JP6169885B2 - 精製装置及び精製方法 - Google Patents

Description

本発明は精製装置及び精製方法に関する。

培養により生産した有用物質は、様々な分野で利用されている。例えば、有用物質として抗体医薬を挙げることができる。抗体医薬は、動物細胞を培養し、培養液を精製することにより得ることができる。

動物細胞を培養する場合、有用物質は細胞外に分泌される。そのため、有用物質は、細胞を除去した後にクロマトグラフィーを用いて精製される。一方、微生物を培養する場合、有用物質は細胞内に分泌される。そのため、有用物質は、細胞を破砕し、固形物を除去した後にクロマトグラフィーを用いて精製される。

有用物質の一例である抗体医薬は、一般的に、複数のクロマトグラフィーを用いた粗精製工程、中間精製工程、及び最終精製工程を経て精製される。ここで、粗精製工程ではアフィニティークロマトグラフィーが使用され、中間精製工程及び最終精製工程では疎水クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー等が使用される。

なお、本技術分野の背景技術としては、特許文献１〜４等を挙げることができる。

国際公開第０１／０７４４８２号パンフレット 特開２００２−１１９８５４号公報 国際公開第０８／１５６１２４号パンフレット 特表２００９−５２０６９１号公報

有用物質をアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製する場合、酸性の溶離液を用いて有用物質を溶出させる。しかし、酸性の溶離液を用いると、有用物質の凝集化や活性の低下が引き起こされ、品質が低下するおそれがある。

そこで、本発明は、酸性の溶離液を用いることなく有用物質を精製することのできる精製装置及び精製方法を提供することを目的とする。

本発明者らが鋭意検討した結果、担体と、担体に結合した温度応答性ポリアミノ酸と、温度応答性ポリアミノ酸に結合した、有用物質（標的物質）に特異的に結合する結合性物質とを含む充填剤を充填したカラムを使用することにより、酸性の溶離液を用いることなく、温度制御によって標的物質を精製できることを見出した。

本発明によれば、酸性の溶離液を用いることなく標的物質を精製することができる。

本発明に係る精製装置の好ましい実施形態を示す。 温度応答性ポリアミノ酸の一例を示す。 温度応答性ポリアミノ酸の構造変化を示す。 温度応答性ポリグルタミン酸の合成の一例を示す。 温度応答性ポリアスパラギンの合成の一例を示す。 結合性物質（Ｎ末端：Ｃｙｓ）とポリアミノ酸（Ｃ末端：チオール）との結合反応を示す。 温度応答性カラムと従来カラムとの精製方法の違いを示す。 表面にアミノ基処理を施した樹脂プレートを示す。 温度制御による吸脱着評価の結果を示す。

以下、本発明について詳細に説明する。

＜精製装置＞
本発明は、担体と、担体に結合した温度応答性ポリアミノ酸と、温度応答性ポリアミノ酸に結合した、標的物質に特異的に結合する結合性物質とを含む充填剤を充填したカラムを備える精製装置に関する。

担体は、温度応答性ポリアミノ酸を結合できるものであれば特に限定されない。例えば、一般的なアフィニティークロマトグラフィー用のカラムに充填されている担体を使用することができる。担体は、温度応答性ポリアミノ酸との結合を可能にするための、表面に化学的処理が施されているものでもよい。

温度応答性ポリアミノ酸は、温度の変化に応じてその立体構造を変化させることができる。温度変化による温度応答性ポリアミノ酸の立体構造の変化が、結合性物質と標的物質との間の結合に影響を与えるため、結合性物質に標的物質を結合させること、及び結合性物質から標的物質を分離させることが可能となる。

例えば図３に示すように、温度応答性ポリアミノ酸は、２０℃以下では結合性物質（プロテインＡ）に標的物質が結合できるような立体構造を形成し、３７℃では結合性物質に結合した標的物質を分離させるような立体構造を形成することができる。

本発明では温度変化による温度応答性ポリアミノ酸の立体構造の変化を利用するため、酸性の溶離液を使用する必要はない。そのため、標的物質の精製を中性条件下で行うことができ、標的物質の凝集化や活性の低下を回避することができる。この結果、標的物質の品質及び生産性を向上させることができる。また、立体構造の変化は可逆的であるため、温度応答性ポリアミノ酸は再利用することが可能である。

温度応答性ポリアミノ酸の立体構造の変化は、例えば、相転移として観察することができる。このような相転移としては、例えば、ゾル−ゲル転移を挙げることができる。

温度応答性ポリアミノ酸の立体構造の変化は、０〜６０℃の範囲で生じることが好ましく、４〜４０℃の範囲で生じることが特に好ましい。このような温度範囲では、標的物質の劣化を抑制することができる。また、このような温度範囲では、標的物質を溶出させるために使用する緩衝液の凍結、緩衝液中の塩の析出等を回避することができる。

温度応答性ポリアミノ酸としては、例えば、ポリリシン、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン等を挙げることができる。これらのポリアミノ酸には側鎖が導入されていてもよい。

温度応答性ポリアミノ酸の立体構造の変化が生じる温度は、ポリアミノ酸の分子量、側鎖等を変更することによって適宜調節することができる。

ポリアミノ酸の好ましい分子量は、ポリアミノ酸の種類によって異なるが、例えば１〜２０ｋＤａであり、好ましくは２〜１８ｋＤａであり、特に好ましくは３〜１６ｋＤａである。

ポリアミノ酸の側鎖としては、両親媒性基、疎水性基、及び親水性基を挙げることができる。具体的には、ポリアミノ酸が、側鎖として両親媒性基を有することが好ましい。また、ポリアミノ酸が、側鎖として疎水性基及び親水性基を共に有することが好ましい。

両親媒性基としては、例えば、吉草酸、酪酸等を挙げることができる。疎水性基としては、例えばアルキルアミン、より具体的にはドデシルアミン等を挙げることができる。親水性基としては、例えばアミノアルコール、より具体的には３−アミノプロパノール等を挙げることができる。

側鎖を有するポリアミノ酸としては、例えば図２に示すような、ドデシルアミン側鎖を有するモノマー単位とアミノアルコール側鎖を有するモノマー単位とを含むポリアスパラギンを挙げることができる。

側鎖を有するポリアスパラギンは、例えば図５に示すように、ポリスクシンイミドにアミノアルコール側鎖等を導入することにより合成することができる。また、側鎖を有するポリグルタミン酸は、例えば図４に示すように、ポリグルタミン酸にアミノアルコール側鎖等を導入することにより合成することができる。

温度応答性ポリアミノ酸と担体との間の結合は、標的物質の精製条件において分離しない程度の結合力を有していればよい。このような結合としては、例えば、共有結合、より具体的には、アミド結合、エステル結合等を挙げることができる。

結合性物質は、特定の標的物質に特異的に結合する能力を有するものであれば特に限定されない。そのため、標的物質の種類に応じて、結合性物質を適宜選択又は作成することができる。特に限定するものではないが、結合性物質としてタンパク質、より具体的にはプロテインＡを使用することが好ましい。

結合性物質と温度応答性ポリアミノ酸との間の結合は、標的物質の精製条件において分離しない程度の結合力を有していればよい。このような結合としては、例えば、共有結合、より具体的には、アミド結合、エステル結合等を挙げることができる。

標的物質は特に限定されない。例えば、標的物質は、生理活性を有する低分子化合物及び高分子化合物であることが好ましく、抗体、酵素等のタンパク質であることが好ましく、医薬として使用可能な抗体であることが特に好ましい。このような標的物質は、例えば、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、酵母、細菌、真菌、藻類等を用いた培養によって生産することができる。

標的物質と結合性物質との間の結合は、温度応答性ポリアミノ酸の立体構造の変化によって分離する程度の結合力を有していればよい。このような結合としては、例えば、イオン交換親和力、吸着親和力、疎水性親和力等の物質間に働く相互作用を挙げることができる。

本発明の一実施形態において、精製装置は、温度応答性ポリアミノ酸の温度を、例えば０〜６０℃、好ましくは４〜４０℃の範囲で変化させる温度調節手段を更に備えていてもよい。温度調節手段を備えることにより、標的物質が劣化しないように温度を制御するこができる。このような温度調節手段としては、例えば、溶離液を貯蔵するタンクを加温する加温器、カラムを加温する加温器等を挙げることができる。

本発明の一実施形態において、精製装置は、上記カラムで精製した標的物質を更に精製するための手段を更に備えていてもよい。このような手段として、例えば、陰イオン交換樹脂を充填した陰イオン交換カラム、陽イオン交換樹脂を充填した陽イオン交換カラム等を挙げることができる。本発明においては酸性の溶離液を使用する必要がないため、酸性の溶離液によるイオン交換カラムの損傷を回避することができる。

本発明の一実施形態において、精製装置は、カラムで精製した標的物質に対するウイルス不活化・除去手段を更に備えていてもよい。ウイルス不活性化・除去手段としては、例えば、限外（ＵＦ）濾過装置、ナノフィルター（ＮＦ）濾過装置、液状加熱処理装置、有機溶媒／界面活性剤（Ｓ／Ｄ）処理装置等を挙げることができる。従来の精製装置では、酸性の溶離液の使用によってウイルスが不活化されるため、ウイルス不活化・除去手段を１つ備えていればよい。しかし、本発明では中性の溶離液が使用されるため、ウイルスは不活化されない。そのため、精製装置は、ウイルス不活性化・除去手段を２つ以上備えていることが好ましい。

本発明に係る精製装置の好ましい実施形態を図１に示す。図１では、アフィニティーカラム２の下流に、陰イオン交換カラム３、陽イオン交換カラム４、ＵＦ濾過装置５、及び除菌フィルター８が順に設置されている。アフィニティーカラム２の上流には、培地受けタンク１、及び溶離液タンク６が設置されている。

＜精製方法＞
本発明は、結合工程、洗浄工程、分離工程、及び溶出工程を含む標的物質の精製方法にも関する。

結合工程では、担体と、担体に結合した温度応答性ポリアミノ酸と、温度応答性ポリアミノ酸に結合した、標的物質に特異的に結合する結合性物質とを含む充填剤を充填したカラムに、標的物質と不純物とを含む溶液を通し、標的物質を結合性物質に結合させる。

担体、温度応答性ポリアミノ酸、結合性物質、及び標的物質についての説明は上述の通りである。標的物質と不純物とを含む溶液としては、例えば、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、酵母、細菌、真菌、藻類等を用いた培養によって得られる培養液等を挙げることができる。

結合工程における温度は、温度応答性ポリアミノ酸が、結合性物質に標的物質が結合できるような立体構造を形成する温度であればよい。例えば０〜６０℃、好ましくは２〜２０℃、特に好ましくは４〜１０℃で結合工程を行うことが好ましい。また、結合工程におけるｐＨは、例えば５〜９、好ましくは６〜８である。このような条件で結合工程を行うことにより、標的物質を劣化させることなく、結合性物質に結合させることができる。

洗浄工程では、結合性物質に結合した標的物質を分離させることなく、不純物を洗浄する。不純物の洗浄に使用する溶媒は、結合性物質と標的物質との結合に悪影響を与えるものでなければ特に限定されない。洗浄工程における温度及びｐＨは、結合工程と同様の条件であることが好ましい。

分離工程では、温度応答性ポリアミノ酸に温度変化を与え、結合性物質に結合した標的物質を分離させる。分離工程における温度は、温度応答性ポリアミノ酸が、結合性物質に結合した標的物質を分離させるような立体構造を形成する温度であればよい。例えば０〜６０℃、好ましくは２０〜５０℃、特に好ましくは３５〜４０℃で分離工程を行うことが好ましい。また、分離工程におけるｐＨは、例えば５〜９、好ましくは６〜８である。このような条件で分離工程を行うことにより、標的物質を劣化させることなく、結合性物質から分離させることができる。

溶出工程では、分離した標的物質を溶出する。標的物質の溶出に使用する溶媒は、洗浄工程で使用した溶媒と同じものでもよいし、異なるものでもよい。溶出工程における温度及びｐＨは、分離工程と同様の条件であることが好ましい。

本発明の一実施形態において、精製方法は、溶出工程において溶出した標的物質を、陰イオン交換カラム及び／又は陽イオン交換カラムを用いて更に精製する工程を含んでいてもよい。

本発明の一実施形態において、精製方法は、溶出工程において溶出した標的物質、又はイオン交換カラムを用いて更に精製した標的物質に対して、ウイルス不活性化・除去処理を行う工程を含んでいてもよい。ウイルス不活性化・除去処理を行う工程を２回以上行うことが好ましい。

＜温度応答性ポリリシンの調製＞
水溶性カルボジイミド（ＷＳＣ）（２９０ｍｇ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）（１７０ｍｇ）、及び吉草酸（１３０μｌ）を、ガラス容器に入れた蒸留水又はＰＢＳ（ｐＨ５．８）（４ｍｌ）に溶解させた。得られた溶液を４℃に冷却し、ポリリシン（１４０ｍｇ）を加え、一晩反応させた（３７℃で２時間反応させてもよい）。反応液を透析膜（ｃｕｔ−ｏｆｆ分子量２０００、Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒｅ製）を用いて、室温で純水中、２４時間撹拌して未反応物を除去し、単離・精製した。

＜温度応答性ポリアスパラギンの調製＞
セパラブルフラスコ(スターラー、温度計)にＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）（３４ｇ）を入れ、ポリスクシンイミド（ＰＳＩ）（９．７ｇ、０．１ｍｏｌ）を溶解させた。ドデシルアミン（６．５ｇ、０．０３５ｍｏｌ）及び２−メトキシエチルアミン（４．９ｇ、０．０６５ｍｏｌ）を上記溶液に添加し、７０℃で６時間反応させた。反応液を大量のアセトニトリルに入れ、フィルターを用いて沈殿物を回収した。回収した沈殿物（回収率９２％、１９．４ｇ）を６０℃で２４時間乾燥した。

＜結合性物質と温度応答性ポリアミノ酸の結合＞
結合性物質のＮ末端がシステイン（Ｃｙｓ）の場合、ポリアミノ酸のＣ末端にチオールを付加しておくことにより、結合性物質とポリアミノ酸とを結合させることができる（図６）。ポリアミノ酸のＣ末端チオエステルと結合性物質のＮ末端システインとの反応によってふたつの物質を結合させる。システインの側鎖のチオール基がチオエステル基のカルボニル炭素に選択的に反応し（化学選択的反応）、チオール交換反応により、チオエステル結合初期中間体が生成する。この中間体は、自発的に分子内転位して（自然転移）、連結部位に天然アミド結合を与え、一方、システイン側鎖チオールを再生させる。結合後、ラネーニッケルを使って生成物の上記チオール基を選択的に脱硫（選択的脱硫）を行うと、天然の標的配列が生成する。

以下に、手順を示す。
［試薬の調製］
（１）ストック溶液５０ｍｌ：
（ａ）０．１Ｍ Ｎａ_２ＨＰＯ_４（リン酸水素二ナトリウム）又はＮａＨ_２ＰＯ_４（リン酸二水素ナトリウム）（１．４２ｇ、１０ｍｍｏｌ）
（ｂ）６Ｍ ＧｕＨＣｌ（グアニジン塩酸塩）（２８．７ｇ、３００ｍｍｏｌ）
（ａ）、（ｂ）の順番で溶媒へ溶かす。４℃で数ヶ月保存する。ＧｕＨＣｌはペプチド反応体を可溶化するために使用する。Ｎａ_２ＨＰＯ_４又はＮａＨ_２ＰＯ_４はｐＨを６．８〜７に中和するために使用する。

（２）ＮＣＬ ｂｕｆｆｅｒの調製
シンチレーションバイアルに下記溶質を入れ、フィルター処理（０．２μｍシリンジフィルター）したストック溶液（５ｍｌ）を添加する。
５０ｍＭ ＭＰＡＡ（４２．１ｇ、０．２６ｍｍｏｌ)
（ＭＰＡＡ：４−メルカプトフェニル酢酸（Sigma-Aldrich, Cat. #:653152））
２０ｍＭ ＴＣＥＰ（ＨＣｌ代用可）（２８．７ｇ、０．１ｍｍｏｌ）
（ＴＥＣＰ：トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（Sigma-Aldrich,Cat. #:C4706））

（３）ＮＣＬ ｂｕｆｆｅｒのｐＨ調整
２Ｍ ＮａＯＨ又は１Ｍ ＨＣｌを用いてｐＨ７．１に合わせる。

［結合性物質と温度応答性ポリアミノ酸との反応］
（１）ペプチド（例えばポリアミノ酸）−チオエステル及びＣｙｓ−ペプチド（例えばプロテインＡタンパク）を正確に計りチューブへ入れた。上記、Ｃ末端へのチオエステルの付加及びＮ末端へのＣｙｓ付加の方法は別に記載する。ＮＣＬ ｂｕｆｆｅｒ（５ｍｌ）に対して各ペプチドを１〜５ｍＭ使用する。１５００Ｄａ以下のペプチドの場合は３ｍＭで約５ｍｇである。

（２）ペプチド−チオエステル及びＣｙｓ−ペプチドの入ったチューブにＮＣＬ ｂｕｆｆｅｒを添加し、すばやくペプチドを溶かした。ｐＨを測定し、必要であればｐＨ７．０に合わせる。低濃度（０．２Ｍ等）ＮａＯＨを使用してｐＨを調整する。ｐＨが７より上である場合、ペプチドは加水分解される。

（３）ＬＣＭＳ又はＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳを用いて反応をみる。ペプチドにＮＣＬ ｂｕｆｆｅｒを加えて０分、３０分、１時間、２時間、４時間、８時間、１６時間で反応をみた。通常１〜１６時間の間に反応が起こる。各時間でエッペンに１０μlとり、１９０μlのＡｃＣＮ：Ｈ_２Ｏ（０．０８％：０．１％ ＴＦＡ ｖ／ｖ）＝１：１溶液を加えて２０倍希釈し、反応を止めた（確実に反応を止めるには１Ｍ ＨＣｌでｐＨ４まで下げる）。

（４）反応終了後すぐに１Ｍ ＧｕＨＣｌ（０．１％ ＴＦＡ （ｓｏｌｖｅｎｔ Ａ）使用）で溶液を希釈し、ｐＨを下げて反応を止めた。

＜タンパクのＮ末端にシステイン付加する方法＞
目的のタンパクのＮ末端がシステインでない場合、次の方法で目的タンパクのＮ末端にシステインを付加することが可能である。

目的タンパクの遺伝子がコードされているＤＮＡをｐＴＹＢ２１ベクターのマルチクローニングサイト（例：ＳａｌＩ−ＰｓｔＩ）に挿入する。挿入したｐＴＹＢ２１ベクターをＥ.Ｃｏｌｉ Ｓｔｒａｉｎ ＥＲ２５６６に組み込み、培養することでＮ末端にインテインとキチン結合ドメイン（ＣＢＤ）から構成されるタグが融合した目的タンパクが産生する。産生した目的タンパクをキチンビーズに結合させ、チオール試薬（ＤＴＴ又は２−メルカプトエタンスルホン酸）により、Ｎ末端にシステインが付加された目的タンパクをビーズから切断することができ、Ｎ末端システイン付加タンパクを回収することができる。

＜ポリアミノ酸のＣ末端にチオエステルを付加する方法＞
ポリアミノ酸の配列をコードしたＤＮＡをｐＴＸＢ１ベクターのマルチクローニングサイト（例：Ｎｄｅｌ−ＳａｌＩ又はＳｐｅｌ）に挿入する。挿入したｐＴＸＢ１ベクターをＥ.Ｃｏｌｉ Ｓｔｒａｉｎ ＥＲ２５６６に組み込み、培養することでＣ末端にインテインとキチン結合ドメイン（ＣＢＤ）から構成されるタグが融合したポリアミノ酸が産生する。産生したポリアミノ酸をキチンビーズに結合させ、チオール試薬（ＤＴＴ又は２−メルカプトエタンスルホン酸）により、Ｃ末端にチオエステルが付加されたポリアミノ酸をビーズから切断することができ、Ｃ末端チオエステル付加ポリアミノ酸を回収することができる。

＜温度応答性ポリアミノ酸の担体への結合＞
温度応答性ポリアミノ酸は、他のリガンドタンパクと同等に担体へ固定することが可能である。ここでは、担体への固定の一例を挙げるが、この他の固定化の方法も実施可能である。

［ＨｉＴｒａｐ ＮＨＳ−活性化ＨＰ Ｃｏｌｕｍｎ（１ｍＬ）への固定方法］
（１）カラムの準備
カラムに気泡を入れないように注意しながら、シリンジを接続し、１ｍＭ ＨＣｌ（５ｍｌ）を、流速１滴／秒（又は０．２〜１ｍｌ／ｍｉｎ）で送液した。

（２）カップリング反応
リガンド溶液（１ｍｌ）を、流速１滴／秒（又は０．２〜１ｍｌ／ｍｉｎ）で送液し、カラム出口を付属のストッププラグで密閉し、室温で１５〜３０分間、又は４℃で４時間放置した。カップリングバッファー（３ｍｌ）を、流速１滴／秒（又は０．２〜１ｍｌ／ｍｉｎ）で送液した。

（３）未反応活性基のブロッキング
ブロッキングバッファー（６ｍｌ）を流速１滴／秒（又は１〜２ｍｌ／ｍｉｎ）で送液した。洗浄バッファー（６ｍｌ）を流速１滴／秒（又は１〜２ｍｌ／ｍｉｎ）で送液した。ブロッキングバッファー（６ｍｌ）を流速１滴／秒（又は１〜２ｍｌ／ｍｉｎ）で送液し、室温で１５〜３０分間、又は４℃で４時間放置した。

（４）カラムの洗浄と平衡化
洗浄バッファー（６ｍｌ）を流速１滴／秒（又は１〜２ｍｌ／ｍｉｎ）で送液した。ブロッキングバッファー（６ｍｌ）を流速１滴／秒（又は１〜２ｍｌ／ｍｉｎ）で送液した。洗浄バッファー（６ｍｌ）を流速１滴／秒（又は１〜２ｍｌ／ｍｉｎ）で送液した。平衡化バッファーを流速１滴／秒（又は１〜２ｍｌ／ｍｉｎ）で送液し、 リガンド固定カラムの作製を完了した。

上記の他にも担体上にリガンドの配向性を揃えて、担体の単位体積あたりの吸着量を向上させる方法も可能である。

＜選択性温度刺激吸脱着カラムを用いた精製方法＞
上記で作成した温度応答性特異的吸脱着カラムに、温度を２０℃以下とした培養回収液を流し、抗体タンパクをカラムに吸着させた。その後、３７℃に加温した緩衝液（２０ｍＭ リン酸塩、ｐＨ７．０）をカラムに流し、抗体タンパクを溶出した。

図７に温度応答性特異的吸脱着カラムと、従来のプロテインＡカラムとの相違を示す。精製は、結合工程、洗浄工程、分離・溶出工程からなる。まず抗体と不純物を含む培養液をカラムに通す。カラムにはプロテインＡ結合ビーズが充填されており、抗体は上記ビーズに結合するが、不純物は結合しない。洗浄により、不純物をよく取り除く。分離・溶出工程では抗体とプロテインＡ結合ビーズとの結合力を弱めることで抗体をプロテインＡ結合ビーズから分離する。

従来の方式では、結合工程、洗浄工程を中性ｐＨ、室温で行い、分離・溶出工程を室温、低ｐＨで行うことで、抗体とプロテインＡ結合ビーズとの結合力を弱め、溶出していた。しかし、抗体は低いｐＨに曝されると、抗体同士が結合し、凝集体となる（凝集体誘導）。この凝集体は患者にとって副作用を引き起こす原因とされ、問題視されている。

本方式では、結合工程、洗浄工程を低温で行い、分離・溶出工程を温度を上げて行うことで、結合力を変え、溶出する。すべての工程を中性ｐＨで行い、温度変化は抗体を変性させない範囲で行われる。

以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はこれに限定されるものではない。

＜温度制御型プロテインＡ材料の構築＞
（１）温度応答性ポリリシンの調製
温度応答性ポリリシンは以下の手順に従って調製した。１−エチル−３−カルボジイミド（ＷＳＣ）（２９０ｍｇ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）（１７０ｍｇ）、及び吉草酸（１３０ｍｇ）を純水（４ｍｌ）に溶解させ、この溶液を４℃に冷却、撹拌しながらεポリリシン（種々の分子量が混在）（１４０ｍｇ）を加えた。常温で２時間撹拌した後、透析膜を用いてさらに２４時間撹拌して未反応低分子物を除去した。透析膜の種類により、３．５ｋＤａ以上の分子量を持つ温度応答性ポリリシン、１０ｋＤａ以上の分子量を持つ温度応答性ポリリシン、２０ｋＤａ以上の分子量を持つ温度応答性ポリリシンの３種類を調製した。

（２）温度応答性ポリリシンの基盤への結合
上記調製した３種類の温度応答性ポリリシンそれぞれを、表面にアミノ基処理を施している樹脂プレート（図８）上に以下の手順に従って共有結合させた。グルタルアルデヒドが２％となるように炭酸緩衝液で希釈した。プレートの各ウェルに１５０μｌずつ加え、３７℃で２時間反応させた。各ウェルを純水で３回洗浄した後、温度応答性ポリリシンを各ウェルに１００μｌずつ加え、２時間反応させた。その後、ＰＢＳ（リン酸緩衝液）で各ウェルを３回洗浄した。

（３）プロテインＡの温度応答性ポリリシンへの結合
上記、温度応答性ポリリシンが共有結合しているプレートに２％グルタルアルデヒドを加え、２時間反応させた。純水で洗浄した後、プロテインＡを各ウェルに１００μｌずつ加えて、２時間反応させた。その後、ＰＢＳ（リン酸緩衝液）で各ウェルを３回洗浄した。

＜温度制御型プロテインＡ材料の抗体（ＩｇＧ）の温度制御による吸脱着評価＞
上記で調製した温度制御型プロテインＡ材料を用い、以下の手順に従って、温度による抗体吸脱着評価を行った。

プレート上のプロテインＡ以外にタンパクの非特異的吸着が生じないように５％スキムミルクによりブロッキングを行った。各ウェルを洗浄バッファー（２００μｌ）で３回洗浄した後、ビオチン化抗体を５０μｌずつ加え、４℃、オーバーナイトでインキュベートした。４℃に保ちながら洗浄バッファー（２００μｌ）を用いて、各ウェルを３回洗浄した後、ストレプトアビジン−ペルオキシダーゼコンジュゲートを５０μｌずつ加え、４℃、オーバーナイトでインキュベートした。温度応答性の効果を調べるため、一方は３７℃の条件で、もう一方は４℃の条件で洗浄バッファーを用いて各ウェル２００μｌで３回洗浄した後、色素原を５０μｌずつ加え、室温で発色反応を行った。波長４５０ｎｍの吸光度を測定した。

結果を図９に示す。ポリリシンの分子量が＞３．５ｋＤａ及び＞１０ｋＤａの場合、３７℃の条件よりも４℃の条件において吸光度が高い（４℃で結合し、３７℃で分離する）。４℃では抗体（ＩｇＧ）に対するプロテインＡの結合力が高く、分子量が＞１０ｋＤａの場合に特に結合力が高い。一方、分子量が＞２０ｋＤａの場合には、４℃と３７℃との条件において差異はなく、温度制御による結合が変化していない。

１・・・培地受けタンク、２・・・アフィニティーカラム、３・・・陰イオン交換カラム、４・・・陽イオン交換カラム、５・・・ＵＦ濾過装置、６・・・溶離液タンク、７・・・冷却装置、８・・・除菌フィルター、９・・・画分タンク、１０・・・受けタンク

Claims (7)

1. カラムと、当該カラムに充填された充填剤とを備える、標的物質の精製装置であって、 前記充填剤が、担体と、当該担体に結合した温度応答性ポリアミノ酸と、当該温度応答性ポリアミノ酸に結合した、標的物質に特異的に結合する結合性物質とを含み、
   前記温度応答性ポリアミノ酸が３〜１６ｋＤａのポリリシンであり、前記結合性物質がプロテインＡである、精製装置。
2. 前記温度応答性ポリアミノ酸が、前記結合性物質に前記標的物質が結合できるような立体構造と、前記結合性物質に結合した前記標的物質を分離させるような立体構造との間で構造変化し、前記構造変化が０〜６０℃の範囲で起こる、請求項１に記載の精製装置。
3. 前記温度応答性ポリアミノ酸の温度を０〜６０℃の範囲で変化させる温度調節手段を更に備える、請求項１に記載の精製装置。
4. 標的物質の精製方法であって、
   担体と、当該担体に結合した温度応答性ポリアミノ酸と、当該温度応答性ポリアミノ酸に結合した、標的物質に特異的に結合する結合性物質とを含む充填剤を充填したカラムに、前記標的物質と不純物とを含む溶液を通し、前記標的物質を前記結合性物質に結合させる結合工程；
   前記結合性物質に結合した前記標的物質を分離させることなく、不純物を洗浄する洗浄工程；
   不純物を洗浄した後、前記温度応答性ポリアミノ酸に温度変化を与え、前記結合性物質に結合した前記標的物質を分離させる分離工程；及び
   分離した前記標的物質を溶出する溶出工程；
   を含み、
   前記温度応答性ポリアミノ酸が３〜１６ｋＤａのポリリシンであり、前記結合性物質がプロテインＡである、精製方法。
5. 前記温度応答性ポリアミノ酸が、前記結合性物質に前記標的物質が結合できるような立体構造と、前記結合性物質に結合した前記標的物質を分離させるような立体構造との間で構造変化し、前記構造変化が０〜６０℃の範囲で起こる、請求項４に記載の精製方法。
6. 前記分離工程を０〜６０℃で行う、請求項４に記載の精製方法。
7. 前記溶出工程をｐＨ５〜９で行う、請求項４に記載の精製方法。

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