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JP6169101B2 - 炎症性疾患の予防及び／又は治療において有用な化合物を同定するスクリーニング法 - Google Patents

炎症性疾患の予防及び／又は治療において有用な化合物を同定するスクリーニング法 Download PDF

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Description

(発明の分野)
本発明は、GPR84アゴニストが好中球走化性を誘導し、かつGPR84アンタゴニストがGPR84アゴニスト刺激性走化性を遮断することができる証拠を提供する。これらの結果は、GPR84が好中球動員プロセスにおける必須プレーヤーであることを示す。したがって、本発明は、炎症性疾患に関与するプロセスであるGPR84アゴニスト刺激性走化性を阻害する化合物の同定のための新規のアッセイに関する。特に、炎症性疾患は、炎症性腸疾患(IBD)、関節リウマチ、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、及び特発性肺線維症(IPF)から選択される。
本発明は、炎症性疾患(例えば、炎症性腸疾患(IBD)、関節リウマチ、血管炎、肺疾患(例えば、慢性閉塞性肺疾患(COPD)及び間質性肺疾患(例えば、特発性肺線維症(IPF))))、神経炎症性疾患、感染性疾患、自己免疫疾患、並びに/又は免疫細胞機能の障害が関与する疾患の予防及び/又は治療において有用な化合物の同定方法も提供する。
(発明の背景)
GPR84は、発現配列タグデータマイニング戦略の結果として、及びさらに、好中球で発現される新規ケモカイン受容体を同定することを目的とした縮重プライマー逆転写酵素-ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)法を用いて(Yousefiの文献、2001)、ヒトB細胞から最近単離され、特徴付けられた(Wittenbergerらの文献、2001, J Mol Biol, 307, 799-813)。
GPR84(別名、EX33)は、9〜14の炭素鎖長を有する中鎖脂肪酸(MCFA)がこの受容体のリガンドとして同定されるまでオーファンGPCRであり続けた(Wangの文献、2006)。GPR84は、カプリン酸、ウンデカン酸、及びラウリン酸によって、それぞれ、5μM、9μM、及び11μMの効力で活性化されると記載された。2つの小分子: 3,3'ジ-インドリルメタン(DIM)(Wangの文献、2006)及びエンベリン(WO 2007/027661号)も、いくらかのGPR84アゴニスト活性を有すると記載された。
GPR84発現は、限定されないが、多形核白血球(PMN)、好中球、単球、T細胞、及びB細胞を含む免疫細胞で発現されることが示されている。(Wangの文献、2006、Yousefiの文献、2001、Venkataramanの文献、2005、WO2007/027661号)。より高いレベルのGPR84は、T細胞及びB細胞よりも好中球及び好酸球で測定された。GPR84発現は、炎症応答の伝播において役割を果たし得る組織、例えば、肺、脾臓、骨髄で示された。
例えば、最近の総説において、Du Boisは、特発性肺線維症(IPF)などの間質性肺疾患の治療の現状を報告した。広範性の肺の瘢痕化をもたらし得る間質性肺疾患の異なる傷害性又は炎症性要因が300近く存在し、IPF病理の初期段階は、炎症を伴う可能性が極めて高く(Du Boisの文献、2010)、抗炎症治療を伴う組合せ療法を使用することが有利であり得る。
GPR84の発現は、LPS刺激によって、単球/マクロファージで高度に上方調節された(Wangの文献、2006)。
GPR84ノックアウト(KO)マウスは生存能力があり、野生型同腹子対照と区別することができない(Venkataramanの文献、2005)。様々なマイトジェンに応答したT細胞及びB細胞の増殖は、GPR84欠損マウスで正常であると報告されている(Venkataramanの文献、2005)。GPR84 KO由来のTヘルパー2(Th2)分化T細胞は、野生型同腹子対照と比べて、より高いレベルの3つの主要なTh2サイトカインIL4、IL5、IL13を分泌した。対照的に、Th1サイトカインINFγの産生は、GPR84 KO及び野生型同腹子由来のTh1分化T細胞で同様であった(Venkataramanの文献、2005)。
さらに、カプリン酸、ウンデカン酸、及びラウリン酸は、LPSで刺激されたRAW264.7マウスマクロファージ様細胞からのインターロイキン-12 p40サブユニット(IL-12 p40)の分泌を用量依存的に増大させた。炎症促進性サイトカインIL-12は、細胞性免疫の促進において極めて重要な役割を果たし、Tヘルパー1(Th1)応答を誘導及び維持することにより、並びにTヘルパー2(Th2)応答を阻害することにより病原体を除去する。MCFAは、GPR84に対するその直接的な作用を通じて、Th1/Th2バランスに影響を及ぼし得る。
Berryらは、活動性結核(TB)の全血393遺伝子転写シグナチャーを同定した(Berryの文献、2010)。GPR84は、この活動性TBの全血393遺伝子転写シグナチャーの一部であり、感染性疾患におけるGPR84の潜在的役割を示している。
GPR84発現は、骨髄-単球起源の中枢神経系(CNS)の一次免疫エフェクター細胞であるミクログリアでも記載されている(Bouchardの文献、2007)。末梢免疫細胞で観察されるように、ミクログリアにおけるGPR84発現は、炎症条件、例えば、TNFα及びIL1処理の下で高度に誘導されるが、特に、内毒素血症及び実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)でも高度に誘導され、神経炎症過程における役割を示唆している。これらの結果は、GPR84が、内毒素血症及び多発性硬化症期だけでなく、脳損傷、感染症、アルツハイマー病(AD)、パーキンソン病(PD)を含む、TNFα又はIL1b炎症促進性サイトカインが産生される全ての神経学的疾患においてCNSで上方調節されることを示唆している。
感染部位への好中球走化性は、宿主の自然免疫防御に極めて重要である(Kubesの文献、2002)。無秩序な方向性運動は、慢性炎症などの障害(Woolhouseの文献、2002)及び他の障害を引き起こすことがある。走化性は、走化性物質の勾配によって方向付けられる遊走であり、これは、細胞外及び細胞内シグナル伝達、細胞骨格の調節、並びに細胞と細胞外マトリックスとの相互作用が関与する複雑なプロセスである(Chungの文献、2001)。好中球の遊走は、いくつかの一般的な走化性物質、例えば、細菌産物ホルミル-Met-Leu-Phe(fMLP)、並びにインターロイキン8(IL-8)及びロイコトリエンB4(LTB4)のような宿主由来産物によって導かれる(Foxmanの文献、1997; Foxmannの文献、1999; Baggioliniの文献、1998)。
好中球は、Gタンパク質共役受容体の使用を通して走化性物質の存在を感知する。このクラスの受容体は大量にあり、ゲノムのかなりの部分に相当する。主要なクラスの走化性受容体は、ホルミルペプチド-ホルミルペプチド受容体(FPR)、ケモカイン-ケモカイン受容体(CCR又はCXCR)、及びロイコトリエン-ロイコトリエン受容体(BLT)によって誘発される。
GPR84が走化性の調節に関与し得ることが示唆された(Yousefiの文献、2001)。しかしながら、この著者らは、GPR84が、IL8及びfMLPにより駆動される古典的走化性経路において役割を果たすということを提唱した。本明細書でさらに立証され、かつ本発明により例証されるように、好中球走化性におけるGPR84の役割は極めて特異的であり、古典的走化性経路とは関連しておらず、実際、GPR84アンタゴニストは、Yousefiの刊行物で提唱されている薬剤によって刺激される走化性には効果がない。
本発明は、GPR84が免疫細胞の走化性に関与するが、上記の古典的走化性経路のうちの1つによるものではないという証拠を提供する。本発明は、GPR84活性を調節し、特に、GPR84アゴニスト刺激性走化性を阻害する化合物の同定のための新規のアッセイ、並びにさらに炎症性疾患(例えば、炎症性腸疾患(IBD)、関節リウマチ、血管炎、肺疾患(例えば、慢性閉塞性肺疾患(COPD)及び間質性肺疾患(例えば、特発性肺線維症(IPF))))、神経炎症性疾患、感染性疾患、自己免疫疾患、並びに/又は免疫細胞機能の障害が関与する疾患の予防及び/又は治療において有用な化合物の同定方法を提供する。
(発明の概要)
本発明は、GPR84の活性を阻害する化合物が、免疫細胞、例えば、好中球、マクロファージ、及び樹状細胞、特に、好中球の走化性を阻害することができるという発見に基づいている。該化合物は、種々のさらなる細胞及びインビボモデルにおける該化合物の活性によって示され得るように、炎症性疾患、神経炎症性疾患、感染性疾患、自己免疫疾患、及び/又は免疫細胞機能の障害が関与する疾患の治療において有用である。特定の実施態様において、炎症性疾患は、炎症性腸疾患(IBD)、関節リウマチ、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、及び特発性肺線維症(IPF)から選択される。
本発明は、GPR84アゴニスト刺激性走化性を阻害する化合物を同定する方法であって:配列番号1のアミノ酸配列を含むGPR84ポリペプチドを発現する免疫細胞の集団を試験化合物にGPR84アゴニストの存在下で暴露させること、及び該免疫細胞の走化性の阻害に関連する特性を測定することを含む、方法を提供する。
本発明の別の態様は、炎症性疾患(例えば、炎症性腸疾患(IBD)、関節リウマチ、血管炎、肺疾患(例えば、慢性閉塞性肺疾患(COPD)及び間質性肺疾患(例えば、特発性肺線維症(IPF))))、神経炎症性疾患、感染性疾患、自己免疫疾患、並びに/又は免疫細胞機能の障害が関与する疾患の治療において有用な、治療法、医薬組成物、及びそのような組成物の製造における、本明細書に開示されるGPR84を阻害する薬剤の使用に関する。
(図面の簡単な説明)
GPR84のアミノ酸配列(配列番号1)を示す図である。
好中球遊走アッセイの設定を示す図である。
(詳細な説明)
以下の用語は、それとともに以下に提示された意味を有することが意図され、本発明の説明及び意図される範囲を理解する際に有用である。
本明細書で使用される「GPR84アゴニスト」又は「GPR84のアゴニスト」という用語は、最も広い意味においてGPR84を刺激する任意の薬剤を指す。そのような薬剤の特定の例としては、カプリン酸、ウンデカン酸、ラウリン酸、2,5-ジヒドロキシ-3-ウンデシル-2,5-シクロヘキサジエン-1,4-ジオン(エンベリン)、イコサ-5,8,11,14-テトライン酸、5S,6R-ジヒドロキシ-イコサ-7,9,11,14-テトライン酸、ジインドリルメタン、及びインドール-3-カルビノールが挙げられる。
「化合物」という用語は、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、天然産物、及び小分子を含む、任意の分子を意味する。特に、この用語は、試験化合物又は薬物候補化合物を含む。該化合物には、無機又は有機化合物、例えば、ポリヌクレオチド(例えば、siRNAもしくはcDNA)、脂質、又はホルモン類似体が含まれる。他の生体高分子有機試験化合物には、約2〜約40アミノ酸を含むペプチド及び約40〜約500アミノ酸を含むより大きいポリペプチドが含まれ、これには、ポリペプチドリガンド、酵素、受容体、チャネル、抗体、又は抗体コンジュゲートが含まれる。
本明細書で使用されるように、「自己免疫疾患」という用語は、閉塞性気道疾患(COPD(慢性閉塞性肺疾患)などの疾患を含む)、乾癬、喘息(例えば、内因性喘息、外因性喘息、塵埃性喘息、小児喘息)、特に、慢性又は難治性喘息(例えば、遅発型喘息及び気道過敏)、気管支喘息を含む気管支炎、全身性エリテマトーデス(SLE)、多発性硬化症、Ｉ型糖尿病及びそれと関連する合併症、アトピー性湿疹(アトピー性皮膚炎)、接触性皮膚炎及びさらなる湿疹性皮膚炎、血管炎、炎症性腸疾患(例えば、クローン病及び潰瘍性大腸炎)、アテローム性動脈硬化症、並びに筋萎縮性側索硬化症を含む疾患群を指す。特に、この用語は、COPD、喘息、乾癬、全身性エリテマトーデス、Ｉ型糖尿病、血管炎、及び炎症性腸疾患を指す。
「活性阻害剤(activity inhibitory agent)」又は「活性阻害剤(activity inhibiting agent)」という用語は、細胞内で通常発現される特定のポリペプチド又はタンパク質の活性又は発現を選択的に妨害し又は妨害することができるように設計された、薬剤、例えば、ポリペプチド、小分子、化合物を意味する。
「アゴニスト」という用語は、最も広い意味において、薬剤が結合する受容体を刺激する薬剤を指す。
本明細書で使用されるように、「アンタゴニスト」という用語は、受容体に結合したときに生物学的応答それ自体を誘発するのではなく、アゴニスト媒介性応答を遮断もしくは抑制するか、又はアゴニスト結合を妨害もしくは軽減し、それにより、アゴニスト媒介性応答を妨害もしくは軽減する薬剤を記述するために使用される。
「アッセイ」という用語は、化合物を含む、薬剤の具体的な特性を測定するために使用される任意のプロセスを意味する。「スクリーニングアッセイ」は、化合物をその活性に基づいて一群の化合物から特徴付け又は選択するために使用されるプロセスを意味する。
「結合親和性」という用語は、2以上の化合物が互いに非共有結合的関係でどれほど強く関連するかを記述する特性である。結合親和性は、定性的に特徴付けるか(例えば、「強い」、「弱い」、「高い」、もしくは「低い」)、又は定量的に特徴付ける(例えば、KDを測定する)ことができる。
本明細書における「古典的走化性物質」という用語は、免疫細胞、特に、好中球の走化性を誘導することが知られている任意の薬剤を指す。そのような薬剤は、様々な受容体、経路、及び機序を介して作用し得る。そのような周知の薬剤の例としては、IL8(ヒト)、KC/CXCL1(ラット)、N-ホルミルメチオニル-ロイシル-フェニルアラニン(fMLP)、LTB4、及びC5aが挙げられるが、これらに限定されない。
「複合体」という用語は、2以上の化合物が互いに結合し、接触し、又は関連したときに生成される実体を意味する。
「化合物」という用語は、本明細書において、本発明のアッセイに関連して記載される「試験化合物」又は「薬物候補化合物」との関連で使用される。したがって、これらの化合物は、合成的に誘導されるか又は天然源由来の有機又は無機化合物を含む。「疾病」又は「疾患」という用語は、症状(すなわち、病気)の顕在化、又は異常な臨床指標(例えば、生化学的指標)の徴候を意味する。或いは、「疾患」という用語は、そのような症状又は異常な臨床指標を発症する遺伝的もしくは環境リスク又はその傾向を指す。
「接触」又は「接触させる」という用語は、インビトロ系又はインビボ系に関わらず、少なくとも2つの部分を合わせることを意味する。
「ポリペプチドの誘導体」という用語は、ポリペプチドの連続するアミノ酸残基のストレッチを含み、かつタンパク質の生物学的活性を保持する、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質、及び酵素、例えば、天然形態のポリペプチドのアミノ酸配列と比べてアミノ酸突然変異を有するポリペプチドに関する。誘導体は、天然形態のポリペプチドのアミノ酸配列と比べて、追加の天然、改変、グリコシル化、アシル化、もしくは非天然アミノ酸残基をさらに含むことができる。誘導体は、天然形態のポリペプチドのアミノ酸配列と比べて、1以上の非アミノ酸置換基、又は異種アミノ酸置換基、例えば、共有結合的もしくは非共有結合的にアミノ酸配列に結合した、レポーター分子もしくは他のリガンドを含むこともできる。
本明細書で使用されるように、「免疫細胞機能の障害が関与する疾患」という用語は、再発性及び長引くウイルス及び細菌感染症、並びに遅い回復などの症状を伴う疾患を含む。他の目に見えない症状は、腸内又は全身の寄生虫、酵母、及び細菌性病原体を完全に死滅させる能力の欠如であり得る。
「内在性」という用語は、哺乳動物が天然に産生する物質を意味するものとする。Gタンパク質共役受容体(「GPCR」)という用語に関連する内在性とは、哺乳動物(例えば、限定するものではないが、ヒト)によって天然に産生されるものを意味するものとする。対照的に、これに関連する非内在性という用語は、哺乳動物(例えば、限定するものではないが、ヒト)によって天然に産生されないものを意味するものとする。どちらの用語も、インビトロ系とインビボ系の両方を記述するのに利用することができる。例えば、限定するものではないが、スクリーニング法において、内在性又は非内在性GPR84は、インビトロスクリーニング系に関するものであり得る。さらなる例として、かつ限定としてではなく、哺乳動物のゲノムが非内在性ポリペプチドを含むように操作されている場合、インビボ系による候補化合物のスクリーニングが実行可能である。内在性は、GPR84ポリペプチドのリガンドを指すこともできる。そのような天然リガンドは、細胞内に存在し、かつ細胞によって産生され得る。
「発現可能な核酸」という用語は、タンパク性分子、ペプチド、もしくはポリペプチドをコードするか、又はこれらをコードすることができる核酸を意味し、かつRNA分子又はDNA分子を含み得る。
「発現」という用語は、内在性発現と非内在性発現の両方を含み、形質導入又はトランスフェクションによる過剰発現を含む。
「ポリペプチドの断片」という用語は、連続するアミノ酸残基のストレッチを含み、かつ完全な配列と類似しているが必ずしも同一ではない機能的活性又は発現活性を実質的に示す、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質、モノマー、サブユニット、及び酵素に関する。特定の態様において、「断片」は、該完全な配列のアミノ酸配列のうちの少なくとも5アミノ酸残基(好ましくは、少なくとも10アミノ酸残基、少なくとも15アミノ酸残基、少なくとも20アミノ酸残基、少なくとも25アミノ酸残基、少なくとも40アミノ酸残基、少なくとも50アミノ酸残基、少なくとも60のアミノ残基、少なくとも70アミノ酸残基、少なくとも80アミノ酸残基、少なくとも90アミノ酸残基、少なくとも100アミノ酸残基、少なくとも125アミノ酸残基、少なくとも150アミノ酸残基、少なくとも175アミノ酸残基、少なくとも200アミノ酸残基、又は少なくとも250アミノ酸残基)のアミノ酸配列を含むペプチド又はポリペプチドを指すことができる。
「免疫細胞」という用語は、免疫応答に積極的に関与する任意の細胞を指し、そのような細胞の前駆細胞を含む。そのような細胞の起源は、ヒトに限定されるのではなく、任意の哺乳動物に限定される。免疫細胞の例としては、好中球、マクロファージ、及び樹状細胞が挙げられる。
本明細書で使用されるように、「炎症性疾患」という用語は、関節リウマチ、変形性関節症、若年性特発性関節炎、血管炎、乾癬、痛風、アレルギー性気道疾患(例えば、喘息、鼻炎)、炎症性腸疾患(例えば、クローン病、潰瘍性大腸炎)、及び内毒素誘発性疾患状態(例えば、バイパス手術後の合併症、又は例えば、慢性心不全の一因となる慢性内毒素状態)を含む、疾患群を指す。特に、この用語は、関節リウマチ、アレルギー性気道疾患(例えば、喘息)、及び炎症性腸疾患を指す。
本明細書で使用されるように、「感染性疾患」という用語は、細菌感染性疾患を指し、敗血症、菌血症性敗血症(septicemia)、内毒素血症、全身性炎症反応症候群(SIRS)、胃炎、腸炎、全腸炎、結核症、及び例えば、エルシニア属(Yersinia)、サルモネラ属(Salmonella)、クラミジア属(Chlamydia)、赤痢菌属(Shigella)、又は腸内細菌種が関与する他の感染症などの疾患を含むが、これらに限定されない。
「阻害する(inhibit)」又は「阻害する(inhibiting)」という用語は、「応答」という用語との関連において、応答が、化合物の非存在下ではなく、化合物の存在下で減少し、又は妨害されることを意味する。
「阻害」という用語は、タンパク質又はポリペプチドの発現又は活性の欠如又は最小化をもたらす、プロセスの減少、下方調節、又はプロセスに対する刺激の除去を指す。
「誘導」という用語は、タンパク質又はポリペプチドの発現、発現増強、活性、又は活性増強をもたらす、プロセスの誘導、上方調節、又は刺激を指す。
「リガンド」という用語は、内在性の天然受容体に特異的な内在性の天然分子を意味する。
「哺乳動物細胞」という用語は、哺乳動物種に由来する細胞を意味する。好ましい細胞はヒト細胞である。哺乳動物細胞としては、ネコ、イヌ、ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、ネズミ、例えば、マウス及びラット、並びにウサギが挙げられる。
本明細書で使用されるように、「神経炎症性疾患」という用語は、炎症、脱髄、及び軸索損傷と関連する突然の神経学的欠損を特徴とする疾患又は障害を指し、ギラン-バレー症候群(GBS)、多発性硬化症、軸索変性、自己免疫性脳脊髄炎などの疾患を含むが、これらに限定されない。
「ポリペプチド」という用語は、タンパク質(例えば、GPR84)、タンパク質性分子、タンパク質の断片、高分子タンパク質のモノマーもしくは部分、ペプチド、オリゴペプチド、及び酵素(例えば、キナーゼ、プロテアーゼ、GPCRなど)に関する。
「ポリヌクレオチド」という用語は、一本鎖又は二本鎖形態で、かつセンス又はアンチセンス方向のポリ核酸、ストリンジェントな条件下で特定のポリ核酸にハイブリダイズする相補的ポリ核酸、並びにその塩基対の少なくとも約60パーセントで相同であり、より具体的にはその塩基対の70パーセント、具体的には80パーセント、最も具体的には90パーセント、及び特別な実施態様において、その塩基対の100パーセントが共通であるポリヌクレオチドを意味する。ポリヌクレオチドには、ポリリボ核酸、ポリデオキシリボ核酸、及びそれらの合成類似体が含まれる。ポリヌクレオチドには、ペプチド核酸(PNA)、ポリシロキサン、及び2'-O-(2-メトキシ)エチルホスホロチオエートなどの修飾骨格を有する核酸も含まれる。別の特別な実施態様は、ペプチド核酸(PNA)、ポリシロキサン、及び2'-O-(2-メトキシ)エチルホスホロチオエートなどの修飾骨格を有するか、又は非天然核酸残基、もしくはメチル-、チオ-、スルフェート、ベンゾイル-、フェニル-、アミノ-、プロピル-、クロロ-、及びメタノカルバヌクレオシドなどの1以上の核酸置換基、もしくはその検出を容易にするレポーター分子を含む核酸である。本明細書におけるポリヌクレオチドは、特定の標的DNA配列の異なる鎖と「実質的に」相補的であるように選択される。これは、ポリヌクレオチドが、そのそれぞれの鎖とハイブリダイズするのに十分に相補的でなければならないことを意味する。したがって、ポリヌクレオチド配列は、標的配列の正確な配列を反映する必要がない。例えば、非相補的ヌクレオチド断片は、ポリヌクレオチド配列の残りが鎖に相補的であれば、ポリヌクレオチドの5'末端に付着していてもよい。或いは、非相補的塩基又はより長い配列は、ポリヌクレオチド配列がストリンジェントな条件下でそれとハイブリダイズするか、又は伸長産物の合成用の鋳型を形成するための鎖の配列との十分な相補性を有するならば、ポリヌクレオチド中に散在することができる。
「予防する」又は「予防」は、疾患の開始前に、疾患を引き起こす原因物質に暴露され又は疾患に罹る素因を有し得る対象において、疾患又は障害を獲得又は発症するリスクを低下させること(すなわち、疾患の臨床症状の少なくとも1つを発症させないこと)を指す。
「走化性を測定するのに好適な系」という用語は、細胞遊走、特に、細胞走化性を測定するのに好適な任意のアッセイ又はアセンブリとして理解されるものとする。そのようなアッセイの例が本明細書に提供されているが、それらの例は、限定とみなされるべきではない。任意の好適な走化性測定アッセイを使用することができる。
「対象」という用語は、ヒト及び他の哺乳動物を含む。
「治療する」という用語は、そのような障害又は疾病の1以上の症状を含む、障害、疾患、又は疾病の発症を予防し、又はそれらの病理を変化させ、それにより、それらを改善させることを意図して行なわれる介入を意味する。したがって、「治療する」は、治療的処置と予防的(prophylactic)又は予防的(preventative)対策の両方を指す。治療を必要とする者には、障害を既に有する者及び障害を予防すべき者が含まれる。本明細書で使用される、「治療」という関連用語は、「治療する」という用語が上で定義されているように、障害、症状、疾患、又は疾病を治療する行為を指す。
任意の疾患もしくは障害を「治療する」又は任意の疾患もしくは障害の「治療」という用語は、一実施態様において、疾患又は障害を改善させること(すなわち、疾患を止めること、又はその臨床症状のうちの少なくとも1つの徴候、範囲、もしくは重症度を低下させること)を指す。別の実施態様において、「治療する」又は「治療」は、対象によって認識されることができない、少なくとも1つの物理的パラメータを改善させることを指す。また別の実施態様において、「治療する」又は「治療」は、疾患又は障害を、物理的に調節すること(例えば、認識可能な症状の安定化)、生理的に調節すること(例えば、物理的パラメータの安定化)、又はその両方のいずれかを指す。さらなる実施態様において、「治療する」又は「治療」は、疾患の進行を遅らせることに関する。
(GPR84)
本発明は、GPR84アゴニスト(例えば、中鎖脂肪酸)が好中球走化性を誘導すること、及びGPR84アンタゴニストがこの走化性を特異的に遮断することができることを示し、Gタンパク質共役受容体84(GPR84)が好中球動員プロセスにおける必須プレーヤーであることを示している。好中球の遊走は、通常、いくつかの一般的な走化性物質、例えば、細菌産物ホルミル-Met-Leu-Phe(fMLP)、並びにインターロイキン8(IL-8)及びロイコトリエンB4(LTB4)のような宿主由来産物によって導かれる(Foxmanの文献、1997; Foxmannの文献、1999; Baggioliniの文献、1998)。好中球は、様々なGタンパク質共役受容体の使用を通して走化性物質の存在を感知する。主要なクラスの走化性受容体は、ホルミルペプチド-ホルミルペプチド受容体(FPR)、ケモカイン-ケモカイン受容体(CCR又はCXCR)、及びロイコトリエン-ロイコトリエン受容体(BLT)によって誘発される。IL8、好中球活性化因子-78、ホルミル-Met-Leu-Phe(fMLP)のような典型的な走化性物質を用いた実験により、これらがGPR84のリガンドではないことが明らかにされた(Yosefiの文献、2001)。GPR84は、他のクラスのアゴニストによって活性化され、例示的なGPR84アゴニストとしては、ナトリウムデカノエート、3,3'ジインドリルメタン、及び2,5-ジヒドロキシ-3-ウンデシル-2,5-シクロヘキサジエン-1,4-ジオン(エンベリン)が挙げられる。特に、本発明は、GPR84アンタゴニストが、IL8によって刺激される走化性を含む、古典的走化性物質によって刺激される走化性を遮断しないことを示している。これは、GPR84が、別々のかつ異なる走化性経路を介して作用するということ、及びGPR84のアゴニストが、好中球動員において果たす個々の役割を有するということを示している。
GPR84はGPCRであり、かつそのクラスに典型的であるように、細胞外ドメインと細胞内ドメインを繋ぐ7つの膜貫通ドメインを含有する。GPR84ポリペプチドは、396アミノ酸の長さを有し(図1)、膜貫通ドメイン、細胞内ドメイン、及び細胞外ドメインの予測される位置は、表1に記載されている。
表1.GPR84ポリペプチドの予測される配列特徴(情報源:UniProt)
Figure 0006169101
本発明は、GPR84アゴニスト刺激性走化性を阻害する化合物を同定する方法であって:
a.細胞集団を、試験化合物に、GPR84アゴニストの存在下、走化性を測定するのに好適な系で暴露すること;及び
b.該系における該細胞の走化性の阻害に関連する特性を測定すること
を含む、方法を提供する。
特定の実施態様において、該細胞は、それが、GPR84ポリペプチドを発現することを確認するために試験されている。特別な実施態様において、そのような細胞は、GPR84ポリペプチドを過剰発現するように改変することができる。ペプチドを過剰発現させる方法は、十分に特徴付けられており、かつ当業者に公知である。
特定の実施態様において、アッセイ法は、試験化合物のGPR84ポリペプチドへの結合をさらに調べるために、追加の測定によって補足することができる。その場合のアッセイ法は、以下の追加の工程:
a.試験化合物を、配列番号1のアミノ酸配列並びに/又は配列番号2、6、10、12、及び14からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むその断片を含むGPR84ポリペプチドと接触させる工程;並びに
b.GPR84ポリペプチドの活性及び/又は発現に関連する特性を測定する工程
を含む。
好適な対照を常に準備して、偽陽性読取りを防ぐべきである。本発明の特定の実施態様において、スクリーニング法は、化合物を好適な対照と比較する追加の工程を含む。一実施態様において、対照は、試験化合物と接触しているのではなく、単にGPR84アゴニストに暴露される細胞であってもよい。そのような実施態様の別の態様において、試験細胞は、GPR84ポリペプチドを天然に発現しており、対照細胞は、GPR84アゴニストの存在下でGPR84の既知のアンタゴニストと接触させたものであってもよい。そのようなアンタゴニストは、GPR84の発現を阻害又は妨害する化合物であることができる。そのような実施態様の別の態様において、対照細胞は、古典的走化性物質、例えば、IL8(ヒト)、KC/CXCL1(ラット)、N-ホルミルメチオニル-ロイシル-フェニルアラニン(fMLP)、LTB4、又はC5aの存在下の免疫細胞である。より具体的な実施態様において、そのような走化性物質は、IL8又はLTB4である。例示的な対照が本明細書に記載されているが、これは、限定と理解されるべきではなく;使用されている実験条件のために適切な対照を選択することは、当業者の能力の範囲内である。
アッセイ法を実施するために、好適なGPR84アゴニストを使用しなければならない。本発明の一実施態様において、GPR84アゴニストは、カプリン酸/ナトリウムデカノエート、ウンデカン酸、ラウリン酸、エンベリン、イコサ-5,8,11,14-テトライン酸、5S,6R-ジヒドロキシ-イコサ-7,9,11,14-テトライン酸、ジインドリルメタン、及びインドール-3-カルビノールからなる群から選択される。各々の特定の設定のために、正確なアッセイ設定及び条件に応じて、特異的な走化性物質を選ぶことができる。エンベリン、イコサ-5,8,11,14-テトライン酸、及び5S,6R-ジヒドロキシ-イコサ-7,9,11,14-テトライン酸は、既知のGPR84アゴニストとして、WO2007/027661号に記載されている。ジインドリルメタン(DIM)及びインドール-3-カルビノールは、GPR84アゴニストとして記載されている(Takedaの文献、2003)。より具体的な実施態様において、エンベリン又はカプリン酸は、走化性物質として使用される。
一態様において、該免疫細胞の走化性は、第二のチャンバーに遊走した細胞の数を計数することにより測定され、該計数は、直接的又は間接的に実施することができる。
免疫細胞の走化性に対する試験化合物の効果を評価するために、走化性に関連する適当な特性が測定されるべきである。好適な特性の選択は、利用可能な装置及びアッセイ設定に依存する。一般に、アッセイにとって最も重要な要件は、免疫細胞と試験化合物の両方のアッセイのインキュベーション時間を調整することである。時間が短すぎると、試料中の細胞がなくなり、一方、時間が長すぎると、濃度勾配が乱れ、走化性応答というよりはケモキネティック応答が測定される。細胞走化性を測定する一般的な技術の1つでは、2-チャンバー法が使用される。フィルターで隔離されたチャンバーは、走化性行動の正確な決定のための適切なツールである。特に、そのような特性は、チャンバーのある区画から別の区画に遊走した細胞の数についての細胞計数である。様々なチャンバーを細胞走化性の評価に使用することができ、それらは、当業者に周知であり、かつ十分に記載されている。
本発明の特定の実施態様において、遊走した細胞の数は、トランスウェル/改良型ボイデンチャンバーを用いて定量することができる。ボイデンチャンバーは、通常、細胞培養プレートのウェルの内側に入れ子になった円筒形の細胞培養インサートからなる。インサートは、底部に規定の細孔径を有する膜を含む。細胞を無血清培地中のインサートの上部に播種し、一方、走化性物質を下のウェルに入れる。細胞は、細孔から走化性物質に向かって下に移動し、染色されるか、又は別の方法で、プレートリーダーで定量されることができる。
特定の実施態様において、アッセイ法は、ボイデンチャンバーを利用し、走化性に関連する特性は、遊走した細胞の数である。遊走した細胞の数は、当業者に公知の任意の方法を用いて決定することができるが、例示的な方法としては、495nmでの光学密度測定を伴うクリスタルバイオレット染色の測定、細胞とカルセインとのプレインキュベーション及び吸光度485/535を用いた細胞数の定量、直接的な細胞計数、濁度測定、好中球エラスターゼ、CD11、又はペルオキシダーゼなどの適当な細胞マーカーレベルの測定、並びに適切に標識された好中球の利用による放射性同位体、例えば、51Crの放射能測定が挙げられる。
本発明の特定の実施態様において、アッセイ法における好中球遊走は、低速度撮影ビデオ顕微鏡法を用いて、ジグモンドチャンバーで評価することができる。ジグモンドチャンバー(Zigmondの文献、1988)において、懸濁細胞の滴をカバーガラスの中央に入れる。細胞が接着した後、接着している細胞を含む濡れた部分を残して、カバーガラスの端の水気を拭き取る。このように調製されたカバーガラスを、細胞で覆われた部分の中心が溝と溝の間のブリッジの上に位置するように、溝付きの顕微鏡スライド上に倒置する。クランプを取り付け、細胞懸濁培地及び走化性因子を、それらで満たされ、泡が残らなくなるまで、2つの溝にピペッティングで入れる。その後、チャンバーをインキュベートする。好適な期間の後(細胞型及び実験目的による)、スライドを顕微鏡下に置き、細胞の配向を観察し、定量する。遊走する細胞の内部構造を、高出力光学顕微鏡法を用いることにより調べることもできる。
特定の実施態様において、アッセイ法は、ダン走化性チャンバーを顕微鏡読出しとともに用いて実施することができる。ダン走化性チャンバーは、Zichaの文献、1991に詳細に記載されており、これにより、走化性物質の線形濃度勾配に曝された細胞の行動を光学顕微鏡で直接観察することができる。チャンバーは、良好な光学特性及び勾配の長期安定性を有するように設計され、その結果、何時間にもわたる細胞行動の経時的記録が可能になった。細胞の移動運動の軌道を得るために細胞を記録中にトラッキングする方法は、利用されるソフトウェアによって決まり、当業者は、適切な方法を選択することができる。走化性は、有向データの標準的な統計解析方法を用いて細胞遊走の有向クラスタリングを判定することにより評価することができる(Zichaらの文献、1997; Wells及びRidleyの文献、2005)。
本発明の方法を用いて同定された化合物を、他の走化性物質及び既知の走化性刺激物質の存在下でさらに試験することができる。本発明の特定の実施態様において、アッセイ法で同定された化合物が、免疫細胞のIL8刺激性走化性にもLTB4刺激性走化性にも影響を及ぼさない場合、それらをさらに選択する。
本発明の特定の実施態様において、アッセイ法は、細胞アッセイとして実施される。そのような細胞の要件は、それらがGPR84活性の変化を示す関連分子又は中間代謝物を発現及び/又は産生することである。特に、そのような細胞としては、樹状細胞、マクロファージ、及び好中球が挙げられる。特別な実施態様において、そのような細胞は好中球である。そのような細胞は、任意の哺乳動物に由来することができるが、好ましくは、齧歯類、特に、マウス及びラットに由来することができる。より具体的な実施態様において、それらの細胞は、ヒト対象に由来する。
特別な実施態様において、そのような細胞は、ヒト対象に由来する免疫系細胞である。より具体的な実施態様において、該細胞アッセイは、好ましくはヒト対象由来の好中球細胞を用いて実施される。しかしながら、そのようなものの供給源の選択は、本発明の方法がうまく実施されることにとって重要であると考えられない。GPR84を天然に発現し、かつ走化性機能を示す代替の任意の哺乳動物細胞を利用することができる。
細胞の集団は、様々な手段により、例えば、培地中での直接インキュベーションにより、化合物又は化合物の混合物に暴露することができる。
本発明で提供されるさらなる方法は、細胞アッセイで実施される場合、細胞の下流メディエーター又はアクチベーターを含む、GPR84の活性又は発現のいずれかに基づく様々なGPR84活性測定を利用することができる。
GPCRファミリーのメンバーとして、GPR84は、エフェクタータンパク質を活性化し、細胞内のセカンドメッセンジャーレベルを変化させることができる。GPR84の活性は、そのようなセカンドメッセンジャーの活性レベルを測定することにより測定することができる。1つの重要かつ有用な細胞内セカンドメッセンジャーは、環状AMP(cAMP)である。活性レベルは、ELISAもしくは放射能による技術によって直接的に、又はレポーター遺伝子解析によって間接的に、当業者に公知の方法により測定することができる。1以上のセカンドメッセンジャーの活性レベルは、通常、プロモーターによって制御されるレポーター遺伝子を用いて決定することができ、その場合、プロモーターは、セカンドメッセンジャーに応答性である。そのような目的のために当技術分野で知られかつ使用されるプロモーターは、細胞内の環状AMPレベルに応答する環状AMP応答性プロモーターである。レポーター遺伝子は、通常、容易に検出される遺伝子産物を有する。レポーター遺伝子は、宿主細胞内に、安定に感染させるか、又は一過性にトランスフェクトすることができる。有用なレポーター遺伝子は、アルカリホスファターゼ、高感度緑色蛍光タンパク質、不安定化緑色蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ、及びβ-ガラクトシダーゼである。
GPR84ポリペプチドの活性又は発現を測定する1つの特定の手段は、該ポリペプチドの量を抗体などのポリペプチド結合剤を用いて決定すること、又は該ポリペプチドの活性を生物学的もしくは生化学的尺度で決定することである。ポリペプチドの活性又は発現を測定するさらなる手段は、試験化合物で処理した細胞によって放出されるGPR84活性の下流バイオマーカーの量及び程度を決定することである。
本発明の一態様において、GPR84の活性に関連する特性は、細胞内のGPR84の発現レベルである。GPR84遺伝子発現(mRNAレベル)は、当業者に周知の技術を用いて測定することができる。そのような技術の特定の例としては、ノーザン解析又はリアルタイムPCRが挙げられる。これらの方法は、試料中のGPR84をコードする核酸の存在を示すものであり、したがって、ポリヌクレオチドからの転写物の発現と関連がある。
或いは、シグナル伝達分子の発現レベルは、定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応(Q-PCR/qPCR/qrt-PCR)を用いて測定することができる。qPCRは、PCRに基づく実験技術であり、これは、標的とされるDNA分子を増幅させ、かつ同時に定量するために使用される。DNA試料中の1以上の特異的配列について、リアルタイムPCRにより、検出と定量の両方が可能になる。量は、絶対コピー数又はDNA投入量もしくは追加の正規化遺伝子に対して正規化したときの相対量のいずれかであることができる。
GPR84ポリペプチドを試験化合物と接触させることを含む方法の特定の工程を、GPR84タンパク質、又はモノマー、ペプチド、及びオリゴペプチドを含むその断片のうちの1つ又は複数を用いて、インビトロで実施することができる。
本発明の特定の実施態様において、試験化合物は、スクリーニングライブラリーの化合物及びGPR84ポリペプチドに対する結合親和性を有する化合物からなる群から予め選択される。そのような化合物ライブラリーは、市販されているか、又は特定のGPCRクラスのポリペプチドについて自前で作成することができる。
本発明の特定の実施態様において、上記のアッセイ法は、アッセイ条件のあり得るバリエーションを含め、試験化合物のGPR84ポリペプチドに対する結合親和性のさらなる測定により補足することができる。特別な実施態様において、そのような方法は、以下の追加の工程:
a.該化合物を、配列番号1のアミノ酸配列を含むGPR84ポリペプチド並びに配列番号2、6、10、12、及び14からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むその断片と接触させる工程;
b.該化合物の該GPR84ポリペプチド又はその断片に対する結合親和性を測定する工程;並びに
c.該ポリペプチドに対する所望のレベルの結合親和性を有する化合物を選択する工程
を含む。
より具体的な実施態様において、少なくとも10μMの結合親和性を有する化合物をさらに選択する。
GPR84ポリペプチド及び細胞外空間に露出した断片の両方を利用することができる。そのような断片は、GPR84に対する抗体を試験するときに有用であり得る。
化合物とGPR84ポリペプチドとの結合親和性は、当技術分野で公知の方法によって、例えば、表面プラズモン共鳴バイオセンサー(Biacore(登録商標))を用いて、標識化合物を用いる飽和結合解析(例えば、Scatchard及びLindmo解析)により、示差UV分光光度計、蛍光偏光アッセイ、蛍光イメージングプレートリーダー(FLIPR(登録商標))システム、蛍光共鳴エネルギー転移、及び生体発光共鳴エネルギー転移により測定することができる。化合物の結合親和性は、解離定数(Kd)で、又はIC50もしくはEC50として表すこともできる。IC50は、ポリペプチドに対する別のリガンドの活性の50％阻害に必要とされる化合物の濃度を表す。EC50は、標的(TARGET)機能を測定する任意のアッセイで最大効果の50％を得るのに必要とされる濃度を表す。解離定数Kdは、リガンドがポリペプチドにどのくらいよく結合するかの尺度であり、これは、ポリペプチド上の結合部位のちょうど半分を飽和させるのに必要とされるリガンド濃度に相当する。高親和性結合を有する化合物は、例えば、100nM〜1pMの範囲の低いKd、IC50、及びEC50値を有し;中等度〜低親和性結合は、例えば、マイクロモル濃度範囲の高いKd、IC50、及びEC50値に関する。
本明細書に記載される本発明の実施において有用なGPR84ポリペプチドは、溶液中に遊離していても、固体支持体に取り付けられていても、細胞表面に担持されていても、細胞内にあってもよい。本方法を実施するために、GPR84ポリペプチド又は化合物のいずれかを固定して、複合体化していない形態のポリペプチドからの複合体の分離を容易にすること、及びアッセイの自動化を取り入れることが実現可能である。GPR84ポリペプチドと化合物との相互作用(例えば、結合)は、反応物を収容するのに好適な任意の容器中で達成することができる。そのような容器の例としては、マイクロタイタープレート、試験管、及び微小遠心管が挙げられる。一実施態様において、ポリペプチドがマトリックスに結合するのを可能にするドメインを付加する融合タンパク質を提供することができる。例えば、GPR84ポリペプチドを「His」タグ化して、その後、Ni-NTAマイクロタイタープレートに吸着させることができ、又はGPR84ポリペプチドとのProtA融合体をIgGに吸着させることができ、その後、これを、細胞溶解物(例えば、(35)S標識したもの)及び候補化合物と組み合わせ、混合物を複合体形成に有利な条件下で(例えば、塩及びpHについての生理的条件下で)インキュベートする。インキュベーション後、プレートを洗浄して、未結合の標識を除去し、マトリックスを固定する。放射能の量は、直接、又は複合体の解離後の上清中で決定することができる。或いは、複合体をマトリックスから解離させ、SDS-PAGEで分離し、GPR84タンパク質に対するタンパク質結合のレベルを標準的な電気泳動技術を用いてゲルから定量することができる。
タンパク質をマトリックス上に固定する他の技術は、化合物を同定する方法でも使用することができる。さらに、GPR84又は化合物のいずれかを、ビオチンとストレプトアビジンのコンジュゲーションを利用して固定することができる。ビオチン化GPR84タンパク質分子を、当技術分野で周知の技術(例えば、ビオチン化キット, Pierce Chemicals, Rockford, Ill.)を用いてビオチン-NHS(N-ヒドロキシ-スクシンイミド)から調製し、ストレプトアビジンコーティングした96ウェルプレート(Pierce Chemical)のウェル中で固定することができる。或いは、GPR84と反応するが、GPR84と化合物との結合を妨害しない抗体をプレートのウェルに誘導体化することができ、GPR84を、抗体コンジュゲーションにより、該ウェル中で捕捉することができる。上記のように、標識された候補化合物の調製物を、GPR84を提示するプレートのウェル中でインキュベートし、該ウェル中で捕捉された複合体の量を定量することができる。
当業者の選択に応じて、本アッセイ法を、一連の測定として機能するように設計することができ、該測定の各々は、薬物候補化合物がGPR84ポリペプチドに作用し、それにより、走化性を調節するかどうかをさらに確認するように設計される。例えば、化合物のポリペプチド又はその断片に対する結合親和性を決定するように設計されたアッセイは有用であり得るが、それは、1つの例示的アッセイであっても、試験化合物がGPR84ポリペプチドを介して作用していることを確認するための追加の及びより具体的もしくは特異的なアッセイの中の1つのアッセイであってもよい。
これらの測定を行なう順序は、本発明の実施に重要であるとは考えられず、それは、どの順序で実施されてもよい。例えば、まず、化合物のGPR84ポリペプチドに対する結合親和性に関して情報が不明である1組の化合物のスクリーニングアッセイを実施してもよい。或いは、GPR84ドメインに対する結合親和性を有することが確認されている1組の化合物、又はポリペプチドの阻害剤であることが確認されている1群の化合物をスクリーニングしてもよい。しかしながら、本アッセイが最終的な薬物候補化合物の使用にとって有意義であるために、試験化合物によるGPR84アゴニスト刺激性走化性の阻害の測定が不可欠であると考えられる。GPR84活性に対する効果を測定、評価、又は決定する手段は、当業者により選択又は決定されることができる。それでも、ポリペプチドに対する結合親和性の制御及び測定又は本発明のポリペプチド活性もしくは発現の調節を含む検証試験は、任意の治療的又は診断的用途において有用な化合物を同定する際に有用である。
様々な実施態様において、試験化合物のGPR84への結合は、反応物を収容するのに好適な任意の容器中で達成することができる。そのような容器の例としては、マイクロタイタープレート及び試験管が挙げられる。GPR84ポリペプチドがマトリックスに結合するのを可能にするドメインを付加する融合タンパク質を提供することができる。例えば、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ(GST)融合タンパク質をグルタチオンセファロースビーズ(Sigma Chemical; St. Louis, Mo.)又はグルタチオン誘導体化マイクロタイタープレートに吸着させ、その後、これを試験化合物と組み合わせ、混合物を複合体形成に有利な条件下で(例えば、塩濃度及びpHについての生理的条件で)インキュベートする。インキュベーション後、ビース又はマイクロタイタープレートウェルを洗浄して、未結合の成分を除去し、複合体形成を直接的又は間接的に測定する。
特定の薬物候補化合物は低分子量化合物である。例えば、500ダルトン以下の分子量を有する低分子量化合物は、生体系での吸収及び透過が優れている可能性が高く、結果的に、500ダルトンを超える分子量を有する化合物よりも良好な薬物候補である可能性が高い(Lipinskiらの文献、2001))。ペプチドは、別の特定のクラスの薬物候補化合物を含む。ペプチドは優れた薬物候補であり得、生殖ホルモン及び血小板凝集阻害因子などの、商業的に有用なペプチドの複数の例がある。天然化合物は、別の特定のクラスの薬物候補化合物である。そのような化合物を天然源に見出し、天然源から抽出し、その後、これを合成することができる。脂質は、別の特定のクラスの薬物候補化合物である。
提供された方法は、ペプチドをファージディスプレイライブラリー又は抗体断片ライブラリーで用いて実施することができる。ハイスループット目的のために、抗体断片ライブラリー、ペプチドファージディスプレイライブラリー、ペプチドライブラリー(例えば、LOPAPTM, Sigma Aldrich)、脂質ライブラリー(BioMol)、合成化合物ライブラリー(例えば、LOPACTM, Sigma Aldrich, BioFocus)、又は天然化合物ライブラリー(Specs, TimTec, BioFocus)などの、化合物のライブラリーを使用することができる。
別の特定のクラスの薬物候補化合物は抗体である。本発明は、GPR84に対する抗体も提供する。これらの抗体は、細胞内でGPR84、もしくはその細胞外ドメインのうちの1つに結合するように内在性に産生させるか、又は細胞の外側に存在するGPR84ポリペプチドに結合するように組織に添加することができる。これらの抗体は、モノクローナル抗体であっても、ポリクローナル抗体であってもよい。本発明は、キメラ抗体、単鎖抗体、及びヒト化抗体、並びにFab断片及びFab発現ライブラリーの産物、Fv断片及びFv発現ライブラリーの産物を含む。別の実施態様において、化合物は、天然の単一ドメイン抗体の最小機能断片であるナノボディであってもよい(Cortez-Retamozoらの文献、2004)。抗体には、単独又は任意の組合せの、単一の可変ドメインを含むドメイン抗体(dAb)断片;ラクダ科抗体;単離された相補性決定領域(CDR);単鎖Fv断片;ダイアボディ(これは、VH及びVLドメインが単一のポリペプチド鎖上に発現されるが、同じ鎖上の2つのドメイン間の対合を可能にするには短すぎるリンカーを使用することによって、これらのドメインが別の鎖の相補性ドメインと対合することを強いられ、2つの抗原結合部位を作り出している二価二重特異性抗体である);線状抗体(これは、1対の抗原結合領域を相補性軽鎖ポリペプチドとともに形成する1対のタンデムFvセグメント(VH-CH1-VH-CH1)を含む);並びに重鎖及び/もしくは軽鎖の他の非全長部分、又はそれらの突然変異体、変異体、もしくは誘導体が含まれる。
ある実施態様において、ポリクローナル抗体を本発明の実施において使用することができる。ポリクローナル抗体を調製する方法は、当業者に周知である。ポリクローナル抗体は、例えば、免疫剤、及び望ましい場合、アジュバントの1回以上の注射によって、哺乳動物で惹起することができる。通常、免疫剤及び/又はアジュバントは、複数回の皮下又は腹腔内注射によって動物に注射される。抗体は、無傷のGPR84タンパク質又はポリペプチドに対して、或いはGPR84タンパク質もしくはポリペプチドの断片、コンジュゲートを含む誘導体、もしくは他のエピトープ、例えば、細胞膜に埋め込まれているGPR84、又は抗体可変領域のライブラリー、例えば、ファージディスプレイライブラリーに対して作製することもできる。
免疫剤を、免疫されている哺乳動物で免疫原性であることが知られているタンパク質にコンジュゲートすることが有用である場合がある。そのような免疫原性タンパク質の例としては、キーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシチログロブリン、及び大豆トリプシン阻害因子が挙げられるが、これらに限定されない。利用し得るアジュバントの例としては、フロイント完全アジュバント及びMPL-TDMアジュバント(モノホスホリルリピドA、合成トレハロースジコリノミコレート)が挙げられる。当業者は、過度の実験をすることなく、免疫プロトコルを選択することができる。
いくつかの実施態様において、抗体は、モノクローナル抗体であってもよい。モノクローナル抗体は、当該分野で周知の方法を用いて調製することができる。本発明のモノクローナル抗体は、宿主が該抗体に対する免疫応答を開始するのを防ぐために「ヒト化する」ことができる。「ヒト化抗体」は、相補性決定領域(CDR)並びに/又は軽鎖及び/もしくは重鎖可変ドメインフレームワークの他の部分が非ヒト免疫グロブリンに由来するが、該分子の残りの部分は1以上のヒト免疫グロブリンに由来する抗体である。ヒト化抗体には、ドナーもしくはアクセプターの未修飾軽鎖もしくはキメラ軽鎖と関連しているヒト化重鎖を特徴とする抗体も含まれるし、又はその逆の抗体も含まれる。抗体のヒト化は、当技術分野で公知の方法によって達成することができる(例えば、Mark及びPadlanの文献(1994)「第4章.モノクローナル抗体のヒト化(Chapter 4. Humanization of Monoclonal Antibodies)」、実験薬学ハンドブック(The Handbook of Experimental Pharmacology) 第113巻, Springer-Verlag, New York参照)。トランスジェニック動物を用いて、ヒト化抗体を発現させてもよい。
ヒト抗体は、ファージディスプレイライブラリーを含む当技術分野で公知の様々な技術を用いて産生することもできる(Hoogenboom及びWinterの文献(1991) J. Mol. Biol. 227:381-8; Marksらの文献(1991). J. Mol. Biol. 222:581-97)。Coleら及びBoernerらの技術もヒトモノクローナル抗体の調製に利用可能である(Coleらの文献(1985) モノクローナル抗体及び癌治療(Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy), Alan R. Liss, p. 77; Boernerらの文献(1991). J. Immunol., 147(1):86-95)。
単鎖抗体の産生のための当技術分野で公知の技術を、本発明のGPR84ポリペプチド及びタンパク質に対する単鎖抗体を産生するために適合させることができる。該抗体は、一価抗体であってもよい。一価抗体を調製する方法は、当技術分野で周知である。例えば、1つの方法は、免疫グロブリン軽鎖及び修飾された重鎖の組換え発現を含む。重鎖架橋を防ぐために、重鎖を、通常、Fc領域の任意の点で切断する。或いは、関連するシステイン残基を、別のアミノ酸残基と置換するか、又は架橋を防ぐために欠失させる。
二重特異性抗体は、少なくとも2つの異なる抗原に対する、及び特に、細胞表面タンパク質もしくは受容体もしくは受容体サブユニットに対する結合特異性を有する、特にヒトの又はヒト化されたモノクローナル抗体である。この場合、該結合特異性のうちの1つは、GPR84の1つのドメインに対するものであり、他の1つは、同じGPR84の別のドメインに対するものである。
二重特異性抗体を作製する方法は、当技術分野で公知である。従来、二重特異性抗体の組換え産生は、2つの免疫グロブリン重鎖/軽鎖対の共発現に基づいており、その場合、2つの重鎖は、異なる特異性を有する（Milstein及びCuelloの文献(1983) Nature 305:537-9）。免疫グロブリン重鎖及び軽鎖の組合せがランダムであるため、これらのハイブリドーマ(クアドローマ)は、10種の異なる抗体分子の潜在的混合物を産生し、そのうちの1つだけが正しい二重特異性構造を有する。親和性クロマトグラフィー工程は、通常、正しい分子の精製を達成する。同様の手順は、Trauneekerらの文献(1991) EMBO J. 10:3655-9に開示されている。
上で示され、実施例によって実証されているように、GPR84を阻害し、かつ本明細書に開示される方法を用いて同定される化合物は、炎症性疾患(例えば、炎症性腸疾患(IBD)、関節リウマチ、血管炎、肺疾患(例えば、慢性閉塞性肺疾患(COPD)及び間質性肺疾患(例えば、特発性肺線維症(IPF))))、神経炎症性疾患、感染性疾患、自己免疫疾患、並びに/又は免疫細胞機能の障害が関与する疾患の治療に有用な、治療法、医薬組成物、及びそのような組成物の製造おいて有用である。
本発明を以下の図面及び実施例においてさらに説明する。
上記のように、GPR84は、炎症応答調節の重要な成分であると思われ、特に、免疫細胞、より具体的には、好中球の走化性のプロセスに影響を及ぼす。以下のアッセイは、化合物ライブラリーと組み合わせて使用したとき、炎症性疾患の治療において有用な化合物の発見に有用である。
実施例1は、様々な細胞型におけるGPR84発現プロファイリングの結果を示したものである。
実施例2は、走化性を阻害する化合物を、GPR84活性を阻害することにより同定する方法を示したものである。
実施例3は、GPR84活性化の決定に有用な細胞ベースのアッセイを記載したものである。
同定された本発明の化合物のインビボ活性を以下のインビボ効力炎症モデルで示した:
実施例4は、選択された化合物のインビボ試験を記載し、好中球遊走アッセイで同定された化合物のインビボ効果を示したものである。
実施例5は、同定された化合物の効果をCOPDマウスモデル(マウスのタバコの煙モデル)でさらに示したものである。
(実施例1.GPR84発現プロファイリング)
(ヒト単球由来マクロファージ及び樹状細胞におけるGPR84発現)
PBMC画分を、密度勾配技術により、バフィーコートから単離した。単球を、MACS技術による陽性選択(CD14+細胞選択)を用いて、PBMC画分から単離した。
単球由来マクロファージ分化のために、細胞を96ウェルプレートに播種し、細胞をM-CSF(200ng/mL)の存在下で5日間培養することにより、分化を開始させた。単球由来樹状細胞については、細胞をフラスコに播種し、GM-CSF(90ng/ml)及びIL-4(20ng/mL)の存在下で5日間培養することにより、分化を開始させた。一旦分化したら、細胞を100ng/mL LPSで刺激した。単球由来マクロファージについては、LPSを細胞に直接添加した。単球由来樹状細胞については、細胞を回収し、U底プレートに20000細胞/ウェルで播種した。その後、LPSトリガーを細胞に添加した。処理期間の最後に、上清を破棄し、細胞をRLTバッファー中で溶解させ、解析するまで-80℃で保存した。
(ヒト好中球におけるGPR84発現)
ヘパリン添加チューブに新たに回収した血液を等容量の氷冷DPBSで希釈する。20mLの希釈した血液を4mLのACDバッファー(140mMクエン酸、200mMクエン酸ナトリウム、及び220mMデキストロース)と穏やかに混合する。その後、12mLのデキストラン/NaCl(6％デキストラン/0.9％NaCl)溶液を混合物に添加し、試料を最大20回穏やかに反転させる。全容量を新しい受容器(recipient)に移し、二相の完全な分離が生じるように、室温で1時間インキュベートする。その後、黄色がかった上清を、清潔な遠心分離チューブに移し、1300rpm及び4℃で12分間遠心分離する。遠心分離後、上清を廃棄し、赤血球溶解が生じるように、残存する細胞ペレットを12mLの氷冷H2Oに速やかに再懸濁させる。20秒後、4mLの氷冷した0.6M KClを添加する。試料を慎重に混合し、1300rpm、4℃で6分間遠心分離する。上清を廃棄し、赤血球溶解手順をもう1回繰り返す。その後、細胞ペレットを4mLのDPBSに再懸濁させ、15mL遠心分離チューブ中の5mLのLymphoprep(商標)上に重層する。1500rpm、4℃で30分間遠心分離した後、上清を除去し、好中球を含む細胞ペレットを細胞培養培地(RPMI＋1％Glutamax＋10mM Hepes＋10％HI FBS)に再懸濁させる。5,000,000/mLの200μLの細胞を、100ng/mL LPSを含むウェル(96ウェルプレート)に播種する。37℃、5％CO2、98％湿度で4又は24時間インキュベートした後、試料をマイクロチューブに移し、遠心分離する。ペレットをRLTバッファー(Qiagen)に再懸濁させ、解析するまで-80℃で保存する。
(T細胞におけるGPR84発現)
脾臓を雌マウスBALB/cJから回収し、ピストンを用いて脾臓を破砕することにより、脾細胞の細胞懸濁液を単離する。遠心分離(300×g、10分間)後、CD4+CD62L+ T細胞を、供給元のプロトコル(Miltenyi Biotec)に従って、MACS技術で単離する。
Th17極性化のために、500,000個のCD4+CD62L+ T細胞を、3日間、37℃、5％CO2、98％湿度で、抗マウスCD3ε(5μg/mL)で一晩コーティングした24ウェル培養プレート中、TGF-β1(2.5ng/mL)、IL6(20ng/mL)、抗マウスIFN-γ(10μg/mL)、抗マウスIL4(10μg/mL)、及び抗マウスCD28(1μg/mL)の存在下でインキュベートする。インキュベーション期間の最後に、細胞を回収し、遠心分離し、100ng/mL LPSを含むウェル(24ウェルプレート)に播種する。37℃、5％CO2、98％湿度で4又は24時間インキュベートした後、試料をマイクロチューブに移し、遠心分離する。細胞ペレットをRLTバッファー(Qiagen)に再懸濁させ、解析するまで-80℃で保存する。
Th1分化のために、500,000個のCD4+CD62L+ T細胞を、4日間、37℃、5％CO2、98％湿度で、抗マウスCD3ε(5μg/mL)で一晩コーティングした24ウェル培養プレート中、IL2(10ng/mL)、IL12(20ng/mL)、抗マウスIL4(20μg/mL)、及び抗マウスCD28(6μg/mL)の存在下でインキュベートする。インキュベーション期間の最後に、細胞を回収し、遠心分離し、37℃、5％CO2、98％湿度での2日間の拡大の間、IL2(5ng/mL)を含むウェル(24ウェルプレート)に播種する。その後、細胞を回収し、遠心分離し、100ng/mL LPSを含むウェル(24ウェルプレート)に播種する。37℃、5％CO2、98％湿度で4又は24時間インキュベートした後、試料をマイクロチューブに移し、遠心分離する。細胞ペレットをRLTバッファー(Qiagen)に再懸濁させ、解析するまで-80℃で保存する。
Th2分化のために、500,000個のCD4+CD62L+ T細胞を、4日間、37℃、5％CO2、98％湿度で、抗マウスCD3ε(5μg/mL)で一晩コーティングした24ウェル培養プレート中、IL2(10ng/mL)、IL4(4ng/mL)、抗マウスIFN-γ(10μg/mL)、抗マウスIL12(10μg/mL)、及び抗マウスCD28(6μg/mL)の存在下でインキュベートする。インキュベーション期間の最後に、細胞を回収し、遠心分離し、37℃、5％CO2、98％湿度での2日間の拡大の間、IL2(5ng/mL)を含むウェル(24ウェルプレート)に播種する。その後、細胞を回収し、遠心分離し、100ng/mL LPSを含むウェル(24ウェルプレート)に播種する。37℃、5％CO2、98％湿度で4又は24時間インキュベートした後、試料をマイクロチューブに移し、遠心分離する。細胞ペレットをRLTバッファー(Qiagen)に再懸濁させ、解析するまで-80℃で保存する。
(ラット好中球におけるGPR84発現)
20mLのグリコーゲン(0.1％、w/v)を腹腔内注射してから24時間後、好中球を25mLのPBSバッファーによる腹腔洗浄により回収する。滲出液を、1150rpmで10分間、4℃で遠心分離する(低速ブレーキ)。上清を除去し、細胞を、50mL Falconチューブ中の12mLの氷冷した蒸留水に懸濁させる。10〜20秒後、4mLの0.6M KClを添加し、数回混合する。Falconチューブを50mLまでPBSで満たす。チューブを、1300rpmで6分間、4℃で遠心分離する(高速ブレーキ)。上清を除去し、ペレットを、Falconチューブ当たり4mLのPBSに再懸濁させる。4mLの細胞懸濁液を、15mL Falconチューブ中の5mLのLymphoprep(商標)上に重層し、低速ブレーキを用いて、1500rpmで30分間、4℃で遠心分離する。回転させた後、上清を、滅菌先端による穏やかな吸引を用いて取り除き、細胞を細胞培養培地(RPMI＋1％Glutamax＋10mM Hepes＋10％HI FBSに再懸濁させる。5,000,000/mLの200μLの細胞をウェルに播種し、5μLのRPMI又は100ng/mL LPSを添加する。37℃、5％CO2、98％湿度で4又は24時間インキュベートした後、試料をマイクロチューブに移し、遠心分離する。ペレットをRLTバッファーに再懸濁させ、解析するまで-80℃で保存した。
(全RNA調製及びRT-QPCRによるGPR84発現の解析)
RNeasy Miniキット(Qiagen)を製造業者の指示に従って用いて、全RNAを抽出する。cDNAを、cDNA逆転写キット(Applied Biosystems)を用いて調製し、Q-PCRを、GPR84、及びハウスキーピング遺伝子としてのGAPDH用のSYBRGreenプライマーを用いて実施する。データ解析のために、GPR84対ハウスキーピング遺伝子GAPDHのΔCt値を計算する(ΔCt＝Ct GPR84−Ct GAPDH)。
Figure 0006169101
(実施例2.ヒト好中球遊走阻害アッセイ)
本発明者らは、GPR84アゴニスト(MCFA、例えば、ナトリウムデカノエート、3,3'ジインドリルメタン、及びエンベリン)が好中球走化性を誘導すること、並びにGPR84アンタゴニストが、GPR84アゴニスト刺激性走化性を遮断することができるが、IL8刺激性走化性を遮断することがないことを示し、これにより、Gタンパク質共役受容体84(GPR84)が好中球動員プロセスにおける必須プレーヤーであることが示された。したがって、GPR84のアゴニスト又はアンタゴニストの作用は、好中球遊走試験でアッセイすることができる。好中球遊走アッセイでは、ヒト志願者由来のバフィーコートから新たに単離された好中球を化合物で30分間処理する。その後、好中球を、Corning HTSトランスウェル96透過性サポートシステムの上のウェルに移す。該サポートシステムの下のウェルには、エンベリン溶液が満たされている。1時間インキュベートした後、下の区画中のエンベリンへと向かう好中球の遊走を、ATPliteルミネセンスATP検出アッセイシステム(Perkin Elmer, カタログ番号:436110)を用いて、下のウェルのATP含量を測定することにより定量することができる。
(ヒトバフィーコートからの好中球の単離)
ヒトのバフィーコートを等容量の氷冷DPBSで希釈する。20mLの希釈したバフィーコートを、4mLのACDバッファー(140mMクエン酸、200mMクエン酸ナトリウム、及び220mMデキストロース)と穏やかに混合した。その後、12mLの6％デキストラン/0.9％NaCl溶液(250mL H2Oに溶解させた15gデキストランT2000及び2.25g NaCl)をこの混合物に添加し、試料を最大20回穏やかに反転させる。全容量を新しい受容器(recipient)に移し、二相の完全な分離が生じるように、室温で1時間インキュベートする。その後、黄色がかった上清を、清潔な遠心分離チューブに移し、1300rpm及び4℃で12分間遠心分離する。遠心分離後、上清を廃棄し、赤血球溶解が生じるように、残存する細胞ペレットを12mLの氷冷H2Oに速やかに再懸濁させる。20秒後、4mLの氷冷した0.6M KClを添加する。試料を慎重に混合し、1300rpm、4℃で6分間遠心分離する。上清を廃棄し、赤血球溶解手順をもう1回繰り返す。その後、細胞ペレットを4mLのDPBSに再懸濁させ、15mL遠心分離チューブ中の5mLのLymphoprep(Nycomed Pharma, カタログ番号:1114545)上に重層する。1300rpm、4℃で12分間遠心分離した後、上清を除去し、好中球を含む細胞ペレットを、25mLの走化性バッファー(10mM HEPESを補充したRPMI 1640培地;各実験用に新たに作製されたもの)に再懸濁させる。
(遊走アッセイ)
1ミリリットル当たり8.9×106細胞の細胞懸濁液を調製する。走化性バッファー中の20μLの化合物溶液を180μLの細胞懸濁液に添加する。混合物を、15分後の細胞の再懸濁を間に挟んで、37℃で30分間インキュベートする。この後、70μLの細胞懸濁液を、5.0μmの細孔径のポリカーボネートメンブレンを備えたCorning HTSトランスウェル96透過性サポートシステム(Corning, カタログ番号:3387)の上の区画に移す。その後、該トランスウェルシステムのレシーバーウェルを、化合物及び走化性物質(エンベリン)を含む200μLの走化性バッファーで満たす。5％CO2中、37℃で1時間インキュベートした後、トランスウェルシステムの上のプレートを取り外し、レシーバープレート中の細胞懸濁液を、96ウェルV底プレートに移す。50μLのDPBSをレシーバープレートに添加して、残存する細胞の乾燥を防ぐ。該V底プレートを1500rpmで6分間遠心分離する。上清を除去し、細胞を50μLのDPBSに再懸濁させる。その後、細胞をトランスウェルシステムのレシーバープレートに戻す。この後、100μLのATPlite溶液(Perkin Elmer, カタログ番号:436110)を細胞に添加する。プレートを、振盪させながら、暗所で10分間インキュベートする。その後、170μLの細胞溶解液を白色96ウェルプレートに移し、発光を測定する。検出された発光シグナルは、上のウェルからレシーバーウェルに遊走した細胞の数に線形相関するものとみなされる。
また、上記のものと同じアッセイを、エンベリンの代わりにIL8(25ng/mL)を走化性物質として用いて実施する。
試験化合物の様々な濃度での走化性阻害の比較結果を表4に示す。試験化合物の構造を表3に記載する。カプリン酸を走化性物質として用いた同様の実験から類似の結果が得られる(データは示さない)。
表3．
Figure 0006169101
Figure 0006169101
Figure 0006169101
表4.様々な試験化合物を用いたIL8及びエンベリン誘導性走化性の阻害の結果
Figure 0006169101
(実施例3.ラット好中球遊走アッセイ)
GPR84のアゴニスト又はアンタゴニストの作用は、ラット由来の好中球を用いて、好中球遊走試験でアッセイすることができる。ラット好中球遊走アッセイでは、グリコーゲン(0.1％、w/v)の腹腔内注射後のラットから新たに単離された好中球を化合物で30分間処理する。その後、好中球を、Corning HTSトランスウェル96透過性サポートシステムの上のウェルに移す。該サポートシステムの下のウェルには、EC80(GPR84の活性の80％を生じさせる濃度)のエンベリン溶液が満たされている。1時間インキュベートした後、下の区画中のエンベリンへと向かう好中球の遊走を、Cell Titer Glow Substrateアッセイシステム(Promega, カタログ番号:G755B)を用いて、下のウェルのATP含量を測定することにより定量することができる。
(ラットからの好中球の単離)
グリコーゲン(0.1％、w/v)を腹腔内注射してから24時間後、細胞を25mL HBSSによる腹腔洗浄により回収し、その後、1300rpm及び4℃で12分間遠心分離する。遠心分離後、上清を廃棄し、赤血球溶解が生じるように、残存する細胞ペレットを12mLの氷冷H2Oに速やかに再懸濁させる。20秒後、4mLの氷冷した0.6M KClを添加する。試料を慎重に混合し、1300rpm、4℃で6分間遠心分離する。上清を廃棄し、細胞ペレットを4mLのDPBSに再懸濁させ、15mL遠心分離チューブ中の5mLのLymphoprep(Axis Shield, カタログ番号:1114544)上に重層する。1500rpm、4℃で30分間遠心分離した後、上清を除去し、好中球を含む細胞ペレットを、5mLの走化性バッファー(10mM HEPESを補充したRPMI 1640培地;各実験用に新たに作製されたもの)に再懸濁させる。
(好中球遊走アッセイ)
1ミリリットル当たり8.9×106細胞の細胞懸濁液を調製する。走化性バッファー中の10μLの化合物溶液を90μLの細胞懸濁液に添加する。混合物を、15分後の細胞の再懸濁を間に挟んで、37℃で30分間インキュベートする。この後、75μLの細胞懸濁液を、5.0μmの細孔径のポリカーボネートメンブレンを備えたCorning HTSトランスウェル96透過性サポートシステム(Corning, カタログ番号:3387)の上の区画に移す。その後、該トランスウェルシステムのレシーバーウェルを、化合物及び走化性物質(エンベリン)を含む200μLの走化性バッファーで満たす。5％CO2中、37℃で1時間インキュベートした後、トランスウェルシステムの上のプレートを取り外し、70μLのCell Titer Glow Substrate(Promega, カタログ番号:G755B)をレシーバープレートに添加する。レシーバープレートを、振盪させながら、暗所で10分間インキュベートする。その後、180μLの細胞溶解液を白色96ウェルプレートに移し、発光を測定する。検出された発光シグナルは、上のウェルからレシーバーウェルに遊走した細胞の数に線形相関するものとみなされる。
(実施例4.機能的GPR84活性化アッセイ: GTP-γS結合アッセイ)
以下のアッセイをGPR84活性化の決定に使用することができる。[35S]GTPγS結合アッセイは、GPCRのアゴニスト占有後のGタンパク質活性化のレベルを、非加水分解性類似体[35S]GTPγSのGαサブユニットへの結合を決定することにより測定するものである。
本アッセイは、以下の試薬が添加された96ウェルプレートで実施される。まず、50μLの化合物をアッセイプレートに添加し、その後、20μLの3,3'ジインドリルメタンをEC80濃度(GPR84の活性の80％を生じさせる濃度)で添加する。最終工程で、膜-GTPγS-SpAビーズからなる30μLの混合物を添加する[混合物は、GPR84を過剰発現している安定細胞株から得られる20μg/ウェルの膜(膜は、0.1μM GDPとともに4℃で15分間プレインキュベートする)、0.1nM [35S]GTPγS(Perkin Elmer, NEG030)、及び0.5mg/ウェルのPVT-WGA SpAビーズ(Perkin Elmer, RPNQ0001)からなる]。全ての成分を、20mM Hepes pH 7.4; 5mM MgCl2; 250mM NaCl; 0.05％BSA; 75ug/mLサポニンを含むアッセイバッファーに希釈する。反応液を室温で90分間インキュベートし、その後、2000rpmで15分間遠心分離する。遠心分離後すぐに、プレートをTopcountリーダー(Perkin Elmer)で読み取る(読取時間、1分/ウェル)。実施例2の好中球遊走アッセイで同定された化合物についてのEC50測定の結果を下の表5に記載する。
表5.GPR84 GTP-γS結合アッセイで測定されたEC50値
Figure 0006169101
(実施例5.インビボIBDモデル)
実施例2に記載のアッセイ法、又は本明細書中の他の方法を用いて同定された化合物を、既知の疾患モデルを用いてインビボでさらに検証することができる。マウス慢性DSS誘導性炎症性腸疾患モデル(IBD)は、炎症性腸疾患の十分に検証された疾患モデルである(Wirtz S.らの文献、2007 Nature Protocols 2, 541-546; Sina C.らの文献、2009 J. Immunol. 183 7514-7522)。
慢性結腸炎を誘導するために、雌BALB/cマウスに、飲用水に溶解させた4％デキストラン硫酸ナトリウム(DSS)を4日間与え、その後、通常の飲用水を3日間与える。このサイクルを3回繰り返す。このプロトコルにより、高死亡率を回避しつつ、強い結腸炎を誘導することが可能になる。動物をいくつかの群に分ける:
無傷群(水;ビヒクルのみ、n＝10)、
罹患群(DSS;ビヒクルのみ、n＝10)、
参照として使用されるスルファサラジン群(DSS;スルファサラジン、p.o.、n＝10)、及び
試験化合物群(DSS;試験化合物、p.o.、n＝10)。
臨床パラメータを1日おきに測定する。疾患活動性指標(DAI)は、体重減少、便の硬さ、及び直腸出血についての個々のスコアを組み合わせた合成尺度である。マウスを、Sinaらの文献(2009)に導入されているプロトコルに従って、実験20日目に屠殺する。屠殺時に、結腸全体を摘出し、滅菌PBSですすぐ。遠位結腸分節を、組織学的解析、遺伝子発現及びタンパク質レベルの測定のために解剖する。
走化性アッセイで活性があると同定された化合物のいくつかをIBDモデルで試験した。スルファサラジン及び/又は試験化合物で処置した群は、慢性炎症性腸疾患に対する防護効果を示した(データは示さない)。
(実施例6.インビボでのマウス煙モデル試験)
C57BL/6Jマウス系統にタバコの煙(TS)を連続4日間毎日暴露すると、肺の炎症が引き起こされ、これは、最後の暴露から24時間後、同様に処置された空気に暴露された群と比較したとき、気管支肺胞洗浄液(BAL)中に回収される全細胞数の増加により示された。
試験化合物を検討するために、動物をいくつかの群:無傷群(処置なし、n＝5)、罹患群(TS;ビヒクルのみ、n＝10)、参照としてのロフルミラスト群(TS;ロフルミラスト、n＝10)、及び試験化合物群(TS; 試験化合物、p.o.、n＝10)に分ける。4日間毎日のTSへの毎回の暴露の1時間前及び6時間後に、試験化合物又はビヒクルを経口(p.o.)投与する。4日目の最後に、マクロファージ、上皮細胞、好中球、及び白血球の数をBAL中で計数する。BALを、遺伝子発現及びタンパク質レベルについてさらに解析した。肺組織を、組織学的解析、遺伝子発現及びタンパク質レベルの測定のために解剖する。
実施例2に記載の走化性アッセイで同定された化合物のいくつかを、このモデルを用いて検証した。細胞の総数は有意に減少したが、とりわけ、BAL中に存在する好中球の数は有意に減少した。いくつかの場合、阻害率は、好中球数について約60％であり、参照のロフルミラストと類似していた(データは示さない)。
(参考文献)
Figure 0006169101
前述の説明から、本発明の組成物及び方法の様々な修正及び変更が当業者に思い浮かぶであろう。添付の特許請求の範囲の範囲内に入る全てそのような修正は、その中に含まれることが意図される。
限定されないが、本明細書中に引用される特許及び特許出願を含む、全ての刊行物は、各々の個々の刊行物が、あたかも完全に示されているように引用により本明細書中に組み込まれていることが具体的にかつ個別的に示されているかのように、引用により本明細書中に組み込まれる。

Claims (20)

  1. GPR84アゴニスト刺激性走化性を阻害する化合物を同定する方法であって:
    a.配列番号1のアミノ酸配列を含むGPR84ポリペプチドを発現する細胞集団を、試験化合物に、GPR84アゴニストの存在下、走化性を測定するのに好適な系で暴露すること;
    b.該系における該細胞の走化性の阻害を測定することであって、遊走した細胞の数を測定すること
    を含む、前記方法。
  2. 以下の工程:
    c.前記化合物を、配列番号1のアミノ酸配列を含むGPR84ポリペプチド、及び/又は配列番号2、6、10、12、又は14からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むその断片と接触させる工程;並びに
    d.GPR84ポリペプチドの活性又は発現を測定する工程であって、該GPR84ポリペプチドの活性又は発現が、
    i. 試験化合物で処理された細胞によって放出されるGPR84活性の下流バイオマーカー又はメッセンジャー分子の量によって、又は
    ii. ポリペプチド結合剤を用いてGPR84の量を測定することによって、又は
    iii. 細胞内のGPR84の発現レベルを測定することによって
    決定される、前記工程
    をさらに含む、請求項1記載の方法。
  3. 前記試験されるべき化合物を対照と比較する工程をさらに含む、請求項1又は2のいずれか一項記載の方法。
  4. 前記対照が、IL8(ヒト)、KC/CXCL1(ラット)、N-ホルミルメチオニル-ロイシル-フェニルアラニン(fMLP)、LTB4、又はC5aからなる群から選択される走化性物質の存在下の細胞である、請求項3記載の方法。
  5. 前記対照が、走化性物質の存在下、GPR84ポリペプチドの既知のアンタゴニストに暴露された免疫細胞である、請求項3記載の方法。
  6. 前記対照が、走化性物質のみに暴露された、GPR84ポリペプチドを発現する免疫細胞である、請求項3記載の方法。
  7. 前記化合物が、さらに、IL8刺激性走化性も、LTB4刺激性走化性も阻害しない、請求項1記載の方法。
  8. 前記細胞が、樹状細胞、マクロファージ、及び好中球からなる群から選択される免疫細胞である、請求項1記載の方法。
  9. 前記細胞が好中球である、請求項6記載の方法。
  10. 前記メッセンジャー分子が、環状AMP（cAMP）である、請求項2記載の方法。
  11. 前記GPR84アゴニストが、カプリン酸、ウンデカン酸、ラウリン酸、2,5-ジヒドロキシ-3-ウンデシル-2,5-シクロヘキサジエン-1,4-ジオン(エンベリン)、イコサ-5,8,11,14-テトライン酸、5S,6R-ジヒドロキシ-イコサ-7,9,11,14-テトライン酸、ジインドリルメタン、及びインドール-3-カルビノールを含む群から選択される、請求項1記載の方法。
  12. 前記GPR84アゴニストが、2,5-ジヒドロキシ-3-ウンデシル-2,5-シクロヘキサジエン-1,4-ジオン(エンベリン)又はカプリン酸である、請求項11記載の方法。
  13. 遊走した細胞の数が、改良型ボイデンチャンバーを用いて同定され、かつ前記測定が、495nmにおけるクリスタルバイオレットの光学密度の測定、カルセインとともにプレインキュベートされた細胞の場合の485/535nmにおける吸光度の測定、ATPの測定、直接的な細胞計数、濁度測定、好中球エラスターゼ、CD11 好中球のペルオキシダーゼなどの細胞特異的マーカーの測定、及び放射性同位体計数からなる群から選択される、請求項1記載の方法。
  14. 前記測定が、前記チャンバーにおけるATPレベルの変化である、請求項13記載の方法。
  15. 遊走した細胞の数が、ジグモンドチャンバーを用いて同定され、かつ前記測定が、低速度撮影ビデオ顕微鏡法を用いた観察である、請求項1記載の方法。
  16. 遊走した細胞の数が、ダン走化性チャンバーを用いて同定され、かつ前記測定が顕微鏡の読出しである、請求項1記載の方法。
  17. 前記測定が細胞計数である、請求項13、15、又は16記載の方法。
  18. 前記化合物が、スクリーニングライブラリーの化合物及び配列番号1によるGPR84ポリペプチドに対する結合親和性を有する化合物からなる群から選択される、請求項1〜5のいずれか一項記載の方法。
  19. 以下の工程:
    a.前記化合物を、配列番号1のアミノ酸配列を含むGPR84ポリペプチド、並びに/又は配列番号2、6、10、12、及び14からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むその断片と接触させる工程;
    b.前記GPR84ポリペプチド又はその断片に対する前記化合物の結合親和性を測定する工程;並びに
    c.前記ポリペプチドに対する所望のレベルの結合親和性を有する化合物を選択する工程
    をさらに含む、請求項1〜18のいずれか一項記載の方法。
  20. 少なくとも10μMの結合親和性を有する化合物が選択される、請求項19記載の方法。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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EP3403649A1 (en) 2017-05-16 2018-11-21 Bayer Pharma Aktiengesellschaft Inhibitors and antagonists of gpr84 for the treatment of endometriosis
CN108569953B (zh) * 2018-06-07 2021-08-17 中国科学院昆明植物研究所 茵陈三炔醇类化合物及其药物组合物和其用途
JP7705966B2 (ja) * 2021-06-21 2025-07-10 武漢人福創新薬物研発中心有限公司 Ｇｐｒ８４アンタゴニストとしての三環式化合物

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP4360915B2 (ja) * 2002-01-07 2009-11-11 ユーロスクリーン・ソシエテ・アノニム Ｇタンパク質共役受容体ｇｐｒ４３のリガンドおよびその使用
WO2005050225A2 (en) * 2003-10-31 2005-06-02 Bayer Healthcare Ag Diagnostics and therapeutics for diseases associated with g protein-coupled receptor 84 (gpr84)
EP1929310A2 (en) 2005-09-02 2008-06-11 Arena Pharmaceuticals, Inc. Human g protein-coupled receptor and modulators thereof for the treatment of atherosclerosis and atherosclerotic disease and for the treatment of conditions related to mcp-1 expression
AU2008220419A1 (en) * 2007-02-28 2008-09-04 The Procter & Gamble Company Methods and targets for identifying compounds for regulating rhinovirus infection
US7674891B2 (en) * 2008-08-01 2010-03-09 International Flavors & Fragrances Inc. Nucleic acid molecules encoding GPR84
WO2010097600A1 (en) * 2009-02-27 2010-09-02 Cambridge Entreprise Limited Improved methods for identification

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