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JP6038040B2 - グリコアルカロイド生合成酵素活性を有するタンパク質とそれをコードする遺伝子 - Google Patents

グリコアルカロイド生合成酵素活性を有するタンパク質とそれをコードする遺伝子 Download PDF

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Description

本発明は、ジャガイモ等ナス科植物における特徴的なグリコアルカロイド化合物を生産する製造方法、グリコアルカロイド生合成酵素、当該グリコアルカロイド生合成酵素をコードするDNA、および当該DNAを用いた新たなジャガイモ等ナス科植物の育種、選抜方法、ならびにグリコアルカロイドを生産しないジャガイモ等ナス科植物に関する。
グリコアルカロイドはステロイダルアルカロイドとも呼ばれる一群の植物由来の化合物である。構造的には炭素鎖が27のイソプレノイドに窒素原子が含まれるものであり、ナス属植物の422種がグリコアルカロイドを含むことが報告されている（非特許文献１の7.8章）。ナス属以外のナス科植物ではユリ科でもグリコアルカロイドを含むものが知られている。その中でも重要なものとしてナス科ナス属のジャガイモ（Solanum tuberosum)のチャコニンおよびソラニン、ならびにトマト（Solanum lycopersicum）のトマチンである。
ジャガイモは、トウモロコシ、イネ、コムギに次いで世界第四番目の生産量を示す作物であるが、塊茎から出る芽や地上部植物は有毒なチャコニンおよびソラニンを含んでいることは周知の事実である。チャコニンやソラニンにより腹痛、めまい、軽い意識障害等の中毒症状を引き起こす。塊茎も、傷害を受けることや太陽光に曝されることでチャコニンおよびソラニンを容易に蓄積するため、塊茎の管理を誤ると中毒事故を起こす危険がある。
これらの中毒事故はしばしば起きており、最近では2009年7月16日に日本国奈良市の小学校でグリコアルカロイドの中毒事件が発生している（Asahi.com報道）。ジャガイモの塊茎は暗所で保存すること等により20mg/100g以下のグリコアルカロイドになるように管理されているため通常は安全な食品である。しかしながら、上記のような中毒事故の危険性を考慮すると、バイレイショにおけるグリコアルカロイドを低減させることはジャガイモの育種、生産、貯蔵、輸送、販売、購買などあらゆるジャガイモを扱っている関係者の関心事である。しかし現在まで達成することはできてはいない。その理由としてはグリコアルカロイドのない野生種のジャガイモが発見されていないこと、グリコアルカロイド生合成経路が未確定であり（非特許文献１の図7.24A,B、非特許文献２）、生合成経路に関与する遺伝子の同定が進まなかったことにある。
グリコアルカロイドはコリンエステラーゼ阻害活性や膜破壊効果等の毒性を持つが、それ以外に、抗癌性活性、肝臓保護効果、鎮痙効果、免疫系促進効果、抗カビ性効果、抗原虫性効果、殺貝剤活性などの薬用作用が知られている（非特許文献１）。トマトではグリコアルカロイドの代謝産物であるesculeoside Aがさまざまな生理学的作用を示すことも報告されている（非特許文献３）。しかし生合成経路が不明であることから、代謝産物を抑制することや効率よく生産する研究・開発はほとんど進んでこなかった。
アグリコン以降の糖転移過程を触媒する酵素遺伝子が幾つか報告されている（非特許文献４−６）。しかし、非特許文献４ではアグリコンであるソラニジンからのγソラニンへの経路であるUDP-ガラクトシルトランスフェラーゼの遺伝子と、当該遺伝子の抑制株を報告しているが、チャコニンの生成は全く抑制できていない（非特許文献４の図２）。非特許文献４ではソラニジンからのγチャコニンへの経路であるUDP-グルコシルトランスフェラーゼの遺伝子と、当該遺伝子の抑制株を報告しているが、チャコニンおよびソラニンいずれの生成も殆ど抑制できていない（非特許文献５の図５）。非特許文献６ではβチャコニンからαチャコニン、βソラニンからαソラニンへの経路であるラムノシルトランスフェラーゼの遺伝子を報告しているが、当該遺伝子の抑制によりα体は減少しているがβ体やγ体は増加している。このように糖転移過程を抑制してもグリコアルカロイド分子種を変化させることはできるが、グリコアルカロイドの総量を調節することは極めて難しいことがわかる。最近、グリコアルカロイドの生合成経路に関わる酸化経路を触媒する酵素遺伝子が報告された（特許文献１）。しかし、具体的な酵素反応は依然不明である。
植物ステロールや植物ホルモンの生合成遺伝子を過剰発現することでグリコアルカロイドの低下を試みた報告がある（非特許文献７）。しかしグリコアルカロイド量は多くても半分程度にしか減少できておらず、経路を改変することにおいては有効な手段を提供していない（非特許文献７の図５）。
グリコアルカロイドは窒素分子を含んでいることを特徴とする。この生合成についての研究は乏しい。総説である非特許文献８には26位末端の水酸基が単純にアミノ基に交換するとして、その供与体はナス科のジャガイモではグリシンやアラニンであるとしている。
WO 2011/025011
Eich, Soloanaceae and Convolvulaceae: Secondary Metabolite (2008), Springer Ginzbergら、 Potato Research (2009) 52: 1-15 Noharaら、 J. Nat. Prod. (2010) 73: 1734-1741 McCueら、 Plant Sci.(2005) 168: 267-273 McCueら、Phytochemistry (2006) 67: 1590-1597 McCueら、Phytochemistry (2007) 68: 327-334 Arnqvistら、 Plant Physiol. (2003) 131: 1792-1799 Heftmann、Phytochemistry (1983) 22: 1843-1860
本発明は、ジャガイモ等ナス科植物における特徴的なグリコアルカロイド化合物を生産する製造方法、グリコアルカロイド生合成酵素、当該グリコアルカロイド生合成酵素をコードするDNA、および当該DNAを用いた新たなジャガイモ等ナス科植物の育種、選抜方法、ならびにグリコアルカロイドを産生しないジャガイモ等ナス科植物の提供を課題とする。
本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた。本発明者は、グリコアルカロイドに窒素分子が含まれていることに着目した。この生合成過程は不明な点が多いが候補遺伝子をin silicoで探しだし、その一部分を用いてRNAiを起こす形で発現させることで内在性の候補遺伝子の発現を抑制させた。その結果、形質転換体の中で顕著にグリコアルカロイド含量が低下しているジャガイモを得ることに成功するとともにグリコアルカロイド生合成酵素遺伝子を同定することができた。また、本遺伝子の発現が抑制された植物を選抜することでグリコアルカロイドのないジャガイモ等ナス科植物を得ることを示した。さらに本遺伝子を発現させることで新規のグリコアルカロイド化合物の生産が可能になり、同遺伝子のゲノム配列を各種のジャガイモ等ナス科植物で比較することにより多型を解析することが可能となり新規に育種されたジャガイモ等ナス科植物を系呈することが可能になることを示し、本発明を完成させるに至った。同様にしてトマトにおいても内在性の遺伝子を抑制することでグリコアルカロイド含量の低減されたトマトを作出することができた。
即ち、本発明は以下の発明を包含する。
[１] 以下の(a)または(b)のタンパク質：
(a) 配列番号１に示すアミノ酸配列からなるタンパク質；および
(b) 配列番号１に示すアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、グリコアルカロイド生合成酵素活性を有するタンパク質。
[２] 以下の(c)〜(f)のいずれかのDNAからなる遺伝子；
(c) 配列番号２に示す塩基配列からなるDNA；
(d) 配列番号２に示す塩基配列からなるDNAに相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、グリコアルカロイド生合成酵素活性を有するタンパク質をコードするDNA；
(e) 配列番号２に示す塩基配列と80％以上の配列同一性を有する塩基配列からなり、かつ、グリコアルカロイド生合成酵素活性を有するタンパク質をコードするDNA；および
(f) 配列番号２に示す塩基配列の縮重異性体からなるDNA。
[３] 以下の(g)又は(h)のタンパク質：
(g) 配列番号３に示すアミノ酸配列からなるタンパク質；および
(h) 配列番号３に示すアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、グリコアルカロイド生合成酵素活性を有するタンパク質。
[４] 以下の(i)〜(l)のいずれかのDNAからなる遺伝子：
(i) 配列番号４に示す塩基配列からなるDNA；
(j) 配列番号４に示す塩基配列からなるDNAに相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、グリコアルカロイド生合成酵素活性を有するタンパク質をコードするDNA；
(k) 配列番号４に示す塩基配列と80％以上の相同性を有する塩基配列からなり、かつ、
グリコアルカロイド生合成酵素活性を有するタンパク質をコードするDNA；および
(l) 配列番号４に示す塩基配列の縮重異性体からなるDNA。
[５] [２]または[４]の遺伝子を含有する組換えベクター。
[６] [５]の組換えベクターを導入した形質転換体。
[７] 植物体である[６]の形質転換体。
[８] (i) ゲノムDNAまたはRNAである核酸を植物から単離する工程、
(ii) (i)の核酸がRNAである場合に逆転写しcDNAを合成する工程、
(iii) (i)または(ii)の工程で得られたDNAから配列番号２または配列番号４に示す塩基配列の少なくとも一部を含有する遺伝子断片を増幅する工程、ならびに
(iv) DNA中に突然変異および／または多型の存在を決定する工程、
とを含む、植物におけるグリコアルカロイド生合成酵素をコードする遺伝子の突然変異および／または多型の存在を検出する方法。
[９] 植物がジャガイモ等のナス科植物である[８]の方法。
[１０] [８]または[９]の方法によってグリコアルカロイド生合成酵素をコードする遺伝子の突然変異および／または多型を検出し、突然変異および／または多型を有する植物体を選抜する方法。
[１１] [１０]の方法により選抜された、グリコアルカロイド生合成酵素をコードする遺伝子に突然変異および／または多型を有する植物体。
[１２] ジャガイモ等のナス科植物である[１１]の植物体。
[１３] グリコアルカロイド生合成酵素をコードする遺伝子の発現能またはコードするグリコアルカロイド生合成酵素の活性が、既存品種に対して変化している植物を選抜する、[８]または[９]の植物体を選抜する方法。
[１４] [１３]の方法によって選抜された、グリコアルカロイド生合成酵素をコードする遺伝子の発現能が既存品種に対して変化しているか、またはグリコアルカロイド生合成酵素の活性が既存品種に対して変化している植物体。
[１５] ジャガイモ等のナス科植物である[１４]の植物体。
[１６] 配列番号２または配列番号４に示されるＤＮＡ配列もしくは前記ＤＮＡ配列に相補的な配列にストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡ配列にコードされるグリコアルカロイド生合成酵素遺伝子の発現が抑制されているか、または該酵素の活性が低下している植物を母本とし、交配により得られた後代を選抜することにより、グリコアルカロイドの蓄積リスクの低減した栽培品種を作出する方法。
[１７] 前記母本が、変異処理によるグリコアルカロイド生合成に関与するアミノトランスフェラーゼ遺伝子の人為的な改変により得られたものであるか、またはその後代である、[１６]の方法。
[１８] 前記母本が、野生株のスクリーニングにより得られたものであるか、またはその後代である、[１６]の方法。
[１９] 前記母本が、アミノトランスフェラーゼ遺伝子のイントロンに挿入配列を含むものである、[１８]の方法。
[２０] 前記交配により得られた後代の選抜にあたり、グリコアルカロイド生合成に関与するアミノトランスフェラーゼ遺伝子の変異を遺伝子マーカーにより検出することを含む、[１６]〜[１９]のいずれかの方法。
[２１] 前記遺伝子マーカーがイントロン中に挿入されるTAの２０回以上の繰り返し配列である、[２０]の方法。
[２２] 前記植物が、ナス科植物である[１６]〜[２１]のいずれかの方法。
[２３] 栽培品種が、ジャガイモである[２２]の方法。
[２４] [１６]〜[２３]のいずれかの方法で作出された栽培品種。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願2011-251927号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
本発明によれば、ジャガイモ等ナス科植物における特徴的なグリコアルカロイド化合物生合成活性を有するタンパク質とそれをコードする遺伝子の活性発現の調整を行うことができ、即ち当該遺伝子の活性が調整された植物を作成する方法、グリコアルカロイドを生産しないジャガイモ等ナス科植物が提供される。本発明によりグリコアルカロイド化合物の含有に特徴があるジャガイモ等ナス科植物の育種が可能になる。本発明の酵素により、様々な有用な生理活性を示すグリコアルカロイド化合物を大量かつ安価に生産できる。
ジャガイモとトマトの生合成遺伝子Ｙの相同性をDNA解析ソフトGENETYX（ゼネティックス社）で解析した結果を示す図である。全般で非常に高い相同性が認められる。 ジャガイモとトマトの生合成遺伝子Ｙの相同性をDNA解析ソフトGENETYX（ゼネティックス社）で解析した結果を示す図である（図１−１の続き）。 ジャガイモとトマトの生合成遺伝子Ｙの相同性をDNA解析ソフトGENETYX（ゼネティックス社）で解析した結果を示す図である（図１−２の続き）。 候補Ｙ遺伝子抑制用ベクターの構造を示す図である。図２には、導入する遺伝子部分のT-DNAのライトボーダー(RB)、レフトボーダー(LB)の内部の構造、制限酵素部位を示す。 ジャガイモ形質転換体のin vitro茎のグリコアルカロイド含量を示す図である。 ジャガイモ形質転換体のin vitro茎から抽出したmRNAに対するRT-PCRの結果を示す図である。 ジャガイモ形質転換体の塊茎の表皮のグリコアルカロイド含量を示す。エラーバーは標準偏差を示す図である。 トマト形質転換体の若い葉のグリコアルカロイド含量を示す図である。エラーバーは標準偏差を示す。 野生種および栽培種のＹ遺伝子の転写産物の電気泳動の結果を示す図である。 野生種および栽培種のＹ遺伝子ゲノムのイントロン１２の構造を示す図である。
以下、本発明を詳細に説明する。
１．新規のグリコアルカロイド生合成酵素
本発明のタンパク質・酵素は、ジャガイモ等ナス科植物（Solanaceae）に含まれるグリコアルカロイド生合成酵素である。ジャガイモ等ナス科には、ジャガイモ（Solanum tuberosum)、トマト（Solanum lycopersicum)、ナス(Solanum melongena）、トウガラシ(Capsium annum）等が含まれる。また、本発明の酵素は、アミノトランスフェラーゼである。本発明の酵素により得られるグリコアルカロイドは、ジャガイモ等のナス科植物に合成されるグリコアルカロイドが含まれ、例えばジャガイモのチャコニン及びソラニン等のグリコアルカロイド、トマトのトマチン等のグリコアルカロイドが挙げられる。
本発明のグリコアルカロイド生合成酵素の基質となる好ましいステロイド化合物としては、Ｃ−２６−ｏｘｏ体であるコレステロール類が挙げられる。コレステロール類としては、コレステロール、シトステロール、カンペステロール、スティグマステロール、ブラシカステロールなどが挙げられる。
本発明の酵素の全長アミノ酸配列は、配列番号１または３に示される。配列番号１はジャガイモ（Solanum tuberosum)由来の酵素のアミノ酸配列を示し、配列番号３はトマト（Solanum lycopersicum)由来の酵素のアミノ酸配列を示す。さらに、本発明のタンパク質は、配列番号１に示されるアミノ酸配列または配列番号３に示されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有し、グリコアルカロイド生合成酵素活性を有するタンパク質を包含する。ここで、実質的に同一のアミノ酸配列としては、当該アミノ酸配列に対して１または数個(１〜10個、好ましくは１〜７個、さらに好ましくは１〜５個、さらに好ましくは１〜３個、さらに好ましくは１個もしくは２個)のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列、または当該アミノ酸配列と、BLAST（Basic Local Alignment Search Tool at the National Center for Biological Information（米国国立生物学情報センターの基本ローカルアラインメント検索ツール））等（例えば、デフォルトすなわち初期設定のパラメータ）を用いて計算したときに、少なくとも85％以上、好ましくは90％以上、さらに好ましくは95％以上、特に好ましくは97％以上の配列同一性を有しているアミノ酸配列が挙げられる。
本発明のグリコアルカロイド生合成酵素は、植物体から単離された天然のグリコアルカロイド生合成酵素および遺伝子工学の手法により製造されたリコンビナントのグリコアルカロイド生合成酵素を含む。
２．グリコアルカロイド生合成酵素をコードする遺伝子
本発明の遺伝子は、上記のグリコアルカロイド生合成酵素活性を有するタンパク質をコードする遺伝子である。本発明の遺伝子をＹ遺伝子と呼ぶ。
本発明の遺伝子のDNAの塩基配列は、配列番号２または４に示される。配列番号２はジャガイモ（Solanum tuberosum)由来の遺伝子のDNAの塩基配列を示し、配列番号４はトマト（Solanum lycopersicum)由来の遺伝子のDNAの塩基配列を示す。図１−１〜図１−３に、ジャガイモとトマトの遺伝子の相同性をDNA解析ソフトGENETYX（ゼネティックス社）で解析した結果を示す。さらに、配列番号２または４に示される塩基配列に相補的な塩基配列を有するDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNA、配列番号２または４に示される塩基配列と、BLAST（Basic Local Alignment Search Tool at the National Center for Biological Information（米国国立生物学情報センターの基本ローカルアラインメント検索ツール））等（例えば、デフォルトすなわち初期設定のパラメータを用いて）を用いて計算したときに、少なくとも85％以上、好ましくは90％以上、さらに好ましくは95％以上、特に好ましくは97％以上の配列同一性を有しているDNA、または前記DNAによりコードされるタンパク質のアミノ酸配列に対して１または数個(１〜10個、好ましくは１〜７個、さらに好ましくは１〜５個、さらに好ましくは１〜３個、さらに好ましくは１個もしくは２個)のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNAであって、グリコアルカロイド生合成酵素活性を有するタンパク質を有するタンパクをコードするDNAを包含する。ここで、「ストリンジェントな条件」とは、例えば、「１XSSC、0.1％ SDS、37℃」程度の条件であり、より厳しい条件としては「0.5XSSC、0.1％ SDS、42℃」程度の条件であり、さらに厳しい条件としては「0.2XSSC、0.1％ SDS、65℃」程度の条件である。さらに、本発明の遺伝子は、配列番号２または４に示す塩基配列の縮重異性体からなるDNAを包含する。
３.組換えベクター
本発明のベクターは、上記配列番号２または配列番号４のDNAが挿入された組換えベクターである。ベクターとしては公知の大腸菌用、酵母用、植物細胞用、昆虫細胞用等のものを広く使用できる。本発明において使用されるベクターには、プロモーター、ターミネーター、エンハンサー等の遺伝子の発現や抑制に関する構成要素が組込まれ、必要に応じて、選択マーカー（例えば、薬物耐性遺伝子、抗生物質耐性遺伝子、レポーター遺伝子）を含有する。遺伝子の発現や抑制に関する構成要素は、その性質に応じて、それぞれが機能し得る形で組換えベクターに組み込まれることが好ましい。そのような操作は、当業者であれば適切に行うことができる。
４．形質転換体
本発明の形質転換体は、本発明の組換えベクターを保持する形質転換体である。形質転換体は、酵素をコードする遺伝子を挿入した組換えベクターを、目的遺伝子が発現し得るように宿主中に導入することにより得ることができる。宿主は、ベクターに適したものを使用すればよい。例えば、大腸菌、酵母、植物細胞、昆虫細胞（Sf9など）、植物ウイルスなどが挙げられる。好ましくは、大腸菌、酵母、植物細胞などが挙げられる。組換えベクターの導入方法は、微生物にDNAを導入する方法であれば特に限定されるものではない。例えばカルシウムイオンを用いる方法[Cohenら、Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 69：2110(1972)]、エレクトロポレーション法、トリペアレンタルメイティング(tri-parental mating）法等が挙げられる。また、形質転換植物体を作製する方法として、ウイルス、アグロバクテリウムのＴｉプラスミド、Ｒｉプラスミド等をベクターとして用いる方法が挙げられる。宿主植物としては、イネ、ムギ、トウモロコシ等の単子葉植物、ダイズ、ナタネ、トマト、ジャガイモ等の双子葉植物が挙げられる。形質転換植物体は、本発明の遺伝子で形質転換した植物細胞を再生させることにより得ることができる。植物細胞からの植物体の再生は公知の方法により行うことができる。
５．グリコアルカロイド生合成酵素の製造とグリコアルカロイド化合物の生産方法
本発明のグリコアルカロイド生合成酵素はアミノトランスフェラーゼであり、通常の植物体から回収することができる。さらには、例えば、本発明の遺伝子で形質転換した大腸菌、酵母等の微生物や昆虫細胞発現系を用いた大量生産により製造することができる。大腸菌の例としては、Clarkら[2009, J. Exp. Bot. 60:1743-1757]のものが挙げられる。
これらの系を使って、高い活性を持ったタンパク質として発現できるため、大腸菌の培養液に前記グリコアルカロイド生合成酵素の基質とアミノ基の供与体を添加することにより、グリコアルカロイド化合物を生産することができる。例えば、形質転換大腸菌の培養液にＣ−２６−ｏｘｏ体のコレステロール類を基質として、各種アミノ酸やGABAをアミノ基の供与体として投与することにより、アミノ化されたコレステロール類を効率的に大量に生産することが可能である。酵母がサイトゾルにDMAPPを生合成する経路（メバロン酸経路）を有していることや、大腸菌にメバロン酸経路を導入することで前駆体や基質を生産することが可能にしたことが報告されている（原田と三沢 Appl Microbiol Biotechnol. (2008):1021-31）。このような方法を組み合わせることでより多量のグリコアルカロイド化合物を生産することが可能となる。
６．遺伝子抑制方法
本発明は、植物におけるグリコアルカロイド生合成酵素遺伝子を抑制する方法を提供する。抑制する方法は、遺伝子組換えによるRNAi法、アンチセンス法、ウイルスベクターを利用したPTGS法、small RNA等を直接導入する方法など、遺伝子の発現を抑制するための方法を用いることができる。また、ZFN(zinc finger nuclease)法、TALEN(Tale nuclease)法 ［Science,333,307(2011)］、Cre-loxP部位特異的組換え法などのゲノム自体を改変するものであってもあっても構わない。これらの方法には、本発明で提供される配列を直接変異の導入部位として利用するものが含まれる。あるいは本発明で提供される配列とゲノム情報等から近接領域の配列を特定し、当該近接領域の配列を利用することにより、グリコアルカロイド遺伝子の全領域を欠失させることもできる。
７.遺伝子変異、多型個体、遺伝子発現変異の選抜
本発明は、植物におけるグリコアルカロイド生合成酵素遺伝子突然変異、一塩基多型（SNP)等の多型、遺伝子発現変異の存在を検出するための方法を提供する。変異個体は放射線によるもの、化学処理によるもの、UV照射によるもの、自然突然変異によるものであっても構わない。
この方法には、ゲノムDNAやRNAを変異個体や様々な品種や育成個体の植物から単離し、後者は逆転写しcDNAを合成する工程と、DNA増幅技術の使用によりDNAからグリコアルカロイド生合成酵素遺伝子を含有する遺伝子断片を増幅する工程と、このDNA中に突然変異の存在を決定する工程が含まれる。DNAやRNAを抽出する方法には市販のキット（例えばDNeasyやRNeasy(キアゲン社)など）が使用できる。cDNAを合成する方法も市販キット（例えばスーパースクリプト ファーストストランド システム（インビトロジェン社）など）を使うことができる。DNA増幅技術の使用により遺伝子断片を増幅する方法としては、いわゆるPCR法やLAMP法などの技術を用いることができる。これらは継続的なポリメラーゼ反応により特異的なDNA配列の増幅（つまり、コピー数を増やすこと）を達成するためにポリメラーゼを使用することを基にした、一群の技術を意味する。この反応は、クローニングの代わりに使用することができるが、必要であるのは、核酸配列に関する情報のみである。DNAの増幅を行うために、増幅しようとするDNAの配列に相補的なプライマーを設計する。次にそのプライマーを自動DNA合成により作成する。DNA増幅方法は、当技術分野で周知であり、本明細書中で与えられる教示および指示に基づき、当業者であれば容易に行うことができる。いくつかのPCR法（ならびに関連技術）は、例えば、米国特許第4,683,195号、同第4,683,202号、同第4,800,159号、同第4,965,188号、およびInnisら編、PCR Protocols:A guide to method and applicationsで述べられている。
DNA中に突然変異や多型の存在を決定する工程では塩基配列の決定（アプライドバイオシステムズ社）やミスマッチペアの片側を切断する酵素を用いて突然変異体を検出するTILLING法（Tillら, 2003, Genome Res 13:524-530）など変異遺伝子と正常遺伝子の相同性を利用し検出する方法を用いればよい。これらは該技術から得られた配列データを遺伝子部分に関する配列番号２または配列番号４に表される塩基配列と比較することで行うことができる。
mRNA量の違いを決定する工程では上記cDNAに対し、配列番号２または配列番号４に表される塩基配列に基づいて作製したプライマーを利用してRT-PCR法やリアルタイムPCR法等の定量的PCRを採用すればよい。その後、例えば、品種「サッシー」から得られたcDNAの量と比較することでmRNA量の違いを決定することができる。
特に好ましい実施形態において、上記で定義したグリコアルカロイド生合成酵素遺伝子の変異の存在の決定方法を、ナス科植物（Solanaceae）のジャガイモ（Solanum tuberosum）あるいはその近縁種から得られた材料に適用する（実施例７）。
ジャガイモあるいはその近縁種に属する野生種については、グリコアルカロイド生合成に関する遺伝子型および表現型が未知のものが数多く存在する。これらの野生種をスクリーニングすることにより、生合成遺伝子に変異を有し、グリコアルカロイドの蓄積が検出されないか栽培種に比べて低下している野生株、もしくは交配によって低下をもたらす可能性のある株を選抜することができる（実施例８）。
上記の突然変異および／または多型を決定する方法により、グリコアルカロイド生合成酵素をコードする遺伝子の突然変異や多型を塩基レベルで同定することができ、さらにグリコアルカロイド生合成酵素をコードする遺伝子に突然変異および／または多型を有する植物体を選抜することができる。本発明はこのようにして得られたグリコアルカロイド生合成酵素をコードする遺伝子に突然変異や多型を有する植物体を包含する。
また、突然変異や多型の決定、mRNA量の違いの決定、グリコアルカロイド生合成酵素をコードする遺伝子の発現能またはグリコアルカロイド生合成酵素の活性が変化している植物を選抜することが可能になる。
ここで、グリコアルカロイド生合成酵素をコードする遺伝子の発現能またはグリコアルカロイド生合成酵素の活性の変化は、人為的突然変異もしくは野生種などに保存されている自然突然変異または遺伝的多型によりもたらされるものを含む。活性の変化とは活性の低下または上昇をいう。グリコアルカロイド生合成酵素の活性の改変は、グリコアルカロイド生合成酵素が本来有する正常な機能が低下した若しくは正常な機能を喪失していることを含む。
このような遺伝子の変異としては、例えば、グリコアルカロイド生合成遺伝子における遺伝子の総てまたは一部欠失、一部塩基の他の塩基への置換、塩基の挿入等を含む。塩基の挿入の例として、グリコアルカロイド生合成遺伝子のエクソンにおける数十〜数百個の連続した塩基の挿入が挙げられ、一部塩基の他の塩基への置換の例として、イントロンにおける5'スプライシング保存配列の置換並びにイントロンにおいて異常な転写産物を生じる配列の挿入が挙げられ、該置換により正常なスプライシングが生じなくなる。具体的には、例えば、イントロン中、例えば、エクソン１２とエクソン１３の間のイントロン中に挿入されるTAの２０回以上の繰り返し配列、例えば２０〜４０回の繰り返し配列、好ましくは２３〜３４回の繰り返し配列である。本発明はこのような遺伝子変異を有する植物も包含する。本発明はこのような遺伝子変異を有する植物を選抜して母本とすることも含む。さらに、該植物を母本として、交配により得られた後代を選抜することにより、グリコアルカロイドの蓄積リスクの低減した栽培品種を作出することができる。
さらに、グリコアルカロイド生合成酵素の活性が変化した植物は、グリコアルカロイド生合成酵素をコードする人為的な変異処理により遺伝子を改変することによっても得ることができる。ある植物のグリコアルカロイド生合成酵素活性の突然変異による改変は、その植物の種に含まれる既存品種に対する改変をいい、既存品種には野生型も含まれるが、自然状態で出現した野生種であっても、すでに産業上利用されている品種でなければ既存品種には含めない。既存の品種は、グリコアルカロイド生合成酵素活性が改変された植物が得られたときに存在するすべての品種をいい、交配、遺伝子操作等の人為的操作により作出された品種を含む。また、活性の改変において、すべての既存品種に対して、活性が変化している必要はなく、特定の既存品種に対して改変されていれば、「グリコアルカロイド生合成酵素の活性が改変された植物」に含まれる。「グリコアルカロイド生合成酵素の活性が改変された植物」は、人為的操作を受けず自然状態で突然変異により活性が改変された植物も含み、本発明の方法により、自然状態で活性が変化した植物を選抜することができ、新たな品種として確立することもできる。また、ある既存品種に変異誘発処理を行い、グリコアルカロイド生合成酵素の活性が改変された植物を作出した場合、比較対象は変異誘発処理を行った品種と同じ既存品種でもよいし、それ以外の他の既存品種でもよい。また、自然界からの選抜あるいは変異誘発処理により作出された、グリコアルカロイド生合成酵素をコードする遺伝子に突然変異や多型を有する植物を交配することにより、グリコアルカロイド生合成酵素をコードする遺伝子の変異が固定されグリコアルカロイド生合成酵素遺伝子の発現能またはグリコアルカロイド生合成酵素活性が改変された植物新品種として得ることもできる。
例えば、植物がジャガイモ（Solanum tuberosum）の場合、既存品種として、「シンシア」、「サッシー」（ジャパンアグリバイオ社販売）、「シェリー」、「男爵」、「メークイーン」、「さやか（農林登録番号：農林３６号）」等がある。ここで、グリコアルカロイド生合成酵素をコードする遺伝子の発現能またはグリコアルカロイド生合成酵素の活性が既存品種に対して改変された植物とは、既存品種に対してグリコアルカロイド生合成酵素をコードする遺伝子の発現能が増強した植物および低下した植物を含み、さらに、グリコアルカロイド生合成酵素の活性が既存品種に対して上昇した植物および低下した植物を含む。本発明は、このようなグリコアルカロイド生合成酵素をコードする遺伝子の発現能またはグリコアルカロイド生合成酵素の活性が既存品種に対して改変された植物体も包含する。
特に有毒物質であるグリコアルカロイド生合成酵素の活性が低下した植物が好ましい。このような植物体は、グリコアルカロイド生合成酵素の合成量が低いか、または合成できず、植物体中のグリコアルカロイド生合成酵素の含量が低いか、またはグリコアルカロイド合成酵素が存在せず、あるいはグリコアルカロイド合成酵素の活性が低いかまたは喪失している。その結果、植物体内のグリコアルカロイド含量も低いか、あるいはグリコアルカロイドが存在しない。例えば、ジャガイモの場合はチャコニンおよびソラニン等のグリコアルカロイドが合成されず、ジャガイモの塊茎内においてチャコニンおよびソラニン等のグリコアルカロイドの合成量および存在量が低い。また、トマトの場合は、トマチン等のグリコアルカロイドが合成されず、トマトの実内においてトマチン等のグリコアルカロイドの合成量および存在量が低い。
ジャガイモの場合、グリコアルカロイド合成酵素の活性が低いか、喪失した植物体は、塊茎内でチャコニンおよびソラニン等のグリコアルカロイドが合成されないか、または上記の既存品種に比べて塊茎内で合成されるチャコニンおよびソラニン等のグリコアルカロイドが少なく、塊茎内に存在するチャコニンおよびソラニン等のグリコアルカロイドの量も低い。
グリコアルカロイド生合成遺伝子に変異を有する植物（変異処理によるグリコアルカロイド生合成に関与するアミノトランスフェラーゼ遺伝子の人為的な改変により作られた変異株もしくはスクリーニングにより選抜された野生株）を母本として、グリコアルカロイドの蓄積が低減もしくは消失し、かつ食味や栽培特性の優れた栽培品種を作出することができる。本発明において、グリコアルカロイドの蓄積が低減もしくは消失した栽培品種を、グリコアルカロイドの蓄積リスクの低減した栽培品種とも呼ぶ。
８．交配による、グリコアルカロイドの蓄積が低減もしくは消失した栽培品種の作出
上記により得られた変異株もしくは選抜された野生株を母本として、グリコアルカロイドの蓄積が低減もしくは消失した栽培品種を作出することができる。栽培品種から得られた変異株を母本とする場合は、当該変異株同士を交配するか、目的とする同じ遺伝子の異なる部位に変異を有する変異株同士を交配することが変異を早期に固定する上で有利と考えられる。ジャガイモやジャガイモ近縁種との交配については、古典的な自家不和合性や胚乳均衡数(EBN: Endosperm Balance Number)説による不和合などの障害が知られているが、これらは胚珠への直接受粉、胚珠培養、正逆の交雑の実施、体細胞融合等の処理を行うことで交配もしくは交配と同等の処理を実施することが可能である。これらについては「ジャガイモ辞典」(2012)財団法人いも類振興会編集、全国農村教育協会や「Handbook of potato production, inprovement, and postharvest management」(2006) GopalとPaul Khurana編集 p.77-108 Haworth Press Inc.を参考にすることができる。野生株を、変異を有する遺伝子を持つ導入元とする場合は、導入先の親を栽培種とし導入先の親との戻し交配を行うことで、栽培種の持つ食味や栽培上の優れた特性を維持したまま変異を有する遺伝子を導入することができる。また、当該遺伝子の変異した部位を塩基配列レベルで解析することにより、変異に関する遺伝子マーカーを取得することができる。さらに、昨年、報告されたジャガイモゲノムシークエンス（Nature. 2011;475:189-95）等のゲノム情報を参照することにより、当該遺伝子の近傍に位置する遺伝子マーカーを複数取得し、所望の変異部位のみが導入された後代の選抜を効率的に実施することもできる。当該遺伝子の近傍だけでなく、ゲノム全体をカバーする領域に詳細なマーカーを得ていれば、必要な部分（遺伝子領域）だけを導入元から導入先に入れることができる。この場合、マーカーが導入したい遺伝子（形質）と遺伝距離がある場合は、ある程度の確率でマーカーと形質の分離が起こる可能性があり、形質の検定が必須となる。しかし、本発明で見出した遺伝子変異は形質と一致しているため、形質の検定が必要でなく、交配した種子は発芽しDNAが得られた時点で確実な検定が実施できる。これらのDNAマーカーによる検定技術については鵜飼 保雄「ゲノムレベルの遺伝解析―MAPとQTL」(2001) 東京大学出版会等を参考にすれば実施できる。例えば、前記DNAマーカーはプライマー等のポリヌクレオチドを用いて存在を決定することができる。
以下、本発明を、実施例を示してより詳しく説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
（実施例１）グリコアルカロイド生合成候補遺伝子Ｙの全長配列の取得
ジャガイモ（Solanum tuberosum）の品種「サッシー」の萌芽からmRNAの抽出をRNeasy（キアゲン社）で行った。全cDNAの合成はスーパースクリプト ファーストストランド システム（インビトロジェン社）を用いて行った。近年、大山らはグリコアルカロイドのアミノ基の導入は２６位のアルデヒド体を経由することを示している（第28回日本植物細胞分子生物学会（仙台）大会 講演要旨集（2010）p.165 ）。このアルデヒド体へのアミノ基転移反応にはアミノトランスフェラーゼが介在することが予想されるが、類似する反応は全く知られていない。そこで、同じナス科のトウガラシで、全く違う構造体であるバニリンからバニリルアミンを触媒する酵素をコードする遺伝子pAMTを参考とすることとした（Langら Plant J. (2009) 59: 953-961）。ナス科ゲノムネットワーク(http://solgenomics.net/index.pl)に登録されているunigeneをNCBI Blast法によって検索したところ、相同性の指標であるE valueが極めて低く、アライメントした際のアミノ酸の同一性が80%以上の遺伝子断片を６つ見出すことができた（SGN-U268561, SGN-U268558, SGN-U277939, SGN-U268560, SGN-U268559, SGN-U274756）。この中から萌芽で多くのESTクローンが単離されている遺伝子SGN-U268561に注目した。
この配列を元にプライマー[U1008: caccATGGCCAAGACTACTAATGGATTT （配列番号５、このプライマーには、遺伝子をベクターにクローニングするため、5’末端に４塩基（cacc）が人工的に付加されている。）、U1007: CCATCAAGTTTTTGTCCATGAG （配列番号６）]を用いてアニール温度55℃でPCR（30サイクル、タカラバイオ社 PrimeSTAR HS DNA Polymeraseを使用）によって遺伝子を増幅した。これをpENTRTM/D-TOPOエントリーベクター（インビトロジェン社）へクローニングした。得られた8個の独立クローンについてABI310（アプライドバイオシステムズ社）を用いて塩基配列を決定した。これにより得られた配列は、配列番号１であり、それから推定されるアミノ酸配列は配列番号２である。酵素活性が異なるトウガラシpAMTのアミノ酸配列に対しては全長に渡って82.4％の同一性を有していた。
なお、トマトの相同遺伝子は、ナス科ゲノムネットワーク(http://solgenomics.net/index.pl)の、SGN-U570903に相当する。ORFを含む部分を配列番号４に、cDNA配列からコードされる酵素のアミノ酸配列を配列番号３に示す。トマトとジャガイモの遺伝子の塩基配列を比較したところ相同性は96.0%であった。驚くべきことに当該遺伝子はトマトのgamma-aminobutyrate transaminase subunit precursor isozyme 2(GABA-T2)として報告されている遺伝子のアミノ酸配列（Clarkら J. Exp. Bot. (2009) 60: 3255-3267, Akihiroら Plant Cell Physiol. (2009) 60: 3255-3267）と98.9％の同一性を有していたが（表１）、GABA-T2がグリコアルカロイドの生合成に関わることは知られていない。
（実施例２）グリコアルカロイド生合成候補遺伝子Ｙのゲノム遺伝子の同定
ジャガイモ遺伝子のゲノム配列は最近報告された（Xuら Nature (2011) 475: 189-197）。ゲノム配列はPotato Genome Sequencing Consortium Data ReleaseのHP(http://potatogenomics.plantbiology.msu.edu/index.html)で公開されている。この配列を元にＹのゲノム遺伝子を決定することが可能である。
トマト遺伝子のゲノム配列は同じくナス科ゲノムネットワークのSL1.00sc03540、SL2.31ch12、SL2.40ch12として３つのゲノム構造が掲載され16のイントロンを含むことが報告されている。しかし、同ホームページには、なんら機能に関する報告はない。
（実施例３）グリコアルカロイド生合成候補遺伝子Ｙの抑制形質転換体を作成するためのベクター構築
遺伝子を形質転換によって抑制する方法としては、強力なプロモーターで駆動する構成を持つ逆方向の相補鎖遺伝子断片の発現（植物で一般的にRNAi法と呼ばれる）で行った[Chuangと Meyerowitz Proc Natl Acad Sci U S A., 97, 4985-90 (2000)、WesleyらPlant J., 27, 581-90 (2001)]。実施例１で取得した全長cDNAに対し、プライマー[U895: GAGCTCTAGATATTTGATTTGCCACCTCCAT （配列番号７）、U896: GGATCCATATGCTTACAAGCACAGCACCAA （配列番号８）]を用いてアニール温度55℃でPCR（30サイクル、タカラバイオ社 ExTaq DNA Polymeraseを使用）によって遺伝子を増幅した。これをpCR4-TOPOベクター（インビトロジェン社）へクローニングし、遺伝子断片を取得した。バイナリーベクターpKT11（特開2001-161373号公報）を基本として、カルフラワーモザイクウイルスの35S RNAプロモーター、当該遺伝子断片を順方向、シロイヌナズナのフィトエンデサチュラーゼ遺伝子（AT4g14210）の第３イントロン、当該遺伝子断片を逆方向、カルフラワーモザイクウイルスの35S RNAターミネーターの順に連結を行い、植物形質転換用ベクターpKT250を作成した（図２）。
（実施例４）ジャガイモ形質転換植物体の作出
実施例３で作製したベクターをエレクトロポレーション法(GelvinとSchilperoor編, Plant Molecular Biology Manual, C2, 1-32 (1994), Kluwer Academic Publishers)により、アグロバクテリウム・ツメファシエンスGV3110株に導入した。ベクターを含むアグロバクテリウム・ツメファシエンスGV3110株を、50ppmのカナマイシンを含むYEB液体培地[5g/lビ−フエキス、1g/l酵母エキス、5g/lペプトン、5g/lスクロ−ス、2mM硫酸マグネシウム(pH7.2)]にて28℃、12時間振とう培養した。培養液1.5 mlを10,000rpm、３分間遠心して集菌後、カナマイシンを除くために１mlのLB培地で洗浄した。更に10,000rpm、３分間遠心して集菌後、1.5 mlの３％蔗糖を含むMS培地[Murashige & Skoog, Physiol. Plant., 15, 473-497 (1962)]に再懸濁し、感染用菌液とした。
ジャガイモの形質転換は[門馬(1990)植物組織培養7:57-63]に従い実施した。ジャガイモ品種「サッシー」（ジャパンアグリバイオ社）から得られたマイクロチューバーを２〜３mmにスライスし、アグロバクテリウム感染用の材料とした。これを上記のアグロバクテリウムの菌液に浸した後、滅菌済みの濾紙上に置いて過剰のアグロバクテリウムを除いた。シャーレ内のMS培地（Zeatin 1ppm, IAA 0.1ppm, アセトシリンゴン100μM、及び寒天0.8％を含む）上に置き、培養は３日間25℃、16時間照明（光量子束密度32μE/m2ｓ）／８時間無照明の条件下で行った。ついで、アセトシリンゴンの代わりにカルベニシリン250ppmを含んだ培地で１週間培養した。その後、さらにカナマイシン50 ppmを含む培地上に移し、２週間ごとに継代した。この間に不定芽が形成し、シュートを生じた。伸張したシュートをカルベニシン250 ppm及びカナマイシン100 ppmを含み、植物生長調節物質を含まないMS培地に置床した。発根したシュートをカナマイシン耐性の生長した植物体の中から外来遺伝子としてカナマイシン耐性遺伝子を含有する個体を、PCR（条件：９５℃５分、（９５℃３０秒、５５℃３０秒、７２℃１分）を３０回、７２℃１０分）を行うことで検出し、該再分化植物体が形質転換植物体であることを確認した。ここで、カナマイシン耐性遺伝子の配列を特異的に増幅するプライマーとして、TAAAGCACGAGGAAGCGGT（配列番号９）、及びGCACAACAGACAATCGGCT（配列番号１０）を用いた。以上から、ベクターpKT250が導入されたジャガイモの形質転換植物体25系統を取得した。
（実施例５）形質転換植物体のグリコアルカロイド含量と候補遺伝子Ｙの発現解析
実施例４で得られた30個体のin vitro茎を継代後一ヶ月伸張させ、その部分2〜4本をまとめて約100mgにしアルカリ耐性の逆相クロマトグラフィー用カラムを用いた液体クロマトグラフィーを用いた以下の方法（特許公開2011-27429）によりグリコアルカロイド含量を測定した。
実施例４で得られた25個体のin vitro茎を継代後一ヶ月伸張させ、その部分を2〜4本をまとめて約100mgにし0.1％ギ酸 in 80％MeOH aq. 990μLおよび内部標準としてブラシノライド（ブラシノ社）10μg/10μLを添加し、ミキサーミルで破砕した（1/25 sec, 10 min, 4℃）。得られた破砕物を遠心分離（10,000 rpm, 5 min, 4℃）に供しアルコール沈殿を行った。上清25μLを分取し、0.1％ギ酸水で475μLを加え、マルチスクリーンソルビナート（ミリポア社）でフィルターろ過しLC-MS（島津製作社、LCMS-2010EV、またはウォーターズ社、Alliance e2795 Q-micro）を用い解析した。LCの条件はカラム（XBridgeTM Shield RP18-5（φ2.1×150 mm, ウォーターズ社））で移動相（A：10 mM炭酸水素アンモニウム水（pH 10）：B：アセトニトリル＝４０：６０）アイソクラティック（カラムオーブン：40℃）で分離し解析した。標準品（チャコニン、ソラニン（いずれもシグマ・アルドリッチ社））を用いて定量した。
得られた25個体のin vitro茎から２回の分析を繰り返すことで、5系統（#1, #9, #11, #15, #22）においてはグリコアルカロイドの蓄積が再現性よく低いことを確認した。これら低グリコアルカロイド5系統、低くなかった2系統(#8, #25)、遺伝子を導入していない対照の個体１つのin vitro茎を約200mg採取し、液体窒素で粉砕し、半分をグリコアルカロイド含量の測定、半分をmRNAの測定を行った。低グリコアルカロイド5系統はグリコアルカロイドの蓄積が非形質転換体（１個体）や低くはならなかった２系統と比較して極めて低いことが再確認できた（図３）。各系統から、全RNAの抽出はRNeasy（キアゲン社）で、全cDNAの合成はスーパースクリプト ファーストストランド システム（インビトロジェン社）を用いて行った。プライマー [U935: TGGGGTGTTGGTACATATTTTG （配列番号１１）、U1007: TTCCTCTTTGGCTTTCTCCA （配列番号１２）]を用いたRT-PCR（条件：95℃５分、（95℃30秒、55℃30秒、72℃３分）を25回、72℃5分）の結果、Ｙ遺伝子のmRNAの発現は低グリコアルカロイド5系統では、極めて少ないか観察できなかった（図４）。このことから、候補遺伝子Ｙの遺伝子の発現を抑制することによってグリコアルカロイドの蓄積が極端に減少することが明らかとなり、候補遺伝子Ｙはグリコアルカロイド生合成酵素をコードする遺伝子であることが明らかとなった。
（実施例６）低グリコアルカロイド系統の形質転換植物体から塊茎の作成
非形質転換体とともに、これら低グリコアルカロイド5系統のうち３系統のin vitro植物を増殖し、各３個体を市販されている野菜用の培養土に馴化しバイオハザード温室で定法に従い栽培し塊茎を収穫した。この３系統の各個体(#9, #11, #22)は非形質転換体と同等の生育を示し、同等の塊茎を収穫することができた（表１）。
Figure 0006038040
さらに収穫した塊茎各３つの中央部表皮を約１mmで剥離し同様にグリコアルカロイド含量を解析した。その結果、驚くべきことに、塊茎でのグリコアルカロイドは極めて低いことが確認できた（図５）。
（実施例７）トマト形質転換植物体の作出
トマトの形質転換は[Sunら (2006) Plant Cell Physiol. 47:426-431.]に従い実施した。（実施例３）で作製したベクターpKT230を含むアグロバクテリウム・ツメファシエンスAGL0株を培養し感染用菌液とした。トマト（Solanum lycopersicum）実験系統「マイクロトム」の無菌播種植物体の子葉を５mm以下の切片を、上記のアグロバクテリウム懸濁液に浸し、10分間感染した後、滅菌済みの濾紙上に葉を置いて過剰のアグロバクテリウムを除いた。シャーレ内の共存MS培地（ゼアチン1.5mg/l、アセトシリンゴン40μM及びゲルライト0.3％を含む）[Murashige & Skoog, Physiol. Plant., 15, 473-497 (1962)]上に葉を置き、シャーレを暗所で３日間25℃で培養した。切片は選択MS培地１（ゼアチン1.5mg/l、カナマイシン100mg/l、オーグメンチン375mg/l及びゲルライト0.3％を含む）で25℃、16時間照明（光量子束密度32μE/m2ｓ）／８時間無照明の条件下で２週間ごとに継代した。この間に不定芽が形成し、シュートを生じた。さらにシュートを伸張させるため、選択MS培地２（ゼアチン1.0mg/l、カナマイシン100mg/l、オーグメンチン375mg/l及びゲルライト0.3％を含む）に移植し、伸張したシュートは選択1/2濃度MS培地（カナマイシン100mg/l、オーグメンチン375mg/l及びゲルライト0.3％を含む）で発根させた。シュートをカナマイシン耐性の生長した植物体の中から外来遺伝子としてカナマイシン耐性遺伝子を含有する個体を、上述のカナマイシン耐性遺伝子の配列を特異的に増幅するプライマーによるPCRを行うことで検出し、該再分化植物体が形質転換植物体であることを確認した。ベクターpKT250が導入されたトマトの形質転換植物体30系統を取得した。得られた30系統を温室に馴化し約1ヶ月栽培し、新しく展開した若い葉の3枚から各約100mg秤量し、ジャガイモと同様に実施例５の方法によりグリコアルカロイド含量（αトマチン量、標品のαトマチンはシグマ・アルドリッチ社）を測定した。ただし、分析条件は移動相A：移動相B＝60:40の割合を用いた。30系統のうち14系統は対照の平均である新鮮重100mgあたり266μgの1/5以下(< 53μg)と顕著にトマチン含量が低かった（図６）。
（実施例８）グリコアルカロイド生合成候補遺伝子Ｙ変異植物のスクリーニング
３％蔗糖を含むMS培地[Murashige & Skoog, Physiol. Plant., 15, 473-497 (1962)]などで継代したジャガイモのインビトロ植物体に量子ビーム照射（NIRS-HIMAC照射装置、アルゴンイオンビーム500MeV/核子を0.1から3Gyまたは、ネオンイオンビーム400Mev/核子を0.2から3Gy、または炭素イオンビーム290MeV/核子を0.5Gyから5Gy）で変異処理を行う。変異処理後、生育した植物体からそれぞれ葉を採取し常法によりゲノムDNAを採取する。当該ゲノムDNAをテンプレートとして上述のプライマー[U1008: caccATGGCCAAGACTACTAATGGATTT （配列番号５）、U1007: CCATCAAGTTTTTGTCCATGAG （配列番号６）]を用いてPCRを行い、Ｙ遺伝子の含まれる領域を取得し、さらに遺伝子クローニング用キットなどを用いてクローニングする。クローニングされた領域の塩基配列を決定し、Ｙ遺伝子に変異の生じた個体を選抜することができる。
（実施例９）グリコアルカロイド生合成遺伝子Ｙ変異植物の同定
NRSP-6 - United States Potato Genebank (http://www.ars-grin.gov/nr6/)より入手した野生種で、ジャガイモ（Solanum tuberosum)の近縁種であるSolanum circaeifolium に属するPI 498120の真性種子を発芽させ５系統の植物体を得た。両系統からゲノムDNAの抽出をDNeasy（キアゲン社）にて行った。そのうちFTT14系統から全RNAの抽出をRNeasy（キアゲン社）で行い、全cDNAの合成はスーパースクリプト ファーストストランド システム（インビトロジェン社）を用いて行った。Ｙ遺伝子の転写産物を増幅することができるプライマーU1039: TCAAGAAAGCTTGAAGGAATG（配列番号１３）とプライマーU1040: TTACTTTTTCTGAGACTTGAGTTCTTC（配列番号１４）を用いてRT-PCR（条件：95℃５分、（95℃30秒、55℃30秒、72℃３分）を30回、72℃5分）を行った（対照はSolanum lignicaleと品種サッシーの全cDNA）ところ、アガロース電気泳動による解析では、対照の転写産物と比較して、転写産物が小さく、かつ、分子種を複数含んでいることを認めた（図７）。増幅された転写産物をpCR4-TOPOベクター（インビトロジェン社）へクローニングし、シークエンスを行い、品種サッシーの転写産物の配列と比較した。その結果、クローン１はエクソン１３、１４が欠失、クローン２と３ではエクソン１２、１３、１４が欠失、クローン４はエクソン１３、１４、１５、１６と１７の一部が欠失しており、共通してエクソン１３とエクソン１４が欠落していた。そこで、エクソン１２にある配列のプライマーU1050: CAATTGGTGCTGTGCTTGTAA（配列番号１５）とエクソン１５にある配列のプライマーU1042: CCCCATTCTAGTGGAAAAGGA（配列番号１６）でPCR（条件：95℃５分、（95℃30秒、55℃30秒、72℃３分）を30回、72℃5分）を行い、ゲノム配列を増幅した。pCR4-TOPOベクターへクローニングし、シークエンスを行い、品種サッシーのゲノムの配列と比較した。その結果、エクソンの欠落している転写産物を示す５系統からは、イントロ
ン１２にTAの繰り返しを２０以上繰り返す異常な配列があることを確認した。より具体的には、２３、２４、２５、２６、２８、３０、３１、３４の繰り返しを観察した。このことから正常なスプライシングが起きないこと、正常な転写産物ができないこと、遺伝子が破壊されていることが確認できた。異常な転写が行われているFTT13, FTT14と正常な転写の行われている品種サッシーのゲノムDNAに対して上記プライマーU1050とエクソン１３にある配列のプライマーU1051: CACACGCAACAGGGTGTCCA（配列番号１７）で増幅したイントロン１２の配列を図８に示す（配列番号１８、１９及び２０は、それぞれサッシー、FTT13及びFTT14の配列を示す）。このことからSolanum circaeifolium に属するPI 498120は変異したＹ遺伝子を持っている変異植物であることが明らかになった。
（実施例５）の方法で上記３系統の植物体のin vitro茎のグリコアルカロイド含量を測定したところ、チャコニン、ソラニン、トマチン類を含むすべてのグリコアルカロイドを極めて微量しか含まないことが明らかになった。
Solanum circaeifoliumは、文献（C. M Ochoa, ‘The Potatoes of South America: Peru, Part I. The Wild Species,’ 2004, International Potato Center, Peru）によると、通常のジャガイモSolanum tuberosumと同じCitcaeifoliaシリーズ（植物分類の「列」の分類）に含まれる。同種は、胚乳均衡数(EBN: Endosperm Balance Number)説（「Handbook of potato production, inprovement, and postharvest management」(2006) GopalとPaul Khurana編集 p.77-108 Haworth Press Inc.）では異なるグループのEBN1に属しており交配は極めて難しいとされるが、交配例は知られている（Mattheijら(1992) Theor. Appl. Genet. 83:451-466、Louwesら(1992) Theor. Appl. Genet. 84:362-370）。これらのことから、本遺伝子の配列を使い変異遺伝子を見つけることは容易であり、かつ産業上の利用のために、Solanum circaeifoliumから見出した変異Ｙ遺伝子を育種に利用することが可能であることが明らかになった。
（実施例１０）交配による栽培品種の作出
（実施例９）で用いたSolanum circaeifolium PI 498120由来の種子系統FTT14は２倍体である。これと自家不和合性阻害遺伝子を持った２倍体ジャガイモである97H32-6（Phumichiら Genome (2005) 48: 977-984）と交配しF1世代を作出する。F1同士を交配し取得したF2世代の1/4にグリコアルカロイドのない２倍体ジャガイモの性質を持ったジャガイモを得ることができる。FTT14そのもの、もしくはグリコアルカロイドの無い上記F2世代をコルヒチンなどの薬剤等を使った倍加処理によって４倍体ジャガイモを得ることができる。これと、品種として一般的である４倍体であるホッカイコガネを交配することで、新たなF1世代を得ることができる。このF1同士を交配することでF2世代の1/36の割合でグリコアルカロイドのない４倍体ジャガイモが得られることが期待できる。検定はグリコアルカロイドの含量を測定する必要が無く、幼苗からDNAを取得し（実施例８）で得られたDNAの情報、具体的にはプライマーU1050とU1051でPCRを行い、通常のジャガイモの増幅断片と比較してイントロン１２にTAが連なる領域の有無を調べることで可能である。
本発明のグリコアルカロイド生合成酵素及びその遺伝子を用いる生物作成・検定方法は、植物等の生物を用いた、グリコアルカロイド化合物の生産の開発、ジャガイモ等ナス科植物品種の選抜に有用である。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
配列番号５〜１７ プライマー

Claims (8)

  1. 以下の工程を含むグリコアルカロイド含量が低減された植物体の選抜方法：
    (a) (i) ゲノムDNAまたはRNAである核酸を植物から単離する工程、
    (ii) (i)の核酸がRNAである場合に逆転写しcDNAを合成する工程、
    (iii) (i)または(ii)の工程で得られたDNAから配列番号２または配列番号４に示す塩基配列の少なくとも一部を含有する遺伝子断片を増幅する工程、
    (iv) DNA中に突然変異および／または多型の存在を決定する工程、ならびに
    (v) 配列番号２または配列番号４に示す塩基配列を含有する遺伝子断片から発現されるmRNA量を測定し、既存品種に対する発現量の差を決定する工程、により植物におけるグリコアルカロイド生合成酵素をコードする遺伝子の突然変異および／または多型の存在を検出し、該突然変異および／または多型の存在により遺伝子発現が抑制されているかを確認し、
    (b) 前記植物におけるグリコアルカロイド含量を分析する工程によりグリコアルカロイド含量が低減された植物体を選抜する工程。
  2. 植物がナス科植物である請求項１に記載の方法。
  3. 以下の(i)〜(vi)のいずれかの遺伝子が人為的に発現抑制または改変されており、以下の(i)〜(vi)のいずれかの遺伝子がコードするグリコアルカロイド生合成酵素タンパク質の合成量が既存品種に対して低下しているか、またはグリコアルカロイド生合成酵素の活性が既存品種に対して低下しており、グリコアルカロイドの蓄積リスクの低減したジャガイモまたはトマト栽培品種：
    (i) 配列番号２に示す塩基配列からなるDNAからなる遺伝子、
    (ii) 配列番号２に示す塩基配列と90％以上の配列同一性を有する塩基配列からなり、かつ、グリコアルカロイド生合成酵素活性を有するタンパク質をコードするDNAからなる遺伝子、
    (iii) 配列番号２に示す塩基配列の縮重異性体からなるDNA、
    (iv) 配列番号４に示す塩基配列からなるDNAからなる遺伝子、
    (v) 配列番号４に示す塩基配列と90％以上の配列同一性を有する塩基配列からなり、かつ、グリコアルカロイド生合成酵素活性を有するタンパク質をコードするDNAからなる遺伝子、および
    (vi) 配列番号４に示す塩基配列の縮重異性体からなるDNA。
  4. 以下の(i)〜(vi)のいずれかの遺伝子がコードするグリコアルカロイド生合成酵素遺伝子の発現が既存品種に対して抑制されているか、または該酵素の活性が既存品種に対して低下している植物であるSolanum circaeifolium PI498120を母本とし、交配により得られた後代を選抜することにより、グリコアルカロイドの蓄積リスクの低減した栽培品種を作出する方法：
    (i) 配列番号２に示す塩基配列からなるDNAからなる遺伝子、
    (ii) 配列番号２に示す塩基配列と90％以上の配列同一性を有する塩基配列からなり、かつ、グリコアルカロイド生合成酵素活性を有するタンパク質をコードするDNAからなる遺伝子、
    (iii) 配列番号２に示す塩基配列の縮重異性体からなるDNA、
    (iv) 配列番号４に示す塩基配列からなるDNAからなる遺伝子、
    (v) 配列番号４に示す塩基配列と90％以上の配列同一性を有する塩基配列からなり、かつ、グリコアルカロイド生合成酵素活性を有するタンパク質をコードするDNAからなる遺伝子、および
    (vi) 配列番号４に示す塩基配列の縮重異性体からなるDNA。
  5. 前記交配により得られた後代の選抜にあたり、グリコアルカロイド生合成酵素遺伝子の変異を、イントロン中に挿入されるTAの２０回以上の繰り返し配列である遺伝子マーカーにより検出することを含む、請求項４に記載の方法。
  6. 以下の(i)〜(vi)のいずれかの遺伝子がコードするグリコアルカロイド生合成酵素遺伝子の発現が既存品種に対して抑制されているか、または該酵素の活性が既存品種に対して低下している植物であって、変異処理によるグリコアルカロイド生合成酵素遺伝子の人為的な改変により得られた植物またはその後代を母本とし、交配により得られた後代を選抜することにより、グリコアルカロイドの蓄積リスクの低減した栽培品種を作出する方法：
    (i) 配列番号２に示す塩基配列からなるDNAからなる遺伝子、
    (ii) 配列番号２に示す塩基配列と90％以上の配列同一性を有する塩基配列からなり、かつ、グリコアルカロイド生合成酵素活性を有するタンパク質をコードするDNAからなる遺伝子、
    (iii) 配列番号２に示す塩基配列の縮重異性体からなるDNA、
    (iv) 配列番号４に示す塩基配列からなるDNAからなる遺伝子、
    (v) 配列番号４に示す塩基配列と90％以上の配列同一性を有する塩基配列からなり、かつ、グリコアルカロイド生合成酵素活性を有するタンパク質をコードするDNAからなる遺伝子、および
    (vi) 配列番号４に示す塩基配列の縮重異性体からなるDNA。
  7. 前記植物が、ナス科植物である請求項４〜６のいずれか１項に記載の方法。
  8. 栽培品種が、ジャガイモである請求項７に記載の方法。
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