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JP6058833B2 - Ｃｄ２８結合のための一価組成物および使用方法 - Google Patents

Ｃｄ２８結合のための一価組成物および使用方法 Download PDF

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Description

関連出願の参照
本出願は、２００９年３月２０日に出願された米国仮出願第６１／１６２，１２１号および２００８年７月１８日に出願された米国仮出願第６１／０８２，０７８号の利益を主張する。
ＣＤ２８と結合し、ＣＤ２８のＣＤ８０および／またはＣＤ８６との結合を妨げるドメイン抗体（ｄＡｂ）（ここで、ｄＡｂは、ＣＴＬＡ４と交差反応しない）およびそれを使用する方法が提供される。
配列表
以下に添付された配列表は、引用により本明細書の一部とする。
Ｔリンパ球と抗原提示細胞（ＡＰＣ）間の抗原非特異的細胞間相互作用は、抗原に対するＴ細胞応答を生じさせるＴ細胞共刺激シグナルを生じさせる（Jenkins and Johnson (1993) Curr. Opin. Immunol. 5: 361-367)。共刺激シグナルは、抗原に対するＴ細胞応答の規模およびこの応答が抗原に対するその後の応答を活性化するか不活化するかどうかを決定する(Mueller et al. (1989) Annu. Rev. Immunol. 7: 445-480)。共刺激の不在下でのＴ細胞活性化は、Ｔ細胞応答の中断またはアネルギーをもたらす(Schwartz, R. H. (1992) Cell 71: 1065-1068)。１つの重要な共刺激シグナルは、Ｔ細胞表面受容体ＣＤ２８の、抗原提示細胞上のＢ７関連分子（例えば、それぞれ、Ｂ７−１およびＢ７−２またはＣＤ８０およびＣＤ８６）との相互作用によって提供される(P. Linsley and J. Ledbetter (1993) Annu. Rev. Immunol. 11: 191-212)。ＣＤ２８の、Ｂ７−１（ＣＤ８０）およびＢ７−２（ＣＤ８６）共刺激分子との相互作用は、Ｔ細胞応答を増強および持続するための主要なシグナル伝達経路を提供する(Freedman et al. (1987) J. Immunol. 137: 3260-3267; Freeman et al. (1989) J. Immunol. 143: 2714-2722; Freeman et al. (1991) J. Exp. Med. 174: 625-631; Freeman et al. (1993) Science 262: 909-911; Azuma et al. (1993) Nature 366: 76-79; Freeman et al. (1993) J. Exp. Med. 178: 2185-2192)。
ＣＤ２８は、Ｔ細胞、ほぼすべてのヒトＣＤ４＋Ｔ細胞の表面上で構成的に発現され、ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞、一部のナチュラルキラー細胞およびすべてのマウスＴ細胞でより少ない程度に発現されている。ＣＤ２８は、Ｉ型膜貫通糖タンパク質であり、ＣＤ８０およびＣＤ８６を結合するのに必要とされるＭＹＰＰＰＹ（配列番号６３９）モチーフを有する、その単一のＩｇ可変様細胞外ドメインのために、免疫グロブリンファミリーのメンバーである(Peach et al. 1994, J. Exp. Med. 180: 2049-2058)。ＣＤ２８は、Ｉｇ可変様ドメインの後ろに位置するシステイン残基を有し、これは、そのホモ二量体形成に関与している。ＣＤ２８のタンパク質配列およびヒトＣＤ２８をコードする核酸は、例えば、Harper et al. J. Immunol. (1991) 147: 1037-44に開示されている。ＣＤ２８をコードするヒトｍＲＮＡの配列はまた、例えば、２００９年４月１９日に最新更新されたＮＣＢＩ受託番号ＮＭ＿００６１３９に開示されている。ヒトＣＤ２８の完全タンパク質配列もまた、例えば、２００９年４月１９日に最新更新されたＮＣＢＩ受託番号ＮＰ＿００６１３０に開示されている。
ＣＤ２８は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）シグナルと協同してシグナルを伝達して、ナイーブＴ細胞の活性化を促進する(Lanzavecchia et al. (1999) Cell 96: 1-4)。ＣＤ２８シグナル伝達は、Ｔ細胞活性化の閾値を調節し、効果的なＴ細胞活性化に必要なＴＣＲ結合の数を大幅に減少させる(Viola et al. (1996) Science 273: 104-6)。ＣＤ２８共刺激は、Ｔ細胞増殖の増強、複数のサイトカインおよびサイトカイン受容体の生成、細胞周期進行に関与しているタンパク質の発現の増大、Ｔ細胞生存の持続およびＴ細胞上でのＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）発現の持続をもたらす(Sharpe et al. Fundamental Immunology, W.E. Paul Ed. Fifth Edition, Page 396)。
ＣＤ２８シグナルは、ＣＤ４およびＣＤ８Ｔ細胞分化の調節において重大な役割を有する。ＣＤ２８はまた、これまでに活性化されたＴ細胞の応答を最適化し、ＩＬ−２生成およびＴ細胞生存を促進する。ナイーブＴ細胞によるＩＬ−４生成は、Ｂ７−１／Ｂ７−２共刺激に高度に依存している。ナイーブＴ細胞の活性化の際のＣＤ２８／Ｂ７経路の阻害は、Ｔ細胞増殖および分化を損ない、一方で、それまでに活性化されたＴ細胞におけるＣＤ２８／Ｂ７経路の阻害は、Ｔ細胞増殖を減少させるが、エフェクターサイトカイン生成は減少させない(Sharpe et al. Fundamental Immunology, W.E. Paul Ed. Fifth Edition, pages 393-404)。
Ｔヘルパー細胞依存性抗体反応は、Ｂ７−ＣＤ２８経路を使用して、免疫グロブリンクラススイッチおよび胚中心形成に必要な同族Ｔ細胞／Ｂ細胞相互作用にとって不可欠な共刺激シグナルを提供する。ＣＤ２８ノックアウトマウスでは、抗原刺激後に、潜在的に反応性のＢ細胞が、リンパ濾胞内に蓄積するが、増殖できず、すなわち、体細胞突然変異を受けない(Ferguson et al. (1996) J. Immunol. 156: 4576-4581)。
Ｂ７−１およびＢ７−２はまた、第２の、高度に親和性の受容体、ＣＴＬＡ４（ＣＤ１５２）のリガンドであり、これは、活性化されたＴ細胞の表面に存在する。阻害性シグナルのＢ７−１／Ｂ７−２共刺激は、Ｂ７−１／Ｂ７−２がＣＴＬＡ−４と結合する際に生じる(Brunet et al. (1987) Nature 328: 267-270, Linsley et al. (1991) J. Exp. Med.174: 561-569)。免疫応答の結果は、ＣＤ２８媒介性Ｔ細胞活性化およびＣＴＬＡ−４媒介性Ｔ細胞阻害の間のバランスに関与する。
ＣＤ２８媒介性Ｔ細胞活性化の阻害は、自己免疫、移植拒絶またはアレルギー反応の際に生じる望ましくないＴ細胞応答を阻害し得る。例えば、ＣＤ２８媒介性Ｔ細胞活性化の阻害は、移植片拒絶を遅延し、急性同種移植片拒絶を防ぎ、ドナー特異的耐性を誘発し、慢性同種移植片拒絶の発生を防ぎ、その進行を妨げ、ならびに、移植片対宿主病（ＧＶＨ）を、すなわち、移植されたＴ細胞が、宿主組織同種抗原に対する活発な免疫応答を開始する場合を防ぎ得る(Salama et al. (2001) J. Clin. Invest. 108: 943-48)。CＤ２８媒介性Ｔ細胞活性化の阻害は、ＣＤ２８によるシグナル伝達の活性化を打ち消すことによって免疫応答の勢いを弱めるだけでなく、ＣＤ８６およびＣＤ８０の、ＣＴＬＡ−４との相互作用に影響を及ぼさないはずであり、それによって、Ｔ細胞応答のＣＴＬＡ−４媒介性阻害を保つ。したがって、ＣＤ２８媒介性Ｔ細胞活性化の阻害を使用して、自己免疫の誘導を防ぎ、コラーゲン誘導関節炎、自己免疫性甲状腺炎、自己免疫性ブドウ膜炎、重症筋無力症およびループスのモデルをはじめとする確立された自己免疫疾患の進行および／または重篤度を調節することができる(Saloman et al. (2001) Ann. Rev. Immunol. 19: 225-252)。
必要なことは、ＣＤ２８シグナル伝達経路の刺激を伴わずにＣＤ２８媒介性Ｔ細胞活性化を阻害する方法である。本明細書に示される開示は、この必要性に一致し、対応する。
ＣＤ２８と一価で結合するドメイン抗体（ｄＡｂ）が本明細書において提供される。Ｔ細胞応答および抗体の生成の調節におけるＣＤ２８の明白な重要性のために、ＣＤ２８／Ｂ７（ＣＤ８０およびＣＤ８６）相互作用および経路は、移植拒絶、自己免疫および／または過度の抗体応答などの不適当な細胞応答を含む疾患および障害の治療のための治療的アプローチの開発のための重要な標的を示す。ＣＤ２８の結合について一価であるドメイン抗体は、ＣＤ２８活性を阻害し、免疫応答の勢いを弱め、一方で、ＣＤ２８を二価または多価結合できる抗体を用いた場合に生じ得る望ましくない効果の可能性を避けられる。ドメイン抗体は、標準二価抗体も使用されるいくつかの使用のいずれか、例えば、インビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）イメージングおよび診断にも適用することができる。
したがって、受容体結合アッセイにおいて、ＣＤ２８と結合し、ＣＤ２８の、ＣＤ８０、ＣＤ８６および／またはその他のリガンドとの結合を阻止または阻害し、ＣＤ８０および／またはＣＤ８６によるＣＤ２８シグナル伝達を阻害するドメイン抗体が本明細書に記載される。本明細書に記載されるドメイン抗体はまた、ＣＤ８０およびＣＤ８６の、ＣＴＬＡ４との相互作用を阻止しない。一実施形態では、本明細書に記載されるドメイン抗体は、ＣＴＬＡ４と交差反応せず、したがって、ＣＤ８０／８６と結合する、ＣＴＬＡ４およびＣＤ２８上の共通モチーフと結合しない。
一実施形態では、ドメイン抗体のＣＤ２８との結合は、ＣＤ２８活性を実質的には刺激しない。特に、ｄＡｂは、Ｔ細胞受容体シグナル伝達と組み合わさったＣＤ２８シグナル伝達を刺激しない。別の実施形態では、ドメイン抗体は、ＣＤ２８のＣＤ８０との結合を阻害する。別の実施形態では、ドメイン抗体は、ＣＤ２８のＣＤ８０との結合を阻害し、ＣＤ２８によるシグナル伝達を実質的に刺激しない。さらに別の実施形態では、ドメイン抗体は、ＣＤ２８のＣＤ８６との結合を阻害する。別の実施形態では、ドメイン抗体は、ＣＤ２８のＣＤ８６との結合を阻害し、ＣＤ２８によるシグナル伝達を実質的に刺激しない。また、ＣＤ８０および／またはＣＤ８６の、ＣＤ２８のＭＹＰＰＰＹ（配列番号６３９）配列との結合を干渉するｄＡｂが含まれる。
一態様では、ｄＡｂは、Ｔ細胞受容体シグナル伝達と組み合わさったＴ細胞増殖を実質的に誘導しない。別の態様では、ｄＡｂは、Ｔ細胞受容体シグナル伝達と組み合わさった、Ｔ細胞によるサイトカイン分泌を実質的に誘導しない。一実施形態では、サイトカインは、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２ ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７、ＩＬ−２１、ＩＬ−２２、ＩＬ−２４、ＴＧＦβ、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γからなる群から選択される少なくとも１種のサイトカインである。
一態様では、ヒト抗体は、疾患の治療または予防のためにヒト被験体に投与された場合に、抗体に対する免疫応答の生成を回避するので、例示的実施形態では、ドメイン抗体は、ＣＤ２８活性を実質的に刺激しない、ＣＤ２８と一価で結合するヒトドメイン抗体である。
一実施形態では、ドメイン抗体は、表面プラズモン共鳴によって測定されるように、５０ｎＭから１ｐＭ（５０ｎＭおよび１ｐＭを含めて）の範囲のＫｄ
でヒトＣＤ２８と相互作用する。例えば、ヒトＣＤ２８のＫｄは、２５ｎＭ〜２０ｐＭ、１０ｎＭ〜２０ｐＭ、５ｎＭ〜２０ｐＭ、１ｎＭ〜２０ｐＭ、０．５ｎＭ〜２０ｐＭ、０．１ｎＭ〜２０ｐＭ、０．１ｎＭ〜５０ｐＭ、７５ｐＭ〜２０ｐＭまたはさらに５０ｐＭ〜２０ｐＭであり得る。一実施形態では、ヒトＣＤ２８のＫｄは、約５０ｐＭである。
一実施形態では、ドメイン抗体は、５０ｎＭ以下のＩＣ５０でＣＤ８０のＣＤ２８との結合を阻害する。一実施形態では、ドメイン抗体は、５０ｎＭ以下のＩＣ５０でＣＤ８６のＣＤ２８との結合を阻害する。さらなる実施形態では、ドメイン抗体は、表面プラズモン共鳴によって測定されるような、１×１０−３ｓ−１以下、１×１０−４ｓ−１以下、１ｘ１０−５ｓ−１以下または１×１０−６ｓ−１以下のＫｏｆｆ速度定数で、ＣＤ２８に対する結合特異性を有する。一実施形態では、ドメイン抗体は、標準アッセイにおいて５０ｎＭ以下のＩＣ５０でＣＤ２８を中和する。
別の実施形態では、ドメイン抗体は、ＣＤ２８と結合する、単一の免疫グロブリン可変をドメイン含む。一実施形態では、単一の免疫グロブリン可変ドメインは、ＶＨまたはＶＬドメインである。別の実施形態では、ドメイン抗体は、２種の可変ドメイン、例えば、ＶＨおよびＶＬドメインのホモマルチマーまたはヘテロマルチマーを含むが、可変ドメインの一方は、対応するＶＬまたはＶＨドメインを必要とせずＣＤ２８と結合する能力を有する。すなわち、ｄＡｂは、さらなるＶＨまたはＶＬドメインと独立に、抗原と結合する。これらの実施形態では、可変ドメインは、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含み得る。別の実施形態では、ドメイン抗体は、Ｆｃドメインを含まない。Ｆｃドメインの境界は、Kabat et al. (1991, Sequences of Immunological Interest, 5th ed. U.S. Dept. Health & Human Services, Washington, D.C.;引用により本明細書の一部とする）に示されている。別の方法では、Ｆｃドメインは、ＣＨ２と連結しているヒンジ領域を含んでいてもよい、ＣＨ２−ＣＨ３領域からなる。
一態様では、ドメイン抗体は、ユニバーサルフレームワークを含む。この態様では、ドメイン抗体は、ヒト生殖系列抗体遺伝子セグメントによってコードされる対応するフレームワーク（ＦＷ）領域のアミノ酸配列、またはヒト生殖系列抗体遺伝子セグメントによってコードされる前記の対応するフレームワーク領域のアミノ酸配列と比較して、最大５、例えば、１、２、３、４または５つのアミノ酸の相違を合わせて含む、１または複数の前記フレームワーク領域のアミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を含む１または複数のフレームワーク領域を含み得る。
一実施形態では、ｄＡｂは、ヒト抗体、例えば、ヒト生殖系列抗体のＦＷ１、ＦＷ２、ＦＷ３およびＦＷ４に対応するＦＷ１、ＦＷ２、ＦＷ３およびＦＷ４のアミノ酸配列を含む。さらなる実施形態では、ドメイン抗体のＦＷ１、ＦＷ２、ＦＷ３およびＦＷ４のアミノ酸配列の一部またはすべてが、ヒト生殖系列抗体遺伝子セグメントによってコードされる対応するフレームワーク領域のアミノ酸配列と同一である。例えば、ＦＷ２は、ヒト抗体のＦＷ２と同一であり得る。別の実施形態では、ＦＷ１、ＦＷ２、ＦＷ３およびＦＷ４のアミノ酸配列は、前記のヒト生殖系列抗体遺伝子セグメントによってコードされる対応するフレームワーク領域のアミノ酸配列と比較して最大１０個のアミノ酸の相違を合わせて含む。前述のさらなる実施形態では、ヒト生殖系列抗体遺伝子セグメントは、ＤＰ４７、ＤＰ４５、ＤＰ４８およびＤＰＫ９からなる群から選択され得る。一実施形態では、ユニバーサルフレームワークは、ＤＰ４７、ＤＰ４５およびＤＰ３８からなる群から選択されるＶＨフレームワークを含み、かつ／またはＶＬフレームワークは、ＤＰＫ９である。
一態様では、ドメイン抗体は、そのインビボ半減期を増大するようフォーマットされている。特に、ドメイン抗体は、同じフォーマットされていないドメイン抗体と比較して、増大したインビボｔ−αまたはｔ−β半減期を有する。
一実施形態では、ドメイン抗体組成物のｔα−半減期は、そうでなければ同一の条件下でアッセイされた修飾されていないタンパク質と比較した場合に１０％以上増大している。別の実施形態では、ドメイン抗体組成物のｔα−半減期は、５０％以上増大している。別の実施形態では、ドメイン抗体組成物のｔα−半減期は、２倍以上増大している。別の実施形態では、ドメイン抗体組成物のｔα−半減期は、５倍以上、例えば、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、４０倍、５０倍以上増大している。別の実施形態では、ドメイン抗体組成物のｔα−半減期は、１００倍、２００倍、３００倍、４００倍、５００倍以上増大している。
別の実施形態では、ドメイン抗体は、０．２５から６時間（０．２５時間および６時間を含めて）のｔα半減期を有する。別の実施形態では、ｔα半減期は、３０分から１２時間（３０分および１２時間を含めて）の範囲である。別の実施形態では、ドメイン抗体のｔα−半減期は、１から６時間の範囲である。
別の実施形態では、ドメイン抗体のｔβ−半減期は、そうでなければ同一の条件下でアッセイされた修飾されていないタンパク質と比較した場合に１０％以上増大している。別の実施形態では、ドメイン抗体のｔβ−半減期は、５０％以上増大している。別の実施形態では、抗体ドメイン抗体のｔβ−半減期は、２倍以上増大している。別の実施形態では、ドメイン抗体のｔβ−半減期は、５倍以上、例えば、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、４０倍以上増大している。別の実施形態では、ドメイン抗体のｔβ−半減期は、５０倍以上増大している。
別の実施形態では、ドメイン抗体は、１時間から７４４時間（１時間および７４４時間を含めて）のｔβ半減期を有する。別の実施形態では、ｔβ−半減期は、１２から４８時間（１２時間および４８時間を含めて）の範囲である。別の実施形態では、ｔβ半減期は、１２から２６時間（１２時間および２６時間を含めて）の範囲である。さらに別の実施形態では、ｔβ半減期は、約３３６時間である。
上記の判定基準に加えて、またはその代替として、１ｍｇ・分／ｍｌ以上の範囲のＡＵＣ値（曲線下面積）を有するリガンドを含むドメイン抗体含有組成物が提供される。一実施形態では、範囲の下端は、５、１０、１５、２０、３０、１００、２００または３００ｍｇ・分／ｍｌである。さらに、またはあるいは、リガンドまたは組成物は、最大６００ｍｇ・分／ｍｌの範囲のＡＵＣを有する。一実施形態では、範囲の上端は、５００、４００、３００、２００、１５０、１００、７５または５０ｍｇ・分／ｍｌである。有利なことに、リガンドは、以下からなる群から選択される範囲のＡＵＣを有する：１５〜１５０ｍｇ・分／ｍｌ、１５〜１００ｍｇ・分／ｍｌ、１５〜７５ｍｇ・分／ｍｌおよび１５〜５０ｍｇ・分／ｍｌ。
１つのフォーマット実施形態では、本明細書に記載されるドメイン抗体を、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）と連結することができ、これはまた、分子のインビボ半減期を増大する効果を有する。ヒト血清アルブミンコード配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ０００４７７で入手可能なｃＤＮＡ配列に由来するプライマーを使用するＰＣＲによって得ることができる。このようなコード配列は、本明細書に記載されるようなドメイン抗体のコード配列と融合することができ、融合物は、当業者によって発現させることができる。一実施形態では、ＨＳＡが連結しているドメイン抗体組成物のｔα−半減期が１０％以上増大している。別の実施形態では、ＨＳＡが連結しているドメイン抗体組成物のｔα−半減期は、０．２５時間から６時間の範囲である。別の実施形態では、ＨＳＡが連結しているドメイン抗体組成物のｔβ−半減期は、１０％以上増大している。別の実施形態では、ＨＳＡが連結しているドメイン抗体組成物のｔβ−半減期は、１２から４８時間の範囲である。
別の実施形態では、フォーマッティングは、ｄＡｂのＰＥＧ化を含む。一実施形態では、ＰＥＧは、共有結合によって連結している。別の実施形態では、ＰＥＧは、システインまたはリシン残基でドメイン抗体と連結している。さらに別の実施形態では、ＰＥＧが連結しているドメイン抗体は、少なくとも２４ｋＤの水力学的サイズを有する。さらに別の実施形態では、総ＰＥＧサイズは、２０から６０ｋＤ（２０ｋＤおよび６０ｋＤを含めて）である。さらに別の実施形態では、ＰＥＧが連結しているドメイン抗体は、少なくとも２００ｋＤの水力学的サイズを有する。
別の実施形態では、ＰＥＧが連結しているドメイン抗体は、連結しているポリエチレングリコールを欠く同一ポリペプチド組成物と比較して増大したインビボ半減期を有する。別の実施形態では、ドメイン抗体組成物のｔα−半減期は、１０％以上増大している。別の実施形態では、ドメイン抗体組成物のｔα−半減期は、５０％以上増大している。別の実施形態では、ドメイン抗体組成物のｔα−半減期は、２倍以上増大している。別の実施形態では、ドメイン抗体組成物のｔα−半減期は、５倍以上、例えば、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、４０倍、５０倍以上増大している。別の実施形態では、ドメイン抗体組成物のｔα−半減期は、１００倍、２００倍、３００倍、４００倍、５００倍以上増大している。
別の実施形態では、ＰＥＧが連結しているドメイン抗体は、０．２５〜６時間（０．２５時間および６時間を含めた）の半減期を有する。別の実施形態では、ｔα半減期は、３０分〜１２時間（３０分および１２時間を含めた）の範囲である。別の実施形態では、ドメイン抗体のｔα−半減期は、１〜６時間の範囲である。
別の実施形態では、ＰＥＧが連結しているドメイン抗体のｔβ−半減期は、１０％以上増大している。別の実施形態では、ＰＥＧが連結しているドメイン抗体のｔβ−半減期は、５０％以上増大している。別の実施形態では、ＰＥＧが連結しているドメイン抗体のｔβ−半減期は、２倍以上増大している。別の実施形態では、ＰＥＧが連結しているドメイン抗体のｔβ−半減期は、５倍以上、例えば、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、４０倍以上増大している。別の実施形態では、ＰＥＧが連結しているドメイン抗体のｔβ−半減期は、５０倍以上増大している。
別の実施形態では、ＰＥＧが連結しているドメイン抗体は、１〜１７０時間（１時間および１７０時間を含めて）のｔβ半減期を有する。別の実施形態では、ｔβ−半減期は、１２〜４８時間（１２時間および４８時間を含めて）の範囲である。別の実施形態では、ｔβ−半減期は、１２〜２６時間（１２時間および２６時間を含めて）の範囲である。
別の実施形態では、ＰＥＧが連結しているドメイン抗体は、１ｍｇ・分／ｍｌ以上の範囲のＡＵＣ値（曲線下面積）を有する。一実施形態では、範囲の下端は、約５、１０、１５、２０、３０、１００、２００または３００ｍｇ・分／ｍｌである。さらに、またはあるいは、リガンドまたは組成物は、最大約６００ｍｇ・分／ｍｌの範囲のＡＵＣを有する。一実施形態では、範囲の上端は、約５００、４００、３００、２００、１５０、１００、７５または５０ｍｇ・分／ｍｌである。有利なことに、リガンドは、以下からなる群から選択される範囲のＡＵＣを有する：約１５〜１５０ｍｇ・分／ｍｌ、約１５〜１００ｍｇ・分／ｍｌ、約１５〜７５ｍｇ・分／ｍｌおよび約１５〜５０ｍｇ・分／ｍｌ。
別の実施形態では、そのドメイン抗体が、特異的に、一価でＣＤ２８と結合する、配列番号１〜５７からなる群から選択される配列を有する核酸分子によってコードされるアミノ酸配列と、少なくとも８５％同一である、例えば、少なくとも９０％同一である、少なくとも９５％同一である、９６％、９７％、９８％または９９％まで（それらを含む）同一であるアミノ酸配列を有するドメイン抗体が提供される。
別の実施形態では、ドメイン抗体は、配列番号５８〜３９８および６４０ならびに配列番号５３２〜６３５からなる群から選択されるアミノ酸配列、例示的実施形態では、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号２７２、配列番号２７３、配列番号２７４、配列番号２７５、配列番号２７６、配列番号５３４、配列番号５３５、配列番号５３６、配列番号５３７、配列番号５３９、配列番号５４０、配列番号５４２、配列番号５４３、配列番号５４５、配列番号５４７、配列番号５４８、配列番号５５０、配列番号５５１、配列番号５５３、配列番号５６２、配列番号５６７、配列番号５７０、配列番号５７５、配列番号５７６、配列番号５７７、配列番号５７８、配列番号５８０、配列番号５９９、配列番号６００、配列番号６０７、配列番号６１１、配列番号６１７、および配列番号６２２を含む。
さらに別の態様では、そのポリペプチドが、ＣＤ２８と特異的に、一価で結合する、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号２７２、配列番号２７３、配列番号２７４、配列番号２７５、配列番号２７６、配列番号５３４、配列番号５３５、配列番号５３６、配列番号５３７、配列番号５３９、配列番号５４０、配列番号５４２、配列番号５４３、配列番号５４５、配列番号５４７、配列番号５４８、配列番号５５０、配列番号５５１、配列番号５５３、配列番号５６２、配列番号５６７、配列番号５７０、配列番号５７５、配列番号５７６、配列番号５７７、配列番号５７８、配列番号５８０、配列番号５９９、配列番号６００、配列番号６０７、配列番号６１１、配列番号６１７、および配列番号６２２からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を有するドメイン抗体が提供される。別の実施形態では、ドメイン抗体は、２５以下のアミノ酸位置で選択されたアミノ酸配列とは異なり、選択された配列と少なくとも８０％同一である配列を有する。一実施形態では、ドメイン抗体は、２５以下のアミノ酸位置、２０以下のアミノ酸位置、１５以下のアミノ酸位置、１０以下のアミノ酸位置、５以下のアミノ酸位置、２以下のアミノ酸位置またはわずか１つのアミノ酸位置で選択されたアミノ酸配列とは異なる。さらなる実施形態では、ドメイン抗体は、選択された配列と少なくとも８０％同一である、例えば、少なくとも７０％同一である、少なくとも７５％同一である、少なくとも８０％同一である、少なくとも８５％同一である、少なくとも９０％同一である、少なくとも９５％同一である、９６％、９７％、９８％または９９％まで（それらを含む）同一である。
一実施形態では、ＣＤ２８アンタゴニストは、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号２７２、配列番号２７３、配列番号２７４、配列番号２７５、配列番号２７６、配列番号５３４、配列番号５３５、配列番号５３６、配列番号５３７、配列番号５３９、配列番号５４０、配列番号５４２、配列番号５４３、配列番号５４５、配列番号５４７、配列番号５４８、配列番号５５０、配列番号５５１、配列番号５５３、配列番号５６２、配列番号５６７、配列番号５７０、配列番号５７５、配列番号５７６、配列番号５７７、配列番号５７８、配列番号５８０、配列番号５９９、配列番号６００、配列番号６０７、配列番号６１１、配列番号６１７、および配列番号６２２からなる群から選択されるアミノ酸配列のＣＤＲ１配列と少なくとも５０％同一であるＣＤＲ１配列を有する。
一実施形態では、ＣＤＲ１は、すべてのＣＤＲ１アミノ酸位置、５以下のアミノ酸位置、４以下のアミノ酸位置、３以下のアミノ酸位置、２以下のアミノ酸位置またはわずか１つのアミノ酸位置で選択されたアミノ酸配列とは異なる。さらなる実施形態では、ＣＤＲ１は、選択された配列と少なくとも５０％同一である、例えば、少なくとも６０％同一である、少なくとも７０％同一である、少なくとも７５％同一である、少なくとも８０％同一である、少なくとも８５％同一である、少なくとも９０％同一である、少なくとも９５％同一である、９６％、９７％、９８％または９９％まで（それらを含む）同一である。
一実施形態では、ＣＤ２８アンタゴニストは、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号２７２、配列番号２７３、配列番号２７４、配列番号２７５、配列番号２７６、配列番号５３４、配列番号５３５、配列番号５３６、配列番号５３７、配列番号５３９、配列番号５４０、配列番号５４２、配列番号５４３、配列番号５４５、配列番号５４７、配列番号５４８、配列番号５５０、配列番号５５１、配列番号５５３、配列番号５６２、配列番号５６７、配列番号５７０、配列番号５７５、配列番号５７６、配列番号５７７、配列番号５７８、配列番号５８０、配列番号５９９、配列番号６００、配列番号６０７、配列番号６１１、配列番号６１７、および配列番号６２２からなる群から選択されるアミノ酸配列のＣＤＲ２配列と少なくとも ５０％同一であるＣＤＲ２配列を有する。
一実施形態では、ＣＤＲ２は、すべてのＣＤＲ２アミノ酸位置、５以下のアミノ酸位置、４以下のアミノ酸位置、３以下のアミノ酸位置、２以下のアミノ酸位置またはわずか１つのアミノ酸位置で選択されたアミノ酸配列とは異なる。さらなる実施形態では、ＣＤＲ２は、選択された配列と少なくとも５０％同一である、例えば、少なくとも６０％同一である、少なくとも７０％同一である、少なくとも７５％同一である、少なくとも８０％同一である、少なくとも８５％同一である、少なくとも９０％同一である、少なくとも９５％同一である、９６％、９７％、９８％または９９％まで（それらを含む）同一である。
一実施形態では、ＣＤ２８アンタゴニストは、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号２７２、配列番号２７３、配列番号２７４、配列番号２７５、配列番号２７６、配列番号５３４、配列番号５３５、配列番号５３６、配列番号５３７、配列番号５３９、配列番号５４０、配列番号５４２、配列番号５４３、配列番号５４５、配列番号５４７、配列番号５４８、配列番号５５０、配列番号５５１、配列番号５５３、配列番号５６２、配列番号５６７、配列番号５７０、配列番号５７５、配列番号５７６、配列番号５７７、配列番号５７８、配列番号５８０、配列番号５９９、配列番号６００、配列番号６０７、配列番号６１１、配列番号６１７、および配列番号６２２からなる群から選択されるアミノ酸配列のＣＤＲ２配列と少なくとも５０％同一であるＣＤＲ３配列を有する。
一実施形態では、ＣＤＲ３は、すべてのＣＤＲ３アミノ酸位置、５以下のアミノ酸位置、４以下のアミノ酸位置、３以下のアミノ酸位置、２以下のアミノ酸位置またはわずか１つのアミノ酸位置で選択されたアミノ酸配列とは異なる。さらなる実施形態では、ＣＤＲ２は、選択された配列と少なくとも５０％同一である、例えば、少なくとも６０％同一である、少なくとも７０％同一である、少なくとも７５％同一である、少なくとも８０％同一である、少なくとも８５％同一である、少なくとも９０％同一である、少なくとも９５％同一である、９６％、９７％、９８％または９９％まで（それらを含む）同一である。
配列番号４８４、配列番号４８７、配列番号４９０、配列番号４９３、配列番号４９６、配列番号４９９、配列番号５０２、配列番号５０５、配列番号５０８、配列番号５１１、配列番号５１４、配列番号５１７、配列番号５２０、配列番号５２３、配列番号５２６、配列番号５２９および配列番号６３６からなる群から選択されるＣＤＲ１配列の１種と少なくとも５０％同一であるＣＤＲ１配列と、配列番号４８５、配列番号４８８、配列番号４９１、配列番号４９４、配列番号４９７、配列番号５００、配列番号５０３、配列番号５０６、配列番号５０９、配列番号５１２、配列番号５１５、配列番号５１８、配列番号５２１、配列番号５２４、配列番号５２７、配列番号５３０および配列番号６３７からなる群から選択されるＣＤＲ２配列の１種と少なくとも５０％同一であるＣＤＲ２配列と、配列番号４８６、配列番号４８９、配列番号４９２、配列番号４９５、配列番号４９８、配列番号５０１、配列番号５０４、配列番号５０７、配列番号５１０、配列番号５１３、配列番号５１６、配列番号５１９、配列番号５２２、配列番号５２５、配列番号５２８、配列番号５３１および配列番号６３８からなる群から選択されるＣＤＲ３配列の１種と少なくとも５０％同一であるＣＤＲ３配列とを含むｄＡｂがさらに含まれる。
別の態様では、配列番号４８４、配列番号４８７、配列番号４９０、配列番号４９３、配列番号４９６、配列番号４９９、配列番号５０２、配列番号５０５、配列番号５０８、配列番号５１１、配列番号５１４、配列番号５１７、配列番号５２０、配列番号５２３、配列番号５２６、配列番号５２９および配列番号６３６からなる群から選択されるＣＤＲ１配列と、配列番号４８５、配列番号４８８、配列番号４９１、配列番号４９４、配列番号４９７、配列番号５００、配列番号５０３、配列番号５０６、配列番号５０９、配列番号５１２、配列番号５１５、配列番号５１８、配列番号５２１、配列番号５２４、配列番号５２７、配列番号５３０および配列番号６３７からなる群から選択されるＣＤＲ２配列と、配列番号４８６、配列番号４８９、配列番号４９２、配列番号４９５、配列番号４９８、配列番号５０１、配列番号５０４、配列番号５０７、配列番号５１０、配列番号５１３、配列番号５１６、配列番号５１９、配列番号５２２、配列番号５２５、配列番号５２８、配列番号５３１および配列番号６３８からなる群から選択されるＣＤＲ３配列とを含むｄＡｂが含まれる。
さらに別の態様では、ｄＡｂは、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号２７２、配列番号２７３、配列番号２７４、配列番号２７５、配列番号２７６、配列番号４７２、配列番号４７３、配列番号４７４、配列番号４７５、配列番号４７６、配列番号４７７、配列番号４７８、配列番号４７９、配列番号４８０、配列番号４８１、配列番号４８２、配列番号４８３、配列番号５３４、配列番号５３５、配列番号５３６、配列番号５３７、配列番号５３９、配列番号５４０、配列番号５４２、配列番号５４３、配列番号５４５、配列番号５４７、配列番号５４８、配列番号５５０、配列番号５５１、配列番号５５３、配列番号５６２、配列番号５６７、配列番号５７０、配列番号５７５、配列番号５７６、配列番号５７７、配列番号５７８、配列番号５８０、配列番号５９９、配列番号６００、配列番号６０７、配列番号６１１、配列番号６１７、および配列番号６２２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、ｄＡｂは、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号２７２、配列番号２７３、配列番号２７４、配列番号２７５、配列番号２７６、配列番号５３４、配列番号５３５、配列番号５３６、配列番号５３７、配列番号５３９、配列番号５４０、配列番号５４２、配列番号５４３、配列番号５４５、配列番号５４７、配列番号５４８、配列番号５５０、配列番号５５１、配列番号５５３、配列番号５６２、配列番号５６７、配列番号５７０、配列番号５７５、配列番号５７６、配列番号５７７、配列番号５７８、配列番号５８０、配列番号５９９、配列番号６００、配列番号６０７、配列番号６１１、配列番号６１７、または配列番号６２２のものとは、２５個以下のアミノ酸で異なるアミノ酸配列を含む。
ｄＡｂは、約１００ｎＭ、約５０ｎＭ、約１ｎＭ、約５００ｐＭ、約１００ｐＭ、約５０ｐＭ、約１０ｐＭ、約５ｐＭまたは約１ｐＭのＩＣ５０で、ＣＤ２８のＣＤ８０および／またはＣＤ８６との結合を阻害し得る。例えば、ドメイン抗体は、ＣＤ２８のＣＤ８０との結合を、１ｐＭ〜１．５μＭ（１ｐＭおよび１．５μＭを含めて）の範囲のＩＣ５０；ＣＤ８０とのＣＤ２８結合の阻害のＩＣ５０で阻害する。ＩＣ５０は、１ｐＭ〜１μＭ、１ｐＭ〜９００ｎＭ、１ｐＭ〜８００ｎＭ、１ｐＭ〜７００ｎＭ、１ｐＭ〜６００ｎＭ、１ｐＭ〜５００ｎＭ、１ｐＭ〜４００ｎＭ、１ｐＭ〜３００ｎＭ、１ｐＭ〜２００ｎＭ、１ｐＭ〜１００ｎＭ、１ｐＭ〜５０ｎＭ、１ｐＭ〜１０ｎＭ、１ｐＭ〜１ｎＭ、１ｐＭ〜５００ｐＭ、１ｐＭ〜１００ｐＭ、１ｐＭ〜５０ｐＭ、１ｐＭ〜１０ｐＭまたは１ｐＭ〜５ｐＭの範囲であり得る。さらに許容される範囲として、例えば、５０ｐＭ〜１μＭ、１００ｐＭ〜５００ｎＭ、１２５ｐＭ〜２５０ｎＭ、１５０ｐＭ〜２００ｎＭ、１５０ｐＭ〜１００ｎＭおよび２００ｐＭ〜５０ｎＭが挙げられる。
別の実施形態では、ドメイン抗体は、ＣＤ２８のＣＤ８６との結合を、１ｐＭ〜１．５μＭ（１ｐＭおよび１．５μＭを含めて）の範囲のＩＣ５０；ＣＤ８６とのＣＤ２８結合の阻害のＩＣ５０で阻害する。ＩＣ５０は、１ｐＭ〜１μＭ、１ｐＭ〜９００ｎＭ、１ｐＭ〜８００ｎＭ、１ｐＭ〜７００ｎＭ、１ｐＭ〜６００ｎＭ、１ｐＭ〜５００ｎＭ、１ｐＭ〜４００ｎＭ、１ｐＭ〜３００ｎＭ、１ｐＭ〜２００ｎＭ、１ｐＭ〜１００ｎＭ、１ｐＭ〜５０ｎＭ、１ｐＭ〜１０ｎＭ、１ｐＭ〜１ｎＭ、１ｐＭ〜５００ｐＭ、１ｐＭ〜１００ｐＭ、１ｐＭ〜５０ｐＭ、１ｐＭ〜１０ｐＭまたは１ｐＭ〜５ｐＭの範囲であり得る。さらに許容される範囲として、例えば、５０ｐＭ〜１μＭ、１００ｐＭ〜５００ｎＭ、１２５ｐＭ〜２５０ｎＭ、１５０ｐＭ〜２００ｎＭ、１５０ｐＭ〜１００ｎＭおよび２００ｐＭ〜５０ｎＭが挙げられる。
本明細書に記載されるドメイン抗体を個体に投与することを含み、ドメイン抗体が、個体においてＣＤ８０のＣＤ２８との結合を拮抗する、個体においてＣＤ８０のＣＤ２８との結合を拮抗する方法が提供される。個体においてＣＤ８６のＣＤ２８との結合を拮抗する方法は、本明細書に記載されるドメイン抗体を個体に投与することを含み、ドメイン抗体は、個体においてＣＤ８６のＣＤ２８との結合を拮抗する。個体においてＣＤ２８の活性を拮抗する方法は、本明細書に記載されるドメイン抗体を個体に投与することを含み、ドメイン抗体は、ＣＤ２８の活性を拮抗する。ＣＤ２８によって媒介される疾患または障害を、このような治療を必要とする個体において治療または予防する方法は、個体にＣＤ２８と結合するドメイン抗体を含む組成物の治療上有効な量を投与することを含む。一実施形態では、疾患または障害は、自己免疫疾患または障害である。別の実施形態では、疾患または障害は、移植組織と関連している。
また、第１の抗原に対する結合特異性を有するドメイン抗体と、第２の抗原に対する結合活性を有する単一の可変ドメインとを含み、第１の抗原がＣＤ２８であり、単一の可変ドメインの第２の抗原との結合が、インビボでのリガンドの半減期を増大するよう作用する二重特異性リガンドが含まれる。
一実施形態では、二重特異性リガンドは、４つの鎖のＩｇＧ免疫グロブリンである。４つの鎖ＩｇＧは、２種の二重特異性リガンドを含むことができ、前記二重特異性リガンドは、その可変ドメインで異なっている。
別の実施形態では、ドメイン抗体は、ラクダＶＨＨドメインである。二重特異性リガンドのこの実施形態では、単一の免疫グロブリン可変ドメインは、重鎖可変ドメインであり得る。二重特異性リガンドの別の実施形態では、単一の免疫グロブリン可変ドメインは、軽鎖可変ドメインである。二重特異性リガンドの一実施形態では、リガンドは、４つの重鎖の単一可変ドメインまたは４つの軽鎖の単一可変ドメインを含むＩｇＧ免疫グロブリンとして提供される。重鎖は、ラクダＶＨＨドメインを含み得る。二重特異性リガンドのさらなる実施形態では、二重特異性リガンドが、第１および第２の抗原の両方と同時に結合し得るよう、第１および第２のドメインが独立に結合する。二重特異性リガンドの一実施形態では、ドメイン抗体は、表面プラズモン共鳴によって測定される場合ヒトＣＤ２８について１×１０−８Ｍ以下の解離定数（Ｋｄ）および１×１０−３ｓ−１以下のＫｏｆｆ速度定数を有する。
二重特異性リガンドの一実施形態では、単一の可変ドメインは、血清アルブミン（ＳＡ）にとって特異的であり、表面プラズモン共鳴によって測定される場合ＳＡについて１ｎＭ〜５００μｍの解離定数（Ｋｄ）を有する。さらなる実施形態では、単一の可変ドメインは、標準リガンド結合アッセイにおいて１ｎＭ〜５００μＭのＩＣ５０でＳＡと結合する。単一の可変ドメインは、ＳＡにとって特異的であり得、ＭＳＡ−１６のアミノ酸配列またはそれと少なくとも８０％同一である配列を含む。あるいは、単一の可変ドメインは、ＳＡにとって特異的であり得、ＭＳＡ−２６のアミノ酸配列またはそれと少なくとも８０％同一である配列を含む。
さらなる実施形態では、ドメイン抗体は、一般的リガンドの結合部位を含み得る。一実施形態では、一般的リガンド結合部位は、プロテインＡ、プロテインＬおよびプロテインＧ結合部位からなる群から選択される。
二重特異性リガンドの一実施形態では、ドメイン抗体は、ユニバーサルフレームワークを含む。ドメイン抗体はまた、ＤＰ４７、ＤＰ４５およびＤＰ３８からなる群から選択されるＶＨフレームワークまたはＤＰＫ９であるＶＬフレームワークを含み得る。ドメイン抗体は、ヒト生殖系列抗体遺伝子セグメントによってコードされる対応するフレームワーク領域のアミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を含む１または複数のフレームワーク領域を含み得るか、または前記フレームワーク領域の１または複数のアミノ酸配列は、前記のヒト生殖系列抗体遺伝子セグメントによってコードされる対応するフレームワーク領域のアミノ酸配列と比較して最大５個のアミノ酸の相違を合わせて含む。
一実施形態では、ドメイン抗体のＦＷ１、ＦＷ２、ＦＷ３およびＦＷ４のアミノ酸配列は、ヒト生殖系列抗体遺伝子セグメントによってコードされる対応するフレームワーク領域のアミノ酸配列と同一であり、またはＦＷ１、ＦＷ２、ＦＷ３およびＦＷ４のアミノ酸配列は、前記のヒト生殖系列抗体遺伝子セグメントによってコードされる対応するフレームワーク領域のアミノ酸配列と比較して最大１０個のアミノ酸の相違を合わせて含む。
一実施形態では、前記のドメイン抗体のＦＷ１、ＦＷ２およびＦＷ３のアミノ酸配列は、ヒト生殖系列抗体遺伝子セグメントによってコードされる対応するフレームワーク領域のアミノ酸配列と同一である。ヒト生殖系列抗体遺伝子セグメントは、ＤＰ４７、ＤＰ４５、ＤＰ４８およびＤＰＫ９からなる群から選択され得る。
ＣＤ２８に対する結合特異性を有するドメイン抗体と、インビボでリガンドの半減期を増大するタンパク質に対する結合特異性を有する単一ドメイン抗体とを含む、本明細書に記載される二重特異性リガンドを製造する方法もまた含まれ、この方法は、第１の可変ドメインを、ＣＤ２８と結合するその能力によって選択するステップと；第２の可変ドメインを、インビボでリガンドの半減期を増大する前記タンパク質と結合するその能力によって選択するステップと；可変ドメインを合わせるステップと；二重特異性リガンドを、ＣＤ２８および前記タンパク質と結合するその能力によって選択するステップとを含む。一実施形態では、ドメイン抗体は、相補的可変ドメインの不在下でＣＤ２８との結合について選択される。
本明細書に記載される二重特異性リガンドをコードする核酸もまた含まれる。核酸は、ＭＳＡ−１６の核酸配列またはそれと少なくとも８０％同一である配列を含み得る、あるいは、ＭＳＡ−２６の核酸配列またはそれと少なくとも７０％同一である配列を含み得る。核酸は、ベクターに組み込むことができ、これを宿主細胞に組み込むことができる。
また、本明細書に記載される二重特異性リガンドおよび製薬上許容される賦形剤、担体または希釈剤を含む医薬組成物も含まれる。
また、第１および第２の重鎖単一可変ドメインまたは第１および第２の軽鎖単一可変ドメインを含み、第１の可変ドメインが、ドメイン抗体である二重特異性リガンドも含まれる。一実施形態では、第２の可変ドメインが、ＣＤ２８以外の抗原に対する結合特異性を有する。一態様では、第２の可変ドメインは、ドメイン抗体の安定性に寄与する、および／または増強する。限定されない例として、第２の可変ドメインは、結合特異性血清アルブミンを有する。
また、第１の抗原に対する結合特異性を有する第１の単一可変ドメインと、第２の抗原に対する結合活性を有する第２の単一可変ドメインとを含み、第１の抗原が、ＣＤ２８であり、第２の抗原が、抗原提示細胞表面抗原またはＴ細胞表面抗原である、二重特異性リガンドも含まれる。抗原提示細胞表面抗原は、樹状細胞表面抗原、活性化されたマクロファージ表面抗原、活性化されたＢ細胞表面抗原、共刺激シグナル経路表面抗原およびＭＨＣ抗原からなる群のうちの１種から選択され得る。一実施形態では、ＭＨＣ抗原は、ＭＨＣクラスＩＩ抗原であり、クラスＩＩ抗原は、αおよび／またはβ鎖であり得る。
抗原提示細胞表面抗原またはＴ細胞表面抗原は、ＣＤ４０Ｌ、誘導性共刺激分子（ＩＣＯＳ）、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＯＸ４０、ＣＤ４５、ＣＤ６９またはＣＤ３のうちの１種をはじめ、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、誘導性共刺激分子（ＩＣＯＳ）、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＯＸ４０、ＣＤ４５、ＣＤ６９、ＣＤ３、ＣＤ７０、誘導性共刺激分子リガンド（ＩＣＯＳＬ）、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＨＶＥＭ（Ｈｅｒｐｅｓ Ｖｉｒｕｓ Ｅｎｔｒｙ Ｍｅｄｉａｔｏｒ（ヘルペスウイルス侵入メディエーター）およびＬＩＧＨＴからなる群から選択され得る。例示的表面抗原として、ＣＤ８６またはＣＤ８０などのＢ７遺伝子表面抗原がある。
別の実施形態では、二重特異性リガンドは、第１の抗原に対する結合特異性を有する第１のドメイン抗体と、第２の抗原に対する結合活性を有する第２の単一可変ドメインとを含み、第１の抗原は、ＣＤ２８であり、第２の抗原は、サイトカインである。特定の実施形態では、サイトカインは、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１ ＩＬ−１２ ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−２１、ＩＬ−２２、ＩＬ−２３、ＩＬ−２４、ＩＬ−２８、ＩＬ−３３、ＬＩＦ、ＴＧＦβ、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γであり得る。
本明細書に記載されるドメイン抗体はまた、カルシニューリン（ｃａｌｃｉｎｅｕｉｒｉｎ）阻害剤、シクロスポリン、シトキサン、プレドニゾン、アザチオプリン、メトトレキサート、副腎皮質ステロイド、非ステロイド性抗炎症剤／Ｃｏｘ−２阻害剤、ヒドロキシクロロキン、スルファサラゾプリン（ｓｕｌｐｈａｓａｌａｚｏｐｒｙｉｎｅ）、金塩、エタネルセプト、インフリキシマブ、アナキンラ、ミゾリビン、ミコフェノール酸、ミコフェノール酸モフェチル、インターフェロンβ−１ａ、インターフェロンβ−ｌｂ、酢酸グラチラマー、塩酸ミトキサントロンおよび／または抗ＴＮＦのようなその他の生物製剤などのさらなる免疫抑制／免疫調節および／または抗炎症剤または治療と組み合わせて投与してもよい。ドメイン抗体はまた、免疫応答を調節するための以下の薬剤のうち１または複数と組み合わせて投与してもよい：ＣＴＬＡ４、可溶性ｇｐ３９（ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）、ＣＤ１５４、Ｔ−ＢＡＭ、ＴＲＡＰとしても知られる）、可溶性ＣＤ２９、可溶性ＣＤ４０、可溶性ＣＤ８０、可溶性ＣＤ８６、可溶性ＣＤ５６、可溶性Ｔｈｙ−１、可溶性ＣＤ３、可溶性ＴＣＲ、可溶性ＶＬＡ−４、可溶性ＶＣＡＭ−１、可溶性ＬＥＣＡＭ−１、可溶性ＥＬＡＭ−１、可溶性ＣＤ４４、ｇｐ３９と反応性の抗体、ＣＤ４０との反応性の抗体、Ｂ７と反応性の抗体、ＣＤ２８と反応性の抗体、ＬＦＡ−１と反応性の抗体、ＬＦＡ−２と反応性の抗体、ＩＬ−２と反応性の抗体、ＩＬ−１２と反応性の抗体、ＩＦＮ−γと反応性の抗体、ＣＤ２と反応性の抗体、ＣＤ４８と反応性の抗体、任意のＩＣＡＭ（例えば、ＩＣＡＭ−２）と反応性の抗体、ＣＴＬＡ４と反応性の抗体、Ｔｈｙ−１と反応性の抗体、ＣＤ５６と反応性の抗体、ＣＤ３と反応性の抗体、ＣＤ２９と反応性の抗体、ＴＣＲと反応性の抗体、ＶＬＡ−４と反応性の抗体、ＶＣＡＭ−１と反応性の抗体、ＬＥＣＡＭ−１と反応性の抗体、ＥＬＡＭ−１と反応性の抗体、ＣＤ４４と反応性の抗体、白血球受容体、例えば、ＭＨＣ、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８、ＣＤ７、ＣＤ２５、ＣＤ２７、Ｂ７、ＣＤ４０、ＣＤ４５、ＣＤ５８、ＣＤ１３７、ＩＣＯＳ、ＣＤ１５０（ＳＬＡＭ）、ＯＸ４０、４−１ＢＢまたはそのリガンドに対するモノクローナル抗体。最適な組合せおよび投与量の決定は、当技術分野で周知の方法を使用して決定および最適化することができる。
本発明のドメイン抗体が、例えば、上記で明記されるような別の免疫抑制／免疫調節または抗炎症剤または治療「と組み合わせて」投与される場合には、投与は、同時に行っても、順に行ってもよい。ｄＡｂが、上記で明記される薬剤などの別の薬剤と同時に投与される場合には、ｄＡｂおよび薬剤は、同一医薬組成物中で投与してもよい。
一実施形態では、ドメイン抗体は、ＣＤ２８結合性ドメイン抗体を必要としている患者の治療のための医薬の調製のために提供される。一実施形態では、患者は、免疫疾患を患っている。
一態様では、免疫疾患は、自己免疫疾患である。自己免疫疾患として、それだけには限らないが、アジソン病、アレルギー、アレルギー性鼻炎、強直性脊椎炎、喘息、アテローム性動脈硬化症、耳の自己免疫疾患、眼の自己免疫疾患、自己免疫萎縮性胃炎、自己免疫肝炎、自己免疫溶血性（ｈｙｍｏｌｙｔｉｃ）貧血、自己免疫耳下腺炎、自己免疫ブドウ膜炎、セリアック病、原発性胆汁性肝硬変、良性リンパ球性血管炎（ａｎｉｉｔｉｓ）、ＣＯＰＤ、大腸炎、冠動脈心疾患、クローン病、糖尿病（Ｉ型）、鬱病、１型および／または２型糖尿病を含む糖尿病、精巣上体炎、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、グレーブス病、ギラン・バレー症候群、橋本病、溶血性貧血、特発性血小板減少性紫斑病、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、組換え製剤、例えば、血友病における因子ＶＩＩに対する免疫応答、若年性特発性関節炎、全身性紅斑性狼瘡、ループス腎炎、男性不妊症、混合性結合組織病、多発性硬化症、重症筋無力症、腫瘍学、変形性関節症、疼痛、原発性粘液水腫、天疱瘡、悪性貧血、多発性筋炎、乾癬、乾癬性関節炎、反応性関節炎、リウマチ熱、リウマチ関節炎、サルコイドーシス、強皮症、シェーグレン症候群、脊椎関節症、交感性眼炎、Ｔ細胞リンパ腫、Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病、精巣血管中心性Ｔ細胞リンパ腫、甲状腺炎、移植拒絶、潰瘍性大腸炎、自己免疫ブドウ膜炎および脈管炎が挙げられる。自己免疫疾患として、それだけには限らないが、罹患した組織が、一次標的、いくつかの場合には、二次標的である状態が挙げられる。このような状態として、それだけには限らないが、ＡＩＤＳ、アトピー性アレルギー、気管支喘息、湿疹、らい病、統合失調症、遺伝性鬱病、組織および臓器の移植、慢性疲労症候群、アルツハイマー病、パーキンソン病、心筋梗塞、卒中、自閉症、てんかん、アルサス現象、アナフィラキシーならびにアルコールおよび薬物依存が挙げられる。
別の態様では、免疫疾患は、同種移植片拒絶、異種移植片拒絶移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、急性移植拒絶反応および慢性移植拒絶反応などの移植組織と関連する疾患である。
以下からなる群から選択される少なくとも３つの特徴を有するｄＡｂが含まれる：
ａ）ＣＤ２８とのＣＤ８０およびＣＤ８６結合を妨げる、
ｂ）Ｔ細胞受容体シグナル伝達と組み合わさったＣＤ２８シグナル伝達を刺激しない、
ｃ）ＣＤ２８との結合について、約５０ｎＭ〜約１ｐＭのＫｄを有する、
ｄ）約１５秒〜約１２時間のｔα半減期を有する、
ｅ）約１２時間〜約３３６時間のｔβ半減期を有する、
ｆ）ＭＹＰＰＰＹ配列と結合する、および
ｇ）配列番号４８４、配列番号４８７、配列番号４９０、配列番号４９３、配列番号４９６、配列番号４９９、配列番号５０２、配列番号５０５、配列番号５０８、配列番号５１１、配列番号５１４、配列番号５１７、配列番号５２０、配列番号５２３、配列番号５２６、配列番号５２９および配列番号６３６からなる群から選択されるＣＤＲ１配列、配列番号４８５、配列番号４８８、配列番号４９１、配列番号４９４、配列番号４９７、配列番号５００、配列番号５０３、配列番号５０６、配列番号５０９、配列番号５１２、配列番号５１５、配列番号５１８、配列番号５２１、配列番号５２４、配列番号５２７、配列番号５３０および配列番号６３７からなる群から選択されるＣＤＲ２配列および配列番号４８６、配列番号４８９、配列番号４９２、配列番号４９５、配列番号４９８、配列番号５０１、配列番号５０４、配列番号５０７、配列番号５１０、配列番号５１３、配列番号５１６、配列番号５１９、配列番号５２２、配列番号５２５、配列番号５２８、配列番号５３１および配列番号６３８からなる群から選択されるＣＤＲ３配列。
また、本明細書に開示されるｄＡｂをコードする核酸も含まれる。
本明細書に開示されるｄＡｂの有効量を個体に投与することを含む、ＣＤ２８を拮抗する方法が含まれる。また、本明細書に開示されるｄＡｂの有効量を個体に投与することを含み、ｄＡｂがその個体においてＣＤ２８のＣＤ８０および／またはＣＤ８６との結合を拮抗する、ＣＤ２８の結合を拮抗する方法も含まれる。
本明細書に開示されるｄＡｂの有効量を、免疫疾患を有する、または有する危険にある個体に投与することを含む、自己免疫疾患または移植組織と関連する疾患などの免疫疾患の症状を治療、軽減または予防する方法がさらに含まれる。本明細書に開示されるｄＡｂの有効量を、免疫疾患を有する、または有する危険にある個体に投与することを含む、免疫疾患を治療、軽減または予防する方法が含まれる。
本明細書に開示されるｄＡｂの治療上有効な量と、製薬上許容される担体とを含む医薬組成物が本明細書に含まれる。
それを必要とする患者において免疫疾患を治療または予防するための医薬を調製するための、本明細書に開示されるｄＡｂの使用が含まれる。それを必要とする患者において免疫疾患の症状を治療または予防のための医薬を調製するための、本明細書に開示されるｄＡｂの使用もまた含まれる。それを必要とする患者において免疫疾患の少なくとも１つの症状を軽減する医薬を調製するための、本明細書に開示されるｄＡｂの使用が本明細書にさらに含まれる。
図１は、図１Ａおよび１Ｂを含み、本明細書に示される抗ヒトＣＤ２８ドメイン抗体がアゴニスト活性を示さないことを表す一連の像である。図１Ａは、漸増濃度の種々のｄＡｂが、ＣＤ２８を活性化しないが、ＰＢＭＣに加えられる抗ＣＤ３抗体（ＯＫＴ３）対照が、ＣＤ２８の活性化を示したことを示す。ドメイン抗体（ｄＡｂ）および抗体を、正常ドナーの全血から単離したＰＢＭＣを用いて播種された９６ウェルプレートに加えた。図１Ｂは、９６ウェル丸底プレートに固定された、ｄＡｂ、抗ＣＤ２８（９．３）、抗ＣＤ３（ＯＫＴ３）またはアイソタイプ対照は、ウェルに加えられたＰＢＭＣにおいてアゴニスト活性を示さなかったことを示す。 図２は、抗ＣＤ３（Ｇ１９−４、ＰＢＳ中、１０μｇ／ｍｌ）でコーティングした、９６ウェル平底プレートに加えた場合に、抗ヒトＣＤ２８ドメイン抗体がコアゴニスト活性を示さないことを表すグラフである。各ｄＡｂは、ウェルに、精製したＴ細胞とともに３０μｇ／ｍｌの最終濃度で加えた。陽性対照として、ｄＡｂの代わりに抗ＣＤ２８（ｍＡｂ９．３）を、１μｇ／ｍｌの最終濃度で加えた。 図３は、本明細書に示されるようなドメイン抗体によるＴ細胞増殖のインビボ阻害を表すグラフである。 図４は、図４Ａおよび４Ｂを含み、ｄＡｂ １ｍ−７４−１５−４０Ｌを使用する９日受容体占有率研究の結果を表す一連の像である。図４Ａは、ｄＡｂの腹膜内投薬を用いた受容体占有率を示す。図４Ｂは、ｄＡｂの皮下投薬を用いた受容体占有率を示す。 図５は、カニクイザル研究における１ｈ−９９−２Ｐ４０−分岐および１ｈ−９９−２Ｐ４０−直鎖の血漿中濃度を経時的に表す。 図６は、ドメイン抗体クローンをディスプレイするモノクローナルファージの、組換えヒトＣＤ２８／ＦｃキメラおよびＦｃ対照をコーティングしたプレートとの結合のＥＬＩＳＡを示す。 図７は、組換えヒトＣＤ２８／ＦｃキメラおよびＦｃ対照をコーティングしたプレートとの可溶性モノクローナルドメイン抗体結合のＥＬＩＳＡを示す。 図８は、１２５００ユニットのＣＤ２８−ＦｃでコーティングしたＣＭ５チップと結合するｄＡｂクローンのＢＩＡｃｏｒｅトレースを示す。 図９Ａおよび図９Ｂは、２連の細胞ベースの「インビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）」アッセイにおける、ドメイン抗体クローンの、ＣＤ２８の活性を阻害する能力を示す。このアッセイでは、ヒトＣＤ４陽性Ｔ細胞は、抗ＣＤ３プラスＣＤ８０またはＣＤ８６のいずれかを発現するトランスフェクトされたＣＨＯ細胞で刺激される。 図１０は、抗ＣＤ２８ドメイン抗体がアゴニスト活性を欠くことを示す。図１０Ａでは、ＰＢＭＣを、抗ＣＤ２８ドメイン抗体２３９−８９１−Ｄ７０Ｃまたは有糸分裂促進性抗ＣＤ２８抗体５．１１Ａ１に曝露させた。細胞増殖は、図１０Ａに示されるように、３日目での３［Ｈ］−チミジン取込みによって測定し、図１０Ｂに示されるように、ＩＬ−２製造を測定した。
本開示は、ＣＤ２８活性を拮抗するドメイン抗体を提供する。ドメイン抗体は、安定性および半減期などの薬物動態特性を改善するようポリマーと連結していてもよい。ポリマー分子（例えば、ポリエチレングリコール；ＰＥＧ）をタンパク質と結合して、修飾されたタンパク質の薬物動態特性を調節するための組成物および方法が本明細書に含まれる。例えば、タンパク質のＰＥＧ修飾は、タンパク質のインビボ循環半減期、抗原性、溶解度およびタンパク質分解に対する耐性を変更することが示されている(Abuchowski et al. (1977) J. Biol. Chem., 252: 3578; Nucci et al. (1991) Adv. Drug Delivery Reviews 6: 133; Francis et al., pharmaceutical Biotechnology Vol. 3 (Borchardt, R. T. ed.); and Stability of Protein Pharmaceuticals: in vivo Pathways of Degradation and Strategies for Protein Stabilization 1991 pp235-263, Plenum, NY)。
１．定義および略語
１．１．定義
この詳細な説明に従って、以下の略語および定義が適用される。本明細書において、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は、文脈が明確に他を示すのでない限り、複数の言及を含むことに留意しなければならない。したがって、例えば、「１つの抗体」に対する言及は、複数のこのような抗体を含み、「その投与量」に対する言及は、１または複数回投与量および当業者に公知のその等価物に対する言及を含む、などである。
特に定義しない限り、本明細書に使用されるすべての技術用語および科学用語は、当業者によって普通に理解されるものと同一の意味を有する。特に明記しない限り、本明細書に記載されるすべての範囲は、特定のエンドポイントを含む。以下の用語が以下に提供される。
本明細書において使用する場合、用語「ヒト」とは、ドメイン抗体に、または免疫グロブリン可変ドメインに適用される場合、ポリペプチドがヒト免疫グロブリンに由来する配列を有することを意味する。配列が、ａ）ヒト個体から、またはヒト個体から得た細胞もしくは細胞株から単離されている；ｂ）クローニングされたヒト抗体遺伝子配列のライブラリー（またはヒト抗体Ｖドメイン配列のライブラリー）から単離されている；またはｃ）１または複数の多様な配列を作製するために、クローニングされたヒト抗体遺伝子配列（またはクローニングされたヒトＶ領域配列（例えば、生殖系列Ｖ遺伝子セグメントを含む））が使用され、次いで、所望の標的抗原との結合について選択される場合のいずれかである場合に、配列はヒト免疫グロブリンコード配列「に由来する」。
最小でも、ヒトドメイン抗体は、天然に存在するヒト免疫グロブリン可変ドメイン配列、例えば、Kabat(「Sequences of Proteins of Immunological Interest」, US Department of Health and Human Services 1991)に開示される天然に存在するヒト免疫グロブリン可変ドメイン配列と、少なくとも７０％同一である、少なくとも７５％同一である、少なくとも８０％同一である、少なくとも８５％のアミノ酸同一性（例えば、８７％、９０％、９３％、９５％、９７％、９９％またはより高度の同一性を含む）を有する。
本明細書において、用語「ドメイン」とは、タンパク質の残りとは独立に、その三次構造を保持する折り畳まれたタンパク質構造を指す。通常、ドメインは、タンパク質の個別の機能的特性に関与し、多くの場合には、タンパク質の残部の、および／またはドメインの機能を失うことなく、その他のタンパク質に付加、除去または移動できる。
「ドメイン抗体」とは、免疫グロブリン可変ドメインに特徴的な配列を含み、抗原と特異的に結合する（例えば、５００ｎＭ以下の解離定数）折り畳まれたポリペプチドドメインを意味する。したがって、「ドメイン抗体」は、完全な抗体可変ドメインならびに、例えば、１または複数のループが、抗体可変ドメインに特徴的ではない配列によって置換されている修飾された可変ドメイン、または末端切断されている、もしくはＮもしくはＣ末端伸長を含む抗体可変ドメイン、ならびに５００ｎＭ以下（例えば、４５０ｎＭ以下、４００ｎＭ以下、３５０ｎＭ以下、３００ｎＭ以下、２５０ｎＭ以下、２００ｎＭ以下、１５０ｎＭ以下、１００ｎＭ以下）の解離定数および全長ドメインの標的抗原特異性を保持する可変ドメインの折り畳まれた断片を含む。必要に応じ、または何らかの疑いのある場合には、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．によって示された(Kabat et al. (1991) Sequences of Immunological Interest, 5th ed. U.S. Dept. Health & Human Services, Washington, D.C.)番号付けの慣習および境界を、本明細書において言及される免疫グロブリン可変および定常ドメインに適用できる。
「ｄＡｂ」は、本明細書において、「ドメイン抗体」と同義的に使用される。
本明細書において、ドメイン抗体とは、ヒトを含めた哺乳類免疫グロブリンポリペプチドを指すが、げっ歯類（例えば、その内容が、その全文において本明細書に組み込まれるＷＯ００／２９００４に開示されるように）またはラクダＶＨＨ ｄＡｂも含む。ラクダｄＡｂは、ラクダ、ラマ、アルパカ、ヒトコブラクダおよびグアナコをはじめとする種に由来する抗体単一可変ドメインポリペプチドであり、天然に軽鎖を欠く重鎖抗体：ＶＨＨを含む。ＶＨＨ分子は、ＩｇＧ分子よりも約１０倍小さく、それらは、単一ポリペプチドのように、極めて安定であり、極端なｐＨおよび温度条件に耐える。
ラクダ抗体は、例えば、そのそれぞれの内容が全文において本明細書に組み込まれる米国特許第５，７５９，８０８号；同５，８００，９８８号；同５，８４０，５２６号；同５，８７４，５４１号；同６，００５，０７９号；および同６，０１５，６９５号に記載されている。ヒト化ラクダＶＨＨポリペプチドは、例えば、ＷＯ０４／０４１８６２に教示されており、その教示は、その全文が本明細書に組み込まれる。当業者ならば、天然に存在するラクダ抗体単一可変ドメインポリペプチドは、ＷＯ０４／０４１８６２の教示（例えば、位置４５および１０３でのアミノ酸置換）に従って修飾し、ヒト化ラクダＶＨＨポリペプチドを作製できるということは理解されよう。また、テンジクザメＶＨＨである抗体単一可変ドメインポリペプチドも本明細書に含まれる。テンジクザメＶＨＨ ｄＡｂは、例えば、Greenberg et al. (1995) Nature 374: 168-173および米国公開番号第２００５００４３５１９号に記載されている。
本明細書において、語句「免疫グロブリン可変ドメインに特徴的な配列」とは、免疫グロブリン可変ドメイン配列によって含まれる配列と、２０個以上、２５個以上、３０個以上、３５個以上、４０個以上、４５個以上またはさらに５０以上連続するアミノ酸にわたって同一であるアミノ酸配列を指す。
本明細書に開示される配列と類似している、または同一である（例えば、少なくとも約７０％の配列同一性）配列も、本明細書に含まれる。いくつかの実施形態では、アミノ酸レベルでの配列同一性は、約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上であり得る。核酸レベルでは、配列同一性は、約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上であり得る。あるいは、選択的ハイブリダイゼーション条件（例えば、極めて高いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件）下で、核酸セグメントが、鎖の相補体とハイブリダイズする場合に、実質的な同一性が存在する。核酸は、全細胞中に、細胞溶解物中に、または部分精製されたもしくは実質的に純粋な形態で存在し得る。
本明細書において、用語「同一性」とは、互いに構造的に似ている２種のヌクレオチドまたはアミノ酸配列に関する程度を指す。本明細書において、配列「類似性」とは、アミノ酸配列が、配列のアラインメントにおいて対応する位置に類似のアミノ酸残基を共有する程度の尺度である。アミノ酸は、その側鎖が類似している場合に互いに類似している。具体的には、「類似性」は、互いに保存的置換物であるアミノ酸を包含する。「保存的」置換は、ｂｌｏｓｕｍ６２置換マトリックス(Hentikoff and Hentikoff (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915-10919)において正のスコアを有する任意の置換である。記載「配列Ａは、配列Ｂとｎ％類似している」とは、配列ＡおよびＢ間の最適グローバルアラインメントの位置のｎ％が、同一アミノ酸または保存的置換からなることを意味する。本明細書において、２種の配列は、Tatusova & Madden (1999) FEMS Microbiol Lett. 174: 247-250によって記載されるＮｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズムまたは「ＢＬＡＳＴ２配列」アルゴリズムのいずれかを使用してアラインされる場合に、互いに「類似している」、または「同一性パーセント」を共有している。アミノ酸配列は、「ＢＬＡＳＴ２配列アルゴリズム」を使用してアラインされ、Ｂｌｏｓｕｍ ６２マトリックスがデフォルトマトリックスである。最適グローバルアラインメントは、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアラインメントアルゴリズムにおいて以下のパラメータを使用して実施できる：
ポリペプチドについて：
置換マトリックス：ｂｌｏｓｕｍ６２。
Ｇａｐスコアリング関数：−Ａ−Ｂ＊ＬＧ、式中、Ａ＝１１（ギャップペナルティー）、Ｂ＝１（ギャップ長ペナルティー）およびＬＧは、ギャップの長さである。
核酸配列について：
置換マトリックス：マッチに対して１０、ミスマッチに対して０。
Ｇａｐスコアリング関数：−Ａ−Ｂ＊ＬＧ、式中、Ａ＝５０（ギャップペナルティー）、Ｂ＝３（ギャップ長ペナルティー）およびＬＧは、ギャップの長さである。
ソフトウェアＡｌｉｇｎＸ、Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩ Ｓｕｉｔｅ ８．０（ＩｎｆｏｒＭａｘ, Ｉｎｃ．）の構成要素を使用して、アラインメントをＣｌｕｓｔａｌ Ｗアルゴリズム(1994)Nucleic Acid Research, 22 (22): 4673-4680を使用して作製した。この方法の使用では、配列のすべての対間の粗類似性が算出され、「パリティーズ（Ｐａｒｉｔｉｅｓ）アラインメント」と呼ばれる。次いで、これらのスコアを使用して「樹形図」またはデンドログラムを算出し、これは、複数のアラインメント段階、最終の複数のアラインメントのために配列をアラインする順序を告げる。デンドログラムを算出すると、全配列が最終アラインメントに組み込まれるまで配列をより大きな群にアラインする。
あるいは、本明細書では、アミノ酸および核酸配列の同一性の算出は、ソフトウェアＡｌｉｇｎＸを使用し、以下のパラメータを用いて決定されている：
ＦＡＳＴアルゴリズムの使用： オフ
Ｋ−タプルサイズ： １
最適ダイアゴナルの数： ５
ウィンドウサイズ： ５
ギャップペナルティー： ３
ギャップ開始ペナルティー： １０
ギャップ伸長ペナルティー： ０．１
ＡｌｉｇｎＸのためのマルチプルアラインメント設定は以下の通りに設定した：
ギャップ開始ペナルティー： １０
ギャップ伸長ペナルティー： ０．０５
ギャップ分離ペナルティー範囲： ８
非末端ギャップ分離ペナルティー： 選択されない
アラインメント遅延の同一性％： ４０
残基特異的ギャップオフ： 選択されない
親水性残基ギャップオフ： 選択されない
遷移重み付け： ０
通常の保存的置換は、Ｍｅｔ、Ｖａｌ、Ｌｅｕおよびｌｌｅ間；ＳｅｒおよびＴｈｒ間；残基Ａｓｐ、ＧｌｕおよびＡｓｎ間；残基Ｇｌｎ、ＬｙｓおよびＡｒｇ間；または芳香族残基ＰｈｅおよびＴｙｒ間の交換である。
本明細書において、用語「エピトープ」とは、免疫グロブリンＶＨ／ＶＬ対によって従来結合している構造の単位を指す。エピトープは、抗体の最小結合部位を規定し、したがって、抗体の特異性の標的を表す。ドメイン抗体の場合には、エピトープは、単離されたドメイン抗体によって結合される構造の単位を表す。すなわち、結合部位は、１つの、単一免疫グロブリン可変ドメインによって提供される。エピトープは、直線である場合も、立体構造である場合もあり、３個のアミノ酸ほどの小さいものであり得る。
本明細書において、用語「持続放出」または同義語「制御放出」または「徐放」とは、ポリペプチド薬物などの活性薬物を、個体に投与した後、一定期間にわたって放出する薬物製剤を指す。薬物製剤に応じて、所望の時間の範囲、例えば、数分、数時間、数日、数週間またはそれ以上にわたって起こり得るポリペプチド薬物の持続放出は、実質的に全投与量単位が血流による即時吸収または即時分布に利用可能である標準製剤とは対照的である。持続放出製剤は、例えば、８時間以上、１２時間以上、２４時間以上、３６時間以上、４８時間以上、６０時間以上、７２時間以上、８４時間以上、９６時間以上またはさらに、例えば、１週間もしくは２週間以上、例えば、１カ月以上の間、持続される単回投与からの循環薬物のレベルをもたらし得る。
本明細書において、「ＣＤ２８活性」とは、ＣＤ８０、ＣＤ８６および／または別のリガンドの、ＣＤ２８との結合に関与または起因する活性であり、これとして、それだけには限らないが、ＣＤ２８媒介性細胞シグナル伝達の活性化が挙げられる。ＣＤ２８活性はまた、Ｔ細胞増殖の誘導およびＴ細胞によるサイトカイン、例えば、インターロイキン２（ＩＬ−２）分泌の誘導を含む。
本明細書において、用語「実質的に刺激しない」とは、所与の薬剤、例えば、ドメイン抗体が、用語「活性化する」が本明細書において定義されるようには、１または複数のＣＤ２８活性を実質的に活性化しないということを意味する。具体的には、「実質的に刺激しない」薬剤とは、薬剤が、ＣＤ２８とのＣＤ８０および／またはＣＤ８６結合によって活性化される活性の２０％を超えて活性化しないことを意味し、一態様では、薬剤は、ＣＤ２８とのＣＤ８０および／またはＣＤ８６結合によって活性化される活性の、ゼロを含め、約１０％、８％、５％、３％または２％以下の活性化を超えて活性化しない。限定されない例として、ＣＤ２８活性を実質的に刺激しない本明細書に示されるドメイン抗体は、そうでなければ同一のアッセイ条件下で、抗ＣＤ２８ｍＡｂ ９．３によるＣＤ２８活性の受容体活性化作用の際に得られる活性の５％を超えてＣＤ２８活性を刺激しない(Gibson, et al. (1996) JBC, 271: 7079-7083)。
本明細書において、用語「阻害する（ｉｎｈｉｂｉｔ）」、「阻害する（ｉｎｈｉｂｉｔｓ）」および「阻害される（ｉｎｈｉｂｉｔｅｄ）」とは、所与の測定可能な活性（例えば、結合活性）の、参照に対して少なくとも１０％の低減を指す。阻害が望ましい場合は、このような阻害は、所与の活性の少なくとも約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれ以上、１００％を含むまでの、すなわち、完全な阻害または不在である。ＣＤ８０またはＣＤ８６とのＣＤ２８結合の阻害は、本明細書における実施例に記載されるように測定できる。本明細書において、用語「実質的に阻害する」とは、所与の測定可能な活性（例えば、ＣＤ８０またはＣＤ８６とのＣＤ２８の結合）の、参照に対して少なくとも５０％の低減を指す。例えば、「実質的に阻害する」とは、参照に対して、少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％および１００％を含むまでの所与の測定可能な活性の低減を指す。本明細書において、ＣＤ２８とのドメイン抗体結合の結合、またはＣＤ２８とのＣＤ８０結合、またはＣＤ２８とのＣＤ８６結合に関連して「結合を阻害する」とは、結合の、参照に対する少なくとも１０％の低減を指す。「結合を阻害する」とは、結合の少なくとも約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％またはそれ以上、１００％を含むまでの低減を指す。
本明細書において、用語「活性化する（ａｃｔｉｖａｔｅ）」、「活性化する（ａｃｔｉｖａｔｅｓ）」および「活性化される（ａｃｔｉｖａｔｅｄ）」とは、所与の測定可能な活性の、参照に対して少なくとも５％の、例えば、少なくとも１０％、２５％、５０％、７５％またはさらに１００％またはそれ以上の増大を指す。
本明細書において、用語「ＣＤ２８アンタゴニスト」とは、ＣＤ８０および／またはＣＤ８６の、ＣＤ２８との結合を阻害することによって、ＣＤ２８によって媒介される少なくとも１つの活性を阻害する物質を指す。ＣＤ２８活性は、アンタゴニストの不在下と比較して、存在下で活性が少なくとも１０％、例示的実施形態では、少なくとも約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％またはさらに１００％減少する（すなわち、活性なし）場合に「拮抗される」。例示的実施形態では、ＣＤ２８アンタゴニストは、この用語が本明細書において使用されるときには、ＣＤ２８と一価で結合するドメイン抗体を含む。限定されない例として、本明細書に示されるＣＤ２８アンタゴニストは、一部またはすべてのＣＤ２８活性を阻害する物質であり、一方で同時に、この物質は、Ｔ細胞受容体シグナル伝達と組み合わさったＣＤ２８活性を実質的に刺激しない。
本明細書において、「ここで、ドメイン抗体が、ＣＤ８０によるＣＤ２８との結合と比較して、ＣＤ８６によるＣＤ２８との結合を選択的に阻害する」などの語句において使用されるような用語「選択的に阻害する」は、ドメイン抗体が、前に定義されたＣＤ２８とのＣＤ８０結合の阻害の量に対して、より多量の前に定義されたＣＤ２８とのＣＤ８６結合の阻害を達成することを意味する。
本明細書において、用語「ＣＤ２８アゴニスト」とは、ＣＤ２８によって媒介される少なくとも１つの活性を、単独または別の共刺激と組み合わせた場合に、参照に対して活性化する物質を指す。活性は、アゴニストの不在下と比較して、存在下で、活性が少なくとも約１０％、例えば、５０％、増大する場合に「刺激される」。
本明細書において、「ＣＴＬＡ４活性」を阻害することは、それだけには限らないが、Ｔ細胞機能の阻害を含む。このような機能として、中でも、Ｔ細胞受容体媒介性シグナル伝達、Ｔ細胞増殖およびサイトカイン分泌の誘導が挙げられる。
本明細書において、「免疫疾患」とは、細胞性および／または体液性（ｈｕｍｅｒａｌ）免疫応答を含めた個体における免疫応答の発生と関連している任意の疾患を指す。免疫疾患の例として、それだけには限らないが、炎症、アレルギー、自己免疫疾患および移植組織と関連する疾患が挙げられる。
本明細書において、「自己免疫疾患」とは、個体の免疫応答が個体自身の成分に向けられ、望ましくない、しばしば、衰弱させる状態をもたらす疾患状態および状況を指す。本明細書において、「自己免疫疾患」とは、自己免疫状態、症候群などをさらに含むものとする。自己免疫疾患として、それだけには限らないが、アジソン病、アレルギー、アレルギー性鼻炎、強直性脊椎炎、喘息、アテローム性動脈硬化症、耳の自己免疫疾患、眼の自己免疫疾患、自己免疫萎縮性胃炎、自己免疫肝炎、自己免疫溶血性貧血、自己免疫耳下腺炎、自己免疫ブドウ膜炎、セリアック病、原発性胆汁性肝硬変、良性リンパ球性血管炎、ＣＯＰＤ、大腸炎、冠動脈心疾患、クローン病、糖尿病（Ｉ型）、鬱病、１型および／または２型糖尿病を含む糖尿病、精巣上体炎、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、グレーブス病、ギラン・バレー症候群、橋本病、溶血性貧血、特発性血小板減少性紫斑病、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、組換え製剤、例えば、血友病における因子ＶＩＩに対する免疫応答、若年性特発性関節炎、全身性紅斑性狼瘡、ループス腎炎、男性不妊症、混合性結合組織病、多発性硬化症、重症筋無力症、腫瘍学、変形性関節症、疼痛、原発性粘液水腫、天疱瘡、悪性貧血、多発性筋炎、乾癬、乾癬の関節炎、反応性関節炎、リウマチ熱、関節リウマチ、サルコイドーシス、強皮症、シェーグレン症候群、脊椎関節症、交感性眼炎、Ｔ細胞リンパ腫、Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病、精巣血管中心性Ｔ細胞リンパ腫、甲状腺炎、移植拒絶、潰瘍性大腸炎、自己免疫ブドウ膜炎および脈管炎が挙げられる。自己免疫疾患として、それだけには限らないが、罹患した組織が、一次標的、いくつかの場合には、二次標的である状態が挙げられる。このような状態として、それだけには限らないが、ＡＩＤＳ、アトピー性アレルギー、気管支喘息、湿疹、らい病、統合失調症、遺伝性鬱病、組織および臓器の移植、慢性疲労症候群、アルツハイマー病、パーキンソン病、心筋梗塞、卒中、自閉症、てんかん、アルサス現象、アナフィラキシーならびにアルコールおよび薬物依存が挙げられる。
本明細書において、用語「抗体ポリペプチド」とは、修飾されているか、修飾されていない、抗体であるか、または抗体の一部のいずれかであり、抗原と特異的に結合する能力を保持するポリペプチドを指す。したがって、用語抗体ポリペプチドは、抗原結合性重鎖、軽鎖、重鎖−軽鎖二量体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、ｄＡｂまたは一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）を含むＦｖ断片を含む。語句「抗体ポリペプチド」は、融合に関連して、抗原と特異的に結合する能力を保持する抗体ポリペプチド配列を含む組換え融合ポリペプチドを包含するものとする。
本明細書において、用語「一価」とは、所与のドメイン抗体が、その標的の１個のみの分子と結合できることを意味する。天然に存在する抗体は、各々、ＶＨおよびＶＬドメインを含む２つの機能的抗原結合性ループを有するという点で、通常、二価である。立体障害が問題ではない場合には、二価抗体は、同一抗原の２つの別個の分子と結合できる。対照的に、「一価」抗体は、１つのこのような抗原分子とのみ結合する能力を有する。この用語が本明細書に用いられるとき、「一価」抗体はまた、２つ以上の抗原結合部位、例えば、２つの抗原結合部位を含み得るが、結合部位は、異なる抗原に対するものであるはずであり、その結果、抗体は、一度にＣＤ２８の１つの分子とのみ結合できる。一価抗体の抗原結合性ドメインは、ＶＨおよびＶＬドメインを含み得るが、一態様では、単一の免疫グロブリン可変ドメイン、すなわち、それぞれ、対応するＶＬまたはＶＨドメインを必要とすることなくＣＤ２８と結合する能力を有するＶＨまたはＶＬドメインのみを含む。一価抗体は、単一抗原の分子を架橋する能力を欠く。
本明細書において、用語「標準血小板凝集アッセイ」とは、「血小板凝集アッセイ」と題された以下の本明細書における節に記載されるアッセイを意味する。
本明細書において、用語「ＶＨドメイン」および「ＶＬドメイン」とは、引用により本明細書の一部とする、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．(Kabat et al. (1991)Sequences of Immunological Interest, 5th ed. U.S. Dept. Health & Human Services, Washington, D.C.)によって定義される免疫グロブリン可変領域を指す。
本明細書において、「連結された」とは、ドメイン抗体のアミノ酸残基へのＰＥＧなどのポリマー部分の結合を指す。ドメイン抗体のアミノ酸残基、例えば、ドメイン抗体へのＰＥＧポリマーの結合は、「ＰＥＧ化」と呼ばれ、それだけには限らないが Ｎ−ヒドロキシルスクシンイミド（ＮＨＳ）活性エステル、プロピオン酸スクシンイミジル（ＳＰＡ）、マレイミド（ＭＡＬ）、ビニルスルホン（ＶＳ）またはチオールをはじめとするいくつかのＰＥＧ結合部分を使用して達成できる。ＰＥＧポリマーまたはその他のポリマーは、ドメイン抗体と、所定の位置で連結でき、またはドメイン抗体分子とランダムに連結してもよい。ＰＥＧポリマーは、ドメイン抗体と所定の位置で連結してもよい。ＰＥＧポリマーは、ドメイン抗体中の任意の残基と連結してもよいが、ポリマーが、ドメイン抗体中に天然に存在するか、または、例えば、ドメイン抗体中に天然に存在する残基のシステインもしくはリシンのいずれかへの突然変異誘発によって、ドメイン抗体中に操作されている、リシンもしくはシステインのいずれかと連結されることが好ましい。ＰＥＧ連結はまた、ドメイン抗体と結合しているペプチドリンカーによって媒介され得る。すなわち、ＰＥＧ部分を、ドメイン抗体と融合しているペプチドリンカーと結合でき、これでは、リンカーが、ＰＥＧ結合のための部位、例えば、遊離システインまたはリシンを提供する。本明細書において、「連結された」とはまた、二量体、三量体、四量体またはその他の多量体を形成するための２つ以上のドメイン抗体、例えば、ｄＡｂ単量体の結合を指すことがある。ドメイン抗体単量体は、それだけには限らないが、融合タンパク質としてのドメイン抗体単量体の発現、単量体間のペプチドリンカーによる２つ以上の単量体の連結をはじめとする当技術分野で公知のいくつかの方法によって、または翻訳後に単量体を互いに直接的に、もしくはジスルフィド結合によってリンカーによって、もしくは二価、三価または多価連結部分（例えば、マルチアームＰＥＧ）による連結によって化学的に結合することによって連結して、多量体を形成できる。ｄＡｂ多量体は、本明細書において、例えば、二重特異的または多重特異的ドメイン抗体構築物の関連で具体的に考えられているが、任意の所与のドメイン抗体構築物について、構築物は、ＣＤ２８の１分子とだけ結合できるはずである、すなわち、構築物は、１つのみのＣＤ２８結合因子を有するはずであり、ＣＤ２８を架橋しないはずであるということが強調される。
本明細書において、「ポリマー」とは、反復する単量体単位で構成されている高分子を指し、置換されていてもよい直鎖または分枝鎖ポリアルキレン、ポリアルケニレンもしくはポリオキシアルキレンポリマーまたは分岐もしくは非分岐多糖などの合成または天然に存在するポリマーを指す場合もある。本明細書において「ポリマー」とは、具体的には、置換されていてもよい、または分枝鎖ポリ（エチレングリコール）、ポリ（プロピレングリコール）またはポリ（ビニルアルコール）およびその誘導体を指す。
本明細書において、「ＰＥＧ」または「ＰＥＧポリマー」とは、ポリエチレングリコールを指し、より具体的には、それだけには限らないが、プロピオン酸スクシンイミジルなどのＰＥＧのＮ−ヒドロキシルスクシンイミド（ＮＨＳ）活性エステル、ベンゾトリアゾール活性エステル、マレイミド、ビニルスルホンまたはチオール基を用いて誘導体化されたＰＥＧをはじめとするＰＥＧの誘導体化された形態を指す場合もある。例えば、ＰＥＧ製剤として、ＰＥＧ−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−ＣＯ２−ＮＨＳ；ＰＥＧ−Ｏ−ＣＨ２−ＮＨＳ；ＰＥＧ−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２−ＣＯ２−ＮＨＳ；ＰＥＧ−Ｓ−ＣＨ２ＣＨ２−ＣＯ−ＮＨＳ；ＰＥＧ−Ｏ２ＣＮＨ−ＣＨ（Ｒ）−ＣＯ２−ＮＨＳ；ＰＥＧ−ＮＨＣＯ−ＣＨ２ＣＨ２−ＣＯ−ＮＨＳ；およびＰＥＧ−Ｏ−ＣＨ２−ＣＯ２−ＮＨＳ；（ここで、Ｒは、（ＣＨ２）４）ＮＨＣＯ２（ｍＰＥＧ）である）を挙げることができる。本明細書に示されるＰＥＧポリマーは、直鎖分子である場合も、分岐している場合もあり、これでは、単一ポリマー中に複数のＰＥＧ部分が存在する。いくつかの代表的なＰＥＧ立体構造として、それだけには限らないが、以下が挙げられる：
Figure 0006058833
本明細書において、「スルフヒドリル選択的試薬」とは、ＰＥＧポリマーのチオール含有アミノ酸との結合にとって有用である試薬である。アミノ酸残基システイン上のチオール基は、スルフヒドリル選択的試薬との相互作用にとって特に有用である。このような結合にとって有用であるスルフヒドリル選択的試薬として、それだけには限らないが、マレイミド、ビニルスルホンおよびチオールが挙げられる。システイン残基にカップリングするためのスルフヒドリル選択的試薬の使用は、当技術分野で公知であり、必要に応じて適応させてもよい（例えば、Zalipsky (1995) Bioconjug. Chem. 6: 150; Greenwald et al. (2000) Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 17: 101; Herman et al. (1994) Macromol. Chem. Phys. 195: 203参照）。
ＰＥＧまたは別の物質、例えば、ＨＳＡの、本明細書に記載されるドメイン抗体との結合は、例示的実施形態では、ポリペプチドのＣＤ２８と特異的に結合する能力を損なわない。すなわち、ＰＥＧが連結しているドメイン抗体は、ＰＥＧが連結していない対応物と比較してその結合活性を保持する。本明細書において、「活性を保持する」とは、１または複数の同一抗原結合ドメインを含む、ＰＥＧが連結していないドメイン抗体の活性のレベルの少なくとも１０％、例えば、ＰＥＧが連結していないドメイン抗体の活性の少なくとも約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％および９０％まで、例えば、約９５％、９８％まで、および１００％までであるＰＥＧが連結しているドメイン抗体の活性のレベルを指す。より具体的には、ＰＥＧが連結していないドメイン抗体と比較したＰＥＧが連結しているドメイン抗体の活性は、抗体ポリペプチドモルベースで決定するべきである；すなわち、ＰＥＧが連結しているドメイン抗体およびＰＥＧが連結していないドメイン抗体各々の等しいモル数が各試験において使用されるべきである。特定のＰＥＧが連結しているドメイン抗体が「活性を保持する」かどうかを調べる場合には、ＰＥＧが連結しているドメイン抗体の活性を、ＰＥＧの不在下での同一ドメイン抗体の活性と比較してもよい。
本明細書において、用語「インビボ半減期」とは、インビボで、例えば、天然の機序によるリガンドの分解および／またはクリアランスまたはリガンドの隔離によって、リガンド（例えば、ドメイン抗体）の血清濃度が約５０％低減するのにかかる時間を指す。本明細書に記載されるドメイン抗体は、分解および／またはクリアランスまたは隔離に抵抗するＰＥＧなどの分子との結合によって、インビボで安定化し、その半減期を増大することができる。ドメイン抗体の半減期は、インビボで、ＰＥＧポリマーと連結していない同様の抗体ポリペプチドより長期間、その機能活性が持続する場合に増大する。通常、ＰＥＧ化されたドメイン抗体の半減期は、ＰＥＧ化されていないドメイン抗体と比較して少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％またはそれ以上増大する。半減期の２Ｘ、３Ｘ、４Ｘ、５Ｘ、１０Ｘ、２０Ｘ、３０Ｘ、４０Ｘ、５０Ｘまたはそれ以上の範囲の増大があり得る。あるいは、またはさらに、半減期の最大３０Ｘ、４０Ｘ、５０Ｘ、６０Ｘ、７０Ｘ、８０Ｘ、９０Ｘ、１００Ｘまたは１５０Ｘの範囲の増大があり得る。本明細書に示されるように、ＰＥＧが連結しているドメイン抗体は、０．２５から１７０時間の間、例えば、１から１００時間の間、さらに例えば、３０から１００時間の間、さらに例えば、５０から１００時間の間、および最大１７０、１８０、１９０および２００時間以上の半減期を有する。
本明細書において、ＰＥＧまたはその他のポリマーが連結しているドメイン抗体単量体または多量体に関して、「分解に対する抵抗性」または「分解に抵抗する」とは、ＰＥＧまたはその他のポリマーが連結しているドメイン抗体単量体または多量体が、ｐＨ２．０のペプシンに３０分間曝露された場合にせいぜい約１０％しか分解されない、一態様では、全く分解されないことを意味する。
本明細書において、「水力学的サイズ」とは、水溶液を通る分子の拡散をベースとする分子（例えば、タンパク質分子）の見かけの大きさを指す。溶液を通るタンパク質の拡散または動きを処理して、タンパク質の見かけの大きさを導くことができ、これでは、大きさは、タンパク質粒子の「ストークス半径」または「水力学的半径」によって与えられる。タンパク質の「水力学的サイズ」は、質量および形状（コンホメーション）の両方に応じて変わり、その結果、同一分子量を有する２種のタンパク質が、タンパク質の全体的なコンホメーションに基づいて異なる水力学的サイズを有し得る。水力学的サイズは、例えば、サイズ排除クロマトグラフィーによって測定される。ＰＥＧが連結している抗体ポリペプチド、例えば、ドメイン抗体の水力学的サイズは、約２４ｋＤ〜５００ｋＤ；３０〜５００ｋＤ；４０〜５００ｋＤ；５０〜５００ｋＤ；１００〜５００ｋＤ；１５０〜５００ｋＤ；２００〜５００ｋＤ；２５０〜５００ｋＤ；３００〜５００ｋＤ；３５０〜５００ｋＤ；４００〜５００ｋＤおよび４５０〜５００ｋＤの範囲であり得る。一態様では、ＰＥＧ化されたドメイン抗体の水力学的サイズは、約３０〜４０ｋＤ；７０〜８０ｋＤまたは２００〜３００ｋＤである。ドメイン抗体が、イメージング適用において使用するために望まれる場合には、ドメイン抗体は、約５０〜１００ｋＤの間の水力学的サイズを有するべきである。あるいは、ドメイン抗体が治療的適用のために望まれる場合には、ドメイン抗体製剤は、約２００ｋＤを超える水力学的サイズを有するべきである。
本明細書において、用語「ＩＣ５０」とは、所与の活性を約５０％阻害するのに必要な阻害剤の濃度を指す。ＩＣ５０は、可変量の阻害剤（例えば、ドメイン抗体）の存在下で、所与の活性、例えば、ＣＤ２８のＣＤ８０またはＣＤ８６との結合をアッセイすることおよび阻害剤濃度対標的とされている活性をプロットすることによって決定される。ＣＤ２８のＣＤ８０またはＣＤ８６との結合は、実施例に記載される方法によって本明細書において測定される。あるいは、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を使用してもよい。
本明細書において、用語「ＥＣ５０」とは、反応がベースラインおよび最大反応の間の中間である、被験体において反応を誘発する化合物またはドメイン抗体の濃度を指す。化合物またはドメイン抗体に関して、被験体のベースラインおよび最大反応は、当技術分野で公知の任意の技術によって測定できる。
本明細書において、用語「ドメイン抗体と融合している」とは、通常、ポリペプチドが、組換えＤＮＡ技術の使用によって所与の抗体と融合していることを意味するが、融合は、タンパク質レベルで化学的に起こる場合もある。したがって、別のポリペプチドと、例えば、異なる結合特異性の別の抗体と「融合している」抗体は、天然には存在せず、組換え手段によって作製される。用語「ドメイン抗体と融合している」はまた、ポリペプチドの、所与のドメイン抗体との結合、例えば、ジスルフィドまたはその他の化学結合を包含し、これでは、融合されるポリペプチドは、天然には、ドメイン抗体と融合して見られない。ポリペプチドを別のポリペプチドと、例えば、抗体と融合する組換え法および化学法は、当技術分野で周知である。
本明細書において、用語「Ｆｃドメイン」とは、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．、前掲に従って区切られるＣＨ２およびＣＨ３定常ドメインを含む定常領域抗体配列を指す。重鎖ポリペプチドのＦｃ部分は、自己会合する能力、二価抗体の形成を促進する機能を有する。用語「Ｆｃドメインを欠く」とは、所与のドメイン抗体が、Ｆｃ含有ドメイン抗体の二量体化を媒介するのに十分な免疫グロブリンＦｃドメイン（このようなドメインが、Kabat et al., 1991, Sequences of Immunological Interest, 5th ed. U.S. Dept. Health & Human Services, Washington, D.C.に従って定義されるような）の少なくとも一部を欠くことを意味する。Ｆｃ含有ドメイン抗体の二量体化は、例えば、クロマトグラフ法によって、または表面プラズモン共鳴によって測定される。Ｆｃドメインを欠くドメイン抗体は、Ｆｃ−血小板相互作用を回避し、したがって、血小板凝集の誘導を回避する。
本明細書において、「治療する」、「低減する」、「予防する」または「軽減する」とは、疾患の症状に関連する場合には、症状の、臨床上測定可能なパラメータに基づいて少なくとも１０％の、または、臨床上許容される規模の疾患または症状の重篤度で、少なくとも１点の低減を指す。本明細書において、用語「全身性紅斑性狼瘡の症状（単数または複数）」とは、当業者に公知のＳＬＥの臨床上関連する症状のいずれかを指す。限定されない例として、ＩｇＧ自己抗体［例えば、クロマチンなどの核抗原、ｓｎＲＮＰ（特に、Ｕ１、Ｓｍ、Ｒｏ／ＳＳＡおよびＬａ／ＳＳＢ）、リン脂質および細胞表面分子、溶血性貧血、血小板減少症、白血球減少症、糸球体腎炎、脈管炎、関節炎および漿膜炎に対する］の蓄積が挙げられる。このような症状の低減は、臨床上測定可能なパラメータの少なくとも１０％の、または、臨床上許容される規模の疾患重篤度で、少なくとも１点の低減である。
本明細書において、語句「特異的に結合する」とは、例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ（商標）表面プラズモン共鳴システムおよびＢＩＡｃｏｒｅ（商標）動力学的評価ソフトウェア（例えば、バージョン２．１）を使用する表面プラズモン共鳴分析によって測定される１μＭ以下の解離定数（Ｋｄ）を有する、ドメイン抗体による抗原の結合を指す。一態様では、特異的結合相互作用の親和性またはＫｄは、約５００ｎＭ以下、別の態様では、約３００ｎＭ以下である。
本明細書において、「一般的リガンド」とは、所与のレパートリー中の、例えば、ファージディスプレイライブラリー中の機能的メンバーのかなりの割合と結合するリガンドである。したがって、同じ一般的リガンドは、その標的リガンド特異性にかかわらず、レパートリーの多数のメンバーと結合できる。一般に、機能的一般的リガンド結合部位の存在は、レパートリーメンバーが発現され、正しく折り畳まれていることを示す。したがって、一般的リガンドのその結合部位との結合は、ポリペプチドのレパートリーから機能的ポリペプチドを事前選択する方法を提供する。一般的リガンドとして、例えば、プロテインＡ、プロテインＧおよびプロテインＬが挙げられる。
本明細書において、用語「ユニバーサルフレームワーク」とは、Kabat(Kabat et al. (1991) Sequences of Immunological Interest, 5th ed. U.S. Dept. Health & Human Services, Washington, D.C.)によって定義される、またはChothia and Lesk, (1987) J. Mol. Biol. 196: 910-917によって定義されるヒト生殖系列免疫グロブリンレパートリーまたは構造に対応する配列中に保存される抗体の領域に対応する単一抗体フレームワーク配列を指す。超可変領域単独における変動による実質的に任意の結合特異性の誘導を可能にすることがわかっている単一フレームワークまたはこのようなフレームワークのセットの使用が本明細書に含まれる。
用語「約」は、当業者によって理解され、使用される文脈である程度変わる。通常、約は、参照される値の＋／−１０％である値の範囲を包含する。
本明細書において用語「に対応する」とは、タンパク質または核酸配列および／またはドメインに関して、別個のタンパク質上の類似の配列または構造を指す。例えば、マウスミオシンのカルシウム結合性ドメインは、ヒトミオシンのカルシウム結合性ドメイン「に対応する」。
１．２．略語
以下は、本明細書において使用される用語および関連略語の一覧であり、特に指定しない限り、特定の用語および略語を含む参照される用語に当てはまる。
Ａｂ 抗体
ＡＩＤＳ 後天性免疫欠乏症候群
ＡＰＣ 抗原提示細胞
ＡＵＣ 曲線下面積
ＢＳＡ ウシ血清アルブミン
ｃＤＮＡ 相補ＤＮＡ
ＣＤ８０ ＡＰＣに対するＢ７−１共刺激分子
ＣＤ８６ ＡＰＣに対するＢ７−２共刺激分子
ＣＤＲ 相補性決定領域
ＣＴＬＡ−４ 別名ＣＤ１５２；Ｔ細胞に対する高親和性ＣＤ８０／ＣＤ８６受容体
ＣＲＳ サイトカイン放出症候群
ｄＡｂ ドメイン抗体
ＤＣ 樹状細胞
ＤＮＡ デオキシリボ核酸
ＥＤＴＡ エチレンジアミン四酢酸
ＥＬＩＳＡ 酵素結合免疫吸着測定法
Ｆａｂ 抗原結合領域
Ｆｃ 抗体テール領域
ＦＣＳ ウシ胎児血清
ＦＷ フレームワーク
ＨＰＬＣ 高性能液体クロマトグラフィー
ＨＳＡ ヒト血清アルブミン
ＩＦＮ インターフェロン
ＩＬ インターロイキン
ｋＤ キロダルトン
Ｋｄ 解離定数
ｍＡｂ モノクローナル抗体
ＭＡＬ マレイミド
ｍｇ ミリグラム
ｍｌ ミリリットル
ＭＬＲ 混合リンパ球反応
ｍＭ ミリモル
ＭｏＤＣ 単球由来樹状細胞
ＭＳＡ マウス血清アルブミン
ＮＨＳ Ｎ−ヒドロキシルスクシンイミド
ｎｇ ナノグラム
ｎＭ ナノモル
ｐｇ ピコグラム
ｐＭ ピコモル
ｍＲＮＡ メッセンジャーリボ核酸
ＰＢＭＣ 末梢血単核細胞
ＰＣＲ ポリメラーゼ連鎖反応
ＰＤＢ タンパク質データベース塩基
ＰＥＧ ポリエチレングリコール
ＰＫ 薬物動態学
ｐｐｍ １００万分の１
ＲＯ 受容体占有率
ＲＴ−ＰＣＲ リバーストランスクリプターゼポリメラーゼ連鎖反応
ＳＡ 血清アルブミン
ｓｃＦＶ 一本鎖可変断片
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
ＳＥＣ−ＭＡＬＬＳ サイズ排除クロマトグラフィーマルチアングルレーザー光散乱
ＳＰＡ プロピオン酸スクシンイミジル
ＳＰＲ 表面プラズモン共鳴
ＳＲＢＣ ヒツジ赤血球
ｔ１／２ 半減期
ＴＮＦ 腫瘍壊死因子
ｔ．ｕ． 力価単位
μｇ マイクログラム
μｌ マイクロリットル
μＭ マイクロモル
ＶＨ 重鎖可変鎖ドメイン
ＶＬ 軽鎖可変鎖ドメイン
ＶＳ 硫酸ビニル
１×ＳＳＣ ０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１５Ｍ クエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０
ＣＤ２８との結合について一価であるドメイン抗体が提供される。任意の特定の理論に拘束されようとは思わないが、ＣＤ２８結合について一価であることは、先行技術の抗体を用いる場合に生じる細胞表面受容体の架橋の可能性を除去すると考えられる。したがって、一態様では、本明細書に開示されるドメイン抗体は、ＣＤ８０またはＣＤ８６のＣＤ２８との結合を阻害または拮抗するだけでなく、ＣＤ２８活性を実質的に刺激しない。
一態様では、ＣＤ２８結合について一価である抗体は、ヒトドメイン抗体である。ヒトドメイン抗体は、その他の種、例えば、マウスに由来する抗体の投与によって引き起こされることが多い抗抗体免疫応答を大部分避けながらヒト患者に投与できる。マウス抗体は、ヒト定常ドメインをマウス抗原−結合ドメイン上にグラフトすることによって「ヒト化」することができ、本明細書に開示されるヒト抗体は、マウス抗体配列の骨の折れる、時間のかかる遺伝子操作を必要とすることなく製造される。
２．一価ドメイン抗体
抗体の重鎖および軽鎖ポリペプチドは、抗原相互作用に直接的に関与する可変（Ｖ）領域と、構造的支持体および免疫エフェクターとの非抗原特異的相互作用における機能を提供する定常（Ｃ）領域とを含む。従来の抗体の抗原結合ドメインは、２つの別個のドメイン：重鎖可変ドメイン（ＶＨ）および軽鎖可変ドメイン（ＶＬ、ＶκまたはＶλのいずれかであり得る）からなる。抗原結合部位自体は、６つのポリペプチドループ：ＶＨドメインに由来する３つ（Ｈ１、Ｈ２およびＨ３）およびＶＬドメインに由来する３つ（Ｌ１、Ｌ２およびＬ３）によって形成される。インビボでは、遺伝子セグメントのコンビナトリアル再編成によって、ＶＨおよびＶＬドメインをコードするＶ遺伝子の多様な一次レパートリーが製造される。Ｃ領域は、軽鎖Ｃ領域（ＣＬ領域と呼ばれる）および重鎖Ｃ領域（ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３領域と呼ばれる）を含む。天然に存在する抗体は、通常、２つの抗原結合ドメインを含み、したがって、二価である。
プロテアーゼ消化後に、天然に存在する抗体のいくつかのより小さい抗原結合断片が同定されている。これらとして、例えば、「Ｆａｂ断片」（ＶＬ−ＣＬ／ＣＨ１−ＶＨ）、「Ｆａｂ’断片」（重鎖ヒンジ領域を含むＦａｂ）および「Ｆ（ａｂ’）２断片」（重鎖ヒンジ領域によって結合されているＦａｂ’断片の二量体）が挙げられる。組換え法を使用して、このような断片が作製され、さらにより小さい抗原−結合断片、例えば、ペプチドリンカーによって結合しているＶＬおよびＶＨ（ＶＬ−リンカー−ＶＨ）からなる「一本鎖Ｆｖ」（可変断片）または「ｓｃＦｖ」と呼ばれるものが作製されている。Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片およびｓｃＦｖ断片は、それらが各々、唯一１つの、１つのＶＨ／ＶＬ二量体を含む抗原結合ドメインを含むので抗原結合について一価である。
ドメイン抗体または「ｄＡｂ」は、その他のＶドメインとは独立に抗原と結合するが、ドメイン抗体は、その他のＶＨまたはＶＬドメインを含むホモまたはヘテロマルチマーで存在し得、これでは、その他のドメインは、ｄＡｂによる抗原結合には必要ではない、すなわち、ｄＡｂは、さらなるＶＨまたはＶＬドメインとは独立に抗原と結合する。ドメイン抗体の調製は、本明細書において以下に記載されており、例示される。
抗体単一可変ドメイン、例えば、ＶＨＨは、公知の最小の抗原結合抗体単位である。治療における使用には、ヒト抗体は、主として、それらが患者に投与された場合に免疫応答を引き起こす可能性が低いので特に有利である。ラクダＶＨＨのヒト抗体のＶＨドメインとの比較は、ヒトＶＨドメインのＶＨ／ＶＬ界面に対応する、ラクダＶＨＨドメインのフレームワーク領域におけるいくつかの重要な相違を示す。ヒトＶＨ３のこれらの残基の、より酷似しているＶＨＨ配列への突然変異（具体的には、Ｇｌｙ４４→Ｇｌｕ、Ｌｅｕ４５→ＡｒｇおよびＴｒｐ４７→Ｇｌｙ）を実施して、抗原結合活性を保持する(Davies & Riechmann (1994) FEBS Lett. 339: 285-290)が、発現および溶解度が改善された「ラクダ化」ヒトＶＨドメインが製造されている。（本明細書において使用される可変ドメインアミノ酸番号付けは、Ｋａｂａｔ番号付け変換と一致している(Kabat et al. (1991) Sequences of Immunological Interest, 5th ed. U.S. Dept. Health & Human Services, Washington, D.C.)) ＷＯ０３／０３５６９４(Muyldermans)は、Ｔｒｐ１０３→Ａｒｇ突然変異は、非ラクダＶＨドメインの溶解度を改善することを報告している。Davies & Riechmann (1995)Bio technology N.Y. 13: 475-479もまた、ラクダ化ヒトＶＨドメインのファージにディスプレイされたレパートリーの製造および１００〜４００ｎＭの範囲の親和性でハプテンと結合するクローンの選択を報告しているが、タンパク質抗原との結合について選択されたクローンは、より弱い親和性しか有していなかった。
ドメイン抗体は、いくつかの異なる方法で作製できる。例えば、ＣＤ２８と結合するとわかっている抗体の重鎖および軽鎖をコードする核酸配列を操作して、ＣＤ２８結合について一価であるいくつかの異なるドメイン抗体を作製することができる。したがって、抗体を構成する重鎖および軽鎖ポリペプチドをコードする配列および標準の分子クローニング法を考えると、ＣＤ２８に対して一価である、一価抗原結合ポリペプチド構築物、例えば、Ｆａｂ断片、ｓｃＦｖ、ｄＡｂまたはさらに二重特異性抗体（すなわち、２種の異なる抗原結合部分を含み、したがって、２つの別個の抗原と、一態様では、同時に結合できる抗体）を作製できる。
２．１．ドメイン抗体の設計のための一般的な戦略および方法
ＣＤ２８に特異的なドメイン抗体を作製する１つの手段は、例えば、ドメイン抗体を発現するハイブリドーマ（例えば、マウスハイブリドーマ）から単離された重鎖および軽鎖遺伝子配列のＶＨおよびＶＬ領域を増幅および発現させることである。ＶＨおよびＶＬドメインの境界は、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．(Kabat et al. (1991) Sequences of Immunological Interest, 5th ed. U.S. Dept. Health & Human Services, Washington, D.C.)によって示されている。重鎖および軽鎖遺伝子のＶＨおよびＶＬドメインの境界に関する情報を使用して、ＣＤ２８と結合することがわかっている抗体をコードする重鎖または軽鎖コード配列に由来するＶドメインを増幅するPCRプライマーを設計する。増幅されたＶドメインを適した発現ベクター、例えば、ｐＨＥＮ−１(Hoogenboom et al. (1991) Nucleic Acids Res. 19: 4133-4137)に挿入し、例えば、ｓｃＦｖ中のＶＨおよびＶＬの融合物として、またはその他の適した一価形態で発現させる。次いで、得られたポリペプチドをＣＤ２８との高親和性一価結合についてスクリーニングする。本明細書に示される方法とともに、当技術分野で公知の、または以下に本明細書に記載される結合についてのスクリーニングを実施する。
あるいは、ライブラリースクリーニング法を使用して、一価ＣＤ２８特異的結合性タンパク質を同定できる。ファージディスプレイ技術（例えば、Smith (1985) Science 228: 1315; Scott & Smith (1990) Science 249: 386; McCafferty et al. (1990) Nature 348: 552参照)は、ドメイン抗体の大きな、多様なレパートリーの中から所望の標的と結合するドメイン抗体を選択するためのアプローチを提供する。これらのファージ−抗体ライブラリーは２つのカテゴリーにグループ分けできる：ヒトＢ細胞から回収された再編成されたＶ遺伝子を使用する天然ライブラリー(Marks et al. (1991) J. Mol. Biol., 222: 581;Vaughan et al. (1996) Nature Biotech., 14: 309)またはそれによって生殖系列Ｖ遺伝子セグメントまたはその他のドメイン抗体コード配列がインビトロで「再編成される」(Hoogenboom & Winter (1992) J. Mol. Biol., 227: 381; Nissim et al. (1994) EMBO J., 13: 692; Griffiths et al. (1994) EMBO J., 13: 3245; De Kruif et al. (1995) J. Mol. Biol., 248: 97)または、合成ＣＤＲが単一の再編成されたＶ遺伝子に組み込まれる(Barbas et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 4457)合成ライブラリー。遺伝子ディスプレイパッケージ（例えば、ファージディスプレイ、ポリソームディスプレイ）を含む方法は、それらが、通常、ディスプレイパッケージ上に、全体の、二価抗体ではなく、一価の断片のみを発現するので、一価ＣＤ２８特異的抗体構築物の選択のために十分に適している。種々の抗体断片をディスプレイするファージディスプレイライブラリーの調製方法は、先の参考文献に記載されている。このような方法はまた、例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６，６９６，２４５号に記載されている。‘２４５特許に記載される方法は、通常、その他の領域はランダム化されないままでの、免疫グロブリン遺伝子コーディング領域の選択された領域、特に、ＶＨおよびＶＬコーディング領域のランダム化を含む（以下、参照）。‘２４５特許はまた、ランダム化されたＶＨおよびＶＬドメインを個々に含むｓｃＦｖ構築物の作製を記載する。
抗体の構造および配列の分析によって、６つの抗原結合ループのうち５つ（Ｈ１、Ｈ２、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）が、限定された数の主鎖コンホメーションまたは標準構造を有することがわかっている(Chothia and Lesk (1987) J. Mol. Biol. 196: 901; Chothia et al. (1989) Nature 342: 877)。主鎖コンホメーションは、（ｉ）抗原結合ループの長さおよび（ｉｉ）抗原結合ループおよび抗体フレームワーク中の特定の重要な位置の特定の残基または残基の種類によって決定される。例えば、ループ長および重要な残基の分析は、ヒト抗体配列の大部分によってコードされるＨ１、Ｈ２、Ｌ１、Ｌ２およびＬ３の主鎖コンホメーションの予測を可能にした(Chothia et al. (1992) J. Mol. Biol. 227: 799; Tomlinson et al. (1995) EMBO J. 14: 4628; Williams et al. (1996) J. Mol. Biol. 264: 220)。Ｈ３領域は、配列、長さおよび構造の点でかなり多様であるが（Ｄセグメントの使用のために）、それもまた、短いループ長について限定された数の主鎖コンホメーションを形成し、これは、ループおよび抗体フレームワーク中の重要な位置の特定の残基または残基の種類の長さおよび存在に応じて変わる(Martin et al. (1996) J. Mol. Biol. 263: 800; Shirai et al. (1996) FEBS Letters 399: 1)。
１つのアプローチでは、種々の抗原結合ループのＣＤＲ中の任意の部位で合成レパートリーに多様性を加えることができるが、このアプローチは、適切に折り畳まらず、したがって、抗原と結合する可能性を有する、より低い割合の分子の一因となる、より大きな割合のＶドメインをもたらす。抗原−結合ループの主鎖コンホメーションの一因となる残基を理解することによって、ＶＨまたはＶＬドメインの合成レパートリー中で多様化する特定の残基の同定が可能となる。すなわち、多様性は、主鎖コンホメーションを維持するのに必要でない残基に最良に導入される。例として、ループＬ２の多様化のために、従来のアプローチは、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．(Kabat et al. (1991) Sequences of Immunological Interest, 5th ed. U.S. Dept. Health & Human Services, Washington, D.C.)によって定義される、対応するＣＤＲ（ＣＤＲ２）中のすべての残基、一部の７つの残基を多様化することである。しかし、Ｌ２について、位置５０および５３は、天然に存在する抗体では多様であり、抗原と接触することが観察されることがわかっている。１つのアプローチは、このループ中のそれら２つの残基のみを多様化することである。これは、さまざまな抗原結合特異性を作り出すのに必要な機能的多様性の点で相当な改善を表す。
免疫グロブリンポリペプチドライブラリーは、事前に決定された可変ドメイン主鎖コンホメーションをベースとして設計できることが有利である。このようなライブラリーは、その内容が引用により本明細書の一部とする国際特許出願ＷＯ９９／２０７４９に記載されるように構築できる。したがって、一態様では、ドメイン抗体は、所与のヒト生殖系列Ｖ領域遺伝子セグメント、例えば、ＶＨ生殖系列遺伝子セグメントＤＰ−４７またはＶκ生殖系列遺伝子セグメントＤＰＫ９のアミノ酸配列を含む。このような可変領域ポリペプチドを、ｓｃＦｖまたはＦａｂ、例えば、（ｉ）抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）または生殖系列ＶＨセグメントＤＰ−４７のアミノ酸配列を含むその抗原結合断片および（ｉｉ）抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）または生殖系列ＶκセグメントＤＰＫ９のアミノ酸配列を含むその抗原結合断片を含むｓｃＦｖまたはＦａｂの製造に使用できる。選択された重鎖および軽鎖生殖系列遺伝子セグメント、例えば、ＤＰ−４７、ＤＰＫ９、ＤＰ４５、ＤＰ３８などの関連で配列の多様化は、多様な免疫グロブリンコード配列のレパートリーを作製できる。多様化への１つのアプローチが、多様なドメイン抗体またはｓｃＦｖ配列のライブラリーの作製に関連して以下に記載されている。これらの可変領域ポリペプチドはまた、ドメイン抗体として発現させ、ＣＤ２８との高親和性結合についてスクリーニングできる。レパートリーは、ファージディスプレイに適したベクター、例えば、λまたは糸状バクテリオファージディスプレイベクター中にクローニングでき、またはその中に作製でき、次いで、所与の標的抗原、例えば、ＣＤ２８との結合についてスクリーニングする。
３．ドメイン抗体の調製
ドメイン抗体は、免疫グロブリン可変ドメインに特徴的な配列を含み、抗原と特異的に結合し（例えば、５００ｎＭ以下の解離定数）、任意の相補的可変ドメインを伴わずに単一可変ドメインとして抗原と結合する；すなわち、ドメイン抗体によって提供される１つの結合部位がある折り畳まれたポリペプチドドメインである。したがって、ドメイン抗体は、完全抗体可変ドメインならびに、例えば１または複数のループが、抗体可変ドメインに特徴的でない配列によって置換されている修飾された可変ドメインまたは末端切断されている、もしくはＮもしくはＣ末端伸長を含む抗体可変ドメイン、ならびに約５００ｎＭ以下（例えば、約４５０ｎＭ以下、約４００ｎＭ以下、約３５０ｎＭ以下、約３００ｎＭ以下、約２５０ｎＭ以下、約２００ｎＭ以下、約１５０ｎＭ以下、約１００ｎＭ以下）の解離定数および全長ドメインの標的抗原特異性を保持する可変ドメインの折り畳まれた断片を含む。例示的実施形態では、本明細書に示される組成物および方法において有用な抗体単一可変ドメインは、ＶκおよびＶλを含めたＶＨおよびＶＬの群から選択される。例示的実施形態では、本明細書において有用なドメイン抗体は、その用語が本明細書に置いて定義されるような「ヒト」である。
３．１．１．リガンドの構造
本明細書に開示される一態様によれば、２つ以上の非相補的エピトープ結合ドメインが、それらが本明細書において定義されるような閉構造であるように連結される。それらはさらに、本明細書に記載されるリンカーに代わるものとして、またはそれに加えて、互いにエピトープ結合部位の閉構造の形成および／または維持を促進し得る骨格と結合され得ることが有利である。あるいは、本明細書に開示されるドメイン抗体は、本明細書に論じられるスキャフォールドまたは骨格フレームワークを使用して構築され得る。
リガンド骨格は、免疫グロブリン分子をベースとするものである場合も、本明細書において別の場所で示されるような非免疫グロブリン由来のものである場合もある。本明細書に定義される免疫グロブリン骨格は、以下から選択されるもののうち任意の１または複数を含む：少なくとも（ｉ）抗体のＣＬ（κまたはλサブクラス）ドメイン；または（ｉｉ）抗体重鎖のＣＨ１ドメインを含む免疫グロブリン分子；抗体重鎖のＣＨ１およびＣＨ２ドメインを含む免疫グロブリン分子；抗体重鎖のＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３ドメイン；または抗体のＣＬ（κまたはλサブクラス）ドメインとともにサブセット（ｉｉ）のいずれかを含む免疫グロブリン分子。ヒンジ領域ドメインもまた含まれ得る。このようなドメインの組合せは、例えば、ＩｇＧまたはＩｇＭまたはＦｖ、ｓｃＦｖ、ＦａｂもしくはＦ（ａｂ’）２分子などのそれらの断片などの天然抗体を摸倣し得る。当業者ならば、この羅列は、網羅的であることを意図しないということは承知するであろう。
各エピトープ結合ドメインは、ドメインの１または複数のエピトープとの特定の相互作用に関与している、タンパク質スキャフォールドおよび１または複数のＣＤＲを含む。本明細書に開示されるエピトープ結合ドメインは、３つのＣＤＲを含むことが有利である。適したタンパク質スキャフォールドはまた、免疫グロブリンドメインをベースとするものに加え、免疫グロブリンドメイン以外のタンパク質スキャフォールドまたは骨格をベースとするものであり得る。例えば、ＳｐＡなどの天然細菌受容体が、ＣＤＲをグラフトして、１または複数のエピトープと特異的に結合するリガンドを作製するためのスキャフォールドとして使用されている。この手順の詳細は、ＵＳ５，８３１，０１２に記載されている。その他の適したスキャフォールドとして、フィブロネクチンおよびアフィボディ（Ａｆｆｉｂｏｄｙ、Ｂｒｏｍｍａ、Ｓｗｅｄｅｎ）をベースとするものが挙げられる。適した手順の詳細は、ＷＯ９８／５８９６５に記載されている。その他の適したスキャフォールドとして、van den Beuken et al., (2001) J. Mol. Biol.310: 591-601に記載されるリポカリンおよびＣＴＬＡ４、および例えば、細菌ＧｒｏＥＬまたはその他のシャペロンポリペプチドの環構造をベースとする、ＷＯ００／６９９０７（Ｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｕｎｃｉｌ）に記載されるものなどのスキャフォールドが挙げられる。使用してもよいその他の非免疫グロブリンをベースとするスキャフォールドとして、ＬＤＬ受容体クラスＡ、ＥＧＦドメイン単量体および多量体をベースとするものならびにＢｉｏｒｅｘｉｓ（Ｋｉｎｇ ｏｆ Ｐｒｕｓｓｉａ、ＰＡ）またはＡｖｉｄｉａ（Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、ＣＡ）から入手可能なスキャフォールドが挙げられる。使用してもよいその他の非免疫グロブリンスキャフォールドは、例えば、ＷＯ０５／０４０２２９、ＷＯ０４／０４４０１１およびＵＳ２００５／００８９９３２に記載されている。
３．１．２．主鎖コンホメーションの選択
免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーはすべて、そのポリペプチド鎖について同様の折り畳みを共有している。例えば、抗体が、その一次配列の点で高度に多様であっても、配列および結晶学的構造の比較によって、予想に反して、抗体の６つの抗原結合ループのうち５つ（Ｈ１、Ｈ２、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）が、限定された数の主鎖コンホメーションまたは標準構造をとることが示されている(Chothia and Lesk (1987) J. Mol. Biol., 196: 901; Chothia et al. (1989) Nature、342: 877)。したがって、ループ長および重要な残基の分析によって、ヒト抗体の大部分に見られるＨ１、Ｈ２、Ｌ１、Ｌ２およびＬ３の主鎖コンホメーションの予測が可能となった(Chothia et al. (1992) J. Mol. Biol., 227: 799; Tomlinson et al. (1995) EMBO J., 14: 4628; Williams et al. (1996) J. Mol. Biol., 264: 220)。Ｈ３領域は、配列、長さおよび構造の点でかなり多様であるが（Ｄセグメントの使用のために）、それもまた、短いループ長について限定された数の主鎖コンホメーションを形成し、これは、ループおよび抗体フレームワーク中の重要な位置の特定の残基または残基の種類の長さおよび存在に応じて変わる(Martin et al. (1996) J. Mol. Biol., 263: 800; Shirai et al. (1996) FEBS Letters, 399: 1)。
本明細書に開示されるリガンドは、ドメインのライブラリー、例えば、ＶＨドメインのライブラリーおよび／またはＶＬドメインのライブラリーから選択および／または組み立てることができる。さらに、本明細書に開示されるリガンドは、それ自体、ライブラリーの形態で提供され得る。本明細書に開示される一態様では、特定のループ長および重要な残基が、メンバーの主鎖コンホメーションが公知であることが確実であるよう選択されているリガンドおよび／またはドメインのライブラリーが設計される。これらは、天然に見られる免疫グロブリンスーパーファミリー分子の実際のコンホメーションであり、上記で論じられるように非機能的である機会を最小化することが有利である。生殖系列Ｖ遺伝子セグメントは、抗体またはＴ細胞受容体ライブラリーを構築するための１つの例示的基本的フレームワークとしての役割を果たし；その他の配列も有用である。変動が低頻度で生じ得、その結果、少数の機能的メンバーが、その機能に影響を及ぼさない変更された主鎖コンホメーションを有し得る。
標準構造理論も、リガンドによってコードされる種々の主鎖コンホメーションの数を評価し、リガンド配列に基づいて主鎖コンホメーションを予測し、標準構造に影響を及ぼさない多様化のための残基を選択するのに有用である。ヒトＶκドメインでは、Ｌ１ループは、４種の標準構造のうちの１つをとり得、Ｌ２ループは、単一の標準構造を有すること、およびヒトＶκドメインの９０％は、Ｌ３ループの４種または５種の標準構造のうちの１種をとること(Tomlinson et al. (1995) 前掲);したがって、Ｖκドメイン単独では、種々の標準構造を組み合わせてさまざまな異なる主鎖コンホメーションを作製することができることがわかっている。Ｖλドメインが、Ｌ１、Ｌ２およびＬ３ループの異なる範囲の標準構造をコードすること、および、ＶκおよびＶλドメインが、Ｈ１およびＨ２ループについていくつかの標準構造をコードし得る任意のＶＨドメインと対を形成し得ることを考えれば、これら５つのループについて観察される標準構造組合せの数は極めて多い。このことは、主鎖コンホメーションにおける多様性の作製は、さまざまな結合特異性の製造にとって必須であり得るということを意味する。しかし、単一の公知の主鎖コンホメーションをベースとして抗体ライブラリーを構築することによって、予想に反して、主鎖コンホメーションの多様性は、実質的にすべての抗原を標的とするのに十分な多様性を作製するのに必要ではないということがわかった。単一の主鎖コンホメーションは、コンセンサス構造である必要はないということはさらにより驚くべきことである。単一の天然に存在するコンホメーションを、全ライブラリーの基盤として使用してもよい。したがって、一態様では、本明細書に開示されるリガンドは、単一の公知の主鎖コンホメーションを有する。
選択される単一の主鎖コンホメーションは、一態様では、問題の免疫グロブリンスーパーファミリータイプの分子の中では普通である。コンホメーションは、相当な数の天然に存在する分子がそれをとることが観察される場合に普通である。したがって、本明細書に開示される一態様では、免疫グロブリンドメインの各結合ループの異なる主鎖コンホメーションの自然発生は、別個に考えられ、次いで、種々のループについて、所望の組合せの主鎖コンホメーションを有する天然に存在する可変ドメインが選択される。何も利用可能でない場合には、最も近い等価物が選択され得る。種々のループについて、主鎖コンホメーションの所望の組合せが、所望の主鎖コンホメーションをコードする生殖系列遺伝子セグメントを選択することによって作製されることが好ましい。選択された生殖系列遺伝子セグメントが、天然に頻繁に発現されることがより好ましく、それらが、すべての天然生殖系列遺伝子セグメントの最も頻繁に発現されるものであることが最も好ましい。
リガンドまたはそのライブラリーの設計では、各抗原結合ループの種々の主鎖コンホメーションの出現率は、別個に考えられ得る。Ｈ１、Ｈ２、Ｌ１、Ｌ２およびＬ３について、天然に存在する分子の抗原結合ループの２０％〜１００％によってとられる所与のコンホメーションが選択される。通常、その観察される出現率は、３５％を上回る（すなわち、３５％〜１００％の間）、理想的には、５０％超またはさらに６５％超である。Ｈ３ループの大部分は、標準構造を有さないので、標準構造を示すそれらのループの中で普通である主鎖コンホメーションを選択することが好ましい。したがって、それぞれのループについて、天然レパートリー中で最もよく観察されるコンホメーションが選択される。ヒト抗体では、各ループの最も一般的な標準構造（ＣＳ）は、以下の通りである：Ｈ１−ＣＳ１（発現されるレパートリーの７９％）、Ｈ２−ＣＳ３（４６％）、Ｌ１− Ｖκ中のＣＳ２（３９％）、Ｌ２−ＣＳ１（１００％）、Ｌ３−ＶκのＣＳ１（３６％）（算出によって、κ：λ比、７０：３０と推測される、Hood et al. (1967) Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 48: 133)。標準構造を有するＨ３ループについて、残基９４から残基１０１に塩橋を有する７つの残基のＣＤＲ３長(Kabat et al. (1991) Sequences of proteins of immunological interest, U.S. Department of Health and Human Services)が、最も一般的であると思われる。ＥＭＢＬデータライブラリーには、このコンホメーションを形成するのに必要なＨ３長および重要な残基を含む少なくとも１６種のヒト抗体配列およびタンパク質データバンクには、抗体モデリングの基礎として使用できる少なくとも２つの結晶学的構造（２ｃｇｒおよび１ｔｅｔ）がある。標準構造のこの組合せが、ＶＨセグメント３−２３（ＤＰ−４７）、ＪＨセグメントＪＨ４ｂ、ＶκセグメントＯ２／Ｏ１２（ＤＰＫ９）およびＪκセグメントＪκ１である最も頻繁に発現される生殖系列遺伝子セグメント。ＶＨセグメントＤＰ４５およびＤＰ３８も適している。したがって、これらのセグメントを、所望の単一主鎖コンホメーションを有するライブラリーを構築するための基礎として組み合わせて使用できる。
あるいは、結合ループの各々について単独での種々の主鎖コンホメーションの自然発生に基づいて単一主鎖コンホメーションを選択する代わりに、主鎖コンホメーションの組合せの自然発生を、単一主鎖コンホメーションを選択する基礎として使用する。抗体の場合には、例えば、任意の２、３、４、５または６種すべての抗原結合ループの標準構造組合せの自然発生を決定できる。ここで、選択されたコンホメーションが、天然に存在する抗体において普通であることが好ましく、天然レパートリーにおいて最も頻繁に観察されることが最も好ましい。したがって、ヒト抗体では、単一主鎖コンホメーションを選択する基礎として、例えば、５種の抗原結合ループ、Ｈ１、Ｈ２、Ｌ１、Ｌ２およびＬ３の天然の組合せが考えられる場合、標準構造の最も頻繁な組合せが決定され、次いで、Ｈ３ループの最も一般的なコンホメーションと組み合わされる。
３．２．ドメイン抗体の調製
ドメイン抗体は、いくつかの方法で調製される。これらのアプローチの各々について、核酸配列を調製（例えば、増幅、突然変異誘発など）および操作する周知の方法が適用できる。
ドメイン抗体を調製する１つの手段は、所望の抗原と結合することがわかっているクローニングされた抗体の重鎖または軽鎖遺伝子のＶＨまたはＶＬ領域を増幅および発現させることである。すなわち、既知ドメイン抗体コーディング領域のＶＨまたはＶＬドメインを、単一ドメインとして（または、単一ドメインの融合物として）増幅および発現させ、ＣＤ２８との結合について評価することができる。ＶＨおよびＶＬドメインの境界は、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．(Kabat et al. (1991) Sequences of Immunological Interest, 5th ed. U.S. Dept. Health & Human Services, Washington, D.C.)によって示されている。重鎖および軽鎖遺伝子のＶＨおよびＶＬドメインの境界に関する情報を使用して、ＣＤ２８と結合するとわかっている抗体をコードするクローニングされた重鎖または軽鎖コード配列からＶドメインを増幅するＰＣＲプライマーを設計する。増幅されたＶドメインを、適した発現ベクター、例えば、ｐＨＥＮ−１(Hoogenboom et al. (1991) Nucleic Acids Res. 19: 4133-4137)に挿入し、単独でまたは別のポリペプチド配列との融合物として発現させる。
ＶＨ遺伝子は、３種の遺伝子セグメント、ＶＨ、ＤおよびＪＨの組換えによって製造する。ヒトでは、ハプロタイプに応じて、約５１種の機能的ＶＨセグメント(Cook and Tomlinson (1995) Immunol Today 16: 237)、２５種の機能的Ｄセグメント(Corbett et al. (1997) J. Mol. Biol. 268: 69)および６種の機能的ＪＨセグメント(Ravetch et al. (1981) Cell 27: 583)がある。ＶＨセグメントは、ＶＨドメイン（Ｈ１およびＨ２）の第１および第２の抗原結合ループを形成するポリペプチド鎖の領域をコードするが、ＶＨ、ＤおよびＪＨセグメントは、結合してＶＨドメインの第３の抗原結合ループ（Ｈ３）を形成する。
ＶＬ遺伝子は、２種の遺伝子セグメント、ＶＬおよびＪＬのみの組換えによって製造される。ヒトでは、ハプロタイプに応じて、約４０種の機能的Ｖκセグメント(Schaeble and Zachau (1993) Biol. Chem. Hoppe-Seyler 374: 1001)、３１種の機能的Ｖλセグメント(Williams et al. (1996) J. Mol. Biol. 264: 220; Kawasaki et al. (1997) Genome Res. 7: 250)、５種の機能的Ｊκセグメント(Hieter et al. (1982) J. Biol. Chem. 257: 1516)および４種の機能的Ｊλセグメント(Vasicek and Leder (1990) J. Exp. Med. 172: 609)がある。ＶＬセグメントは、ＶＬドメイン（Ｌ１およびＬ２）の第１および第２の抗原結合ループを形成するポリペプチド鎖の領域をコードするが、ＶＬおよびＪＬセグメントは、結合してＶＬドメインの第３の抗原結合ループ（Ｌ３）を形成する。この一次レパートリーから選択された抗体は、少なくとも中程度の親和性でほぼすべての抗原と結合するよう十分に多様であると考えられる。高親和性抗体は、点突然変異が生じ、改善された結合に基づいて免疫系によって選択される、再編成された遺伝子の「親和性成熟」によってインビボで作製される。
１つのアプローチでは、ＶＨまたはＶＬドメインのレパートリー、一態様では、ヒトＶＨまたはＶＬドメインは、例えば、ファージディスプレイ、所望の抗原に対するパニングによってスクリーニングされる。バクテリオファージディスプレイライブラリーおよびλファージ発現ライブラリーを構築する方法は、当技術分野で周知であり、例えば、McCafferty et al. (1990) Nature 348: 552; Kang et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 88: 4363; Clackson et al. (1991) Nature 352: 624; Lowman et al. (1991) Biochemistry 30: 10832; Burton et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A. 88: 10134; Hoogenboom et al. (1991) Nucleic Acids Res. 19: 4133; Chang et al. (1991) J. Immunol. 147: 3610; Breitling et al. (1991) Gene 104: 147; Marks et al. (1991) J. Mol. Biol. 222: 581; Barbas et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89: 4457; Hawkins and Winter (1992) J. Immunol., 22: 867; Marks et al. (1992) J. Biol. Chem., 267: 16007;およびLerner et al. (1992) Science, 258: 1313によって教示されている。Ｆａｂファージディスプレイライブラリーは、例えば、Ｕ．Ｓ．５，９２２，５４５によって教示される。ｓｃＦｖファージライブラリーは、例えば、Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A. 85: 5879-5883; Chaudhary et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A. 87: 1066-1070; McCafferty et al. (1990) 前掲;Clackson et al. (1991) 前掲; Marks et al. (1991) 前掲;Chiswell et al. (1992) Trends Biotech. 10: 80;および Marks et al. (1992) 前掲によって教示される。バクテリオファージコートタンパク質上にディスプレイされるｓｃＦｖライブラリーの種々の実施形態が記載されている。例えば、ＷＯ９６／０６２１３およびＷＯ９２／０１０４７（Ｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｕｎｃｉｌら）ならびにＷＯ９７／０８３２０（Ｍｏｒｐｈｏｓｙｓ、前掲）に記載されるようなファージディスプレイアプローチの改良も知られている。
ＶＨまたはＶＬドメインのレパートリーは、免疫グロブリン配列の天然に存在するレパートリーまたは合成レパートリーであり得る。天然に存在するレパートリーは、例えば、１または複数の個体から採取された免疫グロブリン発現細胞から調製されたものである。このようなレパートリーは、「ナイーブ」であり得る、すなわち、例えば、ヒト胎児または新生児免疫グロブリン発現細胞から調製され得る、または再編成され得る、すなわち、例えば、成人ヒトＢ細胞から調製され得る。天然レパートリーは、例えば、Marks et al. (1991) J. Mol. Biol. 222: 581およびVaughan et al. (1996) Nature Biotech. 14: 309に記載されている。必要に応じて、次いで、天然レパートリーまたは任意のレパートリーから同定された、さらには、標的抗原と結合するクローンを突然変異誘発およびさらなるスクリーニングに付し、結合特性が改善された変異体を作製し、選択する。
クローニングされたＶドメインに多様性を人為的に導入することによって、ドメイン抗体の合成レパートリーを調製する。合成レパートリーは、例えば、Hoogenboom & Winter (1992) J. Mol. Biol. 227: 381; Barbas et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89: 4457; Nissim et al. (1994) EMBO J. 13: 692; Griffiths et al. (1994) EMBO J. 13: 3245; DeKriuf et al. (1995) J. Mol. Biol. 248: 97;およびＷＯ９９／２０７４９によって記載されている。
一態様では、合成可変ドメインレパートリーは、人為的に多様化された生殖系列ＶＨまたはＶκ配列に基づいて、ＶＨまたはＶκバックグラウンドで調製される。例えば、ＶＨドメインレパートリーは、クローニングされた生殖系列ＶＨ遺伝子セグメントＶ３−２３／ＤＰ４７(Tomlinson et al. (1992) J. Mol. Biol. 227: 776)およびＪＨ４ｂをベースとし得る。Ｖκドメインレパートリーは、例えば、生殖系列Ｖκ遺伝子セグメントＯ２／Ｏ１２／ＤＰＫ９(Cox et al. (1994) Eur. J. Immunol. 24: 827)およびＪκ１をベースとし得る。多様性は、例えば、ＰＣＲ突然変異誘発によってこれらまたはその他の遺伝子セグメントに導入される。多様性は、例えば、エラープローンＰＣＲ(Hawkins, et al. (1992) J. Mol. Biol. 226: 889)または化学突然変異誘発によって無作為に導入され得る。上記で論じたように、しかし、一実施形態では、多様性の導入は、特定の残基にターゲッティングされる。別の実施形態では、所望の残基は、すべてのアミノ酸およびタグ停止コドンをコードする、変異原性プライマーを使用するコドンＮＮＫの導入によって［ＩＵＰＡＣ命名法（ここで、Ｎ＝Ｇ、Ａ、ＴまたはＣ、Ｋ＝ＧまたはＴ）を使用する］ターゲッティングされる。ＮＮＮコドン（さらなる停止コドンＴＧＡおよびＴＡＡの生成をもたらす）、ＤＶＴコドン［（Ａ／Ｇ／Ｔ）（Ａ／Ｇ／Ｃ）Ｔ］、ＤＶＣコドン［（Ａ／Ｇ／Ｔ）（Ａ／Ｇ／Ｃ）Ｃ］およびＤＶＹコドン［（Ａ／Ｇ／Ｔ）（Ａ／Ｇ／Ｃ）（Ｃ／Ｔ）］をはじめ、同様の目的を達成するその他のコドンも有用である。ＤＶＴコドンは、２２％セリンおよび１１％チロシン、アスパラギン、グリシン、アラニン、アスパラギン酸、トレオニンおよびシステインをコードし、天然ヒト抗体の抗原結合部位のアミノ酸残基の分布を最も厳密に摸倣する。レパートリーは、選択された縮重コドンまたは多様化される各部位のコドンを有するＰＣＲプライマーを使用して製造される。ＰＣＲ突然変異誘発は、当技術分野では周知である。
一態様では、多様性は、ヒト生殖系列ＶＨ遺伝子セグメントＶ３−２３／ＤＰ４７(Tomlinson et al. (1992) J. Mol. Biol. 227: 7768)およびＪＨ４ｂの配列に、米国特許第６，６９６，２４５号において使用される番号付けを用い、ＣＤＲ１、２および３の多様性に対応して、部位Ｈ３０、Ｈ３１、Ｈ３３、Ｈ３５、Ｈ５０、Ｈ５２、Ｈ５２ａ、Ｈ５３、Ｈ５５、Ｈ５６、Ｈ５８、Ｈ９５、Ｈ９７およびＨ９８のＮＮＫコドンを使用して導入される。
別の態様では、多様性はまた、ヒト生殖系列ＶＨ遺伝子セグメントＶ３−２３／ＤＰ４７およびＪＨ４ｂの配列に、米国特許第６，６９６，２４５号において使用される番号付けを用い、ＣＤＲ１、２および３の多様性に対応して、例えば、部位Ｈ３０、Ｈ３１、Ｈ３３、Ｈ３５、Ｈ５０、Ｈ５２、Ｈ５２ａ、Ｈ５３、Ｈ５５、Ｈ５６、Ｈ５８、Ｈ９５、Ｈ９７、Ｈ９８、Ｈ９９、Ｈ１００、Ｈ１００ａおよびＨ１００ｂのＮＮＫコドンを使用して導入される。
別の態様では、多様性は、ヒト生殖系列Ｖκ遺伝子セグメントＯ２／Ｏ１２／ＤＰＫ９およびＪκ１の配列に、米国特許第６，６９６，２４５号において使用される番号付けを用い、ＣＤＲ１、２および３の多様性に対応して、例えば、部位Ｌ３０、Ｌ３１、Ｌ３２、Ｌ３４、Ｌ５０、Ｌ５３、Ｌ９１、Ｌ９２、Ｌ９３、Ｌ９４およびＬ９６のＮＮＫコドンを使用して導入される。
多様なレパートリーは、当技術分野で公知のように、例えば、ＷＯ９９／２０７４９に記載されるようにファージディスプレイベクターにクローニングされる。一般に、本明細書に示される組成物および方法に必要な核酸分子およびベクター構築物は、当技術分野で入手可能であり、Sambrook et al. (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, USAおよびその後の版などの標準実験室マニュアルに示されるように構築および操作される。
本明細書に示されるような核酸の操作は、通常、組換えベクターで実施される。本明細書において、「ベクター」とは、異種ＤＮＡを、その発現および／または複製のために細胞に導入するために使用される個別の要素を指す。このようなベクターを選択または構築し、続いて、使用する方法は、当業者には周知である。細菌プラスミド、バクテリオファージ、人工染色体およびエピソームベクターをはじめとする多数のベクターが、公的に入手可能である。このようなベクターを簡易クローニングおよび突然変異誘発に使用してもよく；あるいは、本明細書におけるレパートリー（またはプレレパートリー）メンバーが運ばれるベクターの通常であるが、遺伝子発現ベクターが使用される。本明細書に示される有用なベクターは、所望の大きさ、一般に、０．２５キロベース（ｋｂ）から４０ｋｂの長さのポリペプチドコード配列に対応するよう選択される。適した宿主細胞が、インビトロクローニング操作の後、ベクターを用いて形質転換される。各ベクターは、通常、クローニング（または「ポリリンカー」）部位、複製起点および少なくとも１種の選択マーカー遺伝子を含む種々の機能的成分を含む。所与のベクターが発現ベクターである場合には、以下のうち１または複数をさらに有する：各々、本明細書に示されるポリペプチドレパートリーメンバーをコードする遺伝子と作動可能に連結するよう、クローニング部位の近くに位置する、エンハンサーエレメント、プロモーター、転写終結およびシグナル配列。
クローニングおよび発現ベクターの両方とも、通常、ベクターが、１または複数の選択された宿主細胞において複製するのを可能にする核酸配列を含有する。通常、クローニングベクターでは、この配列は、ベクターが、宿主染色体ＤＮＡと無関係に複製するのを可能にするものであり、複製起点または自立複製配列を含む。このような配列は、さまざまな細菌、酵母およびウイルスについて周知である。プラスミドｐＢＲ３２２に由来する複製起点は、ほとんどのグラム陰性菌に適しており、２ミクロンのプラスミド起源が酵母に適しており、種々のウイルス起源（例えば、ＳＶ４０、アデノウイルス）は、哺乳類細胞においてベクターをクローニングするのに有用である。通常、複製起点は、哺乳類発現ベクターが、ＣＯＳ細胞などの、高レベルのＤＮＡを複製できる哺乳類細胞において使用される限り、哺乳類発現ベクターには必要ではない。
クローニングまたは発現ベクターはまた、選択マーカーとも呼ばれる、選択遺伝子も含むことが有利である。この遺伝子は、選択的培養培地で増殖される形質転換宿主細胞の生存または成長に必要なタンパク質をコードする。したがって、選択遺伝子を含有するベクターで形質転換されていない宿主細胞は、培養培地で生存しない。通常の選択遺伝子は、抗生物質およびその他の毒素、例えば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキサートまたはテトラサイクリンに対する耐性を付与し、栄養要求性欠乏を補完し、または増殖培地中で入手できない重大な栄養素を供給するタンパク質をコードする。
本明細書におけるベクターの複製は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において実施されることが最も好都合であるので、大腸菌選択マーカー、例えば、抗生物質アンピシリンに対する耐性を付与するβ−ラクタマーゼ遺伝子が有用である。これらは、ｐＢＲ３２２などの大腸菌プラスミドまたはｐＵＣ１８もしくはｐＵＣ１９などのｐＵＣプラスミドから得ることができる。しかし、その他のプラスミド微生物の組合せも、無理なく置き換えられ得る。
発現ベクターは、通常、宿主生物によって認識され、注目するコード配列と作動可能に連結しているプロモーターを含有する。このようなプロモーターは、誘導性である場合も、構成的である場合もある。用語「作動可能に連結している」とは、記載される成分が、それらがその意図される方法で機能するのを可能にする関係にある近位を指す。コード配列と「作動可能に連結された」制御配列は、コード配列の発現が、制御配列と適合する条件下で達成されるような方法でライゲーションされる。
原核生物宿主とともに使用するのに適したプロモーターとして、例えば、β−ラクタマーゼおよびラクトースプロモーター系、アルカリ性ホスファターゼ、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系およびｔａｃプロモーターなどのハイブリッドプロモーターが挙げられる。細菌系において使用するためのプロモーターはまた、通常、コード配列と作動可能に連結しているシャイン−ダルガーノ（Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ）配列を含有する。
本明細書に記載されるライブラリーまたはレパートリーでは、ベクターは、ポリペプチドライブラリーメンバーに対応する核酸配列の発現を可能にする発現ベクターであり得る。したがって、選択は、ポリペプチドライブラリーメンバーを発現する単一クローンの別個の増殖および発現によって、または任意の選択ディスプレイ系の使用によって実施される。上記のように、１つの選択ディスプレイ系は、バクテリオファージディスプレイを使用する。したがって、ファージまたはファージミドベクターを使用できる。ベクターは、大腸菌複製起点（二本鎖複製のための）およびまたファージ複製起点（一本鎖ＤＮＡの産生のための）を有するファージミドベクターであり得る。このようなベクターの操作および発現は、当技術分野で周知である(Hoogenboom and Winter (1992) 前掲; Nissim et al. (1994) 前掲）。手短には、ベクターは、ファージミドに選択性を付与するためのβ−ラクタマーゼまたはその他の選択マーカー遺伝子およびｐｅｌＢリーダー配列（発現されたポリペプチドを細胞膜周辺腔に向かわせる）、多重クローニング部位（ヌクレオチド版のライブラリーメンバーをクローニングするための）、所望により、１または複数のペプチドタグ（検出のための）、所望により、１または複数のＴＡＧ停止コドンおよびファージタンパク質ｐＩＩＩからなる（ＮからＣ末端に）発現カセットの上流のｌａｃプロモーターを含有する。一実施形態では、ベクターは、ｐｅｌＢリーダー配列よりはむしろ、融合ポリペプチドの分泌を大腸菌において細胞膜周辺腔に、または真核細胞系において培地に向かわせるのに役立つ真核細胞のＧＡＳ１リーダー配列をコードする。大腸菌の種々のサプレッサーおよび非サプレッサー株を、グルコース、イソプロピルチオ−β−Ｄ−ガラクトシド（ＩＰＴＧ）またはＶＣＳ Ｍ１３などのヘルパーファージを伴って使用して、ベクターは、プラスミドとして複製し、発現を伴わず、多量のポリペプチドライブラリーメンバーのみを産生、またはファージを産生でき、その一部は、その表面に少なくとも１コピーのポリペプチド−ｐＩＩＩ融合物を含有する。
ベクターの一例として、ｐＨＥＮ１ファージミドベクターがあり（Hoogenboom et al. (1991) Nucl. Acids Res. 19: 4133-4137;配列は、例えば、ＷＯ０３／０３１６１１において配列番号７として入手可能である）、これでは、ｐＩＩＩ融合タンパク質の産生は、ＬａｃＺプロモーターの制御下にあり、これは、グルコースの存在下で阻害され、ＩＰＴＧで誘導される。大腸菌のサプレッサー株、例えば、ＴＧ１において増殖された場合には、遺伝子ＩＩＩ融合タンパク質は、産生され、ファージにパッケージングされるが、非サプレッサー株、例えば、ＨＢ２１５１における増殖は、可溶性融合タンパク質の細菌周辺質への、および培養培地への分泌を可能にする。遺伝子ＩＩＩの発現が、ヘルパーファージでの後の感染を防止するので、ファージミドベクターを持つ細菌は、ファージレスキューのためのＶＣＳＭ１３ヘルパーファージでの感染の前にグルコースの存在下で増殖する。
本明細書に示されるベクターの構築は、従来の連結技術を使用する。必要とされるベクターを作製するために、単離されたベクターまたはＤＮＡ断片を切断し、目的に合わせ、所望の形態に再度連結する。必要に応じて、構築されたベクター中に正しい配列が存在することを確認するための配列分析を、標準方法を使用して実施する。発現ベクターを構築し、インビトロ転写物を調製し、ＤＮＡを宿主細胞に導入し、発現および機能を評価するための分析を実施するための適した方法は、当業者には公知である。サンプル中の遺伝子配列の存在が検出され、またはその増幅および／または発現が、サザンまたはノーザン分析、ウエスタンブロッティング、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはタンパク質のドットブロット法、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、免疫細胞化学または核酸もしくはタンパク質分子の配列分析などの従来の方法によって定量化される。当業者ならば、必要に応じて、これらの方法が改変され得る方法を容易に想定されよう。
３．３．抗原結合についてのドメイン抗体のスクリーニング
ファージの表面でのドメイン抗体のレパートリーの発現後、ファージレパートリーを、固定化された標的抗原と接触させること、洗浄して結合していないファージを除去することおよび結合しているファージを増殖させることによって選択を実施し、このプロセス全体は、「パニング」と呼ばれることが多い。このプロセスは、ドメイン抗体ならびにディスプレイライブラリー上に発現され得るその他の抗体断片、例えば、ｓｃＦｖ、Ｆａｂなどのスクリーニングに適用可能である。あるいは、折り畳まれたメンバーのみによって結合される、固定化された一般的リガンド（例えば、プロテインＡまたはプロテインＬ）に対するパニングによって、適切に折り畳まれたメンバー変異体の発現についてファージを事前選択する。これは、機能的でないメンバーの割合を低下させ、それによって、標的抗原と結合する可能性が高いメンバーの割合を増大するという利点を有する。一般的リガンドを用いる事前選択は、例えば、ＷＯ９９／２０７４９に教示されている。ファージ抗体ライブラリーのスクリーニングは、例えば、Harrison et al. (1996) Meth. Enzymol. 267: 83-109によって全般的に記載されている。
スクリーニングは、普通、固相支持体、例えば、プラスチック試験管もしくはウェル上に、またはクロマトグラフィーマトリックス、例えば、セファロース（商標）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）上に固定化されている精製された抗原を使用して実施される。スクリーニングまたは選択はまた、細胞の表面などの複合抗原で実施してもよい(Marks et al. (1993) BioTechnology 11: 1145; de Kruif et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92: 3938)。別の代替法は、溶液中のビオチン化抗原を結合することと、それに続く、ストレプトアビジンコートされたビーズ上での捕獲による選択を含む。
一態様では、パニングを、試験管またはプレート中のウェル、例えば、Ｎｕｎｃ ＭＡＸＩＳＯＲＰ（商標）イムノチューブ８ウェルストリップ上に抗原（一般的または特異的）を固定化することによって実施する。ウェルを、１５０μｌの抗原（ＰＢＳ中、１００μｇ／ｍｌ）でコーティングし、一晩インキュベートする。次いで、ウェルをＰＢＳで３回洗浄し、４００μｌ ＰＢＳ−２％脱脂乳（２％ＭＰＢＳ）を用いて３７℃で２時間ブロッキングする。ウェルをＰＢＳで３回リンスし、２％ＭＰＢＳ中にファージを加える。混合物を、室温で９０分間インキュベートし、結合していないファージを含有する液体を除去する。ウェルをＰＢＳ−０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０を用いて１０回、次いで、ＰＢＳを用いて１０回リンスして、洗浄剤を除去する。２００μｌの新たに調製した１００ｍＭトリエチルアミンを加えること、ウェルを混合することおよび室温で１０分間インキュベートすることによって結合しているファージを溶出する。溶出されたファージを、１００μｌの１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４を含有する試験管に移し、ボルテックス処理して、トリエチルアミンを中和する。対数増殖中の大腸菌宿主細胞（例えば、ＴＧ１）を、例えば、１５０ｍｌの溶出されたファージを用い、３７℃で３０分間インキュベートすることによって感染させる。感染細胞を遠心沈降させ、新鮮培地に再懸濁し、トップアガロース中でプレーティングする。ファージプラークを、宿主細胞の新鮮培養物中に溶出または選び取り、分析のため、またはさらなる選択のラウンドのために増殖させる。選択されたファージの純粋な集団を確実にするために必要である場合には、１または複数のラウンドのプラーク精製を実施する。その他のスクリーニングアプローチは、Harrison et al. (1996) 前掲によって記載されている。
所望の標的と結合するドメイン抗体を発現するファージを同定した後、ｐＨＥＮ１などのファージミドベクターを使用している場合には、可溶性遺伝子ＩＩＩ融合タンパク質の分泌を可能にする、細菌の非サプレッサー株、例えば、ＨＢ２１５１に感染させることによって、可変ドメイン融合タンパク質は可溶性形態で容易に産生される。ＧＡＳ１分泌シグナルペプチドが、ベクターによってコードされる場合には、融合ポリペプチドは、真核細胞（例えば、酵母または哺乳類）または原核細胞（例えば、大腸菌）によって分泌され得る。あるいは、Ｖドメイン配列を、適当な発現ベクターにサブクローニングして、当技術分野で公知の方法に従って可溶性タンパク質を製造できる。
３．４．ドメイン抗体の精製および濃度
細胞膜周辺腔に、または細菌の培地に分泌されたドメイン抗体を、公知の方法に従って回収し、精製する(Harrison et al. (1996) 前掲)。Skerra & Pluckthun (1988) Science 240: 1038およびBreitling et al. (1991) Gene 104: 147には、周辺質からのドメイン抗体の回収が記載されており、Better et al. (1988) Science 240: 1041には、培養上清からの回収が記載されている。いくつかのドメイン抗体について、精製はまた、プロテインＡまたはプロテインＬなどの一般的リガンドとの結合によって達成できる。あるいは、可変ドメインは、アフィニティークロマトグラフィーによる精製を容易にするペプチドタグ、例えば、Ｍｙｃ、ＨＡまたは６Ｘ−Ｈｉｓタグ（配列番号６４４）を用いて発現させてもよい。
必要に応じて、ドメイン抗体を、例えば、限外濾過、ダイアフィルトレーションおよび接線流濾過を含めた当技術分野で周知のいくつかの方法のいずれかによって濃縮する。限外濾過のプロセスは、半透膜および圧力を使用して、大きさおよび形状に基づいて分子種を分離する。圧力は、ガス圧力によって、または遠心分離によって提供する。市販の限外濾過製品は、例えば、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ；例として、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ（商標）およびＭｉｃｒｏｃｏｎ（商標）濃縮器が挙げられる）およびＶｉｖａｓｃｉｅｎｃｅ（Ｈａｎｎｏｖｅｒ、Ｇｅｒｍａｎｙ；例として、Ｖｉｖａｓｐｉｎ（商標）濃縮器が挙げられる）から広く入手可能である。標的ポリペプチドよりも小さい分子量カットオフを選択することにより（わずか１０ｋＤの相違が成功裏に使用できるが、通常、標的ポリペプチドの１／３〜１／６の分子量）、溶媒およびより小さい溶質がメンブレンを通過する際にポリペプチドは保持される。したがって、約５ｋＤの分子量カットオフは、本明細書に記載されるドメイン抗体の濃縮にとって有用である。
ポリペプチド調製物中の塩またはバッファーを除去または交換することが望ましい場合には、「洗浄」プロセスを用いて限外濾過メンブレンを使用するダイアフィルトレーションが使用される。ポリペプチドは、溶媒および小さい溶質のメンブレンを通る通過によって濃縮され、残存する塩またはバッファーは、限外濾過の連続に付随して、望まれるように、保持されるポリペプチドの新規バッファーまたは塩溶液または水での希釈によって除去される。連続ダイアフィルトレーションでは、濾液がメンブレンを通過するのと同じ速度で新規バッファーが加えられる。ダイアフィルトレーション容量は、連続ダイアフィルトレーションを使用するダイアフィルトレーションの開始前のポリペプチド溶液の容量であり、新規バッファーを用いる、６ダイアフィルトレーション容量による洗浄によって９９．５％を超える十分に透過性の溶質が除去され得る。あるいは、このプロセスは、塩またはバッファーを除去または交換し、最終的にポリペプチドを濃縮するために、サンプルが反復して希釈され、次いで、その元の容量に濾過して戻される不連続な方法で実施してもよい。ダイアフィルトレーションのための機器およびその使用のための詳細な方法論は、例えば、Ｐａｌｌ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ、ＭＩ）およびＳａｒｔｏｒｉｕｓ ＡＧ／Ｖｉｖａｓｃｉｅｎｃｅ（Ｈａｎｎｏｖｅｒ、Ｇｅｒｍａｎｙ）から入手可能である。
「クロスフロー濾過」としても知られる接線流濾過（ＴＦＦ）はまた、限外濾過メンブレンも使用する。標的ポリペプチドを含有する流体が、メンブレンの表面に沿って接線方向に送り出される。圧力により、流体の一部がメンブレンを通過し、一方で標的ポリペプチドはフィルター上に保持される。しかし、標準的な限外濾過とは対照的に、保持される分子は、メンブレンの表面上に蓄積せず、接線流によって押し流される。フィルターを通過しない溶液（標的ポリペプチドを含有する）を、メンブレンを通して反復して循環させ、所望の程度の濃度を達成してもよい。ＴＦＦのための機器およびその使用のための詳細な方法論は、例えば、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（例えば、ＰｒｏＦｌｕｘ Ｍ１２（商標）Ｂｅｎｃｈｔｏｐ ＴＦＦシステムおよびＰｅｌｌｉｃｏｎ（商標）システム）、Ｐａｌｌ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（例えば、Ｍｉｎｉｍ（商標）接線流濾過システム）から入手可能である。
タンパク質濃度は、当技術分野で周知のいくつかの方法で測定される。これらとして、例えば、アミノ酸分析、２８０ｎｍでの吸光度、「ブラッドフォード」および「ローリー」法およびＳＤＳ−ＰＡＧＥが挙げられる。最も正確な方法は、完全加水分解と、それに続くＨＰＬＣによるアミノ酸分析であり、次いで、濃度を測定し、次いで、ドメイン抗体の既知配列と比較する。この方法は最も正確であるが、費用がかかり、時間もかかる。２８０ｎｍでのＵＶ吸光度の測定によるタンパク質決定は、より迅速で、費用がかなり少なく、それにもかかわらず、比較的正確であり、アミノ酸分析を上回る妥協案である。２８０ｎｍでの吸光度を使用して、本明細書に記載される実施例において報告されるタンパク質濃度を求めた。
「ブラッドフォード」および「ローリー」タンパク質アッセイ(Bradford (1976) Anal. Biochem. 72: 248-254; Lowry et al. (1951) J. Biol. Chem. 193: 265-275)は、サンプルタンパク質濃度を、最も多くはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）に基づいた標準曲線と比較する。これらの方法は、あまり正確ではなく、ドメイン抗体の濃度を過小評価する傾向がある。しかし、その正確度は、ＶＨまたはＶκ単一ドメインポリペプチドを標準として使用することによって改善できる。
利用できるさらなるタンパク質アッセイ法は、米国特許第４，８３９，２９５号（引用により本明細書の一部とする）に記載され、Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）によって、「ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ」（例えば、Ｐｉｅｒｃｅカタログ番号２３２２７）として市販されているビシンコニン酸アッセイである。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法は、ゲル電気泳動および既知濃度標準、例えば、既知量のドメイン抗体と比較してクーマシーブルー染色を使用する。定量化は、視認によって、またはデンシトメトリーによって行うことができる。
本明細書に記載されるドメイン抗体は、高濃度（例えば、水溶液（例えば、ＰＢＳ）中、少なくとも４．８ｍｇ（約４００μＭ）、一態様では、少なくとも約５ｍｇ／ｍｌ（約４１７μＭ）、１０ｍｇ／ｍｌ（約８３３μＭ）、２０ｍｇ／ｍｌ（約１．７ｍＭ）、２５ｍｇ／ｍｌ（約２．１ｍＭ）、３０ｍｇ／ｍｌ（約２．５ｍＭ）、３５ｍｇ／ｍｌ（約２．９ｍＭ）、４０ｍｇ／ｍｌ（約３．３ｍＭ）、４５ｍｇ／ｍｌ（約３．７５ｍＭ）、５０ｍｇ／ｍｌ（約４．２ｍＭ）、５５ｍｇ／ｍｌ（約４．６ｍＭ）、６０ｍｇ／ｍｌ（約５．０ｍＭ）、６５ｍｇ／ｍｌ（約５．４ｍＭ）、７０ｍｇ／ｍｌ（約５．８ｍＭ）、７５ｍｇ／ｍｌ（約６．３ｍＭ）、１００ｍｇ／ｍｌ（約８．３３ｍＭ）、１５０ｍｇ／ｍｌ（約１２．５ｍＭ）、２００ｍｇ／ｍｌ（約１６．７ｍＭ）、２４０ｍｇ／ｍｌ（約２０ｍＭ）以上）で溶解性を保持する。高い溶解性を促進する１つの構造的特徴は、ドメイン抗体の比較的小さい大きさである。全長の従来の４鎖抗体、例えば、ＩｇＧは、約１５０ｋＤの大きさである。対照的に、４つのフレームワーク（ＦＷ）領域および３つのＣＤＲを含む一般構造を有するドメイン抗体は、約１２ｋＤ、すなわち、従来の抗体の１／１０未満の大きさを有する。同様に、ドメイン抗体は、ｓｃＦｖ分子（約２６ｋＤ）の約半分の大きさ、Ｆａｂ分子（約６０ｋＤ）の約５分の１の大きさである。ドメイン抗体を含有する本明細書に開示される構造の大きさは、例えば、約９０ｋＤ以下、８０ｋＤ以下、７０ｋＤ以下、６０ｋＤ以下、５０ｋＤ以下、４０ｋＤ以下、３０ｋＤ以下、２０ｋＤ以下、約１２ｋＤ、すなわち、単離されたドメイン抗体を含むまでの構造をはじめとする１００ｋＤ以下であり得る。
ドメイン抗体の溶解度は、主として、アミノ酸側鎖と周囲の溶媒との相互作用によって決定する。疎水性側鎖は、ポリペプチドの溶媒が相互作用する表面から離れて、ポリペプチド折り畳みとして内部に局在化される傾向がある。逆に、親水性残基は、ポリペプチドの溶媒が相互作用する表面に局在化される傾向がある。通常、分子が、水性環境に、より多くの親水性残基を露出するよう折り畳まるのを可能にする一次配列を有するポリペプチドは、表面に、より少ない親水性残基を露出するよう折り畳まるものよりも可溶性である。したがって、疎水性および親水性残基の配置および数は、溶解度の重要な決定因子である。ポリペプチド溶解度を決定するその他のパラメータとして、溶媒ｐＨ、温度およびイオン強度が挙げられる。一般的な方法では、ポリペプチドの溶解度は、溶液へのグリセロールの添加（例えば、約１０％ ｖ／ｖ）によって維持または増強され得る。
上記で論じられるように、通常、ヒトＶＨドメインよりも可溶性であるラクダの種のＶＨドメインでは変わる特定のアミノ酸残基が、ヒトＶＨドメインの保存された残基中で同定されている。これらとして、例えば、Ｇｌｙ４４（ラクダではＧｌｕ）、Ｌｅｕ４５（ラクダではＡｒｇ）およびＴｒｐ４７（ラクダではＧｌｙ）が挙げられる。ＶＨのアミノ酸残基１０３もまた、溶解度に関係しており、ＴｒｐからＡｒｇへの突然変異は、ＶＨ溶解度の増大を付与する傾向がある。
本明細書に示されるいくつかの態様では、ドメイン抗体は、ＤＰ４７生殖系列ＶＨ遺伝子セグメントまたはＤＰＫ９生殖系列Ｖκ遺伝子セグメントに基づいている。したがって、これらの生殖系列遺伝子セグメントは、特に、本明細書に記載される選択された構造的な位置で多様化されている場合には、高度に可溶性である特定の結合ドメイン抗体を産生できる。特に、一態様では、多様化されていない４つのフレームワーク領域は、得られるタンパク質の高い溶解度の一因となり得る。
既知の高い溶解度を有するものと配列同一性パーセントを共有するドメイン抗体もまた、高度に可溶性である傾向があるということが予想される。したがって、所与のドメイン抗体が、本明細書に列挙される高い溶解度を有するであろうと予測または認識する１つの手段として、ドメイン抗体の配列を、既知溶解度を有する１または複数のドメイン抗体と比較してもよい。したがって、ドメイン抗体が、高い結合親和性を有するが溶解度は未知と同定される場合には、そのアミノ酸配列の、高い溶解度を有するとわかっている１または複数の（一態様では、複数の）ドメイン抗体（例えば、本明細書に開示されるｄＡｂ配列）との比較によって、その溶解度の予測が可能となり得る。絶対的な予測因子ではないが、既知の高度に可溶性の配列に対して高度の類似性、例えば、９０〜９５％以上の類似性がある場合には、特に、親水性アミノ酸残基または溶媒界面で露出される可能性が高い残基に関して高度の類似性がある場合には、新規に同定された結合ポリペプチドが、既知の高度に可溶性の配列のものに類似した溶解度を有する可能性が高い。
分子モデリングソフトウェアを使用して、既知溶解度のポリペプチドのものと比較してポリペプチド配列の溶解度を予測してもよい。例えば、溶媒に曝露される表面での疎水性残基の置換または付加は、その位置で露出される疎水性が低い、またはさらに親水性の残基を有する既知溶解度の分子と比較して、ポリペプチドの相対的溶解度を低下させると予測される。同様に、このような位置での、より親水性の残基の置換または付加は、相対的溶解度を増大させると予測される。すなわち、既知溶解度を有するドメイン抗体構造と比較した、分子の表面に位置する親水性または疎水性残基の正味の数（または表面に露出される残基の全体的な疎水性もしくは親水性）の変化によって、ドメイン抗体の相対的溶解度を予測できる。
あるいは、またはこのような予測とともに、ポリペプチドを単純に濃縮することによって、ドメイン抗体の溶解度の限界を決定できる。
３．５．親和性決定
本明細書に記載される、単離されたドメイン抗体含有ポリペプチドは、一態様では、少なくとも約５００ｎＭ以下、一態様では、少なくとも約４００ｎＭ〜５０ｐＭ、３００ｎＭ〜５０ｐＭ、２００ｎＭ〜５０ｐＭ、さらなる態様では、少なくとも１００ｎＭ〜５０ｐＭ、７５ｎＭ〜５０ｐＭ、５０ｎＭ〜５０ｐＭ、２５ｎＭ〜５０ｐＭ、１０ｎＭ〜５０ｐＭ、５ｎＭ〜５０ｐＭ、１ｎＭ〜５０ｐＭ、９５０ｐＭ〜５０ｐＭ、９００ｐＭ〜５０ｐＭ、８５０ｐＭ〜５０ｐＭ、８００ｐＭ〜５０ｐＭ、７５０ｐＭ〜５０ｐＭ、７００ｐＭ〜５０ｐＭ、６５０ｐＭ〜５０ｐＭ、６００ｐＭ〜５０ｐＭ、５５０ｐＭ〜５０ｐＭ、５００ｐＭ〜５０ｐＭ、４５０ｐＭ〜５０ｐＭ、４００ｐＭ〜５０ｐＭ、３５０ｐＭ〜５０Ｍ、３００ｐＭ〜５０ｐＭ、２５０ｐＭ〜５０ｐＭ、２００ｐＭ〜５０ｐＭ、１５０ｐＭ〜５０ｐＭ、１００ｐＭ〜５０ｐＭ、９０ｐＭ〜５０ｐＭ、８０ｐＭ〜５０ｐＭ、７０ｐＭ〜５０ｐＭ、６０ｐＭ〜５０ｐＭまたはさらに、５０ｐＭ程度の親和性（解離定数、Ｋｄ＝Ｋｏｆｆ／Ｋｏｎ）を有する。
別の実施形態では、ドメイン抗体は、ＣＤ２８のＣＤ８０との結合を１ｐＭ〜１．５μＭの範囲の（１ｐＭおよび１．５μＭを含めて）ＩＣ５０；ＣＤ８０とのＣＤ２８結合の阻害のＩＣ５０で阻害する。ＩＣ５０は、１ｐＭ〜１μＭ、１ｐＭ〜９００ｎＭ、１ｐＭ〜８００ｎＭ、１ｐＭ〜７００ｎＭ、１ｐＭ〜６００ｎＭ、１ｐＭ〜５００ｎＭ、１ｐＭ〜４００ｎＭ、１ｐＭ〜３００ｎＭ、１ｐＭ〜２００ｎＭ、１ｐＭ〜１００ｎＭ、１ｐＭ〜５０ｎＭ、１ｐＭ〜１０ｎＭ、１ｐＭ〜１ｎＭ、１ｐＭ〜５００ｐＭ、１ｐＭ〜１００ｐＭ、１ｐＭ〜５０ｐＭ、１ｐＭ〜１０ｐＭまたは１ｐＭ〜５ｐＭの範囲であり得る。さらなる許容される範囲として、例えば、５０ｐＭ〜１μＭ、１００ｐＭ〜５００ｎＭ、１２５ｐＭ〜２５０ｎＭ、１５０ｐＭ〜２００ｎＭ、１５０ｐＭ〜１００ｎＭおよび２００ｐＭ〜５０ｎＭが挙げられる。
別の実施形態では、ドメイン抗体は、ＣＤ２８のＣＤ８６との結合を１ｐＭ〜１．５μＭの範囲（１ｐＭおよび１．５μＭを含めて）のＩＣ５０；ＣＤ８６とのＣＤ２８結合の阻害のＩＣ５０で阻害する。ＩＣ５０は、１ｐＭ〜１μＭ、１ｐＭ〜９００ｎＭ、１ｐＭ〜８００ｎＭ、１ｐＭ〜７００ｎＭ、１ｐＭ〜６００ｎＭ、１ｐＭ〜５００ｎＭ、１ｐＭ〜４００ｎＭ、１ｐＭ〜３００ｎＭ、１ｐＭ〜２００ｎＭ、１ｐＭ〜１００ｎＭ、１ｐＭ〜５０ｎＭ、１ｐＭ〜１０ｎＭ、１ｐＭ〜１ｎＭ、１ｐＭ〜５００ｐＭ、１ｐＭ〜１００ｐＭ、１ｐＭ〜５０ｐＭ、１ｐＭ〜１０ｐＭまたは１ｐＭ〜５ｐＭの範囲であり得る。さらなる許容される範囲として、例えば、５０ｐＭ〜１μＭ、１００ｐＭ〜５００ｎＭ、１２５ｐＭ〜２５０ｎＭ、１５０ｐＭ〜２００ｎＭ、１５０ｐＭ〜１００ｎＭおよび２００ｐＭ〜５０ｎＭが挙げられる。
ドメイン抗体の抗原結合親和性は、ＢＩＡｃｏｒｅシステム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、Ｎ．Ｊ．）を使用する表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって測定できることが好都合である。この方法では、抗原は、ＢＩＡｃｏｒｅチップと公知の濃度でカップリングされ、可変ドメインポリペプチドが導入される。可変ドメインポリペプチドと、固定化された抗原間の特異的結合が、チップマトリックス上のタンパク質濃度の増大およびＳＰＲシグナルの変化をもたらす。ＳＰＲシグナルの変化は、レゾナンスユニット（ＲＵ）として記録され、センサーグラムのＹ軸に沿って、時間に対してディスプレイされる。ベースラインシグナルは、チップ上を通過する溶媒単独（例えば、ＰＢＳ）を用いてとられる。ベースラインシグナルと、ドメイン抗体注入の完了後のシグナル間の正味の相違は、所与のサンプルの結合値を表す。解離速度（ｏｆｆ ｒａｔｅ）（Ｋｏｆｆ）、結合速度（ｏｎ ｒａｔｅ）（Ｋｏｎ）および解離速度（Ｋｄ）定数を測定するために、ＢＩＡｃｏｒｅ動力学的評価ソフトウェア（例えば、バージョン２．１）が使用される。
したがって、ＳＰＲを使用して、一価抗体調製物によって引き起こされるＣＤ２８のＣＤ８０またはＣＤ８６との結合の置換または阻害を測定することによって、ドメイン抗体調製物によるＣＤ８０またはＣＤ８６とのＣＤ２８結合の拮抗作用をモニタリングできる。ＳＰＲは、本明細書に記載される抗体調製物においてＦｃ領域を介して起こる二量体化のモニタリングにも使用でき、一態様では、二量体化がないことのモニタリングにも使用できる。
高親和性は、抗原の表面と、抗体または抗体断片のＣＤＲ間の相補性に応じて変わる。相補性は、標的の一部とＣＤＲ間のあり得る分子相互作用の種類および強度、例えば、可能性のあるイオン相互作用、ファンデルワールス引力、水素結合または起こり得るその他の相互作用によって決定される。ＣＤＲ３は、おそらくは、都合のよい表面相互作用のためのより多い機会を提供する、その全般的に大きな大きさのために、ＣＤＲ１および２よりも抗原結合相互作用の一因となる傾向がある（例えば、Padlan et al. (1994) Mol. Immunol. 31: 169-217; Chothia & Lesk (1987) J. Mol. Biol. 196: 904-917;およびChothia et al. (1985) J. Mol. Biol. 186: 651-663.参照)。高親和性は、可変ドメインおよび標的の構造と直接的に関連している高度の相補性を有するドメイン抗体／抗原対合を示す。
一態様では、ドメイン抗体は、別のドメイン抗体と連結して、各個々のドメイン抗体が、異なるコグネイト抗原と結合できるヘテロ二量体を形成する。各単量体が、異なる標的抗原と結合するヘテロ二量体としてドメイン抗体を融合することによって、例えば、それぞれの標的抗原を架橋できる二重特異性リガンドを製造できる。このような二重特異性リガンドを使用して、生物の身体における治療状況において相乗的に協同するサイトカインおよびその他の分子を標的としてもよい。したがって、２種以上のサイトカインと結合できる二重特異性抗体ヘテロ二量体を投与することを含む、２種以上のサイトカインの活性に相乗作用を与える方法が提供される。
本明細書に示されるドメイン抗体として、ＣＤ２８結合ドメイン抗体クローンおよび同様に標的抗原と高親和性で結合する、それらと実質的な配列類似性または同一性パーセントを有するクローンが挙げられる。本明細書において、「実質的な」配列類似性または同一性は、少なくとも７０％類似性または同一性である。
同一性または類似性のさらなる尺度は、高ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする能力である。したがって、ドメイン抗体をコードする第１の配列は、第１の配列が、高ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件（Sambrook et al., Molecular Cloning, Laboratory Manuel, Cold Spring, Harbor Laboratory press, New Yorkによって記載されるものなど）下で第２の配列（またはその補体）とハイブリダイズする場合には、第２のコード配列と実質的に類似している。「高ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」とは、約４５℃で６Ｘ ＳＳＣ中でのハイブリダイゼーションと、それに続く、６５℃で０．２Ｘ ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ中での１または複数回の洗浄を指す。「極めて高ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」とは、６５℃で、０．５Ｍリン酸ナトリウム、７％ ＳＤＳ中でのハイブリダイゼーションと、それに続く、６５℃で、０．２Ｘ ＳＳＣ、１％ ＳＤＳ中での１または複数回の洗浄を指す。
一実施形態では、ドメイン抗体として、下記を含む：
１ｈ−２３９−８５０（配列番号５８）
１ｈ−３５（配列番号５９）
１ｈ−３６（配列番号６０）
１ｈ−７９（配列番号６１）
１ｈ−８０（配列番号６２）
１ｈ−８３（配列番号６３）
１ｈ−１０８（配列番号６４）
１ｈ−２０３（配列番号６５）
１ｈ−２０７（配列番号６６）
１ｈ−２３８（配列番号６７）
１ｈ−２３９（配列番号６８）
１ｈ−１８−１（配列番号６９）
１ｈ−１８−２（配列番号７０）
１ｈ−１８−３（配列番号７１）
１ｈ−１８−４（配列番号７２）
１ｈ−１８−５（配列番号７３）
１ｈ−１８−６（配列番号７４）
１ｈ−２８−１（配列番号７５）
１ｈ−２８−２（配列番号７６）
１ｈ−３１（配列番号７７）
１ｈ−３２（配列番号７８）
１ｈ−３３（配列番号７９）
１ｈ−３４（配列番号８０）
１ｈ−３５（配列番号８１）
１ｈ−３５−１５（配列番号８２）
１ｈ−３５−２（配列番号８３）
１ｈ−３５−５（配列番号８４）
１ｈ−３５−７（配列番号８５）
１ｈ−３５−９（配列番号８６）
１ｈ−３６（配列番号８７）
１ｈ−３６−１（配列番号８８）
１ｈ−３６−２（配列番号８９）
１ｈ−３６−３（配列番号９０）
１ｈ−３６−４（配列番号９１）
１ｈ−３６−５（配列番号９２）
１ｈ−３６−６（配列番号９３）
１ｈ−３６−７（配列番号９４）
１ｈ−３８（配列番号９５）
１ｈ−３９（配列番号９６）
１ｈ−６９（配列番号９７）
１ｈ−７０（配列番号９８）
１ｈ−７１（配列番号９９）
１ｈ−７２（配列番号１００）
１ｈ−７３（配列番号１０１）
１ｈ−７４（配列番号１０２）
１ｈ−７５（配列番号１０３）
１ｈ−７６（配列番号１０４）
１ｈ−７７（配列番号１０５）
１ｈ−７８（配列番号１０６）
１ｈ−７９（配列番号１０７）
１ｈ−７９−１（配列番号１０８）
１ｈ−７９−１０（配列番号１０９）
１ｈ−７９−１１（配列番号１１０）
１ｈ−７９−１５（配列番号１１１）
１ｈ−７９−１５０５（配列番号１１２）
１ｈ−７９−１５１２（配列番号１１３）
１ｈ−７９−１５１９（配列番号１１４）
１ｈ−７９−１５２０（配列番号１１５）
１ｈ−７９−１６（配列番号１１６）
１ｈ−７９−１７（配列番号１１７）
１ｈ−７９−１８（配列番号１１８）
１ｈ−７９−１９（配列番号１１９）
１ｈ−７９−２（配列番号１２０）
１ｈ−７９−２０（配列番号１２１）
１ｈ−７９−２１（配列番号１２２）
１ｈ−７９−２２（配列番号１２３）
１ｈ−７９−２３（配列番号１２４）
１ｈ−７９−２４（配列番号１２５）
１ｈ−７９−２５（配列番号１２６）
１ｈ−７９−２６（配列番号１２７）
１ｈ−７９−２７（配列番号１２８）
１ｈ−７９−２８（配列番号１２９）
１ｈ−７９−２９（配列番号１３０）
１ｈ−７９−３（配列番号１３１）
１ｈ−７９−３０（配列番号１３２）
１ｈ−７９−３１（配列番号１３３）
１ｈ−７９−３２（配列番号１３４）
１ｈ−７９−４（配列番号１３５）
１ｈ−７９−５（配列番号１３６）
１ｈ−７９−６（配列番号１３７）
１ｈ−７９−７（配列番号１３８）
１ｈ−７９−８（配列番号１３９）
１ｈ−７９−８０１（配列番号１４０）
１ｈ−７９−８０２（配列番号１４１）
１ｈ−７９−８０３（配列番号１４２）
１ｈ−７９−８０４（配列番号１４３）
１ｈ−７９−８０５（配列番号１４４）
１ｈ−７９−８０６（配列番号１４５）
１ｈ−７９−８０７（配列番号１４６）
１ｈ−７９−８０８（配列番号１４７）
１ｈ−７９−８０９（配列番号１４８）
１ｈ−７９−８１０（配列番号１４９）
１ｈ−７９−８１１（配列番号１５０）
１ｈ−７９−８１２（配列番号１５１）
１ｈ−７９−８１３（配列番号１５２）
１ｈ−７９−８１４（配列番号１５３）
１ｈ−７９−８１５（配列番号１５４）
１ｈ−７９−９（配列番号１５５）
１ｈ−８０（配列番号１５６）
１ｈ−８０−１（配列番号１５７）
１ｈ−８０−１０（配列番号１５８）
１ｈ−８０−１１（配列番号１５９）
１ｈ−８０−１２（配列番号１６０）
１ｈ−８０−２（配列番号１６１）
１ｈ−８０−３（配列番号１６２）
１ｈ−８０−４（配列番号１６３）
１ｈ−８０−５（配列番号１６４）
１ｈ−８０−６（配列番号１６５）
１ｈ−８０−７（配列番号１６６）
１ｈ−８０−８（配列番号１６７）
１ｈ−８０−９（配列番号１６８）
１ｈ−８１（配列番号１６９）
１ｈ−８２（配列番号１７０）
１ｈ−８３（配列番号１７１）
１ｈ−８４（配列番号１７２）
１ｈ−８５（配列番号１７３）
１ｈ−８６（配列番号１７４）
１ｈ−８７（配列番号１７５）
１ｈ−８８（配列番号１７６）
１ｈ−８９（配列番号１７７）
１ｈ−９０（配列番号１７８）
１ｈ−１０７（配列番号１７９）
１ｈ−１０８（配列番号１８０）
１ｈ−１０８−１（配列番号１８１）
１ｈ−１０８−１０（配列番号１８２）
１ｈ−１０８−１１（配列番号１８３）
１ｈ−１０８−１２（配列番号１８４）
１ｈ−１０８−２（配列番号１８５）
１ｈ−１０８−３（配列番号１８６）
１ｈ−１０８−４（配列番号１８７）
１ｈ−１０８−５（配列番号１８８）
１ｈ−１０８−６（配列番号１８９）
１ｈ−１０８−７（配列番号１９０）
１ｈ−１０８−８（配列番号１９１）
１ｈ−１０８−９（配列番号１９２）
１ｈ−１０９（配列番号１９３）
１ｈ−１１０（配列番号１９４）
１ｈ−１１１（配列番号１９５）
１ｈ−１１６（配列番号１９６）
１ｈ−２００（配列番号１９７）
１ｈ−２０１（配列番号１９８）
１ｈ−２０２（配列番号１９９）
１ｈ−２０３（配列番号２００）
１ｈ−２０３−１（配列番号２０１）
１ｈ−２０３−２（配列番号２０２）
１ｈ−２０３−３（配列番号２０３）
１ｈ−２０４（配列番号２０４）
１ｈ−２０５（配列番号２０５）
１ｈ−２０７（配列番号２０６）
１ｈ−２０８（配列番号２０７）
１ｈ−２０９（配列番号２０８）
１ｈ−２１７（配列番号２０９）
１ｈ−２１８（配列番号２１０）
１ｈ−２１９（配列番号２１１）
１ｈ−２２０（配列番号２１２）
１ｈ−２２１（配列番号２１３）
１ｈ−２２３（配列番号２１４）
１ｈ−２２５（配列番号２１５）
１ｈ−２２７（配列番号２１６）
１ｈ−２２８（配列番号２１７）
１ｈ−２２９（配列番号２１８）
１ｈ−２３１（配列番号２１９）
１ｈ−２３２（配列番号２２０）
１ｈ−２３３（配列番号２２１）
１ｈ−２３４（配列番号２２２）
１ｈ−２３５（配列番号２２３）
１ｈ−２３６（配列番号２２４）
１ｈ−２３７（配列番号２２５）
１ｈ−２３８（配列番号２２６）
１ｈ−２３９（配列番号２２７）
１ｈ−２３９−８（配列番号２２８）
１ｈ−２３９−８０４（配列番号２２９）
１ｈ−２３９−８０７（配列番号２３０）
１ｈ−２３９−８０９（配列番号２３１）
１ｈ−２３９−８１５（配列番号２３２）
１ｈ−２３９−８１６（配列番号２３３）
１ｈ−２３９−８１７（配列番号２３４）
１ｈ−２３９−８１９（配列番号２３５）
１ｈ−２３９−８２４（配列番号２３６）
１ｈ−２３９−８２８（配列番号２３７）
１ｈ−２３９−８２９（配列番号２３８）
１ｈ−２３９−８３２（配列番号２３９）
１ｈ−２３９−８３３（配列番号２４０）
１ｈ−２３９−８３７（配列番号２４１）
１ｈ−２３９−８３８（配列番号２４２）
１ｈ−２３９−８４０（配列番号２４３）
１ｈ−２３９−８４７（配列番号２４４）
１ｈ−２３９−８４９（配列番号２４５）
１ｈ−２３９−８５０（配列番号２４６）
１ｈ−２３９−８５１（配列番号２４７）
１ｈ−２３９−８５６（配列番号２４８）
１ｈ−２３９−８５７（配列番号２４９）
１ｈ−２３９−８５９（配列番号２５０）
１ｈ−２３９−８６１（配列番号２５１）
１ｈ−２３９−８６２（配列番号２５２）
１ｈ−２３９−８６３（配列番号２５３）
１ｈ−２３９−８６４（配列番号２５４）
１ｈ−２３９−８６９（配列番号２５５）
１ｈ−２３９−８７０（配列番号２５６）
１ｈ−２３９−８７１（配列番号２５７）
１ｈ−２３９−８７２（配列番号２５８）
１ｈ−２３９−８７３（配列番号２５９）
１ｈ−２３９−８７４（配列番号２６０）
１ｈ−２３９−８７５（配列番号２６１）
１ｈ−２３９−８７６（配列番号２６２）
１ｈ−２３９−８７７（配列番号２６３）
１ｈ−２３９−８７９（配列番号２６４）
１ｈ−２３９−８８０（配列番号２６５）
１ｈ−２３９−８８１（配列番号２６６）
１ｈ−２３９−８８２（配列番号２６７）
１ｈ−２３９−８８３（配列番号２６８）
１ｈ−２３９−８８５（配列番号２６９）
１ｈ−２３９−８８６（配列番号２７０）
１ｈ−２３９−８８７（配列番号４７２）
１ｈ−２３９−８８８（配列番号４７３）
１ｈ−２３９−８８９（配列番号４７４）
１ｈ−２３９−８９０（配列番号４７５）
１ｈ−２３９−８９１（配列番号４７６）
１ｈ−２３９−８９２（配列番号４７７）
１ｈ−２３９−８９３（配列番号４７８）
１ｈ−２３９−８９４（配列番号４７９）
１ｈ−２３９−８９５（配列番号４８０）
１ｈ−２３９−８９６（配列番号４８１）
１ｈ−２３９−８９７（配列番号４８２）
１ｈ−２３９−８９８（配列番号４８３）
１ｈ−２３９−９（配列番号２７１）
１ｈ−１１２（配列番号３９７）
１ｈ−９９−２３７（配列番号２７２）
１ｈ−９９−２３８（配列番号２７３）
１ｈ−３７（配列番号２７４）
１ｈ−９３（配列番号２７５）
１ｈ−９９（配列番号２７６）
１ｈ−４−１（配列番号２７７）
１ｈ−４−２（配列番号２７８）
１ｈ−４−３（配列番号２７９）
１ｈ−４−４（配列番号２８０）
１ｈ−２９（配列番号２８１）
１ｈ−３０（配列番号２８２）
１ｈ−３７（配列番号２８３）
１ｈ−４０（配列番号２８４）
１ｈ−９１（配列番号２８５）
１ｈ−９２（配列番号２８６）
１ｈ−９３（配列番号２８７）
１ｈ−９３−１（配列番号２８８）
１ｈ−９３−２（配列番号２８９）
１ｈ−９３−２０１（配列番号２９０）
１ｈ−９３−２０４（配列番号２９１）
１ｈ−９４（配列番号２９２）
１ｈ−９５（配列番号２９３）
１ｈ−９６（配列番号２９４）
１ｈ−９７（配列番号２９５）
１ｈ−９８（配列番号２９６）
１ｈ−９９（配列番号２９７）
１ｈ−９９−１（配列番号２９８）
１ｈ−９９−２（配列番号２９９）
１ｈ−９９−２０１（配列番号３００）
１ｈ−９９−２０２（配列番号３０１）
１ｈ−９９−２０３（配列番号３０２）
１ｈ−９９−２０４（配列番号３０３）
１ｈ−９９−２０５（配列番号３０４）
１ｈ−９９−２０６（配列番号３０５）
１ｈ−９９−２０７（配列番号３０６）
１ｈ−９９−２０８（配列番号３０７）
１ｈ−９９−２０９（配列番号３０８）
１ｈ−９９−２１０（配列番号３０９）
１ｈ−９９−２１１（配列番号３１０）
１ｈ−９９−２１１２（配列番号３１１）
１ｈ−９９−２１１３（配列番号３１２）
１ｈ−９９−２１１４（配列番号３１３）
１ｈ−９９−２１１５（配列番号３１４）
１ｈ−９９−２１１６（配列番号３１５）
１ｈ−９９−２１２（配列番号３１６）
１ｈ−９９−２１３（配列番号３１７）
１ｈ−９９−２１４（配列番号６４０）
１ｈ−９９−２１５（配列番号３１８）
１ｈ−９９−２１６（配列番号３１９）
１ｈ−９９−２１７（配列番号３２０）
１ｈ−９９−２１８（配列番号３２１）
１ｈ−９９−２１９（配列番号３２２）
１ｈ−９９−２２０（配列番号３２３）
１ｈ−９９−２２１（配列番号３２４）
１ｈ−９９−２２２（配列番号３２５）
１ｈ−９９−２２３（配列番号３２６）
１ｈ−９９−２２４（配列番号３２７）
１ｈ−９９−２２５（配列番号３２８）
１ｈ−９９−２２６（配列番号３２９）
１ｈ−９９−２２７（配列番号３３０）
１ｈ−９９−２２８（配列番号３３１）
１ｈ−９９−２２９（配列番号３３２）
１ｈ−９９−２３０（配列番号３３３）
１ｈ−９９−２３１（配列番号３３４）
１ｈ−９９−２３２（配列番号３３５）
１ｈ−９９−２３３（配列番号３３６）
１ｈ−９９−２３４（配列番号３３７）
１ｈ−９９−２３５（配列番号３３８）
１ｈ−９９−２３６（配列番号３３９）
１ｈ−９９−２３７（配列番号３４０）
１ｈ−９９−２３８（配列番号３４１）
１ｈ−９９−２４１（配列番号３４２）
１ｈ−９９−２４３（配列番号３４３）
１ｈ−９９−２４４（配列番号３４４）
１ｈ−９９−２４５（配列番号３４５）
１ｈ−９９−２４６（配列番号３４６）
１ｈ−９９−２４７（配列番号３４７）
１ｈ−９９−２４８（配列番号３４８）
１ｈ−９９−２４９（配列番号３４９）
１ｈ−９９−２５０（配列番号３５０）
１ｈ−９９−２５１（配列番号３５１）
１ｈ−９９−２５２（配列番号３５２）
１ｈ−９９−２５３（配列番号３５３）
１ｈ−９９−２５４（配列番号３５４）
１ｈ−９９−２５５（配列番号３５５）
１ｈ−９９−２５６（配列番号３５６）
１ｈ−９９−２５７（配列番号３５７）
１ｈ−９９−２５８（配列番号３５８）
１ｈ−９９−２５９（配列番号３５９）
１ｈ−９９−２６０（配列番号３６０）
１ｈ−９９−２６１（配列番号３６１）
１ｈ−９９−２６３（配列番号３６２）
１ｈ−９９−２６４（配列番号３６３）
１ｈ−９９−２６５（配列番号３６４）
１ｈ−９９−２６６（配列番号３６５）
１ｈ−９９−２６７（配列番号３６６）
１ｈ−９９−２６８（配列番号３６７）
１ｈ−９９−２６９（配列番号３６８）
１ｈ−９９−２７０（配列番号３６９）
１ｈ−９９−２７５（配列番号３７０）
１ｈ−９９−２７６（配列番号３７１）
１ｈ−９９−２７７（配列番号３７２）
１ｈ−９９−２７８（配列番号３７３）
１ｈ−９９−２９７（配列番号３７４）
１ｈ−９９−６（配列番号３７５）
１ｈ−９９−１１（配列番号３７６）
１ｈ−９９−１３（配列番号３７７）
１ｈ−９９−１４（配列番号３７８）
１ｈ−９９−１５（配列番号３７９）
１ｈ−１００（配列番号３８０）
１ｈ−１０１（配列番号３８１）
１ｈ−１０２（配列番号３８２）
１ｈ−１０３（配列番号３８３）
１ｈ−１０４（配列番号３８４）
１ｈ−１０５（配列番号３８５）
１ｈ−１０６（配列番号３８６）
１ｈ−１１３（配列番号３８７）
１ｈ−１１４（配列番号３８８）
１ｈ−１１５（配列番号３８９）
１ｈ−１１７（配列番号３９０）
１ｈ−１１８（配列番号３９１）
１ｈ−１１９（配列番号３９２）
１ｈ−２１２（配列番号３９３）
１ｈ−２１２−１（配列番号３９４）
１ｈ−２１３（配列番号３９５）
１ｈ−２３０（配列番号３９６）
１ｈ−９９−２６２（配列番号３９８）
１ｈ−２３９−８９１０１（配列番号５３２）
１ｈ−２３９−８９１０２（配列番号５３３）
１ｈ−２３９−８９１０３（配列番号５３４）
１ｈ−２３９−８９１０４（配列番号５３５）
１ｈ−２３９−８９１（Ｑ３Ｃ）（配列番号５３６）
１ｈ−２３９−８９１（Ｓ９Ｃ）（配列番号５３７）
１ｈ−２３９−８９１（Ｒ１８Ｃ）（配列番号５３８）
１ｈ−２３９−８９１（Ｇ４１Ｃ）（配列番号５３９）
１ｈ−２３９−８９１（Ｋ４２Ｃ）（配列番号５４０）
１ｈ−２３９−８９１（Ｋ４５Ｃ）（配列番号５４１）
１ｈ−２３９−８９１（Ｓ６０Ｃ）（配列番号５４２）
１ｈ−２３９−８９１（Ｄ７０Ｃ）（配列番号５４３）
１ｈ−２３９−８９１（Ｔ７４Ｃ）（配列番号５４４）
１ｈ−２３９−８９１（Ｑ７９Ｃ）（配列番号５４５）
１ｈ−２３９−８９１（Ｋ１０３Ｃ）（配列番号５４６）
１ｈ−２３９−８９２０１（配列番号５４７）
１ｈ−２３９−８９２０２（配列番号５４８）
１ｈ−２３９−８９２０３（配列番号５４９）
１ｈ−２３９−８９２０４（配列番号５５０）
１ｈ−２３９−８９２０５（配列番号５５１）
１ｈ−２３９−８９２０６（配列番号５５２）
１ｈ−２３９−８９２０７（配列番号５５３）
１ｈ−２３９−８９２０８（配列番号５５４）
１ｈ−２３９−８９２０９（配列番号５５５）
１ｈ−２３９−８９２１０（配列番号５５６）
１ｈ−２３９−８９２１１（配列番号５５７）
１ｈ−２３９−８９２１２（配列番号５５８）
１ｈ−２３９−８９２１３（配列番号５５９）
１ｈ−２３９−８９２１４（配列番号５６０）
１ｈ−２３９−８９２１５（配列番号５６１）
１ｈ−２３９−８９２１６（配列番号５６２）
１ｈ−２３９−８９２１７（配列番号５６３）
１ｈ−２３９−８９２２７（配列番号５６４）
１ｈ−２３９−８９２２８（配列番号５６５）
１ｈ−２３９−８９２２９（配列番号５６６）
１ｈ−２３９−８９２３０（配列番号５６７）
１ｈ−２３９−８９２３１（配列番号５６８）
１ｈ−２３９−８９２３２（配列番号５６９）
１ｈ−２３９−８９２３３（配列番号５７０）
１ｈ−２３９−８９２３４（配列番号５７１）
１ｈ−２３９−８９２１８（配列番号５７２）
１ｈ−２３９−８９２１９（配列番号５７３）
１ｈ−２３９−８９２２０（配列番号５７４）
１ｈ−２３９−８９２２１（配列番号５７５）
１ｈ−２３９−８９２２２（配列番号５７６）
１ｈ−２３９−８９２２３（配列番号５７７）
１ｈ−２３９−８９２２４（配列番号５７８）
１ｈ−２３９−８９２２５（配列番号５７９）
１ｈ−２３９−８９２２６（配列番号５８０）
１ｈ−２３９−８９２３５（配列番号５８１）
１ｈ−２３９−８９２３６（配列番号５８２）
１ｈ−２３９−８９２３７（配列番号５８３）
１ｈ−２３９−８９２３８（配列番号５８４）
１ｈ−２３９−８９２３９（配列番号５８５）
１ｈ−２３９−８９２４０（配列番号５８６）
１ｈ−２３９−８９２４１（配列番号５８７）
１ｈ−２３９−８９２４２（配列番号５８８）
１ｈ−２３９−８９２４３（配列番号５８９）
１ｈ−２３９−８９２４４（配列番号５９０）
１ｈ−２３９−８９２４５（配列番号５９１）
１ｈ−２３９−８９２４６（配列番号５９２）
１ｈ−２３９−８９２４７（配列番号５９３）
１ｈ−２３９−８９２４８（配列番号５９４）
１ｈ−２３９−８９２４９（配列番号５９５）
１ｈ−２３９−８９２５０（配列番号５９６）
１ｈ−９９−２３７０１（配列番号５９７）
１ｈ−９９−２３７０２（配列番号５９８）
１ｈ−９９−２３７０３（配列番号５９９）
１ｈ−９９−２３７０４（配列番号６００）
１ｈ−９９−２３７０５（配列番号６０１）
１ｈ−９９−２３７０６（配列番号６０２）
１ｈ−９９−２３７０７（配列番号６０３）
１ｈ−９９−２３７０８（配列番号６０４）
１ｈ−９９−２３７０９（配列番号６０５）
１ｈ−９９−２３７１０（配列番号６０６）
１ｈ−９９−２３７１１（配列番号６０７）
１ｈ−９９−２３７１２（配列番号６０８）
１ｈ−９９−２３７１３（配列番号６０９）
１ｈ−９９−２３７１４（配列番号６１０）
１ｈ−９９−２３７１５（配列番号６１１）
１ｈ−９９−２３７１６（配列番号６１２）
１ｈ−９９−２３７１７（配列番号６１３）
１ｈ−９９−２３７１８（配列番号６１４）
１ｈ−９９−２３７１９（配列番号６１５）
１ｈ−９９−２３７２０（配列番号６１６）
１ｈ−９９−２３７２１（配列番号６１７）
１ｈ−９９−２３７２２（配列番号６１８）
１ｈ−９９−２３７２３（配列番号６１９）
１ｈ−９９−２３７２４（配列番号６２０）
１ｈ−９９−２３７２５（配列番号６２１）
１ｈ−９９−２３７２６（配列番号６２２）
１ｈ−９９−２３７２７（配列番号６２３）
１ｈ−９９−２３７２８（配列番号６２４）
１ｈ−９９−２３７２９（配列番号６２５）
１ｈ−９９−２３７３０（配列番号６２６）
１ｈ−９９−２３７３１（配列番号６２７）
１ｈ−９９−２３７３２（配列番号６２８）
１ｈ−９９−２３７３３（配列番号６２９）
１ｈ−９９−２３７３４（配列番号６３０）
１ｈ−９９−２３７３５（配列番号６３１）
１ｈ−９９−２３７３６（配列番号６３２）
１ｈ−９９−２３７３８（配列番号６３３）
１ｈ−９９−２３７３９（配列番号６３４）
１ｈ−９９−２３７３７（配列番号６３５）。
一実施形態では、ドメイン抗体は、以下のＣＤＲのうちの１または複数を含み得る：
１ｈ−２３９−８５０ ＣＤＲ１（配列番号４８４）
１ｈ−２３９−８５０ ＣＤＲ２（配列番号４８５）
１ｈ−２３９−８５０ ＣＤＲ３（配列番号４８６）
１ｈ−３５ ＣＤＲ１（配列番号４８７）
１ｈ−３５ ＣＤＲ２（配列番号４８８）
１ｈ−３５ ＣＤＲ３（配列番号４８９）
１ｈ−３６ ＣＤＲ１（配列番号４９０）
１ｈ−３６ ＣＤＲ２（配列番号４９１）
１ｈ−３６ ＣＤＲ３（配列番号４９２）
１ｈ−７９ ＣＤＲ１（配列番号４９３）
１ｈ−７９ ＣＤＲ２（配列番号４９４）
１ｈ−７９ ＣＤＲ３（配列番号４９５）
１ｈ−８０ ＣＤＲ１（配列番号４９６）
１ｈ−８０ ＣＤＲ２（配列番号４９７）
１ｈ−８０ ＣＤＲ３（配列番号４９８）
１ｈ−８３ ＣＤＲ１（配列番号４９９）
１ｈ−８３ ＣＤＲ２（配列番号５００）
１ｈ−８３ ＣＤＲ３（配列番号５０１）
１ｈ−１０８ ＣＤＲ１（配列番号５０２）
１ｈ−１０８ ＣＤＲ２（配列番号５０３）
１ｈ−１０８ ＣＤＲ３（配列番号５０４）
１ｈ−２０３ ＣＤＲ１（配列番号５０５）
１ｈ−２０３ ＣＤＲ２（配列番号５０６）
１ｈ−２０３ ＣＤＲ３（配列番号５０７）
１ｈ−２０７ ＣＤＲ１（配列番号５０８）
１ｈ−２０７ ＣＤＲ２（配列番号５０９）
１ｈ−２０７ ＣＤＲ３（配列番号５１０）
１ｈ−２３８ ＣＤＲ１（配列番号５１１）
１ｈ−２３８ ＣＤＲ２（配列番号５１２）
１ｈ−２３８ ＣＤＲ３（配列番号５１３）
１ｈ−２３９ ＣＤＲ１（配列番号５１４）
１ｈ−２３９ ＣＤＲ２（配列番号５１５）
１ｈ−２３９ ＣＤＲ３（配列番号５１６）
１ｈ−９９−２３７ ＣＤＲ１（配列番号５１７）
１ｈ−９９−２３７ ＣＤＲ２（配列番号５１８）
１ｈ−９９−２３７ ＣＤＲ３（配列番号５１９）
１ｈ−９９−２３８ ＣＤＲ１（配列番号５２０）
１ｈ−９９−２３８ ＣＤＲ２（配列番号５２１）
１ｈ−９９−２３８ ＣＤＲ３（配列番号５２２）
１ｈ−３７ ＣＤＲ１（配列番号５２３）
１ｈ−３７ ＣＤＲ２（配列番号５２４）
１ｈ−３７ ＣＤＲ３（配列番号５２５）
１ｈ−９３ ＣＤＲ１（配列番号５２６）
１ｈ−９３ ＣＤＲ２（配列番号５２７）
１ｈ−９３ ＣＤＲ３（配列番号５２８）
１ｈ−９９ ＣＤＲ１（配列番号５２９）
１ｈ−９９ ＣＤＲ２（配列番号５３０）、
１ｈ−９９ ＣＤＲ３（配列番号５３１）、
１ｈ−２３９−８９１ ＣＤＲ１（配列番号６３６）、
１ｈ−２３９−８９１ ＣＤＲ２（配列番号６３７）、および
１ｈ−２３９−８９１ ＣＤＲ３（配列番号６３８）。
４．ＣＤ２８活性のアッセイ
例示的実施形態では、本明細書に記載されるドメイン抗体は、ＣＤ２８と結合するが、ＣＤ２８シグナル伝達を実質的に刺激しない。ＣＤ２８経路の活性化は、経路の活性に対する所与のドメイン抗体の効果を評価するために測定され得るいくつかの異なる結果を表す。しかし、本明細書に記載されるドメイン抗体のアンタゴニストまたはアゴニスト機能の評価のために、以下のＣＤ２８アッセイのうちの少なくとも１種を使用できる。
一実施形態では、Ｔ細胞の活性化が測定される。アッセイでは、ヒトＣＤ３陽性Ｔ細胞が、ＣＤ８０またはＣＤ８６のいずれかを発現する抗ＣＤ３およびトランスフェクトされたＣＨＯ細胞を用いて刺激される。これは、Ｔ細胞の増殖をもたらし、ドメイン抗体が増殖反応を阻止するのでＣＤ２８依存性である。
別の実施形態では、Ｔ細胞増殖の誘導およびサイトカイン分泌の誘導が測定される。アッセイは、抗ＣＤ２８ｍＡｂ ９．３でのヒトＣＤ３陽性Ｔ細胞の刺激を含む(Gibson, et al. (1996) J. Biol. Chem., 271: 7079-7083)。これは、Ｔ細胞受容体媒介性シグナル伝達のアップレギュレーションおよびサイトカインの分泌をもたらし、ｍＡｂ９．３が増殖反応を阻止するのでＣＤ２８依存性である。測定され得る分泌されるサイトカインとして、それだけには限らないが、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２ ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７、ＩＬ−２１、ＩＬ−２２、ＩＬ−２４、ＴＧＦβ、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γが挙げられる。このようなサイトカインのうちの１または複数が、本明細書に示される開示にしたがって検出および／または測定され得る。
本明細書において別の場所で示されるように、ＣＤ２８活性のアッセイはまた、ＣＴＬＡ４活性の評価を含み得る。特に、本開示に従うドメイン抗体は、Ｔ細胞受容体媒介性シグナル伝達の阻害、Ｔ細胞増殖の阻害およびサイトカイン分泌の阻害をはじめとするＴ細胞機能のＣＴＬＡ−４媒介性阻害を阻害しない。
本明細書における開示に基づいて、本明細書に示されるドメイン抗体は、複数の機能および活性を有し得、したがって、複数の個別のアッセイによってアッセイされ得るということは理解されよう。本明細書において別の場所に詳細に示されるように、ドメイン抗体は、複数の決定的な特徴（例えば、中でも、ＣＤ２８結合親和性、ＣＤＲドメイン同一性およびアミノ酸配列）を有し、したがって、各個別のドメイン抗体は、複数の方法で、複数のパラメータによって特徴づけされ得る。したがって、このようなドメイン抗体各々の特徴づけは、単独で、またはドメイン抗体活性および／またはＣＤ２８結合特性とともに、ドメイン抗体の独特な同定する特徴を提供できる。
５．ドメイン抗体のＰＥＧ化
また、本明細書において、半減期が増大しており、一態様では、分解に対して耐性でもある、非ＰＥＧ化ドメイン抗体と比較して活性（例えば、結合親和性）の喪失を伴わないＰＥＧ化されたドメイン抗体も提供される。
タンパク質分子の部位特異的およびランダムＰＥＧ化の両方が、当技術分野で公知である（例えば、Zalipsky and Lee, Poly(ethylene glycol) Chemistry: Biotechnical and Biomedical Applications (1992) pp 347-370, Plenum, NY; Goodson and Katre (1990) Bio/Technology, 8: 343; Hershfield et al. (1991) PNAS 88: 7185参照）。より具体的には、抗体分子のランダムＰＥＧ化は、リシン残基およびチオール化誘導体で記載されている(Ling and Mattiasson (1983) Immunol. Methods 59: 327; Wilkinson et al. (1987) Immunol. Letters, 15: 17; Kitamura et al. (1991) Cancer Res. 51: 4310; Delgado et al. (1996) Br. J. Cancer, 73: 175; Pedley et al. (1994) Br. J. Cancer, 70: 1126)。
したがって、この態様によるドメイン抗体は、当技術分野で公知の方法を使用して、本明細書に包含される、半減期の増大および分解耐性特性を達成するのに有用なポリマー分子（一態様では、ＰＥＧ）とカップリングされ得る。使用できるポリマー部分は、合成であっても、天然に存在するものであってもよく、それだけには限らないが、直鎖または分枝鎖ポリアルキレン、ポリアルケニレンもしくはポリオキシアルキレンポリマー、またはホモ−もしくはヘテロ多糖などの分岐もしくは非分岐多糖が挙げられる。使用され得る合成ポリマーの例として、直鎖または分枝鎖ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）、ポリ（プロピレングリコール）またはポリ（ビニルアルコール）およびその誘導体または置換形態が挙げられる。有用な置換ポリマーとして、メトキシ（ポリエチレングリコール）を含めた置換ＰＥＧが挙げられる。ＰＥＧに加えて、またはＰＥＧの代わりに本明細書において使用され得る天然に存在するポリマー部分として、ラクトース、アミロース、デキストランまたはグリコーゲンならびに当業者によって認識されるその誘導体が挙げられる。本明細書に示されるポリマー分子の誘導体化形態として、例えば、本明細書に記載されるドメイン抗体のアミノ酸残基との相互作用を可能にする、その中に存在するさらなる部分または反応性基を有する誘導体が挙げられる。このような誘導体として、Ｎ−ヒドロキシルスクシンイミド（ＮＨＳ）活性エステル、プロピオン酸スクシンイミジルポリマーおよびスルフヒドリル選択的反応物質、例えば、マレイミド、ビニルスルホンおよびチオールが挙げられる。誘導体化されたポリマーとして、それだけには限らないが、次式を有するＰＥＧポリマーが挙げられる：ＰＥＧ−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−ＣＯ２−ＮＨＳ；ＰＥＧ−Ｏ−ＣＨ２−ＮＨＳ；ＰＥＧ−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２−ＣＯ２−ＮＨＳ；ＰＥＧ−Ｓ−ＣＨ２ＣＨ２−ＣＯ−ＮＨＳ；ＰＥＧ−Ｏ２ＣＮＨ−ＣＨ（Ｒ）−ＣＯ２−ＮＨＳ；ＰＥＧ−ＮＨＣＯ−ＣＨ２ＣＨ２−ＣＯ−ＮＨＳ；およびＰＥＧ−Ｏ−ＣＨ２−ＣＯ２−ＮＨＳ；ここで、Ｒは、（ＣＨ２）４）ＮＨＣＯ２（ｍＰＥＧ）である。本明細書に示されるような有用なＰＥＧポリマーは、直鎖分子であっても、分岐していてもよく、これでは、複数のＰＥＧ部分が、単一ポリマー中に存在する。有用なＰＥＧ誘導体として、それだけには限らないが、以下に例示されるｍＰＥＧ−ＭＡＬ、ｍＰＥＧ２−ＭＡＬ、ｍＰＥＧ−（ＭＡＬ）２、マルチアームＰＥＧ、ｍＰＥＧ−ＳＰＡ、ｍＰＥＧ２−ＮＨＳおよびｍＰＥＧ２−（ＭＡＬ）２が挙げられる：
Figure 0006058833
反応性基（例えば、ＭＡＬ、ＮＨＳ、ＳＰＡ、ＶＳまたはチオール）は、ＰＥＧポリマーと直接結合していてもよく、リンカー分子を介してＰＥＧと結合していてもよい。
本明細書に示されるような有用なポリマーの大きさは、約５００Ｄａ〜６０ｋＤの間、例えば、約１０００Ｄａ〜６０ｋＤ、１０ｋＤ〜６０ｋＤ、２０ｋＤ〜６０ｋＤ、３０ｋＤ〜６０ｋＤ、４０ｋＤ〜６０ｋＤおよび５０ｋＤ〜６０ｋＤまでの範囲であり得る。本明細書において使用されるポリマー、特に、ＰＥＧは、直鎖ポリマーであり得、または分岐コンホメーションを有し得る。分子量およびコンホメーションの組合せに応じて、本明細書に示されるような有用なポリマー分子は、ドメイン抗体に結合されると、約２４〜５００ｋＤの間の平均の水力学的サイズを有する分子を生じる。本明細書において使用されるポリマー分子の水力学的サイズとは、水溶液を通る分子の拡散に基づいた分子（例えば、タンパク質分子）の見かけの大きさを指す。溶液を通るタンパク質の拡散または動きを処理して、タンパク質の見かけの大きさを導くことができ、これでは、大きさは、タンパク質粒子のストークス半径または水力学的半径によって与えられる。タンパク質の「水力学的サイズ」は、質量および形状（コンホメーション）の両方に応じて変わり、その結果、同一分子量を有する２種のタンパク質が、タンパク質の全体的なコンホメーションに基づいて異なる水力学的サイズを有し得る。ＰＥＧが連結しているドメイン抗体、例えば、本明細書に記載されるドメイン抗体の水力学的サイズは、約２４ｋＤ〜５００ｋＤ；３０〜５００ｋＤ；４０〜５００ｋＤ；５０〜５００ｋＤ；１００〜５００ｋＤ；１５０〜５００ｋＤ；２００〜５００ｋＤ；２５０〜５００ｋＤ；３００〜５００ｋＤ；３５０〜５００ｋＤ；４００〜５００ｋＤおよび４５０〜５００ｋＤの範囲であり得る。例示的実施形態では、本明細書に記載されるＰＥＧ化されたドメイン抗体の水力学的サイズは、約３０〜４０ｋＤ；７０〜８０ｋＤまたは２００〜３００ｋＤである。したがって、ドメイン抗体と結合しているポリマー分子の大きさは、所望の適用に応じて変えてもよい。例えば、ＰＥＧ化されたドメイン抗体が、循環から出て、末梢組織に入るよう意図される場合は、結合しているポリマーの大きさを、血流からの血管外漏出を容易にするよう小さく維持することが望ましい。あるいは、ＰＥＧ化されたドメイン抗体を、循環中に、より長期間とどまらせることが望まれる場合には、より高分子量のポリマーを使用してもよい（例えば、３０〜６０ｋＤポリマー）。
本明細書に示されるように有用なポリマー（ＰＥＧ）分子は、当技術分野で周知の方法を使用してドメイン抗体と結合できる。ＰＥＧまたはその他のポリマー部分の、ドメイン抗体との結合における第１のステップは、求電子物質含有官能基によるＰＥＧポリマーのヒドロキシル末端基の置換である。特に、ＰＥＧポリマーは、ドメイン抗体中に存在するシステインまたはリシン残基のいずれかと結合される。システインおよびリシン残基は、天然に存在していてもよく、またはドメイン抗体分子に操作してもよい。例えば、システイン残基は、ドメイン抗体のＣ末端に組換えによって操作してもよく、またはドメイン抗体中の特定の溶媒が接近可能な位置の残基を、システインまたはリシンで置換してもよい。一実施形態では、ＰＥＧ部分は、ドメイン抗体のＣ末端のヒンジ領域中に存在するシステイン残基と結合している。
別の実施形態では、ＰＥＧ部分またはその他のポリマーは、本明細書に示されるドメイン抗体のＮ末端に天然に存在するか、本明細書に示されるドメイン抗体のＮ末端に操作されたシステインまたはリシン残基と結合している。いっそうさらなる実施形態では、ＰＥＧ部分またはその他のポリマーは、本明細書に示されるドメイン抗体と、ドメイン抗体のＣおよび／またはＮ末端から少なくとも２残基離れている（例えば、内部へ）システインまたはリシン残基（天然に存在するか、操作された）で結合している。
一実施形態では、ＰＥＧポリマー（単数または複数）は、フレームワーク領域（ＦＷ）中に存在する１個または複数のシステインまたはリシン残基およびドメイン抗体の１つまたは複数の異種ＣＤＲと結合している。ＣＤＲおよびフレームワーク領域（例えば、ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３およびＦＷ１〜ＦＷ４）は、免疫学的に注目されるタンパク質の配列のＫａｂａｔデータベースにおいて(Kabat et al. (1991) Sequences of Immunological Interest, 5th ed. U.S. Dept. Health & Human Services, Washington, D.C.)定義されるドメイン抗体の領域である。一実施形態では、ＰＥＧポリマーは、ＶＨフレームワークセグメントＤＰ４７またはＶｋフレームワークセグメントＤＰＫ９中のシステインまたはリシン残基と連結している。本明細書に開示されるＰＥＧと連結され得るＤＰ４７のシステインおよび／またはリシン残基として、配列番号６４１の位置２２または９６のシステインおよび位置４３、６５、７６または９８のリシンが挙げられる。本明細書に開示されるＰＥＧと連結され得るＤＰＫ９のシステインおよび／またはリシン残基として、配列番号６４３の位置２３または８８のシステイン残基および位置３９、４２、４５、１０３または１０７のリシン残基が挙げられる（配列番号６４３のＤＰＫ９配列は、９５アミノ酸長である；しかし、残基１０３および１０７は、ＤＰＫ９配列と融合される場合にＪ遺伝子セグメントによってコードされる配列によって提供されるということは当技術分野では理解される）。さらに、ＶＨ標準フレームワーク領域ＤＰ３８またはＤＰ４５では、特定のシステインまたはリシン残基がＰＥＧと連結され得る。
さらに、天然に存在するシステインまたはリシン残基ではないドメイン抗体中の特定の溶媒が接近可能な部位を、ＰＥＧポリマーの結合のために、システインまたはリシンに突然変異させてもよい。任意の所与のドメイン抗体中の溶媒が接近可能な残基は、ドメイン抗体の結晶構造の分析などの当技術分野で公知の方法を使用して決定できる。例えば、ＶＨ ｄＡｂ ＨＥＬ４（配列番号３９９；ニワトリ卵白リゾチームと結合するドメイン抗体）の解析された結晶構造を使用して、残基Ｇｌｎ−１３、Ｐｒｏ−１４、Ｇｌｙ−１５、Ｐｒｏ−４１、Ｇｌｙ−４２、Ｌｙｓ−４３、Ａｓｐ−６２、Ｌｙｓ−６５、Ａｒｇ−８７、Ａｌａ−８８、Ｇｌｕ−８９、Ｇｌｎ−１１２、Ｌｅｕ−１１５、Ｔｈｒ−１１７、Ｓｅｒ−１１９およびＳｅｒ−１２０が、溶媒が接近可能であると同定されており、本明細書に開示されるものは、ＰＥＧポリマーの結合のためのシステインまたはリシン残基への突然変異の魅力的な候補である。さらに、Ｖｋダミードメイン抗体（配列番号４００）の解析された結晶構造を使用して、残基Ｖａｌ−１５、Ｐｒｏ−４０、Ｇｌｙ−４１、Ｓｅｒ−５６、Ｇｌｙ−５７、Ｓｅｒ−６０、Ｐｒｏ−８０、Ｇｌｕ−８１、Ｇｌｎ−１００、Ｌｙｓ−１０７およびＡｒｇ−１０８が、溶媒が接近可能であると同定されており、本明細書に開示されるものは、ＰＥＧポリマーの結合のための、システインまたはリシン残基への突然変異のための魅力的な候補である。本明細書に開示される一実施形態では、ＰＥＧポリマーは、複数の溶媒が接近可能なシステインまたはリシン残基と、またはシステインもしくはリシン残基へ突然変異されている溶媒が接近可能な残基と連結している。あるいは、特定のドメイン抗体が、１個の溶媒が接近可能なシステインまたはリシン（またはシステインまたはリシンへ改変された残基）のみを有する場合、または特定の溶媒が接近可能な残基が、ＰＥＧ化のためにいくつかのこのような残基の中から選択される場合のいずれかに、１個の溶媒が接近可能な残基のみが、ＰＥＧと連結している。
ＨＥＬ４の一次アミノ酸配列（配列番号３９９）：
Figure 0006058833
Ｖｋダミーの一次アミノ酸配列（配列番号４００）：
Figure 0006058833
本明細書に開示されるいくつかのＰＥＧ結合スキームは、Ｎｅｋｔａｒ社（ＳａｎＣａｒｌｏｓ、ＣＡ）によって提供される。例えば、ＰＥＧまたはその他のポリマーの、リシン残基との結合が望まれる場合には、プロピオン酸スクシンイミジルなどのＮ−ヒドロキシルスクシンイミドで誘導体化されているＰＥＧポリマーの活性エステルを使用してもよい。システイン残基との結合が意図される場合には、マレイミド、ビニルスルホンまたはチオールなどのスルフヒドリル選択的試薬を用いて誘導体化されているＰＥＧポリマーを使用してもよい。本明細書に開示されるものとして使用してもよい、ＰＥＧ化抗体を作製できるＰＥＧ誘導体の特定の実施形態のその他の例は、Ｎｅｋｔａｒカタログ（ｎｅｋｔａｒ．ｃｏｍのワールドワイドウェブで入手可能）に見出すことができる。さらに、いくつかの誘導体化された形態のＰＥＧを本明細書に開示されるように使用して、ＰＥＧポリマーの、ドメイン抗体との結合を促進できる。本明細書に開示されるＰＥＧ誘導体として、それだけには限らないが、ＰＥＧ−スクシンイミジルスクシネート、ウレタン連結ＰＥＧ、ＰＥＧフェニルカルボナート、ＰＥＧスクシンイミジルカルボナート、ＰＥＧ−カルボキシメチルアジド、ジメチルマレイン酸無水物ＰＥＧ、ＰＥＧジチオカルボナート誘導体、ＰＥＧ−トレシレート（ｔｒｅｓｙｌａｔｅｓ）［２，２，２−トリフルオロエタンソルホナート（ｔｒｉｆｌｕｏｒｏｅｔｈａｎｅｓｏｌｆｏｎａｔｅｓ）］、ｍＰＥＧイミドエステルおよびZalipsky and Lee, (1992)［「Use of functionalized poly(ethylene glycol)s for modification of peptides」in Poly(Ethylene Glycol）Chemistry: Biotechnical and Biomedical Applications, J. Milton Harris, Ed., Plenum Press, NY］に記載されるその他のものが挙げられる。
本明細書に開示される一実施形態では、ドメイン抗体組成物は、ドメイン抗体およびＰＥＧポリマーを含み、これでは、ＰＥＧポリマー対ドメイン抗体の比は、少なくとも０．２５：１モル比である。さらなる実施形態では、ＰＥＧポリマー対ドメイン抗体のモル比は、０．３３：１またはそれ以上である。いっそうさらなる実施形態では、ＰＥＧポリマー対ドメイン抗体のモル比は、０．５：１またはそれ以上である。
６．ドメイン抗体の改変
６．１．標準配列の多様化
いくつかの既知主鎖コンホメーションまたは、一態様では、単一の既知主鎖コンホメーションを選択した後、本明細書に開示されるリガンドまたは本明細書において使用するためのライブラリーは、構造的および／または機能的多様性を有するレパートリーを作製するよう分子の結合部位を変更することによって構築できる。これは、変異体が、それらが、その構造において、および／またはその機能において十分な多様性を有し、その結果、それらがさまざまな活性を提供できるよう作製されることを意味する。
所望の多様性は、通常、１つまたは複数の部位の選択された分子を変更することによって作製される。変更される位置は、無作為に選択されてもよく、または一態様では、選択される。次いで、変動は、常在のアミノ酸が、天然または合成の任意のアミノ酸またはその類似体によって置換され、極めて多数の変異体を製造する際のランダム化によって、または常在するアミノ酸を、１つまたは複数のアミノ酸の定義されたサブセットで置換し、より限定された数の変異体を製造することのいずれかによって達成され得る。
このような多様性を導入するための種々の方法が、報告されている。エラープローンＰＣＲ(Hawkins et al. (1992) J. Mol. Biol., 226: 889)、化学的突然変異誘発(Deng et al. (1994) J. Biol. Chem.，269: 9533)または細菌変異誘発株(Low et al. (1996) J. Mol. Biol., 260: 359)を使用して、分子をコードする遺伝子にランダム突然変異を導入できる。選択された位置を突然変異する方法はまた、当技術分野で周知であり、ミスマッチなオリゴヌクレオチドまたは縮重オリゴヌクレオチドの使用を含み、ＰＣＲの使用を含むか含まない。例えば、抗原結合ループに突然変異をターゲッティングすることによっていくつかの合成抗体ライブラリーが作製されている。ヒトテタヌストキソイド結合性ＦａｂのＨ３領域がランダム化されて、さまざまな新規結合特異性が作製されている(Barbas et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 4457)。ランダムまたはセミランダムＨ３およびＬ３領域が、生殖系列Ｖ遺伝子セグメントに付加されて、突然変異を受けていないフレームワーク領域を有する大きなライブラリーが製造されている(Hoogenboom & Winter (1992) J. Mol. Biol., 227: 381; Barbas et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 4457; Nissim et al. (1994) EMBO J., 13: 692; Griffiths et al. (1994) EMBO J., 13: 3245; De Kruif et al. (1995) J. Mol. Biol., 248: 97)。このような多様化は、その他の抗原結合ループの一部またはすべてを含むよう広げられている(Crameri et al. (1996) Nature Med., 2: 100; Riechmann et al. (1995) Bio/Technology, 13: 475; Morphosys, ＷＯ９７／０８３２０、前掲)。
ループランダム化は、Ｈ３単独について、およそ１０１５を超える構造を、その他の５種のループについて同様に多数の変異体を作製する可能性を有するので、現在の形質転換技術を使用して、または細胞不含系を使用することによって、すべてのあり得る組合せに相当するライブラリーを製造することは実現可能ではない。例えば、この設計のライブラリーの可能性のある多様性の唯一の画分である今日までに構築された最大のライブラリーの１種では、６×１０１０種の異なる抗体が作製された(Griffiths et al. (1994) 前掲)。
一実施形態では、分子の所望の機能の作製または修飾に直接的に関与する残基のみが多様化される。多数の分子について、機能は、標的と結合することであり、したがって、分子の全体的なパッキングにとって、または選択された主鎖コンホメーションを維持するのに重要である残基の変更を避けながら、多様性は標的結合部位中に濃縮されるべきである。
６．１．１．抗体ドメインに適用するときの標準配列の多様化
本明細書に開示されるリガンドの場合には、標的の結合部位は、抗原結合部位であることが最も多い。したがって、一態様では、抗原結合部位中の残基のみが変更されている、抗体リガンドの、または抗体リガンドの構築のためのライブラリー。これらの残基は、ヒト抗体レパートリーにおいて極めて多様であり、高分解能抗体／抗原複合体において接触することがわかっている。例えば、Ｌ２では、位置５０および５３は、天然に存在する抗体において多様であり、抗原と接触すると観察されることがわかっている。対照的に、本発明において開示されるような使用のためのライブラリーにおいて多様化される２個と比較して、従来のアプローチは、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．(Kabat et al., 1991, Sequences of Immunological Interest, 5th ed. U.S. Dept. Health & Human Services, Washington, D.C.)によって定義される、対応する相補性決定領域（ＣＤＲ１）中のすべての残基、およそ７個の残基を多様化してきた。これは、さまざまな抗原結合特異性を作製するのに必要な機能的多様性の点で大きな改善を表す。
実際は、抗体多様性は、２つのプロセス：ナイーブ一次レパートリー（いわゆる、生殖系列および接合部多様性）を作製するための生殖系列Ｖ、ＤおよびＪ遺伝子セグメントの体細胞組換えと、得られた再編成されたＶ遺伝子の体細胞超変異の結果である。ヒト抗体配列の分析によって、一次レパートリーの多様性は、抗原結合部位の中心に集中しているのに対し、体細胞超変異は、多様性を、一次レパートリーにおいて高度に保存されている抗原結合部位の周辺の領域に広げることが示されている(Tomlinson et al. (1996) J. Mol. Biol., 256: 813参照)。この相補性はおそらくは、配列空間を検索するための効率的な戦略として発達し、抗体に特有であるようであるが、その他のポリペプチドレパートリーに容易に適用できる。変更される残基は、標的の結合部位を形成するもののサブセットである。標的結合部位中の残基の異なる（重複を含む）サブセットは、必要に応じて、選択の間の種々の段階で多様である。
抗体レパートリーの場合には、最初の「ナイーブ」レパートリーが作製され、抗原結合部位中の残基のすべてでなく一部が多様である。これに関連して、本明細書において、用語「ナイーブ」とは、所定の標的を有さない抗体分子を指す。これらの分子は、その免疫系がまだ、さまざまな抗原刺激によって曝露されていない胎児および新生児個体の場合のように、免疫多様化を受けていない個体の免疫グロブリン遺伝子によってコードされるものと類似している。次いで、さまざまな抗原またはエピトープに対してこのレパートリーを選択する。必要な場合には、次いで、さらなる多様性を、最初のレパートリー中の多様な領域の外側に導入できる。この成熟したレパートリーは、改変された機能、特異性または親和性について選択できる。
抗原結合部位中の残基の一部またはすべてが変更されているリガンドまたはリガンドのナイーブライブラリーの構築のための、結合ドメインの２つの異なるナイーブレパートリーが本明細書に開示される。「一次」ライブラリーは、天然一次レパートリーを摸倣し、生殖系列Ｖ遺伝子セグメントにおいて多様である（生殖系列多様性）または組換え法の際に多様な（接合部多様性）抗原結合部位の中心の残基に限定された多様性を有する。多様である残基として、それだけには限らないが、Ｈ５０、Ｈ５２、Ｈ５２ａ、Ｈ５３、Ｈ５５、Ｈ５６、Ｈ５８、Ｈ９５、Ｈ９６、Ｈ９７、Ｈ９８、Ｌ５０、Ｌ５３、Ｌ９１、Ｌ９２、Ｌ９３、Ｌ９４およびＬ９６が挙げられる。「体細胞」ライブラリーでは、多様性は、組換え法の際に多様であるか（接合部多様性）、高度に体細胞突然変異されている残基に限定される）。多様である残基として、それだけには限らないが：Ｈ３１、Ｈ３３、Ｈ３５、Ｈ９５、Ｈ９６、Ｈ９７、Ｈ９８、Ｌ３０、Ｌ３１、Ｌ３２、Ｌ３４およびＬ９６が挙げられる。これらのライブラリーにおいて多様化に適しているとして上記で列挙されるすべての残基が、１種または複数の抗体−抗原複合体で接触することがわかっている。両ライブラリーにおいて、抗原結合部位中の残基のすべてが変更されないので、そうすることが望まれる場合には、残存する残基を変えることによる選択の際にさらなる多様性が組み込まれる。任意のこれらの残基（または抗原結合部位を含むさらなる残基）の任意のサブセットを、抗原結合部位の最初のおよび／またはその後の多様化に使用できるということは当業者には明らかであろう。
本明細書に開示されるような使用のためのライブラリーの構築では、選択された位置の多様化は、通常、いくつかのあり得るアミノ酸（全部で２０種またはそのサブセット）を、その位置に組み込むことができるようポリペプチドの配列を指定するコード配列を変更することによって、核酸レベルで達成される。ＩＵＰＡＣ命名法を使用すると、最も万能なコドンは、ＮＮＫであり、これは、すべてのアミノ酸ならびにＴＡＧ停止コドンをコードする。ＮＮＫコドンは、一態様では、必要な多様性を導入するために使用される。ＮＮＮコドンをはじめとする、同じ結果を達成するその他のコドンも有用であり、これは、さらなる停止コドンＴＧＡおよびＴＡＡの生成につながる。
ヒト抗体の抗原結合部位における側鎖多様性の特徴は、特定のアミノ酸残基に有利に働く明白な傾向である。ＶＨ、ＶκおよびＶλ領域各々中の１０の最も多様な位置のアミノ酸組成物をまとめると、側鎖多様性の７６％超が、７個の種々の残基のみに由来し、これらは、セリン（２４％）、チロシン（１４％）、アスパラギン（１１％）、グリシン（９％）、アラニン（７％）、アスパラギン酸（６％）およびトレオニン（６％）である。主鎖適応性を提供し得る親水性残基および小さい残基に向かうこの傾向は、おそらくは、さまざまな抗原またはエピトープと結合する傾向がある表面の発達を反映するものであり、一次レパートリーにおいて抗体の無差別性が必要なことを説明するのに役立ち得る。
アミノ酸のこの分布を摸倣することが好ましいので、変更される位置のアミノ酸の分布は、一態様では、抗体の抗原結合部位で見られるものを摸倣する。さまざまな標的抗原に対する特定のポリペプチド（単にドメイン抗体だけではない）の選択を可能にする、アミノ酸の置換におけるこのような傾向は、任意のポリペプチドレパートリーに容易に適用される。変更される位置のアミノ酸分布を偏らせる種々の方法があり（トリヌクレオチド突然変異誘発の使用をはじめとして、ＷＯ９７／０８３２０参照）、その中の１つの有利な方法は、合成の容易さのために、従来の縮重コドンの使用である。縮重コドンのすべての組合せによってコードされるアミノ酸プロフィール（各位置で等割合の一重、二重、三重および四重縮重を含む）を、天然アミノ酸使用と比較することによって、最も代表的なコドンを算出することが可能である。コドン（ＡＧＴ）（ＡＧＣ）Ｔ、（ＡＧＴ）（ＡＧＣ）Ｃおよび（ＡＧＴ）（ＡＧＣ）（ＣＴ）は、所望のアミノ酸プロフィールに最も近いものであり：それらは、２２％セリンおよび１１％チロシン、アスパラギン、グリシン、アラニン、アスパラギン酸、トレオニンおよびシステインをコードし、一態様では、これらのコドンが、ライブラリーの構築において使用される。
６．２．二重特異性リガンド
また、各々がそれぞれの特性を有するドメイン抗体を含む二重特異性リガンドも本明細書において提供され、すなわち、二重特異性リガンドによって結合される第１および第２のエピトープは、一態様では、異なっているか、または同一エピトープの２コピーであり、エピトープは、それぞれの可変ドメインによって結合している。一実施形態では、「二重特異性リガンド」とは、本明細書において定義されるような、第１のドメイン抗体および第２のドメイン抗体を含むリガンドを指し、これでは、可変領域は、単一特異的免疫グロブリンによっては通常結合されない、２種の異なる抗原または同一抗原上の２種のエピトープと結合できる。別の実施形態では、「二重特異性リガンド」とは、本明細書に定義されるような、ドメイン抗体および免疫グロブリン可変ドメインを含むリガンドを指し、これでは、可変領域は、単一特異的免疫グロブリンによっては通常結合されない、２種の異なる抗原または同一抗原上の２種のエピトープと結合できる。例えば、２種のエピトープは、同一ハプテン上にあり得るが、同一エピトープではなく、単一特異的リガンドによって結合されるのに十分なほど隣接していない。本明細書に開示される二重特異性リガンドは、種々の特異性を有し、同一特異性を有する互いに相補的な可変ドメイン対を含まない可変ドメインからなる。二重特異性リガンドは、天然に存在するものであっても、合成であってもよい、ポリペプチド、タンパク質または核酸であり得る、またはその一部であり得る。
有利なことに、二重または多重特異性リガンドは、標的分子と結合できる第１のドメインと、リガンドの半減期を延長する分子または基と結合できる第２のドメインとを含み得る。例えば、分子または基は、ＨＳＡまたは細胞基質タンパク質などのかさ高い物質であり得る。本明細書において、語句「リガンドの半減期を延長する分子または基」とは、本明細書に記載される二重特異性リガンドによって結合されると、動物に投与された場合に、分子または基と結合していないリガンドと比較して、このような二重特異性リガンドのインビボ半減期を増大する分子または化学基を指す。リガンドの半減期を延長する分子または基の例が、本明細書において以下に記載される。一実施形態では、閉構造多重特異性リガンドは、半減期増強分子または基の置換時にのみ標的分子と結合し得る。したがって、例えば、閉構造多重特異性リガンドが、ＨＳＡなどのかさ高い分子によって被験体の血流中の循環中に維持される。標的分子に遭遇すると、閉構造多重特異性リガンドの結合ドメイン間の競合が、ＨＳＡの置換および標的の結合をもたらす。半減期を増大する分子は、上記でさらに詳細に論じられる。
本明細書に開示される第２の立体配置の一実施形態では、可変ドメインは、第１および／または第２の抗原またはエピトープに対する抗体に由来する。一実施形態では、可変ドメインは、単一可変抗体ドメインのレパートリーに由来する。一実施例では、レパートリーは、動物または合成レパートリーでは作製されないレパートリーである。別の実施例では、単一可変ドメインは、動物免疫化によって単離されない（少なくとも一部は）。したがって、単一ドメインは、ナイーブライブラリーから単離され得る。
別の態様では、第１のエピトープ結合特異性を有する第１のエピトープ結合ドメインと、第２のエピトープ結合特異性を有する非相補的な第２のエピトープ結合ドメインとを含む多重特異的リガンドが本明細書に開示される。第１および第２の結合特異性は、同一であっても異なっていてもよい。
さらなる態様では、第１のエピトープ結合特異性を有する第１のエピトープ結合ドメインと、第２のエピトープ結合特異性を有する非相補的な第２のエピトープ結合ドメインとを含む閉構造多重特異的リガンドが本明細書に開示され、これでは、第１および第２の結合特異性は、エピトープ結合について競合し得、その結果、閉構造多重特異的リガンドは、両エピトープと同時に結合できない。
本明細書に開示される任意の態様に従うリガンド、ならびにこのようなリガンドの構築において有用なドメイン抗体単量体は、約３００ｎＭ〜１ｐＭまたは５ｐＭ（すなわち、３×１０−７〜５×１０−１２Ｍ）、一態様では、表面プラズモン共鳴によって決定される、約５０ｎＭ〜２０ｐＭまたは５ｎＭ〜２００ｐＭまたは１ｎＭ〜１００ｐＭ、１×１０−７Ｍ以下、１×１０−８Ｍ以下、１×１０−９Ｍ以下、１×１０−１０Ｍ以下、１×１０−１１Ｍ以下のＫｄおよび／または約５×１０−１〜１×１０−７Ｓ−１、一態様では、約１×１０−２〜１×１０−６Ｓ−１または５×１０−３〜１×１０−５Ｓ−１または５×１０−１Ｓ−１以下または１×１０−２Ｓ−１以下または１×１０−３Ｓ−１以下または１×１０−４Ｓ−１以下または１×１０−５Ｓ−１以下または１×１０−６Ｓ−１以下のＫｏｆｆ速度定数でその同族標的（単数または複数）から解離し得ることが有利である。Ｋｄ速度定数は、Ｋｏｆｆ／Ｋｏｎとして定義される。二重特異性リガンドに関するさらなる詳細は、ＷＯ０３／００２６０９、ＷＯ０４／００３０１９およびＷＯ０４／０５８８２１に見出すことができる。
さらに、血清アルブミン（ＳＡ）と、１ｎＭ〜５００μＭ（すなわち、１×１０−９ Ｍ〜５×１０−４Ｍ）、一態様では、１００ｎＭ〜１０μＭのＫｄで結合するドメイン抗体単量体が提供される（またはこのようなドメイン抗体を含む二重特異性リガンド）。一態様では、第１の抗ＳＡドメイン抗体と、別の標的に対する第２のドメイン抗体とを含む二重特異性リガンドについて、第２のｄＡｂの、その標的に対する親和性（例えば、例えば、ＢｉａＣｏｒｅを使用する表面プラズモン共鳴によって測定されるＫｄおよび／またはＫｏｆｆ）は、ＳＡに対する第１のドメイン抗体の親和性の１〜１００，０００倍（一態様では、１００〜１００，０００、さらなる態様では、１０００〜１０００００または１００００〜１０００００倍）である。例えば、第１のドメイン抗体は、約１０μＭの親和性でＳＡと結合するが、第２のドメイン抗体は、約１００ｐＭの親和性でその標的と結合する。例示的実施形態では、血清アルブミンは、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）である。
一実施形態では、第１のドメイン抗体（またはドメイン抗体単量体）は、およそ約５０ｎＭ、一態様では、約７０ｎＭ、別の態様では、約１００、１５０または２００ｎＭのＫｄでＳＡ（例えば、ＨＳＡ）と結合する。
また、前記の態様に従って前記のドメイン抗体単量体の二量体、三量体およびポリマーが提供される。
ドメイン抗体単量体、二量体および三量体を含めた本明細書に開示されるリガンドは、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインの一方または両方、場合によりヒンジ領域を含む抗体Ｆｃ領域に連結され得る。例えば、単一の核酸配列としてＦｃ領域と連結されているリガンドをコードするベクターを使用して、このようなポリペプチドを調製してもよい。あるいは、本明細書に開示されるリガンドは、Ｆｃドメインを含まなくてもよい。
さらなる態様では、本明細書に定義される少なくとも二重または多重特異性のリガンドをコードする１種または複数の核酸分子が提供される。一実施形態では、リガンドは、閉構造リガンドである。別の実施形態では、開放コンホメーションリガンドである。多重特異性リガンドは、単一核酸分子にコードされ得；あるいは、各エピトープ結合ドメインは、別個の核酸分子によってコードされ得る。リガンドが、単一核酸分子によってコードされる場合には、ドメインは、融合ポリペプチドとして発現される場合も、別個に発現され、その後、例えば、化学連結剤を使用して一緒に連結される場合もある。別個の核酸から発現されたリガンドは、適当な手段によって一緒に連結される。
核酸は、発現時にポリペプチドを宿主細胞から輸送するためのシグナル配列をさらにコードし得、発現時に糸状バクテリオファージ粒子の表面成分（または選抜ディスプレイ系のその他の成分）と融合され得る。細菌発現および／またはファージまたはファージミドディスプレイにおいて使用され得るリーダー配列として、ｐｅｌＢ、ｓｔＩＩ、ｏｍｐＡ、ｐｈｏＡ、ｂｌａ、ｏｍｐＴおよびｐｅｌＡが挙げられる。
本明細書に開示される第２の立体配置のさらなる態様では、核酸を含むベクターを含む。
なおさらなる態様では、ベクターでトランスフェクトされた宿主細胞が提供される。
このようなベクターからの発現は、例えば、選択のためにバクテリオファージ粒子の表面、エピトープ結合ドメイン上に産生するよう構成され得る。これによって、ディスプレイされたドメインの選択、したがって、本明細書に開示される方法を使用して「多重特異性リガンド」の選択が可能となる。
６．２．１．「二重特異性リガンド」の構造
上記のように、抗体は、少なくとも１つの重鎖および軽鎖可変ドメイン、少なくとも２つの重鎖可変ドメインまたは少なくとも２つの軽鎖可変ドメインを含む、抗体または断片（Ｆａｂ、Ｆｖ、ジスルフィド結合しているＦｖ、ｓｃＦｖ、ダイアボディー）として本明細書において定義される。抗体は、抗体を天然に産生する任意の種に少なくとも部分的に由来し得る、または血清、Ｂ細胞、ハイブリドーマ、トランスフェクトーマ、酵母または細菌から単離されるかどうかにかかわらず、組換えＤＮＡ技術によって作製され得る）。
一実施形態では、二重特異性リガンドは、抗体の少なくとも１つの単一重鎖可変ドメインおよび抗体の１つの単一軽鎖可変ドメイン、または２つの単一重鎖もしくは軽鎖可変ドメインを含む。例えば、リガンドは、ＶＨ／ＶＬ対、ＶＨドメインの対またはＶＬドメインの対を含み得る。
このようなリガンドの第１および第２の可変ドメインは、同一ポリペプチド鎖上にあり得る。あるいは、それらは別個のポリペプチド鎖上にあってもよい。それらが同一ポリペプチド鎖上にある場合には、それらは、上記のペプチド配列であり得るリンカーによって連結され得る。
第１および第２の可変ドメインは、共有結合によって結合していても、非共有結合によって結合していてもよい。それらが共有結合によって結合している場合には、共有結合は、ジスルフィド結合であり得る。
可変ドメインが、例えば、本明細書に記載されるファージディスプレイ技術を使用して選択されるＶ遺伝子レパートリーから選択される場合には、これらの可変ドメインは、ユニバーサルフレームワーク領域を含み、その結果、それらは、本明細書に定義される特異的一般的リガンドによって認識され得る。ユニバーサルフレームワーク、一般的リガンドなどの使用は、ＷＯ９９／２０７４９に記載されている。
Ｖ遺伝子レパートリーが使用される場合には、ポリペプチド配列の変動は、一態様では、可変ドメインの構造的ループ内に位置する。可変ドメインのポリペプチド配列は、ＤＮＡシャッフリングによって、または突然変異によってのいずれかで、各可変ドメインのその相補的対との相互作用を増強するよう変更され得る。ＤＮＡシャッフリングは、当技術分野で公知であり、例えば、Stemmer (1994) Nature 370: 389-391および米国特許第６，２９７，０５３号によって教示されており、その両方とも引用により本明細書の一部とする。突然変異誘発のその他の方法は、当業者に周知である。
一実施形態では、「二重特異性リガンド」は、一本鎖Ｆｖ断片である。代替実施形態では、「二重特異性リガンド」は、Ｆａｂフォーマットからなる。
本明細書に開示されるさらなる態様は、少なくとも、本明細書に定義される「二重特異性リガンド」をコードする核酸を提供する。
当業者であれば、態様に応じて、抗原またはエピトープの両方が同一抗体分子と同時に結合し得ることを理解されよう。あるいは、それらは、同一抗体分子との結合について競合し得る。例えば、両エピトープが同時に結合している場合には、二重特異性リガンドの両可変ドメインは、その標的エピトープと独立に結合できる。ドメインが競合する場合には、一方の可変ドメインは、その標的と結合できるが、他方の可変ドメインがその同族標的と結合するのと同時には結合できず；または第１の可変ドメインはその標的と結合できるが、第２の可変ドメインがその同族標的と結合するのと同時には結合できない。
可変領域は、標的抗原またはエピトープに対する抗体に由来し得る。あるいは、それらは、糸状バクテリオファージの表面上に発現されるものなどの単一抗体ドメインのレパートリーに由来し得る。選択は、以下に記載されるように実施してよい。
一般に、本明細書に開示される能力に必要な核酸分子およびベクター構築物は、Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, USAなどの標準実験室マニュアルに示されるように構築および操作され得る。
本明細書に開示されるように有用な核酸の操作は、通常、組換えベクターで実施する。
したがって、本明細書に開示されるさらなる態様は、少なくとも、本明細書に定義される「二重特異性リガンド」をコードする核酸を含むベクターを提供する。
本明細書において、ベクターとは、異種ＤＮＡを、その発現および／または複製のために細胞に導入するために使用される個別の要素を指す。このようなベクターを選択または構築し、続いて、使用する方法は、当業者に周知である。細菌プラスミド、バクテリオファージ、人工染色体およびエピソームベクターをはじめとする多数のベクターが、公的に入手可能である。このようなベクターは、簡易クローニングおよび突然変異誘発のために使用してもよく；あるいは、遺伝子発現ベクターが使用される。本明細書に開示される有用なベクターは、所望の大きさ、一般に、０．２５キロベース（ｋｂ）から４０ｋｂ以上の長さのポリペプチドコード配列に対応するよう選択され得る。適した宿主細胞が、インビトロクローニング操作の後、ベクターを用いて形質転換される。各ベクターは、通常、クローニング（または「ポリリンカー」）部位、複製起点および少なくとも１種の選択マーカー遺伝子を含む種々の機能的成分を含む。所与のベクターが、発現ベクターである場合には、以下のうちの１または複数をさらに有する：各々、本明細書に開示されるリガンドをコードする遺伝子と作動可能に連結するよう、クローニング部位の近くに位置する、エンハンサーエレメント、プロモーター、転写終結およびシグナル配列。
クローニングおよび発現ベクターの両方とも、通常、ベクターが、１または複数の選択された宿主細胞において複製するのを可能にする核酸配列を含有する。通常、クローニングベクターでは、この配列は、ベクターが、宿主染色体ＤＮＡと無関係に複製するのを可能にするものであり、複製起点または自立複製配列を含む。このような配列は、さまざまな細菌、酵母およびウイルスについて周知である。プラスミドｐＢＲ３２２に由来する複製起点は、ほとんどのグラム陰性菌に適しており、２ミクロンのプラスミド起源が酵母に適しており、種々のウイルス起源（例えば、ＳＶ４０、アデノウイルス）は、哺乳類細胞においてベクターをクローニングするのに有用である。通常、複製起点は、哺乳類発現ベクターが、ＣＯＳ細胞などの、高レベルのＤＮＡを複製できる哺乳類細胞において使用される限り、哺乳類発現ベクターには必要ではない。
有利には、クローニングまたは発現ベクターはまた、選択マーカーとも呼ばれる、選択遺伝子も含有し得る。この遺伝子は、選択的培養培地で増殖される形質転換宿主細胞の生存または成長に必要なタンパク質をコードする。したがって、選択遺伝子を含有するベクターで形質転換されていない宿主細胞は、培養培地で生存しない。通常の選択遺伝子は、抗生物質およびその他の毒素、例えば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキサートまたはテトラサイクリンに対する耐性を付与し、栄養要求性欠乏を補完し、または増殖培地中で入手できない重大な栄養素を供給するタンパク質をコードする。
６．２．２．単一可変ドメインを組み合わせること
本明細書に開示されるように有用なドメインは、上記に例示される方法を使用して選択されると、共有結合および非共有結合法を含めた、当技術分野で公知のさまざまな方法によって組み合わせられ得る。
方法は、例えば、ｓｃＦｖ分子に関連した、記載されるようなポリペプチドリンカーの使用を含む(Bird et al., (1988) Science 242: 423-426)。適したリンカーの考察は、Bird et al., Science 242: 423-426; Hudson et al., (1999) J. Immunol. Methods 231: 177-189; Hudson et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 85: 5879-5883に提供されている。リンカーは、一態様では、可動性であり、２つの単一ドメインが相互作用するのを可能にする。１つのリンカーの例は、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎリンカー（ここで、ｎ＝１〜８、例えば、２、３、４、５または７である）がある。あまり可動性でない、ダイアボディーにおいて使用されるリンカーも使用してよい(Holliger et al., (1993) PNAS (USA) 90: 6444-6448)。
一実施形態では、使用されるリンカーは、免疫グロブリンヒンジ領域ではない。
可変ドメインは、リンカー以外の方法を使用して組み合わせてもよい。例えば、天然に存在する、または操作されたシステイン残基によって提供されるジスルフィド橋の使用を利用して(Reiter et al., (1994) Protein Eng. 7: 697-704)、または相互作用の「適合」したがって、安定性を改善するために可変ドメイン間の界面をリモデリングすることによって(Ridgeway et al., (1996) Protein Eng. 7: 617-621; Zhu et al., (1997) Protein Science 6: 781-788)、ＶＨ−ＶＨ、ＶＬ−ＶＬまたはＶＨ−ＶＬ二量体を安定化させることができる。
免疫グロブリンの可変ドメイン、特に、抗体ＶＨドメインを結合または安定化するその他の技術も必要に応じて使用できる。
本明細書に開示されるように、二重特異性リガンドは、溶液中で「閉鎖」コンホメーションであり得る。「閉鎖」立体配置は、２つのドメイン（例えば、ＶＨおよびＶＬ）が結合している形態で存在するもの、例えば、抗体結合部位を形成する、結合しているＶＨ−ＶＬ対のものである。例えば、ｓｃＦｖは、ＶＨおよびＶＬドメインを連結するために使用されるリンカーの配置に応じて閉コンホメーションであり得る。これが、ドメインが結合するのを可能にするのに十分に可動性である場合、または結合している位置でそれらを堅く保持する場合は、ドメインは、閉構造をとる可能性が高い。
同様に、ＶＨドメイン対およびＶＬドメイン対は、閉構造で存在し得る。通常、これは、リガンド分子中の強固なリンカーなどによるドメインの密接な結合の関数である。閉構造中のリガンドは、リガンドの半減期を増大する分子と、第２の標的分子の両方と結合できない。したがって、リガンドは、通常、リガンドの半減期を増大する分子からの解離時に第２の標的分子とのみ結合する。
さらに、リンカーを用いないＶＨ／ＶＨ、ＶＬ／ＶＬまたはＶＨ／ＶＬ二量体の構築は、ドメイン間の競合を提供する。
本明細書に開示されるリガンドは、さらに、開放コンホメーションであり得る。このようなコンホメーションでは、リガンドは、リガンドの半減期を増大する分子と、第２の標的分子の両方と同時に結合できる。通常、開放立体配置の可変ドメインは（ＶＨ−ＶＬ対の場合には）、ドメインが、相互作用し、抗体結合部位を形成しないよう、またそのそれぞれのエピトープとの結合について競合しないよう十分に離れて保持される。ＶＨ／ＶＨまたはＶＬ／ＶＬ二量体の場合には、ドメインは、強固なリンカーによって一緒にされない。必然的に、このようなドメイン対形成は、抗原結合について競合しない、または抗体結合部位を形成しない。
Ｆａｂ断片および抗体全体は、主として、閉構造で存在するが、開放および閉鎖二重特異性リガンドは、種々の状況下、さまざまな平衡で存在する可能性が高いことが理解されよう。リガンドの標的との結合は、平衡のバランスを開放立体配置へ移動させる可能性が高い。したがって、本明細書に開示される特定のリガンドは、溶液中で、２種のコンホメーションで存在し得、そのうちの一方（開放形態）は、２種の抗原またはエピトープと独立に結合し得る一方で、代替のコンホメーション（閉鎖形態）は、１種の抗原またはエピトープとのみ結合し得；したがって、抗原またはエピトープは、このコンホメーションでのリガンドとの結合について競合する。
したがって、二重特異性リガンドの開放形態は、溶液中で閉鎖形態との平衡で存在し得るが、平衡は閉鎖形態に有利に働き；さらに、開放形態は、標的結合によって閉構造へ隔離され得ると想定される。したがって、例示的実施形態では、本明細書に開示される特定の二重特異性リガンドは、２種（開放および閉鎖）コンホメーション間の平衡で存在する。
本明細書に開示される二重特異性リガンドは、開放または閉構造に有利に働くよう改変できる。例えば、ジスルフィド結合を用いるＶＨ−ＶＬ相互作用の安定化は、閉構造を安定化する。さらに、ＶＨドメインおよびＶＬドメイン対を含めたドメインを結合するために使用されるリンカーは、開放形態が有利であるように構築され得；例えば、リンカーは、適切な位置への大きなアミノ酸残基の組込み、またはドメインを物理的に離れた間隔に維持する適した強固な構造の設計などによってドメインの結合を立体障害し得る。
６．２．３．二重特異性リガンドの特徴づけ。
二重特異性リガンドの、その特異的抗原またはエピトープとの結合は、当業者によく知られる、ＥＬＩＳＡを含む方法によって試験できる。一実施形態では、結合は、モノクローナルファージＥＬＩＳＡを使用して試験される。
ファージＥＬＩＳＡは、任意の適した手順に従って実施でき：例示的プロトコールは、以下に示される。
選択の各ラウンドで産生されるファージの集団を、選択された抗原またはエピトープとの結合についてＥＬＩＳＡによってスクリーニングし、「ポリクローナル」ファージ抗体を同定できる。これらの集団に由来する単一の感染細菌コロニーから得たファージを、ＥＬＩＳＡによってスクリーニングし、「モノクローナル」ファージ抗体を同定できる。抗原またはエピトープとの結合について可溶性抗体断片をスクリーニングすることもまた望ましく、これは、例えば、ＣまたはＮ末端タグに対して、試薬を使用してＥＬＩＳＡによって行うことができる（例えば、Winter et al. (1994) Ann. Rev. Immunology 12、433-55およびそれに引用される参考文献参照）。
選択されたファージモノクローナル抗体の多様性はまた、ＰＣＲ産物のゲル電気泳動［Marks et al. (1991)前掲; Nissim et al. (1994)前掲］、プロービング［Tomlinson et al., (1992) J. Mol. Biol. 227, 776］によって、またはベクターＤＮＡの配列決定によって評価できる。
７．ポリペプチド安定性の増大
７．１．半減期の増大
インビボで、本明細書に記載されるＰＥＧ化されたドメイン抗体は、ＰＥＧ化された抗体分子が大きく延長されたインビボ半減期を有するという点でＰＥＧ化されていないドメイン抗体を上回る明白な利点を付与し得る。本開示との関連で、任意の組成物の特定の半減期は、患者への組成物の投与経路によって増大または減少され得るということは理解されよう。
それにもかかわらず、１つの特定の理論に拘束されるものではないが、本明細書に記載される分子の半減期の増大は、ＰＥＧポリマー（単数または複数）の結合に起因するドメイン抗体の水力学的サイズの増大によって付与されると考えられる。より具体的には、２種のパラメータが、ＰＥＧ化されたドメイン抗体の血清半減期の決定において重要な役割を果たすと考えられる。第１の判定基準は、ＰＥＧ結合の性質および大きさであり、すなわち、使用されるポリマーが単に直鎖または分岐（ｂｒａｎｃｈｅｄ ｃｈａｉｎ）／分岐鎖（ｆｏｒｋｅｄ ｃｈａｉｎ）である場合は、分岐／分岐鎖は、より長い半減期を生じさせる。第２は、最終フォーマットでの、ＰＥＧ部分またはドメイン抗体上の部分の位置および分子が、「遊離の」修飾されていないＰＥＧアームをどれだけ多く有するかである。例えば、サイズ排除クロマトグラフィーによって推定されるＰＥＧ化されたドメイン抗体の得られた水力学的サイズは、分子の血清半減期を反映する。したがって、ＰＥＧ化された分子の水力学的サイズが大きいほど、血清半減期は長い。
半減期の増大は、免疫グロブリン、特に、抗体、最も特には、小さいサイズの抗体断片ならびにドメイン抗体のインビボ適用において有用である。このような断片（Ｆｖｓ、Ｆａｂｓ、ｓｃＦｖｓ）およびドメイン抗体は、身体から迅速なクリアランスに遭い；したがって、それらは迅速に身体のほとんどの部分に達することができ、製造するのが速く、操作が容易でありながら、そのインビボ適用は、そのインビボでの短い持続だけによって制限されてきた。
一態様では、本明細書に記載されるドメイン抗体は、ドメイン抗体の水力学的サイズを増大する、ＰＥＧなどの部分との融合によってインビボで安定化される。薬物動態分析および半減期の決定のための方法は、当業者にはよく知られるであろう。詳細は、Kenneth et al., Chemical Stability of Pharmaceuticals: A Handbook for Pharmacists and in Peters et al., Pharmacokinetc Analysis: A Practical Approach (1996)に見ることができる。ｔ−αおよびｔ−β半減期および曲線下面積（ＡＵＣ）などの薬物動態パラメータを記載する「Pharmacokinetics」、M. Gibaldi & D. Perron、published by Marcel Dekker、2nd Rev. edition (1982)も参照される。
通常、本明細書に記載されるＰＥＧ化されたドメイン抗体の半減期は、ＰＥＧ化されていないｄＡｂと比較して約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％以上増大される（ここで、ＰＥＧ化されたドメイン抗体およびＰＥＧ化されていないドメイン抗体のドメイン抗体は同一である）。半減期の２×、３×、４×、５×、７×、１０×、２０×、３０×、４０×、５０×以上までの範囲の増大があり得る。あるいは、またはさらに、半減期の３０×、４０×、５０×、６０×、７０×、８０×、９０×、１００×または１５０×以上までの範囲の増大があり得る。
半減期（ｔ１／２−αおよびｔ１／２−β）およびＡＵＣは、時間に対するリガンドの血清濃度の曲線から決定できる。ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ分析パッケージ（Pharsight Corp., Mountain View, CA 94040、USAから入手可能）を使用し、例えば、曲線をモデリングできる。第１相（α相）では、リガンドは、患者において主に分配を受け、一部は排出される。第２相（β相）は、リガンドが分配され、リガンドが患者から除去されるにつれ、血清濃度が低下している最終相である。「ｔα半減期」は、第１相の半減期であり、「ｔβ半減期」は、第２相の半減期である。本明細書において、「半減期」とは、特に断りのない限り、非コンパートメントモデリング（例えば、二相モデリングとは対照的に）によって決定される、本明細書に開示される抗体単一可変ドメインの全体的な半減期を指す。β半減期は、ドメイン抗体単量体または多量体の量が、それが投与される哺乳類から排除されるのにかかる時間の測定値である。したがって、有利なことに、ドメイン抗体含有組成物、例えば、約０．２５時間〜６時間以上の範囲のｔα半減期を有するドメイン抗体−エフェクター群組成物が考慮される。一実施形態では、範囲の下端は、約３０分、４５分、１時間、１．３時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、１０時間、１１時間または１２時間である。さらに、またはあるいは、ドメイン抗体含有組成物は、１２時間まで（１２時間を含めて）の範囲のｔα半減期を有する。一実施形態では、範囲の上端は、約１１、１０、９、８、７、６または５時間である。適した範囲の例は、約１．３〜６時間、２〜５時間または３〜４時間である。
有利なことに、リガンドを含むドメイン抗体含有組成物は、約１〜１７０時間以上の範囲のｔβ半減期を有する。一実施形態では、範囲の下端は、約２．５時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間または１２時間である。さらに、またはあるいは、ドメイン抗体含有組成物、例えば、ｄＡｂ−エフェクター群組成物は、２１日まで（２１日を含めて）の範囲のｔβ半減期を有する。一実施形態では、範囲の上端は、約１２時間、２４時間、２日、３日、５日、１０日、１５日または２０日である。本明細書に開示されるｄＡｂ含有組成物は、約２〜１００時間、４〜８０時間および１０〜４０時間の範囲のｔβ半減期を有することが有利である。さらなる実施形態では、約１２〜４８時間の範囲となる。なおさらなる実施形態では、約１２〜２６時間の範囲となる。１〜１７０時間以上の範囲の半減期を有するリガンドを含むドメイン抗体含有組成物が、本明細書に開示される。一実施形態では、範囲の下端は、約１．３時間、２．５時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間または１２時間である。さらに、またはあるいは、ドメイン抗体含有組成物、例えば、ｄＡｂ−エフェクター群組成物は、２１日まで（２１日を含めて）の範囲の半減期を有する。一実施形態では、範囲の上端は、約１２時間、２４時間、２日、３日、５日、１０日、１５日または２０日である。
上記の判定基準に加えて、または代えて、リガンドを含むドメイン抗体含有組成物は、１ｍｇ・分／ｍｌ以上の範囲のＡＵＣ値（曲線下面積）を有する。一実施形態では、範囲の下端は、約５、１０、１５、２０、３０、１００、２００または３００ｍｇ・分／ｍｌである。さらに、またはあるいは、本明細書に開示されるリガンドまたは組成物は、約６００ｍｇ・分／ｍｌまでの範囲のＡＵＣを有する。一実施形態では、範囲の上端は、約５００、４００、３００、２００、１５０、１００、７５または５０ｍｇ・分／ｍｌである。本明細書に開示される例示的リガンドは、以下からなる群から選択される範囲のＡＵＣを有するであろう：約１５〜１５０ｍｇ・分／ｍｌ、１５〜１００ｍｇ・分／ｍｌ、１５〜７５ｍｇ・分／ｍｌおよび１５〜５０ｍｇ・分／ｍｌ。
単一特異的、二重特異的および多重特異的を含めた本明細書に開示されるリガンドは、その１つの立体配置では、インビボでリガンドの半減期を増大する１つまたは複数の分子と結合できる。通常、このような分子は、インビボで天然に生じ、生物から不要な物質を除去する内因性機序による分解または除去に抵抗するポリペプチドである。
例えば、生物において半減期を増大する分子は、以下から選択され得る：
・細胞外マトリックス由来のタンパク質；例えば、コラーゲン、ラミニン、インテグリンおよびフィブロネクチン。コラーゲンは、細胞外マトリックスの主要なタンパク質である。約１５種のコラーゲン分子が現在知られており、身体のさまざまな部位に見られる、例えば、骨、皮膚、腱、靭帯、角膜、内臓器官に見られるＩ型コラーゲン（身体のコラーゲンの９０％を占める）または軟骨、椎間板、脊索、眼の硝子体液に見られるＩＩ型コラーゲン。
・血液中に見られるタンパク質、例えば：フィブリン、α−２マクログロブリン、血清アルブミン、フィブリノゲンＡ、フィブリノゲンＢ、血清アミロイドプロテインＡ、ヘプタグロビン、プロフィリン、ユビキチン、ウテログロブリンおよびβ−２−ミクログロブリンなどの血漿タンパク質；
・酵素およびプラスミノゲン、リゾチーム、シスタチンＣ、α−１−アンチトリプシンおよび脾臓トリプシン阻害剤などの阻害剤。プラスミノゲンは、トリプシン様セリンプロテアーゼプラスミンの不活性前駆体である。通常、血流による循環に見られる。プラスミノゲンが活性化になり、プラスミンに変換される場合には、血液細胞をもつれさせ、血液血餅にするフィブリノゲン線維を溶解する強力な酵素ドメインを折り畳まない。これは、繊維素溶解と呼ばれる。
・ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭなどの免疫系タンパク質。
・レチノール結合タンパク質、α−１ミクログロブリンなどの輸送タンパク質。
・β−デフェンシン１、好中球デフェンシン１、２および３などのデフェンシン。
・メラノコルチン受容体、ミエリン、アスコルベート輸送体などの、血液脳関門で、または神経組織中に見られるタンパク質。
・トランスフェリン受容体特異的リガンド−神経医薬品融合タンパク質（米国特許第５，９７７，３０７号参照）；脳毛細血管内皮細胞受容体、トランスフェリン、トランスフェリン受容体、インスリン、インスリン様成長因子１（ＩＧＦ １）受容体、インスリン様成長因子２（ＩＧＦ２）受容体、インスリン受容体。
・腎臓に局在するタンパク質、例えば、ポリシスチン、ＩＶ型コラーゲン、有機陰イオン輸送体Ｋ１、ヘイマン抗原。
・肝臓に局在するタンパク質、例えば、アルコールデヒドロゲナーゼ、Ｇ２５０。
・血液凝固第Ｘ因子
・α１アンチトリプシン
・ＨＮＦ １α
・肺に局在するタンパク質、例えば、分泌成分（ＩｇＡと結合する）。
・心臓に局在するタンパク質、例えば、ＨＳＰ２７。これは、拡張型心筋症と関連している。
・皮膚に局在するタンパク質、例えば、ケラチン。
・骨形成活性を示すトランスフォーミング増殖因子βスーパーファミリーのサブセットである骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）などの骨特異的タンパク質。例として、ＢＭＰ−２、−４、−５、−６、−７［骨形成タンパク質（ＯＰ−１）および−８（ＯＰ−２）とも呼ばれる］が挙げられる。
・ヒトトロホブラスト抗原、ヘルセプチン受容体、エストロゲン受容体、カテプシン（例えば、カテプシンＢ）（肝臓および脾臓に見られる）をはじめとする腫瘍特異的タンパク質。
・活性化されたＴ細胞でのみ発現される抗原などの疾患特異的タンパク質：例えば、ＬＡＧ−３（リンパ球活性化遺伝子）、オステオプロテジェリンリガンド（ＯＰＧＬ）(Nature 402, 304-309; 1999)；ＯＸ４０（活性化されたＴ細胞で発現されるＴＮＦ受容体ファミリーのメンバー、ヒトＴ細胞白血病ウイルスＩ型（ＨＴＬＶ−Ｉ）産生細胞中で、特異的にアップレギュレートされるとわかっている唯一の共刺激Ｔ細胞分子）(J. Immunol. 165(1): 263-70, 2000参照);メタロプロテアーゼ（関節炎／癌と関連している）、例えば、ＣＧ６５１２ ショウジョウバエ、ヒトパラプレジン（ｐａｒａｐｌｅｇｉｎ）、ヒトＦｔｓＨ、ヒトＡＦＧ３Ｌ２、マウスｆｔｓＨ；血管新生増殖因子、例えば、酸性繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ−１）、塩基性繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ−２）、血管内皮増殖因子 ／ 血管透過性因子（ＶＥＧＦ／ＶＰＦ）、トランスフォーミング増殖因子−ａ（ＴＧＦａ）、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）、アンギオゲニン、インターロイキン−３（ＩＬ−３）、インターロイキン−８（ＩＬ−８）、血小板由来内皮増殖因子（ＰＤ−ＥＣＧＦ）、胎盤増殖因子（ＰｌＧＦ）、ミッドカイン血小板由来増殖因子−ＢＢ（ＰＤＧＦ）、フラクタルカイン。
・ストレスタンパク質（熱ショックタンパク質）。ＨＳＰは、通常、細胞内に見られる。それらが細胞外に見られる場合は、細胞が死滅し、その内容物が飛び出したことの指標である。このプログラムされていない細胞死（壊死）は、外傷、疾患または傷害の結果としての場合にのみ起こり、したがって、インビボ、細胞外ＨＳＰは、免疫系からの応答を引き起こし、これは、感染および疾患と戦う。細胞外ＨＳＰと結合する二重特異性は、疾患部位に局在させることができる。
・Ｆｃ輸送に関与するタンパク質、例えば：
○Ｂｒａｍｂｅｌｌ受容体（ＦｃＲＢとしても知られる）。このＦｃ受容体は、２つの機能を有し、その両方ともデリバリーにとって有用である可能性がある。機能として、母から子への胎盤を通るＩｇＧの輸送およびＩｇＧの分解からの保護によるＩｇＧの血清半減期の延長が挙げられる。受容体は、ＩｇＧをエンドソームから再生利用すると考えられる(Holliger et al, (1997) Nat. Biotechnol. 15: 632-6参照)。
○Fc輸送に関与するその他のタンパク質として、Gastinel et al. (1992) PNAS 89: 638;およびRoopenian et al. (2003) J. Immunol. 170: 3528に記載される新生児Fc受容体(FcRn)が挙げられる。
・本明細書に開示されるリガンドは、インビボでの半減期の何らかの増大または増大することを必要とせず、上記の標的に特異的であるよう設計できる。例えば、本明細書に開示されるリガンドは、組織特異的である前記のものから選択された標的に特異的であり得、それによって、半減期の何らかの増大に関係なく、組織特異的な治療上関連する標的と結合する二重特異性リガンドまたはドメイン抗体の組織特異的ターゲッティングが可能となるが、これは起こり得る。さらに、リガンドまたはドメイン抗体が、腎臓または肝臓を標的とする場合には、これは、リガンドまたはドメイン抗体を、代替のインビボクリアランス経路に向け直し得る（例えば、リガンドは、肝臓クリアランスから離れて腎臓クリアランスへ向けられ得る）。
半減期を増大するのに有用なポリペプチドとして、それだけには限らないが、添付書類Ｉに示されるものが挙げられる。
７．２．プロテアーゼ分解に対する耐性の増大
また、本明細書に記載されるＰＥＧ化されたドメイン抗体およびドメイン抗体多量体がプロテアーゼの作用に対する増大した安定性を有することも本明細書に開示される。酸性条件下ではタンパク質が折り畳まれず、したがって、タンパク質をプロテアーゼ酵素に対してより感受性にするので、ペプシンの存在下で、多数のドメイン抗体がｐＨ２で完全に分解される。ドメイン抗体多量体をはじめとするＰＥＧ化されたドメイン抗体分子が本明細書において提供され、これでは、ＰＥＧポリマーが、ＰＥＧポリマーによる主鎖の物理的被覆によってポリペプチド主鎖の保護を提供し、それによってプロテアーゼがポリペプチド主鎖に接近し、それを切断するのを防ぐと考えられている。一実施形態では、大きな水力学的サイズ（例えば、２００〜５００ｋＤ）を有するＰＥＧ化されたドメイン抗体が、本明細書に開示されるように作製されるが、これは、大きな水力学的サイズが、小さい水力学的サイズを有するＰＥＧ化されたドメイン抗体よりも高いレベルのプロテアーゼ分解からの保護を確信させるからである。一実施形態では、ＰＥＧまたはその他のポリマーが連結している抗体単一可変ドメイン単量体または多量体は、ペプシン、トリプシン、エラスターゼ、キモトリプシンまたはカルボキシペプチダーゼのうち１または複数に曝露されるとわずか１０％しか分解されず、これでは、プロテアーゼがペプシンである場合は、曝露は、ｐＨ２．０で３０分間実施し、プロテアーゼが、トリプシン、エラスターゼ、キモトリプシンまたはカルボキシペプチダーゼのうち１または複数である場合には、曝露は、ｐＨ８．０で３０分間実施する。一実施形態では、ＰＥＧまたはその他のポリマーが連結しているドメイン抗体単量体または多量体は、ｐＨ２．０で３０分間ペプシンに曝露されるとわずか１０％しか分解されず、一態様では、わずか５％、別の態様では、全く分解されない。別の実施形態では、本明細書に開示されるＰＥＧまたはその他のポリマーが連結しているドメイン抗体多量体（例えば、ヘテロまたはホモ二量体、三量体、四量体、オクタマーなど）は、ｐＨ２．０で３０分間のペプシンの存在下で５％未満しか分解されず、一態様では、全く分解されない。例示的実施形態では、ＰＥＧまたはその他のポリマーが連結しているドメイン抗体単量体または多量体は、ｐＨ８．０で３０分間トリプシン、エラスターゼ、キモトリプシンまたはカルボキシペプチダーゼに曝露されるとわずか１０％しか分解されず、一態様では、わずか５％、さらなる態様では、全く分解されない。さらなる例示的実施形態では、本明細書に開示されるＰＥＧまたはその他のポリマーが連結しているドメイン抗体多量体（例えば、ヘテロまたはホモ二量体、三量体、四量体、オクタマーなど）は、ｐＨ８．０で３０分間のトリプシン、エラスターゼ、キモトリプシンまたはカルボキシペプチダーゼの存在下で５％未満しか分解されず、一態様では、全く分解されない。
プロテアーゼ：ＰＥＧ−ドメイン抗体の相対比率は、上記の所望のレベルの分解を達成するよう本明細書に開示されるように変更してもよい。例えば、プロテアーゼ対ＰＥＧ−ドメイン抗体の比率は、約１：３０〜約１０：４０、〜約２０：５０、〜約３０：５０、約４０：５０、約５０：５０、約５０：４０、約５０：３０、約５０：２０、約５０：１０、約５０：１、約４０：１および約３０：１であり得る。
したがって、本明細書に記載される実施形態のいずれかに従って、ドメイン抗体単量体または多量体を、ＰＥＧポリマーと連結することを含む、ドメイン抗体の分解を低減する方法が本明細書に開示される。本明細書に開示されるように、ドメイン抗体は、ｐＨ２．０で３０分間のペプシンの存在下でわずか１０％しか分解されない。特に、ＰＥＧが連結しているｄＡｂ多量体は、ｐＨ２．０で３０分間のペプシンの存在下でわずか５％しか分解されず、一態様では、全く分解されない。代替実施形態では、ドメイン抗体は、トリプシン、エラスターゼ、キモトリプシンまたはカルボキシペプチダーゼにｐＨ８．０で３０分間曝露された場合にわずか１０％しか分解されず、一態様では、わずか５％、別の態様では、全く分解されない。
本明細書に示されるＰＥＧが連結しているドメイン抗体単量体および多量体の分解は、当業者に周知の方法を使用して測定され得る。例えば、ＰＥＧが連結しているドメイン抗体をペプシンとともにｐＨ２．０で３０分間またはトリプシン、エラスターゼ、キモトリプシンもしくはカルボキシペプチダーゼとともにｐＨ８．０で３０分間インキュベートした後、ドメイン抗体サンプルを、ゲル濾過によって分析してもよく、これでは、ドメイン抗体単量体または多量体の分解は、分解されていない（すなわち、ペプシン、トリプシン、キモトリプシン、エラスターゼまたはカルボキシペプチダーゼで処理されていない対照ドメイン抗体）ドメイン抗体より小さい分子量のゲルバンドによって証明される。ゲル上のドメイン抗体バンドの分子量は、バンドの移動を、分子量ラダーの移動と比較することによって決定できる（図５参照）。タンパク質分解を測定するその他の方法も当技術分野で公知であり、適応させて、本明細書に開示されるようなＰＥＧが連結しているドメイン抗体単量体および多量体を評価することができる。
８．ドメイン抗体の使用
本明細書に記載されるドメイン抗体は、ＣＤ２８の活性を拮抗するのに有用である。したがって、本明細書に記載されるドメイン抗体を使用して、ＣＤ２８活性によって、全体において、または一部において媒介される状態、疾患または障害を有する患者を治療できる。
本明細書に記載されるドメイン抗体は、ＣＤ２８媒介性経路の不適当な活性化が関与している疾患または障害の治療または予防にとって有用である。本明細書に記載されるドメイン抗体もまた、ＣＤ２８媒介性経路の不適当な活性化が関与している疾患または障害の症状の治療、予防または軽減にとって有用である。
一態様では、自己免疫疾患は、ＣＤ２８経路の不適当な調節または活性を含むことが多い。自己免疫疾患を含めたこのような疾患を患っている個体への本明細書に記載されるドメイン抗体の投与は、疾患の１または複数の症状を低減し得る。本明細書に記載されるドメイン抗体が治療上有用であり得る疾患の限定されない例として、それだけには限らないが、アジソン病、アレルギー、強直性脊椎炎、喘息、アテローム性動脈硬化症、耳の自己免疫疾患、眼の自己免疫疾患、自己免疫萎縮性胃炎、自己免疫肝炎、自己免疫溶血性貧血、自己免疫耳下腺炎、原発性胆汁性肝硬変、良性リンパ性血管炎、大腸炎、冠動脈心疾患、クローン病、糖尿病（Ｉ型）、１型および／または２型糖尿病を含む糖尿病、精巣上体炎、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、グレーブス病、ギラン・バレー症候群、橋本病、溶血性貧血、特発性血小板減少性紫斑病、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、組換え製剤、例えば、血友病における因子ＶＩＩに対する免疫応答、全身性エリテマトーデス、ループス腎炎、男性不妊症、混合性結合組織病、多発性硬化症、重症筋無力症、原発性粘液水腫、天疱瘡、悪性貧血、多発性筋炎、乾癬、乾癬の関節炎、リウマチ熱、関節リウマチ、サルコイドーシス、強皮症、シェーグレン症候群、脊椎関節症、交感性眼炎、Ｔ細胞リンパ腫、Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病、精巣血管中心性Ｔ細胞リンパ腫、甲状腺炎、移植拒絶、潰瘍性大腸炎、自己免疫ブドウ膜炎および脈管炎が挙げられる。自己免疫媒介性状態として、それだけには限らないが、罹患した組織が、一次標的、いくつかの場合には、二次標的である状態が挙げられる。このような状態として、それだけには限らないが、ＡＩＤＳ、アトピー性アレルギー、気管支喘息、湿疹、らい病、統合失調症、遺伝性鬱病、組織および臓器の移植、慢性疲労症候群、アルツハイマー病、パーキンソン病、心筋梗塞、卒中、自閉症、てんかん、アルサス現象、アナフィラキシーならびにアルコールおよび薬物依存が挙げられる。
本明細書に記載されるドメイン抗体はまた、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、急性移植拒絶および慢性移植拒絶などの移植組織と関連する疾患において治療上有用であり得る。
本明細書に記載されるドメイン抗体は、通常、任意の抗体調製物が有用である方法で、例えば、インビボイメージングまたは診断用途、インビトロ診断用途などにとってさらに有用である。
これらおよびその他の使用のために、例えば、蛍光、比色分析、酵素または放射性標識を用いてドメイン抗体を標識することが望ましい場合がある。ドメイン抗体を標識する方法は、当技術分野で周知である。
９．医薬組成物、投与量および投与
本明細書に示されるドメイン抗体は、被験体への投与に適した医薬組成物へ組み込むことができる。通常、医薬組成物は、ドメイン抗体と製薬上許容される担体とを含む。本明細書において、「製薬上許容される担体」は、生理学的に適合する、ありとあらゆる溶媒、分散媒、被膜、抗菌薬および抗真菌薬、等張剤および吸収遅延剤などを含む。用語「製薬上許容される担体」は、ウシまたはウマ血清を含む組織培養培地を含まない。製薬上許容される担体の例として、水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなどのうち１または複数ならびにそれらの組合せが挙げられる。多くの場合、組成物中に、例えば、糖類、マンニトール、ソルビトールなどのポリアルコールまたは塩化ナトリウムなどの等張剤を含むことが好ましい。製薬上許容される物質として、ドメイン抗体の有効期間または有効性を増強する、微量の、湿潤剤または乳化剤、保存料またはバッファーなどの補助物質が挙げられる。
本明細書に記載される組成物は、さまざまな形態であり得る。これらとして、例えば、液体溶液（例えば、注射用および注入用溶液）、分散物または懸濁液、散剤、リポソームおよび坐剤などのなどの液体、半固体および固体投与形が挙げられる。好ましい形態は、意図される投与様式および治療的適用に応じて変わる。通常好ましい組成物は、その他の抗体を用いるヒトの受動免疫に使用されるものと同様の組成物などの注射用または注入用溶液の形態である。１つの投与様式として、非経口（例えば、静脈内、皮下、腹腔内、筋肉内）がある。
治療用組成物は、通常、無菌で、製造および保存の条件下で安定でなくてはならない。組成物は、溶液、マイクロエマルジョン、分散物、リポソームまたは高い薬物濃度に適したその他の指示された構造として製剤してよい。滅菌注射用溶液は、必要に応じて、適当な溶媒に、必要な量の活性化合物を、上記で列挙された１種の成分または成分の組合せとともに組み込むことと、それに続く濾過滅菌によって調製できる。通常、分散物は、基礎分散媒および上記で列挙されたものから必要なその他の成分を含む滅菌ビヒクルに、活性化合物を組み込むことによって調製する。滅菌注射用溶液の調製のための滅菌散剤の場合には、調製方法は、事前に滅菌濾過したその溶液から有効成分および任意のさらなる望ましい成分の散剤を生じる真空乾燥および凍結乾燥を含む。溶液の適切な流動性は、例えば、レシチンなどの被膜の使用によって、分散剤の場合には必要な粒径の維持によって、および界面活性剤の使用によって維持できる。
本明細書に記載されるドメイン抗体は、当技術分野で公知のさまざまな方法によって投与できるが、多数の治療的適用にとって、好ましい投与経路および様式は、静脈内注射または注入である。ポリペプチドはまた、筋肉内または皮下注射によって投与できる。
当業者には当然であろうが、投与経路および／または様式は、所望の結果に応じて大きく変わる。特定の実施形態では、活性化合物は、化合物を迅速な放出から保護する担体、例えば、インプラントをはじめとする制御放出製剤およびマイクロカプセル化デリバリー系とともに調製できる。ドメイン抗体は、幾分かは、その小さい大きさために持続放出製剤の製剤によく適しており、用量あたりのモル数は、例えば、フルサイズの抗体の投与量よりもかなり高い。エチレン酢酸ビニル、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステルおよびポリ乳酸などの生分解性、生体適合性ポリマーを使用できる。注射用組成物の長期の吸収は、吸収を遅延する薬剤、例えば、モノステアリン酸塩およびゼラチンを組成物中に含めることによって成し遂げられ得る。このような製剤を調製するための多数の方法が特許権がとられており、一般に当業者に知られている。例えば、Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems、J. R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978参照。本明細書に開示される一価ドメイン抗体などのポリペプチド物質の制御放出または持続放出に適用できるさらなる方法は、例えば、米国特許第６，３０６，４０６号および同６，３４６，２７４号に、ならびに、例えば、米国特許公報番号ＵＳ２００２０１８２２５４およびＵＳ２００２００５１８０８に記載されており、それらのすべては、すべての目的上、引用により本明細書の一部とする。
さらなる活性化合物も、組成物に組み込むことができる。特定の実施形態では、ドメイン抗体は、１種または複数のさらなる治療薬と同時製剤および／または同時投与される。例えば、ドメイン抗体は、１種または複数の、その他の標的と結合するさらなる抗体（例えば、その他のサイトカインと結合する、または細胞表面分子と結合する抗体）、または例えば、１種または複数のサイトカインと同時製剤および／または同時投与できる。このような併用療法は、低投与量の投与される治療薬を、したがって、種々の単剤治療に関連する可能性ある毒性または合併症を避けながら使用できる。
本明細書に開示される医薬組成物は、ドメイン抗体の「治療上有効な量」または「予防上有効な量」を含み得る。「治療上有効な量」とは、投与量で、所望の治療結果を達成するのに必要な期間、有効な量を指す。ドメイン抗体の治療上有効な量は、個人の疾患状態、年齢、性別および体重、ならびにドメイン抗体の、個体において所望の応答を誘発する能力などの因子に応じて変わり得る。治療上有効な量はまた、抗体または抗体の一部の任意の毒性または有害な効果を、治療上有益な効果が上回るものである。「予防上有効な量」とは、投与量で、所望の予防結果を達成するのに必要な期間、有効な量を指す。通常、予防的用量は、疾患に先立って、または疾患の初期の段階で被験体に使用されるので、予防上有効な量は、治療上有効な量より少なくなる。
投与計画は、最適な所望の反応（例えば、治療的または予防的反応）を提供するよう調整できる。例えば、単回ボーラスを投与してもよく、いくつかの分割された用量を経時的に投与してもよく、用量は、治療状態の要求によって示されるように、比例的に減少または増大させてもよい。非経口組成物を、投与の容易性および投与量の均一性のために単位投与形で製剤することが有利である。本明細書において単位投与形とは、治療される哺乳類被験体のための単一投与量に適した物理的に個別の単位を指し；各単位は、必要な製薬担体と関連して、所望の治療効果を生じるよう算出された所定の量の活性化合物を含有する。
ドメイン抗体の治療上または予防上有効な量の限定されない範囲は、０．１〜２０ｍｇ／ｋｇ、一態様では、１〜１０ｍｇ／ｋｇである。投与量の値は、軽減される状態の種類および重篤度に応じて変わり得るということも注意すべきである。任意の特定の被験体には、特定の投与計画が、個々の必要性および投与する臨床医の専門的な判断に従って経時的に調整されるべきであるさらに理解されるべきである。
本明細書に記載されるドメイン抗体を用いる治療の有効性は、治療される病状または障害の１つまたは複数の症状または指標の改善に基づいて熟練した臨床医によって判断される。１つまたは複数の臨床指標の少なくとも１０％の改善（測定される指標に応じた、増大または減少）が、「有効な治療」と考えられるが、約２０％、３０％、４０％、５０％、７５％、９０％またはさらに１００％、または測定される指標に応じて１００％を超えて（例えば、２倍、３倍、１０倍など、疾患のない状態の達成を含むまでなど、より大きな改善も含まれる。指標は、物理的測定値、例えば、酵素、サイトカイン、増殖因子または代謝産物レベル、細胞増殖または細胞死の速度または異常な細胞の存在もしくは量であり得る。また、例えば、疾患または障害の症状の再燃間の（例えば、多発性硬化症などの疾患の寛解／再発についての）時間量の相違も測定できる。あるいは、疼痛または不快感または病状のその他の指標の低減の報告といった非物理的測定値も、治療の有効性を評価するのに頼りになり得る。非物理的測定値がとられる場合には、種々の臨床上許容されるスケールまたは指数、例えば、中でも、ヘマトクリットおよび液体または極めてやわらかい便の数などの物理的指標を、腹痛の重篤度または筋痙攣および全体的に満足のいく状態などの患者によって報告される因子と組み合わせるクローン病活性指数、すなわちCDAI(Best et al. (1976) Gastroenterology 70: 439)を使用して、疾患スコアを割り当ててもよい。
乾癬の治療の有効性は、例えば、Ｓａｌｆｏｒｄ Ｐｓｏｒｉａｓｉｓ Ｉｎｄｅｘ（ＳＰＩ）またはＰｓｏｒｉａｓｉｓ Ａｒｅａ Ｓｅｖｅｒｉｔｙ Ｉｎｄｅｘ（ＰＡＳＩ）を使用してモニタリングできる。ＰＡＳＩは、臨床試験において乾癬疾患重篤度を評価するために最もよく用いられる方法であるが、毎日の臨床業務において使用するには非常に面倒であり得る。この方法は、身体が４つの区分（下肢、ヒトの皮膚の４０％を有する；３０％を有する胴体（躯幹面積：胃、胸部、背中など）；腕（２０％）；および頭部（１０％））に分けられることを含む。これらの面積の各々は、それ自体にスコアがつけられ、次いで、４つのスコアが最終ＰＡＳＩに合わせられる。各区分について、病変皮膚面積のパーセントを推定し、次いで、０〜６の等級に変換する：
０％の病変（ｉｎｗｏｌｖｅｄ）面積、等級：０
＜１０％の病変面積、等級：１
１０〜２９％の病変面積、等級：２
３０〜４９％の病変面積、等級：３
５０〜６９％の病変面積、等級：４
７０〜８９％の病変面積、等級：５
９０〜１００％の病変面積、等級：６
重篤度は、４つの異なるパラメータ：そう痒、紅斑（発赤）、落屑性および厚さ（乾癬皮膚は、正常皮膚よりも厚い）によって推定される。重篤度パラメータは、なし〜最大まで、０〜４のスケールで測定される。
皮膚の４つの区分について、４つの重篤度パラメータすべての合計を算出し、その面積の面積スコアを乗じ、それぞれの切片の重量を乗じる（頭部０．１、腕０．２、胴体０．３および下肢０．４）。例：
（Ｉｈｅａｄ＋Ｅｈｅａｄ＋Ｓｈｅａｄ＋Ｔｈｅａｄ）×Ａｈｅａｄ×０．１＝Ｔｏｔａｌｈｅａｄ．
最後に、４つの皮膚区分すべてのＰＡＳＩの合計として総ＰＡＳＩが算出される。乾癬病変面積のコンピュータを使用した測定は、標準アプローチと比較して、臨床試験の能力を改善するとわかった。医師の乾癬の病変面積の推定は、過剰評価する傾向がある。乾癬面積が、面積等級に変換されないが、連続型変数として維持された適応したＰＡＳＩ指数も、臨床試験の能力を改善した。連続型変数としてのコンピュータを使用した面積測定を含む改変されたＰＡＳＩは、コンピュータを使用した乾癬連続型面積および重篤度スコア（Ｃｏｍｐｕｔｅｒ ａｉｄｅｄ ｐｓｏｒｉａｓｉｓ ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ａｒｅａ ａｎｄ ｓｅｖｅｒｉｔｙ ｓｃｏｒｅ）ｃＰｃＡＳＩと名づけられている。
臓器移植拒絶の治療の有効性もまた、モニタリングできる。臓器移植患者の生存率（現在、すべての移植臓器について、５年で約７０〜８５％）は、臓器保存および免疫抑制治療の進歩の結果として改善されてきた。しかし、臓器拒絶、特に、術後、最初の数週に起こる急性拒絶ならびに慢性移植片拒絶は、依然として、臓器移植において機能不全を引き起こす主要な原因の１つである。固形臓器移植後の移植片拒絶の現在の診断または確認には、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞、マクロファージなど）の移植片への浸潤およびその他の病理学的変化を検出するために組織の生検が必要である。組織生検は、侵襲性であるだけでなく、患者への健康上のリスクの増大と関連しており、サンプリング誤差が生まれやすく、これが偽陰性結果につながり得る。拒絶された臓器での免疫細胞の蓄積をモニタリングするために使用できる磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）などの代替の非侵襲性方法が開発されている(Ho et al., (2004) Curr. Pharm. Biotech., 5: 551-566)。
本明細書において、本明細書に記載される組成物を使用して実施される「予防」は、１つまたは複数の症状の発生または重篤度が、組成物で治療されていない同様の個体（ヒトまたは動物モデル）におけるこのような症状と比較して、少なくとも１０％遅延または低減される、または消滅される場合に「有効」である。
本明細書に記載されるドメイン抗体が、ヒトＣＤ２８と結合するのに対して、動物モデル系におけるその効果を評価する場合には、ポリペプチドは、動物モデル系において１種または複数の抗原と、一態様では、高親和性で交差反応しなくてはならない。当業者ならば、所与の動物モデル系および所与のドメイン抗体について、この条件が満たされるかどうかを容易に決定できる。この条件が満たされる場合には、ドメイン抗体の有効性を、疾患状態を摸倣する条件下でそれを動物モデルに投与することおよび少なくとも１０％の改善について、その疾患状態の１種または複数の指標をモニタリングすることによって調べることができる。
１０．動物モデル
本明細書に記載されるドメイン抗体は、ＣＤ２８シグナル伝達が不適当に活性である自己免疫障害の治療にとって有用である。所与のドメイン抗体の治療効力を、以下に論じるように評価できるいくつかの動物モデルがある。
１０．１．炎症性腸疾患（ＩＢＤ）モデル（重症複合免疫不全またはＲａｇ−／−マウスに対するＣＤ４＋ ＣＤ４５ＲＢｈｉｇｈ）−慢性モデル
ＩＢＤモデルは、De Winter et al. (1999) Am. J. Physiol. 276: G1317-1321によって論じられる、粘膜免疫性および炎症系を使用することを含む。手短には、ＩＢＤは、原因不明の多因子性免疫障害である。いくつかの、ＩＢＤに類似する粘膜炎症のマウスモデルが、正常および病的粘膜免疫機能の両方を支配する機序への洞察を提供した。一態様では、ＣＤ４（＋）Ｔリンパ球、ＣＤ４（＋）ＣＤ４５ＲＢｈｉｇｈ細胞のサブセットの免疫不全マウスへの注射は、腸の炎症につながる。発病は、幾分かは、炎症促進性サイトカインの分泌による。別の態様では、大腸炎の誘発は、別のＣＤ４（＋）亜集団、ＣＤ４（＋）ＣＤ４５ＲＢｌｏｗＴ細胞の同時移植によって阻止され得る。この集団は、活性化マーカーの獲得および宿主腸へのホーミングの点では、ＣＤ４（＋）ＣＤ４５ＲＢｈｉｇｈ集団と類似して挙動する。しかし、活性化された場合のそのリンホカインプロフィールは異なっており、ＣＤ４（＋）ＣＤ４５ＲＢｌｏｗＴ細胞によって分泌および／または誘発される抗炎症性サイトカインが、大腸炎を阻止する。Ｄｅ Ｗｉｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．は、養子移植モデルならびに大腸炎発病を促進および阻止する因子の説明を提供している。
１０．２．ＮＯＤマウスと交配されたＫＲＮ ＴＣＲ Ｔｇにおける特発性関節炎モデル−慢性モデル
全身性自己免疫によって誘発される臓器特異的疾患のモデルは、Kouskoff et al. (1996) Cell 87: 811-822によって提供される。関節リウマチ（ＲＡ）は、白血球浸潤および滑膜細胞活性化と、それに続く、軟骨および骨の破壊を特徴とする慢性関節疾患である。ＲＡの病因および発病は、あまり理解されていない。Ｋｏｕｓｋｏｆｆ ｅｔ ａｌ．は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）トランスジェニック系統を、ＮＯＤ株と交配することによって作製したＲＡの特発性マウスモデルを示している。すべての子孫が、ヒトにおけるＲＡを高度に暗示する関節疾患を発生する。マウス障害のトリガーは、トランスジェニックＴＣＲによるＮＯＤ由来主要組織適合複合体（ＭＨＣ）クラスＩＩ分子の偶然の認識であり；関節炎の進行は、ＣＤ４＋Ｔ、Ｂおよびおそらくは、骨髄系細胞を関係させる。
１０．３．マウスコラーゲン誘導関節炎−慢性モデル
コラーゲン誘発性関節炎のマウスモデルは、Brand et al. (2004) Methods Mol. Med. 102: 295-312によって提供されている。手短には、コラーゲン誘発性関節炎（ＣＩＡ）は、ＩＩ型コラーゲン（ＣＩＩ）、関節軟骨の主成分タンパク質での免疫化によって、げっ歯類（ラットおよびマウス）および非ヒト霊長類の感受性株において誘発され得る実験用自己免疫疾患である。免疫化後、動物は、ＲＡと、いくつかの臨床的および組織学的特徴を共有する自己免疫多発性関節炎を発生する。げっ歯類におけるＣＩＡに対する感受性は、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）のクラスＩＩ分子と関連しており、ＣＩＩに対する免疫応答は、コラーゲン特異的Ｔ細胞の刺激および高力価の、免疫原（異種ＣＩＩ）および自己抗原（マウスＣＩＩ）の両方に対して特異的な抗体の産生の両方を特徴とする。マウスＣＩＡは、組織学的には、関節炎の臨床発生と正確に対応する激しい滑膜炎を特徴とする。この実験データは、ＣＩＡとＲＡ間の病理学的類似性のために、ＣＩＡを評価するのに有用である。
１０．４．インビボでの抗原誘発性Ｔ細胞増殖−急性モデル
インビボでのＴ細胞活性化の研究のためのＴ細胞−抗原−受容体−トランスジェニックＴ細胞の養子移植の使用によって、抗原誘発性Ｔ細胞増殖のモデルが提供されている。Pape et al., (1997) Immunol. Rev. 156: 67-78には、既知ペプチド／ＭＨＣ特異性の同定可能なＴＣＲを均一に発現するＴＣＲ−トランスジェニックＴ細胞の養子移植を使用して、抗原特異的Ｔ細胞のインビボ挙動をモニタリングできることを論じられている。この系を使用して、ナイーブＴ細胞が、第２のリンパ組織のＴ細胞領域内でまず活性化され、Ｂ７依存的に増殖することを示した。この期間の間にアジュバントまたは炎症性サイトカインが存在する場合には、増強された数のＴ細胞が蓄積し、Ｂ細胞が豊富な濾胞に遊走し、ＩＦＮ−γを産生する能力を獲得し、Ｂ細胞がＩｇＧ２ａを産生するのを補助する。炎症がない場合には、最初に活性化された抗原特異的Ｔ細胞のほとんどが、濾胞に入ることなく消失し、生存者は、ＩＬ−２およびＩＦＮ−γの産生が乏しい。
ドメイン抗体の結合の選択
ドメイン抗体（ｄＡｂ）の結合の選択を、組換えヒトＣＤ２８／Ｆｃキメラ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｂｉｎｇｄｏｎ，ＵＫ）を用いて実施した。選択に使用されるドメイン抗体ライブラリーは、単一ヒトＶＨフレームワーク（Ｖ３−２３ａｋａ ＤＰ４７およびＪＨ４ｂ）および単一ヒトＶＬフレームワーク（０１２／０２ ａｋａ ＤＰκ９およびＪκ１）に基づいていた。ｄＡｂ遺伝子は、感染性ファージ粒子を作製するのに必要なすべてのｆｄ遺伝子を含んでいたｐＤＯＭ４ベクター中、ＧＡＳ１リーダー配列の制御下に、ｆｄファージ遺伝子ＩＩＩタンパク質に遺伝子を連結した（図１）。ファージ選択の第１ラウンドは、ファージライブラリー（ＶＨライブラリーの４プール［ＶＨ１１−１３、ＶＨ１４−１５、ＶＨ１６−１７、ＶＨ１８−１９］およびＶＫライブラリーの単一プール）を、２％ ＭＰＢＳ（２％ Ｍａｒｖｅｌ脱脂粉乳を補給したリン酸緩衝生理食塩水）と予混合することおよびＣＤ２８−Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＵＫ）を１００ｎＭの最終濃度に加えることによって実施した。混合物を、回転混合しながら、室温で少なくとも１時間インキュベートし、次いで、プロテインＧ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（Ｄｙｎａｌ，Ｓｗｅｄｅｎ）を使用して抗原−ファージ複合体を捕獲し、１ｍｌ ＰＢＳＴ（０．１％ Ｔｗｅｅｎ ２０を補給したＰＢＳ）を用いて８回洗浄し、続いて、１ｍｌ ＰＢＳで単回洗浄した。ＰＢＳ（５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．４、０．１ｍＭ ＣａＣｌ２を補給した）中の、１ｍｇ／ｍｌウシ膵臓由来トリプシンＸＩＩＩ型（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ，ＵＫ）０．５ｍｌとともにインキュベートすることによって、洗浄したファージを、抗原／ビーズ複合体から溶出した。溶出されたファージを使用して、大腸菌に感染させ、アウトプットファージ力価を１×１０４〜１×１０５力価単位（ｔ．ｕ．）／ｍｌであると決定し、ここで、ｔ．ｕ．／ｍｌは、ｍｌあたりの感染性ファージ粒子の尺度である。ｔ．ｕ．の尺度は、所与の希釈のファージを用いる大腸菌の感染と、それに続く、選択的寒天プレートでの感染大腸菌の増殖によって決定される。
選択の第２ラウンドは、５０ｎＭ ＣＤ２８−Ｆｃの最終濃度を用い、選択のこれまでのラウンドから回収した濃縮ファージを使用して実施し、それに続いて、上記のようなプロテインＧビーズを使用して捕獲した。アウトプット力価は、１×１０６〜１×１０９ ｔ．ｕ．／ｍｌの範囲であった。
１０ｎＭ ＣＤ２８−Ｆｃを使用する選択の第３ラウンドと、それに続く、プロテインＧビーズを使用する捕獲を実施した。溶出したファージ力価は、２×１０９〜８×１０９ｔ．ｕ．／ｍｌの範囲であった。
選択ラウンド２および３後にモノクローナルファージＥＬＩＳＡを実施した。すべての洗浄は、２５０μｌのＰＢＳＴの３回の洗浄と、それに続く２５０μｌのＰＢＳの３回の洗浄を使用して実施した。プレートを、それぞれ、ＰＢＳ中の１ｍｇ／ｍｌおよび０．６ｍｇ／ｍｌ ＣＤ２８−Ｆｃを用いて４℃で一晩コーティングした。次いで、プレートを洗浄し、２％ ＭＰＢＳを用いて室温で１時間ブロッキングした。プレートを洗浄し、ファージ上清を等容積の２％ ＭＰＢＳに加え、室温で１時間インキュベートした。プレートを洗浄し、結合しているファージを、２％ ＭＰＢＳで１：５０００希釈した抗Ｍ１３−ＨＲＰコンジュゲート（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，ＵＫ）を用いて検出し、室温で１時間インキュベートした。プレートを洗浄し、ＳｕｒｅＢｌｕｅ １−Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ＴＭＢ ＭｉｃｒｏＷｅｌｌペルオキシダーゼ溶液（ＫＰＬ Ｉｎｃ，ＵＳＡ）を使用してＥＬＩＳＡを作成した。１ｍｇ／ｍｌ Ｆｃ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ，ＵＫ）を用いてコーディングしたプレートと比較することによって特異的ファージを同定した。ラウンド２の後、ライブラリープールＶＨ１４−１５、ＶＨ１８−１９およびＶＫにおいて特異的ファージを主に同定したのに対し、ラウンド３によっては、わずかな特異的ファージしか残っていなかった。すべてのラウンド２プールをｐＤＯＭ５にサブクローニングし（図２）、可溶性ファージとしてスクリーニングした。ファージＥＬＩＳＡは、図３に示されている。
結合性ｄＡｂの配列の同定
結合性ｄＡｂを以下のように同定した。ＶＨ１４−１５、ＶＨ１８−１９およびＶＫアウトプットの各々から９６の個々のコロニー（ｐＤＯＭ５）を選び、Ｃｏｓｔａｒ９６ウェル細胞培養クラスター（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ，ＵＳＡ）中、２５０ｒｐｍで振盪しながら、ＯｎＥｘ自己誘導培地（Ｎｏｖａｇｅｎ，ＵＫ）を含有するＴｅｒｒｉｆｉｃ培養液２００μＬ中、３７℃で、一晩発現させた。培養物を遠心分離して、細胞をペレットとし、ＣＤ２８結合性ｄＡｂについて抗原結合ＥＬＩＳＡによって上清をアッセイした。Ｍａｘｉｓｏｒｐ９６ウェルイムノプレート（Ｎｕｎｃ，ＵＳＡ）を、ＰＢＳ中、１ｍｇ／ｍｌのＣＤ２８−Ｆｃを用いて４℃で一晩コーティングし、次いで、洗浄した。すべての洗浄は、ファージＥＬＩＳＡについて記載された通りとした。プレートを、１％ Ｔｗｅｅｎ ２０を含有するＰＢＳ２００μｌを用いて室温で１時間ブロッキングし、次いで、洗浄した。清澄化したｄＡｂを含有する培養上清を、それぞれ、ＶＨまたはＶＫ ｄＡｂを架橋することによってＥＬＩＳＡシグナル強度を増大するために、ＶＨのためのプロテインＡ（Ｓｉｇｍａ，ＵＫ）またはＶＫのためのプロテインＬ（Ｓｉｇｍａ，ＵＫ）のいずれかの存在下、ＥＬＩＳＡプレートに加えた。このプレートを、室温で１時間インキュベートし、次いで、洗浄した。２段階法を使用して結合しているｄＡｂを検出し、最初に、ＰＢＳＴで１：２０００希釈した９Ｅ１０（抗ｍｙｃ ＩｇＧ，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，ＵＫ）を室温で１時間加え、次いで、洗浄し、それに続いて、抗マウスＦｃ−ＨＲＰをＰＢＳＴで１：２０００に室温で１時間希釈した。プレートを洗浄し、ＳｕｒｅＢｌｕｅ １−Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ＴＭＢ ＭｉｃｒｏＷｅｌｌペルオキシダーゼ溶液（ＫＰＬ Ｉｎｃ，ＵＳＡ）を使用してＥＬＩＳＡを作成し、色を発色させた。比色分析反応を、等容量の１Ｍ ＨＣＬを添加することによって停止し、ＥＬＩＳＡプレートを４５０ｎｍで読み取った。Ｆｃ単独でコーティングした対照プレートと比較することによってＣＤ２８特異的クローンを同定した（可溶性ＥＬＩＳＡの例について図４参照）。すべての特異的クローンを、ＤＮＡ配列決定し、最初に２８個の独特なクローンを同定した（配列については添付書類参照）。ｄＡｂ上清のさらなる２つのプレートを、ＣＤ２８−Ｆｃとの結合についてＢＩＡｃｏｒｅ分析（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，ＵＫ）によってスクリーニングした。このスクリーニングから、さらなる３０個の独特の配列が同定された。
以下の実施例中のｄＡｂアミノ酸配列は、配列表に開示されるｄＡｂ配列と必ずしも正確に対応していない。いくつかの場合には、ｄＡｂアミノ酸配列は、タンパク質のＮ末端に、クローニングを容易にするために発現ベクターに導入されるさらなるアミノ酸残基を含み得る。実施例５（以下参照）では、例えば、組換えによって発現されたｄＡｂのアミノ酸配列は、Ｎ末端にＳｅｒ Ｔｈｒ 配列を含み得る。これらのさらなるＮ末端残基は、ｄＡｂの生物活性に影響を及ぼさないと考えられている。
ｄＡｂ結合特性の特徴づけ
配列決定されたｄＡｂの結合活性を特徴づけするために、５８個のクローンすべてを発現させ、精製し、１２５００ＲＵ（レスポンスユニット（ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｕｎｉｔｓ））のＣＤ２８−ＦｃでコーティングしたＣＭ５チップに対してＢＩＡｃｏｒｅで試験した。ＤＯＭ２１−４、ＤＯＭ２１−６、ＤＯＭ２１−１８、ＤＯＭ２１−２０、ＤＯＭ２１−２２、ＤＯＭ２１−２７およびＤＯＭ２１−２８（ＢＩＡｃｏｒｅトレースについては図５参照）ならびにＤＯＭ２１−３８およびＤＯＭ２１−４４を含め、合計９個のクローンが結合を示した。
ＢＩＡｃｏｒｅ分析に使用したタンパク質濃度は以下の通りとした：
ＤＯＭ２１−４ ４２．３μM
ＤＯＭ２１−６ ６８．１μM
ＤＯＭ２１−１８ １３．８μM
ＤＯＭ２１−２０ ５７．５μM
ＤＯＭ２１−２２ １９．４μM
ＤＯＭ２１−２７ １４．７μM
ＤＯＭ２１−２８ １６．６μM。
本明細書において開示され、特徴づけされたいくつかのｄＡｂをアラインして、観察された活性とともに配列同一性を比較した：
ＤＯＭ２１−１８（ＶＫ）および１ｈ−２３９−８９１（ＶＫ）は、８２．４％同一である。
ＤＯＭ２１−２８（ＶＫ）および１ｈ−２３９−８９１（ＶＫ）は、８３．３％同一である。
ＤＯＭ２１−２８（ＶＫ）および１ｈ−２３９−８５０（ＶＫ）は、８５．２％同一である。
１ｈ−２３９−８９１（ＶＫ）および１ｈ−２３９−８５０（ＶＫ）は、９６．３％同一である。
ＤＯＭ２１−４（ＶＨ）および１ｈ−９９−２３８（ＶＨ）は、８１．７％同一である。
ＤＯＭ２１−２０（ＶＨ）および１ｈ−９９−２３８（ＶＨ）は、７８．９％同一である。
ＤＯＭ２１−４（ＶＨ）および１ｈ−２３９−８５０（ＶＫ）は、２３．９％同一である。
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インビトロｄＡｂ活性アッセイ
dAb活性を、以下の通りインビトロで試験した。ｄＡｂ（ＤＯＭ２１−４、ＤＯＭ２１−６、ＤＯＭ２１−１８、ＤＯＭ２１−２０、ＤＯＭ２１−２２、ＤＯＭ２１−２７およびＤＯＭ２１−２８）のうち７種を発現させ、大規模で精製した。１００μＭのストック濃度の、エンドトキシンが枯渇したｄＡｂサンプルを使用して、ｄＡｂが、Boulougouris, J. Immunol. 1998, 161(8): 3919-3924によって記載されるものと同様の細胞ベースのインビトロアッセイにおいてＣＤ２８の活性を阻害できるかどうかを決定した。増殖アッセイを、１０％ ＦＣＳおよび抗生物質を含有するＲＰＭＩ１６４０培地を使用して、ウェルあたり２００μｌの最終容量で、９６ウェルプレートにおいて３連で実施した。ヒトＣＤ４陽性Ｔ細胞（５×１０４個）を、１μｇ／ｍｌの抗ＣＤ３抗体（ＯＫＴ３）およびＣＤ８０またはＣＤ８６のいずれかを発現するトランスフェクトされたＣＨＯ細胞およびさまざまな濃度のｄＡｂまたは対照抗体の存在下で培養した。アッセイを、ウェルあたり１μＣｉ［３Ｈ］−チミジンの存在下、３７℃で１８時間〜７２時間の間インキュベートした。Ｐａｃｋａｒｄ（Ｍｅｒｉｄｅｎ，ＣＴ）９６ウェルハーベスターを使用して、細胞を９６ウェルフィルタープレート上に回収し、液体シンチレーション計数によって［３Ｈ］−チミジン取込みを決定した。４種のｄＡｂ、ＤＯＭ２１−４、ＤＯＭ２１−１８、ＤＯＭ２１−２０およびＤＯＭ２１−２８は、阻害活性を示し（図６）、ＤＯＭ２１−４およびＤＯＭ２１−２８は、最大程度の阻害を示した（図７）。
ＣＤ８０またはＣＤ８６とのＣＤ２８結合を阻害すると受容体結合アッセイにおいて同定された独特のｄＡｂのＤＮＡ配列が以下に詳述されている。アミノ酸配列も下に示されており、種々のｄＡｂのＣＤＲ領域を下線で示す。
>DOM21-1
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTGATGCGTATTCGATGATTTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCTCAACTATTACTCCGCAGGGTGATAGGACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGCAAGCTGGTTGGAGTTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC（配列番号１）
>DOM21-2
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTGTGGATTATGAGATGGCTTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCTCAACTATTTCGAATGATGGCGCTGCTACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGAAAGATGATGCTGCTTTTGACTACTGGGGTCAGGGAGCCCTGGTCACCGTCTCGAGCG（配列番号２）
>DOM21-3
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTGGTGCGTATTCTATGGGGTGGGCCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCTCATGGATTACGGGGAATGGTGGTTCTACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGAAAGCGGAGGAGCCGTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC（配列番号３）
>DOM21-4
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTAGTAGGTATCATATGGCGTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCTCAGTGATTGATTCTCTTGGTCTTCAGACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGGAATATGGTGGTGCGTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGCG（配列番号４）
>DOM21-5
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTACTCATTATTCTATGGGGTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCTCACATATTACTCCGGATGGTCTTATTACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGATACCGCGGTATATTACTGTGCGAAAGGTAGGTTGGTTGATTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGCG（配列番号５）
>DOM21-6
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTGAGAATTATGGTATGGCTTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCTCAAATATTGGTCGGGCTGGTAGTGTTACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGAAAGTTCAGTCGTGGAGGACTTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC（配列番号６）
>DOM21-7
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTCCTGCGTATTCTATGGGGTGGGTCCGCCAGGCTCCAGAGAAGGGTCTAGAGTGGGTCTCATATATTGATGGGCGTGGTGCTGAGACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGCGCCGAGGATACCGCGGTATATTACTGTGCGAAAATTGATACTCTGATTTCTGAGTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC（配列番号７）
>DOM21-8
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTCCTAATTATACGATGTGGTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCTCATCTATTAGTGGTACTGGTCATACTACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGATACCGCGGTATATTACTGTGCGAAATTTGGGCCTAATAATCCTATGTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC（配列番号８）
>DOM21-9
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTGCGAGTTATGATATGGGTTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCTCAGCGATTTCGGCGGATGGTACGTTTACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGAAATCTTCTTTTGATAAGTATAATTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC（配列番号９）
>DOM21-10
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTGCTAAGTATACGATGTGGTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCTCAAGTATTGATCCTGTTGGTAATTTGACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGAAAAGGGGGCCGACGTCGTCTAATTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC（配列番号１０）
>DOM21-11
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTAGTGAGTATGGTATGAAGTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCTCAACGATTGATAATGTTGGTTCGGTGACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGAAAACTACGCCTGTTTTGCTGCCGCTTTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC（配列番号１１）
>DOM21-12
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTGATTCTTATAATATGGGTTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTTGAGTGGGTCTCAGCTATTGCGGCTAATGGTCGTGTGACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGAAAATGACGAATATGGCGTATGGTAGTTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC（配列番号１２）
>DOM21-13
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTGATCTGTATTCGATGGCTTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTGGAGTGGGTCTCACATATTGATAGGGCTGGTATGATTACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGAAAGTTTCTAATGCTGTTAATATGCAGTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC（配列番号１３）
>DOM21-14
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTGCTAAGTATACGATGTGGTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCTCAAGTATTGATCCTGTTGGTAATTTGACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGAAACGTCATAGGCCTTCGACGCAGGATTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGNCACCGTCTCGAGC（配列番号１４）
>DOM21-15
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTCCTGATTATAAGATGGGTTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCTCATGGATTGATAAGGGTGGTATTATTACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGATACCGCGGTATATTACTGTGCGAAAATGTTTCCTAAGTTTCGGCCGGCTTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGCG（配列番号１５）
>DOM21-16
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTGAGGATTATGGGATGGGGTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCTCACATATTAATCGTTCTGGTCTGGTTACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGAAAGTTCTGAATGCTCCTAATTTTAAGTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGCG（配列番号１６）
>DOM21-17
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTAATCGTTATGCGATGGGTTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCTCATGGATTGATGGTAATGGTCTGGTTACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGAAACGGACTAGGTCTCATTCTGATTCGGGTTGGGCTTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC（配列番号１７）
>DOM21-18
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACCGTGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGTATATTGGTACTTCGTTAAATTGGTACCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGACCTATCAGGCTTCCTTGTTGCAAAGTGGGGTCCCATCACGTTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCTACGTACTACTGTCAACAGTTGGCGCTGCGTCCTATGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGGG（配列番号１８）
>DOM21-19
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTGGTAATTATAATATGGGGTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCTCAGGTATTACGAAGGGTGGTCGGGTGACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGATACCGCGGTATATTACTGTGCGAAATTGGGTCCGTCGAGGATGCTTAATGAGCCGCTGTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGCG（配列番号１９）
>DOM21-20
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTCCGGCGTATTCGATGATTTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCTCAACGATTTCGCCGCTGGGTTATTCGACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGGAACAGACGGCTTATTTGAATCGTGCTACGGAGCATTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGCG（配列番号２０）
>DOM21-21
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTTCGAAGTATGATATGGCTTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTGGAGTGGGTCTCATCGATTTATGCTATTGGTGGTAATACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGAAATTGAAGTCGGGGATGCAGACTCGGTTGAATTCTTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGCG（配列番号２１）
>DOM21-22
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTGAGCTGTATCAGATGGGTTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCTCAACTATTATGCCTAGTGGTAATCTTACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGATACCGCGGTATATTACTGTGCGAAAATGTGGTCGTTGAATTTGGGGTTTCATGCGGCTTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC（配列番号２２）
>DOM21-23
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTGGGCAGTATGGTATGGGTTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCTCAGGGATTAGTCCTTCTGGTAATTATACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGATACCGCGGTATATTACTGTGCGAAAGGGAATGGGTCTCTTCCGCCTCGTGGGTCTATTTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGCG（配列番号２３）
>DOM21-24
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTGGTAATTATAATATGGGGTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCTCAGGTATTACGAAGGGTGGTCGGGTGACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGATACCGCGGTATATTACTGTGCGAAATTGGGTCCGTCGAGGATGCTTAATGAGCCGCTGTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGCG（配列番号２４）
>DOM21-25
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTGGGACGTATTATATGGGGTGGGCCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCTCATCTATTGGGGCTAATGGTGCTCCTACATATTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGATACCGCGGTATATTACTGTGCGAAAATTCGTTCGCTTAATAGGTGGGCGGAGCCTGTGTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC（配列番号２５）
>DOM21-26
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTGCTGATTATTCTATGTATTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTGGAGTGGGTCTCACAGATTAGTCCGGCGGGTTCTTTTACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGATACCGCGGTATATTACTGTGCGAAAGATTCTAAGTCTTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGCG（配列番号２６）
>DOM21-27
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACCGTGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGTATTGGGACGGGTTTACGGTGGTACCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTATGCTCCTGATCTATCGGGCGTCCATTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCACGTTTTAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCTACGTACTACTGTCAACAGACGACTCTTCAGCCTTTTACGTTCAGCCAAGGGACTAAGGTGGAAATCAAACGGG（配列番号２７）
>DOM21-28
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACCGTGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGTCTATTAGTCATTCGTTAGTTTGGTACCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATTGGGCTTCCCTTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCACGTTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCTACGTACTACTGTCAACAGGGTATGACTACGCCTTTTACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGGG（配列番号２８）
>DOM21-30
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTGATAGTTATGATATGAATTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCTCACAGATTTCTGCTGATGGTCATTTTACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGAAATCGCGGAGTAGTTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC（配列番号２９）
>DOM21-31
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTAGGGATTATATGATGGGGTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCTCACGTATTGATTCTCATGGTAATCGTACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGAAACATATGACGGGTTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC（配列番号３０）
>DOM21-32
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTAGGGAGTATATGATGGGGTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCTCACGTATTAATGGTGTGGGTAATTCTACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGAAACATCAGGTGGGTTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC（配列番号３１）
>DOM21-33
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTAGTGATTATATGATGGGTTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCTCACGTATTACGTCTGAGGGTTCGCATACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGAAACATACGTCTGGTTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC（配列番号３２）
>DOM21-34
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTGGGAGGTATATGATGGGGTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTGGAGTGGGTCTCACGGATTTCTGGTCCTGGTACGGTTACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGAAACATGATACGGGGTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC（配列番号３３）
>DOM21-35
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTTCTTCTTATGCTATGATTTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCTCAGAGATTTCTCCTTATGGTAATCATACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGAAACCTGATCGGCGTTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC（配列番号３４）
>DOM21-36
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTACTTCGTATGGGATGCAGTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCTCATCGATTTCTACTGATGGTATGGTTACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGATACCGCGGTATATTACTGTGCGAAACTTGGGGTTAATTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC（配列番号３５）
>DOM21-37
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTGGTGATTATATGATGGGGTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTGGAGTGGGTCTCAATTATTCGTGTGCCTGGTTCGACTACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGAAACAGAAGGGTGATGAGTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC（配列番号３６）
>DOM21-38
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTATTCTGTATGATATGCAGTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCTCACGTATTTCTGCTAATGGTCATGATACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGAAAGGTCCGCATTATTTGTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC（配列番号３７）
>DOM21-39
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGCGCAGCCTCCGGATTCACCTTTACTAAGTATTTTATGGGTTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCTCACTGATTGATCCGCGTGGTCCTCATACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGAAACAGTTGGGTGAGGAGTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC（配列番号３８）
>DOM21-40
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTAAGACTTATACGATGAGGTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCTCAACTATTAATTCGAGTGGTACTTTGACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGATACCGCGGTATATTACTGTGCGAAATCTAGTTCTTATACGTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC（配列番号３９）
>DOM21-41
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTGCGATGTATAGTATGAAGTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCTCATCGATTTCGAATGCTGGTGATATTACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGATACCGCGGTATATTACTGTGCGGAATCGTTTAGGTCTCGTTATTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC（配列番号４０）
>DOM21-42
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTGATGATTATCTTATGGGGTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTGGAGTGGGTCTCACTGATTCGTATGAGGGGTTCTGTTACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGAAACATTCTCTTACTACTAATCTTTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC（配列番号４１）
>DOM21-43
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTACTGATTATATGATGGCTTGGGCCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCTCAATTATTGGGACTACTGGTACGTGGACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGAAAACTAATGCGTATGAGAGTGAGTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC（配列番号４２）
>DOM21-44
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTGCGCGGTATACTATGGTGTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCTCAGCTATTCATTTTGATGGTCGGACTACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAATAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGAAAAATGAGTGGGCGTCTCTTAAGCATTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC（配列番号４３）
>DOM21-45
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTGAGGATTATATGATGGGTTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCTCATTTATTAATCTGCCTGGTGGTCGTACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGAAACAGACTCATGGGCTGACTGGTTATTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC（配列番号４４）
>DOM21-46
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTGGTTTGTATGGTATGGCTTGGGCCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCTCATCGATTGGGATGCATGGTGATACTACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGAAAGTTTGTGGGGCTACGTATTGTAATTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC（配列番号４５）
>DOM21-47
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTGGTAAGTATGTTATGGCTTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCTCAATTATTGATTCCTTGGGTTCTACTACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGAAAGGGGGTTTGTTGGTTCATTATGATTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC（配列番号４６）
>DOM21-48
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTGAGGTGTATGGTATGTCTTGGGCCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCTCATTGATTGATGCGGGTGGTCGGAATACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGATACCGCGGTATATTACTGTGCGAAATCGACGACGCGTGCTTATAGTGATTATTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC（配列番号４７）
>DOM21-49
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTGAGAATTATGATATGCATTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCTCAGGGATTACTACGCATGGTAGGCGTACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGATACCGCGGTATATTACTGTGCGAAAAGTGATAATTTGAATATGAATGTGGATTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC（配列番号４８）
>DOM21-50
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTATTAAGTATGATATGTGTTGGGCCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCTCATGTATTGAGTCTAGTGGTCAGAATACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGAAATGTCTGAATGATAGTTGTAATGTTCATTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC（配列番号４９）
>DOM21-51
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTGGTAATTATAATATGGGGTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCTCAGATATTGGTCGTTATGGTAGGGTTACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGATACCGCGGTATATTACTGTGCGAAAACTCAGCGTATGGTTAATCCGTCGCCTTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC（配列番号５０）
>DOM21-52
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCTTCCGGATTCACCTTTGTTAGTTATAGTATGGGTTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCTCAATTATTTCGGGGCAGGGTACTGTTACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGAAATCGCCGATGGTTTTTGCTTTGGATGGGAGGTCTTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC（配列番号５１）
>DOM21-53
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTACAGCCTCCGGATTCACCTTTTCTGAGTATAGTATGGGGTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCTCAAGTATTACGCCTGTTGGTGTTTTTACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGAAAGGGAGGCCTGGGCCGCATGGTTGGTCTTTTCGGTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC（配列番号５２）
>DOM21-54
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTGGGCAGTATATGATGGGTTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCTCAACTATTGATAAGTCGGGTTATAGTACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGAAAAGTGGGATTGATTCGCGGGGTCTGATGACTAAGTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC（配列番号５３）
>DOM21-55
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTGCTCGTTATCGTATGGCGTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCTCATCTATTCTGAGTGATGGTGCGGTTACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGAAACCTGGGGGGAATGCGTGGTCTACTCGGGTTACTTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC（配列番号５４）
>DOM21-56
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTTTTACGTATACNATGGCTTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCTCATCTATTACGCCGCTTGGTTATAATACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGAAACCGTCGGATGTGAAGGTGTCTCCGCTGCCGAGTTTTGACTACTGGGGTCGGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC（配列番号５５）
>DOM21-57
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTACTATGTATGGTATGCATTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCTCATCGATTTCTCAGTATGGTCTTTCTACATACTACGCAGATTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGAAAGGGTCTATGAGGCGGGTGTTTAGTAGTTCGGATACTTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC（配列番号５６）
>DOM21-58
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACCGTGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAATATAGGTGATCGGTTACATTGGTACCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATCGTATTTCCCGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCACGTTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCTACGTACTACTGTCAACAGTTTGGGCTGTATCCTACTACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGG（配列番号５７）
DOM21-4
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYHMAWVRQAPGKGLEWVSVIDSLGLQTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAEYGGAFDYWGQGTLVTVSS（配列番号４０１）
DOM21-20
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFPAYSMIWVRQAPGKGLEWVSTISPLGYSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAEQTAYLNRATEHFDYWGQGTLVTVSS（配列番号４０２）
DOM21-1
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFDAYSMIWVRQAPGKGLEWVSTITPQGDRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAQAGWSFDYWGQGTLVTVSS（配列番号４０３）
DOM21-2
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFVDYEMAWVRQAPGKGLEWVSTISNDGAATYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDDAAFDYWGQGALVTVSS（配列番号４０４）
DOM21-3
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFGAYSMGWARQAPGKGLEWVSWITGNGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKAEEPFDYWGQGTLVTVSS（配列番号４０５）
DOM21-4
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYHMAWVRQAPGKGLEWVSVIDSLGLQTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAEYGGAFDYWGQGTLVTVSS（配列番号４０６）
DOM21-5
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTHYSMGWVRQAPGKGLEWVSHITPDGLITYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGRLVDFDYWGQGTLVTVSS（配列番号４０７）
DOM21-6
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFENYGMAWVRQAPGKGLEWVSNIGRAGSVTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKVQSWRTFDYWGQGTLVTVSS（配列番号４０８）
DOM21-7
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFPAYSMGWVRQAPEKGLEWVSYIDGRGAETYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKIDTLISEFDYWGQGTLVTVSS（配列番号４０９）
DOM21-8
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFPNYTMWWVRQAPGKGLEWVSSISGTGHTTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKFGPNNPMFDYWGQGTLVTVSS（配列番号４１０）
DOM21-9
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFASYDMGWVRQAPGKGLEWVSAISADGTFTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSSFDKYNFDYWGQGTLVTVSS（配列番号４１１）
DOM21-10
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFAKYTMWWVRQAPGKGLEWVSSIDPVGNLTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKRGPTSSNFDYWGQGTLVTVSS（配列番号４１２）
DOM21-11
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSEYGMKWVRQAPGKGLEWVSTIDNVGSVTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKTTPVLLPLFDYWGQGTLVTVSS（配列番号４１３）
DOM21-12
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFDSYNMGWVRQAPGKGLEWVSAIAANGRVTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKMTNMAYGSFDYWGQGTLVTVSS（配列番号４１４）
DOM21-13
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFDLYSMAWVRQAPGKGLEWVSHIDRAGMITYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKVSNAVNMQFDYWGQGTLVTVSS（配列番号４１５）
DOM21-14
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFAKYTMWWVRQAPGKGLEWVSSIDPVGNLTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKRHRPSTQDFDYWGQGTLVTVSS（配列番号４１６）
DOM21-15
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFPDYKMGWVRQAPGKGLEWVSWIDKGGIITYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKMFPKFRPAFDYWGQGTLVTVSS（配列番号４１７）
DOM21-16
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFEDYGMGWVRQAPGKGLEWVSHINRSGLVTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKVLNAPNFKFDYWGQGTLVTVSS（配列番号４１８）
DOM21-17
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNRYAMGWVRQAPGKGLEWVSWIDGNGLVTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKRTRSHSDSGWAFDYWGQGTLVTVSS（配列番号４１９）
DOM21-19
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFGNYNMGWVRQAPGKGLEWVSGITKGGRVTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKLGPSRMLNEPLFDYWGQGTLVTVSS（配列番号４２０）
DOM21-20
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFPAYSMIWVRQAPGKGLEWVSTISPLGYSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAEQTAYLNRATEHFDYWGQGTLVTVSS（配列番号４２１）
DOM21-21
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSKYDMAWVRQAPGKGLEWVSSIYAIGGNTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKLKSGMQTRLNSFDYWGQGTLVTVSS（配列番号４２２）
DOM21-22
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFELYQMGWVRQAPGKGLEWVSTIMPSGNLTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKMWSLNLGFHAAFDYWGQGTLVTVSS（配列番号４２３）
DOM21-23
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFGQYGMGWVRQAPGKGLEWVSGISPSGNYTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGNGSLPPRGSIFDYWGQGTLVTVSS（配列番号４２４）
DOM21-24
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFGNYNMGWVRQAPGKGLEWVSGITKGGRVTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKLGPSRMLNEPLFDYWGQGTLVTVSS（配列番号４２５）
DOM21-25
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFGTYYMGWARQAPGKGLEWVSSIGANGAPTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKIRSLNRWAEPVFDYWGQGTLVTVSS（配列番号４２６）
DOM21-26
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFADYSMYWVRQAPGKGLEWVSQISPAGSFTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDSKSFDYWGQGTLVTVSS（配列番号４２７）
DOM21-40
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFKTYTMRWVRQAPGKGLEWVSTINSSGTLTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSSSYTFDYWGQGTLVTVSS（配列番号４２８）
DOM21-41
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFAMYSMKWVRQAPGKGLEWVSSISNAGDITYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAESFRSRYFDYWGQGTLVTVSS（配列番号４２９）
DOM21-42
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFDDYLMGWVRQAPGKGLEWVSLIRMRGSVTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKHSLTTNLFDYWGQGTLVTVSS（配列番号４３０）
DOM21-43
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTDYMMAWARQAPGKGLEWVSIIGTTGTWTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKTNAYESEFDYWGQGTLVTVSS（配列番号４３１）
DOM21-44
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFARYTMVWVRQAPGKGLEWVSAIHFDGRTTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKNEWASLKHFDYWGQGTLVTVSS（配列番号４３２）
DOM21-45
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFEDYMMGWVRQAPGKGLEWVSFINLPGGRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKQTHGLTGYFDYWGQGTLVTVSS（配列番号４３３）
DOM21-46
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFGLYGMAWARQAPGKGLEWVSSIGMHGDTTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKVCGATYCNFDYWGQGTLVTVSS（配列番号４３４）
DOM21-47
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFGKYVMAWVRQAPGKGLEWVSIIDSLGSTTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGGLLVHYDFDYWGQGTLVTVSS（配列番号４３５）
DOM21-48
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFEVYGMSWARQAPGKGLEWVSLIDAGGRNTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSTTRAYSDYFDYWGQGTLVTVSS（配列番号４３６）
DOM21-49
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFENYDMHWVRQAPGKGLEWVSGITTHGRRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSDNLNMNVDFDYWGQGTLVTVSS(配列番号４３７）
DOM21-50
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFIKYDMCWARQAPGKGLEWVSCIESSGQNTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKCLNDSCNVHFDYWGQGTLVTVSS（配列番号４３８）
DOM21-51
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFGNYNMGWVRQAPGKGLEWVSDIGRYGRVTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKTQRMVNPSPFDYWGQGTLVTVSS（配列番号４３９）
DOM21-52
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFVSYSMGWVRQAPGKGLEWVSIISGQGTVTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSPMVFALDGRSFDYWGQGTLVTVSS（配列番号４４０）
DOM21-53
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCTASGFTFSEYSMGWVRQAPGKGLEWVSSITPVGVFTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGRPGPHGWSFRFDYWGQGTLVTVSS（配列番号４４１）
DOM21-54
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFGQYMMGWVRQAPGKGLEWVSTIDKSGYSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSGIDSRGLMTKFDYWGQGTLVTVSS（配列番号４４２）
DOM21-55
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFARYRMAWVRQAPGKGLEWVSSILSDGAVTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKPGGNAWSTRVTFDYWGQGTLVTVSS（配列番号４４３）
DOM21-57
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTMYGMHWVRQAPGKGLEWVSSISQYGLSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGSMRRVFSSSDTFDYWGQGTLVTVSS（配列番号４４４）
DOM21-59
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFDSYDMNWVRQAPGKGLEWVSQISADGHFTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSRSSFDYWGQGTLVTVSS（配列番号４４５）
DOM21-60
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFRDYMMGWVRQAPGKGLEWVSRIDSHGNRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKHMTGFDYWGQGTLVTVSS（配列番号４４６）
DOM21-61
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFREYMMGWVRQAPGKGLEWVSRINGVGNSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKHQVGFDYWGQGTLVTVSS（配列番号４４７）
DOM21-62
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYMMGWVRQAPGKGLEWVSRITSEGSHTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKHTSGFDYWGQGTLVTVSS（配列番号４４８）
DOM21-63
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFGRYMMGWVRQAPGKGLEWVSRISGPGTVTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKHDTGFDYWGQGTLVTVSS（配列番号４４９）
DOM21-64
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMIWVRQAPGKGLEWVSEISPYGNHTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKPDRRFDYWGQGTLVTVSS（配列番号４５０）
DOM21-65
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTSYGMQWVRQAPGKGLEWVSSISTDGMVTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKLGVNFDYWGQGTLVTVSS（配列番号４５１）
DOM21-66
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFGDYMMGWVRQAPGKGLEWVSIIRVPGSTTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKQKGDEFDYWGQGTLVTVSS（配列番号４５２）
DOM21-67
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFILYDMQWVRQAPGKGLEWVSRISANGHDTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGPHYLFDYWGQGTLVTVSS（配列番号４５３）
DOM21-68
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTKYFMGWVRQAPGKGLEWVSLIDPRGPHTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKQLGEEFDYWGQGTLVTVSS（配列番号４５４）
DOM21-18
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQYIGTSLNWYQQKPGKAPKLLTYQASLLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQLALRPMTFGQGTKVEIKR（配列番号４５５）
DOM21-28
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISHSLVWYQQKPGKAPKLLIYWASLLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGMTTPFTFGQGTKVEIKR（配列番号４５６）
DOM21-18
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQYIGTSLNWYQQKPGKAPKLLTYQASLLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQLALRPMTFGQGTKVEIKR（配列番号４５７）
DOM21-27
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIGTGLRWYQQKPGKAPMLLIYRASILQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTTLQPFTFSQGTKVEIKR（配列番号４５８）
DOM21-28
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISHSLVWYQQKPGKAPKLLIYWASLLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGMTTPFTFGQGTKVEIKR（配列番号４５９）
DOM21-58
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQNIGDRLHWYQQKPGKAPKLLIYRISRLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQFGLYPTTFGQGTKVEIKR（配列番号４６０）
DOM21-30
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFDSYDMNWVRQAPGKGLEWVSQISADGHFTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSRSSFDYWGQGTLVTVSS（配列番号４６１）
DOM21-31
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFRDYMMGWVRQAPGKGLEWVSRIDSHGNRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKHMTGFDYWGQGTLVTVSS（配列番号４６２）
DOM21-32
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFREYMMGWVRQAPGKGLEWVSRINGVGNSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKHQVGFDYWGQGTLVTVSS（配列番号４６３）
DOM21-33
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYMMGWVRQAPGKGLEWVSRITSEGSHTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKHTSGFDYWGQGTLVTVSS（配列番号４６４）
DOM21-34
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFGRYMMGWVRQAPGKGLEWVSRISGPGTVTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKHDTGFDYWGQGTLVTVSS（配列番号４６５）
DOM21-35
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMIWVRQAPGKGLEWVSEISPYGNHTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKPDRRFDYWGQGTLVTVSS（配列番号４６６）
DOM21-36
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTSYGMQWVRQAPGKGLEWVSSISTDGMVTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKLGVNFDYWGQGTLVTVSS（配列番号４６７）
DOM21-37
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFGDYMMGWVRQAPGKGLEWVSIIRVPGSTTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKQKGDEFDYWGQGTLVTVSS（配列番号４６８）
DOM21-38
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFILYDMQWVRQAPGKGLEWVSRISANGHDTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGPHYLFDYWGQGTLVTVSS（配列番号４６９）
DOM21-39
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTKYFMGWVRQAPGKGLEWVSLIDPRGPHTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKQLGEEFDYWGQGTLVTVSS（配列番号４７０）
DOM21-56
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFFTYXMAWVRQAPGKGLEWVSSITPLGYNTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKPSDVKVSPLPSFDYWGRGTLVTVSS（配列番号４７１）
以下のさらなるＶＨおよびＶＫ ｄＡｂを調製、単離および特徴づけした。種々のｄＡｂのアミノ酸配列は以下に示されており、種々のｄＡｂのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域は太字フォントである。種々のｄＡｂのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３アミノ酸配列も以下に別個に示されている。
VK dAb:1h-239-850（配列番号５８）
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASRPIWPFLEWYQQKPGKAPKLLIYFTSRLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQNVSMPATFSQGTKVEIKR
1h-35（配列番号５９）DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQYIGSALSWYQQKPGKAPKLLIYRASNLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQLAIRPFTFGQGTKVEIKR
1h-36（配列番号６０）
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASRDIALDLLWYQQKPGKAPKLLIKGWSGLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCAQGWGRPVTFGQGTKVEIKR
1h-79（配列番号６１）
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQPIGHSLAWYQQKPGKAPKLLIYWASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQMLRTPFTFGQGTKVEIKR
1h-80（配列番号６２）
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQRIGSNLAWYQQKPGKAPKLLIYWASLLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTRSAPFTFGQGTKVEIKR
1h-83（配列番号６３）
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIGHSLVWYQQKPGKAPKLLIYWASLLQSGVSSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSRAAPFTFGQGTKVEIKR
1h-108（配列番号６４）
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQYIGTALNWYQQKPGKAPKLLIYRRSHLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQIALTPYTFGQGTKVEIKR
1h-203（配列番号６５）
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQPIGSVLAWYQQKPGKAPKLLIYFSSILQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQALRSPFTFGQGTKVEIKR
1h-207（配列番号６６）
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQYIGTSLAWYQQKPGKAPKLLIYHSSGLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTALRPFTFGQGTKVEIKR
1h-238（配列番号６７）
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQHINASLGWYQQKPGKAPKLLIYWASQLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQMVRTPFTFGQGTKVEIKR
1h-239（配列番号６８）
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIYPFLEWYQQKPGKAPKLLIYFTSRLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQNATNPATFGQGTKVEIKR
1h-18-1（配列番号６９）
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQYIGTSLNWYQQKPGKAPKLLTYQASFLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQLALRPMTFGQGTKVEIKR
1h-18-2（配列番号７０）
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQYIGTSLNWYQQKPGKAPKLLTYQASLLQSGVPSRFSGSGYGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQLALRPMTFGQGTKVEIKR
1h-18-3（配列番号７１）
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQYIGTSLNWYQQKPGKAPKLLTYRASLLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQLALRPMTFGQGTKVEIKR
1h-18-4（配列番号７２）
DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQYIGTSLNWYQQKPGKAPKLLAYQASLLQSGVPSRFSGSGYGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQLALRPMTFGQGTKVEIKR
1h-18-5（配列番号７３）
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQYIGTSLNWYQQKPGKAPKLLTYQASLLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQLAMRPMTFGQGTKVEIKW
1h-18-6（配列番号７４）
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQYIGTSLNWYQQKPGKAPKLLIYQASLLQSGVPSRFSGSGYGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQLALRPMTFGQGTKVEIKR
1h-28-1（配列番号７５）
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISHSLVWYQQKPGKAPKLLIYWASLLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGMSTPFTFGQGTKVEIKR
1h-28-2（配列番号７６）
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISHSLVWYQQKPGKAPKLLIYWASLLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGMTAPFTFGQGTKVEIKR
1h-31（配列番号７７）
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIGYSLAWYQQKPGKAPKLLIYWVSSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTQRTPFTFGQGTKVEIKR
1h-32（配列番号７８）
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQNIGHGLAWYQQKPGKAPKLLIYWVSLLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTLSKPFTFGQGTKVEIKR
1h-33（配列番号７９）
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSNIHNRLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCRQWIQPPWTFGQGTKVEIKR
1h-34（配列番号８０）
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQYIGTSLAWYQQKPGKAPKLLIYHSSGLQSGVPLRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTALRPFTFGQGTKVEIKR
1h-35（配列番号８１）
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQYIGSALSWYQQKPGKAPKLLIYRASNLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQLAIRPFTFGQGTKVEIKR
1h-35-15（配列番号８２）
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQYIGSALGWYLQKPGKAPKLLIYRASNLQSGVPSRFSGSGYGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQLAIRPFTFGQGTKVEIKR
1h-35-2（配列番号８３）
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQYIGSALGWYQQKPGKAPKLLIYRASHLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQLAIRPFTFGQGTKVEIKR
1h-35-5（配列番号８４）
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQYIGSAISWYQQKPGRAPKLLIYRASYLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQLAIRPFTFGQGTKVGIKR
1h-35-7（配列番号８５）
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQYIGSALGWYQQKPGKAPKLLIYRASNLQSGVPSRFSGSGYGTGFTLTISSLQPEDFATYYCQQLAIRPFTFGQGTKVEIKR
1h-35-9（配列番号８６）
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQYIGSALGWYQQKPGKAPKLLIYRASNMQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQLAIRPFTFGQGTKVEIKR
1h-36（配列番号８７）
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASRDIALDLLWYQQKPGKAPKLLIKGWSGLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCAQGWGRPVTFGQGTKVEIKR
1h-36-1（配列番号８８）
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASRDIALDILWYQQKPGKAPKLLIKGWSGLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCARGWGRPVTFGQGTKVEIKR
1h-36-2（配列番号８９）
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASRDIALDILWYQQKPGKAPKLLIKGWSGLQSEVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCAKGWGRPVTFGQGTKVEIKR
1h-36-3（配列番号９０）DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASRDIALDLMWYQQKPGKAPKLLIKGWSGLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCAQGWGRPVTFGQGTKVEIKR
1h-36-4（配列番号９１）
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASRDIALDLSWYQHKPGKAPKLLIKGWSGLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTINSLQPEDFATYYCAQGWGRPVTFGQGTKVEIKR
1h-36-5（配列番号９２）
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASRDIALDLSWYQQKPGRAPKLLIKGWSGLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCAQGWGRPETFGQGTKVEIKR
1h-36-6（配列番号９３）
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASRDIALDLLWYQLKPGKAPKLLIKGWSGLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYFCAQGWGRPVTFGQGTKVEIKR
1h-36-7（配列番号９４）
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASRDIALDLLWYQQKPGKAPKLLIKGWSGLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCAQGWGRPATFGQGTKVEIKR
1h-38（配列番号９５）
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQPIGSVLAWYQQKPGKAPKLLIYFSSILQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISGLQPEDFATYYCQQALRSPFTFGQGTKVEIKR
1h-39（配列番号９６）
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQYIGTALHWYQQKPGKAPRLLIYLSSNLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSALNPYTFGQGTKVEIKR
1h-69（配列番号９７）
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQKIGTGLRWYQQKPGKAPKLLIYRASVLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTAFPPYTFGQGTKVEIKR
1h-70（配列番号９８）
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIGTGLRWYQQKPGKAPMLLIYRASILQSGVPSRFSGGGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTWYRPYTFGQGTKVEIKR
1h-71（配列番号９９）
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASRDIGHMLNWYQQKPGKAPKLLIWFGSVLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCVQGRLRPPTFGQGTKVEIKR
1h-72（配列番号１００）
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASRSINHWLDWYQQKPGKAPTLLISGVSWLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCCQPGFRPCTFGQGTKVEIKR
1h-73（配列番号１０１）
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQYIGTQLSWYQQKPGKAPKLLIYRGSLLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTALSPYTFGQGTKVEIKR
1h-74（配列番号１０２）
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQYIGGALSWYQQKPGKAPKLLIYRASRLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQVALVPYTFGQGTKVEIKR
1h-75（配列番号１０３）
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQYIGTRLSWYQQKPGKAPKLLIYNASFLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQLALSPLTFGQGTKVEIKR
1h-76（配列番号１０４）
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQYIGTRLVWYQQKPGKAPKLLIYQSSLLQSGVPSRFRGSGSGTDFTLTISSLQPEDSATYYCQQTALVPYTFGQGTKVEIKR
1h-77（配列番号１０５）
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIYPFLEWYQQKPGKAPRLLIYFTSRLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSASMPITFGQGTKVEIKR
1h-78（配列番号１０６）
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQNIGHMLAWYQQKPGKAPKLLIYWGSLLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQARAAPFTFGQGTKVEIKR
1h-79（配列番号１０７）
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQPIGHSLAWYQQKPGKAPKLLIYWASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQMLRTPFTFGQGTKVEIKR
1h-79-1（配列番号１０８）
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQPIGHSFGWYQQKPGKAPKLLIYWASTLQSGVPTRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQMLRTPFTFGQGTKVEIKR
1h-79-10（配列番号１０９）
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQPIGHSLGWYQQKPGKAPKLLFYWASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQMLRTPFTFGQGTKVEIKR
1h-79-11（配列番号１１０）
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQPIGHSFGWYQQKPGKAPKLLIYWASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDLATYYCQQMLRTPFTFGHGTKVEIKR
1h-79-15（配列番号１１１）
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQPIGHSLGWYQQKPGKAPKLLIYWASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTITISSLQPEDFATYYCQQMLRTPFTFGQGTKVEIKR
1h-79-1505（配列番号１１２）
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQPIGHSLGWYQQKPGKAPKLLIYWGSWLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQMLRTPFTFGQGTKVEIKR
1h-79-1512（配列番号１１３）
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQPIGHSLGWYQQKPGKAPKLLIYWASVLLHGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQMLRTPFTFGQGTKVEIKR
1h-79-1519（配列番号１１４）
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQPIGHSLGWYQQKPGKAPKLLIYWASLLLDGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQMLRTPFTFGQGTKVEIKR
1h-79-1520（配列番号１１５）
DIQMTQSPSSLSASVGDRVAITCRASQPIGHSLGWYEQKPGKAPKLLIYWSSVLISGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQMLRTPFTFGQGTKVEIKR
1h-79-16（配列番号１１６）
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQPIGHSFAWYQQKPGKAPKLLIYWASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYFCQQMLRTPFTFGQGTKVEIKR
1h-79-17（配列番号１１７）
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQPIGHSLAWYQQKPGKAPKLLIYWASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQMLRTPFAFGQGTKVEIKR
1h-79-18（配列番号１１８）
DIQMTQSSSSLSASVGDRVSITCRASQPIGHSLGWYQQKPGKAPKLLIYWASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPADSATYYCQQMLRTPFTFGQGTKVEIKR
1h-79-19（配列番号１１９）
DIQMTQSPSSRSASVGDRVTITCRASQPIGHSLGWYQQKPGKAPKLLIYWASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQMLRTPFTFGQGTKVEIKR
1h-79-2（配列番号１２０）
DTQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASRPIGHSLGWYQQKPGKAPKLLIYWASMLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQMLRTPFTFGQGTKVEIKR
1h-79-20（配列番号１２１）
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTVTCRASQPIGHSLAWYQQKPGKAPKLLIYWASMLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQMLRTPFTFGQGTKVEIKR
1h-79-21（配列番号１２２）
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQPIGHSFAWYQQKPGKAPKLLIYWASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQMLRTPFTFGQGTKVEIKR
1h-79-22（配列番号１２３）
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQPIGHSLAWYQQKPGKAPKLLIYWASMLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQMLRTPFSFGQGTKVEIKR
1h-79-23（配列番号１２４）
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQPIGHSFAWYQQKPGKAPKLLIYWASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQMLRTPFMFGQGTKVEIKR
1h-79-24（配列番号１２５）
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQPIGHSLGWYQQKPGKAPKLLIYWASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQMLRTPFAFGQGTKVEIKR
1h-79-25（配列番号１２６）
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQPIGHSFAWYQQKPGKAPKLLIYWASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQMLRTPFAFGQGTKVEIKR
1h-79-26（配列番号１２７）
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQPIGHSLGWYQQKPGKAPKLLIYWASMLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQMLRTPFSFGQGTKVEIKR
1h-79-27（配列番号１２８）
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQPIGHSFAWYQQKPGKAPKLLIYWASMLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQMLRTPFSFGQGTKVEIKR
1h-79-28（配列番号１２９）
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQPIGHSLGWYQQKPGKAPKLLIYWASMLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQMLRTPFMFGQGTKVEIKR
1h-79-29（配列番号１３０）
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQPIGHSLGWYQQKPGKAPKLLIYWASMLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQMLRTPFAFGQGTKVEIKR
1h-79-3（配列番号１３１）
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQPIGHSLGWYQQKPGKAPKLLIYWASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLRPEDFATYYCQQMLRTPFTFGQGTKVEIKR
1h-79-30（配列番号１３２）
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQPIGHSFGWYQQKPGKAPKLLIYWASMLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQMLRTPFSFGQGTKVEIKR
1h-79-31（配列番号１３３）
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQPIGHSFGWYQQKPGKAPKLLIYWASMLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQMLRTPFMFGQGTKVEIKR
1h-79-32（配列番号１３４）
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQPIGHSFGWYQQKPGKAPKLLIYWASMLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQMLRTPFAFGQGTKVEIKR
1h-79-4（配列番号１３５）
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQPIGHSLGWYQQKPGKAPRLLIYWASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQMLRTPFTFGQGTKVEIKR
1h-79-5（配列番号１３６）
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQPIGHSLGWYQQKPGKAPKLLIYWASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQMLRTPFTFGQGTKVENKR
1h-79-6（配列番号１３７）
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQPIGHSFAWYQQKPGKAPKLLIYWASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQREDFATYYCQQMLRTPFTFGQGTKVEIKR
1h-79-7（配列番号１３８）
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQPIGHSLGWYQQKPGKAPKLLTYWASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQMLRTPFTFGQGTKVEIKR
1h-79-8（配列番号１３９）
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQPIGHSLGWYQQKPGKAPKLLIYWASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQMLRTPFMFGQGTKVEIKR
1h-79-801（配列番号１４０）
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQPIGHSLGWYQQKPGKAPKLLIYWGSDLYKGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQMLRTPFMFGQGTKVEIKR
1h-79-802（配列番号１４１）
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASTPIGHSLGWYQQKPGKAPKLLIYWASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQMLRTPFMFGQGTKVEIKR
1h-79-803（配列番号１４２）
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIGHSLGWYQQKPGKAPKLLIYWASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQMLRTPFMFGQGTKVEIKR
1h-79-804（配列番号１４３）
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASKPISHSLGWYQQKPGKAPKLLIYWASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQMLRTPFMFGQGTKVEIKR
1h-79-805（配列番号１４４）
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQAIDHSLGWYQQKPGKAPKLLIYWASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQMLRTPFMFGQGTKVEIKR
1h-79-806（配列番号１４５）
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQPIGHSLGWYQQKPGKAPKLLIYWASMLQGGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQMLRTPFMFGQGTKVEIKR
1h-79-807（配列番号１４６）
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQPIGHTLGWYQQKPGKAPKLLIYWASDLIRGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQMLRTPFMFGQGTKVEIKR
1h-79-808（配列番号１４７）
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQPIGHALGWYQQKPGKAPRLLIYWASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQMLRTPFMFGQGTKVEIKR
1h-79-809（配列番号１４８）
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQAIGHSLGWYQQKPGKAPKLLVYWASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQMLRTPFMFGQGTKVEIKR
1h-79-810（配列番号１４９）
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQPIGHSLGWYQQKPGKAPKLLIYWGSDLSYGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQMLRTPFMFGQGTKVEIKR
1h-79-811（配列番号１５０）
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASRSIGHSLGWYQQKPGKAPKLLIYWASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQMLRTPFMFGQGTKVEIKR
1h-79-812（配列番号１５１）
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSTIGHSLGWYQQKPGKAPKLLIYWASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQMLRTPFMFGQGTKVEIKR
1h-79-813（配列番号１５２）
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQPIGHSLGWYQQKPGKAPKLLIYWASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQMMRTPFMFGQGTKVEIKR
1h-79-814（配列番号１５３）
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSRIGSSLGWYQQKPGKAPKLLIYWASMLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQMLRTPFMFGQGTKVEIKR
1h-79-815（配列番号１５４）
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASRAIGHSLGWYQQKPGKAPKLLIYWASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQMLRTPFMFGQGTKVEIKR
1h-79-9（配列番号１５５）
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQPIGHSLGWYQQKPGKAPKLLIYWASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPADFATYYCQQMLRTPFTFGRGTKVEIKR
1h-80（配列番号１５６）
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQRIGSNLAWYQQKPGKAPKLLIYWASLLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTRSAPFTFGQGTKVEIKR
1h-80-1（配列番号１５７）
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQRIGSNLAWYQQKPGRAPKLLIYWASLLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLIISSLQPEDFATYYCQQTRSAPFAFGQGTKVEIKR
1h-80-10（配列番号１５８）
DLQMTQSPSSLSASVGDSVTITCRASQRIGSNLAWYQQKPGKAPKLLIYWASLLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTRSAPFTFGQGTKVEIKR
1h-80-11（配列番号１５９）
DFQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRAGQRIGSNLAWYQQKPGKAPKLLIYWASLLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTRSAPFTFGQGTKVEIKR
1h-80-12（配列番号１６０）
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQRIGSNLAWYQQKPGKAPKLLVYWASLLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTRSAPFTFGQGTKVEIKR
1h-80-2（配列番号１６１）
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQRIGSNLAWYQQKPGKAPKLLIYWASLLQSGVPSRFSGSGSETDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTRSAPFAFGQGTKVEIKR
1h-80-3（配列番号１６２）
DIQMTQSPSSLSESIGDRVTITCRASQRIGSNLAWYQQKPGKAPKLLIYWASLLQNGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTRSAPFTFGQGTKVEIKR
1h-80-4（配列番号１６３）
DIQMIQSPSSLSASVGERVTIICQASQRIGSNLAWYQQKPGKAPKLLIYWASLLQSGVPSRFSGSGSGSDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTRSAPFTFGQGTKVEIKR
1h-80-5（配列番号１６４）
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQRIGSNLAWYQQKPGKAPKLLIYWASLLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTINSLQPEDFATYYCQQTRSAPFTFGQGTKVEIKR
1h-80-6（配列番号１６５）
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIGSNLAWYQQKPGKAPKLLIYWASLLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQETRSAPFTFGQGTKVEIKR
1h-80-7（配列番号１６６）
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQRIGSNLAWYQQKPGKAPKLLIYWASLLQSGVPSRFSGSGSGSDFTLTISSLQPEDFATYYCQETRSAPFTFGQGTKVEIKR
1h-80-8（配列番号１６７）
DLQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQRIGSNLAWYQQKPGKAPKLLIYWASLLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDYATYYCQQTRSAPFTFGQGTKVEIKR
1h-80-9（配列番号１６８）
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQRIGSNLAWYQQKPGKAPKLLIYWASLLQSGVPSRFSGSGSATDFTLTISSLRPEDFATYYCQQTRSAPFAFGQGTKVEIKR
1h-81（配列番号１６９）
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQEIDHGLAWYQQKPGKAPKLLIYWASRLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQVVAAPFTFGQGTKVEIKR
1h-82（配列番号１７０）
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIGLNLLWYQQKPGKAPTLLIYWSSMLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGRMRPFTFGQGTKVEIKR
1h-83（配列番号１７１）
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIGHSLVWYQQKPGKAPKLLIYWASLLQSGVSSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSRAAPFTFGQGTKVEIKR
1h-84（配列番号１７２）
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIGKGLMWYQQKPGKAPKLLIYWASMLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSLRTPFTFGQGTEVEIKR
1h-85（配列番号１７３）
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1h-86（配列番号１７４）
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1h-87（配列番号１７５）
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIGKSLAWYQQKPGKAPKLLIYWVSLLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQIVSRPFTFGQGTKVEIKR
1h-88（配列番号１７６）
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQAISNGLLWYQQKPGKAPKLLIYWTSLLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQVLRRPFTFGQGTKVEIKR
1h-89（配列番号１７７）
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIANSLVWYQQKPGKAPKLLIYWVSILQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTIAAPFTFGQGTKVEIKR
1h-90（配列番号１７８）
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQTIGHGLVWYQQKPGKAPKLLIYWSSHLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTLRTPFTFGQGTKVEIKR
1h-107（配列番号１７９）
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQYIGNALAWYQQKPGKAPKLLIYRGSYLQSGVPSRFSGSGSRTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTALRPLTFGQGTKVEIKR
1h-108（配列番号１８０）
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQYIGTALNWYQQKPGKAPKLLIYRRSHLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQIALTPYTFGQGTKVEIKR
1h-108-1（配列番号１８１）
DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQYIGTALNWYQQKPGKAPKLLIYRGSHLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQIALTPYTFGQGTKVEIKR
1h-108-10（配列番号１８２）
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1h-108-11（配列番号１８３）
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1h-108-12（配列番号１８４）
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQYIGTALNWYQQKPGEAPKLLIYRRSHLQSGVPSRFSGSGSETDFTLTISSLQPEDFVTYYCQQIALTPYTFGQGTKVEIKR
1h-108-2（配列番号１８５）
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTISCRASQYIGTALNWYQQKPGEAPKLLIYRRSHLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQIALTPFTFGQGTKVEIKR
1h-108-3（配列番号１８６）
DIQMTQSPTSLSASVGDRVIITCRASQYIGTALNWYQQKPGKAPKLLIYRGSHLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQIALTPYTFGQGTKVEIKR
1h-108-4（配列番号１８７）
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1h-108-5（配列番号１８８）
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1h-108-6（配列番号１８９）
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1h-108-7（配列番号１９０）
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1h-108-8（配列番号１９１）
DIQMTQSPSSLSASVGDRVIITCRASQYIGTALNWYQQKPGNAPKLLIYRGSHLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLLPEDYATYYCQQIALTPYTFSQGTKVEIKR
1h-108-9（配列番号１９２）
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1h-109（配列番号１９３）
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1h-110（配列番号１９４）
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1h-111（配列番号１９５）
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1h-116（配列番号１９６）
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1h-200（配列番号１９７）
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASRDIALDLLWYQQKPGKAPKLLIKGWSGLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCAQGWGRPVTFGQGTKVEIKC
1h-201（配列番号１９８）
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1h-202（配列番号１９９）
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1h-203（配列番号２００）
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1h-203-1（配列番号２０１）
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1h-203-2（配列番号２０２）
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1h-203-3（配列番号２０３）
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1h-204（配列番号２０４）
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1h-205（配列番号２０５）
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1h-207（配列番号２０６）
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1h-208（配列番号２０７）
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQYIGTALHWYQQKPGKAPKLLIYLSSNLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSALNPYTFGQGTKVEIKR
1h-209（配列番号２０８）
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1h-217（配列番号２０９）
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIGYSLAWYQQKPGKAPKLLIYWVSSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTQRTPFTFGQGTKVEIKC
1h-218（配列番号２１０）
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQYIGSALSWYQQKPGKAPKLLIYRASNLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQLAIRPFTFGQGTKVEIKC
1h-219（配列番号２１１）
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1h-220（配列番号２１２）
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1h-221（配列番号２１３）
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1h-223（配列番号２１４）
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1h-225（配列番号２１５）
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQYIGTSLAWYQQKPGKAPKLLIYHSSGLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTALRPFTFGQGTKVEIKC
1h-227（配列番号２１６）
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1h-228（配列番号２１７）
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1h-229（配列番号２１８）DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQYIGTRLVWYQQKPGKAPKLLIYQSSLLQSGVPSRFRGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTALVPYTFGQGTKVEIKC
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1h-234（配列番号２２２）
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1h-236（配列番号２２４）
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQYIGTALNWYQQKPGKDPKLLIYRRSHLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQIALTPYTFGQGTKVEIKR
1h-237（配列番号２２５）
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1h-238（配列番号２２６）
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQHINASLGWYQQKPGKAPKLLIYWASQLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQMVRTPFTFGQGTKVEIKR
1h-239（配列番号２２７）
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIYPFLEWYQQKPGKAPKLLIYFTSRLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQNATNPATFGQGTKVEIKR
1h-239-8（配列番号２２８）
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIYPFLEWYQQKPGKAPKLLIYFTSRLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQNVTNPATFSQGTKVEIKR
1h-239-804（配列番号２２９）
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIYPFLEWYQQKPGKAPKLLIYFTSRLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQNVSMPATFSQGTKVEIKR
1h-239-807（配列番号２３０）
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1h-239-809（配列番号２３１）
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1h-239-815（配列番号２３２）
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1h-239-816（配列番号２３３）
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1h-239-817（配列番号２３４）
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1h-239-819（配列番号２３５）
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1h-239-824（配列番号２３６）
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1h-239-828（配列番号２３７）
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1h-239-829（配列番号２３８）
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIYPFLEWYQQKPGKAPKLLIYFSSRLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQNVTNPATFSQGTKVEIKR
1h-239-832（配列番号２３９）
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1h-239-837（配列番号２４１）
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1h-239-838（配列番号２４２）
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1h-239-849（配列番号２４５）
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1h-239-850（配列番号２４６）
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1h-239-851（配列番号２４７）
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1h-239-856（配列番号２４８）
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1h-239-857（配列番号２４９）
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1h-239-859（配列番号２５０）
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIYPFLEWYQQKPGKAPKLLIYFSSMLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQNVTNPATFSQGTKVEIKR
1h-239-861（配列番号２５１）
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASRPIWPFLEWYQQKPGKAPKLLIYFTSRLRAGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQNVSMPATFSQGTKVEIKR
1h-239-862（配列番号２５２）
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASRAIWPFLEWYQQKPGKAPKLLIYFTSRLAYGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQNVSMPATFSQGTKVEIKR
1h-239-863（配列番号２５３）
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1h-239-864（配列番号２５４）
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASRAIWPFLEWYQQKPGKAPKLLIYFTSRLRAGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQNVSMPATFSQGTKVEIKR
1h-239-869（配列番号２５５）
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIYPFLEWYQQKPGKAPKLLIYFTSRLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQNVQMPATFSQGTKVEIKR
1h-239-870（配列番号２５６）DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIYPFLEWYQQKPGKAPKLLIYFTSRLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQNVMMPATFSQGTKVEIKR
1h-239-871（配列番号２５７）
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIYPFLEWYQQKPGKAPKLLIYFTSRLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQNVANPATFSQGTKVEIKR
1h-239-872（配列番号２５８）
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASRPIWPFLEWYQQKPGKAPKLLIYFTSRLRAGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQNVSMPATFSQGTKVEIKR
1h-239-873（配列番号２５９）
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASRAIWPFLEWYQQKPGKAPKLLIYFTSRLAYGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQNVSMPATFSQGTKVEIKR
1h-239-874（配列番号２６０）
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASRAIWPFLEWYQQKPGKAPKLLIYFTSRLRQGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQNVSMPATFSQGTKVEIKR
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1h-239-876（配列番号２６２）
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1h-239-880（配列番号２６５）
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1h-239-881（配列番号２６６）
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASRPIWPFLEWYQQKPGKAPKLLIYFTSRLARGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQNVTNPATFSQGTRVEIKR
1h-239-882（配列番号２６７）
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASRPIWPFLEWYQQKPGKAPKLLIYFTSRLRHGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQNVSMPATFSQGTKVEIKR
1h-239-883（配列番号２６８）
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASRPIWPFLEWYQQKPGKAPKLLIYFTSRLAAGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQNVSMPATFSQGTKVEIKR
1h-239-885（配列番号２６９）
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASRPIWPFLEWYQQKPGKAPKLLIYFTSRLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQNVQMPATFSQGTKVEIKR
1h-239-886（配列番号２７０）
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASRPIWPFLEWYQQKPGKAPKLLIYFTSRLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQNVANPATFSQGTKVEIKR
1h-239-887（配列番号４７２）
IQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASRPIWPFLEWYQQKPGKAPKLLIYFTSRLRAGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQNVANPATFSQGTKVEIKR
1h-239-888（配列番号４７３）
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASRAIWPFLEWYQQKPGKAPKLLIYFTSRLAYGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQNVANPATFSQGTKVEIKR
1h-239-889（配列番号４７４）
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SRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQNVANPATFSQGTKVEIKR
1h-239-890（配列番号４７５）
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SRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQNVANPATFSQGTKVEIKR
1h-239-891（配列番号４７６）
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SRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQNVANPATFSQGTKVEIKR
1h-239-892（配列番号４７７）
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SRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQNVANPATFSQGTKVEIKR
1h-239-893（配列番号４７８）
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SRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQNVQMPATFSQGTKVEIKR
1h-239-894（配列番号４７９）
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SRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQNVQMPATFSQGTKVEIKR
1h-239-895（配列番号４８０）
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SRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQNVQMPATFSQGTKVEIKR
1h-239-896（配列番号４８１）
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SRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQNVQMPATFSQGTKVEIKR
1h-239-897（配列番号４８２）
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SRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQNVQMPATFSQGTKVEIKR
1h-239-898（配列番号４８３）
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SRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQNVQMPATFSQGTKVEIKR
1h-239-9（配列番号２７１）
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1h-112（配列番号３９７）
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQHINASLGWYQQKPGKAPRLLIYWASQLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQMVRTPFTFGQGTKVEIKR
1h-239-89101（配列番号５３２）
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1h-239-89102（配列番号５３３）
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1h-239-89103（配列番号５３４）
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1h-239-89104（配列番号５３５）
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1h-239-891(Q3C）（配列番号５３６）
DICMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASRPIWPFLEWYQQKPGKAPKLLIYFTSRLRHGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQNVANPATFSQGTKVEIKR
1h-239-891(S9C）（配列番号５３７）
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1h-239-891(R18C）（配列番号５３８）
DIQMTQSPSSLSASVGDCVTITCRASRPIWPFLEWYQQKPGKAPKLLIYFTSRLRHGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQNVANPATFSQGTKVEIKR
1h-239-891(G41C）（配列番号５３９）
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1h-239-891(K42C）（配列番号５４０）
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1h-239-891(K45C）（配列番号５４１）
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1h-239-891(S60C）（配列番号５４２）
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1h-239-891(D70C）（配列番号５４３）
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1h-239-891(T74C）（配列番号５４４）
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1h-239-891(Q79C）（配列番号５４５）
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1h-239-891(K103C）（配列番号５４６）
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1h-239-89201（配列番号５４７）
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1h-239-89202（配列番号５４８）
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1h-239-89203（配列番号５４９）
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1h-239-89204（配列番号５５０）
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1h-239-89205（配列番号５５１）
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1h-239-89206（配列番号５５２）
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1h-239-89207（配列番号５５３）
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1h-239-89208（配列番号５５４）
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1h-239-89209（配列番号５５５）
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1h-239-89210（配列番号５５６）
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1h-239-89211（配列番号５５７）
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1h-239-89212（配列番号５５８）
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1h-239-89213（配列番号５５９）
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1h-239-89214（配列番号５６０）
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1h-239-89215（配列番号５６１）
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1h-239-89216（配列番号５６２）
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1h-239-89217（配列番号５６３）
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1h-239-89227（配列番号５６４）
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1h-239-89228（配列番号５６５）
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1h-239-89229（配列番号５６６）
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1h-239-89230（配列番号５６７）
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1h-239-89231（配列番号５６８）
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1h-239-89232（配列番号５６９）
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1h-239-89233（配列番号５７０）
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1h-239-89234（配列番号５７１）
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1h-239-89218（配列番号５７２）
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASRWIWPFLEWYQQKPGKAPKLLIYFTSRLAAGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQNVANPATFSQGTKVEIKR
1h-239-89219（配列番号５７３）
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1h-239-89220（配列番号５７４）
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASREIWPFLEWYQQKPGKAPKLLIYFTSRLAAGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQNVANPATFSQGTKVEIKR
1h-239-89221（配列番号５７５）
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASRTIWPFLEWYQQKPGKAPKLLIYFTSRLAAGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQNVANPATFSQGTKVEIKR
1h-239-89222（配列番号５７６）
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASRSIWPFLEWYQQKPGKAPKLLIYFTSRLAAGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQNVANPATFSQGTKVEIKR
1h-239-89223（配列番号５７７）
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASRAIWPFLEWYQQKPGKAPKLLIYFTSRLAAGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQNVANPATFSQGTKVEIKR
1h-239-89224（配列番号５７８）
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASRDIWPFLEWYQQKPGKAPKLLIYFTSRLAAGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQNVANPATFSQGTKVEIKR
1h-239-89225（配列番号５７９）
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASRFIWPFLEWYQQKPGKAPKLLIYFTSRLAAGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQNVANPATFSQGTKVEIKR
1h-239-89226（配列番号５８０）
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASRNIWPFLEWYQQKPGKAPKLLIYFTSRLAAGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQNVANPATFSQGTKVEIKR
1h-239-89235（配列番号５８１）
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASRKIWPFLEWYQQKPGKAPKLLIYFTSRLAAGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQNVANPATFSQGTKVEIKR
1h-239-89236（配列番号５８２）
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASRYIWPFLEWYQQKPGKAPKLLIYFTSRLAAGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQNVANPATFSQGTKVEIKR
1h-239-89237（配列番号５８３）
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASRPIWPFLEWYQQKPGKAPKLLIYFTSRLAAGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQNIANPATFSQGTKVEIKR
1h-239-89238（配列番号５８４）
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRGSRTIWPFLEWYQQKPGKAPKLLIYFTSRLAAGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQNVANPATFPQGTKVEIKR
1h-239-89239（配列番号５８５）
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASRSIWPFLEWYQQKPGKAPKLLIYFTSTLAAGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQNVANPATFTQGTKVEIKR
1h-239-89240（配列番号５８６）
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASRNIWPFLEWYQQKPGKAPKLLIYFTSRLAAGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQNVANPATFTQGTKVEIKR
1h-239-89241（配列番号５８７）
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASRSIWPFLEWYQQKPGKAPKLLIYFTSRLAAGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQNVANPATFAQGTKVEIKR
1h-239-89242（配列番号５８８）
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1h-239-89243（配列番号５８９）
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASRNIWPFLEWYQQKPGKAPKLLIYFTSRLAAGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQNVANPATFAQGTKVEIKR
1h-239-89244（配列番号５９０）
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASRNIWPFLEWYQQKPGKAPKLLIYFTSRLAAGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQNVANPATFPQGTKVEIKR
1h-239-89245（配列番号５９１）
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASRSIWPFLEWYQQKPGKAPKLLIYFTSTLAAGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQNVANPATFAQGTKVEIKR
1h-239-89246（配列番号５９２）
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASRTIWPFLEWYQQKPGKAPKLLIYFTSRLAAGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQNVANPATFAQGTKVEIKR
1h-239-89247（配列番号５９３）
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASRSIWPFLEWYQQKPGKAPKLLIYFTSRLAAGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQNVANPATFPQGTKVEIKR
1h-239-89248（配列番号５９４）
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASRSIWPFLEWYQQKPGKAPKLLIYFTSRLAAGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQNVANPATFTQGTKVEIKR
1h-239-89249（配列番号５９５）
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASRNIWPFLEWYQQKPGKAPKLLIYFTSTLAAGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQNVANPATFPQGTKVEIKR
1h-239-89250（配列番号５９６）
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASRSIWPFLEWYQQKPGKAPKLLIYFTSTLAAGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQNVANPATFPQGTKVEIKR
1h-239-850 CDR1（配列番号４８４）
RASRPIWPFLE
1h-239-850 CDR2（配列番号４８５）
FTSRLQS
1h-239-850 CDR3（配列番号４８６）
LQNVSMPAT
1h-35 CDR1（配列番号４８７）
RASQYIGSALS
1h-35 CDR2（配列番号４８８）
RASNLQS
1h-35 CDR3（配列番号４８９）
QQLAIRPFT
1h-36 CDR1（配列番号４９０）
RASRDIALDLL
1h-36 CDR2（配列番号４９１）
GWSGLQS
1h-36 CDR3（配列番号４９２）
AQGWGRPVTFGQGTKVEIKR
1h-79 CDR1（配列番号４９３）
RASQPIGHSLA
1h-79 CDR2（配列番号４９４）
WASTLQS
1h-79 CDR3（配列番号４９５）
QQMLRTPFT
1h-80 CDR1（配列番号４９６）
RASQRIGSNLA
1h-80 CDR2（配列番号４９７）
WASLLQS
1h-80 CDR3（配列番号４９８）
QQTRSAPFT
1h-83 CDR1（配列番号４９９）
RASQSIGHSLV
1h-83 CDR2（配列番号５００）
WASLLQS
1h-83 CDR3（配列番号５０１）
QQSRAAPFTFGQGTKVEIKR
1h-108 CDR1（配列番号５０２）
RASQYIGTALN
1h-108 CDR2（配列番号５０３）
RRSHLQS
1h-108 CDR3（配列番号５０４）
QQIALTPYT
1h-203 CDR1（配列番号５０５）
RASQPIGSVLA
1h-203 CDR2（配列番号５０６）
FSSILQS
1h-203 CDR3（配列番号５０７）
QQALRSPFT
1h-207 CDR1（配列番号５０８）
RASQYIGTSLA
1h-207 CDR2（配列番号５０９）
HSSGLQS
1h-207 CDR3（配列番号５１０）
QQTALRPFT
1h-238 CDR1（配列番号５１１）
RASQHINASLG
1h-238 CDR2（配列番号５１２）
WASQLQS
1h-238 CDR3（配列番号５１３）
QQMVRTPFT
1h-239 CDR1（配列番号５１４）
RASQSIYPFLE
1h-239 CDR2（配列番号５１５）
FTSRLQS
1h-239 CDR3（配列番号５１６）
QQNATNPAT
1h-239-891 CDR1（配列番号６３６）
RASRPIWPFLE
1h-239-891 CDR2（配列番号６３７）
FTSRLRH
1h-239-891 CDR3（配列番号６３８）
LQNVANPAT
VH dAbs:1h-99-237（配列番号２７２）
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFDSANMSWARQAPGKGLEWVSWIEAPGVQTFYADSVRGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARSPFGPLYGFDYRGQGTLVTVSS
1h-99-238（配列番号２７３）
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFDSANMSWARQAPGKGLEWVSWIEASGVQTFYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSPFGPLYGFDYRGQGTLVTVSS
1h-37（配列番号２７４）
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFGTYKMVWVRQAPGKGLEWVSSIGPGGLDTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSWMTLPITGFDYRGQGTLVTVSS
1h-93（配列番号２７５）
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFPLYEMAWVRQAPGKGLEWVSSIMSNGIRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKRKSSSSRTVFDYWGQGTLVTVSS
1h-99（配列番号２７６）
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFDSANMTWVRQAPGKGLEWVSWIDDTGTQTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSPFGPLYGFDYWGQGTLVTVSS
1h-4-1（配列番号２７７）
EVQLLESGGGWVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYHMAWVRQAPGKGLEWVSVIDSLGLQAYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSMRAEDTAVYYCAEYSGAFDYWGQGTLVTVSS
1h-4-2（配列番号２７８）
EVQLLESGGGLVQPGGSLHLSCAASGFTFTRYHMAWVRQAPGKGLEWVSVIDSLGLQTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAEYGGAFDYWGQGTLVTVSS
1h-4-3（配列番号２７９）
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYHMAWVRQAPGKGLEWVSVIDSLGLQTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAEYSGAFDYWGQGTLVTVSS
1h-4-4（配列番号２８０）
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYHMAWVRQAPGKGLEWVSVIDSLGLQTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAEYGGAFDYWGPGTLVTVSS
1h-29（配列番号２８１）
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFEDYDMNWVRQAPGKGLEWVSHIDRGGTLTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSTLMGFDYWGQGTLVTVSS
1h-30（配列番号２８２）
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFAHYHMGWVRQAPGKGLEWVSWIPADGLRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKYEGAFDYWGQGTLVTVSS
1h-37（配列番号２８３）
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFGTYKMVWVRQAPGKGLEWVSSIGPGGLDTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSWMTLPITGFDYRGQGTLVTVSS
1h-40（配列番号２８４）
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFKTYTMRWVRQAPGKGLEWVSTINSSGTLTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSSSYTFDYWGQGTLVTVSS
1h-91（配列番号２８５）
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFWFYDMQWVRQAPGKGLEWVSSITHNGKTTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDGQLTFDYWGQGTLVTVSS
1h-92（配列番号２８６）
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFELYQMGWVRQAPGKGLEWVSTIMPSGNLTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKMWSLNLGFHAAFDYWGQGTLVTVSS
1h-93（配列番号２８７）
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFPLYEMAWVRQAPGKGLEWVSSIMSNGIRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKRKSSSSRTVFDYWGQGTLVTVSS
1h-93-1（配列番号２８８）
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFPLYEMAWVRQAPGKGLEWVSSIMSNGTRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKRESSSSRTVFDYWGQGTLVTVSS
1h-93-2（配列番号２８９）
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFPLYEMAWVRQAPGKGLEWVSSIMSNGIRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKRESSSSRTVFDYWGQGTLVTVSS
1h-93-201（配列番号２９０）
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSVSEMAWVRQAPGKGLEWVSSIMSNGIRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRESSSSRTVFDYWGQGTLVTVSS
1h-93-204（配列番号２９１）
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFYTAEMAWVRQAPGKGLEWVSSIMSNGIRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRESSSSRTVFDYWGQGTLVTVSS
1h-94（配列番号２９２）
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFPGYTMEWVRQAPGKGLEWVSSITPLGANTYYADSVKGRFTISRDNSRNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDIRYTGTYNFDYWGQGTLVTVSS
1h-95（配列番号２９３）
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFPTYAMGWVRQAPGKGLEWVSFIPGAGGVTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKAVDGLANAFDYWGQGTLVTVSS
1h-96（配列番号２９４）
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMIWVRQAPGKGLEWVSEISPYGNHTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKPDRRFDYWGQGTLVTVSS
1h-97（配列番号２９５）
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFHSYHMTWVRQAPGKGLEWVSWIDAHGFTTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSRGGPLSTFDYWGQGTLVTVSS
1h-98（配列番号２９６）
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFDTETMHWVRQAPGKGLEWVSSIYVPGSYTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGRHSDVEFDYWGQGTLVTVSS
1h-99（配列番号２９７）
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFDSANMTWVRQAPGKGLEWVSWIDDTGTQTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSPFGPLYGFDYWGQGTLVTVSS
1h-99-1（配列番号２９８）
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFDSANMTWVRQAPGKGLEWVSWIEDTGTQTFYADSVRGRFTISRDNFKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSPFGPLYGFDYRGQGTLVTVSS
1h-99-2（配列番号２９９）
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFDSANMSWVRQAPGKGLEWVSWIEDTGTQTFYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSPFGPLYGFDYRGQGTLVTVSS
1h-99-201（配列番号３００）
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFHRWNMSWARQAPGKGLEWVSWIEDTGTQTFYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSPFGPLYGFDYRGQGTLVTVSS
1h-99-202（配列番号３０１）
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRHNMSWVRQAPGKGLEWVSWIEDTGTQTFYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSPFGPLYGFDYRGQGTLVTVSS
1h-99-203（配列番号３０２）
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFYKANMSWARQAPGKGLEWVSWIEDTGTQTFYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSPFGPLYGFDYRGQGTLVTVSS
1h-99-204（配列番号３０３）
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFVRQNMSWVRQAPGKGLEWVSWIEDTGTQTFYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSPFGPLYGFDYRGQGTLVTVSS
1h-99-205（配列番号３０４）
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRSNMSWVRQAPGKGLEWVSWIEDTGTQTFYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCAKSPFGPLYGFDYRGQGTLVTVSS
1h-99-206（配列番号３０５）
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1h-99-207（配列番号３０６）
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFRASNMSWVRQAPGKGLEWVSWIEDTGTQTFYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSPFGPLYGFDYRGQGTLVTVSS
1h-99-208（配列番号３０７）
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1h-99-209（配列番号３０８）
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFDKANMSWVRQAPGKGLEWVSWIEDTGTQTFYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSPFGPLYGFDYRGQGTLVTVSS
1h-99-210（配列番号３０９）
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFYTSNMSWVRQAPGKGLEWVSWIEDTGTQTFYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSPFGPLYGFDYRGQGTLVTVSS
1h-99-211（配列番号３１０）
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFASANMSWARQAPGKGLEWVSWIEDTGTQTFYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSPFGPLYGFDYRGQGTLVTVSS
1h-99-2112（配列番号３１１）
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1h-99-2113（配列番号３１２）
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFKDKNMSWARQAPGKGLEWVSWIEASGVQTFYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSPFGPLYGFDYRGQGTLVTVSS
1h-99-2114（配列番号３１３）
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFKDKNMSWARQAPGKGLEWVSWIEAIGVQTFYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSPFGPLYGFDYRGQGTLVTVSS
1h-99-2115（配列番号３１４）
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFKDKNMSWVRQAPGKGLEWVSWIEAPGVQTFYADSVRGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARSPFGPLYGFDYRGQGTLVTVSS
1h-99-2116（配列番号３１５）
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFKDKNMSWVRQAPGKGLEWVSWIEASGVQTFYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSPFGPLYGFDYRGQGTLVTVSS
1h-99-212（配列番号３１６）
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFVKANMSWVRQAPGKGLEWVSWIEDTGTQTFYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSPFGPLYGFDYRGQGTLVTVSS
1h-99-213（配列番号３１７）
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1h-99-214（配列番号６４０）
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFMRANMSWVRQAPGKGLEWVSWIEDTGTQTFYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSPFGPLYGFDYRGQGTLVTVSS
1h-99-215（配列番号３１８）
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1h-99-216（配列番号３１９）
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1h-99-217（配列番号３２０）
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1h-99-218（配列番号３２１）
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFDKSNMSWARQAPGKGLEWVSWIEDTGTQTFYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSPFGPLYGFDYRGQGTLVTVSS
1h-99-219（配列番号３２２）
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1h-99-220（配列番号３２３）
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFYRSNMSWVRQAPGKGLEWVSWIEDTGTQTFYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSPFGPLYGFDYRGQGTLVTVSS
1h-99-221（配列番号３２４）
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFARSNMSWVRQAPGKGLEWVSWIEDTGTQTFYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSPFGPLYGFDYRGQGTLVTVSS
1h-99-222（配列番号３２５）
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFQRSNMSWVRQAPGKGLEWVSWIEDTGTQTFYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSPFGPLYGFDYRGQGTLVTVSS
1h-99-223（配列番号３２６）
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSYANMSWVRQAPGKGLEWVSWIEDTGTQTFYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSPFGPLYGFDYRGQGTLVTVSS
1h-99-224（配列番号３２７）
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSHNNMSWVRQAPGKGLEWVSWIEDTGTQTFYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSPFGPLYGFDYRGQGTLVTVSS
1h-99-225（配列番号３２８）
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFRLQNMSWVRQAPGKGLEWVSWIEDTGTQTFYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSPFGPLYGFDYRGQGTLVTVSS
1h-99-226（配列番号３２９）
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1h-99-227（配列番号３３０）
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNHANMSWVRQAPGKGLEWVSWIEDTGTQTFYADSVKGRFTISRDNYKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSPFGPLYGFDYRGQGTLVTVSS
1h-99-228（配列番号３３１）
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFHRANMSWVRQAPGKGLEWVSWIEDTGTQTFYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSPFGPLYGSDYRGQGTLVTVSS
1h-99-229（配列番号３３２）
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1h-99-230（配列番号３３３）
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFDSANMSWVRQAPGKGLEWVSWIESIGVQTFYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSPFGPLYGFDYRGQGTLVTVSS
1h-99-231（配列番号３３４）
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFDSANMSWVRQAPGKGLEWVSWIEASGTQTFYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSPFGPLYGFDYRGQGTLVTVSS
1h-99-232（配列番号３３５）
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFDSANMSWARQAPGKGLEWVSWIEALGVQTFYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSPFGPLYGFDSRGQGTLVTVSS
1h-99-233（配列番号３３６）
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFDSANMSWVRQAPGKGLEWVSWIEASGRQTFYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNGLRAEDTAVYYCAKSPFGPLYGFDYRGQGTLVTVSS
1h-99-234（配列番号３３７）
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFDSANMSWVRQAPGKGLEWVSWIEAAGPQTFYADSVKGRFTISRDNSKDTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSPFGPLYGFDYRGQGTLVTVSS
1h-99-235（配列番号３３８）
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFDSANMSWVRQAPGKGLEWVSWIENGGGQTFYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSPFGPLYGFDYRGQGTLVTVSS
1h-99-236（配列番号３３９）
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFDSANMSWVRQAPGKGLEWVSWIEAPGKQTFYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSPFGPLYGFDYRGRGTLVTVSS
1h-99-237（配列番号３４０）
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFDSANMSWARQAPGKGLEWVSWIEAPGVQTFYADSVRGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARSPFGPLYGFDYRGQGTLVTVSS
1h-99-238（配列番号３４１）
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFDSANMSWARQAPGKGLEWVSWIEASGVQTFYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSPFGPLYGFDYRGQGTLVTVSS
1h-99-241（配列番号３４２）EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFDSANMSWVRQAPGKGLEWVSWIENNGPQTFYADSVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSPFGPLYGFDYRGQGTLVTVSS
1h-99-243（配列番号３４３）
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFDSANMSWGRQAPGKGLEWVSWIEASGVQTFYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSPFGPLYGFDYRGQGTLVTVSS
1h-99-244（配列番号３４４）
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFDSANMSWVRQAPGKGLEWVSWIESSGPQTFYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSPFGPLYGFDYRGQGTLVTVSS
1h-99-245（配列番号３４５）
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFDSANMSWARQAPGKGLEWVSWIEASGFQTFYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSPFGPLYGFDYRGQGTLVTVSS
1h-99-246（配列番号３４６）
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFDSANMSWARQAPGKGLEWVSWIEASGGQTFYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSPFGPLYGFDYRGQGTLVTVSS
1h-99-247（配列番号３４７）
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFDSANMSWARQAPGKGLEWVSWIEDQGVQTFYADSVKGRFTISRDNSKSTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSPFGPLYGFDYRGQGTLVTVSS
1h-99-248（配列番号３４８）
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFDSANMSWVRQAPGKGLEWVSWIEDIGIQTFYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSPFGPLYGFDYRGQGTLVTVSS
1h-99-249（配列番号３４９）
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFDSANMSWVRQAPGKGLEWVSWIEDIGVQTFYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSPFGPLYGFDYRGQGTLVTVSS
1h-99-250（配列番号３５０）
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFDSANMSWARQAPGKGLEWVSWIEATGGQTFYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSPFGPLYGFDYRGQGTLVTVSS
1h-99-251（配列番号３５１）
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFDSANMSWARQAPGKGLEWVSWIEAEGGQTFYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSPFGPLYGFDYRGQGTLVTVSS
1h-99-252（配列番号３５２）
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFDSANMSWVRQAPGKGLEWVSWIESSGYQTFYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSPFGPLYGFDYRGQGTLVTVSS
1h-99-253（配列番号３５３）
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFDSANMSWVRQAPGKDLEWVSWIEDSGIQTFYADSVKGRFTISRDNSRNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSPFGPLYGFDYRGQGTLVTVSS
1h-99-254（配列番号３５４）
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFDSANMSWARQAPGKGLEWVSWIESSGGQTFYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSPFGPLYGFDYRGQGTLVTVSS
1h-99-255（配列番号３５５）
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1h-99-256（配列番号３５６）
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1h-99-257（配列番号３５７）
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFDSANMSWARQAPGKGLEWVSWIEDGGLQTFYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSPFGPLYGFDYRGQGTLVTVSS
1h-99-258（配列番号３５８）
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1h-99-259（配列番号３５９）
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFDSANMSWARQAPGKGLEWVSWIEGSGQQTFYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSPFGPLYGFDYRGQGTLVTVSS
1h-99-260（配列番号３６０）
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1h-99-261（配列番号３６１）
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1h-99-263（配列番号３６２）
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFYKANMSWVRQAPGKGLEWVSWIEASGVQTFYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSPFGPLYGFDYRGQGTLVTVSS
1h-99-264（配列番号３６３）
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFDKSNMSWVRQAPGKGLEWVSWIEAPGVQTFYADSVRGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARSPFGPLYGFDYRGQGTLVTVSS
1h-99-265（配列番号３６４）
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFDKSNMSWARQAPGKGLEWVSWIEASGVQTFYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSPFGPLYGFDYRGQGTLVTVSS
1h-99-266（配列番号３６５）
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFYRSNMSWVRQAPGKGLEWVSWIEAPGVQTFYADSVRGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARSPFGPLYGFDYRGQGTLVTVSS
1h-99-267（配列番号３６６）
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFYRSNMSWVRQAPGKGLEWVSWIEASGVQTFYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSPFGPLYGFDYRGQGTLVTVSS
1h-99-268（配列番号３６７）
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFKSANMSWVRQAPGKGLEWVSWIEAPGVQTFYADSVRGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARSPFGPLYGFDYRGQGTLVTVSS
1h-99-269（配列番号３６８）
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFKSANMSWVRQAPGKGLEWVSWIEASGVQTFYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSPFGPLYGFDYRGQGTLVTVSS
1h-99-270（配列番号３６９）
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFYKANMSWARQAPGKGLEWVSWIEASGVQTFYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSPFGPLYGFDYRGQGTLVTVSS
1h-99-275（配列番号３７０）
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1h-99-276（配列番号３７１）
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1h-99-277（配列番号３７２）
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFDSANMSWARQAPGKGLEWVSWIEAVGVQTFYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSPFGPLYGFDYRGQGTLVTVSS
1h-99-278（配列番号３７３）
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1h-99-297（配列番号３７４）
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1h-99-6（配列番号３７５）
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1h-99-11（配列番号３７６）
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1h-99-13（配列番号３７７）
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1h-99-14（配列番号３７８）
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1h-99-15（配列番号３７９）
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1h-100（配列番号３８０）
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1h-101（配列番号３８１）
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1h-102（配列番号３８２）
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1h-103（配列番号３８３）
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1h-104（配列番号３８４）
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1h-105（配列番号３８５）
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1h-106（配列番号３８６）
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1h-113（配列番号３８７）
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1h-114（配列番号３８８）
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1h-115（配列番号３８９）
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1h-117（配列番号３９０）
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1h-118（配列番号３９１）
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1h-119（配列番号３９２）
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1h-212（配列番号３９３）
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1h-212-1（配列番号３９４）
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1h-213（配列番号３９５）
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1h-230（配列番号３９６）
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1h-99-262（配列番号３９８）
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1h-99-23701（配列番号５９７）
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1h-99-23702（配列番号５９８）
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1h-99-23703（配列番号５９９）
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1h-99-23704（配列番号６００）
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1h-99-23705（配列番号６０１）
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1h-99-23706（配列番号６０２）
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1h-99-23707（配列番号６０３）
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1h-99-23708（配列番号６０４）
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1h-99-23709（配列番号６０５）
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1h-99-23710（配列番号６０６）
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1h-99-23711（配列番号６０７）
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1h-99-23712（配列番号６０８）
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1h-99-23713（配列番号６０９）
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1h-99-23714（配列番号６１０）
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1h-99-23715（配列番号６１１）
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1h-99-23716（配列番号６１２）
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1h-99-23717（配列番号６１３）
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1h-99-23718（配列番号６１４）
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1h-99-23719（配列番号６１５）
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1h-99-23720（配列番号６１６）
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1h-99-23721（配列番号６１７）
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1h-99-23722（配列番号６１８）
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1h-99-23723（配列番号６１９）
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1h-99-23724（配列番号６２０）
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1h-99-23725（配列番号６２１）
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1h-99-23726（配列番号６２２）
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1h-99-23727（配列番号６２３）
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1h-99-23728（配列番号６２４）
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1h-99-23729（配列番号６２５）
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1h-99-23730（配列番号６２６）
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1h-99-23731（配列番号６２７）
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1h-99-23732（配列番号６２８）
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1h-99-23733（配列番号６２９）
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1h-99-23734（配列番号６３０）
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1h-99-23735（配列番号６３１）
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1h-99-23736（配列番号６３２）
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFDSANMSWARQAPGKGLEWVSWIEAPGVQTFYADSVRGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARSPHGPLYGFDYRGQGTLVTVSS
1h-99-23738（配列番号６３３）
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1h-99-23739（配列番号６３４）
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1h-99-23737（配列番号６３５）
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1h-99-237 CDR1（配列番号５１７）
SANMS
1h-99-237 CDR2（配列番号５１８）
WIEAPGVQTFYADSVRG
1h-99-237 CDR3（配列番号５１９）
SPFGPLYGFDY
1h-99-238 CDR1（配列番号５２０）
SANMS
1h-99-238 CDR2（配列番号５２１）
WIEASGVQTFYADSVKG
1h-99-238 CDR3（配列番号５２２）
SPFGPLYGFDY
1h-37 CDR1（配列番号５２３）
TYKMV
1h-37 CDR2（配列番号５２４）
SIGPGGLDTYYADSVKG
1h-37 CDR3（配列番号５２５）
SWMTLPITGFDY
1h-93 CDR1（配列番号５２６）
LYEMA
1h-93 CDR2（配列番号５２７）
SIMSNGIRTYYADSVKG
1h-93 CDR3（配列番号５２８）
RKSSSSRTVFDY
1h-99 CDR1（配列番号５２９）
SANMT
1h-99 CDR2（配列番号５３０）
WIDDTGTQTYYADSVKG
1h-99 CDR3（配列番号５３１）
SPFGPLYGFDY
ｄＡｂ活性のさらなるアッセイ
以下のさらなる生物学的アッセイを使用して、ＣＤ２８活性に対するｄＡｂの効果を調べた。
混合リンパ球反応サイトカインアッセイ
刺激細胞としてのＭｏＤＣに応じて、種々の時点でサイトカインを測定するＭＬＲ実験のために、３００μＬの１０％ ＦＣＳ−ＲＰＭＩの総容量中で、１．５×１０５個のＴ細胞／９６ウェル丸底プレートのウェルを、１．５×１０４個の同種異系ＭｏＤＣと混合することによってアッセイを実施した。ＣＤ２８ドメイン抗体、アバタセプトまたはベラタセプトの力価測定を３連で加えて、ＭＬＲの開始後２４、４８および７２時間でサイトカイン放出を測定した。Ｄｕｏｓｅｔ ＥＬＩＳＡ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔキット（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ；Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）を使用して、上清中のＩＬ−２およびＴＮＦ−αを検出した。Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）製の対の抗体および組換えサイトカインを使用して、ＩＦＮγを測定した。すべてのキットおよびＡｂｓは、製造業者の推奨に従って使用した。アッセイプレートを処理し、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｐｌｕｓ分光光度計（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ Ｃｏｒｐ．，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）で読み取った。データは、既知濃度の組換えサイトカインを使用して作成した標準曲線に対する比較によって、Ｓｏｆｔｍａｘソフトウェアを使用して分析した。
ＩＬ−２リポーターアッセイ（「ルシフェラーゼアッセイ」）
ＩＬ−２プロモーターの制御下に、ルシフェラーゼ遺伝子を用いてトランスフェクトされたＪｕｒｋａｔ−ＣＡ細胞を、１０％ ＦＣＳ（Ｓｕｍｍｉｔ Ｂｉｏ−ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｆｔ．Ｃｏｌｌｉｎｓ．，ＣＯ．）、１％ １−グルタミン、１％ピルビン酸ナトリウム、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳおよび０．４ｍｇ／ｍｌ ジェネテシン（すべてＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．製）を含むＲＰＭＩ１６４０（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）中で培養した。Ｒａｊｉ細胞（ＡＴＣＣ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）を、１０％ ＦＣＳ、１％ １−グルタミンを含むＲＰＭＩ １６４０中で培養した。Ｊｕｒｋａｔ細胞活性化を開始するために、Ｊｕｒｋａｔ−ＣＡ細胞およびＲａｊｉ細胞の両方を、各１．０×１０６個細胞／ｍｌで９６ウェル不透明プレート（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）にプレーティングした。合わせた細胞を、抗ＣＤ３クローンＵＣＨＴ１（０．１μｇ／ｍｌ；ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）および種々の濃度のｄＡｂとともにインキュベートする。１６〜２０時間後、プレートを室温に冷却し、このプレートにＳｔｅａｄｙ−Ｇｌｏ（商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を加えた。Ｓｔｅａｄｙ−Ｇｌｏの添加の３０分以内に、Ｔｏｐｃｏｕｎｔ−ＮＸＴ機器（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を使用してプレートを分析した。
混合リンパ球反応（ＭＬＲ）アッセイ
ＰＢＭＣを、正常な健常ドナーから得たＥＤＴＡ処理した全血の密度−勾配分離（リンパ球分離培地；Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ Ｉｎｃ．，Ｈｅｒｎｄｏｎ，ＶＡ）によって得た。Ｔ細胞は、ＳＲＢＣ（Ｃｏｌｏｒａｄｏ Ｓｅｒｕｍ Ｃｏｍｐａｎｙ；Ｄｅｎｖｅｒ，ＣＯ）を用いてロゼット形成したＰＢＭＣのＥ＋画分から調製した。成熟ＭｏＤＣは、６ウェル組織培養プレート中で正常ドナーから得たＰＢＭＣのＥ画分から得た単球の接着と、それに続く、非接着細胞を除去するための多量の穏やかな洗浄とによって調製した。接着細胞を１００ｎｇ／ｍｌ ＧＭ−ＣＳＦおよび５０ｎｇ／ｍｌ ＩＬ−４とともに１０％ ＦＣＳを含有するＲＰＭＩ中で７日間培養し、１／２培地を１日おきに交換し、同濃度のサイトカインを含有する新鮮培地で置換した。７日目に、細胞をＬＰＳ（１μｇ／ｍｌ）を用いて２４時間、成熟させた。次いで、これらの成熟ＭｏＤＣを、混合リンパ球反応（ＭＬＲ）において抗原提示細胞として使用した。
ＣＤ２８ドメイン抗体の力価測定を測定するＭＬＲ増殖アッセイのために、２００μｌの１０％ ＦＣＳ−ＲＰＭＩの総容量中で、９６ウェル丸底プレートにおいてＡＰＣとして２×１０３個の同種異系ＭｏＤＣとともに、Ｔ細胞を、１×１０５個細胞／ウェルで３連のウェルで培養した。ドメイン抗体を、相対効力によって、１００μｇ／ｍｌ〜１０ｎｇ／ｍｌの範囲の濃度で加えた。ＭＬＲの開始後５日目に、培養物を１μＣｉの３［Ｈ］−チミジン（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）を用いて６時間パルスし、Ｐａｃｋａｒｄ細胞ハーベスター（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）で回収し、Ｐａｃｋａｒｄ ＴｏｐＣｏｕｎｔ−ＮＸＴ機器（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を使用する液体シンチレーション計数に付した。
図３は、ｄＡｂ １ｍ７４−１５−Ｐ４０Ｌを使用するインビボでのＴ細胞増殖の阻害を示す。「−１」日目に、ＤＯ１１Ｔ細胞受容体マウスから得た３０×１０６個細胞／ｍｌ脾細胞を、尾静脈によってＢＡＬＢ／ｃマウスに注入した。０日目に、マウスに、ＰＢＳ、ｄＡｂまたはＣＴＬＡ−４ Ｉｇを腹膜内投与した。この腹膜内投与の２時間後、マウスに、完全フロイントアジュバントと１：１で乳化した５０ｍｇニワトリオボアルブミンを用いて足蹠に注射した。１および２日目に、腹膜内投与した。３日目に、流入領域膝窩リンパ節を、抗ＣＤ４ＡＰＣおよびクローン形質抗体ＫＪ−１２６ ＰＥでの染色のために採取した（図３）。図３では、ＣＤ４およびＫＪ１２６二重陽性細胞は、抗原特異的Ｔ細胞に相当する。血液を、血液中のｄＡｂのレベルを決定するために、曝露のために動物から採取した。
図４Ａおよび４Ｂは、ｄＡｂ １ｍ７４−１５−Ｐ４０Ｌを用いる、９日受容体占有率（ＲＯ）研究の結果を示す。ナイーブＢＡＬＢ／ｃマウスに、１、３または１０ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝４）のＰＢＳまたは１ｍ７４−１５ ４０Ｌのいずれかを用いて腹膜内に（図４Ａ）、または皮下に（図４Ｂ）注射した。１、４、２４、４８、７２、９６、１６８および２１６時間の時点で、血液を動物から採取した。ｄＡｂ処理群については、抗ＣＤ４ ＡＰＣおよび抗ＣＤ２８ＰＥを用いる染色に５０μｌの血液を使用し、曝露のために５０μｌの血液を使用した。ＰＢＳ群については、抗ＣＤ４ ＡＰＣおよび抗ＣＤ２８ＰＥを用いる染色に５０μｌの血液を使用し、非特異的結合を明確にするために過度の非標識抗ＣＤ２８抗体の存在下での、抗ＣＤ４および抗ＣＤ２８ＰＥを用いる染色のために５０μｌの血液を使用した。抗体結合の尺度の単位として平均蛍光強度（ＭＦＩ）を使用した。パーセント受容体占有率（％ＲＯ）は、「１−［ＣＤ２８ＭＦＩ（ｄＡｂ）−ＣＤ２８ＭＦＩ（非特異的）］／［ＣＤ２８ＭＦＩ（ＰＢＳ）−ＣＤ２８ＭＦＩ（非特異的）］」として定義した。
コアゴニストアッセイ
ＰＢＭＣを、正常な健常ドナーから得たＥＤＴＡ処理した全血の密度−勾配分離（リンパ球分離培地；Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ Ｉｎｃ．，Ｈｅｒｎｄｏｎ，ＶＡ）によって得た。Ｔ細胞は、ＳＲＢＣ（Ｃｏｌｏｒａｄｏ Ｓｅｒｕｍ Ｃｏｍｐａｎｙ；Ｄｅｎｖｅｒ，ＣＯ）を用いてロゼット形成したＰＢＭＣのＥ＋画分から調製した。Ｔ細胞を、２０μｇ／ｍｌの抗ＣＤ３抗体（Ｇ１９−４ ｍＡｂ，Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ）を用いて事前にコーティングし、アッセイに先立って洗浄した９６ウェル平底プレートの３連のウェルで、２００μｌの１０％ ＦＣＳ−ＲＰＭＩの総容量中で、１×１０５個細胞／ウェルで培養した。ドメイン抗体は、１００μｇ／ｍｌ〜０．３μｇ／ｍｌの範囲の濃度で加えた。抗ＣＤ２８（９．３ｍＡｂ、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ; Gibson et al. (1996) Am Soc. Biochem. Mol. Bio., 271:7079-7083）、１．０μｇ／ｍｌを陽性対照として使用した。アッセイの開始後３日目に、培養物を１μＣｉの３［Ｈ］−チミジン（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）を用いて６時間パルスし、Ｐａｃｋａｒｄ細胞ハーベスター（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）で回収し、Ｐａｃｋａｒｄ ＴｏｐＣｏｕｎｔ−ＮＸＴ機器（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）における液体シンチレーション計数に付した。
図２は、本明細書に示される抗ヒトＣＤ２８ ｄＡｂが、コアゴニスト活性を示さないこと示す。精製されたＴ細胞（１×１０５個細胞／ウェル）を、抗ＣＤ３（Ｇ１９−４、ＰＢＳ中、１０μｇ／ｍｌ）でコーティングした９６ウェル平底プレートに加えた。３０μｇ／ｍｌの最終濃度の各ｄＡｂを、３連のウェルで細胞に加えた。陽性対照として、ｄＡｂの代わりに抗ＣＤ２８ｍＡｂ（９．３）を、１μｇ／ｍｌの最終濃度で加えた。増殖は、３日目の３［Ｈ］−チミジン取込みによって測定した（図２）。
アゴニストアッセイ
ＰＢＭＣを、正常な健常ドナーから得たＥＤＴＡ処理した全血の密度−勾配分離（リンパ球分離培地；Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ Ｉｎｃ．，Ｈｅｍｄｏｎ，ＶＡ）によって得た。ＰＢＭＣを、２００μｌの１０％ ＦＣＳ−ＲＰＭＩの総容量で、９６ウェル平底プレートの３連のウェルにおいて、ｔ×１０５個細胞／ウェルで培養した。ｄＡｂを、１００μｇ／ｍｌ〜０．３μｇ／ｍｌのさまざまな濃度で加えた。抗ＣＤ３（ＯＫＴ３）、溶液中、１μｇ／ｍｌを、最大増殖の陽性対照として使用した。いくつかのアッセイでは、抗ＣＤ２８（９．３、溶液中、１０μｇ／ｍｌ）も、ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ、溶液中、５０μｇ／ｍｌで使用される）とともにコンパレータとして使用した。アッセイの開始後３日目に、培養物を１μＣｉの３［Ｈ］−チミジン（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）を用いて６時間パルスし、Ｐａｃｋａｒｄ細胞ハーベスター（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）で回収し、Ｐａｃｋａｒｄ ＴｏｐＣｏｕｎｔ−ＮＸＴ機器（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を使用する液体シンチレーション計数に付した。
図１Ａおよび１Ｂは、本明細書に示される抗ヒトＣＤ２８ ｄＡｂが、アゴニスト活性を示さないことを示す。第１の実験では、ＰＢＭＣを、正常なドナーから得た全血から単離し、１×１０５個細胞／ウェルで９６ウェル平底プレートに播種した。本明細書に示されるいくつかのｄＡｂを、３連のウェルに加え、図１Ａに示される最終濃度で加えた。抗ＣＤ３（ＯＫＴ３、１μｇ／ｍｌ最終濃度）を、陽性対照として含めた。増殖は、３日目の３［Ｈ］−チミジン取込みによって測定した（図１Ａ）。別個の実験では、本明細書に示されるいくつかのｄＡｂ、抗ＣＤ２８抗体（９．３）、抗ＣＤ３抗体（ＯＫＴ３）またはアイソタイプ対照を、９６ウェル丸底プレート中の３連のウェルに、示される最終濃度で加え、ウェル上で風乾させた。ＰＢＭＣを加え（１×１０５個細胞／ウェル）、増殖は３日目の３［Ｈ］−チミジン取込みによって測定した。
ＩＬ−２リポーターアッセイおよび混合リンパ球反応アッセイの両方においてｄＡｂについて得られたデータが、以下の表１に比較のためにまとめられている。これらの実験の結果ならびに本明細書に記載されるコアゴニスト実験の結果に基づいて、本明細書に示されるｄＡｂが、親和性および特異性を伴ってＣＤ２８と結合することおよびｄＡｂは、ＣＤ２８活性に関して拮抗性であることが示される。ｄＡｂはまた、ＣＤ２８アゴニスト活性をほとんどないし全く示さない。
表１：本明細書に示されるｄＡｂを使用するＭＬＲアッセイおよびルシフェラーゼアッセイの結果
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ｄＡｂのポリエチレングリコール修飾
本明細書に示されるｄＡｂの安定性、半減期およびバイオアベイラビリティの増大のために、種々のｄＡｂのＰＥＧ化を行った。ｄＡｂのＮ末端アミンのポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）修飾（「ＰＥＧ化」）のために、サンプルを精製し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に透析し、溶液中のエンドトキシンレベルを最大１０エンドトキシン単位（ＥＵ）／ｍｇ（１ＥＵ＝１００ｐｇリポ多糖類）に低減させた。次いで、サンプルを０．１Ｍ リン酸カリウムｐＨ６．８に透析した。透析後、サンプルを濾過し、タンパク質濃度を決定し、２〜３ｍｇ／ｍｌに調整した。
ＰＥＧ（４０ｋＤ直鎖、４０ｋＤ分岐または３０ｋＤ直鎖）の結合のために、メトキシポリ（エチレングリコール）プロピオンアルデヒド固体を、ｄＡｂの３倍モル過剰で溶液に加え、ローラーで室温で１時間混合した。その時点で、１０倍モル過剰の水素化シアノホウ素ナトリウム（０．１Ｍリン酸カリウムｐＨ６．８中の５ｍｇ／ｍｌストック）を加え、ローラーで室温で５時間混合した。さらなる１０倍モル過剰のシアノ水素化ホウ素ナトリウムを加え、反応を室温で一晩進行させた。ＰＥＧ化の進行は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによってモニタリングした。
Ｃ末端位置または内部位置（例えば、アミノ酸位置１５、４１、６０、７０、８１または１００）いずれかでのｄＡｂ中のシステイン残基のＰＥＧ化のために、ｄＡｂを精製し、ＰＢＳに透析し、エンドトキシンレベルを最大１０ＥＵ／ｍｇに低減した。透析後、サンプルを濾過し、ｄＡｂ濃度を決定し、２〜３ｍｇ／ｍｌに調整した。
ＰＥＧ（４０ｋＤ直鎖、４０ｋＤ分岐または３０ｋＤ直鎖）の結合のために、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）を用いるｄＡｂの還元を使用した。サンプルにグリセロールを加え（２０％（ｖ／ｖ））、サンプルを完全に混合し、その後、ジチオスレイトール（５ｍＭ）を用いて還元した。反応を、室温で２０分間進行させ、その後、２６／１０ Ｈｉ−Ｐｒｅｐ脱塩カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用してバッファーをＰＥＧカップリングバッファー（２０ｍＭ ＢＩＳ−Ｔｒｉｓ ｐＨ６．５、５ｍＭ ＥＤＴＡおよび１０％グリセロール［ｖ／ｖ］）に交換した。タンパク質濃度を測定し、２〜３ｍｇ／ｍｌに調整した。この溶液に、メトキシポリ（エチレングリコール）マレイミド固体を、ｄＡｂの３倍モル過剰で加え、溶液をローラーで４〜１６時間の間室温で混合した。ＰＥＧ化の進行は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによってモニタリングした。
ＰＥＧ化はまた、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）を用いるｄＡｂの還元を使用して実施した。サンプルを、２６／１０ ＨｉＰｒｅｐ脱塩カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用してＰＥＧカップリングバッファー（２０ｍＭ ＢＩＳ−Ｔｒｉｓ ｐＨ６．５、５ｍＭ ＥＤＴＡおよび１０％グリセロール［ｖ／ｖ］）に透析した。ｄＡｂの濃度を測定し、２〜３ｍｇ／ｍｌに調整した。５ｍＭの濃度で加えたＴＣＥＰを使用して、室温で２０分間還元を実施した。次いで、メトキシポリ（エチレングリコール）マレイミド（ｍａｌｉｅｍｉｄｅ）固体を、ｄＡｂの３倍モル過剰で加え、ローラーで４〜１６時間の間室温で混合した。ＰＥＧ化の進行は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによってモニタリングした。
必要な場合には、マレイミドを使用して、システイン残基をブロックした。タンパク質サンプルを精製し、ＰＢＳに透析し、エンドトキシンレベルを最大１０ＥＵ／ｍｇに低下させた。
透析後、サンプルを濾過し、タンパク質濃度を決定し、２〜３ｍｇ／ｍｌに調整した。ＰＥＧの付加のために、サンプルにグリセロールを加え（２０％（ｖ／ｖ）、完全に混合し、その後、ジチオスレイトール（ＤＴＴ５ｍＭ）を用いて還元した。反応を、室温で２０分間進行させ、その後、２６／１０ Ｈｉ−Ｐｒｅｐ脱塩カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用してＰＥＧカップリングバッファー（２０ｍＭ ＢＩＳ−Ｔｒｉｓ ｐＨ６．５、５ｍＭ ＥＤＴＡおよび１０％グリセロール［ｖ／ｖ］）に透析した。タンパク質濃度を測定し、２〜３ｍｇ／ｍｌに調整した。マレイミド固体を、ｄＡｂの３倍モル過剰で加え、ローラーで４〜１６時間の間室温で混合した。反応の程度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用してモニタリングした。
ＰＥＧ化されたｄＡｂの精製のために使用される方法は、ｄＡｂの等電点（ｐＩ）に応じて変わる。７より低いｐＩを有するｄＡｂには、陰イオン交換を使用したのに対し、７より高いｐＩを有するｄＡｂには、陽イオン交換が適当であった。
精製には、まず、ｄＡｂをバッファーＡ（陰イオン交換には２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８および陽イオン交換には２０ｍＭ 酢酸ナトリウム ｐＨ４）で１：５希釈し、ｐＨをチェックした。Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｑ（陰イオン交換体）およびＳ（陽イオン交換体）またはＨｉＴｒａｐ ＱまたはＳ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用した。１０カラム容積の０．５Ｍ ＮａＯＨと、それ続いて１０カラム容積のバッファーＢ（陰イオン交換には１Ｍ ＮａＣｌを使用する２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８および陽イオン交換には１Ｍ ＮａＣｌを使用する２０ｍＭ 酢酸ナトリウム ｐＨ４）を用いてカラムを洗浄した。カラムをバッファーＡを用いて平衡化し、その後、希釈したサンプルをロードした。サンプルの溶出は、以下の勾配にわたって実施した：
３０カラム容積にかけて０〜３０％バッファーＢ、
１０カラム容積にかけて３０〜１００％バッファーＢ、
５カラム容積にかけて１００％バッファーＢ。
任意の過剰の遊離ＰＥＧまたはマレイミドが、カラムを通過し、フロースルーに残存した。ＰＥＧ化されたサンプルは、通常、第１の勾配に溶出し、残存する非ＰＥＧ化サンプルが溶出した第２の勾配とは十分に分離されていた。各勾配中で２ミリリットル画分を採取し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。カラムを０．５Ｍ ＮａＯＨで最後に洗浄して、あらゆる残存する物質を溶出した。適当な画分をプールし、ｈｉｇｈ−ｐＩ ｄＡｂの場合には、ｐＨを１Ｍ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８の添加によって中性に調整した。
表２および３は、ＰＥＧ化されたｄＡｂが、本明細書において使用されるアッセイにおいて結合活性および生物活性を保持することを示す。
表２：ＰＥＧ化されたヒトｄＡｂの活性。
Figure 0006058833
表３：ＰＥＧ化されたマウスｄＡｂの活性。
Figure 0006058833
ｄＡｂを用いる動物交差反応性研究
本明細書に示されるｄＡｂの、非ヒト細胞およびポリペプチドと反応する能力を調べた。交差反応性研究では、ｄＡｂ １ｈ−７９−８０７は、ＣＤ２８を発現するヒトおよびマウス細胞両方に対する活性を示した。ヒト細胞研究のために、上記のように、ルシフェラーゼおよびＭＬＲアッセイを使用した。マウス細胞研究のためには、ＭＬＲおよびマウス脾細胞アッセイを使用した。これらのアッセイでは、ｄＡｂ １ｈ−７９−８０７は、３１＋／−１２ｎＭの効力（脾細胞アッセイ）および３８＋／−６ｎＭの効力（ＭＬＲアッセイ）を示した。
マウスＭＬＲアッセイのために、Ｔｅｎｂｒｏｅｃｋ組織ホモジナイザーを使用してＢＡＬＢ／ｃマウスのリンパ節およびＤＢＡ／２マウス由来の脾臓から単細胞懸濁液を作製した。赤血球溶解バッファー（ＳＩＧＭＡ，Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ）を使用する溶解と、それに続く、完全培地［（ＲＰＭＩ１６４０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、１０％ウシ胎児血清（Ｓｕｍｍｉｔ）、１％ｌ−グルタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１％ピルビン酸ナトリウム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１００μｇ／ｍｌゲンタマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、５×１０−５ Ｍ ２−メルカプトエタノール（ＳＩＧＭＡ）］での２回の洗浄によって両集団から赤血球を除去した。最後の洗浄後、細胞ペレットを２ｍｌの完全培地に再懸濁し、個々の予備平衡化したナイロンウールカラム（ＷＡＫＯ，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＶＡ）にロードし、３７℃で６０分間インキュベートした。ＢＡＬＢ／ｃリンパ節およびＤＢＡ／２脾臓のいずれかから得たＴ細胞を、２５ｍｌの加温培地の添加によってカラムから溶出した。ＤＢＡ／２脾臓由来のＴ細胞を廃棄し、ＡＰＣ集団を２５ｍｌの氷冷完全培地（前掲に記載）の添加を用いてカラムから溶出した。ＢＡＬＢ／ｃＴ細胞またはＤＢＡ／２ ＡＰＣを４００ｘｇで１０分間遠心分離し、完全培地に再懸濁し、細胞を血球計で計数した。両細胞集団を、完全培地で１．０×１０６ 個細胞／ｍｌに希釈した。丸底９６ウェルプレート（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）中で、ＤＢＡ／２ ＡＰＣ（０．２５×１０６ ／ｍｌ）を、ＢＡＬＢ／ｃＴ細胞（０．５×１０６／ｍｌ）と組み合わせ、ｄＡｂの段階希釈または対照物質をウェルに加えた。プレートを５％ ＣＯ２中、３７℃で９６時間インキュベートした。ウェルに３Ｈ−チミジン（１μＣｉ；ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を、インキュベーション期間の最後の６時間前に加えた。プレートを、ＧＦ／ｃフィルタープレート（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）によって回収し、乾燥させ、次いで、５０μｌのＭｉｃｒｏｓｃｉｎｔ−２０（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を各ウェルに加え、ＴｏｐＣｏｕｎｔ（Ｐａｃｋａｒｄ，Ｍｅｒｉｄｅｎ，ＣＴ）で放射能をカウントした。ＥｘｃｅｌＦｉｔプログラム（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ，Ｒｅｄｍｏｎｄ，ＷＡ）を使用してデータを分析した。
マウス脾細胞アッセイのためには、Ｔｅｎｂｒｏｅｃｋ組織ホモジナイザーを使用してＢＡＬＢ／ｃマウスの脾臓から単細胞懸濁液を作製した。赤血球溶解バッファー中でインキュベートすることと、それに続く、完全培地［ＲＰＭＩ １６４０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１０％ウシ胎児血清（Ｓｕｍｍｉｔ）、１％ ｌ−グルタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１％ピルビン酸ナトリウム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１００μｇ／ｍｌゲンタマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、５×１０−５Ｍ ２−メルカプトエタノール（ＳＩＧＭＡ）］での２回の洗浄によって、赤血球をその他のホモジネート物質から分離した。最後の洗浄後、細胞ペレットを完全培地に再懸濁し、血球計を使用して脾細胞を計数した。脾細胞を完全培地で１．０×１０６個細胞／ｍｌに希釈し、５００μｌを丸底９６ウェルプレートに加えた。抗ＣＤ３抗体（クローン１４５−２Ｃ１１（ＢＭＳ））を、０．１μｇ／ｍｌの濃度で各ウェルに加えた。ウェルにｄＡｂの段階希釈または対照物質を加え、５％ ＣＯ２中、３７℃で４８時間インキュベートした。ウェルに、３Ｈ−チミジン（１μＣｉ）を、インキュベーション期間の最後の６時間前に加え、脾細胞をＧＦ／ｃフィルタープレート（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）によって回収した。プレートを乾燥させ、各ウェルに５０μｌのＭｉｃｒｏｓｃｉｎｔ−２０（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を加え、ＴｏｐＣｏｕｎｔで放射能をカウントした。ＥｘｃｅｌＦｉｔプログラムを使用してデータを分析した。
別の交差反応性研究では、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）修飾された（「ＰＥＧ化」）ｄＡｂの大きさおよびコンホメーションに関連してＰＫを解明するために、カニクイザルを使用してｄＡｂの薬物動態学（ＰＫ）を調べた。４０ｋＤ ＰＥＧ部分を保有する抗ヒトＣＤ２８ ｄＡｂ １ｈ ９９−２−ＰＥＧの効果を、各々、３匹のサルを含む２群で調べた。群１のサルには、ｄＡｂ １ｈ ９９−２ Ｐ４０分岐ＰＥＧを皮下に、１０ｍｇ／ｋｇの濃度で与えた。群２のサルには、ｄＡｂ １ｈ ９９−２ Ｐ４０直鎖ＰＥＧを皮下に、１０ｍｇ／ｋｇの濃度で与えた。動物から採取したすべての血清サンプルは、−７０℃で保存し、研究の終局において分析した。血清サンプルは、いくつかの希釈で、ＥＬＩＳＡおよびＭＳＤを使用して分析した。
ＥＬＩＳＡ分析には、ビオチン−単量体ＣＤ２８を、１μｇ／ｍｌの濃度でＥＬＩＳＡプレートにコーティングした。標準の、品質管理サンプルおよびすべての実験サンプル希釈物は、１％の最終血清濃度で調製した。カニクイザルサンプルを室温で解凍し、アッセイレンジ内のシグナルを同定するためにサンプルのいくつかの希釈物を調製した。ＥＬＩＳＡプレート上のウェルにカニクイザルサンプルを加え、室温で２時間インキュベートした。ウサギ抗Ｖｈ ｄＡｂを調製し、アフィニティー精製およびポリクローナル抗体を使用して単離した。プレートにロバ抗ウサギＨＲＰ、続いて、基質を加え、反応を計測した時間進行させた後、反応を停止した。各反応の光学濃度（ＯＤ）をマイクロプレート光学式読取装置を使用して測定した。標準曲線を作成し、標準曲線の４パラメータロジスティックフィットを使用して、ウェル中のｄＡｂ濃度を、定量化可能なレンジ内のＯＤ読取り値に基づいて算出した。結果は、複数の希釈物から得た濃度の平均に基づいていた。
表４〜６には、カニクイザルへのｄＡｂ １ｈ ９９−２ Ｐ４０分岐およびｄＡｂ １ｈ ９９−２ Ｐ４０直鎖の投与から得られた結果が記載されている。図５は、サルにおけるＰＥＧ化されたｄＡｂの研究の血漿中濃度を経時的に示す。
分岐ＰＥＧを付加されたｄＡｂを用いた実験結果は、直鎖ＰＥＧを付加されたｄＡｂのものとは、曝露および終末半減期の両方で異なっていたが、これは、廃棄よりも吸収の差によるものであり得る。
分岐ｄＡｂの半減期（Ｔ１／２）（Ｔ１／２＝４．５日）は、直鎖ｄＡｂ（Ｔ１／２＝６日）のものよりも短いようであるが、分岐ＰＥＧ ｄＡｂは、曝露および標的濃度にわたる適用範囲の可能性（例えば、インビトロＩＣ５０＝３μｇ／ｍＬまたは２００ｎＭ）の点で良好な候補である。分岐ｄＡｂのＡＵＣは、直鎖ｄＡｂのものよりも約２．５倍大きかった（一因子分散分析 Ｐ＝０．０１７）。分岐ｄＡｂの平均滞留時間（ＭＲＴ）は、直鎖ｄＡｂのものよりも約１．５倍長かった。
皮下投与後、両ＰＥＧ化タンパク質のピーク濃度は、２４時間あたりで生じた。両ｄＡｂの定常状態分布容積（Ｖｓｓ／Ｆ）値は、１００ｍＬ／ｋｇより低く、このことは、ＰＥＧ化されたタンパク質は、大部分は血漿中に存在するということを示す。
表４： ｄＡｂ １ｈ ９９−２ Ｐ４０分岐の血清レベル
Figure 0006058833
表５： ｄＡｂ １ｈ ９９−２ Ｐ４０直鎖の血清レベル
Figure 0006058833
表６： ＰＥＧ化されたｄＡｂの薬物動態（ＰＫ）パラメータの要約
Figure 0006058833
実験実施例７ならびに表４〜６中のデータは、本明細書に示されるｄＡｂは、交差反応性ヒト、マウスおよびサルモデル系であることを示す。さらに、ＰＥＧ化されたｄＡｂの薬物動態パラメータは、ｄＡｂは生物が利用可能であり、生存被験体において活性であるということを示す。
ｄＡｂのＳＥＣ−ＭＡＬＬＳ分析の方法
ｄＡｂの溶液サイズおよびオリゴマー構造を推定するために、マルチアングレーザー光散乱を、サイズ排除クロマトグラフィーとともに使用した。ポリペプチドサンプルを精製し、適当なバッファー（すなわち、ＰＢＳ）中に透析した。透析後、サンプルを濾過し、濃度を決定し、１ｍｇ／ｍｌに調整した。ＢＳＡは、Ｓｉｇｍａから購入し、さらなる精製を行わずに使用した。
オートサンプラー（ＳＩＬ−２０Ａ）およびＳＰＤ−２０Ａ Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ ＵＶ／可視光検出器を備えたＳｈｉｍａｄｚｕ ＬＣ−２０ＡＤ Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ ＨＰＬＣシステムを、Ｗｙａｔｔ Ｍｉｎｉ Ｄａｗｎ Ｔｒｅｏｓ（ＭＡＬＬＳ、マルチアングルレーザー光散乱検出器）およびＷｙａｔｔ Ｏｐｔｉｌａｂ ｒＥＸ ＤＲＩ（示差屈折率）検出器と接続した。検出器は、以下の順−ＬＳ−ＵＶ−ＲＩで接続した。ＲＩおよびＬＳ機器は両方とも、４８８ｎｍの波長で作動した。ＴＳＫ２０００（Ｔｏｓｏｈ ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）またはＢｉｏＳｅｐ２０００（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）カラムを、５０ｍＭリン酸バッファー（塩を含むか含まない）、ｐＨ７．４または１×ＰＢＳの移動相を用いて使用した（両方とも、同様の分離レンジ、１〜３００ｋＤを有する、シリカベースのＨＰＬＣカラム）。カラムからのタンパク質の回収を改善するために、１０％エタノールを時折加えた。使用した流速は、０．５または１．０ｍｌ／分のいずれかとし、実施の経時的推移を異なる流速（４５または２３分）を反映するよう調整し、分子の分離に大きな影響を及ぼさないよう期待した。タンパク質は、ＰＢＳで１ｍｇ／ｍｌの濃度に調製し、注射容量は１００μｌとした。
光散乱検出器を、製造業者の使用説明書に従ってトルエンを用いて較正した。３種の検出器すべてから得られるシグナルをＷｙａｔｔ ＡＳＴＲＡソフトウェアを用いて同時に収集できるよう、ＵＶ検出器アウトプットおよびＲＩ検出器アウトプットを光散乱機器に接続した。ＰＢＳの移動相（０．５または１ｍｌ／分）におけるＢＳＡの数回の注入をＴｏｓｏｈ ＴＳＫ２０００カラムに流し、ＵＶ、ＬＳおよびＲＩシグナルはＷｙａｔｔソフトウェアによって収集した。次いで、製造業者の使用説明書に従って、ＡＳＴＲＡソフトウェアを使用してトレースを分析し、バンドの広がりについて、シグナルを、標準化し、アラインし、補正した。次いで、較正定数を平均化し、さらなるサンプルのランのために使用されるテンプレートにインプットした。
絶対モル質量算出
１ｍｇ／ｍｌサンプル１００マイクロリットルを、適当な予備平衡化カラムに注入した。ＳＥＣカラムを通して処理した後、サンプルを３つのオンライン検出器−ＵＶ、ＭＡＬＬＳ（マルチアングルレーザー光散乱）およびＤＲＩ（示差屈折率）に通し、絶対モル質量の決定を可能にした。カラムで起こる希釈は、約１０倍であり、そのため、溶液状態で測定した濃度を１００μｇ／ｍｌまたは約８μＭ ｄＡｂとした。
ＡＳＴＲＡにおける算出の、ならびにバッチサンプル様式で実行されることが多いＺｉｍｍプロット技術の基礎は、Zimm (1948) J. Chem. Phys. 16:1093−1099からの方程式である：
Figure 0006058833
 （方程式１）
［式中、
・ｃは、溶媒中の溶質分子の質量濃度（ｇ／ｍＬ）であり、
・Ｍは、重量平均モル質量（ｇ／ｍｏｌ）であり、
・Ａ２は、第２のビリアル係数（ｍｏｌ ｍＬ／ｇ２）であり、
・Ｋ＊＝４ｐ２ｎ０ ２（ｄｎ／ｄｃ）２ｌ０ −４ＮＡ −１は、光学定数であり（ここで、ｎ０は、入射放射線（真空）波長での溶媒の屈折率であり、ｌ０は、ナノメートルで表される入射放射線（真空）波長であり、ＮＡは、アボガドロ数であり、６．０２２×１０２３ｍｏｌ−１に等しく、ｄｎ／ｄｃは、ｍＬ／ｇで表される溶質濃度の変化に関する溶媒−溶質溶液の示差屈折率増分である（この因子は、ｄＲＩ検出器を使用して独立に測定されなければならない）、
・Ｐ（ｑ）は、理論的に導かれた形状因子であり、
１−２μ２＜ｒ２＞／３！＋…（ここで、μ＝（４π／λ）ｓｉｎ（θ／２）であり、＜ｒ２＞は、平均二乗半径である）にほぼ等しく、Ｐ（ｑ）は、分子のｚ−平均サイズ、形状および構造の関数であり、
・Ｒｑは、過剰レイリー比（ｃｍ−１）である。］
この方程式は、垂直に偏光した入射光を仮定し、ｃ２を整理するのに有効である。
本発明者らは、Ｒｑ／Ｋ＊ｃ ｖｓ．ｓｉｎ２（ｑ／２）へのフィットである、Ｚｉｍｍフィット法を用いる算出を実施するために、方程式１ ｃの一次の逆数を拡大する必要がある：
本発明者らは、Ｒｑ／Ｋ＊ｃ ｖｓ．ｓｉｎ２（ｑ／２）へのフィットである、Ｚｉｍｍフィット法を用いる算出を実施するために、方程式１の逆数をｃの一次に拡大する必要がある：
Figure 0006058833
 （方程式２）
この場合における適当な結果は、
Figure 0006058833
 （方程式３）
および
Figure 0006058833
 （方程式４）
［式中、
Figure 0006058833
 （方程式５）。］
算出は、ＡＳＴＲＡソフトウェアによって自動で実施し、データスライスの各々の決定されたモル質量を用いるプロットが得られた。クロマトグラムで観察されたピークの各々のプロットから得られたモル質量値を、単一ユニットのタンパク質の予測モル質量と比較した。これによって、溶液状態のタンパク質の測定が可能となる。
表７：ｄＡｂの溶液状態および大きさ
Figure 0006058833
抗ＣＤ２８ ｄＡｂは、ＤＣ駆動ＭＬＲとの関連でサイトカイン産生を阻害する
この実施例は、抗ＣＤ２８ドメイン抗体が、樹状細胞駆動ＭＬＲとの関連でサイトカイン産生を阻害できることを示す。
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、正常なヒトドナーから得た全血の密度−勾配分離によって得た。Ｔ細胞は、ヒツジ赤血球（Ｃｏｌｏｒａｄｏ Ｓｅｒｕｍ Ｃｏｍｐａｎｙ）を用いてロゼット形成したＰＢＭＣのＥ＋画分から調製した。樹状細胞（ＤＣ）は、ＰＢＭＣのＥ−画分から得た単球のプラスチックとの接着ならびにＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とともの７日間の培養と、それに続く、成熟を誘導するための２４時間のＬＰＳ（Ｓｉｇｍａ、１μｇ／ｍｌ）の添加によって作製した。抗ＣＤ２８ドメイン抗体は、９点用量反応曲線のための半対数希釈で力価測定して、その１：１０比の樹状細胞対Ｔ細胞相互作用の阻害を評価した。サイトカイン産生は、市販のＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）によって上清において測定した。ＩＬ−２およびＩＦＮγは、刺激後２日目に測定し、ＴＮＦαは３日目に測定した。増殖は、５日目に３［Ｈ］−チミジン取込みによって測定した。ＥＣ５０値は、各処理の阻害曲線から作製した。結果は、表８に示されている。以下の「２３９−８９１−Ｄ７０Ｃ Ｐ３０Ｌ ＰＥＧ」および「２３９−８９１−Ｄ７０Ｃ Ｐ４０Ｂ ＰＥＧ」は、それぞれ、３０ｋＤａ直鎖または４０ｋＤａ分岐ポリエチレングリコールのいずれかを用いてＰＥＧ化された抗ＣＤ２８ヒトＶκドメイン抗体（ｄＡｂ）１ｈ−２３９−８９１−Ｄ７０Ｃを表す。
表８
Figure 0006058833
ＣＤ２８ ｄＡｂは、ＣＤ８０対ＣＤ８６駆動Ｔ細胞増殖の阻害において同様に有効である
この実施例は、抗ＣＤ２８ドメイン抗体がＣＤ８０およびＣＤ８６駆動Ｔ細胞増殖の両方を阻害することを示す。
Ｔ細胞は、ヒツジ赤血球を用いてロゼット形成したＰＢＭＣのＥ＋画分から調製した。ヒトＣＤ８０またはＣＤ８６のいずれかを用いて安定にトランスフェクトされたチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を、１μｇ／ｍｌのαＣＤ３（ＯＫＴ３）の存在下でＴ細胞と組み合わせた。抗ＣＤ２８ドメイン抗体は、９点用量反応曲線のための半対数希釈で力価測定して、その１：３比のＣＤ８０またはＣＤ８６−ＣＨＯ対Ｔ細胞相互作用の阻害を評価した。増殖は、５日目に３［Ｈ］−チミジン取込みによって測定した。ＥＣ５０値は、各処理の阻害曲線から作製した。結果は、表９に示されている。
表９
Figure 0006058833
ＣＤ２８ ｄＡｂは、種々のＡＰＣによって開始されたＴ細胞増殖を阻害する
この実施例は、抗ＣＤ２８ドメイン抗体が、種々の抗原提示細胞によって開始されるＴ細胞増殖を阻害することを示す。
Ｔ細胞は、ヒツジ赤血球（Ｃｏｌｏｒａｄｏ Ｓｅｒｕｍ Ｃｏｍｐａｎｙ）を用いてロゼット形成したＰＢＭＣのＥ＋画分から調製した。樹状細胞（ＤＣ）は、ＰＢＭＣのＥ−画分から得た単球のプラスチックとの接着ならびにＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とともに７日間の培養と、それに続く、成熟を誘導するための２４時間のＬＰＳ（Ｓｉｇｍａ、１μｇ／ｍｌ）の添加によって作製した。単球は、水簸によってＰＢＭＣのＥ−画分から調製した。リンパ芽球様細胞株（ＰＭ−ＬＣＬ）は、ＥＢＶによって形質転換された、正常なドナーから得たＢ細胞株である。種々のＡＰＣを、同種異系のＴ細胞と、１：５０の比で組み合わせた。抗ＣＤ２８ドメイン抗体は、９点用量反応曲線のための半対数希釈で力価測定して、その増殖の阻害を評価し、これは、５日目の３［Ｈ］−チミジン取込みによって測定した。ＥＣ５０値は、各処理の阻害曲線から作製した。結果は、表１０に示されている。
表１０
Figure 0006058833
抗ＣＤ２８ドメイン抗体は、アゴニスト活性を欠く
この実施例は、抗ＣＤ２８ドメイン抗体がアゴニスト活性を欠くことを示す。
抗ＣＤ２８ドメイン抗体２３９−８９１−Ｄ７０Ｃおよび有糸分裂促進性抗ヒトＣＤ２８抗体５．１１Ａ１を、９６ウェル丸底プレートの底にコーディングされ、風乾された、ＰＢＳでの半対数希釈で別個に力価測定した。ＰＢＭＣは、正常なヒトドナーから得た全血から単離し、風乾された抗体を含有するウェルに加えた。増殖は、図１０Ａに示されるように、３日目に３［Ｈ］−チミジン取込みによって測定し、ＩＬ−２産生は、図１０Ｂに示されるように測定した。
抗ＣＤ２８ドメイン抗体は、インビボでその標的と結合し、アゴニスト活性を欠く
この実施例は、抗ＣＤ２８ドメイン抗体が、インビボでその標的と結合し、アゴニスト活性を欠くことを示す。
カニクイザルに、３０ｋＤａ直鎖または４０ｋＤａ分岐ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のいずれかでＰＥＧ化された抗ＣＤ２８ヒトＶκドメイン抗体（ｄＡｂ）１ｈ−２３９−８９１−Ｄ７０Ｃの単回皮下用量を投与した。
末梢血Ｔヘルパー細胞（ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ８−）上のＣＤ２８受容体占有率（ＲＯ）を、フローサイトメトリーを使用して、投与後２、４、２４、４８、９６、１６８、２４０、３３６、４０８、５０４および６７２時間にモニタリングした。最大１００％のＲＯが観察され、血漿薬物濃度と相関する期間の間持続された。
非ヒト霊長類は、サイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）それ自体に感受性ではないが(Horvath and Milton, Toxicol. Pathol. 37(3): 372-383 (2009)に概説されている)、サイトカイン濃度の中程度の増大の存在は、ヒトにおけるＣＲＳを予測するために有用であり得る。したがって、血漿サイトカイン濃度（ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−α）は、マルチプレックスビーズベースのアッセイを使用して、投与前、ならびに投与後２、４、８および２４時間で評価した。薬物と関連するサイトカイン放出は観察されず、ほとんどのサイトカイン濃度は検出限界より低く低下した。このｄＡｂの、血漿サイトカイン濃度に対して中程度の効果さえもなかったことは、アゴニスト活性を欠くことを支持する。
非ヒト霊長類ではＣＲＳがないために、末梢血Ｔ細胞数のモニタリングは、ヒトにおける望ましくないＴ細胞活性化およびＴ細胞枯渇を予測し得る(Horvath and Milton (2009) Toxicol. Pathol. 37(3): 372-83)。したがって、末梢血Ｔ細胞数を、フローサイトメトリーを使用して投与後２、４、２４、４８、９６、１６８、２４０、３３６、４０８、５０４および６７２時間でモニタリングした。スーパーアゴニストモノクローナル抗体ＴＧＮ１４１２の単回用量後にヒトにおいて(Suntharalingam et al. (2006) New Engl. J. Med. 355(10): 1018-28)、またはＯＫＴ３およびＨｕＭ２９１を用いる投薬後に非ヒト霊長類において（Horvath and Milton, 2009に概説されている）観察されるものに類似する、末梢血Ｔ細胞数の迅速な、激しい変化はなかった。このｄＡｂの、末梢血Ｔ細胞数に対して迅速な、および／または激しい効果が全くないことは、アゴニスト活性を欠くことを支持する。
本明細書に示される開示は、その具体的な実施形態を参照して特に示され、記載されている。当業者には理解されるであろうが、添付の特許請求の範囲によって包含される範囲から逸脱することなく、それにおいて、形態および詳細の種々の変法を行ってもよい。

Claims (15)

  1. ＣＤ２８と結合し、１ｈ−２３９−８９１（Ｄ７０Ｃ）（配列番号５４３）に対して少なくとも９５％同一性を有するポリペプチド配列を含むドメイン抗体（ｄＡｂ）であって、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）と連結しており、該ＰＥＧが４０ｋＤａ ＰＥＧである、ｄＡｂ。
  2. ＰＥＧが４０ｋＤａ直鎖ＰＥＧである、請求項１記載のｄＡｂ。
  3. ＰＥＧが４０ｋＤａ分岐ＰＥＧである、請求項１記載のｄＡｂ。
  4. ａ）配列番号６３６のＣＤＲ１配列と；
    ｂ）配列番号６３７のＣＤＲ２配列と；
    ｃ）配列番号６３８のＣＤＲ３配列と
    を含む、請求項１に記載のｄＡｂ。
  5. 配列番号５４３のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のｄＡｂ。
  6. ＰＥＧが、システインまたはリシン残基によって連結している、請求項１に記載のｄＡｂ。
  7. 患者の治療のための医薬の調製のための、請求項１〜６のいずれか１項記載のドメイン抗体（ｄＡｂ）の使用であって、前記患者が免疫疾患を有する、または有する危険にある、使用。
  8. 前記免疫疾患が、自己免疫疾患または移植組織と関連する疾患である、請求項７に記載の使用。
  9. 前記移植組織と関連する疾患が、同種移植片拒絶、異種移植片拒絶および移植片対宿主病からなる群から選択される、請求項８に記載の使用。
  10. 前記自己免疫疾患が、全身性エリテマトーデス（ｌｕｐｕｓ ｅｒｙｔｈｅｍａｔｏｓｉｓ）、多発性硬化症、関節リウマチ、糖尿病、乾癬、強皮症、アテローム性動脈硬化症、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、クローン病、重症性筋無力症、天疱瘡、悪性貧血、多発性筋炎、乾癬性関節炎、およびシェーグレン症候群からなる群から選択される、請求項８に記載の使用。
  11. 前記自己免疫疾患が、全身性エリテマトーデスである、請求項８に記載の使用。
  12. 前記自己免疫疾患が、シェーグレン症候群である、請求項８に記載の使用。
  13. 請求項１〜６のいずれか１項記載のｄＡｂおよび製薬上許容される担体を含む医薬組成物。
  14. 免疫抑制／免疫調節および／または抗炎症剤をさらに含む、請求項１３に記載の医薬組成物。
  15. 請求項１〜６のいずれか１項記載のｄＡｂをコードする核酸。
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