods. 2006 Jul;3(7):551-9 (Diehl et al), Proc Natl Acad Sci U S A. 2003 Jul 22;100(15):8817-22 (Dressman et al), J Biotechnol. 2003 Apr 24;102(2):117-24. (Nakano et al), or Biomacromolecules. 6, 1824-1828 (2005) (Musyanovych et al)等が挙げられる。

当業者には明らかなように、コンパートメント化系としてエマルジョンを使用する場合には、同様のサイズ分布に準えて、コンパートメント体積分布はゴールトン（Galton）分布と呼ばれる対数正規分布としてモデル化される。対数正規分布を仮定し、実際の液滴サイズの測定を行なうことによって、特定の実験についての期待値（平均）及び標準偏差を計算することができる。この分布によれば、コンパートメント体積の９５％が平均（ログ）体積からＬ対数単位内の範囲に存在することになる。ここでＬは、ログ体積の標準偏差の１．９６倍である。

本発明の好ましい態様によれば、データを分析する際に、平均コンパートメントサイズ、変動及び標準偏差を考慮する。

本発明の好ましい態様によれば、平均コンパートメントサイズの２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、又は１００倍の体積を有するコンパートメントを、実験から除外する。

本発明の好ましい態様によれば、平均コンパートメントサイズの１／１００、１／９０、１／８０、１／７０、１／６０、１／５０、１／４０、１／３０、１／２０、１／１０、１／９、１／８、１／７、１／６、１／５、１／４、１／３、又は１／２未満の体積を有するコンパートメントを、実験から除外する。

当業者には明らかなように、コンパートメントの体積に基づいて一部のコンパートメントを実験から除外するには、幾つかの技術が使用可能である。例えば、ＦＡＣＳ選別、平衡遠心、濾過、微小流体システム等である。

あるいは、インビトロコンパートメント化系は、アガロース小滴微小流体技術であってもよい（Lab Chip. 2010 Sep 13. [Epub ahead of print] Agarose droplet microfluidics for highly parallel and efficient single molecule emulsion PCR.
Leng X, Zhang W, Wang C, Cui L, Yang CJ）。

或いは、インビトロのコンパートメント化系は、単純に溶液を工程（ｉｉｉ）の「マイクロタイタープレート」内に分散させ、マイクロタイタープレートの個別のウェル（即ち個別コンパートメント）内に無作為に入れたものであってもよい。周知のとおり、この作業は現在では、適切なロボット機器やオープンウェル系を用いることにより、迅速且つかつ効率的に実施することが可能である。マイクロタイタープレートと機能的に同等な、ナノリッターＰＣＲの高密度アレイに基づく斯かる系の例であるナノプレート系によれば、標準的なスライドガラス大の装置で、最大３，０７２のＰＣＲ反応を同時に実施することができる（Methods Mol Biol. 2009;496:161-74. (Brennan et al)）。

別の例として、マイクロメートルサイズの穴を有する大型アレイを配置したシリコンデバイスが挙げられる。このデバイスは、フェムトリッターレベルの少量の溶液を多数、長期間に亘って堅牢に保持することが可能である。斯かるマイクロチップによれば、チャンバが均一且つ正確に配置されている（Nat Biotechnol. 2005 Mar;23(3):361-5 (Rondelez et al)）。

当業者には明らかなように、微小流体装置を、インビトロコンパートメント化系で使用することができる（概説については、例えばAngew Chem Int Ed Engl. 2010 Aug 9;49(34):5846-68 (Theberge et al)参照）。

本発明の好ましい態様によれば、適切な平均コンパートメント体積は、１０^-6リットル未満、１０^-7リットル未満、１０^-8リットル未満、１０^-9リットル未満、１０^-10リットル未満、１０^-11リットル未満、１０^-12リットル未満、１０^-13リットル未満、１０^-14リットル未満、１０^-15リットル未満、１０^-16リットル未満、１０^-17リットル未満、１０^-18リットル未満、１０^-19リットル未満、１０^-20リットル未満、１０^-21リットル未満、又は１０^-22リットル未満である。

当業者には明らかなように、コンパートメント体積は無限小にはなり得ない。コンパートメントは、コンパートメント化される分子よりも大きくなければならないからである。

要するに、当業者であれば、本発明との関連において興味ある膨大な数のインビトロコンパートメント化系を挙げることができるであろう。

第１の観点の工程（ｖ）
第１の観点の工程（ｖ）は、「同じ個別コンパートメント内に存在するＢ構造物とＴ構造物との核酸分子を融合し、即ち、Ｂ構造物の核酸分子をＴ構造物の核酸分子に融合し」と記載する。

この工程を簡単に言えば、工程（iv）で形成されたＢ構造物とＴ構造物との共コンパートメント化が、同族の遺伝子型の融合へと「変形される」（transformed）ということになる。

本発明との関連において、「Ｂ構造物の核酸分子をＴ構造物の核酸分子に融合」させるとは、コンパートメント内の２つの遺伝子型が有する遺伝子情報を連結するとの意味に解するものとする。

当業者には周知のように、これを達成する方法は、以下のように幾つか挙げられる。
ａ）ＰＣＲやオーバーラップ・ゲノム伸長（外部プライマーを用いないオーバーラップＰＣＲ）等による情報移送。ある遺伝子型に由来する鎖がプライマーとして機能し、別の遺伝子型に由来する鎖をテンプレートとして使用する。
ｂ）容易に増幅可能な結合を形成する酵素によって触媒される情報連結。例えば、各ゲノムの少なくとも一方の鎖同士の間に、ＤＮＡ連結酵素等によってホスホジエステル結合を形成する。
ｃ）増幅不能な結合を形成する酵素によって触媒される情報連結。例えば、酵素によって連結され得る部位が各ゲノムに存在する場合に、各遺伝子型の少なくとも一方の鎖同士の２部位間を酵素によって連結する。
ｄ）酵素によって触媒されない情報連結。例えば、各ゲノムに化学反応性基が存在する場合に、各遺伝子型の少なくとも一方の鎖同士の２部位間を化学結合によって連結する。
ｅ）一時的な情報連結。例えば、各ゲノムにアフィニティータグ（同一でも異なっていてもよい）が存在する場合に、両タグに親和性を有する剤を導入することにより、両遺伝子型を含む三量体を形成する。

図１に示す例において、この工程（ｖ）は、左から３番目の個別コンパートメント内に存在するＢ構造物及びＴ構造物の核酸分子を融合させることに相当する。

本発明において非常に重要な利点は、この工程の際に、結合体と標的との結合が全く関連しないという点である。即ち、本工程で核酸分子の融合を行なう条件を決定するに際して、標的と結合体との結合や空間的配置をについて配慮する必要はない。この工程を簡単に言えば、工程（ｉ）由来の結合体と標的との結合が、ここでＢ構造物とＴ構造物との共コンパートメント化に転換されるということである。これは、本明細書に記載の方法の非常に大きな利点であるということができる。

例えば、塩基対重複部位のハイブリダイゼーションによって、Ｂ構造物及びＴ構造物の核酸分子の融合を形成しようとする場合、この工程（ｖ）では、結合体と標的との結合が破壊されないように配慮する必要はなく、所望の塩基対ハイブリダイゼーションが達成されるように、十分に温度を変更することができる。

従って、工程（ｖ）を実施する際の条件は、工程（ｉ）の結合体の何れかと工程（ii）の標的の何れかとが実質的に結合しない条件であってもよい。

既に上で議論したように、Ｂ構造物及びＴ構造物の核酸分子の融合は、塩基対重複部位のハイブリダイゼーション等とは異なる方法で行ってもよい。

例えば、工程（ｖ）でリガーゼ酵素を用いて融合核酸分子を得る場合には、工程（ｉ）のＢ構造物の核酸分子（遺伝子型）と、工程（ii）のＴ構造物の核酸分子（遺伝子型）との間に、塩基対重畳領域を配置する必要はない。

当業者には明らかなように、リガーゼ又はポリメラーゼ酵素を使用する場合、このリガーゼ酵素は、工程（ｖ）において関連する個別コンパートメント内に適切に存在するようにするために、工程（iii）の溶液に対して、或いは任意の希釈工程（iii−ｂ）の際に、加えておくことが好ましい。

当業者には明らかなように、ゲノムの融合には幾つかの異なる酵素反応が使用できる。多数の酵素反応が文献に記載されている。例えば、Kabanov et al., Biochimica et Biophysica Acta, 996 (1989) 147-152, Salon et al. Biochemistry 1992,31, 8072-8079, Anarbaev et al, Biochimica et Biophysica Acta 1384 1998. 315-324, Ong et al., (2006). J. Mol. Biol. 361: 537-50, Ghadessy, F.J. Ong, J.L. and Holliger, P. (2001).. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98: 4552-4557, Protein Engineering, Design & Selection vol. 17 no. 3 pp. 201-204, 2004, Levy et al , RNA (2005), 11:1555-1562, Turner et al., Nucleic Acids Res. 2008 August; 36(13): e82 等が挙げられる。

本発明の好ましい態様によれば、共コンパートメント化された遺伝子型は、酵素によって融合される。

当業者には明らかなように、コンパートメント化前の溶液における遺伝子型の濃度が非常に低い（例えばピコモルからマイクロモルの範囲）にもかかわらず、他の遺伝子型と共コンパートメント化されたコンパートメント内における遺伝子型の濃度は高くなる。例えば、コンパートメントの体積がフェムトリッター（１０^-15リットル）の範囲であれば、遺伝子型の濃度はナノモル（１０^-9Ｍ）の範囲になり、コンパートメントの体積がアトリッター（１０^-18リットル）の範囲であれば、遺伝子型の濃度はマイクロモル（１０^-6Ｍ）の範囲になり、コンパートメントの体積がゼプトリッター（１０^-21リットル）の範囲であれば、遺伝子型の濃度はミリモル（１０^-3Ｍ）の範囲になる。従って、コンパートメント内における遺伝子型の濃度を調節することによって、酵素反応や、更には旧来の化学反応についても、容易化を図ることが可能となる。

当業者には明らかなように、エマルジョン中で誘導可能な化学架橋を使用する場合に、誘導化剤や他の試薬をコンパートメント化前に用いる必要はなく、後で所定のコンパートメントに「送達」してもよい。例えば、誘導物質として、連続相を介して送達される光、温度又は化学的な活性化因子を用いればよい。斯かる態様は、特に小型のコンパートメントを所望する場合には有利であろう。

本発明の好ましい態様によれば、化学架橋は例えば以下のように行なわれる。

求核置換反応は、例えば以下に記載の方法で、実質的に行うことができる。
Z. J. Gartner et al., J. Am. Chem. Soc. 2001, 123, 6961.

本発明の好ましい態様によれば、化学架橋は例えば以下のように行なわれる。

芳香族求核置換反応は、例えば以下に記載の方法で、実質的に行うことができる。
Clark et al, Nature Chemical Biology 5, 647 - 654 (2009)

本発明の好ましい態様によれば、化学架橋は例えば以下のように行なわれる。

共役付加は、例えば以下に記載の方法で、実質的に行うことができる。
Z. J. Gartner et al., J. Am. Chem. Soc., 2001, 123, 6961.

本発明の好ましい態様によれば、化学架橋は例えば以下のように行なわれる。

還元的アミノ化は、例えば以下に記載の方法で、実質的に行うことができる。
Z. J. Gartner et al., Angew. Chem. Int. Ed., 2002, 41, 1796.

本発明の好ましい態様によれば、化学架橋は例えば以下のように行なわれる。

アミンアシル化は、例えば以下に記載の方法で、実質的に行うことができる。
Z. J. Gartner et al., Angew. Chem. Int. Ed., 2002, 41, 1796.

本発明の好ましい態様によれば、化学架橋は例えば以下のように行なわれる。

ホスホロアミド酸形成は、例えば以下に記載の方法で、実質的に行うことができる。
Luther A et al., Nature, 1998, 396:245-248.

本発明の好ましい態様によれば、化学架橋は例えば以下のように行なわれる。

アルドール縮合反応は、例えば以下に記載の方法で、実質的に行うことができる。
Zhuo Tang et al., Angew. Chem. Int. Ed., 2007, 46, 7297-7300

本発明の好ましい態様によれば、化学架橋は例えば以下のように行なわれる。

シクロ付加反応は、例えば以下に記載の方法で、実質的に行うことができる。
Buller et al. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 18 (2008) 5926-5931
Fujimoto K, J Am Chem Soc 2000, 122:5646-5647.
Gartner Z. J. et al. Angew Chem Int Ed Engl 2002, 41:1796-1800.
Gartner Z. J. et al. Angew Chem Int Ed Engl 2003, 42:1370-1375.
Poulin-Kerstien A. T. et al. J Am Chem Soc 2003, 125:15811-15821.

本発明の好ましい態様によれば、化学架橋は例えば以下のように行なわれる。

ジスルフィド架橋は、例えば以下に記載の方法で、実質的に行うことができる。
Mays, J. R. et al., Tetrahedron Lett., 2007, 48, 4579.
Theodoropoulos, D. et al., Journal of Medicinal Chemistry, 1985, vol. 28, 10, p. 1536 - 1539
Lorenz, Katrin B. et al., Journal of Organic Chemistry, 2004, vol. 69, 11, p. 3917-3927

本発明の好ましい態様によれば、化学架橋は例えば以下のように行なわれる。

カップリング試薬：ビス（４−ニトロフェニル）カーボネート

尿素架橋は、例えば以下に記載の方法で、実質的に行うことができる。
欧州特許第１８０９７４３号（Vipergen）

本発明の好ましい態様によれば、化学架橋は例えば以下のように行なわれる。

ウィッティヒ（Wittig）オレフィン化反応は、例えば以下に記載の方法で行うことができる。
Gartner Z. J., et al., Angew Chem Int Ed Engl, 2002, 41:1796-1800

本発明の好ましい態様によれば、化学架橋は例えば以下のように行なわれる。

ウィッティヒ（Wittig）オレフィン化反応は、例えば以下に記載の方法で、実質的に行うことができる。
Gartner Z. J., et al., Angew Chem Int Ed Engl, 2002, 41:1796-1800

本発明の好ましい態様によれば、化学架橋は例えば以下のように行なわれる。

遷移金属触媒反応は、例えば以下に記載の方法で、実質的に行うことができる。
Czlapinski, J. L. et al., J Am Chem Soc 2001, 123: 8618-8619.
Gartner, Z. J. et al., Angew Chem Int Ed Engl 2002, 41: 1796-1800
Calderone, C. T. et al., Angew Chem Int Ed Engl 2005, 44: 1-5
Kanan M. W., et al., Nature, 431, 545-549, 2004

本発明の好ましい態様によれば、化学架橋は例えば以下のように行なわれる。

光架橋は、例えば以下に記載の方法で、実質的に行うことができる。
Quamrul, A. et al., Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters; 18; (2008); 5923-5925
Weber, T. et al., Journal of the American Chemical Society; 117; 11; (1995); 3084 - 3095
Chee, G. et al., Bioorganic and Medicinal Chemistry; 18; 2; (2010); 830 - 838
Nassal, M., Journal of the American Chemical Society; 106; (1984); 7540 - 7545
Pandurangi, R. S. et al., Bioorganic Chemistry; 25; 2; (1997); 77 - 87
Patent; KENT STATE UNIVERSITY; LELAND STANFORD JUNIOR UNIVERSITY; US2010/29952; (2010); (A1)

要するに、当業者であれば、同一の個別コンパートメント内に存在するB構造物及びT構造物の核酸分子を融合する方法を、多数熟知しているであろう。

当業者であれば理解するように、第１の態様の方法の工程（iii）及び（iv）では、Ｂ構造物及びＴ構造物の核酸分子の融合が実質的に形成されないことが好ましい。言いかえれば、工程（ｖ）の前には、ＢＴ_融合 構造物が実質的に形成されないことが好ましい。

工程（vi） of 第１の観点
工程（vi）は「・・・工程（ｖ）の個別コンパートメントの内容物を併合する・・・」と記載する。

ここで明らかなように、「工程（ｖ）の個別コンパートメントの内容物」の「併合」は、工程（iv）で使用されるインビトロコンパートメント化系に応じた適切な方法で行われる。

例えば、工程（iv）で使用したインビトロコンパートメント化系が、マイクロタイタープレート型のフォーマット（上記参照）である場合には、個々のウェルの内容物を単に併合すれば（組み合わせれば）よい。

例えば、工程（iv）で使用したインビトロコンパートメント化系が、適切な油中水エマルションである場合には、遠心分離、昇温、又は適切な有機溶媒の添加等によって、個々の油コンパートメントを単に破壊すればよい。

要するに、本発明において、工程（ｖ）の個別コンパートメントの内容を併合することは、当業者であれば定型的な作業で達成可能である。

工程（vi）は更に「Ｂ構造物の核酸分子とＴ構造物の核酸分子との融合がない条件、即ち、工程（ｖ）で形成されなかった新たなＢＴ_融合 構造物が形成されない条件下で」と記載する。

上に議論したように、本発明において所望されるＢＴ_融合 構造物の富化は、上述の工程で既に得られたということができる。即ち、当業者には明らかなように、この工程は、「新たな」ＢＴ_融合 構造物自体を形成することを意図するものではない。

工程（vi）を斯かる条件下で行なうことは、当業者であれば定型的な作業で実施可能である。例えば、工程（ｖ）で所望のＢＴ_融合 構造物を得るためにリガーゼを使用した場合には、工程（vi）の前に、このリガーゼを（例えば温度を適切に上昇させることにより）不活性化すればよい。

本明細書での議論を考慮すれば、この工程（vi）の結果として、ＢＴ_融合 構造物のライブラリーが得られることは、当業者には明らかであろう。

当業者には明らかなように、このＢＴ_融合 構造物のライブラリーは、結合体及び標的の同定を可能にする核酸配列情報を含むＢＴ_融合 構造物種が富化されたライブラリーであると記載することができる。即ち、標的と結合実体との結合対に由来する工程（ｉ）及び（ii）の配列情報が、標的と結合実体との非結合対に由来するＢＴ_融合 構造物と比べて、富化されたライブラリーである。

任意工程（vii） 〜 即ち、第１の観点の工程（iv）の富化ライブラリーのその後の使用
上に議論したように、工程（vii）は任意の工程である。

本明細書で記載するように、工程（vii）の富化ライブラリーが得られたら、このライブラリーを本技術分野に従って様々な方法で用いることができる。例えば、富化ライブラリーを富化されたインビトロディスプレイライブラリーとして、例えば選択／富化の第２ラウンドに使用することができる。或いは、工程（vi）の富化ライブラリーから、興味ある特定の結合体の構造物を直接同定してもよい。

従って、本発明のある態様は、本明細書に記載の方法において、更なる工程（vii）として、工程（vi）の富化ライブラリーを用いて、少なくとも１つの所定の標的に結合する少なくとも１つの個別の結合体を同定することを含む方法に関する。

融合された遺伝子型の精製
本発明の適切な態様によれば、融合された遺伝子型（即ちＢＴ_融合 構造物s）を精製してもよい。

本技術分野の当業者は、融合した遺伝子型を精製する定型的な手法として、多数の異なる手法を挙げることができる。例としては、限定されるものではないが、アガロースゲル電気泳動法、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法、スパンカラム、酵素処理、ＨＰＬＣによる精製、アフィニティーによる精製、又はキャピラリー電気泳動法等が挙げられる（Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3-Volume Set), 3rd Edition, 2001-01 by Joseph Sambrook, David W. Russell, Publisher: Cold Spring Harbor Laboratory Press）。

本発明の好ましい態様によれば、融合された遺伝子型は、コンパートメント化後に、ゲル精製や不所望の核酸種の酵素分解等によって精製される。本技術分野の当業者であれば、斯かる手順は容易に設計することが可能であろう。例えば、遺伝子型の融合にオーバーラップＰＣＲを使用する場合には、ゲル精製を促進する適切な遺伝子型のサイズを選択することが可能である。例えば、ディスプレイライブラリー遺伝子型の長さが約２５０ｂｐであり、標的遺伝子型の長さが約１００ｂｐであり、重畳領域が約２０塩基である場合には、結果として得られる融合された遺伝子型は約３３０ｂｐとなり、これは標準的なアガロースゲル電気泳動やポリアクリルアミドゲル電気泳動によって、元の融合していない種から、容易に分離・精製することができる。更に、未融合の遺伝子型をテンプレートとして用いたプライマー伸長に由来する未使用のプライマー及びssＤＮＡは、ExoSAP-IT（Amersham Biosciences）等の酵素によって好適に分解することができる。遺伝子型の融合にリガーゼ又は化学的橋架又は一時的連結を使用する場合の別の例として、ゲル精製を促進するように遺伝子型のサイズを選択してもよい。例えば、例えば、ディスプレイライブラリー遺伝子型の長さが約２５０ｂｐであり、標的遺伝子型の長さが約１００ｂｐである場合には、結果として得られる融合された遺伝子型は約３５０ｂｐとなり、これは標準的なアガロースゲル電気泳動やポリアクリルアミドゲル電気泳動によって、元の融合していない種から、容易に分離・精製することができる。

本発明の好ましい態様によれば、融合された遺伝子型はゲル精製される。

要するに、当業者であれば、同一の個別コンパートメント内に存在するＢ構造物及びＴ構造物の融合された核酸分子を精製する方法を、多数熟知しているであろう。

融合された遺伝子型の洗練（polish）
本発明の好ましい態様によれば、（ＤＮＡ増幅と互換性を有さない手法で）融合された遺伝子型を、融合したゲノム内の２つの遺伝子型間に増幅可能な結合を形成するように洗練（polish）してもよい。ここで、増幅可能な結合とは、融合された遺伝子型内の１の遺伝子型の３’末端と別の遺伝子型の５’末端とのホスホジエステル結合（又は類似の結合）である。

当業者であれば、融合された遺伝子型を精製する手法として、多数の異なる手法を定型的な作業で実施することが可能であろう。例えば、限定されるものではないが、酵素的な手法（例えば大腸菌（E. coli）ＤＮＡリガーゼ、Ｔａｑ ＤＮＡリガーゼ、９°Ｎ^{(登録商標)}ＤＮＡリガーゼ、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ１（ｓｓＲＮＡ リガーゼ）、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ２（ｄｓＲＮＡリガーゼ）、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ２、切断型等）や、化学的な手法が挙げられる。

当業者には明らかなように、コンパートメント化後における同族の（cognate）遺伝子型（同一のコンパートメントに由来する遺伝子型）間に正しく形成されたホスホジエステル結合（又は類似の結合）は、偽分子内反応であって、遺伝子型の濃度とは独立であるから、容易に制御することが可能である。これとは逆に、同族ではない（non-cognate）遺伝子型間に誤って形成されたホスホジエステル結合（又は類似の結合）は、分子間反応であって、遺伝子型の濃度に依存する。

本発明の好ましい態様によれば、洗練にはＤＮＡリガーゼを使用する。

要するに、当業者であれば、同一の個別コンパートメント内に存在するB構造物及びT構造物の融合された核酸分子を洗練（polish）する方法を、多数熟知しているであろう。

核酸に連結された標的の除去又は不活性化
本発明の好ましい態様によれば、融合された遺伝子型に連結された標的を除去又は不活性化してもよい。

当業者であれば、融合された遺伝子型に連結された標的を除去又は不活性化する手法として、多数の異なる手法を定型的な作業で実施することが可能であろう。例えば、限定されるものではないが、熱、プロテアーゼ処理、６Ｍの塩化グアニジン、又は、標的が開裂可能なリンカーによって連結されている場合には、リンカーの開裂等が挙げられる。

本発明の好ましい態様によれば、融合された遺伝子型に連結された標的は、熱、プロテアーゼ処理、又は６Ｍの塩化グアニジンによって除去又は不活性化される。

本発明の好ましい態様によれば、融合された遺伝子型に連結された標的は、プロテアーゼＫ処理によって除去される。

本発明の好ましい態様によれば、融合された遺伝子型に連結された標的は、プライマー伸長による置換によって除去される。

要するに、当業者であれば、同一の個別コンパートメント内に存在するB構造物及びT構造物の融合された核酸分子に連結された標的を除去又は破壊する方法を、多数熟知しているであろう。

ＥＣＣの次ラウンド
本発明の好ましい態様において、融合された遺伝子型は、次の一ラウンドのＥＣＣに供されてもよい。すなわち、次のラウンドにおいて、融合された遺伝子型は、新たな標的の遺伝子型と融合されるだろう。新たな標的は、以前の標的と同一の種類であってもよく、異なる種類であってもよい。

当業者であれば認識するように、ステップ(iv)の融合された遺伝子型の富化ライブラリーは、インビトロディスプレイライブラリーである。

本発明の好ましい態様によれば、核酸に連結された以前のラウンドのＥＣＣ標的は、次回のラウンドのＥＣＣの前に除去又は破壊される。

本発明の好ましい態様によれば、次回のラウンドのＥＣＣの標的は、以前のラウンドのＥＣＣの標的と同一である。

本発明の好ましい態様によれば、次回ラウンドのＥＣＣの標的は、以前のラウンドのＥＣＣの標的と同一ではない。

本発明の好ましい態様によれば、次回のラウンドのＥＣＣにおける標的の遺伝子型は、結合体の元の遺伝子型の遊離末端に融合される。

本発明の好ましい態様によれば、次回のラウンドのＥＣＣにおける標的の遺伝子型は、前回のラウンドのＥＣＣ由来の標的の遺伝子型の遊離末端に融合される。

従来の選択/富化法：
本発明の好ましい態様によれば、融合された遺伝子型は、従先行技術における従来の既知の選択／豊富化法のラウンドに供されてもよい。

本発明の好ましい態様によれば、核酸に連結された以前のラウンドのＥＣＣ標的は、従来の選択／豊富化法のラウンドの前に除去又は破壊される。

当業者であれば、従来の選択／豊富化法のラウンドを実施する手法として、多数の異なる手法を挙げることができる。例としては、限定されるものではないが、EP1809743B1 (Vipergen), EP1402024B1 (Nuevolution), EP1423400B1 (David Liu), Nature Chem. Biol. (2009), 5:647-654 (Clark), WO 00/23458 (Harbury), Nature Methods (2006), 3(7), 561-570, 2006 (Miller), Nat. Biotechnol. 2004; 22, 568-574 (Melkko), Nature. (1990); 346(6287), 818-822 (Ellington), or Proc Natl Acad Sci USA (1997). 94 (23): 12297-302 (Roberts)等が挙げられる。

要するに、当業者であれば、同一の個別コンパートメント内に存在するB構造物及びT構造物の融合された核酸分子のライブラリーについて、従来の選択／豊富化法のラウンドを実施する方法を、多数熟知しているであろう。

融合された遺伝子型の増幅：
本発明の好ましい態様によれば、融合された遺伝子型内の核酸を増幅してもよい。即ち、ステップ（vi）の富化ライブラリーの中にあるＢＴ_融合 構造物を増幅してもよい。

当業者であれば、融合された遺伝子型内の核酸を増幅するための手法として、多数の異なる手法を定型的に実施することができる。例としては、限定されるものではないが、PCR (United States Patent 4,683,202; Mullis), Emulsion PCR (Nakano et al., J Biotechnol. 2003;102(2):117-24), Digital PCR (Vogelstein, B; Kinzler KW (1999). "Digital PCR". Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (16): 9236-41), NASBA (Compton J. Nucleic acid sequence-based amplification. Nature. 1991;350(6313):91-2), or Rolling Circle Amplification (American Journal of Pathology. 2001;159:63-69) 等が挙げられる。

本発明の好ましい態様によれば、融合された遺伝子型内の核酸は、コンパートメント解消工程後に増幅される。

本発明の好ましい態様によれば、融合された遺伝子型内の核酸は、ＰＣＲによって行なわれたコンパートメント化工程に続いて増幅される。

本発明の好ましい態様によれば、融合された遺伝子型内の核酸は、順方向ＰＣＲのプライミング部位がＢ構造物遺伝子型内に存在し、逆方向プライミング部位がＴ構造物遺伝子型内に存在するＰＣＲによって行なわれたコンパートメント化工程後に増幅される。

本発明の好ましい態様によれば、融合された遺伝子型内の核酸は、順方向ＰＣＲのプライミング部位がＢ構造物遺伝子型内に存在し、逆方向プライミング部位の一部が第１のＴ構造物遺伝子型内に存在し、逆方向プライミング部位の残部が第２のＴ構造物遺伝子型内に存在するＰＣＲによって行なわれたコンパートメント化工程後に増幅される。

本発明の好ましい態様によれば、融合された遺伝子型内の核酸は、順方向ＰＣＲのプライミング部位が第１のＴ構造物遺伝子型内に存在し、逆方向プライミング部位の一部がＢ構造物遺伝子型内に存在し、逆方向プライミング部位の残部が第２のＴ構造物遺伝子型内に存在するＰＣＲによって行なわれたコンパートメント化工程後に増幅される。

本発明の好ましい態様によれば、融合された遺伝子型内の核酸は、順方向ＰＣＲのプライミング部位の一部が第１のＴ構造物遺伝子型内に存在し、順方向ＰＣＲのプライミング部位の残部がＢ構造物遺伝子型内に存在し、逆方向プライミング部位が第２のＴ構造物遺伝子型内に存在するＰＣＲによって行なわれたコンパートメント化工程後に増幅される。

本発明の好ましい態様によれば、融合された遺伝子型内の核酸は、順方向ＰＣＲのプライミング部位がＢ構造物遺伝子型内に存在し、逆方向プライミング部位の３０〜７０％が第１のＴ構造物遺伝子型内に存在し、逆方向プライミング部位の残る３０〜７０％が第２のＴ構造物遺伝子型内に存在するＰＣＲによって行なわれたコンパートメント化工程後に増幅される。

本発明の好ましい態様によれば、融合された遺伝子型内の核酸は、順方向ＰＣＲのプライミング部位が第１のＴ構造物遺伝子型内に存在し、逆方向プライミング部位の３０〜７０％がＢ構造物遺伝子型内に存在し、逆方向プライミング部位の残る３０〜７０％が第２のＴ構造物遺伝子型内に存在するＰＣＲによって行なわれたコンパートメント化工程後に増幅される。

本発明の好ましい態様によれば、融合された遺伝子型内の核酸は、順方向ＰＣＲのプライミング部位の３０〜７０％が第１のＴ構造物遺伝子型内に存在し、順方向ＰＣＲのプライミング部位の残る３０〜７０％がＢ構造物遺伝子型内に存在し、逆方向プライミング部位が第２のＴ構造物遺伝子型内に存在するＰＣＲによって行なわれたコンパートメント化工程後に増幅される。

要するに、当業者であれば、同一の個別コンパートメント内に存在するB構造物及びT構造物の融合された核酸分子内の核酸を増幅する方法を、多数熟知しているであろう。

翻訳:
本発明の好ましい態様によれば、融合された遺伝子型の核酸を増幅し、翻訳過程に供してもよい。ここで、富化された融合遺伝子型のライブラリーは、新たな富化インビトロディスプレイライブラリーに翻訳される。

当業者であれば、融合された遺伝子型を増幅し、翻訳過程に供する手法として、多数の異なる手法を定型的に実施することができる。例としては、限定されるものではないが、EP1809743B1 (Vipergen), EP1423400B1 (David Liu), WO 00/23458 (Harbury), Nature Methods (2006), 3(7), 561-570, 2006 (Miller), Nature. (1990); 346(6287), 818-822 (Ellington), or Proc Natl Acad Sci USA (1997). 94 (23): 12297-302 (Roberts)等が挙げられる。

要するに、当業者であれば、同一の個別コンパートメント内に存在するB構造物及びT構造物の融合された核酸分子を増幅し、翻訳過程を実施するする方法を、多数熟知しているであろう。

同定及び組成の分析：
本発明の好ましい態様によれば、融合された遺伝子型の核酸を同定及び組成決定するために分析してもよい。

当業者であれば、融合された遺伝子型の核酸の同定及び組成決定のための分析を行うための手法として、多数の異なる手法を定型的に実施することができる。例としては、限定されるものではないが、塩基配列決定（概説として、Metzker, Michael L. (2010). "Sequencing technologies - the next generation". Nat Rev Genet 11 (1): 31-46）、ＤＮＡハイブリダイゼーション技術（Science 270 (5235): 467-470）、制限酵素消化、ＰＣＲ方法、例えばEP1809743B1 (Vipergen), EP1402024B1 (Nuevolution), EP1423400B1 (David Liu), Nature Chem. Biol. (2009), 5:647-654 (Clark), WO 00/23458 (Harbury), Nature Methods (2006), 3(7), 561-570, 2006 (Miller), Nat. Biotechnol. 2004; 22, 568-574 (Melkko), Nature. (1990); 346(6287), 818-822 (Ellington), or Proc Natl Acad Sci USA (1997). 94 (23): 12297-302 (Roberts), WO06053571A2 (Rasmussen) 等の手法が挙げられる。

本発明の好ましい態様によれば、融合された遺伝子型の核酸をＤＮＡ塩基配列決定によって分析することにより、同定及び組成決定を行ってもよい。

本発明の好ましい態様によれば、融合された遺伝子型の核酸を、454 technology（Margulies M, Egholm M, Altman WE, et al (September 2005). "Genome sequencing in microfabricated high-density picolitre reactors". Nature 437 (7057): 376-80）を用いたＤＮＡ塩基配列決定によって分析することにより、同定及び組成決定を行ってもよい。

要するに、当業者であれば、同一の個別コンパートメント内に存在するB構造物及びT構造物の融合された遺伝子型の核酸分子について、同定及び組成決定を行うための分析法を、多数熟知しているであろう。

本発明の異なる独立の側面
本発明の異なる独立の側面について以下に説明する。

当業者であれば理解するように、本発明のこの異なる独立の側面に係る方法は、本発明及びそれに関連する態様の最初の態様について上述したのと同じ基礎的な技術原理を使用する。

従って、当業者であれば理解するように、本発明の最初の側面の特定の好ましい態様（例えば、工程（iv）のインビトロコンパートメント化システムが油中水滴型エマルション系である態様）は、本発明のこの異なる独立した側面の好ましい態様とも対応していてもよい。

従って、本発明の別の独立の観点は、少なくとも１つの標的に結合する少なくとも１つの結合体（binding entity）の同定を可能にする特定の核酸配列情報を含む富化ライブラリーを作製する方法であって、前記特定の結合体はインビトロディスプレイライブラリー内に存在し、前記方法は、
（ｉ）少なくとも１００の異なる結合体Ｂ_n（ここでｎは１００以上の数である）のインビトロディスプレイライブラリーを作製し、ここで各結合体は核酸分子に連結され、前記核酸分子は前記結合体の同定を可能にする特定の核酸配列情報を含み、これにより前記核酸分子の特定の核酸配列情報から、前記核酸分子に連結された前記特定の結合体の構造物が直接同定され（前記核酸分子（遺伝子型）に連結された前記結合体の構造物（即ち表現型）を以下「Ｂ構造物」（B-structure）と呼ぶ）、
（ii）少なくとも１種類の標的Ｔ_n（ここでｎは１以上の数である）が連結された核酸分子を作製し、ここで前記核酸分子は特異的標的の同定を可能にする特定の核酸配列情報を含み、ここで前記標的は工程（ｉ）のライブラリーに存在する結合体の少なくとも１つに結合する能力を有し（前記核酸分子（遺伝子型）に連結された前記標的の構造物（即ち表現型）を以下「Ｔ構造物」（T-structure）と呼ぶ）、
（iiiａ）工程（ｉ）のライブラリーの総数Ｘ（Ｘは１０⁴よりも大きな数である）個のＢ構造物を含む溶液を、工程（ii）の総数Ｙ（Ｙは１０²よりも大きな数である）個のＴ構造物を含む溶液と、結合条件下で混合し、ここで結合条件は、標的分子に結合する能力を有する結合体を含むＢ構造物が、同じ標的に結合する能力を有しない結合体を含むＢ構造物と比べて、対応するＴ構造物により効率的に結合する条件であり、これにより前記結合体の少なくとも１つが少なくとも１つの標的に結合して、Ｔ構造物に結合したＢ構造物を含む複合体が生成され（これを以下「Ｂ_結合Ｔ構造物」（B_BoundToT-structure）と呼ぶ。）、
（iiiｂ）工程（iiiａ）に存在するＹ個のＴ構造物に対して、少なくとも２倍の核酸分子を含む工程（iiiａ）の溶液を混合し、ここで、当該核酸分子は、特異的標的（これを以下「標的ＤＮＡ」（target-DNA）と呼ぶ。）の同定を可能とする特定の核酸配列情報を含有し;
（iv）インビトロのコンパートメント化系を結合条件下で適用し、ここで結合条件は、標的分子に結合する能力を有する結合体を含むＢ構造物が、同じ標的に結合する能力を有しない結合体を含むＢ構造物と比べて、対応するＴ構造物より効率的に結合する条件であり、ここで前記コンパートメント化系は、Ｂ構造物、Ｔ構造物、Ｂ_結合Ｔ構造物及び標的ＤＮＡが個別コンパートメント内に無作為に入る条件下で、工程（iii）で存在するＹ個のＴ構造物と比べて、少なくとも２倍の個別コンパートメントを含み、
（ｖ）同じ個別コンパートメント内に存在するＢ構造物と標的ＤＮＡとの核酸分子を融合し（この構造物を以下「ＢＴ_融合 構造物」（BT_Fused-structure）と呼ぶ。）、前記ＢＴ_融合 構造物は、工程（ｉ）の結合体の同定を可能にする特定の核酸配列情報と、工程（ii）の特異的標的の同定を可能にする特定の核酸配列情報とを含み、
（vi）Ｂ構造物の核酸分子とＴ構造物の核酸分子との融合がない条件、即ち、工程（ｖ）で形成されなかった新たなＢＴ_融合 構造物が形成されない条件下で、工程（ｖ）の個別コンパートメントの内容物を併合することにより、ＢＴ_融合 構造物のライブラリーを取得し、ここで前記ライブラリーは、標的と結合実体（binder entity）との非結合対に由来するＢＴ_融合 構造物に比べて、標的と結合実体との結合対に由来するＢＴ_融合 構造物の種が富化されたライブラリーである、方法に関する。

当業者には周知のように、２つのＤＮＡ分子を融合させることが可能な酵素の適切な例としては、リガーゼ、ポリメラーゼ等が挙げられる。

本発明の第１の側面の議論に従えば、本発明において適切な核酸分子は、ＤＮＡ分子であることが好ましい。また、これに従えば、リガーゼ又はポリメラーゼは、ＤＮＡリガーゼ又はＤＮＡポリメラーゼであることが好ましい。

本発明の文脈において、当業者であれば理解するように、本発明のこの個別の独立した側面における工程（ｖ）のＢ構造物及び標的ＤＮＡの核酸分子の融合は、本発明のこの個別の独立した側面における工程（ii）のＴ構造物に存在するように、２つのＤＮＡ分子を融合させることができる酵素（例えばリガーゼまたはポリメラーゼ）によって行われる。

本明細書で議論した第１の側面の方法（２以上の標的Ｔが存在していてもよい）とは異なり、本発明のこの個別の独立した側面では、１つの標的Ｔのみが存在する。

従って、本発明のこの個別の独立した側面の工程（iiiｂ）において、核酸分子の特定の標的の同定を可能にする特定の核酸配列情報は、単に本発明と関連する特性決定のための単一の配列であってもよい。

本発明の第１の側面の議論に従えば、特定の標的の同定を可能にする、この特定の核酸配列情報は、ＰＣＲ増幅可能な配列であることが好ましい。工程（ｖ）のＢＴ_融合 構造物をその後にＰＣＲすることができるからである。

実施例１：
ジーンタイプ（genetype）−遺伝子型融合−スパイキング実験のためのオーバーラップｅＰＣＲを用いた共コンパートメント化による富化
概要については図２を参照。

方法
使用したＤＮＡオリゴヌクレオチド
ヨクトリアクター（yoctoreactor）に対するＤＮＡアナログの連続鎖
[Hansen et al. J. Am. Chem. Soc., 2009, 131 (3), pp 1322-1327]:
CGCTAAtggtccctggcagtctccTTAGCGgaccGACTCcTgctcGAAGACAACGGTgttttacACCGTTGTCTTCgagcTgtACCTGCgcAAGTGCgttttacGCACTTgcGCAGGTacTgtGCATCgacAAGACCgttttacGGTCTTgtcGATGCacTgGAGTCggtcCTGTTCGATCTTGGGCGTAT
vip1461: ATACGCCCAAGATCGAACAG
vip2501: x-TGGTCCCTGGCAGTCTCC (x=5'-biotin-TEG)
vip2504: CTGTTCGATCTTGGGCGTATGAGAAGAGCCAGAAACGTGGCTTCAGGCACCAAGGAAGAC
vip2512: GCCTTGCCAGCCCGCTCAGGCAAGTCTTACAGCCGATCAGTCTTCCTTGGTGCCTGAAG
vip2502: CTGTTCGATCTTGGGCGTAT
vip2500: x-GCCTTGCCAGCCCGCTCAG (x= 5' carboxyl)
vip157: GCCTTGCCAGCCCGCTCAG
vip660: TGGTCCCTGGCAGTCT
vip1481: GAACAGGACCGA
vip1471: CTGTTCGATCTTGGGCGTAT

ヨクトリアクター（yoctoreactor）ライブラリーの調製
ライブラリーの構築は、Hansen et al. J. Am. Chem. Soc., 2009, 131 (3), pp 1322-1327に従い、更に以下の変更を加えて行う。スプリントオリゴヌクレオチドvip1481及びオリゴヌクレオチドvip1471を用いて逆方向プライミング部位を導入する。

コード化ＤＮＡに連結された既知の標的結合物質（ビオチン）の調製
ヨクトリアクターライブラリー配列に対する連続鎖ＤＮＡアナログを、ｖｉｐ１４６１プライマー及び５’−ビオチンを有するｖｉｐ２５０１プライマーを用いたＰＣＲに供する。それにより５’−ビオチンがヨクトリアクターＤＮＡアナログに導入される。

プロトコール
ＰＣＲ混合物：
５０μＬ ２Ｘ ＰＣＲ mastermix（４０ｍＭ Tris-HCl、２０ｍＭ （ＮＨ₄）₂ＳＯ₄、２０ｍＭ ＫＣｌ、１６ｍＭ ＭｇＳＯ₄、０．２％ Triton X-100、０．２ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ、０．４ｍＭ 各ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＣＴＰ、ｐＨ８．８ ＠ ２５℃）
１０μＬ ５Ｍ ベタイン（終濃度０．５Ｍ）
１μＬ ５０μＭ vip2501（終濃度０．５μＭ）
１μＬ ５０μＭ vip1461（終濃度０．５μＭ）
１μＬ（１０⁷分子s）のヨクトリアクター（yoctoreactor）に対する連続鎖ＤＮＡアナログ
１μＬ（２ｕ／μＬ） Vent（exo-）ポリメラーゼ
３６μＬ 水

混合物に対して、ＰＣＲ機器で以下のプログラムを適用することにより、熱サイクリングを実施する。
９２℃で２分、２５サイクル（９２℃で３０秒、７２℃で１分）、７２℃で２分）、７２℃で２分

１８５ｂｐのＤＮＡ断片を、標準的な手順（Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3-Volume Set), 3rd Edition, 2001-01 by Joseph Sambrook, David W. Russell, Publisher: Cold Spring Harbor Laboratory Press）に従ってＰＡＧＥ精製し、エタノール沈殿する。

標的ＤＮＡ（ＴＤ）の調製
９９量体の標的ＤＮＡを、単工程オーバーラップＰＣＲプロトコールで調製した後、１０％ＴＢＥ−ＰＡＧＥネーティブゲルで精製する。

プロトコール
ＰＣＲ混合物:
５０μＬ ２Ｘ ＰＣＲ mastermix （４０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、２０ｍＭ（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄、２０ｍＭ ＫＣｌ、１６ｍＭ ＭｇＳＯ₄、０．２％ Triton X-100、０．２ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ、０．４ｍＭ 各ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＣＴＰ、ｐＨ８．８ ＠ ２５℃）
１０μＬ 5M ベタイン（終濃度０．５Ｍ）
１μＬ ５０μＭ vip2500（終濃度０．５μＭ）
１μＬ ５０μＭ vip2502（終濃度０．５μＭ）
１μＬ ２０ｐＭ vip2504（終濃度０．２ｐＭ）
１μＬ ２０ｐＭ vip2512（終濃度０．２ｐＭ）
１μＬ （2ｕ／μＬ）Vent（exo-）ポリメラーゼ
３５μＬ 水

混合物に対して、PCR機器で以下のプログラムを適用することにより、熱サイクリングを実施した。
９２℃で２分、２５サイクル（９２℃で３０秒、７２℃で１分）、７２℃で２分

９９ｂｐのＤNA断片を、標準的な手順(Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3-Volume Set), 3rd Edition, 2001-01 by Joseph Sambrook, David W. Russell, Publisher: Cold Spring Harbor Laboratory Press)に従ってPAGE精製し、エタノール沈殿した。

ＤＮＡ−標的コンジュゲーション
材料
塩酸１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド（ＥＤＣ、１００ｍＭの新規調製ストック、Aldrich E6383）
Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミド（ｓ−ＮＨＳ、２００ｍＭストック、Aldrich 56485）
モルホリノエタンスルホン酸、ＭＥＳ緩衝剤 ｐＨ６．０、５００ｍＭ
β−メルカプトエタノール、５００ｍＭ ストック
低鎖に５’カルボキシル基を有するＰＣＲ産物（上述）
ストレプトアビジンタンパク質（AbCam 78833）（標的タンパク質）

プロトコール
末端カルボキシルを有するカルボキシル修飾オリゴヌクレオチド（１本鎖ＤＮＡ）又はＰＣＲ産物は、標的タンパク質との反応に先立って、ＥＤＣ／ｓ−ＮＨＳ系を使用して、予め活性化することができる（種々のカルボキシル活性化の例については文献を参照）。標的タンパク質をＥＤＣに暴露すると、例えばチロシン又はシステイン残査の化学修飾によって、標的タンパク質が不活性化されてしまう場合がある。従って、ＤＮＡカルボキシルと標的タンパク質との混合前に、任意により、例えばβ−メルカプトエタノールを終濃度２０ｍＭとなるように加える等の手法で、残留ＥＤＣをクエンチしてもよい。

例：予活性化混合物
終濃度
１０μＬ ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ又はｄｓＤＮＡ）
１０μＬ ５００ｍＭ ＭＥＳ、ｐＨ６ １００ｍＭ
２．５μＬ １００ｍＭ ＥＤＣ ５ｍＭ
２．５μＬ ２００ｍＭ ｓ−ＮＨＳ １０ｍＭ
２５μＬ 水
計 ５０μＬ

カルボン酸活性化は、２０℃で１５〜３０分間インキュベートすればよい。

任意：残留EDCをクエンチするために、５００ｍＭβ−メルカプトエタノール水溶液２μＬを加えた（終濃度２０ｍＭ）。

その後、ｓ−ＮＨＳ−活性化エステルは直ちに使用する。

予活性化試験
前活性化混合物（２５ｐモルの１本鎖ＤＮＡ）のアリコートを、水と、ＭｅＣＮ（活性化エステルをクエンチする第一級アミン）中１％フェネチルアミンとで希釈する。この混合物を１５分間反応させた後、ＥｔＯＨを用いて沈殿させる。１００ｍＭ酢酸トリエチルアンモニウム（ＴＥＡＡ、ｐＨ７）に溶解させた後、ＤＮＡ産物をＲＰ−ＨＰＬＣにより、１００ｍＭ ＴＥＡＡ中ＭｅＣＮの勾配を用いて分析することができる。

当初の保持時間からより高い保持時間への変更は、１）カルボキシルからＮＨＳエステルへの転換、及び、２）その後のアミンとの反応を示している。

標的タンパク質との反応
酵素製品緩衝組成物に第一級アミンが含まれるか確認すること。
このプロトコールでは、タンパク質ストック液中にＤＴＴやＥＤＴＡ等が存在することは許容されるが、第一級アミンは透析によって除去しなければならない。
第一級アミンは、活性化エステルをクエンチし、ＤＮＡ−タンパク質架橋を阻害してしまう。

或いは、予活性化混合物と混合する酵素として、可能な限り富化された酵素を用い、化学反応を促進すること。

２０℃で１〜２ｈ（反応が遅い場合はできるだけ一晩）インキュベートした後、電気泳動でＤＮＡタンパク質複合体を精製する。

連結混合物
１０⁶の異なる分子及び計１０⁹の分子（即ち、二本鎖（ｄｓ）ＤＮＡに連結される潜在的なリガンド）からなる多様なヨクトリアクター（yoctoreactor）ライブラリーを、１０⁶のｄｓＤＮＡに連結されたビオチン分子（既知の標的結合物質）でスパイクした。スパイクされたライブラリーを、１０⁷分子のｄｓＤＮＡに連結されたストレプトアビジン（ＤＮＡに連結された標的）と混合する。混合物中の分子を、総体積３μｌの結合バッファー（ＰＢＳ、０．０５％ｔｗｅｅｎ２０、０．２％のＢＳＡ）と、室温で１時間接触させ、平衡に達するまで放置する。ストレプトアビジン（標的）の濃度は約６ｐＭであり、ビオチン・ストレプトアビジン複合体について報告されているＫｄである^~１０〜１４ｍｏｌ／Ｌの１００倍以上である。これは、事実上全てのビオチンが平衡状態でストレプトアビジンに結合されることを意味する。

ＰＣＲ混合物
６７ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）、１６．６ｍＭ ＮＨ₄ＳＯ₄、６．７ｍＭ ＭｇＣｌ₂、１０ｍＭ ２−メルカプトエタノール、１ｍＭの各ｄＮＴＰ、７．５μＭの各プライマー（vip157及びvip660）、４５ユニットのＴａｑポリメラーゼ、総体積６１０μＬ。

エマルションＰＣＲ
１ｍｌ当たりの約５×１０⁹コンパートメントからなるエマルジョン２ｍＬを、Dressman et al., 2003 に記載の方法と同様の方法で調製する。標的（ストレプトアビジン）又はリガンド（非結合又は結合）に連結されたＤＮＡ断片にはそれぞれオーバーラップ領域が存在し、これによって３つの断片が連結されて集合断片を形成し得る。すなわち、アセンブリーＰＣＲによって、一混合物当たり２種類の結合断片が生成され得る。断片（Ａ）は、ストレプトアビジンとビオチンとが同一のコンパートメント内に存在していたことを示す。断片（Ｂ）は、ストレプトアビジンと無作為のライブラリー分子（結合したビオチンではない）とが同一のコンパートメント内に存在していたことを示す。これら２種類の断片は、塩基配列決定法、又は、制限部位消化によって区別することができる。

１ｍＬ及び５００μＬ（１．５ｍＬ）の連続相を、以下の手順で調製する。即ち、５ｍｌの丸底Ｃｒｙｏバイアル内で、ピボット輪を有する磁気撹拌子を用いて一定速度で撹拌（１，４００ｒｐｍ）しながら、鉱油に０．４０％（体積／体積）のＴｗｅｅｎ８０を溶解させ、次いで０．０５％（体積／体積）のトリトンＸ−１００及び４．５％（体積／体積）のＳｐａｎ８０を溶解させる。この連続相を、２つの５ｍｌの丸底Ｃｒｙｏバイアルに６００μＬずつ分割する。

５９７μｌのＰＣＲ混合物を３μＬの連結混合物に加えて水相を調製する。２つの連続相の各々を、ピボット輪を有する磁気撹拌子を用いて一定速度で撹拌（１４００ｒｐｍ）しながら、３００μＬの水相を徐々に加える（１５ｓ当たり１０μＬずつ）。水相添加後、撹拌を３０分間継続する。

エマルジョンを各々１００μＬずつ、９６ウェルのＰＣＲプレートの約２０のウェルへ等分する。増幅プログラムは、次の工程を有する３０サイクルから構成する。９２℃で２分間の初期変性；９２℃で３０秒のｄｓＤＮＡ変性、７２℃で２分間のプライマーアニーリング、及び７２℃で３０秒の伸長からなる２０サイクル；並びに７２℃で２分間の最終伸長。

エマルションの破壊
エマルジョンＰＣＲ由来のＤＮＡ断片は、エマルジョンをプールし２５℃で５分間、１３，０００ｇで遠心分離することにより回収される。油相を廃棄する。以下の抽出を２回繰り返し、エマルジョンから残留鉱油及び界面活性剤を除去する。１ｍｌの水飽和ジエチルエーテルを加え、チューブを攪拌し、上部（溶剤）相を廃棄。

予測される結果
仮定：等サイズの球状コンパートメント、コンパートメント内の分子及び複合体のランダムな分布、ストレプトアビジン・ビオチン複合体の１００％の会合、ストレプトアビジン・ビオチン複合体の解離なし、ｙＲライブラリーのストレプトアビジンに対して十分な結合親和力を有する結合物質は殆ど、又は全く存在しないと仮定、ＰＣＲ反応のバイアスなし、並びに、ＰＣＲサイクリングにおける「プライマー伸張」時の反応効率１００％（単一のプライミング部位が存在、共コンパートメント化なし）、両プライミング部位存在時に１００００倍増幅（共コンパートメント化）。

エマルションＰＣＲ後の異なるＤＮＡ種の理論量は以下の通り：
ストレプトアビジン断片（１００ｂｐ）：１０⁷分子
ストレプトアビジン断片（１００ｎｔ）：２０サイクル時間１０⁷分子＝２×１０⁸分子
ヨクトリアクター（yoctoreactor）断片（２５０ｂｐ）：１０⁹分子ｓ
ヨクトリアクター（yoctoreactor）断片（２５０ｎｔ）：２０サイクル時間１０⁹分子＝２×１０¹⁰分子
（何れも元のビオチン断片が融合種に転換されると仮定、以下参照）

融合遺伝子型−既知結合物質：断片Ａ（ストレプトアビジン−ビオチンＤＮＡ断片）（３３０ｂｐ）：１００００×１０⁶分子＝１０¹⁰（ビオチン断片のＰＣＲ増幅回数）−上記仮定の下でビオチン断片が標的ＤＮＡと共コンパートメント化される可能性は１。

融合遺伝子型−非結合物質：断片Ｂ（無作為共コンパートメント化断片）（３３０ｂｐ）：１００００×１０^-3×１０⁹分子＝１０¹⁰（ＰＣＲ増幅回数掛ける無作為共コンパートメント化確率掛ける当初のｙＲライブラリー分子数）−上記仮定の下で非結合物質が共コンパートメント化される確率は＃標的分子／＃コンパートメント＝１０⁷／１０¹⁰＝１０^-3

従って、本手順後、３３０個のｂｐ断片の５０％が、ビオチン由来のＤＮＡを含む。更に、３３０ｂｐの断片は約１５ナノグラムとなり、総二本鎖ＤＮＡ量の殆どを占める。一本鎖ＤＮＡは、ＥｘｏＳＡＰＩＴ（アマシャム・バイオサイエンス）を用いて、メーカーの指示に従って好適に除去される。また、３３０個のｂｐ断片は、標準的な手順に従って、ＰＡＧＥで好適に精製される。

４５４シークエンシング技術を用いたＤＮＡ配列決定による富化の分析
プライマーを末端Ａ及びＢ配列と用いたＰＣＲによって、４５４シークエンシングプライミング部位を導入する。結果として得られる断片をＰＡＧＥで精製し、メーカーのプロトコールに従って４５４ＤＮＡシークエンシングに供する。

ＤＮＡ塩基配列を分析し、ビオチン遺伝子型の頻度を計算する。

結論s
上記から理解されるように、本明細書に記載の方法を用いることで、１０００倍の富化が達成される。上記の計算によれば、ビオチン遺伝子型は高頻度で、即ち最大２分の１の確率で見出されると予測される。一方、非結合ヨクトリアクターライブラリーの各メンバーは、最大でも平均２００万分の１程度であると予測される。従って、非結合物質に対して、結合物質は１０００倍に富化されたことになる。これは、本発明の実現可能性を実証するだろう。

実施例２：
遺伝子型−遺伝子型融合にeLigationを用いた共コンパートメント化による富化 − スパイク化実験。
概要については図１参照。

方法
使用するＤＮＡオリゴヌクレオチド vip1481：GAACAGGACCGA
vip1471：CTGTTCGATCTTGGGCGTAT
vip2513：ACGCCCAAGATCGAACAG
ヨクトリアクター（yoctoreactor）に対するビオチン修飾連続一本鎖ＤＮＡアナログ：
x-CGCTAAtggtccctggcagtctccTTAGCGgaccGACTCcTgctcGAAGACAACGGTgttttacACCGTTGTCTTCgagcTgtACCTGCgcAAGTGCgttttacGCACTTgcGCAGGTacTgtGCATCgacAAGACCgttttacGGTCTTgtcGATGCacTgGAGTCggtcCTGTTCGATCTTGGGCGTAT（ｘ＝５’−ビオチン−ＴＥＧ）

ヨクトリアクター（yoctoreactor）に対するビオチン修飾連続一本鎖ＤＮＡアナログは、Hansen et al. J. Am. Chem. Soc., 2009, 131 (3), pp 1322-1327に実質的に記載の、５’−ビオチンＴＥＧ修飾オリゴヌクレオチドを５’部位に有する小型のオリゴヌクレオチドから調製される。
vip2514：x-GCCTTGCCAGCCCGCTCAGGGGAAGGACGTTGGTGTAGAAGCGTTCACTTGGTGGAAGTAT（ｘ＝５’カルボキシル）
vip2515：ACTTCCACCAAGTGAACGCT
vip157：GCCTTGCCAGCCCGCTCAG
vip660：TGGTCCCTGGCAGTCT

ヨクトリアクター（yoctoreactor）ライブラリーの調製
本ライブラリーは、Hansen et al. J. Am. Chem. Soc., 2009, 131 (3), pp 1322-1327 の記載に従い、更に以下の変更を加えて構築する。
１）スプリントオリゴヌクレオチドvip1481及びオリゴヌクレオチドvip1471を用いて逆方向プライミング部位を導入する。
２）オリゴヌクレオチドvip2513を用いてプライマー伸長によるヨクトリアクター（yoctoreactor）の破壊を行う。

コード化ＤＮＡに連結された既知の標的結合物質（ビオチン）の調製
二本鎖コード化ＤＮＡに連結された既知の標的結合物質（ビオチン）は、ヨクトリアクター（yoctoreactor）によるビオチン修飾連続一本鎖ＤＮＡアナログを、vip2513を用いたプライマー伸長で破壊することにより作製する（Hansen et al. J. Am. Chem. Soc., 2009, 131 (3), pp 1322-1327）。２ｎｔの３’−オーバーハングが作製されるようにプライマーを選択する。３’−オーバーハングによって以下の連結反応が促進されるであろう。

二本鎖ＤＮＡ断片を、標準的な手順（Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3-Volume Set), 3rd Edition, 2001-01 by Joseph Sambrook, David W. Russell, Publisher: Cold Spring Harbor Laboratory Press）に従ってＰＡＧＥ精製し、エタノール沈殿した。

標的ＤＮＡ（ＴＤ）の調製
プロトコール
６１量体のターゲットＤＮＡを、プライマー伸張で調製し、続いて１０％のＴＢＥ−ＰＡＧＥネーティブゲルで精製する。ヨクトリアクター３’−オーバーハングの３’−オーバーハングに相補的な２つのヌクレオチド３’−オーバーハングが作製されるようにプライマーを選択する。更に、プライマーのリン酸化により連結反応が可能になる。

実施例:
プライマーのリン酸化
２μＬ（２００pmol） vip2515
２０μＬ １０×緩衝剤 O（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５、３７℃）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ₂、
１００ｍＭ ＮａＣｌ、０．１ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ）
２μＬ １００ｍＭ ＡＴＰ（終濃度２ｍＭ）
１０μＬ Ｔ４ ポリヌクレオチド キナーゼ（１００ｕ）
６６μＬ 水、ヌクレアーゼ不含

リン酸化反応は３７℃で３０分間実施し、キナーゼの不活性化は７５℃で１０分間のインキュベーションにより行う。

ＤＮＡをエタノール沈澱で沈殿させ、７０％エタノールで洗浄し、１０μＬＴＥバッファーに再懸濁させる。

プライマー伸長:
１０μＬ リン酸化vip2515（２００ｐモル）
１０μＬ １０×緩衝剤 O（New England Biolabs）
２μＬ １０ｍＭ ｄＮＴＰミックス（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＴＴＰの終濃度０．２ｍＭ）
７７μＬ 水
１μＬ（５ｕ） Klenow（exo-、5ｕ／μＬ）

反応を15分間進行させ、標準的な手順（Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3-Volume Set), 3rd Edition, 2001-01 by Joseph Sambrook, David W. Russell, Publisher: Cold Spring Harbor Laboratory Press）に従って、15％アクリルアミドゲルから抽出することにより、精製された二本鎖ＤＮＡを取得し、これをエタノールで沈殿させる。

ＤＮＡ−標的コンジュゲーション
材料
塩酸１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド（ＥＤＣ、１００ｍＭ 新規調製ストック、Aldrich E6383）
Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミド（ｓ−ＮＨＳ、２００ｍＭ ストック、Aldrich 56485）
モルホリノエタンスルホン酸、ＭＥＳ緩衝剤 ｐＨ６．０、５００ｍＭ
β−メルカプトエタノール、５００ｍＭ ストック
低鎖に５’カルボキシル基を有するＰＣＲ産物（上述）
ストレプトアビジンタンパク質（AbCam 78833）（標的タンパク質）

プロトコール
末端カルボキシルを有するカルボキシル修飾オリゴヌクレオチド（１本鎖ＤＮＡ）又はＰＣＲ産物は、標的タンパク質との反応に先立って、ＥＤＣ／ｓ−ＮＨＳ系を使用して、予め活性化することができる（種々のカルボキシル活性化の例については文献を参照）。標的タンパク質をＥＤＣに暴露すると、例えばチロシン又はシステイン残査の化学修飾によって、標的タンパク質が不活性化されてしまう場合がある。従って、ＤＮＡカルボキシルと標的タンパク質との混合前に、任意により、例えばβ−メルカプトエタノールを終濃度２０ｍＭとなるように加える等の手法で、残留ＥＤＣをクエンチしてもよい。

実施例 予活性化混合物
終濃度
１０μＬ ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ又はｄｓＤＮＡ）
１０μＬ ５００ｍＭ ＭＥＳ、ｐＨ６ １００ｍＭ
２．５μＬ １００ｍＭ ＥＤＣ ５ｍＭ
２．５μＬ ２００ｍＭ ｓ−ＮＨＳ１０ｍＭ
２５μＬ 水
計 ５０μＬ

カルボン酸活性化は、２０℃で１５〜３０分間インキュベートすればよい。
任意：残留ＥＤＣをクエンチするために、５００ｍＭ β−メルカプトエタノール水溶液２μＬを加えた（終濃度２０ｍＭ）。

Subsequently、the ｓ−ＮＨＳ-activated エステル should be used immediately. その後、ｓ−ＮＨＳ−活性化エステルは直ちに使用する。

予活性化試験
前活性化混合物（２５ｐモルの１本鎖ＤＮＡ）のアリコートを、水と、ＭｅＣＮ（活性化エステルをクエンチする第一級アミン）中１％フェネチルアミンとで希釈する。この混合物を１５分間反応させた後、ＥｔＯＨを用いて沈殿させる。１００ｍＭ酢酸トリエチルアンモニウム（ＴＥＡＡ、ｐＨ７）に溶解させた後、ＤＮＡ産物をＲＰ−ＨＰＬＣにより、１００ｍＭ ＴＥＡＡ中ＭｅＣＮの勾配を用いて分析することができる。

当初の保持時間からより高い保持時間への変更は、１）カルボキシルからＮＨＳエステルへの転換、及び、２）その後のアミンとの反応を示している。

標的タンパク質との反応
酵素製品緩衝組成物に第一級アミンが含まれるか確認すること。このプロトコールでは、タンパク質ストック液中にＤＴＴやＥＤＴＡ等が存在することは許容されるが、第一級アミンは透析等によって除去しなければならない。第一級アミンは、活性化エステルをクエンチし、ＤＮＡ−タンパク質架橋を阻害してしまう。

或いは、予活性化混合物と混合する酵素として、可能な限り富化された酵素を用い、化学反応を促進すること。

２０℃で１〜２ｈ（反応が遅い場合はできるだけ一晩）インキュベートした後、電気泳動等でＤＮＡ−タンパク質複合体を精製する。

連結混合物
１０⁶の異なる分子及び計１０⁹の分子（即ち、二本鎖（ｄｓ）ＤＮＡに連結される潜在的なリガンド）からなる多様なヨクトリアクター（yoctoreactor）ライブラリーを、１０⁶のｄｓＤＮＡに連結されたビオチン分子（既知の標的結合物質）でスパイクした。スパイクされたライブラリーを、１０⁷分子のｄｓＤＮＡに連結されたストレプトアビジン（ＤＮＡに連結された標的）と混合する。混合物中の分子を、総体積３μｌの結合バッファー（ＰＢＳ、０．０５％ｔｗｅｅｎ２０、０．２％のＢＳＡ）と、室温で１時間接触させ、平衡に達するまで放置する。ストレプトアビジン（標的）の濃度は約６ｐＭであり、ビオチン・ストレプトアビジン複合体について報告されているＫｄである〜１０〜１４ｍｏｌ／Ｌの１００倍以上である。これは、事実上全てのビオチンが平衡状態でストレプトアビジンに結合されることを意味する。

ライゲーション混合物
１×Tagライゲーションバッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、２５ｍＭ 酢酸カリウム、１０ｍＭ 酢酸マグネシウム、１ｍＭ ＮＡＤ、１０ｍＭ ジチオスレイトール ０．１％ Triton X-100 ｐＨ７．６ ＠２５℃）を、２μＬ（４０ｕ／μＬ）Taq ＤＮＡリガーゼに加え、総体積を６１０μＬとする。

６７ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）、１６．６ｍＭ ＮＨ₄ＳＯ₄、６．７ｍＭ ＭｇＣｌ₂、１０ｍＭ ２−メルカプトエタノール、各ｄＮＴＰ１ｍＭ、７．５μＭの各プライマー（vip157及びvip660）、４５ユニットのTaqポリメラーゼを、総体積６１０μＬに含む。

エマルション内でのライゲーション
１ｍｌ当たりの約５×１０⁹コンパートメントからなるエマルジョン２ｍＬを、Dressman et al., 2003 に記載の方法と同様の方法で調製する。

標的（ストレプトアビジン）又はリガンド（非結合又は結合）にそれぞれ連結されたＤＮＡ断片は、一方の鎖においてライゲートすることができる。すなわち、ライゲーションによって、一混合物当たり２種類の結合断片が生成され得る。断片（Ａ）は、ストレプトアビジンとビオチンとが同一のコンパートメント内に存在していたことを示す。断片（Ｂ）は、ストレプトアビジンと無作為のライブラリー分子（結合したビオチンではない）とが同一のコンパートメント内に存在していたことを示す。これら２種類の断片は、塩基配列決定法又は制限部位消化によって区別することができる。

１ｍＬ及び５００μＬ（１．５ｍＬ）の連続相を、以下の手順で調製する。即ち、５ｍｌの丸底Ｃｒｙｏバイアル内で、ピボット輪を有する磁気撹拌子を用いて一定速度で撹拌（１，４００ｒｐｍ）しながら、鉱油に０．４０％（体積／体積）のＴｗｅｅｎ８０を溶解させ、次いで０．０５％（体積／体積）のトリトンＸ−１００及び４．５％（体積／体積）のＳｐａｎ８０を溶解させる。この連続相を、２つの５ｍｌの丸底Ｃｒｙｏバイアルに６００μＬずつ分割し、氷冷して維持する。

５９７μｌのＰＣＲ混合物を３μＬの氷冷ライゲーション混合物に加えて水相を調製する。２つの連続相の各々を、ピボット輪を有する磁気撹拌子を用いて一定速度で撹拌（１４００ｒｐｍ）しながら、３００μＬの水相を徐々に加える（１５ｓ当たり１０μＬずつ）。水相添加後、撹拌を３０分間継続する。

エマルションを４５℃に加熱し、１時間ライゲートさせる。

エマルションの破壊
ライゲーション混合物に各々３０μＬの５００ｍＭ ＥＤＴＡを加え、軽く攪拌する。ＤＮＡ断片は、エマルジョンをプールし２５℃で５分間、１３，０００ｇで遠心分離することにより回収される。油相を廃棄する。以下の抽出を２回繰り返し、エマルジョンから残留鉱油及び界面活性剤を除去する。１ｍｌの水飽和ジエチルエーテルを加え、チューブを攪拌し、上部（溶剤）相を廃棄。

ＤＮＡを沈殿によって富化し、変性10％ポリアクリルアミドゲルでサイズ分画し、ライゲートされた断片を、標準的な手順（Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3-Volume Set), 3rd Edition, 2001-01 by Joseph Sambrook, David W. Russell, Publisher: Cold Spring Harbor Laboratory Press）に従って、ＰＡＧＥで単離・精製し、エタノール沈殿し、１０μＬ ＴＥ緩衝剤に再溶解させる。

ライゲートされたＤＮＡの増幅
最後に、ライゲートされた断片をＰＣＲで増幅する。

例：
ＰＣＲ混合物：
１０μＬ 精製ライゲートＤＮＡ
５０μＬ ２× ＰＣＲ mastermix（４０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、２０ｍＭ（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄、２０ｍＭ ＫＣｌ、１６ｍＭ ＭｇＳＯ₄、０．２％ Triton X-100、０．２ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＣＴＰ各０．４ｍＭ、ｐＨ８．８ ＠ ２５℃）
１０μＬ ５Ｍ ベタイン（終濃度０．５Ｍ）
１μＬ ５０μＭ vip167（終濃度０．５μＭ）
１μＬ ５０μＭ vip660（終濃度０．５μＭ）
１μＬ（２ｕ／μＬ） Vent（exo-）ポリメラーゼ
２７μＬ 水

混合物に対して、PCR機器で以下のプログラムを適用することにより、熱サイクリングを実施した。
９２℃で２分、２５サイクル（９２℃で３０秒、７２℃で１分）、７２℃で２分

結果として得られたＤＮＡ断片のライブラリーを配列決定し、結合断片の富化率を計算する。

予測される結果
仮定：等サイズの球状コンパートメント、コンパートメント内の分子及び複合体のランダムな分布、ストレプトアビジン・ビオチン複合体の１００％の会合、ストレプトアビジン・ビオチン複合体の解離なし、ｙＲライブラリーのストレプトアビジンに対して十分な結合親和力を有する結合物質は殆ど、又は全く存在しないと仮定、ライゲーション反応又はその後のＰＣＲ反応のバイアスなし、ライゲーション時に共コンパートメント化なし、ライブラリー及び標的ＤＮＡ断片が共コンパートメント化される場合に１００の反応効率。

エマルションのライゲーション後、ライゲートされたＤＮＡ種の理論量は以下の通り。（何れも元のビオチン断片が融合種に転換されると仮定、以下参照）

ライゲート遺伝子型−既知結合物質：断片Ａ（ストレプトアビジン−ビオチンＤＮＡ断片）（２５０ｂｐ）：１０⁶分子−上記仮定の下でビオチン断片が標的ＤＮＡと共コンパートメント化される可能性は１。

融合遺伝子型−非結合物質：断片Ｂ（無作為共コンパートメント化断片）（２５０ｂｐ）：１０^-3×１０⁹分子＝１０⁶（無作為共コンパートメント化の確率掛ける当初のｙＲライブラリー分子数）−上記仮定の下で非結合物質が共コンパートメント化される確率は、＃標的分子／＃コンパートメント＝１０⁷／１０¹⁰＝１０^-3

最後のＰＣＲ増幅は、２種の分子の何れについても、同じ効率となると予測される。従って、この過程の後、３３０ｂｐの断片の５０％が、ビオチン−ストレプトアビジン結合に由来するＤＮＡを含むと予測される。

４５４シークエンシング技術を用いたＤＮＡ配列決定による富化の分析
プライマーを末端Ａ及びＢ配列と用いたＰＣＲによって、４５４シークエンシングプライミング部位を導入する。結果として得られる断片をＰＡＧＥで精製し、メーカーのプロトコールに従って４５４ＤＮＡシークエンシングに供する。

ＤＮＡ塩基配列を分析し、ビオチン遺伝子型の頻度を計算する。

結論
上記から理解されるように、本明細書に記載の方法を用いることで、1000倍の富化が達成される。上記の計算からは、ビオチン遺伝子型は高頻度で、即ち最大2分の1の確率で見出されると予測される。一方、非結合ヨクトリアクターライブラリーの各メンバーは、最大でも平均200万分の1程度であると予測される。従って、非結合物質に対して、結合物質は1000倍に富化されたことになる。
これは、本発明の実現可能性を実証するだろう。

下記の実施例は全て、開示した技術情報（例えば上記の実施例に開示の情報）に基づき、更に当業者の技術常識に基づいて作製された。

実施例３：
オーバーラップｅＰＣＲを遺伝子−型遺伝子型融合のために用いた共コンパートメント化による富化

ＥＣＣの原理、結合パートナーの共コンパートメント化、及び、その結果として連結されたＤＮＡの融合は、結合パートナーとしてビオチン及びストレプトアビジン（ＳＡ）を用いて実証された。ビオチンＤＮＡコンジュゲート（yR_biotin）を、標的としてＤＮＡ（SA_TD001）に連結されたＳＡを用いたＥＣＣに供した。負の対照として、ビオチンと共にプレインキュベートしたＳＡ＿ＴＤ００１を標的として用いて、ＥＣＣを並行に実施した。概観については図２参照。

方法s
適用したＤＮＡオリゴヌクレオチド：
ヨクトリアクター（yoctoreactor）に対するＤＮＡアナログの連続鎖に適用（Hansen et al. J. Am. Chem. Soc., 2009, 131 (3), pp 1322-1327）：
CGCTAAtggtccctggcagtctccTTAGCGgaccGACTCcTgctcGAAGACAACGGTgttttacACCGTTGTCTTCgagcTgtACCTGCgcAAGTGCgttttacGCACTTgcGCAGGTacTgtGCATCgacAAGACCgttttacGGTCTTgtcGATGCacTgGAGTCggtcCTGTTCGATCTTGGGCGTAT
vip1481：GAACAGGACCGA
vip1471：CTGTTCGATCTTGGGCGTAT
YR_ビオチンに適用
vip1461：ATACGCCCAAGATCGAACAG
vip2501：x-TGGTCCCTGGCAGTCTCC（ｘ＝ビオチン−ＴＥＧ）
ＥＰＣＲに適用
vip157：GCCTTGCCAGCCCGCTCAG
vip660：TGGTCCCTGGCAGTCT
TD001に適用
vip2500：x-GCCTTGCCAGCCCGCTCAG（ｘ＝カルボキシル修飾）
vip2502：CTGTTCGATCTTGGGCGTAT
vip2512：GCCTTGCCAGCCCGCTCAGGCAAGTCTTACAGCCGATCAGTCTTCCTTGGTGCCTGAAG
vip2507：CTGTTCGATCTTGGGCGTATTGTTTTAGCTGCCCCAACTCCTTCAGGCACCAAGGAAGAC
レスキューＰＣＲに適用
vip2549：GCAAGTCTTACAGCCGATCA
vip660：TGGTCCCTGGCAGTCT

yRの調製
ヨクトリアクター（yoctoreactor）に対するＤＮＡアナログの連続鎖は、実施例１の記載に従って調製した。

yR_ビオチンの調製
yRに結合された既知の標的結合物質（ビオチン）は、実施例１の記載に従って調製した。

標的ＤＮＡ（TD001）の調製
TD001の調製は、Vip2504の代わりにオリゴvip2507を適用した他は、実施例１の記載に従って調製した。

材料
ＭＯＰＳ ３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸（Sigma-Aldrich）
シリコーン ポリエーテル／シクロペンタシロキサン（Dow Corning, DC5225C）
シクロペンタシロキサン／トリメチルシロキシシリケート（Dow Corning, DC749）
ＡＲ２０ シリコンオイル（Sigma-Aldrich）
塩酸１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド（ＥＤＣ、１００ｍＭ 新規調製ストック、Aldrich E6383）
Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミド（ｓ−ＮＨＳ、２００ｍＭ ストック、Aldrich 56485）
モルホリノエタンスルホン酸、ＭＥＳ緩衝剤 ｐＨ６．０、５００ｍＭ
β−メルカプトエタノール、５００ｍＭ ストック
低鎖に５’カルボキシル基を有するＰＣＲ産物（上述）
ストレプトアビジンタンパク質（AbCam 78833）（標的タンパク質）
Slide-A-lyzer mini（Pierce）
組織Lyzer II（Qiagen）

ＤＮＡ−標的コンジュゲーション
予活性化
予活性化は、５．４μＬのＴＤ００１［９．３μＭ］を、１μＬ ＭＯＰＳ ｐＨ６ ［１Ｍ］、１μＬ ＥＤＣ［５０ｍＭ］、１μＬ ｓ−ＮＨＳ［１００ｍＭ］、及び１．６μＬの水と混合して行った。

２０℃で３０分間インキュベートすることにより、カルボン酸を活性化させた。
残留ＥＤＣをクエンチするために、２５０ｍＭβ−メルカプトエタノール水溶液１μｌを加えた。

標的タンパク質との反応
コンジュゲーションに先立って、Slide-A-Lyzer mini透析装置を用いて、メーカー（Pierce）の指示に従い、ＳＡを透析バッファー（１０ｍＭ ＭＯＰＳ（ｐＨ８）、５０ｍＭ ＮａＣｌ）に対して２回、３０分間透析した。

透析されたＳＡ５μＬ［５８μＭ］を、１．６μｌ ＭＯＰＳ ｐＨ ６［１Ｍ］、１．６μｌ ＮａＣｌ水溶液［１Ｍ］、及び１１μｌ ＴＤ００１［４．６μＭ］に加えた。２０℃で２時間反応させた。

反応をクエンチするために、２μｌ トリス ｐＨ８［１Ｍ］を加えた。SA_TD001コンジュゲートを、６％ＴＢＥゲルを用い、２００Ｖで４０分間ＰＡＧＥし、反応物から分離した。

バンドを５００μｌ抽出バッファー（５０ｍＭ トリスｐＨ８、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％Tween20）中、４℃（３０分／o.n.／３０分）で３回抽出する。

残留ゲルを濾過によって除去し、得られたサンプルを、Microcon YM30装置を用い、メーカー（ミリポア）の指示に従い富化した。コンジュゲートの濃度は、Picogreenを用い、メーカー（Molecular Probes）の指示に従ってＤＮＡ濃度を測定したところ、０．３８μＭと推定された。

連結反応（結合反応）
yR_ビオチンとSA_TD001との結合に先立って、総体積５０μＬの連結用バッファー（association buffer）（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．８）、０．０５％ Triton-X100）中６ｅ８分子のSA_TD001分子／μＬを、１μＭビオチン（６ｅ１１分子ビオチン／μＬ）の共存又は不在下で３０分間２０℃でインキュベートした。

連結用バッファー中で以下の結合反応を実施した。
１）３ｅ８のyR_ビオチン分子/μＬ及び３ｅ８のSA_TD001分子/μＬを総体積５０μＬ中、ビオチンとプレインキュベートさせていないSA_TD001と反応させた。
２）３ｅ８のyR_ビオチン分子/μＬ及び３ｅ８のSA_TD001分子/μＬを総体積５０μＬ中、ビオチンとプレインキュベートさせたSA_TD001と反応させた。

結合反応物を２０℃で１時間インキュベートした後、連結用バッファー中、yR_ビオチンが３ｅ６分子／μＬ、SA_TD001が３ｅ６分子／μＬの濃度となるように希釈した。

エマルションＰＣＲ（eＰＣＲ）
yRとTD001との融合、及び、エマルション中での融合分子yR_TD001のＰＣＲによる増幅。

連続相
連続相はTurner and Hurles, Nat Protoc. 2009; 4(12): 1771-1783の記載に従って調製した。

１２００μＬの連続相は、１反応当たり以下からなる。
４８０μＬ シリコンポリエーテル／シクロペンタシロキサン（DC5225C）
３６０μＬ シクロペンタシロキサン／トリメチルシロキシシリケート（DC749）
３６０μＬ ＡＲ２０シリコンオイル

ＰＣＲ水相
６００μＬのＰＣＲ水相は、１反応当たり以下からなる。
６０μＬ Pfu緩衝剤（１０×）
１２μＬ ＢＳＡ（５０ｍｇ／ｍＬ）
1２μＬ dNTP（１０ｍＭ）
３μＬ Vip157（１００μＭ）
３μＬ Vip660（１００μＭ）
４μＬ Pfu-turbo（２．５ｕ／μＬ）
４４６μＬ 水
６０μＬ テンプレート
結果として、yR_ビオチン及びSA_TD001の濃度は各々３ｅ５分子／μＬとなる。

エマルション化
一反応当たり、２ｍｌのエッペンドルフチューブ中、１０００μＬの連続相及び５００μＬのＰＣＲ相、並びに５ｍｍのスチールビーズを加えた。

反応物をTissuelyser IIにより、３０Ｈｚ、２０℃で８分間混合することにより、エマルション化させた。

各ＰＣＲチューブに１００μｌのエマルジョンを加え、混合物をＰＣＲ機器により、以下のプログラムを適用した熱サイクリングに供した。
９２℃で２分、３０サイクル（９２℃で３０秒、５５℃で１分、及び７２℃で１．５分）、並びに７２℃で５分。

ＤＮＡの回収
各ＰＣＲチューブに１００μｌの１−ブタノールを加えることによりエマルジョンを破壊した。一条件当たり８本のＰＣＲチューブの内容物をプールし、６００μｌ ＮａＣｌ水溶液［４Ｍ］を加えた。内容物を最高速度で１０秒攪拌して混合し、１４０００ｇで１分間の遠心分離後に有機相を除去した。プールされたＰＣＲ産物に、更に８００μｌの１−ブタノールを加えて、攪拌及び遠心分離工程を繰り返した。１−ブタノールによる抽出をもう一度繰り返した。

ＰＣＲ精製カラムを用い、メーカー（Macherey-Nagel）の指示に従って、ＤＮＡを更に精製した。一条件当たり５０μｌの溶出バッファーで溶出。

溶出されたＤＮＡを、レスキューＰＣＲに先立ち、稀釈バッファー（１０ｍＭトリス（ｐＨ７．８）、２０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％ Triton-X100）で２０倍に希釈した。

レスキューＰＣＲ
融合分子yR_TD001の増幅
ＰＣＲ混合物は一反応当たり以下を含む。
５０μＬ ２× ＰＣＲ mastermix（４０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、２０ｍＭ（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄、２０ｍＭ ＫＣｌ、１６ｍＭ ＭｇＳＯ₄、０．２％ Triton X-100、０．２ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＣＴＰ各０．４ｍＭ、ｐＨ８．８、２５℃）
１μＬ ５０μＭ vip2549（終濃度０．５μＭ）
１μＬ ５０μＭ vip660（終濃度０．５μＭ）
１μＬ（２ｕ／μＬ） Vent（exo-）ポリメラーゼ
１０μＬ テンプレート
３７μＬ 水

混合物に対して、PCR機器で以下のプログラムを適用することにより、熱サイクリングを実施した。
９２℃で２分、２０サイクル（９２℃で３０秒、５５℃で１分、及び７２℃で１．５分）、７２℃で５分。

結果
融合産物yR_TD001は、２４５ｂｐの長さを有すると予測される。１０％ＴＢＥ ＰＡＧＥを用い、２００Ｖで４０分間分離することにより、ＤＮＡ産物を視覚化した。結果によれば、ビオチンとのプレインキュベーションなしで連結反応を行った場合、予測通りのバンドが存在していた（レーン１）のに対して、ビオチンとプレインキュベーション後に連結反応を行った場合、予測されたバンドは不在であった（レーン２）。図４参照。

結論
この結果は、結合パートナーが共コンパートメント化され、その結果として、それらに連結されたＤＮＡが融合されたことを実証するものであった。

実施例４：
オーバーラップｅＰＣＲを遺伝子型−遺伝子型融合のために用いた共コンパートメント化による富化

標的としてSA_TD001を用い、多様化（diverse）ｙＲライブラリーへとスパイクされたｙＲ＿ビオチンを富化することにより、ＥＣＣを実証した。負の対照として、ビオチンと共にプレインキュベートしたSA_TD001を標的として用いて、ＥＣＣを並行に実施した。

方法
ＤＮＡ オリゴヌクレオチドs applied

ヨクトリアクター（yoctoreactor）に対するＤＮＡアナログの連続鎖に適用（Hansen et al. J. Am. Chem. Soc., 2009, 131 (3), pp 1322-1327）：
CGCTAAtggtccctggcagtctccTTAGCGgaccGACTCcTgctcGAAGACAACGGTgttttacACCGTTGTCTTCgagcTgtACCTGCgcAAGTGCgttttacGCACTTgcGCAGGTacTgtGCATCgacAAGACCgttttacGGTCTTgtcGATGCacTgGAGTCggtcCTGTTCGATCTTGGGCGTAT
vip1481：GAACAGGACCGA
vip1471：CTGTTCGATCTTGGGCGTAT

YR_ビオチンに適用
vip1461：ATACGCCCAAGATCGAACAG
vip2501：x-TGGTCCCTGGCAGTCTCC（ｘ＝ビオチン−ＴＥＧ）

ＥＰＣＲに適用
vip157：GCCTTGCCAGCCCGCTCAG
vip660：TGGTCCCTGGCAGTCT

TD001に適用
vip2500：x-GCCTTGCCAGCCCGCTCAG（ｘ＝カルボキシル修飾）
vip2502：CTGTTCGATCTTGGGCGTAT
vip2512：GCCTTGCCAGCCCGCTCAGGCAAGTCTTACAGCCGATCAGTCTTCCTTGGTGCCTGAAG
vip2507：CTGTTCGATCTTGGGCGTATTGTTTTAGCTGCCCCAACTCCTTCAGGCACCAAGGAAGAC

レスキューＰＣＲに適用
vip2549：GCAAGTCTTACAGCCGATCA
vip660：TGGTCCCTGGCAGTCT

YR多様化（diverse）ライブラリーのＰＣＲに適用
vip341：TGGTCCCTGGCAGTCTCC
vip1461：ATACGCCCAAGATCGAACAG

４５４ＰＣＲに適用
vip2593：CCTATCCCCTGTGTGCCTTGGCAGTCTCAGGTCTTCCTTGGTGCCTGAAG
vip2465：CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGAGGTTGGTCCCTGGCAGTCTCC
vip2467：CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGATCGTGGTCCCTGGCAGTCTCC
vip2468：CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGATGCTGGTCCCTGGCAGTCTCC
vip2469：CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGCACTTGGTCCCTGGCAGTCTCC
vip2470：CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGCAGATGGTCCCTGGCAGTCTCC
vip2471：CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGCCATTGGTCCCTGGCAGTCTCC

yR_ビオチンの調製
yR_ビオチンは実施例１の記載に従って調製した。

多様化（diverse）ヨクトリアクター（yoctoreactor）ライブラリーの調製
yRライブラリーは、実質的にHansen et al. J. Am. Chem. Soc., 2009, 131 (3), pp 1322-1327の記載に従って調製した。多様化yRライブラリーを以下の方法でＰＣＲ増幅した。

ＰＣＲ混合物は、１反応当たり以下からなる。
５０μＬ ２× ＰＣＲ mastermix（４０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、２０ｍＭ（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄、２０ｍＭ KCl、16ｍＭ MgSO₄、0.2％ Triton X-100、０．２ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＣＴＰ各０．４ｍＭ、ｐＨ８．８、２５℃）
１０μＬ ５Ｍ ベタイン（終濃度０．５Ｍ）
１μＬ ５０μＭ vip341（終濃度０．５μＭ）
１μＬ ５０μＭ vip1461（終濃度０．５μＭ）
１μＬ（１０⁸分子）の連続鎖ヨクトリアクター（yoctoreactor）に対するＤＮＡアナログ
１μＬ（２ｕ／μＬ）Vent（exo-）ポリメラーゼ
３６μＬ 水

混合物に対して、ＰＣＲ機器で以下のプログラムを適用することにより、熱サイクリングを実施した。
９２℃で２分、１５サイクル（９２℃で３０秒、７２℃で１分）、７２℃で２分

１８５ｂｐのＤＮＡ断片を、標準的な手順（Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3-Volume Set), 3rd Edition, 2001-01 by Joseph Sambrook, David W. Russell, Publisher: Cold Spring Harbor Laboratory Press）に従ってＰＡＧＥ精製し、エタノール沈殿した。

連結反応（結合反応）
結合反応は、実施例３に記載の手順に、以下の変更を加えて実施した。

yR_biotin及びSA_TD001の結合に先立って、総体積５０μｌの連結用バッファー中、６ｅ８分子／μｌのSA_TD001を、１μＭビオチン（６ｅ１１分子ビオチン／μｌ）の共存又は不在下で、２０℃で３０分間インキュベートした。

連結用バッファー中で以下の結合反応を実施した。
１）３ｅ８のｙＲ＿ビオチン分子／μＬ及び３ｅ８のSA_TD001分子／μＬを総体積５０μＬ中、ビオチンとプレインキュベートさせていないSA_TD001と反応させた。
２）３ｅ８のｙＲ＿ビオチン分子／μＬ及び３ｅ８のSA_TD001分子／μＬを総体積５０μＬ中、ビオチンとプレインキュベートさせたSA_TD001と反応させた。
２０℃で１時間インキュベートして結合反応を行った。

以下の条件を設定した。
Ａ）ビオチンとのプレインキュベーションなし：結合反応物（１）の１０００倍希釈、３ｅ７分子ｙＲライブラリー／μＬ（終濃度）を含む連結用バッファー中、yR_ビオチン濃度３ｅ４分子／μＬ、SA_TD001濃度３ｅ５分子／μＬ。
Ｂ）ビオチンとのプレインキュベーションあり：結合反応物（２）の１０００倍希釈、３ｅ７分子ｙＲライブラリー／μＬ（終濃度）を含む連結用バッファー中、yR_ビオチン濃度３ｅ４分子／μＬ、SA_TD001濃度３ｅ５分子／μＬ。
Ｃ）yR-ビオチンなし：連結用バッファー中、３ｅ７分子／μＬのyRライブラリー及び３ｅ５分子／μＬのSA_TD001を含む。

エマルションＰＣＲ
ｅＰＣＲは、実施例３の記載に従って実施したが、同一条件を２連で、４０ＰＣＲサイクルに亘って実施した。

ＤＮＡの回収
エマルションの破壊は、実施例３の記載に従って実施したが、１６のＰＣＲチューブからエマルションをプールし、一条件当たり１００μＬの溶出バッファーで溶出することにより行った。

レスキューＰＣＲ
レスキューＰＣＲは、実施例３の記載に従って実施したが、ＰＣＲ増幅時には以下の熱プロファイルを用いた。９２℃で２分、２０サイクル（９２℃で３０秒、７２℃で１．５分）、７２℃で５分。

４５４シークエンシングの調製
４５４配列タグを含む予測サイズ３０９ｂｐのｙＲ＿ＴＤ００１融合分子を増幅するためのＰＣＲプロトコール。各条件を二連で実施し、独自の正方向プライマーを適用した。

ＰＣＲ混合物は、１反応当たり以下からなる。
５０μＬ ２× ＰＣＲ mastermix（４０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、２０ｍＭ（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄、２０ｍＭ ＫＣｌ、１６ｍＭ ＭｇＳＯ₄、０．２％ Triton X-100、０．２ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＣＴＰ各０．４ｍＭ、ｐＨ８．８、２５℃）
１０μＬ ５Ｍ ベタイン（終濃度０．５Ｍ）
１μＬ ５０μＭ vip2593（終濃度０．５μＭ）
２μＬ 25μＭ vip2465、vip2467、vip2468、vip2469、vip2470又はvip2471（終濃度０．５μＭ）
各条件のテンプレート５μＬ、二連（duplicate）
１μＬ（２ｕ／μＬ） Vent（exo-） ポリメラーゼ
３１μＬ 水

ＰＣＲ精製カラムを用い、メーカー（Macherey-Nagel）の指示に従って、ＤＮＡを精製し、分光測光器（Eppendorf）を用いてＤＮＡ濃度を決定した。１０％ＴＢＥゲルで２００Ｖ、４０分間分離し、産物の相対的な目視確認により濃度を調節した。何れのＤＮＡ産物も同程度の量のＤＮＡを含むように、ＤＮＡ産物をプールした。プールされたＤＮＡを、標準的な手順（Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3-Volume Set), 3rd Edition, 2001-01 by Joseph Sambrook, David W. Russell, Publisher: Cold Spring Harbor Laboratory Press）に従って、１０％ＴＢＥ ＰＡＧＥゲルで分離し、約３０９ｂｐのＤＮＡ断片をＰＡＧＥ精製し、エタノール沈殿した。

４５４シークエンシング
４５４シークエンシングは、Hansen et al. J. Am. Chem. Soc., 2009, 131 (3), pp 1322-1327の記載に従って実施した。

結果
配列決定の結果によれば（図５参照）、yR_ビオチンをスパイクして、yRライブラリーの1000分の１の濃度としたが、yR_ビオチンカウントのパーセンテージは、
条件（ａ）の二連実験、即ち、SA_TD001をビオチンとプレインキュベートせずに富化した場合には、３７．６％及び３２％、
条件（ｂ）の二連実験、即ち、SA_TD001をビオチンとプレインキュベートした後で富化した場合には、０．３０％及び０．７２％、
条件（ｂ）の二連実験、即ち、yR_ビオチンをサンプルに含まない状態で富化した場合には、０．０２％及び０．０５％となった。

従って、標的としてSA_TD001を用いることにより、ｙＲ＿ビオチンの３００倍を超える富化が観察された。対照的に、負の対照標的である、ビオチンと共にプレインキュベートされたSA_TD001によれば、得られた富化は３〜７倍であった。

結論
標的としてSA_TD001を用い、多様化ｙＲライブラリーへとスパイクされたｙＲ＿ビオチンを富化することにより、ＥＣＣが実証された。

実施例５:
eLigationを遺伝子-型遺伝子型融合のために用いた共コンパートメント化による富化

ＥＣＣの原理、結合パートナーの共コンパートメント化、及び、その結果として連結されたＤＮＡの融合は、結合パートナーとしてデスチオビオチン（desBio）及びストレプトアビジン（ＳＡ）を用いて実証された。デスチオビオチンＤＮＡコンジュゲート（yR_desBio）を、標的としてＤＮＡ（SA_TD002）に連結されたＳＡを用いたＥＣＣに供した。負の対照として、ビオチンと共にプレインキュベートしたSA_TD002を標的として用いて、ＥＣＣを並行に実施した。概観については図１参照。

方法
実施例２に記載のＤＮＡオリゴヌクレオチドを使用した。加えて、以下を適用した。

デスチオビオチン標識yRに適用（desBio_yR）:
vip2815：x-TGGTCCCTGGCAGTCTCC（x=デスチオビオチン）
vip2535：CACCACGATGGCAATGCATTCTTCGCTGCCATTCTG

レスキューＰＣＲに適用：
vip660：TGGTCCCTGGCAGTCT
vip2824：CGATGTCCTGAGGTGGAAGT

「スカベンジャー（Scavenger）ＤＮＡ」に適用：
vip2554：GGCAAGTGATTGTCCATGTGCATGAGAAGAGGCCCACATT
vip2555：CACATGGACAATCACTTGCC
vip2556：AATGTGGGCCTCTTCTCATG

TD002に適用：
vip2528：TCCACATCCTCCAGTTCA
vip2529：ACTTCCACCTCAGGACATCGAGCTGGAGCTTGCTGTTAGC
vip2530：AGGTTCGCTCCCTCCTTAAGTCAGGAGGATGTGACACCAA
vip2531：CGATGTCCTGAGGTGGAAGTTGAACTGGAGGATGTGGACA
vip2532：CTTAAGGAGGGAGCGAACCTGCTAACAGCAAGCTCCAGCT
vip2558：x-TTGGTGTCACATCCTCCTGA（ｘ＝Ｃ６−アミノ修飾）

デスチオビオチン標識yR（desBio_yR）の調製
プライマーvip2815及びvip2535を用いたＰＣＲにより、連続鎖ヨクトリアクター（yoctoreactor）に対するＤＮＡアナログライブラリー配列をテンプレートＤＮＡとして、５’−デスチオビオチンをyRアナログ内に導入した（Hansen et al. J. Am. Chem. Soc., 2009, 131 (3), pp 1322-1327）。ストレプトアビジンにコンジュゲートされた標的ＤＮＡへのライゲーションに適した２ｂｐのオーバーハングを形成するために、ＰＣＲ産物をBseMIで消化した。

標的ＤＮＡ（ＴＤ００２）の調製
プロトコール
TD002（ＧＡヌクレオチド・オーバーハング及び５’カルボキシル基を低鎖に有する９８ｂｐ二本鎖ＤＮＡ）を、リン酸化オリゴヌクレオチドvip2528、vip2529、vip2530、vip2531及びvip2532及び非リン酸化オリゴヌクレオチドvip2558のライゲーションによって構築した。Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼによるリン酸化及びＴ４ ＤＮＡリガーゼによるライゲーションは、メーカーの指示（Fermentas）に従って実施した。二本鎖ＤＮＡ断片を、標準的な手順（Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3-Volume Set), 3rd Edition, 2001-01 by Joseph Sambrook, David W. Russell, Publisher: Cold Spring Harbor Laboratory Press）に従ってＰＡＧＥ精製し、エタノール沈殿した。ライゲーション先立って、vip2559を修飾し、５’カルボキシル基を付与した。即ち、単純なＣ６アミノ修飾を、ジスクシンイミジルスベラート（ＤＳＳ、Ｃ８ジ−ＮＨＳエステル、ピアス２１５８０番）処理によって、カルボン酸に転換した。オリゴヌクレオチドを、水−ＮＭＰの１：１混合液中のＨＥＰＢＳ緩衝剤ｐＨ９中で、４０ｍＭ ＤＳＳで処理した後、更にＬｉＯＨで一晩処理し、ＮＨＳエステルを加水分解した。中和及び沈殿の後、粗製のカルボキシ修飾オリゴヌクレオチドを、更に修飾することなく用いた。

ストレプトアビジンとコンジュゲートされた標的ＤＮＡ（SA_TD002）の調製
SA_TD002は実施例３の記載に従って調製された。

連結反応（結合反応）
材料
１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５
４Ｍ ＮａＣｌ
１０％ Triton X-100
１０μＭ ビオチン
SA_TD002
desBio_yR

プロトコール
総体積０．５μｌの結合緩衝剤（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％ Triton）中、３Ｅ８ desBio_yR分子を、１μＭビオチン（阻害剤）の共存又は不在下で、１．４Ｅ９分子SA_TD002と混合した。分子の連結は、氷上で結合混合物を１時間インキュベートすることにより行った。

解離反応（希釈）
材料
標準ライゲーションバッファー:
５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５
５０ｍＭ ＮａＣｌ
０．１％ Triton X-100
０．７５μＭ ＢＳＡ
９ｍＭ ＫＣｌ
４．５％ グリセロール
０．２ｍＭ ＥＤＴＡ
１ｍＭ ＤＴＴ
２ｍＭ ＡＴＰ
１μＭ Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（Fermentas）
０．０１μＭ 「スカベンジャーＤＮＡ」（４０量体ニック化ｄｓＤＮＡ断片）：

単一のニックを含む４０量体のｄｓＤＮＡ断片は、オリゴヌクレオチドvip2554、リン酸化vip2555及びvip2556を組み合わせることにより調製した。

連続相は実施例３の記載に従って調製された。
スクリューキャップを有する２ｍＬのマイクロチューブ

プロトコール
結合混合物０．１２μＬを、１μＭ Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（標準ライゲーション緩衝剤）を含む６００μＬの水相を入れた２ｍＬのエッペンドルフチューブの蓋まで転送した。チューブを２度反転し、更に１０秒間チューブを攪拌して、結合混合物と水相とを混合することにより、解離反応を開始した。マイクロ遠心分離で軽く撹拌した後、５００μＬの混合物を、１ｍＬの連続相を含む２ｍＬの氷冷マイクロチューブに移送し、氷上で更に放置して、最終的に２分間の解離時間を得た。

エマルション化
材料
誘導緩衝剤：
５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５
５０ｍＭ ＮａＣｌ
０．１％ Triton X-100
１．５μＭ ＢＳＡ
１０ｍＭ ＫＣｌ
５％ グリセロール
０．２ｍＭ ＥＤＴＡ
１ｍＭ ＤＴＴ
２ｍＭ ＡＴＰ
１３５ｍＭ ＭｇＣｌ₂

プロトコール
Precellys24（ベルタン・テクノロジーズ）を用い、５５００ｒｐｍで３×２０秒間（２０秒間の撹拌の間に１０秒間の休止を挟んだ）エマルション化し、連続相（１ｍＬ）と水相（０．５ｍＬ）とを混合することによって、解離反応を開始からちょうど２分後に終了させた。並行して、１３５ｍＭ ＭｇＣｌ₂を含む１ｍＬの連続相及び０．５ｍＬの水相（誘導緩衝剤）を５５００ｒｐｍで３×２０秒間エマルション化することにより、マグネシウムを含むがＴ４ ＤＮＡリガーゼ活性化用リガーゼを含まない誘導エマルションを調製した。

エマルション内でのライゲーション
プロトコール
１エマルション当たり１５０μＬのＭｇＣｌ₂含有誘導エマルションを加え、ＲＴで１時間撹拌混合することにより、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを活性化させた。エマルション内のdesBio_yR及びSA_TD002のライゲーションは、エマルション（１６５０μＬ）を熱ブロック内で１６時間、１６℃及び３００ｒｐｍでインキュベートすることにより行った。

エマルションの破壊及びＤＮＡの回収
材料
１−ブタノール
イソプロパノール
１００％ エタノール
１００ｂｐ 無制限ＤＮＡ
ＰＣＲ クリーンアップキット（NucleoSpin ExtractII, Macherey-Nagel）
１０％ Triton X-100

プロトコール
チューブを６５℃で３０分間インキュベートし、更にマイクロ遠心分離で軽く撹拌することにより、ライゲーション反応を停止させた。エマルションを破壊するために、各エマルションの容量の半分を、清潔な２ｍＬのエッペンドルフチューブに転送した。各チューブに、８５０μＬの１−ブタノールと、１５ｎｇの１００ｂｐ無制限ＤＮＡ［１０ナノグラム／μＬ］とを加え、１０秒間よく攪拌して混合した。チューブを１４，０００×ｇで１分間遠心分離し、上澄みを廃棄した。１容量の１−ブタノールを加え、１−ブタノール抽出をもう一度繰り返すことにより、余剰のシリコーン油及び界面活性剤をエマルションから除去した。先に分離したエマルションの回収された水相を１本のチューブにプールし、サプライヤーの推奨に従って、ＰＣＲクリーンアップキット（NucleoSpin ExtractII, Macherey-Nagel）を使用し、ＤＮＡ断片（desBio_yR _TD002_SA融合分子）を、精製によって回収した。０．１％のTriton X100を含むＥＢ緩衝剤（５ｍＭトリス／ＨＣｌ、ｐＨ ８．５）でＤＮＡを溶出した。ｑＰＣＲ分析に先立って、溶出されたＤＮＡを、稀釈緩衝剤（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ ｐＨ ７．５、１０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０５％ Triton X100）で１０倍に希釈した。

ライゲートされたＤＮＡの増幅及び分析（レスキューＰＣＲ）
材料
２×ＰＣＲ Mastermix（ｐＨ８．８、２５℃）:
４０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ
２０ｍＭ （ＮＨ₄）₂ＳＯ₄
２０ｍＭ ＫＣｌ
１６ｍＭ ＭｇＳＯ₄，
０．２％ Triton X-100、
０．２ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ

ホットスタート（hot-start）ＰＣＲに適したヌクレオチドｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＣＴＰ各０．４ｍＭ（CleanAmp, TriLink）

プロトコール
異なるエマルションに存在するdesBio_yR _TD002_SA融合分子の数を分析するために、プライマーvip660及びvip2824を用い、１０倍希釈精製回収ＤＮＡサンプル５μＬをテンプレートとして、ｑＰＣＲを実施した。標準曲線３Ｅ８、３Ｅ７、３Ｅ６、３Ｅ５又は３Ｅ４については、予めライゲートされたyR_TD002（対照テンプレート）のコピーを、各ｑＰＣＲ反応に加えた。

ｑＰＣＲ混合物は、１反応当たり以下からなる。
５μＬ テンプレート
１０μＬ ２× ＰＣＲ mastermix
２μＬ ５Ｍ ベタイン（終濃度０．５Ｍ）
０．４μＬ SyBR Green（終濃度２．５Ｅ−５％）
０．２μＬ １００μＭ vip660（終濃度１μＭ）
０．２μＬ １００μＭ vip2824（終濃度１μＭ）
０．２μＬ（２ｕ／μＬ） Vent（exo-）ポリメラーゼ（Fermentas）
２μＬ 水

混合物に対して、ｑＰＣＲ機器で以下のプログラムを適用することにより、熱サイクリングを実施した。
９２℃で１０分
３０サイクル、９５℃で３０秒及び７２℃で２分３０秒
７２℃で５分

結果
異なるｑＰＣＲ反応物中の融合分子の数を計算するために、標準曲線を定義した。desBio_yR _TD002_SA融合分子の計算された数をカラムチャートに変換し、１μＭビオチンの共存又は不在下でインキュベートされた連結反応で得られた信号間の差異を視覚化した（図６）。得られた結果によれば、阻害剤ビオチンが存在する状態で連結反応を行った場合と比べて、ビオチンの不在下で連結反応を行った場合には、有意に多い数の融合分子が存在することが分かる。

結論
この結果は、デスチオビオチン-ストレプトアビジン結合に由来するdesBio_yR及びSA_TD002分子が共コンパートメント化され、その結果としてそこに連結されたＤＮＡがライゲートされたことを実証するものである。

実施例６：
遺伝子型-遺伝子型融合のためのｅライゲーションを用いた共コンパートメント化の富化−スパイク化実験

標的としてヒト炭酸脱水酵素ＩＩを使用して、多様化（diverse）ｙＲライブラリーへとスパイクされたｙＲ ＤＮＡ（BSB_yR）にコンジュゲートされたＮ−ベンジル−４−スルファモイルベンズアミドを富化することにより、ＥＣＣを実証した。並行して、負の対照として、ＢＳＢとプレインキュベートされた標的を用いてＥＣＣを実施した。更に、同じ系によって、解離時間依存富化が実証された。
概要については図1参照。

方法
実施例２及び５に記載したＤＮＡオリゴヌクレオチドを使用した。更に、以下を適用した。

ＢＳＢ標識ｙＲ（BSB_yR）に使用
vip2260：ATGAAAGACGTGGCCATTGC
vip2724_vip2607：
CTGACATGGTCCCTGGCAGTCTCCTGTCAGGACCGACTCCXGCTCGAAGAC（ｘ＝ｄＴ−Ｃ６−アミノ修飾）
vip2970：CTATCGGTTTTACCGATAGGTCTTCGAGCTGTACCTGCGC
vip2973：AGCTAGGTTTTACCTAGCTGCGCAGGTACTGTGCATCGAC
vip2980：CTATCGGTTTTACCGATAGGTCGATGCACTGGAGTCGGTC

TD003に使用：
vip2536：CTTATGCTGGCAGTTTCA
vip2529：ACTTCCACCTCAGGACATCGAGCTGGAGCTTGCTGTTAGC
vip2538：AGGTTCGCTCCCTCCTTAAGCCAGCAGTGGTAATTCGACA
vip2996：CGATGTCCTGAGGTGGAAGTTGAAACTGCCAGCATAAGGA
vip2532：CTTAAGGAGGGAGCGAACCTGCTAACAGCAAGCTCCAGCT
vip2559：x-TGTCGAATTACCACTGCTGG（ｘ＝Ｃ６−アミノ修飾）

４５４シークエンシングに使用：
Vip3018：CCTATCCCCTGTGTGCCTTGGCAGTCTCAGCGATGTCCTGAGGTGGAAGT
vip2459：CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGAACCTGGTCCCTGGCAGTCTCC
vip2460：CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGAAGGTGGTCCCTGGCAGTCTCC
vip2461：CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGACACTGGTCCCTGGCAGTCTCC
vip2462：CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGACTGTGGTCCCTGGCAGTCTCC
vip2463：CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGAGAGTGGTCCCTGGCAGTCTCC
vip2464：CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGAGCATGGTCCCTGGCAGTCTCC
vip2465：CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGAGGTTGGTCCCTGGCAGTCTCC
vip2466：CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGAGTCTGGTCCCTGGCAGTCTCC
vip2467：CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGATCGTGGTCCCTGGCAGTCTCC
vip2468：CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGATGCTGGTCCCTGGCAGTCTCC
vip2469：CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGCACTTGGTCCCTGGCAGTCTCC
vip2470：CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGCAGATGGTCCCTGGCAGTCTCC
vip2471：CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGCCATTGGTCCCTGGCAGTCTCC
vip2472：CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGCCTATGGTCCCTGGCAGTCTCC
vip2473：CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGCGAATGGTCCCTGGCAGTCTCC
vip2474：CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGCTACTGGTCCCTGGCAGTCTCC
vip2475：CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGCTCATGGTCCCTGGCAGTCTCC
vip2476：CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGCTGTTGGTCCCTGGCAGTCTCC
vip2477：CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGCTTGTGGTCCCTGGCAGTCTCC
vip2478：CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGGAACTGGTCCCTGGCAGTCTCC
vip2479：CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGGACATGGTCCCTGGCAGTCTCC
vip2480：CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGGAGTTGGTCCCTGGCAGTCTCC
vip2481：CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGGATGTGGTCCCTGGCAGTCTCC
vip2482：CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGGCAATGGTCCCTGGCAGTCTCC
vip2483：CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGGTCTTGGTCCCTGGCAGTCTCC
vip2484：CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGGTGATGGTCCCTGGCAGTCTCC
vip2485：CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGTACGTGGTCCCTGGCAGTCTCC
vip2486：CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGTAGCTGGTCCCTGGCAGTCTCC
vip2487：CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGTCAGTGGTCCCTGGCAGTCTCC
vip2488：CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGTCCATGGTCCCTGGCAGTCTCC
vip2489：CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGTCGTTGGTCCCTGGCAGTCTCC
vip2490：CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGTCTCTGGTCCCTGGCAGTCTCC
vip2491：CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGTGACTGGTCCCTGGCAGTCTCC
vip2492：CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGTGTGTGGTCCCTGGCAGTCTCC
vip2493：CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGTTCCTGGTCCCTGGCAGTCTCC
vip2494：CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGTTGGTGGTCCCTGGCAGTCTCC

ヨクトリアクター（yoctoreactor）ライブラリーの調製
ライブラリーは、Hansen et al. J. Am. Chem. Soc., 2009, 131 (3), pp 1322-1327に従って調製したが、トリマー形態の代わりにテトラマー形態を用いた。

ＢＳＢ標識ｙＲ（BSB_yR）の調製
材料
１０ｍＭ Ｆｍｏｃ−ＮＨ−ＰＥＧ（１２）−ＣＯ₂Ｈ
１００ｍＭ ４−（４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン−２−イル）−４−メチルモルホリニウムクロリド（ＤＭＴ−ＭＭ）
２００ｍＭ Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−（４−ブタンスルホン酸） ｐＨ９（ＨＥＰＢＳ）
Ｎ−メチル−２−ピロリドン（ＮＭＰ）
０．５Ｍ ピペリジン、ＮＭＰ中
１０ｍＭ Ｆｍｏｃ−Ｌ−フェニルグリシン（Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｐｈｇ）
１０ｍＭ ４−カルボキシベンゼンスルホンアミド
０．１Ｍ アセトニトリル／酢酸トリエチルアンモニウム（ｐＨ7）
ＢＳＢ：ＢＳＢはDrabovich et al., Anal. Chem. 2009, 81, 490-494に従って合成した。

プロトコール
ＢＳＢ＿ｙＲはライゲーションによって調製した。位置２オリゴヌクレオチドvip2970、位置３オリゴヌクレオチドvip2973、及び位置４オリゴヌクレオチドvip2980を調製し、これらをＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いたリン酸化により、メーカーの指示（Fermentas）に従ってライゲーションを実施した。位置１オリゴヌクレオチドvip2724_vip2607のＢＳＢラべリングは、以下の反応スキームに従って合成した。

アミノ−ＰＥＧ１２由来オリゴヌクレオチドは、５１量体オリゴヌクレオチド（vip2724_vip2607）［５ｎｍｏｌ］と、Ｆｍｏｃ−ＮＨ−ＰＥＧ（１２）−ＣＯ₂Ｈ［１０ｍＭ］に連結された内部修飾ｄＴ（アミノ−Ｃ６−ｄＴ）とから、１００ｍＭＤＭＴ−ＭＭ、２００ｍＭ ＨＥＰＢＳ ｐＨ９、２００μＬのＮＭＰ：水１：１中溶液中で合成した。１時間後、混合物をエタノール沈殿し、１００μＬの水に溶解させた。ＮＭＰ中０．５Ｍピペリジン１００μＬを加え、２５℃で２時間インキュベートした。アミノ−ＰＥＧ１２−オリゴヌクレオチドをエタノール沈殿で単離し、更に精製することなく示談に使用した。

ＢＳＢ−ＰＥＧ１２標識位置１コンジュゲートは、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｐｈｇを５１量体アミノ修飾オリゴヌクレオチドにコンジュゲートすることにより合成した。ここで、一級アミンはＰＥＧ１２リンカーを介して内部修飾ｄＴに連結される。アミノ−ＰＥＧ１２由来オリゴヌクレオチドは、１００ｍＭ ＤＭＴ−ＭＭ及び２００ｍＭ ＨＥＰＢＳ ｐＨ９の２００μＬのＮＭＰ：水１：１の溶液中で、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｐｈｇ［１０ｍＭ］に連結された。１時間後、混合物をエタノール沈殿し、１００μＬの水に溶解させた。０．５ＭピペリジンＮＭＰ溶液１００μＬを加え、２５℃で２時間インキュベートした。最後の４−カルボキシベンゼンスルホンアミドのカップリングは、Ｌ−Ｐｈｇ−ＰＥＧ１２誘導オリゴヌクレオチドの溶液を、１００ｍＭ ＤＭＴ−ＭＭ及び２００ｍＭ ＨＥＰＢＳ ｐＨ９の２００μＬ ＮＭＰ：水１：１の溶液中、４−カルボキシベンゼンスルホンアミド［１０ｍＭ］で処理することにより行った。２５℃で１時間インキュベーションした後、粗オリゴヌクレオチドコンジュゲートをエタノール沈殿で単離し、C-18 Waters XBridgeカラムを用いた逆相ＨＰＬＣで、アセトニトリル／酢酸トリエチルアンモニウム（ｐＨ７、０．１Ｍ）勾配６〜５０％アセトニトリルで、２０分かけて溶出することにより精製した。適切な画分を収集し、真空下で乾燥し、１６８０ｐモルのＢＳＢ標識化vip2724_vip2607を得た。

ＢＳＢとコンジュゲートされたステム相補的位置１オリゴヌクレオチドvip2724_vip2607コンジュゲート、位置２、位置３及び位置４オリゴヌクレオチドを等量ずつ混合し、ライゲートしてyRを形成した（Hansen et al. J. Am. Chem. Soc., 2009, 131 (3), pp 1322-1327）。T4ＤＮＡリガーゼによるライゲーションはメーカー（Fermentas）の指示に従って実施した。ＢＳＢ＿ｙＲは展開後、リン酸化vip2260を用いたプライマー伸長によって二本鎖を形成させた。これはKlenow（exo-）誘導反応をメーカーの指示（Fermentas）に従って行うことにより達成した。

標的ＤＮＡ（TD003）の調製
TD003は実施例５に記載のTD002と同様に調製した。

炭酸脱水酵素IIのTD003に対するコンジュゲーション（CAII_TD003）
組換ヒトＣＡＩＩ（ＲｎＤ系；2184CA）

プロトコール
TD003のＣＡＩＩへのコンジュゲーションは、実施例３と同様に実施した。
ＣＡＩＩとのコンジュゲーション用標的ＤＮＡとの予活性化混合物。予活性化は、２１μＬのＴＤ００３［４．７μＭ］を、３μＬのＭＯＰＳ ｐＨ６［１Ｍ］、３μＬのＥＤＣ［５０ｍＭ］、及び３μＬのｓ−ＮＨＳ［１００ｍＭ］と混合することにより行った。

カルボン酸活性化は、２０℃で３０分間のインキュベートにより行った。
G25 Illustra カラムを用い、メーカー（GE Healthcare）の指示に従って、緩衝剤を除去した。

コンジュゲーションに先立ち、タンパク質を２×３０分、４℃の透析緩衝剤に対して、Slide-A-Lyzer mini透析装置を用いてメーカー（Pierce）の指示に従って透析した。

コンジュゲーション反応は、１μＬのＭＯＰＳ［１Ｍ］ ｐＨ８．０、１μＬのＮａＣｌ［１Ｍ］、及び１μＬの水を、９μＬの透析ＣＡＩＩタンパク質に対して加えることにより行った。約３５μＬの活性化ＤＮＡをこの混合物に加えた。反応物を４℃で２０時間インキュベートした。

Tris（ｐＨ８）を終濃度５０ｍＭとなるように加えてコンジュゲーション反応をクエンチした。実施例３の記載に従って、ＰＡＧＥ６％ＴＢＥゲルを用いて、CAII_TD003コンジュゲートを反応物から単離した。Picogreenをメーカー（Molecular Probes）の指示に従って用いてＤＮＡ濃度を測定したところ、コンジュゲートの濃度は０．２１μＭと推定された。

連結反応（結合反応）
材料
１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５
４Ｍ ＮａＣｌ
１０％ Triton
１０μＭ ＢＳＢ

プロトコール
総体積1.5μＬの結合緩衝剤（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH7.5）、５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％ Triton X-100）中、６．５Ｅ１０のライブラリー分子と、３．３Ｅ５のＢＳＢ＿ｙＲ分子（５Ｅ６のＢＳＢ＿ｙＲ分子で１〜２０００００にスパイクした１Ｅ１２分子からなるヨクトリアクター（yoctoreactor）ライブラリー）とを、９Ｅ９分子のＣＡＩＩ＿ＴＤ００３と、１μＭ ＢＳＢ（阻害剤）の存在又は不在下で混合した。分子の連結は、氷上で結合混合物を１時間インキュベートすることにより行った。

解離反応（希釈）
材料
標準ライゲーションバッファー:
５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５
５０ｍＭ ＮａＣｌ
０．１％ Triton X-100
０．７５μＭ ＢＳＡ
９ｍＭ ＫＣｌ
４．５％ グリセロール
０．２ｍＭ ＥＤＴＡ
１ｍＭ ＤＴＴ
２ｍＭ ＡＴＰ
１μＭ T4 ＤＮＡリガーゼ（Fermentas）
０．０１μＭ 「スカベンジャー」ＤＮＡ

連続相は実施例３の記載に従って調製した。
スクリューキャップを有する２ｍＬのマイクロチューブ

プロトコール
結合混合物０．１２μＬを、１μＭ Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（標準ライゲーション緩衝剤）を含む６００μＬの水相を入れた２ｍＬのエッペンドルフチューブの蓋まで転送した。チューブを２度反転し、更に１０秒間チューブを攪拌して、結合混合物と水相とを混合することにより、解離反応を開始した。マイクロ遠心分離で軽く撹拌した後、５００μＬの混合物を、１ｍＬの連続相を含む２ｍＬの氷冷マイクロチューブに移送し、氷上で更に放置して、最終的に２分間の解離時間を得た。

エマルション化
材料
誘導緩衝剤：
５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５
５０ｍＭ ＮａＣｌ
０．１％ Triton X-100
１．５μＭ ＢＳＡ
１０ｍＭ ＫＣｌ
５％ グリセロール
０．２ｍＭ ＥＤＴＡ
１ｍＭ ＤＴＴ
２ｍＭ ＡＴＰ
１３５ｍＭ ＭｇＣｌ₂

プロトコール
Precellys24（ベルタン・テクノロジーズ）を用い、５５００ｒｐｍで３×２０秒間（２０秒間の撹拌の間に１０秒間の休止を挟んだ）エマルション化し、連続相（１ｍＬ）と水相（０．５ｍＬ）とを混合することによって、解離反応を開始からちょうど２分後に終了させた。並行して、１３５ｍＭ ＭｇＣｌ₂を含む１ｍＬの連続相及び０．５ｍＬの水相（誘導緩衝剤）を５５００ｒｐｍで３×２０秒間エマルション化することにより、マグネシウムを含むがＴ４ ＤＮＡリガーゼ活性化用リガーゼを含まない誘導エマルションを調製した。

エマルションでのライゲーション
プロトコール
１エマルション当たり１５０μＬのＭｇＣｌ₂含有誘導エマルションを加え、ＲＴで１時間撹拌混合することにより、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを活性化させた。ライゲーションは、エマルション（１６５０μＬ）を熱ブロック内で１６時間、１６℃及び３００ｒｐｍでインキュベートすることにより行った。

エマルション破壊及びＤＮＡ回収
材料
１−ブタノール
イソプロパノール
１００％ エタノール
１００ｂｐ 無制限ＤＮＡ
組織Lyser II（Qiagen）
ＰＣＲ クリーンアップキット（NucleoSpin ExtractII, Macherey-Nagel）
１０％ Triton X-100

プロトコール
チューブを６５℃で３０分間インキュベートし、更にマイクロ遠心分離で軽く撹拌することにより、ライゲーション反応を停止させた。エマルションを破壊するために、１エマルジョン当たり３００μＬの１−ブタノール、１５０μＬのイソプロパノール、５０μＬのエタノール、及び２０ｎｇの１００ｂｐ無制限ＤＮＡ［１０ｎｇ／μＬ］を加え、１５Ｈｚで１分間TissueLyser II（Qiagen）で混合した。続いて、チューブを１４，０００×ｇで２分間遠心分離し、ＲＴで１時間振盪し、上澄みを廃棄した。以下の抽出を２回繰り返し、エマルジョンから残留鉱油及び界面活性剤を除去した。１−ブタノールを加え、TissueLyserで１５Ｈｚで１分間混合し、上部相を廃棄。サプライヤーの推奨に従って、ＰＣＲクリーンアップキット（NucleoSpin ExtractII, Macherey-Nagel）を使用し、ＤＮＡ断片を、精製によって回収した。０．１％のTritonを含むＥＢ緩衝剤（５ｍＭトリス／ＨＣｌ、ｐＨ８．５）でＤＮＡを溶出した。

ライゲートされたＤＮＡ（レスキューＰＣＲ）の増幅
材料
２× ＰＣＲ Mastermix（ｐＨ８．８、２５℃）:
４０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ
２０ｍＭ（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄
２０ｍＭ ＫＣｌ
１６ｍＭ ＭｇＳＯ₄，
０．２％ Triton X-100、
０．２ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ
ホットスタートＰＣＲ適したヌクレオチドｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＣＴＰ各０．４ｍＭ（CleanAmp, TriLink）

プロトコール
ライゲートされた断片を、１０μＬの精製回収ＤＮＡサンプルをテンプレートとして用いて、総体積１００μＬとしてＰＣＲにより回収した。

ＰＣＲ混合物:
１０μＬ テンプレートＤＮＡ
５０μＬ ２×ＰＣＲ Mastermix
１０μＬ ５Ｍ ベタイン（終濃度０．５Ｍ）
１μＬ １００μＭ vip660（終濃度１μＭ）
１μＬ １００μＭ vip2824（終濃度１μＭ）
１μＬ（２ｕ／μＬ） Vent（exo-）ポリメラーゼ（Fermentas）
２７μＬ 水

混合物に対して、ＰＣＲ機器で以下のプログラムを適用することにより、熱サイクリングを実施した。
９５℃で１０分
３２サイクル、９５℃で３０秒、７２℃で２分３０秒
７２℃で２分

調製 for ４５４シークエンシング
プロトコール
４５４シークエンシング用のサンプルは、実施例４でyR_TD001融合分子について記載したのと同様の手順によって調製した。４５４シークエンシングタグを加え、独自の順方向プライマーvip2459〜vip2494を用いて、yR_TD003融合分子をＰＣＲ増幅した。

ＤＮＡ配列決定
プロトコール
４５４シークエンシングは、Hansen et al. J. Am. Chem. Soc., 2009, 131 (3), pp 1322-1327の記載に従って行った。ＤＮＡ配列を分析し、ＢＳＢ遺伝子型の頻度を計算した。

結果
配列決定の結果（図７）によれば、２分間の解離時間を用いることにより、BSB_yRはCA IIによって首尾よく（約１３００倍に）富化された。これに対して、３０分間の解離時間を用いた場合、又は、結合工程に先立ってCA IIをＢＳＢとプレインキュベートした場合には、ＢＳＢ＿ＤＮＡの富化は見られなかった。

結論
標的としてCAIIを用い、多様化ｙＲライブラリーへとスパイクされたBSB_yRを、解離時間依存的に富化することにより、ＥＣＣが実証された。

文献リスト
1: EP1809743B1 (Vipergen)
2: EP1402024B1 (Nuevolution)
3: EP1423400B1 (David Liu)
4: Nature Chem. Biol. (2009), 5:647-654 (Clark)
5: WO 00/23458 (Harbury)
6: Nature Methods (2006), 3(7), 561-570 7: 2006 (Miller)
7: Nat. Biotechnol. 2004; 22, 568-574 (Melkko)
8: Nature. (1990); 346(6287), 818-822 (Ellington)
9: Proc Natl Acad Sci USA (1997). 94 (23): 12297-302 (Roberts)
10: WO06053571A2 (Rasmussen)
11: Bertschinger et al,(2007) Protein Engineering, Design & Selection vol. 20 no. 2 pp. 57-68
12: Miller OJ, Bernath K, Agresti JJ, Amitai G, Kelly BT, Mastrobattista E, Taly V, Magdassi S, Tawfik DS, Griffiths AD. Directed evolution by in vitro compartmentalization. Nat Methods. 2006 Jul;3(7):561-70
13: Doi,N. and Yanagawa,H. (1999) FEBS Lett., 457, 227-230
14: Yonezawa,M., Doi,N., Kawahashi,Y., Higashinakagawa,T. and Yanagawa,H.
(2003) Nucleic Acids Res., 31, e118.
15: Tawfik,D.S. and Griffiths,A.D. (1998) Man-made cell-like compartments for molecular evolution. Nat. Biotechnol., 16, 652-656
16: Ghadessy,F.J., Ong,J.L. and Holliger,P. (2001) Proc. Natl Acad. Sci. USA, 98, 4552-4557;
17: Tay Y, Ho C, Droge P, Ghadessy FJ. Selection of bacteriophage lambda integrases with altered recombination specificity by in vitro compartmentalization. Nucleic Acids Res. 2010 Mar;38(4):e25. Epub 2009 Dec 4
18: Zheng Y, Roberts RJ. Selection of restriction endonucleases using artificial
cells. Nucleic Acids Res. 2007;35(11):e83. Epub 2007
19: Mastrobattista E, Taly V, Chanudet E, Treacy P, Kelly BT, Griffiths AD. High-throughput screening of enzyme libraries: in vitro evolution of a beta-galactosidase by fluorescence-activated sorting of double emulsions. Chem Biol. 2005 Dec;12(12):1291-300
20: Levy M, Griswold KE, Ellington AD. Direct selection of trans-acting ligase
ribozymes by in vitro compartmentalization. RNA. 2005 Oct;11(10):1555-62. Epub 2005 Aug 30;
21: Sepp A, Choo Y. Cell-free selection of zinc finger DNA-binding proteins using in vitro compartmentalization. J Mol Biol. 2005 Nov 25;354(2):212-9. Epub 2005 Oct 3;
22: Bernath K, Magdassi S, Tawfik DS. Directed evolution of protein inhibitors of DNA-nucleases by in vitro compartmentalization (IVC) and nano-droplet delivery. J Mol Biol. 2005 Feb 4;345(5):1015-26. Epub 2004 Dec 7.
23: Bertschinger et al, (2004) Protein Engineering, Design & Selection vol. 17 no. 9 pp. 699-707
24: Chen Yu et al, (November 2008) Nucleic Acid Research, Vol. 36, Nr. 19, Pages: Article No. E128
25: Hansen et al. J. Am. Chem. Soc., 2009, 131 (3), pp 1322-1327
26: Drabovich et al., Anal. Chem. 2009, 81, 490-494
27: Turner and Hurles, Nat Protoc. 2009; 4(12): 1771-1783

Claims (16)

1. 少なくとも１つの標的分子に結合する化合物である少なくとも１つの結合体（binding entity）の同定を可能にする特定の核酸配列情報を含む核酸分子を含む富化ライブラリーを作製する方法であって、前記標的分子はＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、炭水化物、有機若しくは無機分子、又はその断片であり、前記特定の結合体はインビトロディスプレイライブラリー内に存在し、前記方法は、
   （ｉ）少なくとも１００種類の異なる結合体Ｂ_n（ここでｎは１００以上の数である）のインビトロディスプレイライブラリーを作製し、ここで各結合体は核酸分子に連結され、前記核酸分子は前記結合体の同定を可能にする特定の核酸配列情報を含み、これにより前記核酸分子の特定の核酸配列情報から、前記核酸分子に連結された前記特定の結合体の構造物が直接同定され（前記核酸分子（遺伝子型）に連結された前記結合体の構造物（即ち表現型）を以下「Ｂ構造物」（B-structure）と呼ぶ）、
   （ii）少なくとも１種類の標的分子Ｔ_n（ここでｎは１以上の数である）が連結された核酸分子を作製し、ここで前記核酸分子は特異的標的分子の同定を可能にする特定の核酸配列情報を含み、ここで前記標的分子は工程（ｉ）のライブラリーに存在する結合体の少なくとも１つに結合する能力を有する（前記核酸分子（遺伝子型）に連結された前記標的分子の構造物（即ち表現型）を以下「Ｔ構造物」（T-structure）と呼ぶ）
   工程を含み、当該方法は、
   （iii）工程（ｉ）のライブラリーの総数Ｘ（ここでＸは１０⁴よりも大きな数である）個のＢ構造物を含む溶液を、工程（ii）の総数Ｙ（ここでＹは１０²よりも大きな数である）個のＴ構造物を含む溶液と、結合条件下で混合し、ここで結合条件は、標的分子に結合する能力を有する結合体を含むＢ構造物が、同じ標的分子に結合する能力を有しない結合体を含むＢ構造物と比べて、対応するＴ構造物により効率的に結合する条件であり、これにより前記結合体の少なくとも１つが少なくとも１つの標的分子に結合して、Ｔ構造物に結合したＢ構造物を含む複合体が生成され（これを以下「Ｂ_結合Ｔ構造物」（B_BoundToT-structure）と呼ぶ）、
   （iv）インビトロのコンパートメント化系を結合条件下で適用し、ここで結合条件は、標的分子に結合する能力を有する結合体を含むＢ構造物が、同じ標的分子に結合する能力を有しない結合体を含むＢ構造物と比べて、対応するＴ構造物より効率的に結合する条件であり、ここで前記コンパートメント化系は、Ｂ構造物、Ｔ構造物及びＢ_結合Ｔ構造物が個別コンパートメント内に無作為に入る条件下で、工程（iii）で存在するＹ個のＴ構造物と比べて、少なくとも２倍の個別コンパートメントを含み、
   （ｖ）同じ個別コンパートメント内に存在するＢ構造物とＴ構造物との核酸分子を融合し、即ち、Ｂ構造物の核酸分子をＴ構造物の核酸分子に融合し（この構造物を以下「ＢＴ_融合構造物」（BT_Fused-structure）と呼ぶ）、前記ＢＴ_融合構造物は、工程（ｉ）の結合体の同定を可能にする特定の核酸配列情報と、工程（ii）の特異的標的分子の同定を可能にする特定の核酸配列情報とを含み、
   （vi）Ｂ構造物の核酸分子とＴ構造物の核酸分子との融合がない条件、即ち、工程（ｖ）で形成されなかった新たなＢＴ_融合構造物が形成されない条件下で、工程（ｖ）の個別コンパートメントの内容物を併合することにより、ＢＴ_融合構造物のライブラリーを取得し、ここで前記ライブラリーは、標的分子と結合実体（binder entity）との非結合対に由来するＢＴ_融合構造物に比べて、標的分子と結合実体との結合対に由来するＢＴ_融合構造物の種が富化されたライブラリーであり、
   ここで、工程（iv）の個別コンパートメントにおいて、Ｂ_結合Ｔ構造物が溶液内に懸濁されており、及び／又は、
   前記方法が固体支持体への標的分子の固定化を含まない
   ことを特徴とする、方法。
2. 工程（ｉ）の結合体（即ち表現型）が核酸分子（遺伝子型）に共有結合で連結され、工程（ii）の標的分子（即ち表現型）が核酸分子（遺伝子型）に共有結合で連結され、Ｂ構造物の核酸分子がＤＮＡであり、Ｔ構造物の核酸分子がＤＮＡである、請求項１に記載の方法。
3. Ｂ構造物のＤＮＡ核酸分子（遺伝子型）が二本鎖核酸分子であり、Ｔ構造物のＤＮＡ核酸分子（遺伝子型）が二本鎖核酸分子である、請求項２に記載の方法。
4. Ｂ構造物の結合体（表現型）に連結された核酸分子（遺伝子型）がＰＣＲプライミング部位を含み、Ｔ構造物の結合体（表現型）に連結された核酸分子（遺伝子型）がＰＣＲプライミング部位を含む、請求項１〜３の何れか一項に記載の方法。
5. 工程（ｉ）のインビトロライブラリーが少なくとも１０⁵の異なる結合体を含み（即ちＢ_n（ｎ＝１０⁵）であり）、工程（ｉ）の結合体が平均分子量ＭＷ５０００ダルトン未満の化合物である、請求項１〜４の何れか一項に記載の方法。
6. 工程（ii）において少なくとも２つの異なる標的分子が存在する（即ちＴｎ（ｎ＝２以上）である）、請求項１〜５の何れか一項に記載の方法。
7. 少なくとも１つの標的分子がタンパク質である請求項１〜６の何れか一項に記載の方法。
8. 工程（iii）において、ある所定のＴ構造物が少なくとも１０⁵コピー存在し、即ちＴ構造物の総数Ｙが少なくとも１０⁵であり、工程（iii）におけるＴ構造物の濃度が、少なくとも１０^-9Ｍである、請求項１〜７の何れか一項に記載の方法。
9. 工程（iii）の結合条件が、標的分子に結合する能力を有する結合体を含むＢ構造物が、同じ標的分子に結合する能力を有しない結合体を含むＢ構造物に比べて、対応するＴ構造物に１００倍の効率で結合する条件である、請求項１〜８の何れか一項に記載の方法。
10. 前記方法が更に、工程（iv）の前に実施される追加の工程として、
    （iii−ｂ）結合条件、即ち、標的分子に結合する能力を有する結合体を含むＢ構造物が、同じ標的分子に結合する能力を有しない結合体を含むＢ構造物と比べて、対応するＴ構造物により効率的に結合する条件下で、工程（iii）の溶液を少なくとも１００倍に希釈することを含む、請求項１〜９の何れか一項に記載の方法。
11. 工程（iv）において、工程（iii）で存在するＹ個のＴ構造物と比べ、少なくとも１００倍の個別コンパートメントが存在するとともに、工程（iv）において、工程（iii）の総数Ｘ個のＢ構造物と比べ、少なくとも１０の平方根（３．１６）倍の個別コンパートメントが存在する、請求項１〜１０の何れか一項に記載の方法。
12. 工程（iv）のインビトロのコンパートメント化系が油中水（water-in-oil）エマルション系であり、平均コンパートメント体積が１０^-12リットル未満である、請求項１〜１１の何れか一項に記載の方法。
13. 工程（ｖ）の同じ個別コンパートメントに存在するＢ構造物の核酸分子とＴ構造物の核酸分子との融合が、
    （ａ）ＤＮＡリガーゼによって３’−ＯＨと５’−リン酸基との間にホスホジエステル結合を形成することにより、又は、
    （ｂ）ＤＮＡポリメラーゼを用いて、エマルションＰＣＲにより
    実施される、請求項１〜１２の何れか一項に記載の方法。
14. 工程（iv）のインビトロのコンパートメント化系が油中水エマルションであり、工程（vi）において、油コンパートメントを破壊することにより、工程（ｖ）の個別コンパートメントの内容物が併合される、請求項１２に記載の方法。
15. 更なる工程（vii）として、工程（vi）の富化ライブラリー内に存在するＢＴ_融合構造物をＰＣＲで増幅し、その後にＤＮＡ配列決定を行うことにより、少なくとも１つの所定の標的分子に結合する少なくとも１つの個別の結合体を同定することを含む、請求項１〜１４の何れか一項に記載の方法。
16. 更なる工程（vii）として、工程（vi）の富化ライブラリーを用いて、少なくとも１つの所定の標的分子に結合する少なくとも１つの個別の結合体を同定することを含む、請求項１〜１５の何れか一項に記載の方法。

Images