JP6038167B2 - 口腔疾患を予防及び治療する組成物及び方法 - Google Patents

Description

本発明は、口腔内疾患を予防及び治療するために組成物を使用する方法に関する。本発明は更に、組成物を口腔に適用することにより、鉄封鎖糖タンパク質と、キレート剤と、薬学的に許容可能な賦形剤とを含む組成物を配合する方法に関する。より具体的には本発明は、リポソーム系又はナノ粒子送達系のいずれかを用いて、ＰＥＧ化又はフッ素化鉄封鎖糖タンパク質と１つ又は２つのキレート剤とを含有する薬学的に許容可能な配合物を送達する有効な方法に関する。

［関連出願の相互参照］
本願は、２０１１年１０月３１日付けで提出された米国特許出願第６１／５５３，５０６号、２０１２年５月２日付けで提出された同第６１／６４１，５０３号、及び２０１２年６月１日付けで提出された同第６１／６５４，４９０号のそれぞれに対する利益及び優先権を主張するものである。

上述の特許出願の内容は引用することにより、明確に本明細書の詳細な説明の一部をなす。

歯垢は、宿主の細胞外マトリクスに埋包される歯表面上に見られる微生物の多様なコミュニティ及び微生物ポリマーである。歯垢の重要な環境的影響は、嫌気性細菌の定着及び成長を促す低酸素環境の発生である。微生物は歯垢内で、口腔環境に存在する豊富な多糖類、糖タンパク質及び食事性糖類（例えばスクロース）からスライムマトリクス（slime matrix）又はグリコカリックス（バイオフィルム）を合成する。最終的に歯垢は、遺伝子発現を大きく変える、高度に構造化され、マトリクスに埋包された多様な微生物集団を含む特徴的な歯科バイオフィルムとなる。

歯垢は歯石の前兆である。歯石、すなわちタータ（tartar）は、唾液、食べかす及びミネラルの存在によって形成される、歯上の硬化（石灰化）した歯垢の構築を指す。成熟歯石は、骨、エナメル質及び象牙質に類似するヒドロキシアパタイト結晶格子構造で配置された、大部分がリン酸カルシウムである無機部分からなっている。有機部分も存在しており、剥離上皮細胞、白血球、唾液沈渣、食べかす及び様々なタイプの微生物からなっている。歯石の粗表面によって、歯茎の健康を脅かすとともに、天然歯よりも容易に非審美的な汚れを取り込む、細菌成長にとって理想的な媒体がもたらされる。

歯垢は歯茎線の上（歯肉縁上）及び下（歯肉縁下）に発生し得る。歯肉縁上の歯垢は歯上に清掃後数時間以内に形成される。スクロースを豊富に含む食事の存在下では、歯肉縁上の歯垢はより多くの酸産生歯垢へと移行し、結果として齲蝕となる。歯肉縁下の歯表面の上に形成され、歯肉溝の上皮内膜（epithelium lining）を覆う歯垢によって、歯周感染（すなわち歯肉炎及び歯周炎）が発症する。

齲蝕は、歯のミネラル部分の溶解を特徴とするものであり、これにより費用を掛けて歯の修復及び摘出が必要となる、歯の痛み及び生存能力の低下が起こり得る。齲蝕は米国において、５歳〜９歳の児童の５０％、１２歳〜１７歳の青年の６７％、及び１８歳の成人の９４％が罹患している（非特許文献１）。歯の清掃によって虫歯にならないようにすることができるが、精力的に清掃したとしても、歯を十分に清潔に保つことは難しい。例えばフッ化ナトリウム、ケイフッ化ナトリウム又はケイフッ化水素酸の飲料水への添加、及びフッ化ナトリウム又はフッ化スズの局所製剤（歯磨剤及びマウスリンスを含む）への添加を含む、齲蝕を予防又は緩和する様々な方法が開発されている。歯にポリマー材料又はシーラントをコーティングすることによる齲蝕の予防が用いられているが、これらの技法はコストがかかり、リン酸による歯のエッチングが必要とされ、未だ齲蝕が発生していない幼児でのみ有効であり得る。抗生物質を含む抗菌剤も齲蝕の治療として提唱されている。

口腔連鎖球菌及びアクチノミセス種が、歯の表面に現れる最初の細菌である。連鎖球菌は唾液細菌のおよそ２０％を占め、これにはストレプトコッカス・ミュータンス（Streptococcus mutans）、ストレプトコッカス・ソブリナス（Streptococcus sobrinus）、ストレプトコッカス・サングイス（Streptococcus sanguis）、ストレプトコッカス・ゴルドニ（Streptococcus gordonii）、ストレプトコッカス・オラリス（Streptococcus oralis）及びストレプトコッカス・ミチス（Streptococcus mitis）等のストレプトコッカス種が含まれる。ストレプトコッカス・ミュータンス（S. mutans）、ストレプトコッカス・ソブリナス（S. sobrinus）、ストレプトコッカス・サングイス（S. sanguis）及びストレプトコッカス・オラリス（S. oralis）の４種の連鎖球菌が齲蝕の発生に直接関与するが、ストレプトコッカス・ミュータンスが齲蝕の主要原因菌であると考えられている（非特許文献２）。日和見病原体としての役割に併せて、口腔内での生存及び持続に関するバイオフィルムのライフスタイルに応じてストレプトコッカス・ミュータンスが発達することから、ストレプトコッカス・ミュータンスは、バイオフィルムを形成する病原連鎖球菌の最も研究されている例となっている（非特許文献３）。

歯垢内の細菌は、歯肉炎、慢性進行性歯周炎及び壊死性歯周病の主因である。歯肉（歯茎）は歯の周囲の口内の軟組織内膜の一部である。歯肉炎は多くの場合、歯茎の腫脹、発赤又は出血として現れる歯茎の炎症である。一般的に、口内に及び歯表面上に生存する歯垢を形成する細菌が歯肉炎の原因であり、細菌が放出する或る特定の物質が歯茎の炎症を引き起こすと考えられている。そのため、歯垢細菌を低減することで、炎症物質を減少させるとともに、歯肉炎の低減をもたらすことができる。研究から、口腔衛生処理を行わないと、歯垢の蓄積が起こり、１０日〜２１日以内に歯肉炎を発症することが分かっている。米国の成人のおよそ８０％に歯茎／歯周病の症状がある。歯肉炎は日常のオーラルケアによって予防可能であるが、治療しないと歯周炎として知られる重度の歯茎疾患を引き起こす場合がある。歯周炎は、歯垢誘導性の炎症によって支持組織及び骨を破壊する一連の感染を特徴とするものである。慢性歯周炎は、米国の成人集団のおよそ２０％が罹患している最も一般的な型である。症状には、深い歯周ポケットの形成、歯肉退縮、歯の動揺の増大、及び放射線写真により検出される骨量の低下が含まれる。治療をせずに放っておくと、歯周炎によって歯を喪失する場合がある。

アグレガチバクター・アクチノミセテムコミタンス（Aggregatibacter actinomycetemcomitans）（Ａａ）は、限局性及び全身性の思春期前歯周炎、限局性及び全身性の若年性歯周炎、並びに急速進行性又は難治性の成人歯周炎を含む早発性歯周炎の主要原因菌である。歯の喪失は破壊的歯周病の究極の有害な影響である。米国の全国調査から、０．５３％という限局性の若年性歯周炎及び０．１３％という全身性の若年性歯周炎の有病率が明らかになっている（非特許文献４）。多くの研究の所見から、早発性の疾患は、他の先進工業国では同程度であり、発展途上国ではより高頻度であるという結論が裏付けられている（非特許文献４）。加えて、概して成人集団の半分を超える人が罹患している非常に一般的な病態である或る特定のタイプの成人歯周炎が、口腔に常在する微生物の選択群によって引き起こされる可能性がある。

さらに、歯石の形成を抑制する又は形成後に歯石を除去するのに、多様な化学的及び生物学的な作用物質が提唱されている。ピロリン酸塩及び他の化学的作用物質に、歯石の形成を抑制する能力があることが知られている。例えば、特許文献１及び特許文献２には、歯での歯垢及び歯石の形成を抑えるのにジアンヒドロヘキシトールのモノアルキルエステル又はジアルキルエステルを使用することが記載されている。特許文献３には、歯垢、並びに歯及び歯茎の感染を低減するのにｎ−ウンデシレン脂肪酸又はそのカルシウム塩若しくは亜鉛塩を使用することが記載されている。特許文献４には、歯垢の形成を低減するのに有効なスピロ１−（ヒドロキシアルキル）−ピペリジノ誘導体が記載されている。

加えて、特許文献５には、アレキシジンジヒドロフルオリドが歯垢、歯石、歯肉炎及び関連する歯周病の治療に有用であることが開示されている。特許文献６には、塩化亜鉛又は他の許容可能な亜鉛塩のグリセリン溶液が、歯肉及び歯に適用される場合に歯肉炎に有効な治療を与えることが開示されている。特許文献７には、歯石の予防、齲蝕の除去、及び歯垢の溶解のための歯科における歯を治療する方法であって、アルカリ金属及び／又はアルカリ土類金属のヒポクロリットと、水溶性の非粘膜刺激性（non-mucous irritating）Ｎ−クロロ誘導体及び／又はＮ−ジクロロ誘導体を形成することが可能なアミノ化合物とを含む水溶液を歯に適用することを含む、方法が教示されている。

歯肉炎を低減する現在の予防手段には、歯垢防止練り歯磨き又はタータ防止練り歯磨きの使用並びにマウスリンス及びフロスの使用等の良好な口腔衛生が含まれる。これらの製品は沈着物／細菌を歯から遊離させるとともに除去して、歯を清潔にする。歯肉炎の治療には、高頻度の入念な歯のブラッシング及びフロッシングに加えて、抗菌洗口液を使用することができる。このタイプの洗口液には通常、ヘキセチジン、ジグルコン酸クロルヘキシジン、又は塩化セチルピリジニウムが含まれる。このタイプの製品の目的は、微生物及び細菌の量又は影響を低減することである。

テトラサイクリンは、早発性歯周炎の治療に広く使用されている。しかしながら、テトラサイクリンに対する耐性を生じる株、及び他の病原微生物の過剰成長の可能性への懸念が依然として存在する。歯周病の発生を考慮して、安全な予防戦略及び治療戦略が当該技術分野において必要とされている。全身疾患（例えば冠動脈性心疾患）のリスク因子としての歯周感染の考えられる役割に対する昨今の関心を鑑みると、歯周病の制御も非常に重要である。そのため早発性歯周炎、限局性及び全身性の若年性歯周炎、並びに急速進行性又は難治性の成人歯周炎を治療及び予防する方法が当該技術分野において必要とされている。

成分の１つがワックス、活性成分及び陽イオン性脂質で構成されるナノ粒子を囲む感湿バリア層である多成分粒子の形成によるオーラルケア化合物の送達が特許文献８に開示されている。特許文献９には、練り歯磨き又はオーラルリンス製品等の多様なオーラルケア組成物における次亜塩素酸ナトリウムの安定化が開示されている。反応性の高い次亜塩素酸ナトリウムの安定化は、最終組成物のｐＨを少なくとも１０以上とすることによって達成される。これは、ポリホスフェート等のｐＨ感受性成分を含み得るオーラルケア組成物にとって重大な制限である。

概して、化学的及び生物学的な作用物質には、歯又は舌の変色、口腔粘膜の落屑及び痛み、不快な味覚、毒性等といった幾つかの欠点があり、さらに口腔細菌叢の不均衡が引き起こされる場合もある。加えて、市販されているオーラルケア製品におけるほぼ全ての化学的及び生物学的な活性剤は、抗菌／抗微生物活性及び／又はバイオフィルム抑制活性を有するものである。換言するとこれらの作用物質は、既に存在している歯科バイオフィルム（歯垢）中の細菌には有効ではない。このため、抗微生物活性と、バイオフィルム阻害及び破壊活性とを兼ね備える活性成分を含有する生物学的に安全かつ有効なオーラルケア製品を開発することが必要とされている。

米国特許第４，９９９，１８４号 米国特許第４，６１０，８７１号 米国特許第４，１７８，３６３号 米国特許第４，１１９，７１１号 米国特許第３，８８７，７１２号 米国特許第４，１６０，８２１号 米国特許第４，０６０，６００号 米国特許第６，５８９，５６２号 米国特許第６，６９６，０４７号

Morbidity and Mortality Weekly Reports 51: 144-147, 2002 Devulapalle et al., Carbohydr. Res. 339: 1029-1034, 2004 Burne, R. A., J. Dent. Res. 77: 445-452, 1998 Loe & Brown, J. Periodontol. 62:608-616 (1991)

オーラルケア化合物をオーラルケア組成物に効果的に組み込むのに当該技術分野において有効な送達系が依然として必要とされている。オーラルケア組成物においてこれらの特質を達成することができる送達系のタイプの１つが吸着性のナノ粒子又はマイクロ粒子送達系である。

本発明は、齲蝕、歯肉炎、歯周炎、齲蝕、及び口腔細菌感染又は口腔細菌疾患等の口腔内疾患を予防及び／又は治療することにより口腔健康を維持する組成物及び方法を提供する。

本発明の一実施形態は、（ａ）鉄封鎖糖タンパク質と、（ｂ）１つ又は２つのキレート剤とを含む組成物を提供する。

別の実施形態において、本発明の組成物は、（ａ）少量の少なくとも１つの鉄封鎖糖タンパク質と、（ｂ）少量の少なくとも１つのキレート剤とを含み、ここで成分（ａ）及び成分（ｂ）のそれぞれの量が、口腔内の細菌感染に対して効果的な感染防止組成物を形成するのに十分なものである。

更に別の実施形態において、本発明の組成物は、（ａ）少量の少なくとも１つの鉄封鎖糖タンパク質と、（ｂ）少量の少なくとも１つのキレート剤と、（ｃ）薬学的に許容可能な賦形剤とを含む。

本発明の更に別の実施形態は、鉄封鎖糖タンパク質と、齲蝕、歯肉炎及び歯周炎等の口腔疾患を引き起こす細菌及び真菌に対して有効な１つ又は２つのキレート剤とを含む感染防止組成物を提供する。該組成物は口腔疾患関連細菌に対して有効である。

本発明の更なる実施形態は、鉄封鎖糖タンパク質と、脊椎動物の口腔疾患に関連する細菌に対して有効な１つ又は２つのキレート剤とを含む感染防止組成物を提供する。

一実施形態では、鉄封鎖糖タンパク質は、組成物１Ｌ当たり約５０ｍｇ〜１Ｌ当たり約５００ｍｇである。キレート剤は組成物１Ｌ当たり約４００ｍｇ〜１Ｌ当たり約４０００ｍｇである。

鉄封鎖糖タンパク質は、ホロ−オボトランスフェリン及びアポ−オボトランスフェリン、ホロ−ラクトフェリン又はアポ−ラクトフェリン、並びにセロトランスフェリンからなる群から選択され得る。キレート剤は、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、ＤＴＰＡ、ＥＤＤＨＡ、ＩＤＡ、ＣＤＴＡ、ＨＥＤＴＡ、ＨＥＩＤＡ、ＮＴＡ、クエン酸ナトリウム、クエン酸カリウム及びクエン酸亜鉛からなる群から選択され得る。

別の実施形態では、鉄封鎖剤がアポ−オボトランスフェリンであり、キレート剤がＥＤＴＡ二ナトリウムである。アポ−オボトランスフェリンが約１ｍｇ／ｍｌで存在し、ＥＤＴＡ二ナトリウムが約２ｍｇ／ｍｌで存在することができる。

更に別の実施形態では、鉄封鎖剤がラクトフェリンであり、キレート剤がＥＤＴＡ二ナトリウムである。ラクトフェリンが約０．０５ｍｇ／ｍｌで存在し、ＥＤＴＡ二ナトリウムが約２ｍｇ／ｍｌで存在することができる。

更に別の実施形態では、鉄封鎖剤がラクトフェリンであり、キレート剤がＥＤＴＡ二ナトリウム及びクエン酸ナトリウムである。ラクトフェリンが約０．０５ｍｇ／ｍｌで存在し、ＥＤＴＡ二ナトリウム及びクエン酸ナトリウムがそれぞれ、約２ｍｇ／ｍｌ及び３ｍｇ／ｍｌで存在することができる。

本発明の更に別の実施形態は、ＥＤＴＡ二ナトリウムとクエン酸ナトリウムとを含むバイオフィルム防止−抗微生物性口腔組成物を提供する。ＥＤＴＡ二ナトリウムは、約１ｍｇ／ｍｌ、好ましくは約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約０．２５ｍｇ／ｍｌ、最も好ましくは約０．０２５ｍｇ／ｍｌ〜約０．０１０ｍｇ／ｍｌで存在し得る。クエン酸ナトリウムは、約３ｍｇ／ｍｌ、好ましくは約２ｍｇ／ｍｌ〜約１ｍｇ／ｍｌで存在し得る。

本組成物は、水、クエン酸緩衝液、安定化剤、着香料、ビタミン、ミネラル（クエン酸亜鉛、乳酸亜鉛、グルコン酸亜鉛、塩化亜鉛等）、薬草（herbals）、界面活性剤、抗微生物ペプチド、抗微生物剤及びｐＨ調整剤からなる群から選択される１つ又は複数の成分を更に含むことができる。

本発明は、経口投与に好適な配合物を多様な方法で、例えば液体、乾物（dried mass）、歯磨剤、洗口液、オーラルリンス、懸濁液、局所剤、粉末状の栄養補助食品(food supplement)、ペースト、ゲル、固形食品、包装食品、ウェハ、ロゼンジ、チューインガム等に調製する方法も教示している。配合物は、天然又は合成の香料及び食品品質の着色剤を含んでいてもよい。コーンスターチ、グアーガム、カーボポール、ポリエチレングリコール、プルロニックＦ−１２７及びキサンタンガム等の増粘剤を本発明の組成物に添加してもよい。

他の配合物は当業者にとって容易に明らかとなるであろう。本発明の組成物は、栄養補助成分(nutrient supplement component)を含むことができ、ビタミン、ミネラル、必須アミノ酸及び非必須アミノ酸、糖質、脂質、栄養素（foodstuffs）、健康補助食品(dietary supplement)等を含む既知の多様な栄養剤のいずれかを含むことができる。

本発明は、組成物中で感染防止化合物の安定性及び効力を高めるリポソーム系又はナノ粒子送達系の使用も教示している。これらの送達系は、ＰＥＧ化及び／又はフッ素化鉄封鎖糖タンパク質であるアポ−オボトランスフェリン又はラクトフェリンを、キレート剤であるＥＤＴＡ二ナトリウム及びクエン酸ナトリウムと併せて送達するのにも有用である。

齲蝕関連の歯垢を形成するストレプトコッカス・ミュータンスのバイオフィルムに対するオボトランスフェリン（ＯＴ）とエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム（ＮａＥＤＴＡ）との組合せの阻害効果を示す棒グラフである。 齲蝕関連の歯垢を形成するストレプトコッカス・ソブリナスのバイオフィルムに対するオボトランスフェリン（ＯＴ）とエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム（ＮａＥＤＴＡ）との組合せの阻害効果を示す棒グラフである。 齲蝕関連の歯垢を形成するストレプトコッカス・オラリスのバイオフィルムに対するオボトランスフェリン（ＯＴ）とエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム（ＮａＥＤＴＡ）との組合せの阻害効果を示す棒グラフである。 齲蝕関連の歯垢を形成するストレプトコッカス・サングイス（ストレプトコッカス・サングイニス）のバイオフィルムに対するオボトランスフェリン（ＯＴ）とエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム（ＮａＥＤＴＡ）との組合せの阻害効果を示す棒グラフである。 歯肉炎関連のポルフィロモナス・ジンジバリスのバイオフィルムに対するオボトランスフェリン（ＯＴ、１２５μｇ／ｍｌ）とエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム（ＮａＥＤＴＡ、２５０μｇ／ｍｌ）との組合せの阻害効果を示す棒グラフである。 歯肉炎関連のポルフィロモナス・ジンジバリスのバイオフィルムに対するオボトランスフェリン（ＯＴ、５００μｇ／ｍｌ）とエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム（ＮａＥＤＴＡ、１０００μｇ／ｍｌ）との組合せの阻害効果を示す棒グラフである。 歯周炎関連のアグレガチバクター・アクチノミセテムコミタンスのバイオフィルムに対するオボトランスフェリン（ＯＴ、１２５μｇ／ｍｌ）とエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム（ＮａＥＤＴＡ、２５０μｇ／ｍｌ）との組合せの阻害効果を示す棒グラフである。 齲蝕関連の歯垢を形成するストレプトコッカス・ミュータンスの成長及びバイオフィルム形成に対するラクトフェリン単独（ＬＴＦ、０．５ｍｇ／ｍｌ）及びエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム単独（ＮａＥＤＴＡ、２ｍｇ／ｍｌ）及びクエン酸ナトリウム単独（Ｓ．ｃｉｔ、３．２ｍｇ／ｍｌ）、並びにそれらの組合せの阻害効果を示す棒グラフである。 齲蝕関連の歯垢を形成するストレプトコッカス・サングイス（ストレプトコッカス・サングイニス）の成長及びバイオフィルム形成に対するラクトフェリン単独（ＬＴＦ、０．５ｍｇ／ｍｌ）及びエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム単独（ＮａＥＤＴＡ、２ｍｇ／ｍｌ）及びクエン酸ナトリウム単独（Ｓ．ｃｉｔ、３．２ｍｇ／ｍｌ）、並びにそれらの組合せの阻害効果を示す棒グラフである。 歯周炎関連のアグレガチバクター・アクチノミセテムコミタンスの成長及びバイオフィルム形成に対するラクトフェリン単独（ＬＴＦ、０．５ｍｇ／ｍｌ）及びエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム単独（ＮａＥＤＴＡ、２ｍｇ／ｍｌ）及びクエン酸ナトリウム単独（Ｓ．ｃｉｔ、３．２ｍｇ／ｍｌ）、並びにそれらの組合せの阻害効果を示す棒グラフである。 齲蝕関連の歯垢を形成する歯周炎関連のストレプトコッカス・ミュータンス、ストレプトコッカス・ソブリナス、ストレプトコッカス・ゴルドニ、ストレプトコッカス・サングイス（ストレプトコッカス・サングイニス）及び歯周炎関連のアグレガチバクター・アクチノミセテムコミタンスの成長及びバイオフィルムに対するラクトフェリン（ＬＴＦ、０．５ｍｇ／ｍｌ）と、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム（ＮａＥＤＴＡ、２ｍｇ／ｍｌ）と、クエン酸ナトリウム（Ｓ．ｃｉｔ、３．２ｍｇ／ｍｌ）との配合物の阻害効果を示す棒グラフである。 齲蝕関連の歯垢を形成するストレプトコッカス・ミュータンスのバイオフィルムに対するラクトフェリン（ＬＴＦ、０．５ｍｇ／ｍｌ）と、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム（ＮａＥＤＴＡ、２ｍｇ／ｍｌ）と、クエン酸ナトリウム（Ｓ．ｃｉｔ、３．２ｍｇ／ｍｌ）とを含む配合物の阻害効果を、市販のペット用オーラルケア製品（Ｐｅｔ Ｄｅｎｔａｌ、Ｓｌｕｒｐ ｎ ｆｒｅｓｈ及びＨｅａｌｔｈｙ ｍｏｕｔｈ）の阻害効果と比較して示す棒グラフである。 齲蝕関連の歯垢を形成するストレプトコッカス・サングイスのバイオフィルムに対するラクトフェリン（ＬＴＦ、０．５ｍｇ／ｍｌ）と、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム（ＮａＥＤＴＡ、２ｍｇ／ｍｌ）と、クエン酸ナトリウム（Ｓ．ｃｉｔ、３．２ｍｇ／ｍｌ）とを含む配合物の阻害効果を、市販のペット用オーラルケア製品（Ｐｅｔ Ｄｅｎｔａｌ、Ｓｌｕｒｐ ｎ ｆｒｅｓｈ及びＨｅａｌｔｈｙ ｍｏｕｔｈ）の阻害効果と比較して示す棒グラフである。 歯周炎関連のアグレガチバクター・アクチノミセテムコミタンスのバイオフィルムに対するラクトフェリン（ＬＴＦ、０．５ｍｇ／ｍｌ）と、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム（ＮａＥＤＴＡ、２ｍｇ／ｍｌ）と、クエン酸ナトリウム（Ｓ．ｃｉｔ、３．２ｍｇ／ｍｌ）とを含む配合物の阻害効果を、市販のペット用オーラルケア製品（Ｐｅｔ Ｄｅｎｔａｌ、Ｓｌｕｒｐ ｎ ｆｒｅｓｈ及びＨｅａｌｔｈｙ ｍｏｕｔｈ）の阻害効果と比較して示す棒グラフである。 ラクトフェリン（ＬＴＦ、０．５ｍｇ／ｍｌ）と、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム（ＮａＥＤＴＡ、２ｍｇ／ｍｌ）と、クエン酸ナトリウム（Ｓ．ｃｉｔ、３．２ｍｇ／ｍｌ）とを含む飲料水添加用の配合物のビーグル犬における歯垢、歯肉炎及び歯石（タータ）を低減する効果を、未処理の対照ビーグル犬と比較して示す棒グラフである。 齲蝕関連の歯垢を形成するストレプトコッカス・ミュータンスのバイオフィルムに対する可変濃度のエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム（ＮａＥＤＴＡ、１．０ｍｇ／ｍｌ、０．５ｍｇ／ｍｌ及び０．２５ｍｇ／ｍｌ）と、クエン酸ナトリウム（Ｓ．ｃｉｔ、３．２ｍｇ／ｍｌ）との組合せの阻害効果を示す棒グラフである。 齲蝕関連の歯垢を形成するストレプトコッカス・ゴルドニのバイオフィルムに対する可変濃度のエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム（ＮａＥＤＴＡ、１．０ｍｇ／ｍｌ、０．５ｍｇ／ｍｌ及び０．２５ｍｇ／ｍｌ）と、クエン酸ナトリウム（Ｓ．ｃｉｔ、３．２ｍｇ／ｍｌ）との組合せの阻害効果を示す棒グラフである。 齲蝕関連の歯垢を形成するストレプトコッカス・サングイス（ストレプトコッカス・サングイニス）のバイオフィルムに対する可変濃度のエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム（ＮａＥＤＴＡ、１．０ｍｇ／ｍｌ、０．５ｍｇ／ｍｌ及び０．２５ｍｇ／ｍｌ）と、クエン酸ナトリウム（Ｓ．ｃｉｔ、３．２ｍｇ／ｍｌ）との組合せの阻害効果を示す棒グラフである。 歯周炎関連のアグレガチバクター・アクチノミセテムコミタンスのバイオフィルムに対する可変濃度のエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム（ＮａＥＤＴＡ、１．０ｍｇ／ｍｌ、０．５ｍｇ／ｍｌ及び０．２５ｍｇ／ｍｌ）と、クエン酸ナトリウム（Ｓ．ｃｉｔ、３．２ｍｇ／ｍｌ）との組合せの阻害効果を示す棒グラフである。 齲蝕関連の歯垢を形成するストレプトコッカス・サングイス（ストレプトコッカス・サングイニス）のバイオフィルムに対する固定濃度のエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム（ＮａＥＤＴＡ、０．５ｍｇ／ｍｌ）及びクエン酸ナトリウム（Ｓ．ｃｉｔ、３．２ｍｇ／ｍｌ）と、可変濃度の乳酸亜鉛（ＺＬ、０．１０ｍｇ／ｍｌ、０．０５ｍｇ／ｍｌ、０．０２５ｍｇ／ｍｌ）とを含む配合物の阻害効果を示す棒グラフである。 歯周炎関連のアグレガチバクター・アクチノミセテムコミタンスのバイオフィルムに対する固定濃度のエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム（ＮａＥＤＴＡ、０．５０ｍｇ／ｍｌ）及びクエン酸ナトリウム（Ｓ．ｃｉｔ、３．２ｍｇ／ｍｌ）と、可変濃度の乳酸亜鉛（ＺＬ、０．１０ｍｇ／ｍｌ、０．０５ｍｇ／ｍｌ、０．０２５ｍｇ／ｍｌ）とを含む配合物の阻害効果を示す棒グラフである。 ストレプトコッカス・ミュータンスのバイオフィルムに対するエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム（ＮａＥＤＴＡ、０．２５ｍｇ／ｍｌ）とクエン酸ナトリウム（Ｓ．ｃｉｔ、３．２ｍｇ／ｍｌ）との組合せの相乗阻害効果を、個々の化合物の効果と比較して示す棒グラフである。 ストレプトコッカス・ミュータンスのバイオフィルムに対するエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム（ＮａＥＤＴＡ、０．２５ｍｇ／ｍｌ）とクエン酸ナトリウム（Ｓ．ｃｉｔ、１．６ｍｇ／ｍｌ）との組合せの相乗阻害効果を、個々の化合物の効果と比較して示す棒グラフである。 アグレガチバクター・アクチノミセテムコミタンスのバイオフィルムに対するエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム（ＮａＥＤＴＡ、０．２５ｍｇ／ｍｌ）とクエン酸ナトリウム（Ｓ．ｃｉｔ、３．２ｍｇ／ｍｌ）との組合せの相乗阻害効果を、個々の化合物の効果と比較して示す棒グラフである。 アグレガチバクター・アクチノミセテムコミタンスのバイオフィルムに対するエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム（ＮａＥＤＴＡ、０．２５ｍｇ／ｍｌ）とクエン酸ナトリウム（Ｓ．ｃｉｔ、１．６ｍｇ／ｍｌ）との組合せの相乗阻害効果を、個々の化合物の効果と比較して示す棒グラフである。

定義
「抗微生物剤」という用語は、細菌及び酵母を含むがこれらに限定されない微生物を死滅させるか又は微生物の成長を抑制する化合物又は組成物を指す。

「バイオフィルム形成」という用語は、微生物の表面への付着と、それに続く細胞の多層の発生とを指す。

「齲蝕」という用語は、発酵性糖の細菌による分解によって産生された酸による歯の組織の局所破壊を指す。齲蝕の主原因菌はストレプトコッカス・ミュータンスである。歯表面上でのストレプトコッカス・ミュータンスによる発酵性糖の分解によって、口腔組織、より具体的にはエナメル質及び象牙質を破壊する酸が生じる。

「歯垢」という用語は、細菌及び唾液を起源とするポリマーマトリクスに埋包された、歯表面に見られる多様な微生物コミュニティ（大部分は細菌である）についての総称である。さらに、「歯垢関連のストレプトコッカス・ミュータンス」は、歯垢の成分であるストレプトコッカス・ミュータンスを指す。

「歯肉炎」という用語は、結合組織を損なわない歯肉組織の炎症を指す。

「阻害」という用語は、歯垢関連の細菌（例えばストレプトコッカス・ミュータンス）の成長及びバイオフィルム形成の少なくとも低減を指す。

治療について「哺乳動物」という用語は、ヒト、家畜及び産業動物、並びに動物園の動物、スポーツ動物又はペット動物、例えばイヌ、ウマ、ネコ、ウシ、ブタ、ヒツジ等を含む哺乳動物に分類される任意の動物を指す。

「口腔疾患」という用語は、口腔を侵す疾患及び障害、又は関連する医学的病態を指す。口腔疾患としては、齲蝕、及び歯周病（例えば歯肉炎、成人歯周炎、早発性歯周炎等）が挙げられるが、これらに限定されない。

「歯周病」という用語は、歯肉溝の深化（deep gingival sulcus）を引き起こし、場合によっては歯周ポケット及び歯槽骨の欠損を生じる、歯肉組織及び／又は歯の歯根膜の炎症過程を指す。

「歯周炎」という用語は、付着の喪失を伴う歯の支持構造又は周囲構造の結合組織の炎症及び欠損を指す。

「予防法」又は「予防」という用語は、特に哺乳動物に病態の素因があることが見出されているが、まだ病態を有するとは診断されていない場合に、哺乳動物において発生する口腔細菌に関連する病態を少なくとも予防することを指す。

「被験体」という用語は、治療を必要とする哺乳動物（好ましくはヒト及びペット動物）等の生きている脊椎動物を指す。

「治療的に有効な量」という用語は、治療対象の被験体の病態（複数の場合もあり）の著しい陽性の変化をもたらすのに十分に高い組成物の量を指す。

「予防量（preventative amount）」は、本明細書で使用される場合、予防的な量（prophylactic amount）、例えば齲蝕及び関連する疾患、並びにそれらの症状を予防する又はそれらから保護するのに効果的な量と、齲蝕、関連する疾患、及びそれらの症状を緩和又は治癒するのに効果的な量とを含む。抗微生物剤と同時に本発明の方法に使用するのに適したペプチドを投与することによって、ペプチド及び／又は抗微生物剤を、抗微生物剤を唯一の活性成分として投与する場合に要求される投与量よりも少ない投与量で投与することができる。より少ない投与量の活性成分を投与することで、関連する副作用を低減することができる。

「治療」という用語は、存在する障害の更なる進行を抑える又はその病状を変える意図で行われる介入を指す。したがって、「治療」は治療的処置及び予防的手段又は予防手段の両方を指す。治療を必要とするものには、既に疾患に罹っているもの及び障害を予防する予定のものが含まれる。齲蝕に関しては、「治療すること又は治療（treating or treatment）」は、病態に少なくとも部分的に罹患している被験体、例えばヒトを含むがこれに限定されない哺乳動物におけるストレプトコッカス・ミュータンスに関連する病態の軽減を少なくとも意味する意図があり、病態の調節、阻害、及び／又は病態の緩和を含むが、これらに限定されない。

本発明は、鉄封鎖糖タンパク質と、例えば抗微生物剤／バイオフィルム防止化合物等の他の抗微生物剤、界面活性剤又は安定化剤を含むキレート剤との組合せを含む、抗微生物活性及びバイオフィルム防止活性を与える感染防止組成物を教示している。

細菌成長及びバイオフィルムの著しい阻害を達成するのに、抗微生物組成物に通常必要とされる量よりも少ない量の鉄封鎖糖タンパク質及び／又はキレート剤が用いられるように、新規な組成物では鉄封鎖糖タンパク質をキレート剤とともに組み合わせている。或る特定の用途において望ましい場合、より高濃度のこれらの化合物を使用することができる。

本発明の抗微生物組成物に使用される鉄封鎖糖タンパク質の量は２５ｍｇ／Ｌ〜２０００ｍｇ／Ｌとすることができる。この上述範囲を超える量を、使用前に希釈する濃縮生成物を調製するのに使用することができる。非濃縮生成物については、本発明に使用される鉄封鎖糖タンパク質の量は約２５ｍｇ／Ｌ〜１０００ｍｇ／Ｌであるのが好ましい。この範囲は、好ましくは約２５ｍｇ／Ｌ〜５００ｍｇ／Ｌであり、より好ましくは約２５ｍｇ／Ｌ〜１００ｍｇ／Ｌである。

キレート剤の使用量は約５００ｍｇ／Ｌ〜４０００ｍｇ／Ｌであるものとする。組成物を濃縮物として配合する場合には、この範囲を超える量を適用することができる。非濃縮生成物については、本発明に使用されるキレート剤の量は約５００ｍｇ／Ｌ〜３０００ｍｇ／Ｌであるのが好ましい。この範囲は、好ましくは約１０００ｍｇ／Ｌ〜３０００ｍｇ／Ｌ、より好ましくは約２０００ｍｇ／Ｌ〜３０００ｍｇ／Ｌである。

調製
１つの方法によって、キレート剤と鉄封鎖糖タンパク質とを含む二成分組成物を形成する場合、これらの化合物を下記のように組み合わせることができる。十分に撹拌しながら、キレート剤を水に溶解した後、鉄封鎖糖タンパク質を溶解することができる。ただし、添加順序を逆にすることができることに留意されたい。

さらに有利には、抗微生物剤／抗微生物ペプチド、抗生物質、バイオフィルム防止化合物、第四級アンモニウム化合物及び界面活性剤を、抗微生物組成物中の鉄封鎖糖タンパク質と組み合わせることもできる。本発明の組成物は、（ａ）少量の少なくとも１つの鉄封鎖糖タンパク質と、（ｂ）少量の抗微生物ペプチド又は抗生物質又はバイオフィルム防止化合物と、（ｃ）節約量の、安定化剤及び／又は界面活性剤からなる群の内の少なくとも１つの化合物とを含み、ここで成分（ａ）、成分（ｂ）及び成分（ｃ）のそれぞれの量は、合わせると、口腔内疾患の予防及び治療に効果的な感染防止組成物を形成するのに十分なものである。

組成物中の活性成分の濃度は、口腔疾患を予防又は治療するのに本発明の組成物を使用する時間を低減するように所望又は必要に応じて変動し得る。活性成分の濃度のこれらの変動は当業者によって容易に決定される。

組成物
本発明は、少なくとも１つの鉄封鎖糖タンパク質と１つのキレート剤とを含む、口腔疾患の予防又は予防法に対して改良された口腔感染防止組成物を含む。

一実施形態において、鉄封鎖糖タンパク質とキレート剤とを含む組成物は抗微生物性化合物を含む。抗微生物／バイオフィルム防止化合物とともに鉄封鎖糖タンパク質とキレート剤とを含む組成物は、口腔細菌成長及びバイオフィルム形成に対して改善された阻害効果を有する。さらに、鉄封鎖糖タンパク質とキレート剤とを含む組成物に抗微生物性化合物を添加することで、組成物を齲蝕、歯肉炎及び歯周炎に関連する口腔病原菌に対して効果的なものとすることができる。

本発明の一実施形態において、改良された口腔用抗微生物性−バイオフィルム防止組成物は、少なくとも１つの鉄封鎖糖タンパク質と、１つのキレート剤と、ベンズイミダゾール（例えばランソプラゾール及びオメプラゾール）、ポリオール（例えばキシリトール、ソルビトール等）、ポリフェノール（例えば没食子酸エピガロカテキン）、消毒剤（例えばトリクロサン、クロルヘキシジン塩、塩化セチルピリジニウム等）、抗生物質、齲蝕予防剤、及びバクテリオシン（例えばナイシン、エピデルミン、ガリデルミン（gallidermin）、シンナマイシン、ズラマイシン、ラクチシン４８１等）を含む１つ又は複数の抗微生物剤とを含む。さらに、口腔組成物は、シトレート（例えばクエン酸、クエン酸亜鉛、クエン酸ナトリウム、クエン酸カリウム等）、ミネラル（例えば塩化亜鉛、グルコン酸亜鉛、乳酸亜鉛、クエン酸亜鉛等のミネラル塩）、トリテルペノイド（例えばオレアノール酸及びウルソール酸）及びキトサン等の成分を含むことができる。

一実施形態において、組成物は抗生物質と、鉄封鎖糖タンパク質と、更に１つのキレート剤とを含む。抗生物質は既知である。抗生物質群としては、β−ラクタム阻害剤（例えばペニシリン、アンピシリン、アモキシシリン、メチシリン等）、セファロスポリン（例えばセファロチン、セファマイシン等）、アミノグリコシド（例えばストレプトマイシン、トブラマイシン等）、ポリエン（例えばアンホテリシン、ナイスタチン等）、マクロライド（例えばエリスロマイシン等）、テトラサイクリン（例えばテトラサイクリン、ドキシサイクリン等）、ニトロイミダゾール（例えばメトロニダゾール）、キノロン（例えばナリジクス酸）、リファマイシン（例えばリファンピン）、及びスルホンアミド（例えばスルファニルアミド）、芳香族ニトロ化合物（例えばクロラムフェニコール）、及びピリジン（例えばイソニアジド）が挙げられるが、これらに限定されない。

一実施形態において、組成物は、ポリフェノールと、鉄封鎖糖タンパク質と、１つのキレート剤とを含む。ポリフェノールの一例は没食子酸エピガロカテキン（ＥＧＣｇ）である。ＥＧＣｇは緑茶から単離されたカテキンであり、抗酸化活性及び免疫調節活性を有する（Matsunaga et al., 2002, Clin. Diagn. Lab. Immunol. 9: 864-871）。タイム、カシュー及びユーカリ由来のタンニン等のポリフェノールの抗微生物活性も有益なものである（Cowan, Clin. Microbiol. Rev. 12:564-582, 1999）。

一実施形態において、組成物は、ポリオールと、鉄封鎖糖タンパク質と、１つのキレート剤とを含む。糖アルコールとしても知られるポリオールは、砂糖を含まない糖質系甘味料である。ポリオールは、カルボニル基を還元して第１級又は第２級のヒドロキシル基にすることで糖質から誘導される。ポリオールとしては、ソルビトール、キシリトール、マンニトール及びマルチトールが挙げられるが、これらに限定されない。ポリオールは、歯石（タータ）及び齲蝕の前兆である歯垢に関連する口腔連鎖球菌の成長及び口腔連鎖球菌のバイオフィルム形成を制限することが知られている。

一実施形態において、組成物は、バクテリオシンと、鉄封鎖糖タンパク質と、１つのキレート剤とを含む。バクテリオシンとしてはランチバイオティクス（lantibiotics）が挙げられる。ストレプトコッカス・ミュータンスは、ミュータシンと呼ばれるバクテリオシン系抗微生物分子を産生する。ミュータシンはランチバイオティクス及び非抗生物質という２つのファミリーに分類されている。バクテリオシンの例としては、ナイシン、エピデルミン（epidermin）、ガリデルミン、シンナマイシン、ズラマイシン、ラクチシン４８１、ミュータシンＩ、Ｂ−Ｎｙ２６６及びミュータシン１１４０が挙げられるが、これらに限定されない。米国特許第６，６９９，９７０号、同第６，６９９，８３９号、同第６，４７５，７７１号、同第６，３９１，２８５号、同第６，３４２，３８５号、同第６，２１８，３６２号、及び同第５，９３２，４６９号も参照されたい。

一実施形態において、組成物は、消毒剤と、鉄封鎖糖タンパク質と、１つのキレート剤とを含む。消毒剤は身体の外表面上での微生物を死滅させる又は微生物の成長を阻害する作用物質である。消毒剤としては、トリクロサン、クロルヘキシジン塩及び塩化セチルピリジニウムが挙げられるが、これらに限定されない。

一実施形態において、組成物は、バイオフィルム防止化合物と、鉄封鎖糖タンパク質と、キレート剤とを含む。バイオフィルム防止化合物としては、ＤＮアーゼＩ、プロテイナーゼＫ、アピラーゼ、シス−２−デセン酸、アルギン酸リアーゼ、ラクトフェリン、ガリウム、及び５−フルオロウラシルが挙げられるが、これらに限定されない。

一実施形態において、組成物は、１つ又は複数の齲蝕予防剤と、鉄封鎖糖タンパク質と、１つのキレート剤とを含む。様々な齲蝕予防剤が既知であり、本発明の一実施形態に含まれる。様々な齲蝕予防剤としては、安息香酸エステル、セスキテルペンアルコール（例えばファルネソール、ネロリドール、ビサボロール及びサンタロール）、ハロゲン化カルバニリド、フェノール化合物、芳香族ハロフェノール、レゾルシノール、カテコール、ビスフェノール化合物、高ヒスチジンポリペプチド、フルオリド（フッ化ナトリウム、フッ化スズ、フッ化アミン、フルオロリン酸一ナトリウム（monosodiumfluorophosphate））、乳酸カルシウム、グリセロリン酸カルシウム、高プロリンタンパク質、非免疫原性アミノ酸セグメント、及びストレプトコッカス・ミュータンスの抗体が挙げられるが、これらに限定されない。

一実施形態において、組成物は、口腔疾患関連の細菌において成長及びバイオフィルム形成を阻害するのに効果的である。適切な環境条件下では、ストレプトコッカス・ミュータンスの個体数及び周辺の歯垢のｐＨが低下する。歯垢中に常在する最も酸耐性の生物の１つであるストレプトコッカス・ミュータンスは、この酸性環境においてその数を増やし、最終的には歯垢コミュニティの優占種となる。最終的にこの状況が歯のエナメル質の溶解を引き起こし、齲蝕の発生が起こる。感染は本発明の実施形態を用いることで調節することができる。

本発明の一実施形態は、抗酸化剤、緩衝液及び溶質等といった、対象のレシピエント内で配合物を等張にさせる他の薬学的に許容可能なビヒクル、希釈剤及び添加剤と、懸濁化剤及び増粘剤を含み得る水性及び非水性の滅菌懸濁液とを含んでいてもよい。

口腔配合物
本発明の組成物を、洗口溶液、研磨用歯磨剤ゲル、義歯洗浄剤、非研磨用歯磨剤ゲル、義歯洗浄剤又は浸漬液、義歯接着剤又はセメント、チューインガム、キャンディ、ソフトドリンク及びスポーツドリンクを含むが、これらに限定されない、口腔への該組成物の送達に好適な多様な配合物に添加することができる。かかる配合物を提供するために、本発明の組成物を１つ又は複数の口腔に許容可能な担体及び／又は賦形剤と組み合わせる。

洗口溶液、研磨用歯磨剤ゲル、義歯洗浄剤、非研磨用歯磨剤ゲル、義歯洗浄剤又は浸漬液、義歯接着剤又はセメント、チューインガム、キャンディ、ソフトドリンク、スポーツドリンクを含むが、これらに限定されない配合物と、鉄封鎖糖タンパク質及びキレート剤を含む他の口腔に許容可能な組成物とを、任意の既知の方法によってベンズイミダゾール、ポリオール、ポリフェノール、消毒剤、抗生物質、バクテリオシン、シトレート、又はトリテルペノイド、又はキトサンと組み合わせて調製することができる。

概して、口腔感染防止組成物を製造する方法は、口腔に許容可能な担体と、有効量の鉄封鎖糖タンパク質及びキレート剤の両方とを、ベンズイミダゾール、ポリオール、ポリフェノール、消毒剤、抗生物質、バクテリオシン、齲蝕予防剤、シトレート、トリテルペノイド、又はキトサンと組み合わせることを含む。

多様な担体及び賦形剤は、本発明の一実施形態による組成物を配合するのに使用することができ、既知である。かかる口腔に許容可能なビヒクルとしては、水、エタノール、ポリプロピレングリコール、グリセロール及びソルビトール等の湿潤剤、セルロース誘導体等のゲル化剤、ポリオキシプロピレン／ポリオキシエチレンブロック共重合体、Ｇａｎｔｒｅｚ（商標）等の結合剤、ピロホスフェート、ビスホスフェート、Ｃａｒｂｏｐｏｌ（商標）９３４等の増粘剤、二酸化ケイ素等のゲル安定化剤、サッカリンナトリウム等の甘味料、並びに他の認可済み香料、安息香酸ナトリウム、ソルビン酸カリウム、メチルパラベン及びエチルパラベン等の保存料、ラルリル硫酸ナトリウム、ラウロイルサルコシンナトリウム（sodium lauroyl sarcosinate）等の洗浄剤、並びに認可済みの着色料が挙げられるが、これらに限定されない。

治療方法
本発明の別の態様は、齲蝕、歯肉炎及び歯周炎を治療する方法を含む。概して、齲蝕及び歯周病は、１つ又は複数の齲蝕予防／抗微生物剤と組み合わせた、齲蝕、歯肉炎及び歯周炎に関連する口腔細菌を低減するのに効果的な量の鉄封鎖糖タンパク質及びキレート剤と被験体の口腔とを接触させることによって治療することができる。

一実施形態において、鉄封鎖糖タンパク質及びキレート剤を、担体と、活性成分として鉄封鎖糖タンパク質及びキレート剤を含む有効量の組成物とを含む、本明細書に記載の口腔に許容可能な薬剤として配合する。

本発明の口腔組成物の例示的な服用方法（dosing regime）は、糖を含む食餌又は食品を被験体が摂取する度に被験体（動物又はヒト）の口腔に組成物を適用することである。例えば一般的に人は１日に１回〜３回は糖を含む食品を摂取する。この実施形態によれば、被験体は、齲蝕を阻害若しくは治療する日常的な口腔衛生管理プログラムの一環として、歯肉炎を予防若しくは治療する常法として、又は歯周病を予防若しくは治療する常法として、糖含有食品又は飲料を消費した直後に１日１回〜３回、本発明の組成物を口腔に適用する。動物又はペットについては、本発明の組成物を、１日１回飲料水若しくは食餌において、又は１日１回歯をブラッシングするペーストにおいて、又は１日１回若しくは２回咀嚼用のビスケットにおいて使用することができる。

本発明の更なる実施形態において、改良された口腔感染防止組成物には、歯の汚れ及び毒性の問題はない。さらに、鉄封鎖糖タンパク質（オボトランスフェリン又はラクトフェリン）とキレート剤（ＮａＥＤＴＡ及びクエン酸ナトリウム）とを含む本発明の組成物はＧＲＡＳ（一般に安全と認められる（Generally Recognized as Safe））状況にある。

本発明は、下記実施例を参照してより良好に理解することができる。これらの実施例は本発明の特定の実施形態を代表するものであることが意図され、本発明の範囲を限定するものではない。

実施例１：齲蝕関連のバイオフィルムに対するオボトランスフェリン（ＯＴ）とエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム（ＮａＥＤＴＡ）との組合せの阻害効果
９６ウェルクリスタルバイオレット染色バイオフィルムアッセイを用いて、歯垢（バイオフィルム）形成に関与する齲蝕を引き起こす細菌に対するオボトランスフェリン（ＯＴ）とエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム（ＮａＥＤＴＡ）との組合せの阻害効果を求めた。簡潔に述べると、ストック培養物を、嫌気条件下において０．３％酵母エキス（ＴＨＹＥ）と０．０１％ブタ胃ムチン（ｐＨ７．０）とを含むトッドヒューイット培地中で成長させた。バイオフィルムを、９６ウェルのＣｏｓｔａｒ ３５９８マイクロタイタープレート（Corning Inc.、ニューヨーク州コーニング）において発生させた。静止状態のバイオフィルムの成長は、塩（５８ｍＭ Ｋ_２ＨＰＯ_４、１５ｍＭ ＫＨ_２ＰＯ_４、１０ｍＭ （ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、３５ｍＭ ＮａＣｌ、及び２ｍＭ ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ）、ビタミン（０．０４ｍＭ ニコチン酸、０．１ｍＭ ピリドキシンＨＣｌ、０．０１ｍＭ パントテン酸、１μＭ リボフラビン、０．３μＭ チアミンＨＣｌ、０．０５μＭ ｄ−ビオチン）、アミノ酸（４ｍＭ Ｌ−グルタミン酸、１ｍＭ Ｌ−アルギニンＨＣｌ、１．３ｍＭ Ｌ−システインＨＣｌ、０．１ｍＭ Ｌ−トリプトファン）、０．２％カザミノ酸、及び２０ｍＭ グルコース（ｐＨ７．０）を含む半規定（semi-defined）最小（ＳＤＭ）培地に一晩培養物を３．３％で接種することによって開始させた。細菌をオボトランスフェリン（ＯＴ、１２５μｇ／ｍｌ）とＥＤＴＡ二ナトリウム（ＮａＥＤＴＡ、２５０μｇ／ｍｌ）との組合せの非存在（対照）又は存在下で成長させた。プレートを、ストレプトコッカス・ミュータンスＵＡ１５９、ストレプトコッカス・ソブリナスＨＮＧ ９０９Ｓ、ストレプトコッカス・オラリスＮＣＴＣ１１４７２及びストレプトコッカス・サングイスＮＣＴＣ１０９０４とともに嫌気条件下において３７℃で１６時間インキュベートした。バイオフィルムの発生を、クリスタルバイオレット染色及び光学密度測定によって測定した。浮遊細胞を含む培地を捨て、バイオフィルムを１ウェル当たり２００μｌの水で１回リンスして、一晩風乾した。バイオフィルム細胞を２００μｌの０．４％（ｗｔ／ｖｏｌ）クリスタルバイオレットで１５分間染色した。クリスタルバイオレットを除去して、ウェルを毎回２００μｌの水で３回リンスした。プレートを１５分間風乾して、各ウェルの沈着物（stain）を２００μｌの３３％酢酸中に可溶化して、６３０ｎｍの吸光度を、マイクロタイタープレートリーダー（Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ Ａｓｃｅｎｔ、Labsystems、フィンランド、ヘルシンキ）を用いて測定した。各実験に対して、バックグラウンド染色を、接種していない対照に結合するクリスタルバイオレットを差し引くことで補正した。比較分析は全て、変動を最小限に抑えるために、同じ９６ウェルマイクロタイタープレートにおいて異なる株をインキュベートすることによって実施した。ＯＴ（１２５μｇ／ｍｌ）とＮａＥＤＴＡ（２５０μｇ／ｍｌ）との組合せは、歯石及び齲蝕を引き起こす歯垢に関連する４つ全ての試験ストレプトコッカス種のバイオフィルムに対して有意な阻害効果を有していた（それぞれ、図１、図２、図３及び図４）。

実施例２：歯肉炎関連のバイオフィルムに対するオボトランスフェリン（ＯＴ）とエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム（ＮａＥＤＴＡ）との組合せの阻害効果
９６ウェルクリスタルバイオレット染色バイオフィルムアッセイを用いて、歯肉炎関連のバイオフィルム形成に対するオボトランスフェリン（ＯＴ）とエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム（ＮａＥＤＴＡ）との組合せの阻害効果を求めた。簡潔に述べると、グリセロールストックを、０．０２５％メナジオン（５ｍｇ／ｍｌ）、０．１％ヘミン（１ｍｇ／ｍｌ）及び５％ヒツジ血液が添加されたトリプチックソイ寒天（Tryptic Soy Agar）プレート上で嫌気条件下において４８時間成長させた。液体培養物（２５ｍｌ）を、０．１％ヘミン（１ｍｇ／ｍｌ）及び０．０２５％メナジオン（５ｍｇ／ｍｌ）が添加されたトッドヒューイット培地において嫌気条件下において（２４時間）成長させた。バイオフィルムを、９６ウェルのＣｏｓｔａｒ ３５９８マイクロタイタープレート（Corning Inc.、ニューヨーク州コーニング）において発生させた。ポルフィロモナス・ジンジバリスＷ５０の静止状態のバイオフィルムの成長を、（１０ｍＭ Ｎａ_２Ｈ_２ＰＯ_４、１０ｍＭ ＫＣｌ、２ｍＭ Ｃ_６Ｈ_８Ｏ_７、１．２５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、２０μＭ ＣａＣｌ_２、０．１μＭ Ｎａ_２ＭｏＯ_４、２５μＭ ＺｎＣｌ_２、５０μＭ ＭｎＣｌ_２、５μＭ ＣｕＣｌ_２、１０μＭ ＣｏＣｌ_２、５μＭ Ｈ_３ＢＯ_３（ｐＨ７．０に調整））を含む変法塩基本培地において１０倍希釈で一晩培養物を接種することによって開始させた。この基本培地に、３％ウシ血清アルブミン、２０ｍＭ α−ケトグルタル酸及び１％トリプトンを添加して、これを滅菌濾過し、０．１％ヘミン（１ｍｇ／ｍｌ）及び０．０２５％メナジオン（５ｍｇ／ｍｌ）を添加したものである。細菌をオボトランスフェリン（ＯＴ、１２５μｇ／ｍｌ及び５００μｇ／ｍｌ）とＥＤＴＡナトリウム（ＮａＥＤＴＡ、２５０μｇ／ｍｌ及び１０００μｇ／ｍｌ）との組合せの非存在（対照）又は存在下で成長させた。プレートを嫌気条件下において３７℃で４８時間インキュベートした。バイオフィルムの発生を、クリスタルバイオレット染色及び光学密度測定によって測定した。浮遊細胞を含む培地を捨て、バイオフィルムを１ウェル当たり２００μｌの水で２回リンスして、１時間風乾した。バイオフィルム細胞を２００μｌの０．４％（ｗｔ／ｖｏｌ）クリスタルバイオレットで１５分間染色した。クリスタルバイオレットを除去して、ウェルを２００μｌの水で２回リンスした。プレートを１５分間風乾した後、２００μｌの３３％酢酸中に可溶化して、６３０ｎｍの吸光度を、マイクロタイタープレートリーダー（Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ Ａｓｃｅｎｔ、Labsystems、フィンランド、ヘルシンキ）を用いて測定した。各実験に対して、バックグラウンド染色を、接種していない対照に結合するクリスタルバイオレットを差し引くことで補正した。比較分析は全て、変動を最小限に抑えるために、同じ９６ウェルマイクロタイタープレートにおいて全ての作用物質をインキュベートすることによって実施した［注釈：プラスチック製品及び培地は全て、最低でも実験前に４８時間予め嫌気条件でインキュベートした］。ＯＴ（１２５μｇ／ｍｌ及び５００μｇ／ｍｌ）とＮａＥＤＴＡ（２５０μｇ／ｍｌ及び１０００μｇ／ｍｌ）との組合せは、歯肉炎に関連するポルフィロモナス・ジンジバリスのバイオフィルムに対して相当な阻害効果を有していた（図５ａ及び図５ｂ）。

実施例３：歯周炎関連のバイオフィルムに対するオボトランスフェリン（ＯＴ）とエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム（ＮａＥＤＴＡ）との組合せの阻害効果
９６ウェルクリスタルバイオレット染色バイオフィルムアッセイを用いて、歯周炎関連のバイオフィルム形成に対するオボトランスフェリン（ＯＴ）とエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム（ＮａＥＤＴＡ）との組合せの阻害効果を求めた。簡潔に述べると、グリセロールストックを、５％重炭酸ナトリウムが添加されたトリプチックソイ寒天プレート上で嫌気条件下において４８時間成長させた。アグレガチバクター・アクチノミセテムコミタンスＵＴ３２の１０個のコロニーを、これらのプレートから取り出し、２００μｌの新しい培養液に移した［トリプチックソイ培養液（３０ｇ／Ｌ）、酵母エキス（６ｇ／Ｌ）、デキストロース（８ｇ／Ｌ）］。１０秒間ボルテックスを行い、２００μｌの培養液を２ｍｌの新しい培養液へと移し、１５秒間ボルテックスを行った。接種材料を５μＭ ＰＶＤＦシリンジフィルター（Ｍｉｌｌｅｘ−ＳＶ、カタログ番号ＳＬＳＶＯ２５ＬＳ）に通した。バイオフィルムを、９６ウェルのＣｏｓｔａｒ ３５９８マイクロタイタープレート（Corning Inc.、ニューヨーク州コーニング）において発生させた。静止状態のバイオフィルムの成長を、新しい培養液中にある接種材料を用いて１０倍希釈で接種することによって開始させた。細菌を、オボトランスフェリン（ＯＴ、１２５μｇ／ｍｌ）とＥＤＴＡナトリウム（ＮａＥＤＴＡ、２５０μｇ／ｍｌ）との組合せの非存在（対照）又は存在下で成長させた。プレートを嫌気条件下において３７℃で４８時間インキュベートした。バイオフィルムの発生を、クリスタルバイオレット染色及び光学密度測定によって測定した。浮遊細胞を含む培地を捨て、バイオフィルムを１ウェル当たり２００μｌの水で１回リンスした直後に、２００μｌの０．４％（ｗｔ／ｖｏｌ）クリスタルバイオレットで１分間染色した。クリスタルバイオレットを除去して、ウェルを毎回２００μｌの水で３回リンスした。プレートを風乾して、各ウェルの沈着物を２００μｌの３３％酢酸中に可溶化して、６３０ｎｍの吸光度を、マイクロタイタープレートリーダー（Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ Ａｓｃｅｎｔ、Labsystems、フィンランド、ヘルシンキ）を用いて測定した。各実験に対して、バックグラウンド染色を、接種していない対照に結合するクリスタルバイオレットを差し引くことで補正した。比較分析は全て、変動を最小限に抑えるために、同じ９６ウェルマイクロタイタープレートにおいて全ての作用物質をインキュベートすることによって実施した。ＯＴ（１２５μｇ／ｍｌ）とＮａＥＤＴＡ（２５０μｇ／ｍｌ）との組合せは、歯周炎に関連するアグレガチバクター・アクチノミセテムコミタンスのバイオフィルムに対する有意な阻害効果を有していた（図６）。

実施例４：最小発育阻止濃度（Minimum Inhibitory Concentration：ＭＩＣ）アッセイによって求められる、口腔内疾患関連細菌に対するオボトランスフェリン（ＯＴ）とＥＤＴＡ二ナトリウム（ＮａＥＤＴＡ）との組合せの阻害効果
ストレプトコッカス・ミュータンス（歯垢及び齲蝕に関連する）、ストレプトコッカス・オラリス（歯垢及び齲蝕に関連する）、ポルフィロモナス・ジンジバリス（正：Porphyromonas gingivalis）（歯肉炎に関連する）、アグレガチバクター・アクチノミセテムコミタンス（歯周炎に関連する）、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）（院内感染に関連する）及びバークホルデリア・マルティボランス（Burkholderia multivorans）（肺感染に関連する）を含む６種の生物についてのオボトランスフェリンとＥＤＴＡ二ナトリウムとの組合せのＭＩＣを、９６ウェルマイクロタイタープレートアッセイにおいて培養液微量希釈アッセイを用いることで求めた。簡潔に述べると、細菌株を、ストレプトコッカス種についてはＴＨＹＥ培地、ポルフィロモナス・ジンジバリスについてはヘミン及びメナジオンが添加されたトッドヒューイット培養液、アグレガチバクター・アクチノミセテムコミタンスについては重炭酸ナトリウムが添加されたトリプチックソイ／酵母エキス培養液、並びに緑膿菌（P. aeruginosa）及びバークホルデリア・マルティボランス（B. multivorans）についてはルリア培養液中で嫌気条件又は好気条件において３７℃で一晩成長させた後、１０^５ｃｆｕ／ｍＬに希釈した。１００ｍＬという一定量の細菌懸濁液を各ウェルに添加した。次いで一定量（１００ｍＬ）の組合せをマイクロタイタープレートのウェルの第１列に加えた。マイクロタイタープレートのウェルの内容物を、マルチピペッターを用いて混合し、二段階希釈を行い、所望の濃度の組合せを得た。プレートを嫌気条件下において３７℃で２４時間〜４８時間インキュベートして、マイクロタイタープレートリーダー（Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ Ａｓｃｅｎｔ、Labsystems、フィンランド、ヘルシンキ）を用いて６００ｎｍで読み取った。ＭＩＣは、成長が完全に阻害された最小抗微生物剤濃度として評価した。ＭＩＣ値は、各濃度の組合せをプレーティングすることによってＯＤ評価後に確認した。ＭＩＣを試験した最大濃度は４０００μｇ／ｍｌ（ＯＴ）／８０００μｇ／ｍｌ（ＮａＥＤＴＡ）であった。ストレプトコッカス・ミュータンス、ストレプトコッカス・オラリス、ポルフィロモナス・ジンジバリス及びアグレガチバクター・アクチノミセテムコミタンスについてのＯＴ／ＮａＥＤＴＡの組合せのＭＩＣは２５０μｇ／ｍｌ（ＯＴ）／５００μｇ／ｍｌ（ＮａＥＤＴＡ）〜１０００μｇ／ｍｌ（ＯＴ）／２０００μｇ／ｍｌ（ＮａＥＤＴＡ）と様々であったが、該組合せは、４０００μｇ／ｍｌ（ＯＴ）／８０００μｇ／ｍｌ（ＮａＥＤＴＡ）と高い濃度であっても緑膿菌及びバークホルデリア・マルティボランスに対する効果はなかった（表１）。したがって試験結果から、齲蝕、歯肉炎及び歯周炎等の口腔疾患に関連する細菌に対するＯＴとＮａＥＤＴＡとの組合せの選択的効力が実証される。

実施例５：ＰＥＧ化オボトランスフェリン又はラクトフェリンの調製方法
１００ｍｇのオボトランスフェリン又はラクトフェリンを２５０ｍｌ容のガラスボトルに取る。２０ｍＭシアノ水素化ホウ素ナトリウムを含み、５％ソルビトールを含む／含まない、１００ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ５．０）を含有するバッファーを反応混合物に添加する。２０ｋＤａのメトキシ−ポリエチレングリコール−プロピオンアルデヒド（ｍＰＥＧ−アルデヒド）をタンパク質の上記の撹拌溶液に添加する。次いでｍＰＥＧ−アルデヒドをタンパク質溶液の入ったボトルに移す。タンパク質濃度は５ｍｇ／ｍｌに維持する。次に反応混合物を一晩２℃〜８℃で撹拌する。反応混合物を、バッファー中に５％ソルビトールを含む／含まない４０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ４．０）（容量は反応容量の５倍にする）を添加することによってクエンチする。粗反応混合物をサイズ排除クロマトグラフィ及びイオン交換樹脂によって精製し、ＭＡＬＤＩ質量分析法によって特性決定する。

実施例６：フッ素化オボトランスフェリン及びラクトフェリンの調製方法
オボトランスフェリン及びラクトフェリン等の鉄封鎖糖タンパク質を、僅かなプロリン又はロイシン残基をそれぞれ、フルオロプロリン又はヘキサフルオロロイシンに置き換えることによってフッ素化する。末端６×Ｈｉｓタグを含む、標的タンパク質、すなわちオボトランスフェリン又はラクトフェリンを発現するＩＰＴＧ誘導性ベクターを、大腸菌発現細胞株に移入する。抑制遺伝子ｌａｃＩ^ｑを含まない発現ベクターを、ｌａｃＩ^ｑをコードするｐＲＥ４で同時形質転換する。選択される発現細胞株は、アミノ酸が組換えタンパク質に取り込まれる栄養要求性である。Ｐｒｏ栄養要求性及びＬｅｕ栄養要求性の大腸菌株ＪＭ８３及びＪＷ５８０７−２をそれぞれ、フルオロプロリン及びヘキサフルオロロイシンの取り込みに使用する。選択されるアミノ酸アナログを取り込むのに、発現細胞株を、栄養要求性アミノ酸（０．０５ｍＭ）と、発現プラスミドを維持するのに適切な抗生物質とが添加された５０ｍｌのＭ９最小培地中で振盪しながら３７℃で一晩成長させる。一晩培養物を用いて、独立栄養性アミノ酸（０．０３５ｍＭ）と抗生物質とが添加された５００ｍｌのＭ９最小培地を接種する。栄養要求性アミノ酸が完全に枯渇するまで細胞を成長させた後、栄養要求性アミノ酸（１ｍＭ）及びＩＰＴＧ（１ｍＭ）のフッ素化アナログを添加し、組換えタンパク質の合成を誘導する。細胞を１２時間〜１８時間振盪しながら３７℃で更に培養させ、遠心分離によって回収する。細胞を、５０μｇ／ｍｌリゾチームと、１ｍＭ ＰＭＳＦと、０．００１％ Ｉｇｅｐａｌとを含む１００ｍＭ リン酸Ｎａバッファー中で再懸濁し、超音波処理して、氷上で３０分間保存する。次いで溶解物にＲＮアーゼ（１０μｇ／ｍｌ）及びＤＮアーゼ（５μｇ／ｍｌ）を添加して、室温で３０分間インキュベートして、遠心分離によって透明にする。透明にした溶解物をＮｉ−アガロースカラムに通し、１００リン酸Ｎａバッファーで洗浄して、フッ素化組換えタンパク質を１００ｍＭのリン酸Ｎａバッファー中の０ｍＭ→１００ｍＭのイミダゾール勾配で溶出する。標的タンパク質を含む溶出画分をプールし、水で透析した後、凍結乾燥する。

実施例７：オボトランスフェリン及びラクトフェリンナノ粒子の調製方法
１００ｍｇのポリＤ，Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド（ＰＬＧＡ）及び１００ｍｇのオボトランスフェリン又はラクトフェリンを６ｍｌのアセトンに溶解する。この溶液を２０ｍｌの０．１５％ ＳＤＳ溶液に撹拌しながら滴加する。混合物を１時間撹拌し続け、２０分間１００００ｒｐｍで遠心分離して、ナノ粒子をペレット状にする。液体を捨て、ペレットを、毎回２５ｍｌの水で再懸濁することで３回洗浄した後、１００００ｒｐｍで２０分間遠心分離する。最後に、ペレットをドラフト内で風乾し、４℃で保存する。

実施例８：（ｉ）「リポソームオボトランスフェリン及びエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム（ＮａＥＤＴＡ）配合物」並びに（ｉｉｉ）「リポソームラクトフェリン、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム（ＮａＥＤＴＡ）及びクエン酸ナトリウム（Ｓ．ｃｉｔ）」の調製方法
多層リポソームを、Novaczek, et al. (1991 Aquatic Toxicology, 21 : 103-118)の処方に従って調製する。コレステロール、ステアリルアミン及びホスファチジルコリンの１：２：７μＭ混合物を用いて、オボトランスフェリン及びＮａＥＤＴＡの水溶液を封入する。脂質混合物をクロロホルム中で調製し、ドラフト下で２５ｍｍ径のガラス試験管の壁上で乾燥させる。次いでオボトランスフェリン−ＮａＥＤＴＡ溶液を添加して、脂質膜が視認されなくなるまで混合物をボルテックスする。得られるリポソームを超遠心分離して、３回洗浄して、遊離オボトランスフェリン及びＮａＥＤＴＡを除去する。

実施例９：齲蝕関連のバイオフィルムに対するラクトフェリン（ＬＴＦ）単独、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム（ＮａＥＤＴＡ）単独及びクエン酸ナトリウム（Ｓ．ｃｉｔ）単独、並びにそれらの組合せの阻害効果
９６ウェルクリスタルバイオレット染色バイオフィルムアッセイを用いて、歯垢（バイオフィルム）形成に関与する齲蝕を引き起こす細菌に対するラクトフェリン（ＬＴＦ）単独、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム（ＮａＥＤＴＡ）単独及びクエン酸ナトリウム（Ｓ．ｃｉｔ）単独、並びにそれらの組合せの阻害効果を求めた。簡潔に述べると、ストレプトコッカス・ミュータンスＵＡ１５９及びストレプトコッカス・サングイス（ストレプトコッカス・サングイニス）ＮＣＴＣ１０９０４のストック培養物を、嫌気条件下において０．３％酵母エキス（ＴＨＹＥ）と０．０１％ブタ胃ムチン（ｐＨ７．０）とを含むトッドヒューイット培地中で成長させた。バイオフィルムを、９６ウェルのＣｏｓｔａｒ ３５９８マイクロタイタープレート（Corning Inc.、ニューヨーク州コーニング）において発生させた。静止状態のバイオフィルムの成長は、塩（５８ｍＭ Ｋ_２ＨＰＯ_４、１５ｍＭ ＫＨ_２ＰＯ_４、１０ｍＭ （ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、３５ｍＭ ＮａＣｌ、及び２ｍＭ ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ）、ビタミン（０．０４ｍＭ ニコチン酸、０．１ｍＭ ピリドキシンＨＣｌ、０．０１ｍＭ パントテン酸、１μＭ リボフラビン、０．３μＭ チアミンＨＣｌ、０．０５μＭ ｄ−ビオチン）、アミノ酸（４ｍＭ Ｌ−グルタミン酸、１ｍＭ Ｌ−アルギニンＨＣｌ、１．３ｍＭ Ｌ−システインＨＣｌ、０．１ｍＭ Ｌ−トリプトファン）、０．２％カザミノ酸、及び２０ｍＭ グルコース（ｐＨ７．０）を含む半規定最小（ＳＤＭ）培地に一晩培養物を３．３％で接種することによって開始させた。細菌をラクトフェリン（ＬＴＦ、５００μｇ／ｍｌ）単独、ＥＤＴＡ二ナトリウム（ＮａＥＤＴＡ、２．５ｍｇ／ｍｌ）単独及びクエン酸ナトリウム（Ｓ．ｃｉｔ、３．２ｍｇ／ｍｌ）単独、並びにそれらの組合せの非存在（対照）又は存在下で成長させた。プレートを嫌気性条件下において３７℃で１６時間、インキュベートした。バイオフィルムの発生を、クリスタルバイオレット染色及び光学密度測定によって測定した。浮遊細胞を含む培地を捨て、バイオフィルムを１ウェル当たり２００μｌの水で１回リンスして、一晩風乾した。バイオフィルム細胞を２００μｌの０．４％（ｗｔ／ｖｏｌ）クリスタルバイオレットで１５分間染色した。クリスタルバイオレットを除去して、ウェルを毎回２００μｌの水で３回リンスした。プレートを１５分間風乾して、各ウェルの沈着物を２００μｌの３３％酢酸中に可溶化して、６３０ｎｍの吸光度を、マイクロタイタープレートリーダー（Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ Ａｓｃｅｎｔ、Labsystems、フィンランド、ヘルシンキ）を用いて測定した。各実験に対して、バックグラウンド染色を、接種していない対照に結合するクリスタルバイオレットを差し引くことで補正した。比較分析は全て、変動を最小限に抑えるために、同じ９６ウェルマイクロタイタープレートにおいて異なる株をインキュベートすることによって実施した。ＬＴＦ（０．５ｍｇ／ｍｌ）、ＮａＥＤＴＡ（２．５ｍｇ／ｍｌ）及びＳ．ｃｉｔ（３．２ｍｇ／ｍｌ）の組合せは、歯石及び齲蝕を引き起こす歯垢に関連するストレプトコッカス・ミュータンス及びストレプトコッカス・サングイス（ストレプトコッカス・サングイニス）で試験した場合、バイオフィルムに対して有意な阻害効果を有していた（それぞれ、図７ａ及び図７ｂ）。

実施例１０：歯周炎関連のバイオフィルムに対するラクトフェリン（ＬＴＦ）単独、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム（ＮａＥＤＴＡ）単独及びクエン酸ナトリウム（Ｓ．ｃｉｔ）単独、並びにそれらの組合せの阻害効果
９６ウェルクリスタルバイオレット染色バイオフィルムアッセイを用いて、歯周炎関連のバイオフィルム形成に対するラクトフェリン（ＬＴＦ）単独、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム（ＮａＥＤＴＡ）単独及びクエン酸ナトリウム（Ｓ．ｃｉｔ）単独、並びにそれらの組合せの阻害効果を求めた。簡潔に述べると、グリセロールストックを、５％重炭酸ナトリウムが添加されたトリプチックソイ寒天プレート上で嫌気条件下において４８時間成長させた。アグレガチバクター・アクチノミセテムコミタンスＵＴ３２の１０個のコロニーを、これらのプレートから取り出し、２００μｌの新しい培養液に移した［トリプチックソイ培養液（３０ｇ／Ｌ）、酵母エキス（６ｇ／Ｌ）、デキストロース（８ｇ／Ｌ）］。１０秒間ボルテックスを行い、２００μｌの培養液を２ｍｌの新しい培養液へと移し、１５秒間ボルテックスを行った。接種材料を５μＭ ＰＶＤＦシリンジフィルター（Ｍｉｌｌｅｘ−ＳＶ、カタログ番号ＳＬＳＶＯ２５ＬＳ）に通した。バイオフィルムを、９６ウェルのＣｏｓｔａｒ ３５９８マイクロタイタープレート（Corning Inc.、ニューヨーク州コーニング）において発生させた。静止状態のバイオフィルムの成長を、新しい培養液中にある接種材料を用いて１０倍希釈で接種することによって開始させた。細菌を、ラクトフェリン（ＬＴＦ、０．５ｍｇ／ｍｌ）単独、ＥＤＴＡ二ナトリウム（ＮａＥＤＴＡ、２．０ｍｇ／ｍｌ）単独及びクエン酸ナトリウム（Ｓ．ｃｉｔ、３．２ｍｇ／ｍｌ）単独、並びにそれらの組合せの非存在（対照）又は存在下で成長させた。プレートを嫌気条件下において３７℃で４８時間インキュベートした。バイオフィルムの発生を、クリスタルバイオレット染色及び光学密度測定によって測定した。浮遊細胞を含む培地を捨て、バイオフィルムを１ウェル当たり２００μｌの水で１回リンスした直後に、２００μｌの０．４％（ｗｔ／ｖｏｌ）クリスタルバイオレットで１分間染色した。クリスタルバイオレットを除去して、ウェルを毎回２００μｌの水で３回リンスした。プレートを風乾して、各ウェルの沈着物を２００μｌの３３％酢酸中に可溶化して、６３０ｎｍの吸光度を、マイクロタイタープレートリーダー（Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ Ａｓｃｅｎｔ、Labsystems、フィンランド、ヘルシンキ）を用いて測定した。各実験に対して、バックグラウンド染色を、接種していない対照に結合するクリスタルバイオレットを差し引くことで補正した。比較分析は全て、変動を最小限に抑えるために、同じ９６ウェルマイクロタイタープレートにおいて全ての作用物質をインキュベートすることによって実施した。ＬＴＦ（０．５ｍｇ／ｍｌ）、ＮａＥＤＴＡ（２．０ｍｇ／ｍｌ）及びＳ．ｃｉｔ（３．２ｍｇ／ｍｌ）の組合せは、歯周炎に関連するアグレガチバクター・アクチノミセテムコミタンスのバイオフィルムに対する有意な阻害効果を有していた（図８）。

実施例１１：最小殺菌濃度（Minimum Bactericidal Concentration：ＭＢＣ）アッセイによって求められる、口腔内疾患関連の細菌に対するラクトフェリン（ＬＴＦ）単独、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム（ＮａＥＤＴＡ）単独及びクエン酸ナトリウム（Ｓ．ｃｉｔ）単独、それらの対、並びにそれらの組合せの阻害効果
ラクトフェリン（ＬＴＦ）、ＥＤＴＡ二ナトリウム（ＮａＥＤＴＡ）及びクエン酸ナトリウム（Ｓ．ｃｉｔ）のそれぞれ単独並びにそれらの対（ＬＴＦ及びＮａＥＤＴＡ、ＬＴＦ及びＳ．ｃｉｔ、ＮａＥＤＴＡ及びＳ．ｃｉｔ）並びに３つ全ての組合せ（ＬＴＦ／ＮａＥＤＴＡ／Ｓ．ｃｉｔ）のＭＢＣを、ストレプトコッカス・サングイス（イヌ、歯垢関連）及びポルフィロモナス・カンジンジバリス（P. cangingivalis）（イヌ、イヌ歯肉炎関連）を含む２種の生物について、９６ウェルマイクロタイタープレートアッセイにおける培養液微量希釈アッセイを用いた後にプレーティングを行い、細胞死を確認することによって求めた。簡潔に述べると、細菌株をストレプトコッカス種についてはＴＨＹＥ培地、ポルフィロモナス・カンジンジバリスについてはヘミン及びメナジオンが添加されたトッドヒューイット培養液中で嫌気条件又は好気条件において３７℃で一晩成長させた後、１０^５ｃｆｕ／ｍＬに希釈した。１００ｍＬという一定量の細菌懸濁液を各ウェルに添加した。次いで一定量（１００ｍＬ）の組合せをマイクロタイタープレートのウェルの第１列に加えた。マイクロタイタープレートのウェルの内容物を、マルチピペッターを用いて混合し、二段階希釈を行い、所望の濃度の組合せを得た。プレートを嫌気条件下において３７℃で２４時間〜４８時間インキュベートして、マイクロタイタープレートリーダー（Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ Ａｓｃｅｎｔ、Labsystems、フィンランド、ヘルシンキ）を用いて６００ｎｍで読み取った。ＭＢＣは、成長が完全に阻害された最小抗微生物剤濃度として評価した。ＭＢＣ値は、各濃度の組合せをプレーティングすることによってＯＤ評価後に確認した。ＭＢＣを試験した最大濃度は２０ｍｇ／ｍｌ（ＬＴＦ）、８ｍｇ／ｍｌ（ＮａＥＤＴＡ）及び１１２ｍｇ／ｍｌ（Ｓ．ｃｉｔ）であった。

ＬＴＦのＭＢＣによって、最大２０ｍｇ／ｍｌの濃度で単独で用いられたＬＴＦはストレプトコッカス・サングイス（ストレプトコッカス・サングイニス）及びポルフィロモナス・カンジンジバリスを完全に阻害することはできなかったことが示された（表２の第１列）。ＮａＥＤＴＡ単独の場合、最大８．０ｍｇ／ｍｌの濃度では、ポルフィロモナス・カンジンジバリスを完全に阻害することはできなかったが、２．０ｍｇ／ｍｌではストレプトコッカス・サングイス（ストレプトコッカス・サングイニス）の成長を完全に阻害することができた（表２の第２列）。Ｓ．ｃｉｔ単独の場合、１１２ｍｇ／ｍｌ及び２８ｍｇ／ｍｌの濃度でそれぞれ、ストレプトコッカス・サングイス（ストレプトコッカス・サングイニス）及びポルフィロモナス・カンジンジバリスを完全に阻害することができた（表２の第３列）。ストレプトコッカス・サングイス（ストレプトコッカス・サングイニス）及びポルフィロモナス・カンジンジバリスについて３つの化合物２つの組合せ（ＬＴＦ及びＮａＥＤＴＡ；ＬＴＦ及びＳ．ｃｉｔ；並びにＮａＥＤＴＡ及びＳ．ｃｉｔ）］の場合、成長を完全に阻害させるＮａＥＤＴＡ又はＳ．ｃｉｔのいずれかを伴うＬＴＦの濃度が大幅に低減した（表２の第４列及び第５列）。ＮａＥＤＴＡ及びＳ．ｃｉｔの組合せの場合、ストレプトコッカス・サングイス（ストレプトコッカス・サングイニス）及びポルフィロモナス・カンジンジバリスは１．０／１．７濃度で完全に阻害された（表２の第６列）。３つ全ての化合物を使用する組合せの場合、ストレプトコッカス・サングイス（ストレプトコッカス・サングイニス）は、完全な阻害を示すＬＴＦ及びＮａＥＤＴＡの濃度の大幅な低下を示した。ポルフィロモナス・カンジンジバリスの場合では、完全な阻害を示すＬＴＦ、ＮａＥＤＴＡ及びＳ．ｃｉｔが大幅に低下した（表２の第７列）。このため試験結果から、歯垢、歯肉炎及び歯周炎等の口腔病態及び疾患に関連する細菌に対するＬＴＦ／ＮａＥＤＴＡ／Ｓ．ｃｉｔの組合せの効力が実証される。

実施例１２：齲蝕及び歯周炎関連のバイオフィルムに対するラクトフェリン（ＬＴＦ）、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム（ＮａＥＤＴＡ）及びクエン酸ナトリウム（Ｓ．ｃｉｔ）配合物の阻害効果
９６ウェルクリスタルバイオレット染色バイオフィルムアッセイを用いて、齲蝕を引き起こし、歯垢（バイオフィルム）を形成する細菌に対するラクトフェリン（ＬＴＦ）、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム（ＮａＥＤＴＡ）及びクエン酸ナトリウム（Ｓ．ｃｉｔ）配合物の阻害効果を求めた。歯周炎関連細菌も試験した。ストレプトコッカス・ミュータンスＵＡ１５９、ストレプトコッカス・ソブリナスＨＮＧ ９０９Ｓ、ストレプトコッカス・ゴルドニＳＫ１２０、及びストレプトコッカス・サングイス（ストレプトコッカス・サングイニス）ＮＣＴＣ１０９０４のストレプトコッカス株を実施例１０に記載のように成長させた。アグレガチバクター・アクチノミセテムコミタンスを実施例１１に記載のように成長させた。ＬＴＦ（０．５ｍｇ／ｍｌ）、ＮａＥＤＴＡ（２．０ｍｇ／ｍｌ）及びＳ．ｃｉｔ（３．２ｍｇ／ｍｌ）の配合物は、歯石及び齲蝕を引き起こす歯垢に関連する４つ全ての試験ストレプトコッカス種と、歯周病に関連するアグレガチバクター・アクチノミセテムコミタンスのバイオフィルムに対して顕著な阻害効果を有していた（図９）。

実施例１３：バイオフィルムに対するラクトフェリン（ＬＴＦ）、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム（ＮａＥＤＴＡ）及びクエン酸ナトリウム（Ｓ．ｃｉｔ）配合物の阻害効果と、市販の伴侶動物用オーラルケア製品の阻害効果との比較
１２ウェルポリスチレンマイクロタイタープレートバイオフィルムアッセイを用いて、口腔疾患細菌に対するラクトフェリン（ＬＴＦ）、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム（ＮａＥＤＴＡ）及びクエン酸ナトリウム（Ｓ．ｃｉｔ）配合物の阻害効果を求めた。簡潔に述べると、ストレプトコッカス・ミュータンスＵＡ１５９、ストレプトコッカス・サングイス（ストレプトコッカス・サングイニス）ＮＣＴＣ１０９０４及びアグレガチバクター・アクチノミセテムコミタンスのバイオフィルムを１２ウェルポリスチレンマイクロタイタープレート上に発生させ、バイオフィルムに埋包された口腔生菌をアッセイする迅速かつ単純な方法を提供した。最終濃度０．０１％のブタ胃ムチンが添加された４倍希釈ＴＨＹＥ培地を、ストレプトコッカス・ミュータンス及びストレプトコッカス・サングイス（ストレプトコッカス・サングイニス）のバイオフィルム培地（ＢＭ）として使用した。特別なＢＭ［トリプチックソイ培養液（３０ｇ／Ｌ）、酵母エキス（６ｇ／Ｌ）、デキストロース（８ｇ／Ｌ）］をアグレガチバクター・アクチノミセテムコミタンスに使用した。バイオフィルムの成長を、２ｍｌのＢＭの入った各ウェルに２０μｌの細胞懸濁液を接種することによって開始させ、１２のウェルを以下のように設定した：対照２ウェル及び各処理２ウェル（Ｐｅｔ Ｄｅｎｔａｌ、Ｓｌｕｒｐ ｎ ｆｒｅｓｈ、Ｈｅａｌｔｈｙ ｍｏｕｔｈ及び本配合物）及びブランク２ウェル。培養物を嫌気条件下において３７℃で２０時間インキュベートして、液体培地を除去した。ウェルを１０ｍＭ ＰＢＳバッファー（ｐＨ７．２）で１回リンスして、バイオフィルムに埋包された細胞を１５秒間緩やかに超音波処理することによって２ｍｌのＰＢＳバッファー中に回収し、希釈した後、ＴＨＹＥプレート上に塗布し、嫌気条件下において３７℃でインキュベートした。バイオフィルムに埋包された生細胞を、４８時間のインキュベーション後のコロニー形成単位（ＣＦＵ）のカウントによって定量化した。ＬＴＦ（０．５ｍｇ／ｍｌ）、ＮａＥＤＴＡ（２．０ｍｇ／ｍｌ）及びＳ．ｃｉｔ（３．２ｍｇ／ｍｌ）の配合物が、市販の他の伴侶動物用オーラルケア製品よりも良好に作用した（図１０ａ、図１０ｂ及び図１０ｃ）。

実施例１４：活性成分としてラクトフェリン（ＬＴＦ）、ＥＤＴＡ二ナトリウム（ＮａＥＤＴＡ）及びクエン酸ナトリウム（Ｓ．ｃｉｔ）を含む口腔配合物のｉｎ ｖｉｖｏでの効力
イヌについてのＶＯＨＣ（米国獣医口膣衛生協議会（Veterinary Oral Health Council）、米国ペンシルバニア州）推奨の試験プロトコルを用いるｉｎ ｖｉｖｏでの予備効力研究の目的は、歯垢、歯石（タータ）及び歯肉炎の低減におけるＬＴＦ−ＮａＥＤＴＡ−Ｓ．ｃｉｔ配合物の効果を実証することであった。同数のイヌ（ビーグル成犬）を対照群及び試験群に用いた。本研究でのイヌは全て、同程度のサイズであり、欠損歯がないものにした。イヌに麻酔をして、獣医によって各イヌに対して歯科清掃を行った。歯科清掃の後、研究を始める前にイヌの上顎及び下顎の両方について０レベルのスコアを付けた（歯垢及びタータが完全に存在しないことを意味する）。活性成分としてＬＴＦ（０．５ｍｇ／ｍｌ）、ＮａＥＤＴＡ（２ｍｇ／ｍｌ）及びＳ．ｃｉｔ（３．２ｍｇ／ｍｌ）を含む配合物を試験群の通常の飲料水に添加し、対照群には通常の飲料水を与えた。試験期間、全てのイヌ（処理及び対照）に対照食餌（キッブル、乾燥状態で給餌した）を与えた。本研究では、対照とＬＴＦ−ＮａＥＤＴＡ−Ｓ．ｃｉｔ配合物とで食物及び水の消費量と、更にはイヌの体重の変化とをモニタリングした。各イヌでスコア付けを行う歯は以下のものであった：上顎（Ｉ３、Ｃ、Ｐ３、Ｐ４、ＭＩ）、下顎（Ｃ、Ｐ３、Ｐ４、ＭＩ）。研究期間は１４日であった。予備研究の結果から、歯垢、歯石／タータ及び歯肉炎の大幅な低減が示された（図１１）。さらに、食物又は水の消費量及び体重には違いが見られず、このことから全てのイヌが良好な健康状態であったことが示唆される。この予備研究によって、イヌにおける歯垢及び歯周病に関連する細菌に対するＬＴＦ−ＮａＥＤＴＡ−Ｓ．ｃｉｔ配合物の効力が実証される。

実施例１５：口腔内疾患関連のバイオフィルムに対する可変濃度のエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム（ＮａＥＤＴＡ）と、固定濃度のクエン酸ナトリウム（Ｓ．ｃｉｔ）とを含む配合物の阻害効果
１２ウェルポリスチレンマイクロタイタープレートバイオフィルムアッセイを用いて、口腔疾患細菌に対する可変濃度のＮａＥＤＴＡ（１ｍｇ／ｍｌ、０．５ｍｇ／ｍｌ及び０．２５ｍｇ／ｍｌ）と、固定濃度のＳ．ｃｉｔ（３．２ｍｇ／ｍｌ）とを含む配合物の阻害効果を求めた。簡潔に述べると、ストレプトコッカス・ミュータンスＵＡ１５９、ストレプトコッカス・ゴルドニ、ストレプトコッカス・サングイス（ストレプトコッカス・サングイニス）ＮＣＴＣ１０９０４及びアグレガチバクター・アクチノミセテムコミタンスのバイオフィルムを１２ウェルポリスチレンマイクロタイタープレート上に発生させ、バイオフィルムに埋包された口腔生菌をアッセイする迅速かつ単純な方法を提供した。最終濃度０．０１％のブタ胃ムチンが添加された４倍希釈ＴＨＹＥ培地を、ストレプトコッカス・ミュータンス、ストレプトコッカス・ゴルドニ及びストレプトコッカス・サングイス（ストレプトコッカス・サングイニス）のバイオフィルム培地（ＢＭ）として使用した。特別なＢＭ［トリプチックソイ培養液（３０ｇ／Ｌ）、酵母エキス（６ｇ／Ｌ）、デキストロース（８ｇ／Ｌ）］をアグレガチバクター・アクチノミセテムコミタンスに使用した。バイオフィルムの成長を、２ｍｌのＢＭの入った各ウェルに２０μｌの細胞懸濁液を接種することによって開始させ、１２のウェルを以下のように設定した：対照３ウェル及び各処理３ウェル及びブランク３ウェル。培養物を嫌気条件下において３７℃で２０時間インキュベートして、液体培地を除去した。ウェルを１０ｍＭ ＰＢＳバッファー（ｐＨ７．２）で１回リンスして、バイオフィルムに埋包された細胞を１５秒間緩やかに超音波処理することによって２ｍｌのＰＢＳバッファー中に回収し、希釈した後、ＴＨＹＥプレート上に塗布し、嫌気条件下において３７℃でインキュベートした。バイオフィルムに埋包された生細胞を、４８時間のインキュベーション後のコロニー形成単位（ＣＦＵ）のカウントによって定量化した。可変濃度のＮａＥＤＴＡと固定濃度のＳ．ｃｉｔとを含む３つの試験配合物が、試験生物において異なる程度のバイオフィルムの低減を示した（図１２ａ、図１２ｂ、図１２ｃ及び図１２ｄ）。

実施例１６：口腔内疾患関連のバイオフィルムに対する固定濃度のエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム（ＮａＥＤＴＡ）及びクエン酸ナトリウム（Ｓ．ｃｉｔ）と、可変濃度の乳酸亜鉛（ＺＬ）とを含む配合物の阻害効果
１２ウェルポリスチレンマイクロタイタープレートバイオフィルムアッセイを用いて、口腔疾患細菌に対する固定濃度のＮａＥＤＴＡ（０．５ｍｇ／ｍｌ）及びＳ．ｃｉｔ（３．２ｍｇ／ｍｌ）と、可変濃度のＺＬ（０．０２５ｍｇ／ｍｌ、０．０５０ｍｇ／ｍｌ及び０．１ｍｇ／ｍｌ）とを含む配合物の阻害効果を求めた。簡潔に述べると、ストレプトコッカス・サングイス（ストレプトコッカス・サングイニス）ＮＣＴＣ１０９０４及びアグレガチバクター・アクチノミセテムコミタンスのバイオフィルムを１２ウェルポリスチレンマイクロタイタープレート上に発生させ、バイオフィルムに埋包された口腔生菌をアッセイする迅速かつ単純な方法を提供した。最終濃度０．０１％のブタ胃ムチンが添加された４倍希釈ＴＨＹＥ培地を、ストレプトコッカス・サングイス（ストレプトコッカス・サングイニス）のバイオフィルム培地（ＢＭ）として使用した。特別なＢＭ［トリプチックソイ培養液（３０ｇ／Ｌ）、酵母エキス（６ｇ／Ｌ）、デキストロース（８ｇ／Ｌ）］をアグレガチバクター・アクチノミセテムコミタンスに使用した。バイオフィルムの成長を、２ｍｌのＢＭの入った各ウェルに２０μｌの細胞懸濁液を接種することによって開始させ、１２のウェルを以下のように設定した：対照３ウェル及び各処理３ウェル及びブランク３ウェル。培養物を嫌気条件下において３７℃で２０時間インキュベートして、液体培地を除去した。ウェルを１０ｍＭ ＰＢＳバッファー（ｐＨ７．２）で１回リンスして、バイオフィルムに埋包された細胞を１５秒間緩やかに超音波処理することによって２ｍｌのＰＢＳバッファー中に回収し、希釈した後、ＴＨＹＥプレート上に塗布し、嫌気条件下において３７℃でインキュベートした。バイオフィルムに埋包された生細胞を、４８時間のインキュベーション後のコロニー形成単位（ＣＦＵ）のカウントによって定量化した。可変濃度のＺＬと、固定濃度のＮａＥＤＴＡ及びＳ．ｃｉｔとを含む３つの試験配合物が、試験生物においてほぼ同程度のバイオフィルムの低減を示した（図１３ａ及び図１３ｂ）。

実施例１７：口腔内疾患関連のバイオフィルムに対する個々の化合物の効果と比較したエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム（ＮａＥＤＴＡ）とクエン酸ナトリウム（Ｓ．ｃｉｔ）との組合せの相乗阻害効果
１２ウェルポリスチレンマイクロタイタープレートバイオフィルムアッセイを用いて、口腔疾患細菌に対するＮａＥＤＴＡ（０．０２５ｍｇ／ｍｌ及び０．５ｍｇ／ｍｌ）単独及びＳ．ｃｉｔ（１．６ｍｇ／ｍｌ及び３．２ｍｇ／ｍｌ）単独、並びにそれらの組合せの相乗阻害効果を求めた。簡潔に述べると、ストレプトコッカス・ミュータンス及びアグレガチバクター・アクチノミセテムコミタンスのバイオフィルムを１２ウェルポリスチレンマイクロタイタープレート上に発生させ、バイオフィルムに埋包された口腔生菌をアッセイする迅速かつ単純な方法を提供した。最終濃度０．０１％のブタ胃ムチンが添加された４倍希釈ＴＨＹＥ培地を、ストレプトコッカス・サングイス（ストレプトコッカス・サングイニス）のバイオフィルム培地（ＢＭ）として使用した。特別なＢＭ［トリプチックソイ培養液（３０ｇ／Ｌ）、酵母エキス（６ｇ／Ｌ）、デキストロース（８ｇ／Ｌ）］をアグレガチバクター・アクチノミセテムコミタンスに使用した。バイオフィルムの成長を、２ｍｌのＢＭの入った各ウェルに２０μｌの細胞懸濁液を接種することによって開始させ、１２のウェルを以下のように設定した：対照３ウェル及び各処理３ウェル及びブランク３ウェル。培養物を嫌気条件下において３７℃で２０時間インキュベートして、液体培地を除去した。ウェルを１０ｍＭ ＰＢＳバッファー（ｐＨ７．２）で１回リンスして、バイオフィルムに埋包された細胞を１５秒間緩やかに超音波処理することによって２ｍｌのＰＢＳバッファー中に回収し、希釈した後、ＴＨＹＥプレート上に塗布し、嫌気条件下において３７℃でインキュベートした。バイオフィルムに埋包された生細胞を、４８時間のインキュベーション後のコロニー形成単位（ＣＦＵ）のカウントによって定量化した。予想外なことに、ＮａＥＤＴＡとＳ．ｃｉｔとの組合せは、個々の化合物と比較してより低い濃度でストレプトコッカス・ミュータンス及びアグレガチバクター・アクチノミセテムコミタンスのバイオフィルムのより多くの低減を示し、このことから２つの化合物間の強い相乗効果が示唆される（図１４ａ、図１４ｂ、図１４ｃ及び図１４ｄ）。

Claims (17)

1. （ａ）ＥＤＴＡと、
   （ｂ）クエン酸ナトリウム、クエン酸カリウム及びクエン酸亜鉛の１つ又は複数から選択されるクエン酸塩と、
   を含み、
   キレート剤をＥＤＴＡとクエン酸の濃度の合計が４００ｍｇ／ｌから４０００ｍｇ／ｌであることを特徴とする、
   細菌に関連する口腔内疾患を予防及び治療するための組成物。
2. 前記ＥＤＴＡが二ナトリウム塩又は四ナトリウム塩の形態である、請求項１に記載の組成物。
3. （ａ）ＥＤＴＡと、
   （ｂ）クエン酸ナトリウム、クエン酸カリウム及びクエン酸亜鉛の１つ又は複数から選択されるクエン酸塩と、
   を含み、
   ＥＤＴＡとクエン酸の濃度の合計が３００ｍｇ／ｌから３０００ｍｇ／ｌであることを特徴とする、
   細菌に関連する口腔内疾患を予防及び治療するための組成物。
4. 前記細菌が、ストレプトコッカス・ミュータンス、ストレプトコッカス・ソブリナス、ストレプトコッカス・サングイス（サングイニス）、ストレプトコッカス・ゴルドニ、ストレプトコッカス・オラリス、ストレプトコッカス・ミチス、アクチノミセス・オドントリティカス（Actinomyces odontolyticus）、アクチノミセス・ビスコーサス（Actinomyces viscosus）、アグレガチバクター・アクチノミセテムコミタンス、ポルフィロモナス・ジンジバリス、プレボテラ・インテルメディア（Prevotella intermedia）、バクテロイデス・フォーサイス（Bacteroides forsythus）、トレポネーマ・デンティコラ（Treponema denticola）、フゾバクテリウム・ヌクレアーツム（Fusobacterium nucleatum）、カンピロバクター・レクタス（Campylobacter rectus）、アイケネラ・コローデンス（Eikenella corrodens）、ベイロネア種（Veillonella spp.）、ミクロモナス・ミクロス（Micromonas micros）、ポルフィロモナス・カンジンジバリス（Porphyromonas cangingivalis）、ヘモフィルス・アクチノミセテムコミタンス（Haemophilus actinomycetemcomitans）、アクチノミセス種、バチルス種、マイコバクテリウム種、フソバクテリウム種、ストレプトコッカス種、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）、化膿レンサ球菌（Streptococcus pyogenes）、ストレプトコッカス・アガラクティエ（正：Streptococcus agalactiae）、プロテウス・ミラビリス（Proteus mirabilis）、クレブシエラ・ニューモニエ（Klebsiella pneumoniae）、大腸菌、アシネトバクター種、エンテロコッカス種、プレボテラ種、ポルフィロモナス種、クロスチジウム種、ステノトロホモナス・マルトフィリア（Stenotrophomonas maltophilia）及びカンジダ・アルビカンス（Candida albicans）からなる群より選択される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
5. 水、緩衝液、安定化剤、結合剤、ゲル化剤、脱感作剤、歯牙漂白剤、歯垢沈着防止助剤、界面活性剤、フッ化物、薬草、ビタミン、ミネラル、抗微生物剤、抗生物質、ｐＨ調整剤、香料、安息香酸ナトリウム及び着色剤からなる群より選択される１つ又は複数の成分を更に含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組成物。
6. ＥＤＴＡがＥＤＴＡ二ナトリウムである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組成物。
7. クエン酸ナトリウムとＥＤＴＡ二ナトリウムとを含み、クエン酸ナトリウムとＥＤＴＡ二ナトリウムの合計の濃度が４００ｍｇ／ｌから４０００ｍｇ／ｌである、口腔内疾患を予防及び治療するための組成物。
8. 水、緩衝液、安定化剤、結合剤、ゲル化剤、脱感作剤、歯牙漂白剤、歯垢沈着防止助剤、界面活性剤、フッ化物、薬草、ビタミン、ミネラル、抗微生物剤、抗生物質、ｐＨ調整剤、香料、安息香酸ナトリウム及び着色剤からなる群より選択される１つ又は複数の成分を更に含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の組成物。
9. 前記ミネラルが、亜鉛塩、乳酸亜鉛、クエン酸亜鉛、グルコン酸亜鉛及び塩化亜鉛の１つ又は複数からなる群より選択される、請求項８に記載の組成物。
10. 洗口液／リンス、噴霧剤、溶液、ゲル、水添加剤、研磨用／非歯磨剤ゲル、ペースト、義歯洗浄剤、義歯浸漬液、義歯接着剤又はセメント、チューインガム、キャンディ、ロゼンジ、ビスケット及びソフトドリンクの１つ又は複数として調製される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の組成物。
11. リポソーム系又はナノ粒子送達系を含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の組成物。
12. 過炭酸ナトリウム又は過ホウ素酸ナトリウム、シリコーンポリマー、ラウリル硫酸ナトリウム；フッ化ナトリウム、フッ化第一スズ及びモノフルオロリン酸ナトリウムからなる群より選択されるオーラルケア化合物を更に含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の組成物。
13. ＣＳＰ、ＣＳＰアナログ、ＤｉｓｐｅｒｓｉｎＢ、ナイシン、ラクトフェリシン、オボアルブミン、オボムコイド、硫酸プロタミン、クロルヘキシジン、塩化セチルピリジニウム、トリクロサン、塩化ベンザルコニウム、過酸化水素、没食子酸エピガロカテキン、ランソプラゾール、キシリトール、ソルビトール、オイゲノール、トリポリリン酸ナトリウム、クエン酸、クエン酸ナトリウム、クエン酸カリウム、クエン酸亜鉛、５−フルオロウラシル、シス−２−デセン酸、ＤＮアーゼ Ｉ、プロテイナーゼＫ、銀、ガリウム及び抗微生物ペプチドからなる群より選択される感染防止化合物を更に含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の組成物。
14. 家畜及び産業動物、並びに動物園の動物、スポーツ用動物又はペット動物、例えばイヌ、ウマ、ネコ、ウシ、ブタ及びヒツジの１種又は複数種を治療するために使用される、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の組成物の口腔使用を含む、口腔内疾患を予防又は治療する方法。
15. 前記口腔内疾患が歯科バイオフィルムに関連するものである、請求項１４に記載の方法。
16. 前記口腔内疾患が、齲蝕、歯肉炎、歯周炎、口腔細菌感染及び疾患の１つ又は複数から選択される、請求項１４又は１５に記載の方法。
17. 前記組成物への複数回曝露を更に含む、請求項１４〜１６のいずれか一項に記載の方法。

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