JP6037339B2

JP6037339B2 - 形質転換植物細胞を用いたタンパク質製造方法

Info

Publication number: JP6037339B2
Application number: JP2013531352A
Authority: JP
Inventors: 加藤　晃; 晃加藤; 清貴上田; 錬也大河原; 寿啓矢村
Original assignee: Nara Institute of Science and Technology NUC
Current assignee: Nara Institute of Science and Technology NUC
Priority date: 2011-09-02
Filing date: 2012-08-29
Publication date: 2016-12-07
Anticipated expiration: 2032-08-29
Also published as: US20140315248A1; CA2847113C; CA2847113A1; WO2013031821A1; JPWO2013031821A1

Description

本発明は、形質転換植物細胞を用いたタンパク質製造方法に関する。より詳細には、本発明は、特定の5’非翻訳領域（5’UTR）をコードする組換え遺伝子により形質転換された、植物細胞を用いたタンパク質製造方法に関する。

微生物、動物細胞、又は植物細胞を用いて、有用タンパク質を製造する方法が広く知られている。微生物や動物又は植物細胞に目的タンパク質をコードする遺伝子を導入して形質転換体を得、当該形質転換体を培養することにより、目的タンパク質を産生させることができる。

しかし、微生物や細胞を培養する場合、環境ストレスにより培養効率やタンパク質への翻訳効率が低下してしまうことがある。最近の研究により、ストレスによる翻訳状態の変化と5’UTRの関連性が示唆されている。当該関連性を検討することにより、翻訳制御を規定する5'UTRの重要領域及び配列を同定したという報告がある（特許文献１）。但し、当該報告は、温度ストレス又は浸透圧ストレス（塩ストレス）といった、“生育において不必要な条件が加わるというストレス”に対して翻訳抑制を回避することが記載されるのみであり、栄養飢餓ストレスなどの“生育において本来必要な条件が不足するというストレス”と翻訳抑制との関連については示されていない。

植物培養細胞を用いて有用タンパク質を生産しようとする場合、通常、環境ストレス（例えば温度ストレスや塩ストレス）を加えることはせず、培養条件はできるだけ最適化する。また、特に、生育に本来必要な条件が不足してストレスがかかると（以下、当該ストレスを「生育必要条件欠乏ストレス」ともいう）と、生産を意図した有用タンパク質の生産量は減少してしまうのが通常である。これは、ｍＲＮＡの翻訳が抑制され、タンパク質生産の効率が落ちてしまうことが一因と考えられる。そこで、効率よく植物細胞を培養してタンパク質生産を行うためには、このような翻訳抑制を回避し、タンパク質生産効率を保つことが重要となる。

ＷＯ２０１１／０２１６６６号

本発明は、特に生育に本来必要な条件が不足して生じるストレス（生育必要条件欠乏ストレス；例えば栄養飢餓ストレスや低酸素ストレス）下における植物培養細胞のｍＲＮＡの翻訳抑制を回避し、効率よく植物細胞を培養してタンパク質生産を行うことを課題とする。

本発明者は、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、特定の配列の5’UTRを有するｍＲＮＡが生育必要条件欠乏ストレス下においても翻訳が抑制されないことを見出し、更に検討を重ねて本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は例えば以下の項に記載の、生育必要条件欠乏ストレスによる翻訳抑制を回避する方法、及びタンパク質を製造する方法、を包含する。
項１．
以下の（ａ）又は（ｂ）の5’UTRを有するｍＲＮＡをコードする組換えＤＮＡ分子により形質転換された植物細胞を生育必要条件欠乏ストレス下で培養する工程を含む、前記ｍＲＮＡにコードされるタンパク質が、生育必要条件欠乏ストレスにより翻訳抑制されるのを回避する方法。
（ａ）配列番号１、２、３、４、５又は６の塩基配列からなる5’UTR
（ｂ）（ａ）の5’UTRの塩基配列において、１又は数個の塩基が置換、欠失、又は付加され、かつ、生育必要条件欠乏ストレスによる翻訳抑制を回避する5’UTR
項２．
生育必要条件欠乏ストレスが、栄養飢餓ストレス及び低酸素ストレスからなる群より選択される少なくとも１種のストレスである、項１に記載の方法。
項３．
前記植物細胞が、シロイヌナズナ培養細胞又はタバコ培養細胞である、項１又は２に記載の方法。
項４．
以下の（ａ）又は（ｂ）の5’UTRを有するｍＲＮＡをコードする組換えＤＮＡ分子により形質転換された植物細胞を生育必要条件欠乏ストレス下で培養する工程を含む、前記ｍＲＮＡにコードされるタンパク質が、生育必要条件欠乏ストレスにより翻訳抑制されるのを回避して、前記タンパク質を製造する方法。
（ａ）配列番号１、２、３、４、５又は６の塩基配列からなる5’UTR
（ｂ）（ａ）の5’UTRの塩基配列において、１又は数個の塩基が置換、欠失、又は付加され、かつ、生育必要条件欠乏ストレスによる翻訳抑制を回避する5’UTR
項５．
生育必要条件欠乏ストレスが、栄養飢餓ストレス及び低酸素ストレスからなる群より選択される少なくとも１種のストレスである、項４に記載の方法。
項６．
前記植物細胞が、シロイヌナズナ培養細胞又はタバコ培養細胞である、項４又は５に記載の方法。
項Ａ．
配列番号２、３、５又は６の塩基配列からなるＲＮＡ。
項Ｂ．
項Ａに記載のＲＮＡをコードするＤＮＡ。
項Ｃ．
項Ａに記載のＲＮＡをコードする領域を有する組換えＤＮＡ。

本発明によれば、タンパク質をコードする遺伝子を導入して形質転換させた植物細胞を培養して該タンパク質を産生する場合において、栄養飢餓ストレスや低酸素ストレスといった生育必要条件欠乏ストレス下であっても、ｍＲＮＡからタンパク質への翻訳効率が低下しないため、目的タンパク質を効率よく産生することができる。

シロイヌナズナT87野生株における増殖曲線（Ａ）及びポリソーム解析結果（Ｂ）を示す。（Ａ）：継代後、培養液1 mLあたりに含まれる培養細胞の新鮮重量（Fresh weight g/ mL）を1日おきに9日目まで測定した。3回測定の平均と標準偏差を示す。（Ｂ）：回収した細胞から調製した細胞抽出液をショ糖密度勾配遠心法(15-60%)により分画した後、254 nmの吸光プロファイルを記録した。（0日目、1日目、3日目、5日目、8日目の結果を示す。）ポリソーム画分及び非ポリソーム画分を図中に示した。沈降方向は右から左である。ポリソーム／マイクロアレイ解析の概要を示す。培養1日目と8日目の細胞から調製した細胞抽出液をショ糖密度勾配遠心（15-60％）により分画した後、RNAの分布を見積もるために254 nmの吸光プロファイルを記録した。密度勾配液を等容量ずつ8つの画分に分画し、1-3番目の画分混合液からpolysome RNAを、全8画分からtotal RNAを抽出・精製し、それぞれのRNAを鋳型にCy3あるいはCy5で蛍光標識したcRNAを調製後、マイクロアレイハイブリダイゼーション実験に供した。個々のmRNA種の、total RNAに対するpolysome RNAの比（Polysome ratio：PR）を1日目（PR_1d）および8日目（PR_8d）について算出した。ΔPRは1日目と8日目でのPR値の変化（即ち、翻訳状態の変化）を示す指標である。培養前期（1日目）及び後期（8日目）におけるポリソーム形成状態のゲノムワイド解析の結果を示す。ポリソーム形成状態の変化から、生育必要条件欠乏ストレスによる翻訳状態が変化したことがわかる。（Ａ）：培養1日目および8日目におけるPR値のヒストグラムを示す。縦軸は遺伝子数を示す。（Ｂ）：翻訳状態変化を示す指標であるΔPRのヒストグラムを17077種のmRNAについて示した。縦軸は遺伝子数を表す。翻訳が維持されるmRNA（ΔＰＲ＞０）も少ないながら存在していることがわかる。ポリソーム／定量RT-PCR解析の概要を示す。培養1日目と8日目の細胞から調製した細胞抽出液をショ糖密度勾配遠心（15-60％）により分画した後、RNAの分布を見積もるために254 nmの吸光プロファイルを記録した。密度勾配液を等容量ずつ8つの画分に分画し、各画分からmRNAを精製し、定量RT-PCRを行った。定量RT-PCRにより各画分に存在する内在遺伝子(At1g77120、At1g06760、At4g10710、At4g14560、At5g09590、At1g55330、At3g47610、act2)の挙動変化を解析した。なお、act2はアクチン遺伝子である。シロイヌナズナにおける内在遺伝子のポリソーム／定量RT-PCR解析結果を示す。（Ａ）：培養1日目と8日目の細胞から調製した細胞抽出液をショ糖密度勾配遠心（15-60％）により分画した後、RNAの分布を見積もるために254 nmの吸光プロファイルを記録した。シロイヌナズナにおける内在遺伝子のポリソーム／定量RT-PCR解析結果を示す。（Ｂ）：各画分から抽出したRNAを等容量ずつ定量RT-PCR解析に供し、それぞれの画分に存在する内在遺伝子のmRNAを定量した。縦軸は各画分に存在するそれぞれのmRNA量を全画分に対する割合で表記している。形質転換シロイヌナズナ細胞製造のために作製したバイナリーベクターの模式図を示す。 At3g47610形質転換培養細胞におけるGUS mRNAの挙動解析の結果を示す。（Ａ）：培養1日目と8日目の細胞から調製した細胞抽出液をショ糖密度勾配遠心（15-60％）により分画した後、RNAの分布を見積もるために254 nmの吸光プロファイルを記録した。（Ｂ）：各画分から抽出したRNAを等容量ずつ定量RT-PCR解析に供し、それぞれの画分に存在するact2、At3g47610、At1g77120およびAt3g47610の5’UTRを付加したGUS mRNAを定量した。縦軸は各画分に存在するそれぞれのmRNA量を全画分に対する割合で表記している。 At1g77120形質転換培養細胞におけるGUS mRNAの挙動解析の結果を示す。（Ａ）：培養1日目と8日目の細胞から調製した細胞抽出液をショ糖密度勾配遠心（15-60％）により分画した後、RNAの分布を見積もるために254 nmの吸光プロファイルを記録した。（Ｂ）：各画分から抽出したRNAを等容量ずつ定量RT-PCR解析に供し、それぞれの画分に存在するact2、At3g47610、At1g77120およびAt1g77120の5’UTRを付加したGUS mRNAを定量した。縦軸は各画分に存在するそれぞれのmRNA量を全画分に対する割合で表記している。形質転換シロイヌナズナ細胞製造のために作製したバイナリーベクターの模式図を示す。 At3g47610形質転換培養細胞におけるFluc mRNAの挙動解析の結果を示す。（Ａ）：培養1日目、4日目、9日目の細胞からそれぞれ調製した細胞抽出液をショ糖密度勾配遠心（15-60％）により分画した後、RNAの分布を見積もるために254 nmの吸光プロファイルを記録した。（Ｂ）：各画分から抽出したRNAを等容量ずつ定量RT-PCR解析に供し、それぞれの画分に存在するact2、At3g47610、At1g77120及びAt3g47610の5’UTRを連結したFluc mRNAを定量した。縦軸は各画分に存在するそれぞれのmRNA量を全画分に対する割合で表記している。 At1g77120形質転換培養細胞におけるFluc mRNAの挙動解析の結果を示す。（Ａ）：培養1日目、4日目、9日目の細胞からそれぞれ調製した細胞抽出液をショ糖密度勾配遠心（15-60％）により分画した後、RNAの分布を見積もるために254 nmの吸光プロファイルを記録した。（Ｂ）：各画分から抽出したRNAを等容量ずつ定量RT-PCR解析に供し、それぞれの画分に存在するact2、At3g47610、At1g77120及びAt1g77120の5’UTRを連結したFluc mRNAを定量した。縦軸は各画分に存在するそれぞれのmRNA量を全画分に対する割合で表記している。 5’UTRがFlucタンパク質の蓄積量に及ぼす影響を調べた結果を示す。継代後、4〜9日間培養した細胞をそれぞれ回収した。回収した細胞から粗タンパク質溶液を調製し、総タンパク質量当たりのFluc活性を測定した。各形質転換培養細胞の4日目の細胞における活性値を100としたときの、それぞれの相対Fluc活性値（％）を示した。活性測定はそれぞれ5回行い、最高値及び最低値を除いた3回分のFluc活性値の平均値、及び標準偏差を算出した。形質転換タバコ細胞製造のために作製したバイナリーベクターの模式図を示す。 At3g47610形質転換培養細胞におけるHRP C1a mRNAの挙動解析結果を示す。（Ａ）：継代後、培養液1 mLあたりに含まれる培養細胞の新鮮重量（Fresh weight g/ mL）を1日おきに9日目まで測定した。3回測定の平均と標準偏差を示す。（Ｂ）：培養1日目と8日目の細胞から調製した細胞抽出液をショ糖密度勾配遠心（15-60％）により分画した後、RNAの分布を見積もるために254 nmの吸光プロファイルを記録した。（Ｃ）：各画分から抽出したRNAを等容量ずつ定量RT-PCR解析に供し、それぞれの画分に存在するT-actinおよびAt3g47610の5’UTRを付加したHRP C1a mRNAを定量した。縦軸は各画分に存在するそれぞれのmRNA量を全画分に対する割合で表記している。なお、T-actinはタバコアクチン遺伝子である。 At1g77120形質転換培養細胞におけるHRP C1a mRNAの挙動解析結果を示す。（Ａ）：継代後、培養液1 mLあたりに含まれる培養細胞の新鮮重量（Fresh weight g/ mL）を1日おきに9日目まで測定した。3回測定の平均と標準偏差を示す。（Ｂ）：培養1日目と8日目の細胞から調製した細胞抽出液をショ糖密度勾配遠心（15-60％）により分画した後、RNAの分布を見積もるために254 nmの吸光プロファイルを記録した。（Ｃ）：各画分から抽出したRNAを等容量ずつ定量RT-PCR解析に供し、それぞれの画分に存在するT-actinおよびAt1g77120の5’UTRを付加したHRP C1a mRNAを定量した。縦軸は各画分に存在するそれぞれのmRNA量を全画分に対する割合で表記している。 At1g55330形質転換培養細胞におけるHRP C1a mRNAの挙動解析結果を示す。（Ａ）：継代後、培養液1 mLあたりに含まれる培養細胞の新鮮重量（Fresh weight g/ mL）を1日おきに9日目まで測定した。3回測定の平均と標準偏差を示す。（Ｂ）：培養1日目と8日目の細胞から調製した細胞抽出液をショ糖密度勾配遠心（15-60％）により分画した後、RNAの分布を見積もるために254 nmの吸光プロファイルを記録した。（Ｃ）：各画分から抽出したRNAを等容量ずつ定量RT-PCR解析に供し、それぞれの画分に存在するT-actinおよびAt1g55330の5’UTRを付加したHRP C1a mRNAを定量した。縦軸は各画分に存在するそれぞれのmRNA量を全画分に対する割合で表記している。

以下、本発明について、さらに詳細に説明する。なお、本明細書におけるアミノ酸、ペプチド、塩基配列、核酸などの略号による表示は、ＩＵＰＡＣ、ＩＵＢの規定、「塩基配列又はアミノ酸配列を含む明細書などの作成のためのガイドライン」（特許庁編）及び当該分野における慣用記号に従うものとする。また、ＤＮＡはデオキシリボ核酸を表し、ＲＮＡはリボ核酸を表し、ｍＲＮＡはメッセンジャーＲＮＡを表す。

また、遺伝子操作等の分子生物学的操作については、適宜公知の方法を用いることができる。例えば、特に断りのない限り、Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3rd Edition（Cold Spring Harbor Laboratory Press）等に記載の方法に従って行うことができる。

本発明の方法は、以下の（ａ）又は（ｂ）の5’UTRを有するｍＲＮＡをコードする組換えＤＮＡ分子により形質転換された植物細胞を生育必要条件欠乏ストレス下で培養する工程を含む。
（ａ）配列番号１、２、３、４、５又は６の塩基配列からなる5’UTR
（ｂ）（ａ）の5’UTRの塩基配列において、１又は数個の塩基が置換され、かつ、生育必要条件欠乏ストレスによる翻訳抑制を回避する5’UTR。

ｍＲＮＡが配列番号１、２、３、４、５又は６の塩基配列からなる5’UTRを有することにより、生育必要条件欠乏ストレスによる翻訳回避が可能となる。

配列番号１〜６の塩基配列は、それぞれ下記の通りである。なお、これらの配列番号の塩基配列はシロイヌナズナの遺伝子から得られたものである。各配列番号の直後に括弧書きで、その5’UTRが得られた遺伝子名を示す。
配列番号１（At1g77120由来）
UACAUCACAAUCACACAAAACUAACAAAAGAUCAAAAGCAAGUUCUUCACUGUUGAUA
配列番号２（At1g06760由来）
CUUCACAAUCCUCAUAAUCACUUUCGAAAUUACAUUUACGCUUUCUUGCAAUCAAAUUUUCCGAUCUUAAGUUCAGAAGACG
配列番号３（At4g10710由来）
GGUAGAAAAACCAUUCUUUGGUAACUUUCGCUUACUCUCUCCCCAUUCUCUCUCGAAGAGAGCCUCGCCGGAGUUUGUUUUUCUUCUUGUUUCGCGGCCAAAACCGCCUUUGUGUAAAGCUACCUUGUUAUUUUCCUCCGUUAACCAUCUGGUAUAGGUUGCUGCUGGACUCUUUAG
配列番号４（At4g14560由来）
ACACAAGCAUUUUCAAGGAUAUCAAAUCACAAUCCCAAGAAGAGCAAUAACAAGAGAAGAAGAAGUAGUUCAAGAAUUAAGGAAGAGAGCUUCUCCGUUAAAGUAUAGUGAGAGAAU
配列番号５（At5g09590由来）
CCGUCGUCGAUGUCGAGAAUUAUCACCAUCUAGAAUCUUCCCUCAACCUCUAGAAAACAACUUUCGUAUCCUUCAAAAACCCUAAACCCUAGCUUUUGCACAGACGCAAUUUCAUCGCAUCAUUUUGCAAUUUUCCUUUACUGAUCUGUCACCACCUCUUGAAUUUCGAAACC
配列番号６（At1g55330由来）
AUCAUCACAACACAAAUCAAAACAAGAAUAACAAAAUCUUUCUCUUAUAAAUUCUUAUUUCAAGACAUCAAAGGAGAAUUA

また、配列番号１、２、３、４、５又は６の塩基配列からなる5’UTRの他に、配列番号１〜６の塩基配列において、１又は数個の塩基が置換、欠失、又は付加され、かつ、生育必要条件欠乏ストレスによる翻訳抑制を回避する5’UTRも、本発明に有用である。

置換、欠失、又は付加される塩基数は、好ましくは１〜１０（１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０）塩基、より好ましくは１〜５塩基、さらに好ましくは１、２、又は３塩基である。なお、「置換、欠失、又は付加され」るとは、１の配列において、置換、欠失及び付加からなる少なくとも１種の塩基の改変がなされるという意味である。また、前記の置換、欠失、又は付加される塩基数は、置換、欠失及び付加された塩基数の合計数（置換、欠失及び付加された塩基の合計が最小となるよう換算した数）を示す。

より詳細に説明すると、本発明の組換えＤＮＡ分子は、上記特定の5’UTR配列を有するｍＲＮＡをコードするように組み換えられたＤＮＡ分子である。特定の5’UTR配列を有するｍＲＮＡを発現するＤＮＡ分子であるともいってもよい。本発明の組換えＤＮＡ分子は、人工的に少なくとも5’UTRに相当する部分の塩基配列を変化させて製造したＤＮＡ分子である。

特に制限されないが、当該組換えＤＮＡ分子は、ＤＮＡ構築物であることが好ましい。例えば、ｍＲＮＡを発現しやすくするため、プロモーター配列がｍＲＮＡをコードする部分の上流に含まれたＤＮＡ構築物が好ましい。具体的には、ｍＲＮＡをコードする塩基配列を含む発現ベクター等が例示できる。当該発現ベクターは、クローニングベクターに上記ｍＲＮＡをコードするＤＮＡ分子を組み込んだＤＮＡ構築物である。クローニングベクターとしては公知のものを用いることできる。例えばプラスミドベクター（特にＴｉ−プラスミドが好ましい）、コスミドベクター、ウイルスベクター等が例示できる。また、ベクターが有するプロモーター配列も公知のものを用いることができる。例えばカリフラワーモザイクウイルス由来プロモーターであるＣａＭＶ３５Ｓプロモーターが例示できる。

なお、ＤＮＡ分子の塩基配列を人工的に変化させる方法は、様々な公知の方法が知られており、適宜選択して使用することができる。例えば、適切な制限酵素によりＤＮＡ分子を切断した後新たなＤＮＡ断片を当該切断部へ連結させることにより、又は、目的遺伝子と完全に相補的ではないプライマー対を設計してＰＣＲを行うことにより、あるいはこのような手法を組み合わせて用いることによって、ＤＮＡ分子の塩基配列を改変することができる。

本発明の組換えＤＮＡ分子は、上記特定の5’UTR配列を有するｍＲＮＡをコードするように組み換えられたＤＮＡ分子であればよく、当該ＤＮＡ分子にコードされるタンパク質（ペプチドを含む）の種類は特に限定されない。タンパク質（ペプチドを含む）としては、薬理活性を有するタンパク質が好ましく例示できる。具体的には、例えば、酵素、転写因子、サイトカイン、膜結合タンパク質、各種ペプチドホルモン（例えば、インスリン、成長ホルモン、ソマトスタチン）、ワクチンや抗体（FabやF(ab')₂等、分子を特異的に認識する断片も含む）などの医療用タンパク質、等が挙げられる。また、本発明の組換えＤＮＡ分子は、このようなタンパク質をコードするＤＮＡ分子に、ＧＦＰやルシフェラーゼ等のレポーター遺伝子、ＨｉｓタグやＦＬＡＧ（登録商標）タグ等のタグペプチドの配列が連結されてなるＤＮＡ分子や、人工的に設計されたキメラ遺伝子であってもよい。

組換えＤＮＡ分子の原料は公知のものを用いることができる。公知のＤＮＡ分子を原料とする場合は、その塩基配列情報は、例えばＮＣＢＩ（National Center for Biotechnology Information）が運営する配列データベースＧｅｎＢａｎｋ等のデータベースから入手することができる。当該配列情報を基に、例えばＰＣＲ等の常法により各種生物からＤＮＡ分子を製造できる。また、各販社から例えばcDNAライブラリー等の形態で既知遺伝子が販売されており、これを購入して用いることもできる。

このような、上記5’UTRを有するｍＲＮＡをコードする組換えＤＮＡ分子を植物細胞へ導入することで、当該植物細胞（形質転換植物細胞）において当該ｍＲＮＡを発現させることができる。なお、当該ｍＲＮＡが発現するのであれば、導入した組換えＤＮＡ分子が細胞内でどのように存在しているかは特に制限されない。例えば、染色体のDNAとは独立して自律的に複製を行うもの（プラスミドなど）であってもよいし、染色体に組み込まれていてもよい。

植物細胞の種類は特に制限されない。例えば双子葉植物由来細胞が挙げられ、より具体的には、シロイヌナズナ由来細胞、タバコ由来細胞、ダイズ由来細胞、キク由来細胞、レタス由来細胞等が例示できる。好ましくは、シロイヌナズナ培養細胞、又はタバコ培養細胞である。

また、組換えＤＮＡ分子を植物細胞へ導入する方法は特に制限されず、公知の方法を適宜選択して用いることができる。例えば、エレクトロポレーション法、パーティクルガン法、Ｔｉプラスミドを用いた方法（例えばバイナリーベクター法、リーフディスク法）等が例示できる。

なお、ベクターが宿主に組み込まれたか否かの確認は、PCR法、サザンハイブリダイゼーション法、ノーザンハイブリダイゼーション法等の公知の方法により行うことができる。

本発明の形質転換植物細胞は、上記組換えＤＮＡ分子が導入されることにより形質転換されている。より詳細には、本発明の形質転換植物細胞では、本発明の組換えＤＮＡ分子から前記ｍＲＮＡが転写され、当該ｍＲＮＡからタンパク質が翻訳される。上述の通り、本発明の組換えＤＮＡ分子は特定の5’UTR配列をコードしており、生育必要条件欠乏ストレスによる翻訳抑制を回避（低減）できる。明細書において「翻訳抑制を回避する」とは、全く翻訳抑制を無くすという意味だけではなく、翻訳抑制を低減するという意味を包含する。

当該形質転換植物細胞の培養は、形質転換する前の野生型の植物細胞を培養可能な公知の方法により行うことができる。例えば、用いる植物細胞がシロイヌナズナ培養細胞の場合は、公知のシロイヌナズナ培養細胞の培養方法により培養することができ、用いる植物細胞がタバコ培養細胞の場合は、公知のタバコ培養細胞の培養方法により培養することができる。。

生育必要条件欠乏ストレスとは、上述の通り、生育に本来必要な条件が不足して生じるストレスのことである。特に植物細胞の場合、培養に必要な成分が欠乏することにより生じるストレスであり、培養必要成分欠乏ストレスと言い換えてもよい。具体的には、例えば培地中の栄養分や酸素が消費されることで起こるストレスである。栄養飢餓ストレスや低酸素ストレスが例示される。特に制限されないが、生育必要条件欠乏ストレスとしては、栄養飢餓ストレス（例えばショ糖飢餓ストレス）及び低酸素ストレスからなる群より選択される少なくとも１種のストレスが好ましい。

本発明において、翻訳が抑制されているか否かは、ポリソーム画分に存在するｍＲＮＡ量が減少しているか否かで判断する。つまり、ポリソーム画分に存在するｍＲＮＡ量が減少した場合、翻訳が抑制されていると判断できる。そして、翻訳が抑制されるｍＲＮＡについて、上記（ａ）又は（ｂ）の5’UTRを有するように改変した場合に、ポリソーム画分に存在するｍＲＮＡ量が減少していた時期になっても、ポリソーム画分に存在するｍＲＮＡ量が減少しないか減少してもその減少幅が抑えられている場合に、翻訳抑制が回避されたと判断できる。

なお、ポリソーム画分とは、細胞抽出液（ｍＲＮＡとリボソームの結合は維持されている）をショ糖密度勾配遠心法により分離し、遠心後の当該密度勾配液を等容量ずつ複数の画分に分画した際、ポリソームを多く含有する画分のことをいう。一般に、翻訳効率の高いｍＲＮＡ分子は、一分子あたり、より多くのリボソームと結合しているので沈降速度のより大きなポリソーム画分に分布する。超遠心後の密度勾配液において、ショ糖密度のより高い画分にポリソームは多く含まれる。より具体的には、buffer (50 mM Tris-HCl, pH8.5, 25 mM KCl, 及び10 mM MgCl₂)により調製した15-60%ショ糖密度勾配液を用いて55,000 rpm, 50 min, 4℃の条件で超遠心し、等容量ずつ８画分に分画した際の、ショ糖密度の高い方（遠心チューブの底）から１〜３画分目がポリソーム画分である。

以下、本発明を具体的に説明するが、本発明は下記の例に限定されるものではない。まず実験に用いた材料及び手法について詳述し、その次に具体的な実験内容及び結果を記載する。

＜植物培養細胞＞
以下の検討には、次の植物培養細胞を用いた。
〔シロイヌナズナT87〕
シロイヌナズナ培養細胞(Arabidopsis thaliana T87)(Axelos et al., 1992)は理化学研究所ジーンバンク室植物開発銀行より分与していただいたものを使用した。培養は22℃、18時間明期／6時間暗期、攪拌速度120 rpm(SLK-3-FS, 日本医化器械製作所)の条件で行い、95 mLの改変LS培地 (Nagata, 1992) を300 mL容の三角フラスコに入れ使用した。一週間ごとに定常期に達した細胞4 mLを新しい培地95 mLに移植し継代培養を行った。なお、後述する安定形質転換培養細胞の作出に使用した培養細胞は、定常期に達した細胞2 mLを植え継ぎ、3-4日間培養した細胞を使用した。
〔タバコBY-2〕
タバコ培養細胞(Nicotiana tabacum L. cv. Bright Yellow 2)の培養は27℃、24時間暗期、攪拌速度130 rpm (BR-3000, Taitec, Saitama, Japan) の条件で行い、95 mLの改変LS培地を300 mL容の三角フラスコに入れ使用した。一週間ごとに定常期に達した細胞4 mLを新しい培地95 mLに移植し継代培養を行った。また、カルスの継代に用いた固形培地は滅菌前に0.3%のゲランガムを加えること以外は液体培養と同様である。カルスは90 mm径のシャーレで25℃、暗期で継代した(MIR-553, Sanyo Medicasystems, Osaka)。

なお、培養細胞を回収する際は、吸引濾過により培地を除き、細胞を液体窒素中で凍結させ、−80℃にて保存した。また、タバコBY2を回収する際には吸引濾過後に新たな改変LS培地100 mLで細胞を洗浄し、再度吸引濾過を行い液体窒素中で凍結させ−80℃にて保存した。

＜ショ糖密度勾配遠心法を用いたポリソーム解析＞
ショ糖密度勾配遠心を利用したポリソーム分画は、Daviesらの方法に準じて行った(Davies, E., and Abe, S. (1995). Methods Cell Biol. 50, 209-222.)。通常培養細胞もしくはストレス下で培養した細胞約300 mgを乳棒と乳鉢を用いて液体窒素中で細かく破砕した後、破砕粉末に1.5 mLのbuffer U (200 mM Tris-HCl, pH8.5, 50 mM KCl, 25 mM MgCl₂, 2 mM EGTA, 100 μg/mL heparin, 2% polyoxyethylene 10-tridecyl ether [PTE], and 1% sodium deoxycholate [DOC])を加え、緩やかに懸濁した。遠心(15,000 × g, 10 min, 4℃) により細胞残渣を除いた後に、buffer B (50 mM Tris-HCl, pH8.5, 25 mM KCl, and 10 mM MgCl₂)により調製した15-60%ショ糖密度勾配液4.6 mL上に上清を重層し、超遠心を行った(SW55Ti rotor, 55,000 rpm, 50 min, 4℃, brake-off)(Beckman Coulter)。ペリスタポンプ(Minipuls 3; Gilson)に連結したマイクロピペット(40 μＬCalibrated Pipet; Drummond)をショ糖密度勾配の上部から挿入し、下部からショ糖密度勾配液を約1 mL/minの速さで吸引すると同時に、Monitor UV-1(GE Healthcare)を用いて254 nmの吸光度を記録した。

＜マイクロアレイ解析用RNAの抽出＞
超遠心後のショ糖密度勾配液を等容量ずつ8つの画分に分画した場合の、1-3番目の画分（底側が1番）を混合したポリソーム画分と1-8番目を混合したトータル画分から、それぞれpolysome RNA、total RNAを抽出した。それぞれの画分は終濃度5.5 Mになるように8Mグアニジン塩酸塩を予め加えたチューブに回収した。この時、Two-Color RNA Spike-In Kit(Agilent Technologies)に含まれる spike mix A をポリソーム画分に、spike mix B をトータル画分にそれぞれ加えた。それぞれの spike mix には、in vitro合成されたポリA配列をもつ10種類の転写産物が、200倍のダイナミックレンジでかつ既知の量比で混合されている。また、それらの転写産物に対応するスポットが本研究で使用した Agilent oligoarray (Arabidopsis 3 oligo microarray 44K; Agilent Technologies)に存在する。RNA spike-inはショ糖密度勾配遠心液を回収すると同時に加えているため、その後のRNA精製やラベリング、ハイブリダイゼーション(後述)などの過程を経ることになる。従って、RNA spike-inに対応するスポットのシグナル値を用いた補正を行うことにより、ショ糖密度勾配における実際のRNA比率(polysome RNA vs. total RNA)を試算することが可能となる(Melamed and Arava, 2007)。ショ糖溶液及びグアニジン塩酸塩の混合液に対し等量の100％エタノールを加え、−20℃にて一晩冷却した後、遠心操作(20,000 ×g, 45 min, 4℃)を行った。得られたペレットを85%エタノールにて一度洗浄した後、RNeasy kit (Qiagen)に含まれるbuffer RLTにてペレットを溶解し、以降は付属のプロトコールに従いRNeasy kit (Qiagen)を用いてRNA精製を行った。その後、更にLiCl沈殿、エタノール沈殿による精製を行った。RNAの品質は、Agilent Bioanalyzer 2100(Agilent Technologies)を用いたオンチップ電気泳動法により検定した。

＜ショ糖密度勾配遠心液からのRNA精製＞
ショ糖密度勾配溶液約650μＬずつをキャップ構造、ポリA配列を有するin vitro合成Renilla luciferase(r-luc)mRNA 5 ngおよび終濃度5.1 Mになるように8 M グアニジン塩酸塩を予め加えておいたチューブ8本に回収した。合成r-luc mRNAは定量RT-PCR法により目的mRNAの各画分における存在比を算出する際の補正に用いた。各チューブへ混合液と等量の100%エタノールを加え、−20℃にて一晩冷却した後、遠心操作を行った (12,000 × g, 45 min, 4℃) 。得られたペレットは85%エタノールにて一度洗浄した後、乾燥させた。その後のRNA精製にはRNeasy Mini Kit(Qiagen)を付属のプロトコールに従い用いた(DNaseI処理をオプションとして行った)。全ての画分のRNAをそれぞれ30μＬのRNase-free waterで溶解した。精製したRNAの品質は1.5%変性ゲル電気泳動にて検定した。

＜定量RT-PCR＞
超遠心後のショ糖密度勾配液を等容量ずつ分画した8つの画分からそれぞれ精製したRNA溶液を等容量ずつ用いて逆転写反応を行った。逆転写反応にはTranscription First Strand cDNA Synthesis Kit(Roche)を付属のプロトコールに従って用いた。反応系は13μＬとした(oligo dT プライマー使用)。PCR反応は40倍希釈した逆転写反応溶液2μＬを鋳型に、遺伝子特異的プライマーセット及びLightCycler 480 SYBR Green I Master(Roche Applied Science)を用いて、10μＬの反応系で行った。実際の検討に用いたプライマーセットの配列を下に示す。

［定量RT-PCRに使用したプライマーセットの配列 (5’ to 3’)］
Act2(At3g18780)
TCCCATTGTTTTGTAGCTCTGA
AAAGAAATTATAGGGAACAAAAGGAA
At3g47610
TGCCAAGGAATATCTCGACAA
CTGAACTGGCTGCTACATGG
At1g77120
GAGTATTCGTTGCATCATCACC
CAAAGTGAACATCATCTGCGA
At1g06760
TGCTGCAACTAAGAGGAAAGC
CCTTGGCTGGTCTAGCCTTA
At4g10710
TTTTCCTCCGTTAACCATCTG
TCCGAGAGTCTGCCATCTAAA
At4g14560
AACAACAAGCGCAAGAACAA
CGATTTGTGTTTTTGCAGGA
At5g09590
AGCTTTTCCAGAGCCTTTAGC
CCCAAATCAATACCAATGACATC
At1g55330
ACGGCTGCTACCGTTGAA
GGTACAAACATGGCAGCATC
GUS
CTGATAGCGCGTGACAAAAA
CGGTTCGTTGGCAATACTC
Fluc
TGAGTACTTCGAAATGTCCGTTC
GTATTCAGCCCATATCGTTTCAT
T-actin
TGGCATCATACATTTTACAACGA
AGGTGCTTCAGTGAGTAGTACAGG
HRP C1a
GGGAGGTCCTTCTTGGAGAG
GCAAGATCCAGAAATGCTTGT
Rluc
GGATTCTTTTCCAATGCTATTGTT
AAGACCTTTTACTTTGACAAATTCAGT

プライマーの設計にはUniversal ProbeLibrary Assay Design Center/ProbeFinder(Roche Applied Science)を、SYBR Green Iの蛍光強度の経時測定にはLightCycler 480 System(Roche Applied Science)を、データ解析にはLightCycler Data Analysis Software(Roche Applied Science)のsecond derivative maximum methodを用いた。各画分のRNA回収効率、RT-PCR反応効率の違いを補正するために、各画分における目的遺伝子の結果は、ショ糖密度勾配液の回収時に加えた補正用のr-luc mRNAの結果で補正した。PCR産物が単一であることは融解曲線分析もしくはアガロースゲル電気泳動により確認した。シグナルがゲノム由来でないことは、逆転写反応を行っていないRNA溶液を鋳型にしたPCR反応においてシグナルが検出されないことにより確認した。

＜マイクロアレイハイブリダイゼーション＞
同一のショ糖密度勾配由来のpolysome RNA及びtotal RNAから、それぞれcyanine3 (Cy3)、cyanine5 (Cy5)で蛍光標識したcomplementary RNA (cRNA)を調整し、Agilent oligoarray (Arabidopsis 3 oligo microarray 44K；Agilent Technologies)を用いた競合ハイブリダイゼーション実験に供した。Arabidopsis 3 oligo microarrayには、シロイヌナズナ由来の転写産物や前述のRNA spike-inなどの塩基配列から選択された、60 merのオリゴDNAが44000スポットプリントされている。RNAの増幅及び蛍光標識には、Low RNA Input Fluorescent Liner Amplification Kit (Agilent Technologies)を使用した。まず、500 ngのpolysome RNA及びtotal RNAを鋳型に、リンカー配列としてT7プロモーター配列を含むオリゴdTプライマー及びMMLV-RTを用いた逆転写反応を行った。合成されたcDNAを鋳型に、T7 RNA polymerase in vitro転写反応により、Cy3 (polysome RNA)あるいはCy5 (total RNA)で標識されたCTPを取り込んだcRNAを合成した。合成されたcRNAの精製はRNeasy kit(Quiagen)を用いて行った。polysomeRNAおよびtotal RNA由来のcRNAをそれぞれ750 ngずつ混合し、65℃/17時間のハイブリダイゼーション反応に供した。スライドを洗浄した後、Agilent Technologies Microarray Scanner (Agilent Technologies)を用いてスキャニングを行い、Cy3及びCy5のシグナルを検出した。

＜マイクロアレイデータ解析＞
スキャニング画像からデータの抽出及び正規化には、Feature extraction software (Agilent Technologies)を用いて行った。Feature extraction software の設定基準に従って立てられたフラグを基に、Cy3、Cy5いずれかについてシグナル値が飽和しているスポット(glsSaturated, rlsSaturated)、スポット内のシグナルが不均一なスポット (glsFeatNonUnifOL, rlsFeatNonUnifOL)、複数スポットされている遺伝子についてはずれ値であるスポット(glsFeatPopnOL, rlsFeatPopnOL)、シグナルとバックグラウンドに優位さがないスポット(glsPosAndSignif, rlsPosAndSignif) (glsWellAboveBG, rlsWellAboveBG)を、以降の解析から除いた。正規化には、RNA spike-inに対応するスポットを基に行う方法もしくは Feature extraction software (Agilent technologies) における標準的な正規化方法である Liner＆LOWESS法(Locally Weighted Liner Regression) を用いた。解析対象として残ったスポットに関して、解析を行った。解析に使用した略語の説明を以下に示す。

Poly_1d: 継代後1日目の細胞のpolysome画分由来のマイクロアレイデータにおけるCy3シグナル値
Total_1d: 継代後1日目の細胞の全画分由来のマイクロアレイデータにおけるCy5シグナル値
Poly_8d: 継代後8日目の細胞のpolysome画分由来のマイクロアレイデータにおけるCy3シグナル値
Total_8d: 継代後8日目の細胞の全画分由来のマイクロアレイデータにおけるCy5シグナル値

翻訳状態を評価するための指標として、Polysome ratio (polysome RNAのtotal RNAに対する割合)を各スポットについて求めた。
Polysome ratio (1日目の細胞)
PR_1d=Poly_1d/Total_1d
Polysome ratio (8日目の細胞)
PR_8d=Poly_8d/Total_8d
継代後1日目から8日目への時間経過による翻訳状態の変化を評価するための指標（ΔＰＲ）の算出を各スポットについて行った。
ΔPR=PR_8d-PR_1d

Arabidopsis 3 oligo microarrayの各スポットには、gene nameあるいはsystematic name (e.g. AGI code ［The Arabidopsis Genome Initiative gene code］)が付与されている。基本的に一つのgene name (systematic name)には一つのスポットが対応しているが、複数のスポットが対応しているgene name (systematic name)もいくつか存在する。継代後1日目の細胞及び8日目の細胞由来のマイクロアレイデータのいずれにおいても上記データ処理の基準を満たしたgene name (systematic name)の内、AGI code を有するものについてPolysome ratioを算出した。なお上記計算はすべてMicrosoft Excelを使用して行った。

＜Fluc活性測定＞
各培養日数の培養細胞を遠心操作（9,100 × g, 1 min, 22℃）により沈殿させ、アスピレーターで培地を除去後、液体窒素中で凍結し、-80℃にて保存した。回収した細胞に300 μLのPassive Lysis buffer（Promega, USA）を加え、Handy Sonic（TOMY SEIKO, Tokyo）によって細胞を破砕した。破砕した細胞を再度遠心（20,400 × g, 5 min, 4℃）し、200 μLの上清を回収した。その後は、基本的にDual-Luciferase Reporter Assay System（Promega）のプロトコールに従って操作した。上清を10000倍に希釈し、希釈溶液20 μLを100 μLの基質溶液と混合し反応させた後、ルミノメーター（Lumat LB 9501, Berhold, Germany）を付属のプロトコールに従って使用した。Fluc活性はrelative light unit（RLU）/mg proteinとして算出した。総タンパク質量の定量はBradford法（Bradford, 1976）に従った。具体的には、希釈したタンパク質溶液10 μLをタンパク質定量試薬990 μLに加えSPECTRAFLUOR（TECAN, Switzerland）を用いて測定し、既知濃度のBSAを用いて作成した検量線からタンパク質濃度を決定した。
なお、Flucは、ホタルルシフェラーゼを意味する。

植物培養細胞内在遺伝子のタンパク質翻訳状況の経時変化
各培養日数のシロイヌナズナT87野生株を用いてポリソーム解析を行った。ポリソーム解析は、ショ糖密度勾配遠心により細胞抽出液中に存在するmRNAをリボソームの結合数に応じて分画できることから、細胞内の翻訳状態を解析する手法として広く利用されている。これにより培養日数の経過による翻訳状態変化を調べた。

細胞の新鮮重量を測定することで増殖曲線(図１Ａ)を作成した。また、24時間毎に0日（継代直後）〜9日間培養した細胞を回収し、それぞれの細胞から調製した細胞抽出液をショ糖密度勾配遠心(15-60%)により分画した。培養前期にあたる1日目では非ポリソーム画分はほとんど存在せず、大部分がポリソーム画分であり活発に翻訳がなされていることがわかった。一方、培養日数の経過に従って翻訳が活発であるポリソーム画分が減少すると共に、翻訳が不活発な非ポリソーム画分が増大していることが、RNA量の指標である254 nmの吸光度プロファイルからわかった（図１Ｂ）。特に、培養後期の8日目の細胞では非ポリソーム画分が大部分を占め、ポリソーム画分は非常に小さく、酸素や栄養を消費したことにより低酸素や栄養飢餓ストレス（生育必要条件欠乏ストレス）が生じ、これによる著しい翻訳抑制を起こしていることが確認できた。

ポリソーム／マイクロアレイ解析
培養1日目と8日目の細胞を用いて、ショ糖密度勾配遠心によりmRNAをリボソームの結合数に応じて分画し、それぞれの画分から調製したmRNAを用いて、DNAマイクロアレイ解析を行うことにより生育必要条件欠乏ストレス下における個別遺伝子の翻訳状態をゲノムワイドに解析した。ポリソーム／マイクロアレイ解析の概要を図２に示す。

細胞内の個々のmRNAの翻訳状態(ポリソーム形成状態)を示す指標としてPolysome ratio(それぞれPR_1d、PR_8d)を算出した。培養1日目と8日目のPR値のヒストグラムを作成し (図３Ａ)、生育必要条件欠乏ストレスにおける翻訳状態変化を検証した。培養1日目の細胞では大部分のmRNA種のPR_1dは40〜60％であった。一方で、生育必要条件欠乏ストレスが存在する8日目の細胞の場合、PR_8dのヒストグラムの幅が広がりを示しており、大部分のmRNA種においてPR値が減少した。この結果は生育必要条件欠乏ストレスにより各mRNAのポリソーム画分に存在する割合が減少していることを示しており、254 nmの吸光度プロファイルが示す全体的な傾向(図１Ｂ)と一致した。また、培養1日目から8日目への移行に伴う個々のmRNA種のPR値の変化を、ΔPR値として算出した結果からも(図３Ｂ)、大部分のmRNA種が負の値を示し（中央値−0.23）、ポリソーム形成が生育必要条件欠乏ストレスにより阻害されていることが明らかとなった。一方で、細胞全体として翻訳抑制が生じる中、ポリソーム形成が阻害されない、即ち翻訳が維持されるmRNAも少ないながら存在していることが明らかとなった（図３Ｂ）。

ポリソーム／定量RT-PCR解析による内在性mRNAの挙動解析
マイクロアレイ解析より、生育必要条件欠乏ストレス下でも翻訳が維持されることが示唆された遺伝子のうち、At1g77120、At1g06760、At4g10710、At4g14560、At5g09590、及びAt1g55330の挙動解析を、ポリソーム／定量RT-PCR解析によって行った。また、生育必要条件欠乏ストレスにより翻訳が抑制されると示唆された遺伝子act2及びAt3g47610についても、同様に解析した。当該ポリソーム／定量RT-PCR解析の概要を図４に示す。

培養1日目（培養前期）及び培養8日目（培養後期）の細胞抽出液を、ショ糖密度勾配遠心(15-60%)により分画した。培養8日目では培養1日目の細胞のポリソームプロファイルと比較して翻訳が活発であるポリソーム画分が減少すると共に翻訳が不活発な非ポリソーム画分が増大していることが、RNA量の指標である254 nmの吸光度プロファイルから示された（図５Ａ）。さらに、マイクロアレイの結果から翻訳が抑制されない上記６種の遺伝子のmRNAについてショ糖密度勾配液画分における分布を定量RT-PCRにより解析したところ、培養8日目においても大部分が1-3番目のポリソーム画分にとどまっていることから、翻訳が抑制されず、維持されていることが確認できた（図５Ｂ）。一方で、翻訳が抑制されるハウスキーピング遺伝子Actin2(act2)やAt3g47610のmRNAは、培養1日目では大部分が1-3番目のポリソーム画分に存在し活発に翻訳されているが、培養8日目においては大部分が4-7番目の非ポリソーム画分に移行していることから、著しい翻訳抑制を起こしていることが確認された（図５Ｂ）。

ポリソーム／定量RT-PCR解析によるGUS mRNAの挙動解析
上記解析により、生育必要条件欠乏ストレス下において翻訳が抑制されなかったAt1g77120、及び翻訳が抑制されたAt3g47610、のそれぞれの5’UTRをレポーターGUS遺伝子と連結したバイナリーベクター（「At1g77120 5’UTR::GUS」及び「At3g47610 5’UTR::GUS」）をＷＯ２０１１／０２１６６６号に記載の方法に準じて作製し、シロイヌナズナ培養細胞T87に導入して安定形質転換培養細胞を作製した。当該形質転換植物細胞を用いて、ポリソーム／定量RT-PCR解析を行うことで、異なる5’UTRを付加したGUS mRNAと内在性mRNAの生育必要条件欠乏ストレス下における挙動変化を解析した。解析は上記と同様にして行った。なお、作製したバイナリーベクターの模式図を図６に示す。図６におけるHSP-TはHSPターミネーターを示す。

「At3g47610 5’UTR::GUS」により形質転換した培養細胞（At3g47610 5’UTR::GUS形質転換培養細胞）についてポリソーム解析を行った結果、培養8日目ではポリソーム画分が減少し、非ポリソーム画分が増大することが確認された（図７Ａ）。また、定量RT-PCRにより個別mRNAについて解析を行ったところ、act2やAt1g77120のmRNAはそれぞれ野生株（図５Ｂ）と類似した挙動を示した。また、培養後期において翻訳が抑制された遺伝子At3g47610のmRNAも野生株（図５Ｂ）と同様に培養8日目には大部分が非ポリソーム画分に移行しており、翻訳が抑制されていた（図７Ｂ）。さらに、At3g47610の5’UTRを付加したGUS mRNAも同様に翻訳が抑制されることが確認された（図７Ｂ）。

一方、「At1g77120 5’UTR::GUS」により形質転換した培養細胞（At1g77120 5’UTR::GUS形質転換培養細胞）についてポリソーム解析を行った結果、培養8日目ではポリソーム画分の減少と非ポリソーム画分の増大することが確認された（図８Ａ）。また、定量RT-PCRではact2やAt3g47610のmRNAはそれぞれ野生株（図５Ｂ）と類似した挙動を示した（図８Ｂ）。培養後期において翻訳が抑制されなかった遺伝子At1g77120（図５Ｂ）mRNA及びAt1g77120の5’UTRを付加したGUS mRNAは、培養8日目においても大部分がポリソーム画分にとどまっており、翻訳が抑制されないことが確認された（図８Ｂ）。

ポリソーム／定量RT-PCR解析によるFluc mRNAの挙動解析
培養後期において翻訳が維持及び抑制される遺伝子の5’UTRを連結したGUS mRNAは培養後期において、その内在遺伝子と同様の挙動をとることが明らかとなった。次に、この発現システムがGUS遺伝子とは異なるFluc遺伝子においても機能するかを調べた。生育必要条件欠乏ストレス下において翻訳が抑制されなかったAt1g77120、及び翻訳が抑制されたAt3g47610、のそれぞれの5’UTRをレポーターFluc遺伝子と連結したバイナリーベクター（「At1g77120 5’UTR::Fluc」及び「At3g47610 5’UTR::Fluc」）をＷＯ２０１１／０２１６６６号に記載の方法に準じて作製し、シロイヌナズナ培養細胞T87に導入して安定形質転換培養細胞を作製した。当該形質転換植物細胞を用いて、ポリソーム／定量RT-PCR解析を行うことで、異なる5’UTRを付加したFluc mRNAと内在性mRNAの生育必要条件欠乏ストレス下における挙動変化を解析した。解析は上記と同様にして行い、実験には、培養1日目（培養前期）、4日目（培養中期）、9日目（培養後期）の細胞を用いた。なお、作製したバイナリーベクターの模式図を図９に示す。図９におけるHSP-TはHSPターミネーターを示す。

「At3g47610 5’UTR::Fluc」により形質転換した培養細胞（At3g47610 5’UTR::Fluc形質転換培養細胞）についてポリソーム解析を行った結果、培養4日目、9日目と培養経過に従ったポリソーム画分の減少と非ポリソーム画分の増大が確認された（図１０Ａ）。定量RT-PCRでは、翻訳が維持されるAt1g77120は培養4日目、9日目においてもポリソーム画分にとどまることが確認された。一方で、翻訳が抑制されるact2、At3g47610に関しても培養4日目ではまだポリソーム画分にとどまるが、9日目では非ポリソーム画分に移行することが確認された（図１０Ｂ）。さらに、培養後期において翻訳が抑制されるAt3g47610の5’UTRを連結したFluc mRNAにおいても、内在性At3g47610と同様に培養4日目ではポリソーム画分にとどまっているが、9日目には非ポリソーム画分に移行し、翻訳が抑制されることが明らかとなった（図１０Ｂ）。

一方、「At1g77120 5’UTR::Fluc」により形質転換した培養細胞（At1g77120 5’UTR::Fluc形質転換培養細胞）についてポリソーム解析を行った結果、培養9日目でポリソーム画分の減少と非ポリソーム画分の増大が確認された（図１１Ａ）。培養4日目に関しては、1日目と比較してポリソーム画分の減少はわずかだが、非ポリソーム画分の増大が確認できることから、ポリソーム画分と非ポリソーム画分の比を考えると、図１０のAt3g47610 5’UTR::Fluc形質転換培養細胞と同程度の翻訳抑制が生じていると思われた。定量RT-PCRでは、培養後期において翻訳が維持されるAt1g77120の5’UTRを連結したFluc mRNAは内在性At1g77120と同様に培養9日目においてもポリソーム画分にとどまっており、翻訳が維持されることが確認された（図１１Ｂ）。

各培養日数におけるFlucタンパク質蓄積量
さらに、翻訳を維持する5’UTRを連結したFluc遺伝子が、実際に培養後期において翻訳されているかを調べるために、翻訳産物であるFlucタンパク質の蓄積量変化を解析した。

培養後期において翻訳が維持されるAt1g77120 5’UTR::Fluc及び抑制されるAt3g47610 5’UTR::Fluc形質転換培養細胞の培養4〜9日目の細胞におけるFluc活性を測定した。その結果、翻訳が抑制されるAt3g47610 5’UTR::Fluc形質転換培養細胞では4〜8日目にかけて緩やかな増加が認められるが、9日目では8日目からの減少を示した（図１２）。一方で、翻訳が維持されるAt1g77120 5’UTR::Fluc形質転換培養細胞では9日目まで高い増加率を示し、9日目には4日目の3倍以上のFlucタンパク質蓄積量となった（図１２）。

以上の結果から、生育必要条件欠乏ストレス下において翻訳が抑制される遺伝子の5’UTRを導入遺伝子に付加した場合、その内在遺伝子と同様に生育必要条件欠乏ストレス下において翻訳が抑制されること、及び、生育必要条件欠乏ストレス下において翻訳が抑制されない遺伝子の5’UTRを導入遺伝子に付加した場合、生育必要条件欠乏ストレス下において翻訳が抑制されることなく活発に行われること、が明らかになった。

ポリソーム／定量RT-PCR解析によるHRP C1a mRNAの挙動解析
上記の検討では、シロイヌナズナ由来の5’UTRを連結したレポーター遺伝子をシロイヌナズナ培養細胞に導入し、ポリソーム／定量RT-PCR解析により5’UTRの翻訳維持能力を評価した。その結果、培養後期において翻訳が抑制されない遺伝子の5’UTRを利用することで導入遺伝子を効率的に翻訳させることができることが明らかとなった。

そこで次に、他の植物培養細胞であるタバコ培養細胞BY-2を用いた場合も同様の結果が得られるか検討した。生育必要条件欠乏ストレス下において翻訳が抑制されなかったAt1g77120及びAt1g55330並びに翻訳が抑制されたAt3g47610の5’UTRをモデル遺伝子である西洋ワサビペルオキシダーゼC1a遺伝子(Horse Radish peroxidase C1a; HRP C1a)と連結したバイナリーベクターをＷＯ２０１１／０２１６６６号に記載の方法に準じて作製し（「At1g77120 5’UTR:: HRP C1a」、「At1g55330 5’UTR:: HRP C1a」及び「At3g47610 5’UTR:: HRP C1a」）、それぞれタバコ培養細胞BY-2に導入した安定形質転換培養細胞を作製し、ポリソーム／定量RT-PCR解析を上記と同様にして行った。なお、作製したバイナリーベクターの模式図を図１３に示す。図１３におけるHSP-TはHSPターミネーターを示す。

〔At3g47610 5’UTR::HRP C1aタバコ形質転換培養細胞〕
培養時に細胞の新鮮重量を測定することで増殖曲線（図１４Ａ）を作成した。また、培養1日目（培養前期）及び8日目の細胞（培養後期）を回収し、上記と同様の解析を行った。その結果、培養8日目ではポリソーム画分が減少し、非ポリソーム画分が増大することが確認された（図１４Ｂ）。定量RT-PCRにより個別mRNAについての挙動を解析したところ、タバコactin(T-actin) mRNAはシロイヌナズナのact2と同様に培養8日目では翻訳が抑制されることが確認された。また、シロイヌナズナ培養後期において翻訳が抑制された遺伝子At3g47610（図５Ｂ）の5’UTRを付加したHPP C1aもシロイヌナズナ同様にタバコ培養細胞でも培養8日目には翻訳が抑制されることが確認された（図１４Ｃ）。

〔At1g77120 5’UTR::HRP C1aタバコ形質転換培養細胞〕
培養時に細胞の新鮮重量を測定することで増殖曲線（図１５Ａ）を作成した。また、培養1日目（培養前期）及び8日目の細胞（培養後期）を回収し、上記と同様の解析を行った。その結果、培養8日目ではポリソーム画分が減少し、非ポリソーム画分が増大することが確認された（図１５Ｂ）。定量RT-PCRにより個別mRNAについての挙動を解析したところ、培養8日目ではタバコactin(T-actin) mRNAが非ポリソーム画分へ移行することが確認された。一方で、シロイヌナズナ培養後期において翻訳が抑制されなったAt1g77120の5’UTRを付加したHRP C1a mRNAは培養8日目においても大部分がポリソーム画分にとどまっており、翻訳が抑制されないことが確認された（図１５Ｃ）。

〔At1g55330 5’UTR::HRP C1aタバコ形質転換培養細胞〕
培養時に細胞の新鮮重量を測定することで増殖曲線（図１６Ａ）を作成した。また、培養1日目（培養前期）及び8日目の細胞（培養後期）を回収し、上記と同様の解析を行った。その結果、培養8日目ではポリソーム画分が減少し、非ポリソーム画分が増大することが確認された（図１６Ｂ）。定量RT-PCRにより個別mRNAについての挙動を解析したところ、培養8日目ではタバコactin(T-actin) mRNAが非ポリソーム画分へ移行することが確認された。一方で、シロイヌナズナ培養後期において翻訳が抑制されなかったAt1g55330の5’UTRを付加したHRP C1a mRNAは培養8日目においても大部分がポリソーム画分にとどまっており、翻訳が抑制されないことが確認された（図１６Ｃ）。この結果は、シロイヌナズナにおける結果と類似しており、シロイヌナズナから単離した、生育必要条件欠乏ストレス下において翻訳維持能力を持つ5’UTRは、他の植物（例えばタバコ）においても効果を発揮できることが示された。

Claims

以下の（ａ）又は（ｂ）の５’ＵＴＲを有するｍＲＮＡをコードする組換えＤＮＡ分子により形質転換された植物細胞を栄養飢餓ストレス下で培養する工程を含む、前記ｍＲＮＡにコードされるタンパク質が、栄養飢餓ストレスにより翻訳抑制されるのを回避する方法：
（ａ）配列番号１、２、３、４、５又は６の塩基配列からなる５’ＵＴＲ、
（ｂ）（ａ）の５’ＵＴＲの塩基配列において、１又は数個の塩基が置換、欠失、又は付加され、かつ、栄養飢餓ストレスによる翻訳抑制を回避する５’ＵＴＲ。
前記植物細胞が、シロイヌナズナ培養細胞又はタバコ培養細胞である、請求項１に記載の方法。
以下の（ａ）又は（ｂ）の５’ＵＴＲを有するｍＲＮＡをコードする組換えＤＮＡ分子により形質転換された植物細胞を栄養飢餓ストレス下で培養する工程を含む、前記ｍＲＮＡにコードされるタンパク質が、栄養飢餓ストレスにより翻訳抑制されるのを回避して、前記タンパク質を製造する方法：
（ａ）配列番号１、２、３、４、５又は６の塩基配列からなる５’ＵＴＲ、
（ｂ）（ａ）の５’ＵＴＲの塩基配列において、１又は数個の塩基が置換、欠失、又は付加され、かつ、栄養飢餓ストレスによる翻訳抑制を回避する５’ＵＴＲ。
少なくとも５’ＵＴＲに相当する部分の塩基配列が、配列番号２、３、５又は６の塩基配列からなるＲＮＡの配列によって組み換えられているｍＲＮＡをコードする、組換えＤＮＡであって、かつ前記ｍＲＮＡにコードされるタンパク質が、栄養飢餓ストレスにより翻訳抑制されるのを回避する機能を有する組換えＤＮＡ。