JP5977234B2

JP5977234B2 - 対象の３−ｄゲノム領域配列決定戦略

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Publication number: JP5977234B2
Application number: JP2013518301A
Authority: JP
Inventors: ミン，マックス，ジャンファン; ラート，ワウテルデ
Original assignee: Koninklijke Nederlandse Akademie van Wetenschappen
Current assignee: Koninklijke Nederlandse Akademie van Wetenschappen
Priority date: 2010-07-09
Filing date: 2011-07-08
Publication date: 2016-08-24
Anticipated expiration: 2031-07-08
Also published as: US20130183672A1; BR112013000552B1; CN103180459A; WO2012005595A2; EP4063518A1; IL256509B; BR112013000552B8; US20250066846A1; CA2804450A1; WO2012005595A8; CY1121702T1; AU2011274642B2; US12006538B2; NZ606228A; CN103180459B; WO2012005595A3; CA2804450C; KR101862756B1; EP3360975A1; PT2591125T

Description

本発明は、分子生物学の分野、より特定するとＤＮＡ技術に関する。より詳細には本発明は、ＤＮＡの配列決定に関する。本発明は、対象のゲノム領域のＤＮＡ配列の（一部）を決定するための戦略に関する。特に本発明は、相互に、ある空間的配置にあるゲノムの部分の配列の決定に関する。さらに本発明は、個別診断及び医療の開発、悪性腫瘍及び他の状態の存在に関する組織のスクリーニングにおける、本発明の方法の使用に関する。

配列決定用の「標的富化」戦略を開発するために相当な努力が尽くされている。標的富化では、ＤＮＡサンプル由来のゲノム領域が選択的に捕捉され、及び／又は選択的に増幅され、その後配列決定される（Ｍａｍａｎｏｖａら、ＮａｔｕｒｅＭｅｔｈｏｄｓ、２０１０、（２）：１１１〜１１８中に総説される）。ゲノム富化戦略は重要である。それらは特定ゲノム領域に焦点を当てることができ、これは、完全ゲノム分析と比較して、より時間及びコスト効率が良く、分析するのもそれほど困難ではないからである。様々なゲノム富化戦略が存在する。例えば、１つのプライマー対の使用した、ＰＣＲ反応の実施は、あるゲノム領域を増幅し、したがってそのゲノム領域を富化する。しかしながら、生成することができるＰＣＲ産物の大きさは限られる。長鎖ＰＣＲプロトコールは、増幅可能である上限が現在１０〜４０ｋＢであるが（Ｃｈｅｎｇら、ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ、１９９４；９１（１２）：５６９５〜５６９９）、これらの手法は確度を欠く傾向があり、それぞれのＰＣＲは最適化及び確認を必要とし、さらに、大きさの限界は限られる。増幅可能である領域の大きさ、及びアッセイの確度を増大するため、対象のゲノム領域に特異的に設計された多重のＰＣＲプライマー対を使用して、タイル張り手法（tiled approaches）が開発されている。これらのプライマーは、例えば多重ＰＣＲ手法又はＲａｉｎＤａｎｃｅＰＣＲにおいて使用される。標的環状化などの様々な酵素法は、このような標的化増幅戦略と適合性がある。他の方法は、アレイ上又は溶液中での捕捉用プローブの使用を含み、６０〜１２０塩基長のプローブを使用して、ハイブリダイゼーションにより対象のゲノム領域を捕捉する。

前例から明らかであるように、対象のゲノム領域を富化するために、対象のゲノム領域全体の配列情報が事前に必要とされる。これは、対象のゲノム領域の捕捉及び／又は増幅用のプローブ及び／又はプライマーを設計するために必要とされるからである。例えば、３０Ｍｂ配列を富化するには、６，０００の別個のＰＣＲが典型的には必要とされよう。捕捉用プローブを用いると、より一層の配列情報が必要とされる。少なくとも２５０．０００もの１２０ｂｐプローブが必要とされ、３０Ｍｂ配列の捕捉用に設計されなければならないからである。これらのアッセイは、対象のゲノム領域を大部分カバーするプローブ及び／又はプライマーのために配列データを使用することによって偏っている。それらは設計された鋳型配列から過度に逸脱した配列はピックアップせず、したがって例えば挿入は検出しない。さらに、これらの手法は典型的には、分析前に数百塩基対の配列へのＤＮＡの断片化を必要とする。これは、対象のゲノム領域が多くの小片に分解され、情報（時には対象の領域内の再編成に関するもの）の消失をもたらすことを意味する。したがって、より偏りがなく、数千の短い配列を必要とせず、仮説となる対象の領域の完全中立配列決定を可能にする、改善されたゲノム富化戦略が必要とされる。

哺乳動物核構造の研究において、染色体立体配座捕捉（３Ｃ／４Ｃ）アッセイが開発されており、これを用いてゲノム領域の構造編成を分析することができる（国際公開第２００７／００４０５７号パンフレット、国際公開第２００８／０８８４５号パンフレット）。これらの技術は、ＤＮＡを含めたクロマチン構造がその三次元構造で固定されるような、例えばホルムアルデヒドを用いたｉｎｖｉｖｏ細胞架橋を含む。次に、例えば制限酵素でクロマチンを断片化し、次いで架橋ＤＮＡ断片を連結させる。その結果は、互いに隣接するＤＮＡ断片が連結することである。連結産物は後にＰＣＲ増幅され、断片の隣接性を示す連結ＤＮＡ断片の相互作用頻度に関して分析される。ＰＣＲ増幅は、対象のゲノム領域内の標的配列に基づくものであり得る。対象のゲノム領域との高頻度の相互作用は高い隣接性を示し、低頻度の相互作用は低い隣接性を示す。ＤＮＡ断片を同定するために、配列情報が必要とされる。このような配列情報は、プローブを含むマイクロアレイで増幅断片を検出することによって、又は増幅断片の小部分を配列決定することによって提供することができる（典型的には、少なくとも２０〜３０塩基対がゲノム上の対応する位置を同定するのに十分である）。いずれの場合も、同定されるＤＮＡ断片の数、即ち相互作用の頻度は観察点と断片の隣接性を示し、その情報を使用して染色体内及び染色体間相互作用を決定することができる。

細胞内のＤＮＡの架橋及び断片化、及びその後の架橋ＤＮＡ断片の連結の手順は、標的ヌクレオチド配列を含む対象のゲノム領域、即ち、標的ヌクレオチド配列周囲の線状染色体鋳型を分析するのに理想的な起点となり得ることがいまや判明した。本発明は、ＤＮＡの架橋が、線状染色体鋳型上で隣接している配列を標的ヌクレオチド配列に優先的に架橋するであろうという概念に基づく。例えばホルムアルデヒドは、架橋剤として使用することができる。架橋後、ＤＮＡをその架橋状態に保ちながら、ＤＮＡを（酵素）処理、即ち断片化及び連結に施すことができる。互いに隣接した架橋断片のみが連結することができる。標的ヌクレオチド配列を含むＤＮＡ断片と連結するＤＮＡ断片は実際、標的ヌクレオチド配列を含む対象のゲノム領域を表す。これは、染色体内架橋の確率が染色体間架橋頻度より平均して常に高いためである。一般に、異なる断片が架橋する確率は直線距離と逆相関する。推定上、及び実際の架橋条件に応じて、対象の標的ヌクレオチドと連結する断片の２０〜３０％は、標的ヌクレオチド配列から０．５Ｍｂ以内に位置し、一方で対象の標的ヌクレオチドと連結する断片の５０〜８０％は、標的ヌクレオチド配列を含む染色体に由来する。標的ヌクレオチド配列、したがって対象のゲノム領域を含む連結ＤＮＡ断片は、標的ヌクレオチド配列を認識する１つ以上のオリゴヌクレオチドプライマーを使用することによって、増幅、即ち富化することができる。対象のゲノム領域の配列は、当技術分野でよく知られている（ハイスループット）配列決定技術を使用して後に決定することができる。対象のゲノム領域に焦点を当てるのに広範囲の配列情報が必要とされないので、この方法にはほとんど偏りがない。例えば、対象のゲノム領域は対象の対立遺伝子を含み得る。標的ヌクレオチド配列は、それが対象の対立遺伝子の配列内に存在しないように選択することができる。次いで、対象のゲノム領域は、対象の対立遺伝子の配列情報を必要とすることなく、標的ヌクレオチド配列の使用によって増幅することができる。したがって対象の対立遺伝子は、その対立遺伝子由来の如何なる配列も必要とすることなく、富化することができる。その効果は、対象の対立遺伝子の配列をカバーするオリゴヌクレオチド及び／又はプローブの使用によって、富化の方法が偏らないことである。さらに、連結ステップは互いに隣接する断片の連結を含むので、この方法は別個の対立遺伝子の配列分析も可能にすることができる。例えば、架橋ＤＮＡサンプルが多重の対立遺伝子を含むとき（例えば、ＤＮＡサンプルが異種細胞集団に由来するため、又は倍数性が１を超えるため）、それぞれの対立遺伝子は異なる近隣ゲノムを有し得る。標的ヌクレオチド配列を含むＤＮＡ断片は、同じ空間に存在するＤＮＡ断片のみと相互作用する。したがって連結ＤＮＡ断片は、その断片が由来するゲノム環境を表す。全ての異なる連結ＤＮＡ断片の配列の少なくとも一部分を決定することによって、ＤＮＡ断片配列は異なる連結ＤＮＡ断片の配列情報を使用して後にカップリングさせることが可能であり、別の対象のゲノム領域に関する配列を構築することができる。

定義

以下の記載及び実施例において、幾つかの用語を使用する。所与のこのような用語に対する範囲を含めた、本明細書及び特許請求の範囲の明確で一貫した理解をもたらすために、以下の定義を与える。本明細書で他に定義しない限り、使用する全ての技術及び科学用語は、本発明が属する分野の当業者により一般に理解されるのと同じ意味を有する。全ての刊行物、特許出願、特許及び他の参照文献の開示は、それらの全容が参照として本明細書に組み込まれる。

本発明の方法中で使用する従来の技法を実施する方法は、当業者には明らかである。分子生物学、生化学、コンピュータ化学、細胞培養、組換えＤＮＡ、バイオインフォマティクス、ゲノミクス、配列決定及び関連分野における従来の技法の実践は当業者にはよく知られており、例えば、以下の参照文献：Ｓａｍｂｒｏｏｋら、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ．ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ、第２版、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、１９８９；Ａｕｓｕｂｅｌら、ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ、ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、ＮｅｗＹｏｒｋ、１９８７ａｎｄｐｅｒｉｏｄｉｃｕｐｄａｔｅｓ；及びｔｈｅｓｅｒｉｅｓＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ、ＳａｎＤｉｅｇｏ中で論じられる。

本明細書中で使用する単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文脈が明らかに他のことを示さない限り複数の指示物を含む。例えば、前に使用した、「１つの」ＤＮＡ分子を単離するための方法は、複数の分子（例えば、数１０個、数１００個、数１０００個、数万個、数十万個、数百万個、又はより多くの分子）の単離を含む。

本発明による「対象のゲノム領域」は、そのＤＮＡ配列の少なくとも一部分を決定することが望ましい生物のＤＮＡ配列である。例えば、疾患と関連がある対立遺伝子を含む疑いがあるゲノム領域は、対象のゲノム領域であり得る。本明細書中で使用する用語「対立遺伝子（複数可）」は、特定遺伝子座における任意の１つ以上の他型の遺伝子を意味する。二倍体生物の細胞では、所与の遺伝子の対立遺伝子は、染色体上の特定位置、又は遺伝子座（複数の遺伝子座）に位置する。１つの対立遺伝子が相同染色体対のそれぞれの染色体上に存在する。したがって二倍体細胞では、２つの対立遺伝子、及びしたがって２つの別個の（異なる）対象のゲノム領域が存在し得る。

本発明による「核酸」は、ピリミジン及びプリン塩基、好ましくはそれぞれシトシン、チミン、及びウラシル、及びアデニン及びグアニンの任意のポリマー又はオリゴマーを含むことができる（あらゆる目的でその全容が参照として本明細書に組み込まれる、ＡｌｂｅｒｔＬ．Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ、ＰｒｉｎｃｉｐｌｅｓｏｆＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、７９３〜８００（ＷｏｒｔｈＰｕｂ．１９８２）を参照）。本発明は、任意のデオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド又はペプチド核酸成分、及びそれらの任意の化学的変異体、例えばメチル化、ヒドロキシメチル化又はグリコシル化型のこれらの塩基などを企図する。ポリマー又はオリゴマーは組成が異種又は同種であってよく、天然に存在する源から単離することができ、又は人為的若しくは合成的に生成することができる。さらに、核酸はＤＮＡ又はＲＮＡ、又はその混合物であってよく、ホモデュプレックス、ヘテロデュプレックス、及びハイブリッド状態を含めた一本鎖又は二本鎖型で、不変又は一時的に存在し得る。

「サンプルＤＮＡ」は、ＤＮＡを含む、生物若しくは生物の組織から、又は組織及び／又は細胞培養物から得られるサンプルである。生物由来のサンプルＤＮＡは、任意の型の生物、例えば微生物、ウイルス、植物、真菌、動物、ヒト及び細菌、又はこれらの組合せから得ることができる。例えば、細菌及び／又はウイルス感染の疑いがあるヒト患者由来の組織サンプルはヒト細胞だけではなく、ウイルス及び／又は細菌を含む可能性もある。サンプルは細胞及び／又は細胞核を含む可能性がある。サンプルＤＮＡは、その生物のＤＮＡの検査を正当化する特定疾患、例えば癌若しくは任意の他の状態を有するリスクがあり得るか又はその疑いがあり得る、患者又は人間に由来してもよい。

本発明による「架橋」に関しては、２つの異なる位置で、これらの２つの異なる位置が接続できるようにＤＮＡが反応することを意味する。２つの異なる位置の間の接続は直接的であってよく、ＤＮＡ鎖間に共有結合が形成され得る。２本のＤＮＡ鎖はＵＶ照射を使用して直接架橋させることが可能であり、ＤＮＡ鎖間に共有結合が直接形成され得る。２つの異なる位置の間の接続は、作用物質、例えば架橋分子を介して間接的であってよい。第一のＤＮＡ切片は２つの反応基を含む架橋分子の第一の反応基と接続させることが可能であり、架橋分子の第二の反応基は第二のＤＮＡ切片と接続させることが可能であり、それによって架橋分子を介して第一のＤＮＡ切片と第二のＤＮＡ切片を間接的に架橋させることが可能である。２つ以上の分子を介して２本のＤＮＡ鎖の間に間接的に、架橋を形成することもできる。例えば、使用することができる典型的な架橋分子はホルムアルデヒドである。ホルムアルデヒドはタンパク質−タンパク質及びＤＮＡ−タンパク質架橋を誘導する。したがってホルムアルデヒドは、それらの付随タンパク質を介して、異なるＤＮＡ鎖を互いに架橋させることが可能である。例えば、ホルムアルデヒドは、タンパク質及びＤＮＡと反応して、この架橋分子を介してタンパク質とＤＮＡを接続させることが可能である。したがって、２つのＤＮＡ切片はホルムアルデヒドを使用して架橋させ、第一のＤＮＡ切片とタンパク質の間に接続を形成することができ、タンパク質は第二のＤＮＡ切片と接続する別のホルムアルデヒド分子と第二の接続を形成することができ、したがってＤＮＡ１−架橋剤−タンパク質−架橋剤−ＤＮＡ２として表すことができる架橋を形成することができる。いずれの場合も、本発明による架橋は、互いに物理的に隣接したＤＮＡ鎖間の（直接的又は間接的）接続の形成を含むことは理解される。ＤＮＡ鎖は細胞中で互いに物理的に隣接し得る。配列観察点から例えば１００ｋｂ離れながら、ＤＮＡは高度に組織化されているからである。架橋法が後の断片化及び連結ステップと適合性がある限り、このような架橋は本発明の目的で企図することができる。

「架橋ＤＮＡのサンプル」は、架橋を施されたサンプルＤＮＡである。サンプルＤＮＡの架橋には、サンプル内の三次元状態のＤＮＡをおおむね完全に保つ影響がある。このように、互いに物理的に隣接したＤＮＡ鎖は互いに近い状態を保つ。

本発明による「架橋の逆行」は、架橋しているＤＮＡがそれ以上架橋せず、後の増幅及び／又は配列決定ステップに適しているような架橋の破壊を含む。例えば、ホルムアルデヒドによる架橋したサンプルＤＮＡにおけるプロテアーゼＫ処理の実施は、サンプル中に存在するタンパク質を消化する。架橋ＤＮＡはタンパク質を介して間接的に接続するので、プロテアーゼ処理自体がＤＮＡ間の架橋を逆行させることが可能である。しかしながら、ＤＮＡと接続したままのタンパク質断片は後の配列決定及び／又は増幅を妨げる可能性がある。したがって、ＤＮＡとタンパク質の間の接続の逆行が、「架橋の逆行」をもたらす可能性もある。ＤＮＡ−架橋剤−タンパク質接続は、例えば７０℃でのインキュベートによる加熱ステップを介して、逆行させることが可能である。サンプルＤＮＡ中に多量のタンパク質が存在する場合、さらにプロテアーゼでタンパク質を消化することがしばしば望ましい。したがって、架橋サンプル中で接続しているＤＮＡ鎖が配列決定及び／又は増幅に適した状態になる、任意の「架橋の逆行」方法を企図することができる。

「ＤＮＡの断片化」は、架橋ＤＮＡ又は非架橋ＤＮＡ、又は任意の他のＤＮＡであり得るＤＮＡに施用すると、ＤＮＡ断片をもたらす任意の技法を含む。当技術分野でよく知られている技法は超音波処理、せん断及び／又は制限酵素処理であるが、他の技法を想定することもできる。

「制限エンドヌクレアーゼ」又は「制限酵素」は、二本鎖ＤＮＡ分子中の特異的ヌクレオチド配列（認識部位）を認識し、各認識部位若しくは近辺のＤＮＡ分子の両鎖を切断し、平滑又は３’若しくは５’オーバーハング末端を残す酵素である。認識される特異的ヌクレオチド配列は切断の頻度を決定し得る。例えば、６ヌクレオチドのヌクレオチド配列は平均して４０９６ヌクレオチド毎に生じ、一方４ヌクレオチドのヌクレオチド配列は、より高頻度で、平均して２５６ヌクレオチド毎に生じる。

本発明による「連結」は、別個のＤＮＡ断片の接合を含む。ＤＮＡ断片は平滑末端である可能性があり、又はオーバーハングが互いにハイブリダイズすることができるような適合オーバーハング（粘着オーバーハング）を有する可能性がある。ＤＮＡ断片の接合は、リガーゼ酵素、ＤＮＡリガーゼを用いた酵素によるものであってよい。しかしながら、ＤＮＡ断片が接合される、即ち共有結合が形成する限り、非酵素的連結を使用することもできる。典型的には、別の鎖のヒドロキシル基とホスフェート基の間でホスホジエステル結合が形成される。

一般に「オリゴヌクレオチドプライマー」は、ＤＮＡの合成を促進することができるヌクレオチドの鎖を指す。ＤＮＡポリメラーゼは、プライマーなしでＤＮＡをｄｅｎｏｖｏ合成することはできない。プライマーはＤＮＡとハイブリダイズする、即ち塩基対を形成する。互いに相補的である塩基対を形成することができるヌクレオチドは、例えばシトシンとグアニン、チミンとアデニン、アデニンとウラシル、グアニンとウラシルである。プライマーと既存のＤＮＡ鎖の間の相補性は１００％である必要はない。即ち、プライマーの全ての塩基が既存のＤＮＡ鎖と塩基対形成する必要はない。既存のＤＮＡ鎖とハイブリダイズしたプライマーの３’末端から、鋳型として既存の鎖を使用してヌクレオチドが取り込まれる（鋳型指定ＤＮＡ合成）。本発明者らは、「プライマー」として増幅反応中で使用される合成オリゴヌクレオチド分子を指すことができる。

「増幅」は、ポリヌクレオチド増幅反応、即ち、１つ以上の開始配列から複製されるポリヌクレオチドの集団を指す。増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、線状ポリメラーゼ反応、核酸配列ベース増幅、ローリングサークル増幅及び同様の反応だけには限られないが、これらを含めた様々な増幅反応を指すことができる。

「配列決定」は、核酸サンプル、例えばＤＮＡ又はＲＮＡにおけるヌクレオチド（塩基配列）の順序の決定を指す。サンガー法の配列決定、並びにＲｏｃｈｅ、Ｉｌｌｕｍｉｎａ及びＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓによって提供されるようなハイスループット配列決定技術などの、多くの技法が利用可能である。

用語「コンティグ」はＤＮＡの配列分析に関して使用し、隣接ヌクレオチド配列を有する２つ以上のＤＮＡ断片に由来するＤＮＡの再構築された隣接延長部分を指す。したがってコンティグは、対象のゲノム領域の（部分的）隣接配列をもたらす一組の重複ＤＮＡ断片であってよい。コンティグは、参照配列とアラインメントすると隣接ヌクレオチド配列を形成することができる、一組のＤＮＡ断片であってもよい。例えば、用語「コンティグ」は、その近辺の少なくとも１つとそれぞれの（連結）ＤＮＡ断片（複数可）の配列重複を有するように配列する、一連の（連結）ＤＮＡ断片（複数可）を包含する。連結又はカップリングした（連結）ＤＮＡ断片（複数可）は手作業、又は好ましくは例えばＦＰＣ、ＰＨＲＡＰ、ＣＡＰ３などの適切なコンピュータプログラムを使用したいずれかで順序づけることができ、別個のコンティグにグループ分けすることもできる。

「アダプター」は、それらが断片の末端と連結することができるように設計された、限られた数の塩基対、例えば約１０〜約３０塩基対長を有する、短い二本鎖オリゴヌクレオチド分子である。一般にアダプターは、互いに一部分が相補的であるヌクレオチド配列を有する、２つの合成オリゴヌクレオチドで構成される。適切な条件下において溶液中で２つの合成オリゴヌクレオチドを混合すると、それらは互いにアニーリングして二本鎖構造を形成する。アニーリング後、アダプター分子の一末端は、その末端が制限断片の末端に適合しそこに連結することができるように設計することができ、アダプターの他の末端は、その末端が連結不能であるように設計することができるが、例えばアダプターがＤＮＡ断片間に連結するとき、これは必ずしも当てはまらない。

「識別子」は、アダプター若しくはプライマーに加えることができる、又はその配列中に含まれる、又は他の場合独自の識別子をもたらすための標識として使用される短い配列である。このような配列識別子（又はタグ）は、特異的核酸サンプルを同定するために使用する、様々ではあるが明確な長さ、典型的には４〜１６ｂｐの独自の塩基配列であってよい。例えば４ｂｐタグは４の四乗＝２５６の異なるタグを可能にする。典型的な例は、ハイブリダイゼーションによる独自の検出に一般使用されるタグとして当技術分野で知られるＺＩＰ配列である（ｌａｎｎｏｎｅらＣｙｔｏｍｅｔｒｙ３９：１３１〜１４０、２０００）。本発明による識別子は有用である。このような識別子を使用することにより、さらなる処理で（ＰＣＲ）サンプルの起点を決定することができるからである。異なる核酸サンプル由来の組合せ処理物の場合、異なる識別子を使用して異なる核酸サンプルを同定することができる。例えば本発明により、ハイスループット配列決定を使用して配列決定を実施することができるので、多重のサンプルを組合せることができる。したがって識別子は、異なるサンプルに対応する配列の同定を手助けすることもできる。識別子はＤＮＡ断片との連結のためアダプター中に含まれ、ＤＮＡ断片配列同定を手助けする可能性もある。識別子は少なくとも２塩基対互いに異なることが好ましく、読み違いを防ぐため２つの同一連続塩基を含有しないことが好ましい。識別子の機能は、アダプター又はプライマーなどの他の機能と時折組合せることができる。

本発明による「サイズ選択」は、特定のサイズ範囲の分子、例えば（連結）ＤＮＡ断片又は増幅された（連結）ＤＮＡ断片を選択する技法を含む。使用することができる技法は、例えばゲル電気泳動、サイズ排除、ゲル抽出クロマトグラフィーであるが、特定の大きさを有する分子を選択することができる限り、これらだけには限られず、このような技法は十分である。

用語「アラインメントする」及び「アラインメント」に関しては、同一又は類似のヌクレオチドの短い若しくは長い延長部分の存在に基づく、２つ以上のヌクレオチド配列の比較を意味する。アラインメント用の方法及びコンピュータプログラムは当技術分野でよく知られている。アラインメントするために使用又は構成され得る１つのコンピュータプログラムは、１９９１年１２月１０日に米国著作権局、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、Ｄ．Ｃ．２０５５９において利用者向け文書と共に出願されたＧｅｎｅｎｔｅｃｈ、Ｉｎｃ．によって作成された「Ａｌｉｇｎ２」である。

本発明による対象のゲノム領域の配列を決定するための方法の概略を示す図である。この方法は以下のステップを含む：（ａ）架橋ステップ、例えば、ホルムアルデヒド固定により、それらの付随タンパク質（例えば、ヒストン）を介して、核（Ｎ）における近隣ＤＮＡ配列が空間的に架橋するステップ（染色体（Ｃｈ）付近の配列、例えば同じ遺伝子の配列であることが多い）。対象のゲノム領域Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ及びＥの５つの推定断片を示す。（ｂ）次に、架橋サンプルＤＮＡを、例えば制限酵素（例えば、高頻度（４）カッター（例えばＮＩａＩＩＩ））で消化を実施することによって、断片化するステップ。（ｃ）架橋制限断片を連結させてＤＮＡ環を形成するステップ。（ｄ）架橋の逆行後、増幅ステップ、例えばＰＣＲを、対象のゲノム領域近辺又は内部の観察点で（インバース）ＰＣＲプライマーセットを用いて実施するステップ。この観察点と架橋する断片（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ及びＥ）を増幅しゲノムの残り部分より富化させる。例えば環全体（長い読み取り部分）の配列決定により増幅断片を配列決定し、ＰＣＲ増幅物質を最初に断片化して、例えばＩｌｌｕｍｉｎａ又はＳＯＬｉＤ配列決定に適合した配列決定ライブラリーを作製することもできる。（ｅ）次に、読み取り部分からコンティグを構築するステップ、配列を参照ゲノムと比較して遺伝的変異を同定することができる。５つの異なる観察点（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ及びＥ）でのＢＲＣＡ１遺伝子のスキームを示す図である。黒い矢印はセンス方向を示す。円内の数字及び矢印は、遺伝子配列上の位置を示す。観察点Ｅは遺伝子の開始点であり、観察点Ａは終了点である。これらの観察点は約１５〜２５ｋＢ離れている。実施例中に記載するＢＲＣＡ１遺伝子の配列決定用の、架橋サンプルＤＮＡの調製中に得たＤＮＡサンプルのゲル電気泳動を示す図である。（Ａ）レーンＭはラムダＤＮＡＰｓｔＩマーカーＤＮＡを示し、レーン１は未消化対照を示し、レーン２はＮＩａＩＩＩの第一消化対照を示し、レーン３はＮＩａＩＩＩ第一消化サンプルの連結後の連結対照であり、レーン４はＮｓｐＩによる第二の消化を示す。（Ｂ）レーンＭはラムダＤＮＡＰｓｔＩマーカーを示す。レーンＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ及びＥは、実施例セクション中に記載するステップ６７由来のサンプルに対応し、図２中に記載した観察点に対応する、異なるＤＮＡ増幅の増幅産物を示す。

本発明の一態様によれば、標的ヌクレオチド配列を含む対象のゲノム領域の配列を決定するための方法であって、架橋ＤＮＡを断片化するステップ、断片化された架橋ＤＮＡを連結させるステップ、架橋を逆行させるステップ、及び標的ヌクレオチド配列を含む連結ＤＮＡ断片の配列の少なくとも一部分を決定するステップ、及び決定した配列を使用して対象のゲノム領域の配列を構築するステップを含む方法を提供する。

架橋ＤＮＡのサンプルは、架橋に曝されたサンプルＤＮＡを含む。それがサンプル中に存在するときのサンプルＤＮＡの架橋は、ＤＮＡの三次元構造の大まかな維持をもたらす。例えば、使用することができる標準的な架橋作用物質はホルムアルデヒドである。サンプルは患者及び／又は疾患組織から得ることができ、他の生物又は同じ生物の別の切片に由来してもよく、例えば、１患者由来のサンプル、健常組織由来の１サンプルと疾患組織由来の１サンプルなどでもよい。したがって、サンプルは本発明により分析し参照サンプルと比較することができ、又は異なるサンプルを分析し互いに比較することができる。例えば、乳癌を有する疑いのある患者から、疑わしい腫瘍から生検材料を得ることができる。別の生検材料は非疾患組織から得ることができる。両方に由来する組織生検材料は本発明により分析することができる。対象のゲノム領域はＢＲＣＡ１及びＢＲＣＡ２遺伝子であってよく、これらの遺伝子は８３ｋｂ長及び８６ｋｂ長である（Ｍａｚｏｙｅｒ、２００５、ＨｕｍａｎＭｕｔａｔｉｏｎ２５：４１５〜４２２中に総説される）。本発明による対象のゲノム領域の配列を決定すること、及び異なる生検材料のゲノム領域配列及び／又は参照ＢＲＣＡ遺伝子配列をお互いに比較することによって、患者の診断及び／又は患者の治療の決定及び／又は疾患進行予後の予測を手助けする、遺伝子突然変異を発見することができる。

架橋ＤＮＡのサンプルを断片化することによって、対象のゲノム領域に由来するＤＮＡ断片は互いに隣接したままになる。それらは架橋しているからである。これらの架橋ＤＮＡ断片を後に連結させると、架橋のため互いに隣接した対象のゲノム領域のＤＮＡ断片は連結する。この型の連結は近隣連結と呼ぶこともできる。標的ヌクレオチド配列を含むＤＮＡ断片は、配列レベルでは広範囲の直線距離内でＤＮＡ断片と連結することができる。標的ヌクレオチド配列を含む断片を含む連結断片の配列の（少なくとも一部分）を決定することによって、対象のゲノム領域の空間周辺内のＤＮＡ断片の配列が得られる。それぞれ個々の標的ヌクレオチド配列が、多重の他のＤＮＡ断片と架橋する可能性がある。結果として、２つ以上のＤＮＡ断片が、標的ヌクレオチド配列を含む断片と連結可能であることが多い。連結した（増幅された）連結ＤＮＡ断片の（部分的）配列と標的ヌクレオチド配列を含む断片を組合せることによって、対象のゲノム領域の配列を構築することができる。標的ヌクレオチド配列を含む断片と連結したＤＮＡ断片は、連結ＤＮＡ断片中に存在し得る任意の断片を含む。

ＤＮＡを架橋させるステップ、並びにＤＮＡ断片を断片化し連結させるステップを含む方法が当技術分野で知られている（例えば、国際公開第２００７／００４０５７号パンフレット又は国際公開第２００８／０８８４５号パンフレット）。このような方法は、異なるＤＮＡ断片間の相互作用頻度の同定を目的とし、標的ヌクレオチド配列と隣接する断片の主要ヌクレオチド配列の同定は目的としない。相互作用頻度を検出するための４Ｃを使用する当初の概念は、短い配列読み取り部分のみを必要とした。短い配列読み取り部分が相互作用する頻度を、読み取り部分の染色体位置に対してプロットする。このようなプロットのパターンは、特定の対象のゲノム領域がゲノム中の他の領域と相互作用することができるかどうか、又は例えば、染色体間で転座が起こったことを示す。例えば、標的ヌクレオチド配列を含有する染色体以外の染色体上で、高頻度の読み取り部分が観察される場合、それは転座を示す。本発明では、相互作用の頻度は決定しない。本発明では、架橋ＤＮＡを断片化しそのＤＮＡ断片をその後連結させることによって、標的ヌクレオチド配列周辺のゲノム領域が実際捕捉され、配列決定すると、ゲノム領域のコンティグを再構築することができることがいまや判明した。一方当技術分野で知られている方法では、標的ヌクレオチド配列を有する短い配列読み取り部分の相互作用頻度の決定に焦点を当てているが、本発明の焦点は、ＤＮＡ断片の配列及び連結ＤＮＡ断片のカップリングから、対象のゲノム領域のコンティグを構築することができるような、（ＤＮＡ断片及び標的ヌクレオチドを含む）連結ＤＮＡ断片の配列の全体、又は少なくとも広範囲の一部の決定に当てている。

線状連結断片
本発明の一実施形態では、標的ヌクレオチド配列を含む対象のゲノム領域の配列を決定するための方法であって、
ａ）架橋ＤＮＡのサンプルを提供するステップ、
ｂ）架橋ＤＮＡを断片化するステップ、
ｃ）断片化された架橋ＤＮＡを連結させるステップ、
ｄ）架橋を逆行させるステップ、
ｅ）場合によっては、好ましくは制限酵素で、ステップｄ）のＤＮＡを断片化するステップ、
ｆ）場合によっては、少なくとも１つのアダプターとステップｄ）又はｅ）の断片化されたＤＮＡを連結させるステップ、
ｇ）場合によっては、標的ヌクレオチド配列とハイブリダイズする少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、標的ヌクレオチド配列を含むステップｄ）又はｅ）のＤＮＡを増幅する、又は少なくとも１つのアダプターとハイブリダイズする少なくとも１つの他のプライマーを使用してステップｆ）のＤＮＡを増幅するステップ、
ｈ）好ましくはハイスループット配列決定を使用して、標的ヌクレオチド配列を含むステップｄ）、ｅ）、ｆ）又はｇ）の（増幅された）連結ＤＮＡ断片の配列の少なくとも一部分を決定するステップ、
ｉ）決定した配列から対象のゲノム領域のコンティグを構築するステップを含む方法を提供する。

ステップａ）において、本明細書の他の箇所に概略するように架橋ＤＮＡのサンプルを提供する。架橋ＤＮＡのサンプルはステップｂ）において断片化する。架橋ＤＮＡを断片化することによって、架橋により１つに保たれたＤＮＡ断片が生成する。断片化ステップｂ）は超音波処理を含むことができ、酵素によるＤＮＡ末端修復を続けることができる。超音波処理はランダムな部位でのＤＮＡの断片化をもたらし、それは平滑末端であり得るか、又は３’又は５’オーバーハングを有し得るかのいずれかである。これらのＤＮＡ切断点はランダムに存在し、後のステップｃ）においてアダプターと及び／又は互いの断片の連結を可能にする平滑末端を有するＤＮＡ断片が得られるように、ＤＮＡを（酵素により）修復し、生じ得る３’又は５’オーバーハングの充填を行うことができるからである。或いは、例えばエキソヌクレアーゼを使用してオーバーハングヌクレオチドを除去することにより、オーバーハングを平滑末端にすることもできる。断片化ステップｂ）は、１つ以上の制限酵素、又はそれらの組合せを用いた断片化を含むこともできる。制限酵素による断片化は有利である。それは平均断片サイズの調節を可能にすることができるからである。形成される断片は、後のステップｃ）において断片の連結を可能にする適合オーバーハング又は平滑末端を有し得る。さらに、架橋ＤＮＡの１サンプルを複数のサブサンプルに分けると、それぞれのサブサンプルに、異なる認識部位を有する制限酵素を使用することができる。異なる認識部位を有する異なる制限酵素を使用することによって、それぞれのサブサンプルから異なるＤＮＡ断片を得ることができるので、これは有利である。

次のステップｃ）では断片を連結させる。標的ヌクレオチド配列を含む断片は多重の他のＤＮＡ断片と架橋させることが可能であるので、２つ以上のＤＮＡ断片を、標的ヌクレオチド配列を含む断片と連結させることが可能である。これによって、互いに隣接したＤＮＡ断片の組合せが生成し得る。それらは架橋により１つに保たれるからである。連結ＤＮＡ断片において異なる組合せ及び／又は順序のＤＮＡ断片が形成され得る。ＤＮＡ断片が制限酵素処理によって得られた場合、制限酵素の認識部位が既知であり、それによって、それらの断片を同定することができる。制限酵素認識部位の残り部分又は再構築された制限酵素認識部位が、異なるＤＮＡ断片間の分離を示し得るからである。超音波処理及びその後の酵素によるＤＮＡ末端修復などのランダムな断片化によってＤＮＡ断片を得た場合、一断片を他の断片と区別することがさらに難しくなる可能性がある。どの断片化法を使用するかとは無関係に、連結ステップｃ）はアダプターの存在下で実施することが可能であり、断片間にアダプター配列を連結させることが可能である。或いは、別のステップにおいてアダプターを連結させることが可能である。断片間に位置するアダプター配列を同定することによって、異なる断片を容易に同定することができるので、これは有利である。例えば、ＤＮＡ断片末端が平滑末端である場合、アダプター配列はＤＮＡ断片末端の各々と隣接し、別のＤＮＡ断片間の境界を示す。次に、ステップｄ）において架橋を逆行させ、これによって２つ以上の断片を含む連結ＤＮＡ断片のプールが生成する。連結ＤＮＡ断片のプールの亜集団は、標的ヌクレオチド配列を含むＤＮＡ断片を含む。架橋の逆行によって、ＤＮＡの構造的／空間的固定が緩み、ＤＮＡ配列は後のステップ、例えば増幅及び／又は配列決定に利用可能な状態となる。架橋ＤＮＡはこのようなステップに適した基質ではない可能性があるからである。後のステップｅ）及び／又はｆ）は架橋の逆行後に実施することができるが、しかしながら、連結ＤＮＡ断片が依然架橋状態であるときに、ステップｅ）及び／又はｆ）を実施することもできる。

連結ＤＮＡ断片は、好ましくは制限酵素で、ステップｅ）において場合によっては断片化することができる。第一の断片化ステップ及び任意選択の第二の断片化ステップは、後の増幅ステップ及び／又は配列決定ステップに適合した大きさの連結ＤＮＡ断片の入手を目的とし得る。さらに、酵素を用いることが好ましい第二の断片化ステップは、ステップｆ）におけるアダプターの任意選択の連結に適合した連結断片末端を生成することができる。第二の断片化ステップは架橋の逆行後に実施することができるが、しかしながら、ＤＮＡ断片が依然架橋状態であるときに、第二の断片化ステップｅ）及び／又は連結ステップｆ）を実施することもできる。

断片化ステップｂ）及びｅ）が制限酵素を含む場合、ステップｅ）の制限酵素認識部位はステップｂ）の認識部位より長いことが好ましい。したがってｅ）の酵素はステップｂ）より低い頻度で切断する。これは、ステップｂ）の平均ＤＮＡ断片サイズは、ＤＮＡ限定後に得たステップｅ）の平均断片サイズより小さいことを意味する。このように、第一の断片化ステップでは、比較的小さな断片が形成され、それらを後に連結させる。ステップｅ）の第二の制限酵素はステップｂ）より低い頻度で切断するので、大部分のＤＮＡ断片はステップｅ）の制限酵素認識部位を含むことはできない。したがって、連結ＤＮＡ断片が第二のステップ中で後に断片化されるとき、ステップｂ）のＤＮＡ断片の多くは完全な状態に保たれ得る。ステップｂ）のＤＮＡ断片の組合せ配列を使用して対象のゲノム領域のコンティグを構築することができるので、これは有用である。ステップｂ）の断片化がステップｃ）の断片化より低頻度である場合、その結果はステップｂ）の断片が断片化されることであると思われ、これはコンティグを構築するのに有用な比較的大きなＤＮＡ配列の消失をもたらす可能性がある。したがって、ステップｂ）及びｅ）における断片化にどの方法が使用されるかとは無関係に、ステップｂ）のＤＮＡ断片がおおむね完全な状態に保たれ得る、即ちステップｅ）によっておおむね断片化されないように、ステップｅ）と比較してステップｂ）の断片化がより高頻度であることが好ましい。

ステップｄ）又はｅ）の得られた連結ＤＮＡ断片に、少なくとも１つのアダプターを場合によっては連結させる。連結ＤＮＡ断片の末端は、このようなアダプターの連結に適合している必要がある。ステップｄ）又はｅ）の連結ＤＮＡ断片は線状ＤＮＡであり得るので、アダプターの連結はプライマーハイブリダイゼーション配列をもたらすことができる。標的ヌクレオチド配列を含む連結ＤＮＡ断片と連結したアダプター配列は、ＰＣＲを使用して増幅することができるＤＮＡ分子をもたらす。

次のステップｇ）では、標的ヌクレオチド配列を含むステップｆ）のＤＮＡを、標的ヌクレオチド配列とハイブリダイズする少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマー、及び少なくとも１つのアダプターとハイブリダイズする少なくとも１つの他のプライマーを使用して増幅することができる。アダプターを連結させるステップｆ）は任意選択なので、標的ヌクレオチドを含むステップｄ）又はｅ）のＤＮＡは、標的ヌクレオチド配列とハイブリダイズする少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、ステップｇ）において増幅することもできる。

次に、標的ヌクレオチド配列を含むステップｄ）、ｅ）、ｆ）又はｇ）において得た（増幅された）連結ＤＮＡ断片の配列を決定する。配列の決定は、ハイスループット配列決定技術を使用して実施することが好ましい。これは一層便利であり、多重の配列を決定して完全な対象のゲノム領域を網羅することができるからである。これらの決定した配列から、対象のゲノム領域のコンティグを構築することができる。ＤＮＡ断片の配列を決定すると、重複する読み取り部分を得ることができ、そこから対象のゲノム領域を構築することができる。ランダムな断片化によってＤＮＡ断片を得た場合、断片化ステップのランダムな性質はＤＮＡ断片を既にもたらす可能性があり、それを配列決定すると重複する読み取り部分をもたらす。サンプルサイズを増大すること、例えば分析する細胞の数を増大することによって、構築される対象のゲノム領域の信頼性は増大し得る。或いは、異なる制限酵素を使用して、ステップｂ）において複数のサブサンプルを分析すると、重複する読み取り部分がさらに得られる。複数のサブサンプルを増大することによって、重複する断片の数が増大し、構築される対象のゲノム領域のコンティグの信頼性は増大し得る。重複し得るこれらの決定した配列から、コンティグを構築することができる。或いは、配列が重複しない場合、例えばステップｂ）において１つの制限酵素が使用された可能性があるとき、参照配列と（連結）ＤＮＡ断片のアラインメントは対象のゲノム領域のコンティグの構築を可能にすることができる。

環状化連結断片
別の実施形態では、標的ヌクレオチド配列を含む対象のゲノム領域の配列を決定するための方法であって、
ａ）架橋ＤＮＡのサンプルを提供するステップ、
ｂ）架橋ＤＮＡを断片化するステップ、
ｃ）断片化された架橋ＤＮＡを連結させるステップ、
ｄ）架橋を逆行させるステップ、
ｅ）場合によっては、好ましくは制限酵素で、ステップｄ）のＤＮＡを断片化するステップ、
ｆ）ステップｄ）又はｅ）のＤＮＡを環状化するステップ、
ｇ）場合によっては、及び好ましくは、標的ヌクレオチド配列を含む環状化されたＤＮＡを、好ましくは標的ヌクレオチド配列とハイブリダイズする少なくとも１つのプライマーを使用して、増幅するステップ、
ｈ）ハイスループット配列決定を使用して、標的ヌクレオチドを含む（増幅された）連結ＤＮＡ断片の配列の少なくとも一部分を決定するステップ、
ｉ）決定した配列から対象のゲノム領域のコンティグを構築するステップを含む方法を提供する。

ステップａ）において、本明細書の他の箇所に概略するように架橋ＤＮＡのサンプルを提供する。架橋ＤＮＡのサンプルはステップｂ）において断片化する。架橋ＤＮＡを断片化することによって、架橋により１つに保たれたＤＮＡ断片が生成する。断片化ステップｂ）は超音波処理を含むことができ、酵素によるＤＮＡ末端修復を続けることができる。超音波処理はランダムな部位でのＤＮＡの断片化をもたらし、それは平滑末端であり得るか、又は３’又は５’オーバーハングを有し得るかのいずれかである。これらのＤＮＡ切断点はランダムに存在し、後のステップｃ）においてアダプターと又は互いの断片の連結を可能にする平滑末端を有するＤＮＡ断片が得られるように、ＤＮＡを（酵素により）修復し、生じ得る３’又は５’オーバーハングの充填を行うことができるからである。或いは、例えばエキソヌクレアーゼを使用してオーバーハングヌクレオチドを除去することにより、オーバーハングを平滑末端にすることもできる。断片化ステップｂ）は、１つの制限酵素、又はその組合せを用いた断片化を含むこともできる。制限酵素による断片化は有利である。それは平均断片サイズを調節することができるからである。さらに、形成される断片は、さらなる修飾を必要とせずに後のステップｃ）において断片の連結を可能にする適合オーバーハング又は平滑末端を有するであろう。さらに、架橋ＤＮＡの１サンプルを複数のサブサンプルに分けると、それぞれのサブサンプルに、異なる認識部位を有する制限酵素を使用することができる。異なる認識部位を有する異なる制限酵素を使用することによって、それぞれのサブサンプルから異なるＤＮＡ断片を得ることができるので、これは有利である。

次のステップｃ）では断片を連結させる。ＤＮＡ断片が制限酵素処理によって得られる場合、制限酵素の認識部位が既知であり、それによって、それらの断片を同定することができる。制限酵素認識部位の残り部分又は再構築された制限酵素認識部位が、異なるＤＮＡ断片間の分離を示し得るからである。超音波処理及びその後の酵素によるＤＮＡ末端修復などのランダムな断片化によってＤＮＡ断片を得た場合、一断片を他の断片と区別することがさらに難しくなる可能性がある。どの断片化法を使用するかとは無関係に、連結ステップｃ）はアダプターの存在下で実施することが可能であり、断片間にアダプター配列を連結させることが可能である。或いは、別のステップにおいてアダプターを連結させることが可能である。断片間にあるアダプター配列を同定することによって、異なる断片を容易に同定することができるので、これは有利である。例えば、ＤＮＡ断片末端が平滑末端である場合、アダプター配列はそれらのＤＮＡ断片末端と隣接しており、別のＤＮＡ断片を示すであろう。

次に、ステップｄ）において架橋を逆行させ、これによって２つ以上の断片を含む連結ＤＮＡ断片のプールが生成する。連結ＤＮＡ断片のプールの亜集団は、標的ヌクレオチド配列を含むＤＮＡ断片を含む。架橋の逆行によって、ＤＮＡの構造的／空間的固定が緩み、ＤＮＡ配列は後のステップ、例えば増幅及び／又は配列決定に利用可能な状態となる。架橋ＤＮＡはこのようなステップに適した基質ではない可能性があるからである。後のステップｅ）及び／又はｆ）は架橋の逆行後に実施することができるが、しかしながら、連結ＤＮＡ断片が依然架橋状態であるときに、ステップｅ）及び／又はｆ）を実施することもできる。

連結ＤＮＡ断片は、好ましくは制限酵素で、ステップｅ）において場合によっては断片化することができる。断片化は架橋の逆行後に実施することができるが、第二の断片化を架橋の逆行前に実施することも想定される。断片化のため制限酵素を使用することが好ましい。制限酵素は断片化ステップの調節を可能にし、適切な制限酵素を選択した場合、適合末端の連結に好ましい連結ＤＮＡ断片の適合末端をもたらし、ステップｆ）において得られる環状化連結ＤＮＡ断片をもたらすからである。しかしながら、他の方法、例えばせん断及び／又は超音波処理及び平滑末端二本鎖ＤＮＡを形成するようなその後の酵素によるＤＮＡ末端修復を使用した断片化も、連結させて環状化されたＤＮＡを形成させることが可能である。

第一の断片化ステップ及び任意選択の第二の断片化ステップは、後の環状化、増幅ステップ及び／又は配列決定ステップに適合した連結ＤＮＡ断片の入手を目的とする。断片化ステップｂ）及びｅ）が制限酵素を含む場合、断片化ステップｅ）は、断片化ステップｂ）において得られるような、より長い断片を平均してもたらすことが好ましい。断片化ステップｂ）及びｅ）が制限酵素を含む場合、ステップｅ）の制限酵素認識部位はステップｂ）の認識部位より長いことが好ましい。したがってｅ）の酵素はステップｂ）より低い頻度で切断する。これは、ステップｂ）の平均ＤＮＡ断片サイズは、ＤＮＡ限定後に得たステップｅ）の平均断片サイズより小さいことを意味する。このように、第一の断片化ステップでは、比較的小さな断片が形成され、それらを後に連結させる。ステップｅ）の第二の制限酵素はステップｂ）より低い頻度で切断するので、大部分のＤＮＡ断片はステップｅ）の制限酵素認識部位を含むことはできない。したがって、連結ＤＮＡ断片が第二のステップ中で後に断片化されるとき、ステップｂ）のＤＮＡ断片の多くは完全な状態に保たれ得る。ステップｂ）のＤＮＡ断片の組合せ配列を使用して対象のゲノム領域のコンティグを構築することができるので、これは有用である。ステップｂ）の断片化がステップｃ）の断片化より低頻度である場合、その結果はステップｂ）の断片が断片化されることであると思われ、これはコンティグを構築するのに有用な比較的大きなＤＮＡ配列の消失をもたらす可能性がある。したがって、ステップｂ）及びｅ）における断片化にどの方法が使用されるかとは無関係に、ステップｂ）のＤＮＡ断片がおおむね完全な状態に保たれ得る、即ちステップｅ）によっておおむね断片化されないように、ステップｅ）と比較してステップｂ）の断片化がより高頻度であることが好ましい。

その架橋が逆行しているステップｄ）又はｅ）の得られた連結ＤＮＡ断片を、次にステップｆ）において環状化する。環状化前に架橋を逆行させることは有利であり得る。架橋状態の架橋ＤＮＡを環状化することは望ましくない可能性があるからである。しかしながら、連結ＤＮＡ断片が架橋されたまま環状化を実施することもできる。連結ステップ中、環状化連結ＤＮＡ断片が既に形成されており、したがって環状化ステップｆ）がステップｃ）と同時に存在するであろうから、追加的環状化ステップは必要とされないことも可能であり得る。しかしながら、追加的環状化ステップを実施することは好ましい。環状化は、閉環が形成されるような連結ＤＮＡ断片の末端の連結を含む。標的ヌクレオチド配列を含む連結ＤＮＡ断片を含む環状化されたＤＮＡは、標的ヌクレオチド配列とハイブリダイズする少なくとも１つのプライマーを使用して後に増幅することができる。増幅ステップのため、架橋の逆行が必要とされる。架橋ＤＮＡは増幅を阻害又は妨害する可能性があるからである。インバースＰＣＲ反応において標的ヌクレオチド配列とハイブリダイズする２つのプライマーを使用することが好ましい。この方法で、標的ヌクレオチド配列を含むＤＮＡ断片と連結する環状化されたＤＮＡのＤＮＡ断片を増幅することができる。

多重の標的配列
一実施形態では、２つの標的ヌクレオチド配列を含む対象のゲノム領域の配列を決定するための方法を提供する。この方法は、増幅ステップまでは前述したのと同じステップを含むことができる。ここで増幅ステップは、１つの標的ヌクレオチド配列ではなく２つを使用する。２つの標的ヌクレオチド配列用に、１つのプライマーがそれぞれの標的ヌクレオチド配列用である、２つの異なるプライマーをＰＣＲ反応中で使用する。２つの標的ヌクレオチド配列由来の２つのプライマー結合部位が連結ＤＮＡ断片中に存在するとき、プライマー結合部位が正しい配向を有するという条件で、２つのプライマーは２つのプライマー結合部位間の配列を増幅する。環状化連結ＤＮＡ断片を有することは有利であり得る。正しい配向を有する２つのプライマー結合部位に関する確率は、線状連結ＤＮＡ断片と比較して高いからである（線状連結ＤＮＡ断片に関する４配向の１つと比較して、４配向ののうち２つが増幅する）。さらなる実施形態では、２つの標的ヌクレオチド配列以外に、対象のゲノム領域はさらなる標的ヌクレオチドを含み、それぞれの標的ヌクレオチド用にＰＣＲ増幅反応中でプライマーを使用する。一増幅において多重の標的ヌクレオチドと対応するプライマーを組合せることによって、プライマーの組合せがアンプリコンを生成する確率が増大する。

例えば、実施例セクション中に記載するように、ＢＲＣＡ１遺伝子に関して５つの異なる標的ヌクレオチドを使用した（例えば図２参照）。（観察点とも呼ぶ）１つの標的ヌクレオチド配列、例えば、Ａ及びその他、Ｂからプライマーを選択することによって、ＰＣＲを実施することができる。さらに、それぞれの標的ヌクレオチド配列Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ及びＥからプライマーを使用してＰＣＲを実施することができる。これらの標的ヌクレオチドは互いに物理的に隣接するので、アンプリコンが生成し得るようにプライマー結合部位が連結ＤＮＡ断片で終結する条件で、このような増幅を実施することによって対象のゲノム領域が富化される。

したがって、対象のゲノム領域が１つ以上の標的ヌクレオチド配列をさらに含み、増幅ステップ中、標的ヌクレオチド配列とハイブリダイズするプライマーを提供し、対応する１つ以上の他の標的ヌクレオチド用の１つ以上のプライマーを提供し、プライマーを使用して、連結ＤＮＡ断片を増幅し、又は環状化されたＤＮＡを増幅する、本発明による対象のゲノム領域の配列を決定するための方法を提供する。

連結ＤＮＡ断片の配列の決定
連結ＤＮＡ断片の配列を決定するステップは、ハイスループット配列決定を含むことが好ましい。ハイスループット配列決定法は当技術分野でよく知られており、原則として本発明中での任意の方法の使用を企図することができる。ハイスループット配列決定技術は、（例えば、Ｒｏｃｈｅ、Ｉｌｌｕｍｉｎａ又はＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓによって提供される）製造者の説明書に従って実施することができる。一般に、配列決定用アダプターを（増幅された）連結ＤＮＡ断片に連結させることが可能である。例えば本明細書に記載するＰＣＲを使用することにより線状又は環状化断片を増幅する場合、増幅産物は線状であり、アダプターの連結が可能である。アダプター配列の連結に適した末端（例えば、平滑、相補性付着末端）を提供することができる。或いは、ＰＣＲ又は他の増幅法に使用するプライマー（複数可）は、増幅ステップｇ）中にアダプター配列を含む増幅産物が形成されるように、アダプター配列を含むことができる。環状化断片が増幅しない場合、標的ヌクレオチド配列を含むＤＮＡ断片と連結したＤＮＡ断片が完全な状態に保たれるように、例えば好ましくはインバースＰＣＲ反応用のプライマー結合部位間の制限酵素を使用することにより、環状化断片を断片化することができる。配列決定用アダプターを、本発明の方法のステップｃ）及びｆ）中に含めることもできる。これらの配列決定用アダプターは、これらのステップ中で既に場合によっては使用された可能性があるアダプターのアダプター配列の一部として含めることができ、及び／又は、別の配列決定用アダプターをこれらのステップ中でさらに提供することができる。

使用するハイスループット配列決定法において、長い読み取り部分が生成可能であることが好ましい。長い読み取り部分は、連結ＤＮＡ断片の多重のＤＮＡ断片全体の読み取りを可能にすることができる。このように、ステップｂ）のＤＮＡ断片を同定することができる。ＤＮＡ断片配列は参照配列と比較することができ、及び／又は互いに比較することができる。例えば、本明細書で以後さらに説明するように、このようなＤＮＡ断片配列は、遺伝子突然変異を保有する細胞の断片の割合を決定するのに使用することができる。このような配列と隣接するＤＮＡ断片のＤＮＡ断片配列をさらに配列決定することによって、独自の連結ＤＮＡ断片を同定することができる。ランダムな断片化によりステップｂ）においてＤＮＡ断片を得たとき、これは特に当てはまる。２つの細胞が全く同じＤＮＡ断片をもたらす確率は非常に低く、それだけではなく、このような断片が連結するＤＮＡ断片末端も同様である。したがって、このようにＤＮＡ断片を同定することによって、特定の突然変異を含む細胞及び／又は対象のゲノム領域の割合を決定することができる。

したがって、連結ＤＮＡ断片の完全な配列を提供することは必要とされない。ＤＮＡ断片配列が決定されるような、少なくとも（多重の）ＤＮＡ断片にわたる配列が好ましい。

さらに短い配列、例えば５０〜１００ヌクレオチドの短い読み取り部分の読み取りも企図することができる。このようなシナリオでは、ハイスループット配列決定法に適した適切なアダプターに後に連結させることが可能であるより小さな断片に、（増幅された）連結ＤＮＡを断片化することが好ましい。標準的な配列決定プロトコールが使用される場合、これは、連結ＤＮＡ断片に関する情報が消失し得ることを意味し得る。短い読み取り部分に関しては、完全なＤＮＡ断片配列を同定することができない可能性がある。このような短い読み取り部分が企図される場合、短い読み取り部分から連結ＤＮＡ断片のコンティグを構築することができるように、別個の連結ＤＮＡ断片が断片化時に識別子を連結又は装備するような、追加的処理ステップの提供を想定することができる。短い配列読み取り部分に関するこのようなハイスループット配列決定技術は、対型末端配列決定を含むことができる。対型末端配列決定及び短い配列読み取り部分を使用することによって、そのＤＮＡ分子が異なるＤＮＡ断片を含み得る配列決定に使用するＤＮＡ分子の、両末端からの短い読み取り部分は連結したＤＮＡ断片のカップリングを可能にすることができる。これは、両末端から決定した配列と比較して比較的大きなＤＮＡ配列にわたり、２つの配列読み取り部分がカップリング可能であるためである。このように、（増幅された）連結ＤＮＡ断片のコンティグを構築することができる。

しかしながら、ＤＮＡ断片を同定せずに、短い読み取り部分の使用を企図することができる。特に対象のゲノム領域が増幅されているとき、短い配列読み取り部分から、対象のゲノム領域を構築することができるからである。（例えば二倍体細胞の）ＤＮＡ断片及び／又は別個の対象のゲノム領域に関する情報は消失し得るが、ＤＮＡの突然変異は依然同定することができる。

したがって、（増幅された）連結ＤＮＡ配列の配列の少なくとも一部分を決定するステップは短い配列読み取り部分を含むことができるが、ＤＮＡ断片配列を同定することができるように、より長い配列読み取り部分を決定することが好ましい。さらに、（増幅された）（増幅された）連結ＤＮＡ断片用の異なるハイスループット配列決定戦略の使用、例えば、対型末端配列決定からの短い配列読み取り部分とより長い配列読み取り部分を有する比較的遠い末端の組合せも企図することができ、このように、（増幅された）連結ＤＮＡ断片のコンティグを構築することができる。

一実施形態では、本発明は、生成された配列情報の品質管理を行うのに使用することができる。ハイスループット配列決定の方法によって与えられる配列の分析では、配列決定誤差が生じ得る。例えばＤＮＡ鎖の延長中に配列決定誤差が生じる可能性があり、この場合誤った（即ち、鋳型と非相補的）塩基がＤＮＡ鎖中に取り込まれる。配列決定誤差は突然変異とは異なる。増幅及び／又は配列決定された元のＤＮＡはその突然変異を含まないであろうからである。本発明によれば、ＤＮＡ断片配列は、それに連結したＤＮＡ断片の配列（の少なくとも一部分）で決定することができ、それらの配列は独自あり得る。それらがステップｃ）において形成されるときの連結ＤＮＡ断片の独自性によって、ステップｈ）において決定した配列の品質管理を行うことができる。連結ＤＮＡ断片を増幅し、十分な深さで配列決定するとき、同じ独自の（連結）ＤＮＡ断片（複数可）の多重のコピーが配列決定される。元の同じ連結ＤＮＡ断片に由来するコピーの配列を比較することができ、増幅及び／又は配列決定誤差を同定することができる。

さらなる実施形態
さらに本発明の方法に従い、架橋ＤＮＡのサンプルから、多重の対象のゲノム領域の配列を決定する。それぞれの対象のゲノム領域用に、それに対応するプライマー（複数可）を設計することができる標的ヌクレオチド配列を提供する。多重の対象のゲノム領域は重複する可能性もある対象のゲノム領域であってよく、したがって配列を決定することができるその大きさは増大し得る。例えば、標的ヌクレオチド配列を含む対象のゲノム領域の配列が１ＭＢを典型的に含み、部分的に重複する対象のゲノム領域と、例えばそれぞれ対応する標的ヌクレオチド配列を含む０．１ＭＢの重複を組合せる場合、５つの対象のゲノム領域の組合せは４．６ＭＢ（０．９＋３×（０．１＋０．８）＋０．１＋０．９＝４．６ＭＢ）の配列をもたらし、したがって配列を決定又は他の場合分析することができる対象のゲノム領域の大きさは大幅に増大するであろう。対象のゲノム領域内の明確な距離での多重の標的ヌクレオチド配列を使用して、ゲノム領域全体の平均範囲及び／又は範囲の均一性を増大することもできる。

さらに、識別子をステップｇ）の少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマーの中に含めることができる。連結ステップｃ）中の断片間の連結に使用するようなアダプター配列中に、識別子を含めることもできる。オリゴヌクレオチドプライマーの中に識別子を含めることによって、架橋ＤＮＡの複数のサンプル以上のサブサンプルを同時に分析するとき、それぞれのサンプルの起源を容易に決定することができる。架橋ＤＮＡのオリジナルサンプルが同じでありながら、架橋ＤＮＡの（サブ）サンプルは異なる処理をされた可能性があるか、及び／又は、ＤＮＡのサンプルは例えば異なる生物若しくは患者から得られた可能性がある。サンプルの処理を１つにすることができる、例えば同一手順のステップが実施されるとき、識別子は異なる処理をしたサンプルの組合せを可能にする。配列決定ステップｈ）がハイスループット配列決定を含むとき、このように処理を１つにすることは特に有利であり得る。

増幅ステップｇ）の前又は後に、本発明の方法に従い、サイズ選択ステップを実施することができる。このようなサイズ選択ステップは、ゲル抽出クロマトグラフィー、ゲル電気泳動又は密度勾配遠心分離を使用して実施することができ、これらは当技術分野で一般に知られている方法である。２０〜２０，００００塩基対、好ましくは５０〜１０，００００塩基対の間、最も好ましくは１００〜３，０００塩基対の間のサイズのＤＮＡを選択することが好ましい。サイズ分離ステップによって、ＰＣＲ増幅に最適及び／又は次世代配列決定による長い読み取り部分の配列決定に最適であり得るサイズ範囲で（増幅された）連結ＤＮＡ断片を選択することができる。５００ヌクレオチドの読み取り部分の配列決定が現在市販されており、ＰａｃｉｆｉｃＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐａｃｉｆｉｃｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ．ｃｏｍ／）により開発されたＳｉｎｇｌｅＭｏｌｅｃｕｌｅＲｅａｌＴｉｍｅ（ＳＭＲＴ（商標））ＤＮＡ配列決定技術などの企業による近年の進展は、１．０００〜１０，０００ヌクレオチドの読み取り部分が到達範囲内であることを示す。

対象のゲノム領域の細胞における倍数性が１を超える場合、それぞれの倍数性に関して、本発明による方法のステップｈ）においてコンティグを構築する。ゲノム中の任意の所与の標的部位のゲノム環境は、大部分は線状染色体鋳型上の標的配列と物理的に隣接したＤＮＡゲノム配列からなるので、それぞれ個々の染色体鋳型の再構築が可能になる。対象のゲノム領域の倍数性が１を超える場合、多重の対象のゲノム領域（又はそれらの相当物）が細胞中に存在する。これらの多重の対象のゲノム領域は一般に同じ空間を占めない、即ちそれらは空間中に分離している。細胞中の各対象のゲノム領域由来の、このような細胞の架橋ＤＮＡのサンプルが断片化されるとき、標的ヌクレオチド配列を含む対応するＤＮＡ断片が形成され得る。これらのＤＮＡ断片は、それらの近辺のＤＮＡ断片とそれぞれ連結する。したがって連結ＤＮＡ断片は異なる対象のゲノム領域を表す。例えば、倍数性が２である場合、独自の突然変異をそれぞれ有し１ＭＢ離れた２つの断片が、連結ＤＮＡ断片内で一緒に発見されるとき、これらの２つの断片は同じ対象のゲノム領域に由来すると結論付けることができる。したがってこのシナリオでは、２つの断片を同定し、両方共同じゲノム領域に割り当てる。したがって、同定した断片の配列からコンティグを構築すると、突然変異を保有するこれらの２つの断片は１つの特定ゲノム領域のコンティグを構築するのに使用され、一方で他のゲノム領域に関して構築されるコンティグは突然変異を保有しないであろう。

したがって、本発明の方法によれば、コンティグを構築するステップｈ）は、
１）ステップｂ）の断片を同定するステップ、
２）ゲノム領域に断片を割り当てるステップ、
３）断片の配列からゲノム領域のコンティグを構築するステップを含む。

さらに、独自の突然変異を含む３個の断片が存在し（Ａ^＊、Ｂ^＊及びＣ^＊）、対象のゲノムの倍数性が２であるとき。このとき、２個の突然変異断片を含む連結産物を同定し、１個の連結産物はＡ^＊Ｂ^＊を含み１個はＡ^＊Ｃ^＊を含む。さらに、非突然変異断片を含む連結産物はＢＣ及びＡＣとして同定する。このシナリオでは、連結ＤＮＡ断片Ａ^＊Ｂ及びＡ^＊Ｃ^＊は断片Ａ^＊によってカップリングし、連結ＤＮＡ断片ＢＣ及びＡＣは断片Ｃによってカップリングする。このシナリオでは、ＤＮＡ断片Ａ^＊、Ｂ^＊及びＣ^＊は同じゲノム領域に割り当てられ、一方Ａ、Ｂ及びＣは他のゲノム領域に割り当てられる。したがってこのように、ゲノム領域に断片を割り当てるステップ２）は、異なる連結産物を同定するステップとＤＮＡ断片を含む異なる連結産物をカップリングさせるステップを含む。

同様に、同じことが異種細胞集団に当てはまる。例えば、異種細胞集団（例えば、異なる起源の細胞、又は正常細胞及び遺伝的に突然変異した細胞（例えば、癌細胞）を含む生物由来の細胞）を含む架橋ＤＮＡのサンプルが提供される場合、（例えば、一細胞中の異なるゲノム環境、又は異なる細胞由来の異なるゲノム環境であってよい）異なるゲノム環境に対応するそれぞれの対象のゲノム領域に関して、コンティグを構築することができる。

突然変異の同定
別の実施形態では、遺伝子突然変異の有無を同定するための方法を提供する。

第一の実施形態では、遺伝子突然変異の有無を同定するための方法であって、前に記載した本発明のいずれかの方法のステップａ）〜ｈ）を含み、複数のサンプルのコンティグを構築し、以下のさらなるステップ：
ｉ）複数のサンプルのコンティグをアラインメントするステップ、
ｊ）複数のサンプル由来の対象のゲノム領域における遺伝子突然変異の有無を同定するステップ、
を含む方法を提供する。

或いは、遺伝子突然変異の有無を同定するための方法であって、前に記載した本発明のいずれかの方法のステップａ）〜ｇ）を含み、以下のさらなるステップ：
ｉ）参照配列とコンティグをアラインメントするステップ、
ｊ）対象のゲノム領域における遺伝子突然変異の有無を同定するステップ、
を含む方法を提供する。

１つ（又は複数の）サンプルが遺伝子突然変異を含む場合、例えば多重のサンプルのコンティグを比較することにより遺伝子突然変異を同定することができ、これによって、他のサンプルの配列と比較してコンティグの配列が異なることを観察することができる、即ち遺伝子突然変異の存在が同定される。サンプルのコンティグ間で配列の違いが観察されない場合、遺伝子突然変異の不在が同定される。或いは、コンティグの配列とアラインメントすることができる参照配列を使用することもできる。サンプルのコンティグの配列が参照配列の配列と異なるとき、遺伝子突然変異が観察される、即ち遺伝子突然変異の存在が同定される。１つ以上のサンプルのコンティグと参照配列の間で配列の違いが観察されない場合、遺伝子突然変異の不在が同定される。

遺伝子突然変異の有無を同定するためにコンティグを構築することは必要とされない。ＤＮＡ断片配列を互いに、又は参照配列とアラインメントすることができる限り、遺伝子突然変異の有無を同定することができる。したがって、本発明の別の実施形態では、コンティグを構築するステップｈ）を含まない前に記載したいずれかの方法による、遺伝子突然変異の有無を同定するための方法を提供する。

このような方法は、前に記載したいずれかの方法のステップａ）〜ｇ）を含み、以下のさらなるステップ：
ｈ）（増幅された）連結ＤＮＡ断片の決定した配列と参照配列をアラインメントするステップ、
ｉ）決定した配列における遺伝子突然変異の有無を同定するステップ、
を含む。

或いは、遺伝子突然変異の有無を同定するための方法であって、（増幅された）連結ＤＮＡ断片の複数のサンプル配列を決定し、前に記載したいずれかの方法のステップａ）〜ｇ）を含み、以下のさらなるステップ：
ｈ）複数のサンプルの（増幅された）連結ＤＮＡ断片の決定した配列をアラインメントするステップ、
ｉ）決定した配列における遺伝子突然変異の有無を同定するステップ、
を含む方法を提供する。

遺伝子突然変異を保有する対立遺伝子又は細胞の割合
既に前述したように、異種細胞集団（例えば、異なる起源の細胞、又は正常細胞及び遺伝的に突然変異した細胞（例えば、癌細胞）を含む生物由来の細胞）由来の架橋ＤＮＡのサンプルが提供されるとき、（例えば、細胞中の異なる対立遺伝子由来の異なるゲノム環境、又は異なる細胞由来の異なるゲノム環境であってよい）異なるゲノム環境に対応するそれぞれの対象のゲノム領域に関して、コンティグを構築することができる。さらに、遺伝子突然変異を保有する断片又は連結ＤＮＡ断片の割合を決定することができ、それは遺伝子突然変異を保有する対立遺伝子又は細胞の割合と相関し得る。ＤＮＡ断片の連結はランダムなプロセスであり、連結ＤＮＡ断片の一部であるＤＮＡ断片の集結及び順序は独自であってよく、単細胞及び／又は細胞由来の１つの対象のゲノム領域を表す。さらに、断片化ステップｂ）が例えば超音波処理などのランダムな断片化プロセスを含む場合、ＤＮＡが破壊された点は、特に（独自の断片末端をも有し得る）それと連結する他のＤＮＡ断片の文脈内で、他の独自の特徴をもたらす可能性がある。

したがって、遺伝子突然変異を有する断片を含む連結ＤＮＡ断片の同定は、独自の順序及び集結のＤＮＡ断片の連結ＤＮＡ断片の同定も含むことができる。遺伝子突然変異を有する対立遺伝子又は細胞の割合は、治療の評価において、例えば患者が癌治療を施される場合において重要であり得る。癌細胞は特定の遺伝子突然変異を有し得る。このような突然変異を有する細胞の百分率は、治療の成功又は失敗に関する指標となり得る。別の実施形態では、遺伝子突然変異を保有する断片の割合、及び／又は遺伝子突然変異を保有する連結ＤＮＡ断片の割合を決定するための方法を提供する。この実施形態では、特定の遺伝子突然変異又は特定の遺伝子突然変異の淘汰として遺伝子突然変異を定義する。

第一の実施形態では、異種である疑いがある細胞集団から遺伝子突然変異を保有する断片の割合を決定するための方法であって、前に記載したいずれかの方法のステップａ）〜ｈ）を含み、以下のさらなるステップ：

ｉ）ステップｂ）の断片を同定するステップ、
ｊ）断片における遺伝子突然変異の有無を同定するステップ、
ｋ）遺伝子突然変異を保有する断片の数を決定するステップ、
ｌ）遺伝子突然変異を保有していない断片の数を決定するステップ、
ｍ）遺伝子突然変異を保有する断片の割合を計算するステップ、
を含む方法を提供する。

別の実施形態では、異種である疑いがある細胞集団から遺伝子突然変異を有する断片を保有する連結産物の割合を決定するための方法であって、前に記載したいずれかの方法のステップａ）〜ｈ）を含み、以下のさらなるステップ：
ｉ）ステップｂ）の断片を同定するステップ、
ｊ）断片における遺伝子突然変異の有無を同定するステップ、
ｋ）遺伝子突然変異を有する又は有さない断片を保有するステップｆ）の連結産物を同定するステップ、
ｌ）遺伝子突然変異を有する断片を有する連結産物の数を決定するステップ、
ｍ）遺伝子突然変異を有さない断片を有する連結産物の数を決定するステップ、
ｎ）遺伝子突然変異を有する連結産物の割合を計算するステップ、
を含む方法を提供する。

これらの実施形態の方法では、ステップｊ）において、参照配列とアラインメントすることによって、及び／又は複数のサンプルのＤＮＡ断片配列を比較することによって、遺伝子突然変異の有無を同定することができる。

本発明による方法では、同定される遺伝子突然変異はＳＮＰ、単一ヌクレオチド多型、挿入、逆位及び／又は転座であってよい。欠失及び／又は挿入が観察される場合、欠失及び／又は挿入を同定するために、欠失及び／又は挿入を保有するサンプル由来の断片及び／又は連結産物の数を参照サンプルと比較することができる。分析した断片における染色体切断部位の存在に基づいて、欠失、挿入、逆位及び／又は転座を同定することもできる。

別の実施形態中、前に記載した方法中では、ＤＮＡ断片、連結ＤＮＡ断片、及び／又は対象のゲノム領域におけるメチル化ヌクレオチドの有無を決定する。例えば、ステップａ）〜ｆ）のＤＮＡは重亜硫酸塩で処理することができる。重亜硫酸塩を用いたＤＮＡの処理はシトシン残基をウラシルに変換するが、５−メチルシトシン残基は影響を受けないままである。したがって、重亜硫酸塩処理は、個々のシトシン残基のメチル化状態に応じてＤＮＡ配列の特異的変化をもたらし、ＤＮＡセグメントのメチル化状態に関する単一ヌクレオチド解像情報を与える。サンプルをサブサンプルに分けること、サンプルの１つを処理し、他は処理しないことによって、メチル化ヌクレオチドを同定することができる。或いは、重亜硫酸塩で処理した複数のサンプル由来の配列をアラインメントすることもでき、又は重亜硫酸塩で処理した１つのサンプル由来の配列を参照配列とアラインメントすることができる。

（短い）配列読み取り部分の分析時に、使用するプライマーの配列決定を阻止することが対象となる可能性がある。したがって、別の方法では、ハイスループット配列決定ステップの前にプライマー配列を除去することができる。したがって、別の実施形態では、標的ヌクレオチド配列を含む対象のゲノム領域の配列を決定するための以下の方法であって、
ａ）架橋ＤＮＡのサンプルを提供するステップ、
ｂ）架橋ＤＮＡを断片化するステップ、
ｃ）断片化された架橋ＤＮＡを連結させるステップ、
ｄ）架橋を逆行させるステップ、
ｅ）場合によっては、好ましくは制限酵素で、ステップｄ）のＤＮＡを断片化するステップ、
ｆ）場合によっては、少なくとも１つのアダプターとステップｄ）又はｅ）の断片化されたＤＮＡを連結させるステップ、
ｇ）好ましくはＩＩＩ型制限酵素認識部位を有する５’オーバーハングを含有し（２）標的ヌクレオチド配列とハイブリダイズする少なくとも１つのプライマーを使用して標的ヌクレオチド配列を含むステップｄ）又はｅ）の連結ＤＮＡ断片を増幅する、又は（１）好ましくはＩＩＩ型制限酵素認識部位を有する５’オーバーハングを含有し（２）標的ヌクレオチド配列とハイブリダイズする少なくとも１つのプライマー、及び少なくとも１つのアダプターとハイブリダイズする少なくとも１つのプライマーを使用してステップｆ）の連結ＤＮＡ断片を増幅するステップ、
ｈ）ＩＩＩ型制限酵素で対象の増幅ヌクレオチド配列を消化するステップ、次に切り離された二本鎖プライマー配列を除去するためのサイズ選択ステップ、
ｉ）好ましくは超音波処理によってＤＮＡを断片化するステップ、
ｊ）場合によっては、次世代配列決定に必要な二本鎖アダプター配列を連結させるステップ、
ｋ）好ましくはハイスループット配列決定法を使用して、標的ヌクレオチド配列を含むステップｄ）、ｅ）、ｆ）又はｇ）の（増幅された）連結ＤＮＡ断片の配列の少なくとも一部分を決定するステップ、
ｌ）決定した配列から対象のゲノム領域内の遺伝的変異を同定し、対象のゲノム領域のコンティグを構築するステップ
を含む方法を提供する。

別の実施形態では、本明細書に記載するいずれかの方法中、ステップｇ）において、固形担体への結合を介した（増幅された）連結ＤＮＡ断片の任意選択の精製用の、例えばビオチンなどの成分を保有するプライマーを使用する。

一実施形態では、標的ヌクレオチド配列を含む連結ＤＮＡ断片は、標的ヌクレオチド配列とハイブリダイズするハイブリダイゼーションプローブ（又は捕捉用プローブ）を用いて捕捉することができる。ハイブリダイゼーションプローブは固形担体に直接付けることが可能であり、又はビオチン成分を捕捉するのに適した固形担体（例えば、ストレプトアビジンでコーティングしたビーズ）との結合を可能にするため、例えばビオチンなどの成分を含むことができる。いずれの場合も、標的ヌクレオチド配列を含む連結ＤＮＡ断片を捕捉し、これによって標的ヌクレオチド配列を含まない連結ＤＮＡ断片から標的ヌクレオチド配列を含む連結ＤＮＡ断片を分離することができる。したがって、このような捕捉ステップは標的ヌクレオチド配列を含む連結ＤＮＡ断片を富化することができる。したがって、本発明を通じて、富化ステップでもある増幅ステップを実施し、或いは標的ヌクレオチド配列を対象とするプローブを用いた捕捉ステップを実施することができる。対象のゲノム領域用に、標的ヌクレオチド配列用の少なくとも１つの捕捉用プローブを捕捉に使用することができる。対象のゲノム領域用に、２つ以上のプローブを多重の標的ヌクレオチド配列に使用することができる。例えば、ＢＲＣＡ１遺伝子に関して記載したのと同様に、５標的ヌクレオチド配列の１配列の１プライマーを捕捉用プローブ（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ又はＥ）として使用することができる。或いは、対象のゲノム領域を捕捉する組合せ形式（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ及びＥ）で５プライマーを使用することができる。

一実施形態では、増幅ステップと捕捉ステップを組合せることができる。例えば最初に捕捉ステップ、及び次に増幅ステップを実施することができ、又は逆も然りである。

一実施形態では、（増幅された）連結ＤＮＡ断片中に含まれるアダプター配列とハイブリダイズする捕捉用プローブを使用することができる。

これは、完全なＢｒｃａ１遺伝子配列を決定するために使用した、本発明による全遺伝子配列決定手法の一例である。使用した細胞は、Ｂｒｃａ１遺伝子座中の位置２２８８においてＴが欠失した、乳癌接着性細胞株のＳＵＭ１４９ＰＴ細胞であった（ＥｌｓｔｒｏｄｔらＣａｎｃｅｒＲｅｓ、２００６）。図１は、この方法の概略を示す。

細胞培養
ＳＵＭ１４９ＰＴ細胞を、ＲＰＭＩ／１０％ＦＣＳ／ｐｅｎｓｔｒｅｐを含む完全なプレート状態まで１５０ｃｍ^２皿において培養する。皿の事前の分割及び計数によって、１５０ｃｍ^２皿全体は約２０×１０^６個のＳＵＭ１４９ＰＴ細胞を含有することを示した。

固定及び細胞溶解
培養した細胞はＰＢＳで洗浄し、室温において１０分間ＰＢＳ／１０％ＦＣＳ／２％ホルムアルデヒドで固定する。細胞はその後洗浄及び回収し、溶解バッファー（５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＥＤＴＡ、０．５％のＮＰ−４０、１％のＴＸ−１００及び１×完全プロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ＃１１２４５２００）中に取り込ませ、氷上で１０分間インキュベートする。細胞はその後洗浄し、ＭｉｌｌｉＱ中に取り込ませる。

断片化１：消化
固定した溶解細胞はＮＩａＩＩＩ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ＃Ｒ０１２５）で消化する。

連結１
ＮＩａＩＩＩ酵素を熱失活させ、その後Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（Ｒｏｃｈｅ、＃７９９００９）を使用して連結ステップを実施する。

架橋の逆行
このサンプルに、ＰｒｏｔＫ（１０ｍｇ／ｍｌ）を加え６５℃でインキュベートする。ＲＮａｓｅＡ（１０ｍｇ／ｍｌ、Ｒｏｃｈｅ＃１０１０９１６９００１）を後に加え、サンプルは３７℃でインキュベートする。次に、フェノール−クロロホルム抽出を実施し、ＤＮＡを含む上清は沈殿させペレット状にする。ペレットは１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５中に溶かす。

断片化２：第二の消化
消化及び連結サンプルはＮｓｐＩ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ＃Ｒ０６０２Ｓ）で消化する。

連結２：第二の連結及び精製
このサンプルに、ＰｒｏｔＫ（１０ｍｇ／ｍｌ）を加え６５℃でインキュベートする。ＲＮａｓｅＡ（１０ｍｇ／ｍｌ、Ｒｏｃｈｅ＃１０１０９１６９００１）を後に加え、サンプルは３７℃でインキュベートする。次に、フェノール−クロロホルム抽出を実施し、ＤＮＡを含む上清は沈殿させペレット状にする。ペレットは１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５中に溶かす。富化鋳型はここで終了し、保存又は直接続行することができる。

連結ＤＮＡ断片の増幅：ＰＣＲ
Ｂｒｃａ１遺伝子座のＰＣＲ富化に使用するプライマーは、約２０ｋｂのプライマーセットの空間、即ち「観察点」で、ＮＩａＩＩＩ制限断片の制限部位近辺（＜５０ｂｐ）において逆方向ユニークプライマーとして設計する（図２及び表１参照）。

表１．使用したプライマー配列の概要。ＢＲＣＡ１遺伝子、配列マップ上の位置を参照してプライマーに（名称を）名付け（例えば５０．１（ｋｂ））、プライマーはフォワード（ｆｗ）又はリバース（ｒｅｖ）プライマーである。ｖｐは観察点を示し、ＩＤは配列番号、即ち配列番号１〜１０を示す。プライマーが対応するＢＲＣＡ１遺伝子の配列も示す（開始点（５’）及び終了点（３’））。プライマーは外側方向、即ちインバースであり、鋳型として正常なＤＮＡを使用して、アンプリコンを形成することができないことに留意されたい。

典型的な富化ＰＣＲ反応は２５μｌからなる。
（ＥｘｐａｎｄＬｏｎｇ鋳型ポリメラーゼと共に供給される）２．５μｌの１０×ＰＣＲバッファー３
０．５μｌのｄＮＴＰ（１０ｍＭ）
（１μｇ／μｌのプライマーストックから１／７希釈した）０．５μｌのフォワードプライマー
（１μｇ／μｌのプライマーストックから１／７希釈した）０．５μｌのリバースプライマー
０．３７５μｌのＥｘｐａｎｄＬｏｎｇ鋳型ポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ＃１１７５９０６０００１）
１００ｎｇの富化鋳型
２５μｌの合計体積までのＸμｌのＭｉｌｌｉ−Ｑ

増幅された連結ＤＮＡ断片の配列決定
標準ＳＯＬｉＤプロトコールに従い、ＳＯＬｉＤ配列決定用のライブラリー調製を進める。

結果
異なる観察点からの読み取り分布値は、観察点部位周辺で最も高かった。さらなる統計値は表２中に示す。観察点ライブラリーＣ、Ｄ及びＥからの配列読み取り値によって２２８８ｄｅｌＴ突然変異を同定した。ＢＲＣＡ１遺伝子のどの配列が含まれなかったかも決定し、観察点Ａから１５８０７塩基対が含まれず、Ｂからは５０１２４塩基対が含まれなかった。Ｃ、Ｄ、及びＥから、全てのＢＲＣＡ１配列が含まれた。

表２．観察点当たりの配列読み取りの統計値。観察点ライブラリー（ｖｐ、Ａ〜Ｅ）当たりの配列読み取りの統計値を示す。Ｍ（ＢＲＣＡ１に適合する読み取り値）、ＴＲ（読み取り値の合計数）、％ＭｔＴ（標的に適合する全読み取り値の％）、平均（平均範囲）、メディアン（メディアン範囲）、％ｎｔ２０×（２０倍を超える範囲であったＢＲＣＡ１遺伝子由来のヌクレオチドの％）。

したがって、一観察点Ｃ、Ｄ及びＥ由来の１００ｋｂの完全ＢＲＣＡ１が含まれ、観察点Ａ由来の８５ｋｂのＢＲＣＡ１遺伝子が含まれ、観察点Ｂ由来の５０ｋｂのＢＲＣＡ１遺伝子が含まれ、Ｃ、Ｄ及びＥ観察点から２２８８ｄｅｌＴ突然変異を同定した。

Claims

標的ヌクレオチド配列を含む対象のゲノム領域のコンティグを構築するための方法であって、
架橋ＤＮＡを断片化するステップ、
断片化された架橋ＤＮＡを連結させるステップ、
架橋を逆行させるステップ、
架橋の逆行後に得られ、標的ヌクレオチド配列を含む連結ＤＮＡ断片の配列の少なくとも一部分を決定するステップ、及び
決定した配列を使用して対象のゲノム領域のコンティグを構築するステップ
を含む方法。
標的ヌクレオチド配列を含む対象のゲノム領域のコンティグを構築するための方法であって、
ａ）架橋ＤＮＡのサンプルを提供するステップ、
ｂ）架橋ＤＮＡを断片化するステップ、
ｃ）断片化された架橋ＤＮＡを連結させるステップ、
ｄ）架橋を逆行させるステップ、
ｅ）標的ヌクレオチド配列を含むステップｄ）の連結ＤＮＡ断片の配列の少なくとも一部分を決定するステップ、及び
ｆ）決定した配列から対象のゲノム領域のコンティグを構築するステップ
を含む方法。
標的ヌクレオチド配列を含む対象のゲノム領域のコンティグを構築するための方法であって、
ａ）架橋ＤＮＡのサンプルを提供するステップ、
ｂ）架橋ＤＮＡを断片化するステップ、
ｃ）断片化された架橋ＤＮＡを連結させるステップ、
ｄ）架橋を逆行させるステップ、
ｅ）ステップｄ）のＤＮＡを断片化するステップ、
ｆ）標的ヌクレオチド配列を含むステップｅ）の連結ＤＮＡ断片の配列の少なくとも一部分を決定するステップ、及び
ｇ）決定した配列から対象のゲノム領域のコンティグを構築するステップ
を含む方法。
標的ヌクレオチド配列を含む対象のゲノム領域のコンティグを構築するための方法であって、
ａ）架橋ＤＮＡのサンプルを提供するステップ、
ｂ）架橋ＤＮＡを断片化するステップ、
ｃ）断片化された架橋ＤＮＡを連結させるステップ、
ｄ）架橋を逆行させるステップ、
ｅ）少なくとも１つのアダプターとステップｄ）の断片化されたＤＮＡを連結させるステップ、
ｆ）標的ヌクレオチド配列を含むステップｅ）の連結ＤＮＡ断片の配列の少なくとも一部分を決定するステップ、及び
ｇ）決定した配列から対象のゲノム領域のコンティグを構築するステップ
を含む方法。
標的ヌクレオチド配列を含む対象のゲノム領域のコンティグを構築するための方法であって、
ａ）架橋ＤＮＡのサンプルを提供するステップ、
ｂ）架橋ＤＮＡを断片化するステップ、
ｃ）断片化された架橋ＤＮＡを連結させるステップ、
ｄ）架橋を逆行させるステップ、
ｅ）標的ヌクレオチド配列とハイブリダイズする少なくとも１つのプライマーを使用して、標的ヌクレオチド配列を含むステップｄ）の連結ＤＮＡ断片を増幅するステップ、
ｆ）標的ヌクレオチド配列を含むステップｅ）の増幅された連結ＤＮＡ断片の配列の少なくとも一部分を決定するステップ、及び
ｇ）決定した配列から対象のゲノム領域のコンティグを構築するステップ
を含む方法。
標的ヌクレオチド配列を含む対象のゲノム領域のコンティグを構築するための方法であって、
ａ）架橋ＤＮＡのサンプルを提供するステップ、
ｂ）架橋ＤＮＡを断片化するステップ、
ｃ）断片化された架橋ＤＮＡを連結させるステップ、
ｄ）架橋を逆行させるステップ、
ｅ）ステップｄ）のＤＮＡを断片化するステップ、
ｆ）少なくとも１つのアダプターとステップｅ）の断片化されたＤＮＡを連結させるステップ、
ｇ）標的ヌクレオチド配列を含むステップｆ）の連結ＤＮＡ断片の配列の少なくとも一部分を決定するステップ、及び
ｈ）決定した配列から対象のゲノム領域のコンティグを構築するステップ
を含む方法。
標的ヌクレオチド配列を含む対象のゲノム領域のコンティグを構築するための方法であって、
ａ）架橋ＤＮＡのサンプルを提供するステップ、
ｂ）架橋ＤＮＡを断片化するステップ、
ｃ）断片化された架橋ＤＮＡを連結させるステップ、
ｄ）架橋を逆行させるステップ、
ｅ）少なくとも１つのアダプターとステップｄ）の断片化されたＤＮＡを連結させるステップ、
ｆ）標的ヌクレオチド配列とハイブリダイズする少なくとも１つのプライマー、及び少なくとも１つのアダプターとハイブリダイズする少なくとも１つのプライマーを使用してステップｅ）の連結ＤＮＡ断片を増幅するステップ、
ｇ）標的ヌクレオチド配列を含むステップｆ）の増幅された連結ＤＮＡ断片の配列の少なくとも一部分を決定するステップ、及び
ｈ）決定した配列から対象のゲノム領域のコンティグを構築するステップ
を含む方法。
標的ヌクレオチド配列を含む対象のゲノム領域のコンティグを構築するための方法であって、
ａ）架橋ＤＮＡのサンプルを提供するステップ、
ｂ）架橋ＤＮＡを断片化するステップ、
ｃ）断片化された架橋ＤＮＡを連結させるステップ、
ｄ）架橋を逆行させるステップ、
ｅ）ステップｄ）のＤＮＡを断片化するステップ、
ｆ）標的ヌクレオチド配列とハイブリダイズする少なくとも１つのプライマーを使用して、標的ヌクレオチド配列を含むステップｅ）の連結ＤＮＡ断片を増幅するステップ、
ｇ）標的ヌクレオチド配列を含むステップｆ）の増幅された連結ＤＮＡ断片の配列の少なくとも一部分を決定するステップ、及び
ｈ）決定した配列から対象のゲノム領域のコンティグを構築するステップ
を含む方法。
標的ヌクレオチド配列を含む対象のゲノム領域のコンティグを構築するための方法であって、
ａ）架橋ＤＮＡのサンプルを提供するステップ、
ｂ）架橋ＤＮＡを断片化するステップ、
ｃ）断片化された架橋ＤＮＡを連結させるステップ、
ｄ）架橋を逆行させるステップ、
ｅ）ステップｄ）のＤＮＡを断片化するステップ、
ｆ）少なくとも１つのアダプターとステップｅ）の断片化されたＤＮＡを連結させるステップ、
ｇ）標的ヌクレオチド配列とハイブリダイズする少なくとも１つのプライマー、及び少なくとも１つのアダプターとハイブリダイズする少なくとも１つのプライマーを使用してステップｆ）の連結ＤＮＡ断片を増幅するステップ、
ｈ）標的ヌクレオチド配列を含むステップｇ）の増幅された連結ＤＮＡ断片の配列の少なくとも一部分を決定するステップ、及び
ｉ）決定した配列から対象のゲノム領域のコンティグを構築するステップ
を含む方法。
ステップｄ）のＤＮＡを断片化するステップｅ）が、制限酵素でステップｄ）のＤＮＡを断片化することを含む、請求項３、６、８及び９のいずれか一項に記載の方法。
連結ＤＮＡ断片又は増幅された連結ＤＮＡ断片の配列の少なくとも一部分を決定するステップが、ハイスループット配列決定を使用して配列を決定することを含む、請求項２〜１０のいずれか一項に記載の方法。
標的ヌクレオチド配列を含む対象のゲノム領域のコンティグを構築するための方法であって、
ａ）架橋ＤＮＡのサンプルを提供するステップ、
ｂ）架橋ＤＮＡを断片化するステップ、
ｃ）断片化された架橋ＤＮＡを連結させるステップ、
ｄ）架橋を逆行させるステップ、
ｅ）ステップｄ）のＤＮＡを環状化するステップ、
ｆ）ハイスループット配列決定を使用して、標的ヌクレオチドを含む連結ＤＮＡ断片の配列の少なくとも一部分を決定するステップ、及び
ｇ）決定した配列から対象のゲノム領域のコンティグを構築するステップ
を含む方法。
標的ヌクレオチド配列を含む対象のゲノム領域のコンティグを構築するための方法であって、
ａ）架橋ＤＮＡのサンプルを提供するステップ、
ｂ）架橋ＤＮＡを断片化するステップ、
ｃ）断片化された架橋ＤＮＡを連結させるステップ、
ｄ）架橋を逆行させるステップ、
ｅ）ステップｄ）のＤＮＡを断片化するステップ、
ｆ）ステップｅ）のＤＮＡを環状化するステップ、
ｇ）ハイスループット配列決定を使用して、標的ヌクレオチドを含む連結ＤＮＡ断片の配列の少なくとも一部分を決定するステップ、
ｈ）決定した配列から対象のゲノム領域のコンティグを構築するステップ
を含む方法。
標的ヌクレオチド配列を含む対象のゲノム領域のコンティグを構築するための方法であって、
ａ）架橋ＤＮＡのサンプルを提供するステップ、
ｂ）架橋ＤＮＡを断片化するステップ、
ｃ）断片化された架橋ＤＮＡを連結させるステップ、
ｄ）架橋を逆行させるステップ、
ｅ）ステップｄ）のＤＮＡを環状化するステップ、
ｆ）標的ヌクレオチド配列を含む環状化されたＤＮＡを増幅するステップ、
ｇ）ハイスループット配列決定を使用して、標的ヌクレオチドを含む増幅された連結ＤＮＡ断片の配列の少なくとも一部分を決定するステップ、及び
ｈ）決定した配列から対象のゲノム領域のコンティグを構築するステップ
を含む方法。
標的ヌクレオチド配列を含む対象のゲノム領域のコンティグを構築するための方法であって、
ａ）架橋ＤＮＡのサンプルを提供するステップ、
ｂ）架橋ＤＮＡを断片化するステップ、
ｃ）断片化された架橋ＤＮＡを連結させるステップ、
ｄ）架橋を逆行させるステップ、
ｅ）ステップｄ）のＤＮＡを断片化するステップ、
ｆ）ステップｅ）のＤＮＡを環状化するステップ、
ｇ）標的ヌクレオチド配列を含む環状化されたＤＮＡを増幅するステップ、
ｈ）ハイスループット配列決定を使用して、標的ヌクレオチドを含む増幅された連結ＤＮＡ断片の配列の少なくとも一部分を決定するステップ、
ｉ）決定した配列から対象のゲノム領域のコンティグを構築するステップ
を含む方法。
ステップｄ）のＤＮＡを断片化するステップｅ）が、制限酵素でステップｄ）のＤＮＡを断片化することを含む、請求項１３又は１５に記載の方法。
環状化されたＤＮＡを増幅するステップが、標的ヌクレオチド配列とハイブリダイズする少なくとも１つのプライマーを使用して増幅することを含む、請求項１２〜１６のいずれか一項に記載の方法。
対象のゲノム領域が１つ以上の標的ヌクレオチド配列をさらに含み、増幅ステップにおいて、標的ヌクレオチド配列とハイブリダイズするプライマーを提供し、対応する１つ以上の他の標的ヌクレオチド用の１つ以上のプライマーを提供し、プライマーを使用して、連結ＤＮＡ断片を増幅し、又は環状化されたＤＮＡを増幅する、請求項５、７〜１１及び１４〜１７のいずれか一項に記載の方法。
断片化ステップｂ）が超音波処理、次に酵素によるＤＮＡ末端修復を含む、請求項２〜１８のいずれか一項に記載の方法。
断片化ステップｂ）が制限酵素による断片化ステップを含む、請求項２〜１８のいずれか一項に記載の方法。
連結ステップｃ）が、断片間にアダプター配列を連結するアダプターの存在下で実施される、請求項１９又は２０に記載の方法。
ステップｂ）において複数のサブサンプルを処理し、それぞれのサブサンプル用に異なる認識部位を有する制限酵素を使用する、請求項２０又は２１に記載の方法。
請求項１０又は１６に記載の制限酵素でステップｄ）のＤＮＡを断片化するステップを含み、断片化ステップｅ）が、ステップｂ）の制限酵素の認識配列より長い認識配列を有する制限酵素を使用して断片化することを含む、請求項２２に記載の方法。
多重の対象のゲノム領域の配列を決定する、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の方法。
連結ＤＮＡ断片を増幅するステップにおいて、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマー中に識別子が含まれる、請求項５、７〜１１及び１４〜２４のいずれか一項に記載の方法。
標的ヌクレオチド配列を含む連結ＤＮＡ断片又は増幅された連結ＤＮＡ断片を、捕捉用プローブにより捕捉し、標的ヌクレオチド配列を含まない連結ＤＮＡ断片又は増幅された連結ＤＮＡ断片から標的ヌクレオチド配列を含む連結ＤＮＡ断片又は増幅された連結ＤＮＡ断片を分離する、請求項２〜２４のいずれか一項に記載の方法。
連結ＤＮＡ断片を増幅するステップの前又は後にサイズ選択ステップを実施する、請求項５、７〜１１及び１４〜２６のいずれか一項に記載の方法。
ゲル抽出クロマトグラフィー、ゲル電気泳動又は密度勾配遠心分離を使用してサイズ選択ステップを実施する、請求項２７に記載の方法。
２０〜２０，００００塩基対の間、５０〜１０，００００塩基対の間又は１００〜３，０００塩基対の間のサイズのＤＮＡを選択する、請求項２７又は２８に記載の方法。
対象のゲノム領域の細胞における倍数性が１を超える場合、それぞれの倍数性に関して、決定した配列から対象のゲノム領域のコンティグを構築するステップにおいてコンティグを構築する、請求項２〜２９のいずれか一項に記載の方法。
決定した配列から対象のゲノム領域のコンティグを構築するステップが、
１）ステップｂ）の断片を同定するステップ、
２）ゲノム領域に断片を割り当てるステップ、
３）ゲノム領域のコンティグを構築するステップ
を含む、請求項２〜３０のいずれか一項に記載の方法。
ゲノム領域に断片を割り当てるステップ２）が、異なる連結産物を同定するステップ、及び同定した断片に異なる連結産物をカップリングさせるステップを含む、請求項３１に記載の方法。
遺伝子突然変異の有無を同定するための方法であって、請求項２〜３２のいずれか一項に記載の、架橋ＤＮＡのサンプルを提供するステップから、決定した配列から対象のゲノム領域のコンティグを構築するステップまでのステップを含み、複数のサンプルのコンティグを構築し、以下のさらなるステップ：
ｊ）複数のサンプルのコンティグをアラインメントするステップ、
ｋ）複数のサンプル由来の対象のゲノム領域における遺伝子突然変異の有無を同定するステップ、
を含む方法。
遺伝子突然変異の有無を同定するための方法であって、請求項２〜３２のいずれか一項に記載の、架橋ＤＮＡのサンプルを提供するステップから、決定した配列から対象のゲノム領域のコンティグを構築するステップまでのステップを含み、以下のさらなるステップ：
ｊ）参照配列とコンティグをアラインメントするステップ、
ｋ）対象のゲノム領域における遺伝子突然変異の有無を同定するステップ、
を含む方法。
遺伝子突然変異の有無を同定するための方法であって、請求項２〜２９のいずれか一項に記載の、架橋ＤＮＡのサンプルを提供するステップから、連結ＤＮＡ断片又は増幅されたＤＮＡ断片の配列の少なくとも一部分を決定するステップまでのステップを含み、以下のさらなるステップ：
ｉ）連結ＤＮＡ断片又は増幅されたＤＮＡ断片の決定した配列と参照配列をアラインメントするステップ、
ｊ）決定した配列における遺伝子突然変異の有無を同定するステップ、
を含む方法。
遺伝子突然変異の有無を同定するための方法であって、請求項２〜２９のいずれか一項に記載の、架橋ＤＮＡのサンプルを提供するステップから、連結ＤＮＡ断片又は増幅されたＤＮＡ断片の配列の少なくとも一部分を決定するステップまでのステップを含み、連結ＤＮＡ断片又は増幅されたＤＮＡ断片の複数のサンプル配列を決定し、以下のさらなるステップ：
ｉ）複数のサンプルの連結ＤＮＡ断片又は増幅されたＤＮＡ断片の決定した配列をアラインメントするステップ、
ｊ）決定した配列における遺伝子突然変異の有無を同定するステップ、
を含む方法。
異種である疑いがある細胞集団から遺伝子突然変異を保有する断片の割合を決定するための方法であって、請求項２〜２９のいずれか一項に記載の、架橋ＤＮＡのサンプルを提供するステップから、連結ＤＮＡ断片又は増幅されたＤＮＡ断片の配列の少なくとも一部分を決定するステップまでのステップを含み、以下のさらなるステップ：
ｉ）ステップｂ）の断片を同定するステップ、
ｊ）断片における遺伝子突然変異の有無を同定するステップ、
ｋ）遺伝子突然変異を保有する断片の数を決定するステップ、
ｌ）遺伝子突然変異を保有していない断片の数を決定するステップ、
ｍ）遺伝子突然変異を保有する断片の割合を計算するステップ、
を含む方法。
異種である疑いがある細胞集団から遺伝子突然変異を有する断片を保有する連結産物の割合を決定するための方法であって、請求項２〜２９のいずれか一項に記載の、架橋ＤＮＡのサンプルを提供するステップから、連結ＤＮＡ断片又は増幅されたＤＮＡ断片の配列の少なくとも一部分を決定するステップまでのステップを含み、以下のさらなるステップ：
ｉ）ステップｂ）の断片を同定するステップ、
ｊ）断片における遺伝子突然変異の有無を同定するステップ、
ｋ）遺伝子突然変異を有する又は有さない断片を保有する連結ＤＮＡ断片を同定するステップ、
ｌ）遺伝子突然変異を有する断片を保有する連結ＤＮＡ断片の数を決定するステップ、
ｍ）遺伝子突然変異を有さない断片を保有する連結産物の数を決定するステップ、
ｎ）遺伝子突然変異を保有する連結産物の割合を計算するステップ、
を含む方法。
ステップｊ）において、参照配列とアラインメントすることによって、及び／又は複数のサンプルの断片配列を比較することによって、遺伝子突然変異の有無を同定する、請求項３７又は３８に記載の方法。
遺伝子突然変異がＳＮＰ、欠失、挿入、逆位及び／又は転座である、請求項３３〜３９のいずれか一項に記載の方法。
欠失及び／又は挿入を有するサンプルからの断片及び／又は連結産物の数を、参照サンプルと比較することによって、欠失及び／又は挿入を同定する、請求項４０に記載の方法。
分析した断片における染色体切断部位の存在に基づいて、欠失、挿入、逆位及び／又は転座を同定する、請求項４１に記載の方法。
ＤＮＡ断片、連結ＤＮＡ断片、及び／又は対象のゲノム領域におけるメチル化ヌクレオチドの有無を決定する、請求項１〜４２のいずれか一項に記載の方法。