JP5955771B2 - 細胞ベースの抗癌組成物ならびに当該物の製造方法および使用方法 - Google Patents

Description

技術分野
本発明は、粘膜組織に由来する抗原を標的とするＴ細胞を含む組成物、このような組成物を製造する方法、ならびに、起源が粘膜組織である転移性癌に対して個体を保護するために、および起源が粘膜組織である転移性癌に罹患している個体を処置するためのそれらを使用する方法に関する。

発明の背景
治療における改良および成功にもかかわらず、癌は、世界中で多数の人々の命を奪い続けている。例えば、結腸直腸癌は、西洋諸国において悪性疾患の３番目に多い死因である。世界中で、毎年、少なくとも５０万の結腸直腸癌の新たな症例があると概算されている。

スクリーニングにおける改良は、早期の癌を有する多数の個体ならびに癌を有さないが、遺伝的に癌を発症しやすく、したがって癌を発症する危険性が高い多数の個体を同定する機会を提供する。さらに、処置における改良のおかげで、癌を除去されたかまたは寛解期の癌を有した多数の人々が存在する。このような人々は、回帰または再発の危険性があり、癌を発症する危険性も高い。

粘膜組織の癌に罹患している個体を処置する改善された方法が必要である。粘膜組織の癌に罹患している個体を処置するために有用な組成物が必要である。粘膜組織の癌を処置された個体における粘膜組織の癌の再発を予防する改善された方法が必要である。粘膜組織の癌を処置された個体における粘膜組織の癌の再発を予防するために有用な組成物が必要である。個体、特に粘膜組織の癌に対する遺伝的素因を有すると同定された個体における粘膜組織の癌を予防する改善された方法が必要である。個体における粘膜組織の癌を予防するために有用な組成物が必要である。個体における粘膜組織の癌を処置および予防するために有用な組成物を同定する改善された方法が必要である。

発明の概要
粘膜限定抗原(mucosally restricted antigen)の少なくとも１つのエピトープを認識する単離された複数のＴ細胞を提供する。

粘膜限定抗原の少なくとも１つのエピトープを認識する単離された複数のＴ細胞および薬学的に許容される担体または希釈剤を含む医薬組成物も提供する。

粘膜限定抗原の少なくとも１つのエピトープを認識する複数のＴ細胞を製造する方法を提供する。いくつかの方法は、粘膜限定抗原の少なくとも１つのエピトープを認識する少なくとも１つのＴ細胞を含む細胞ドナーからサンプルを単離すること；粘膜限定抗原の少なくとも１つのエピトープを認識するＴ細胞を同定すること；および該Ｔ細胞を、その複製を促進する条件下で粘膜限定抗原の少なくとも１つのエピトープを認識する複数のＴ細胞を生産するために十分な期間培養することを含む。他の方法は、少なくとも１つのＴ細胞を含む細胞ドナーからサンプルを単離すること；該Ｔ細胞を、粘膜限定抗原の少なくとも１つのエピトープを認識するＴ細胞受容体、または粘膜限定抗原の少なくとも１つのエピトープに結合する抗体の少なくとも機能性フラグメントを含む癌粘膜抗原結合性膜結合型融合タンパク質のいずれかをコードする核酸配列で形質転換すること、ここに、発現時に、該融合タンパク質は膜結合型タンパク質である；および該形質転換されたＴ細胞を、その複製を促進する条件下で粘膜限定抗原の少なくとも１つのエピトープを認識する複数のＴ細胞を生産するために十分な期間培養することを含む。

粘膜限定抗原の少なくとも１つのエピトープを認識する複数のＴ細胞の有効量を個体に投与する工程を含む、粘膜組織の癌と診断された個体を処置する方法を提供する。

粘膜限定抗原の少なくとも１つのエピトープを認識する複数のＴ細胞の有効量を個体に投与する工程を含む、粘膜組織の癌を発症する危険性が高いと同定された個体における粘膜組織の癌を予防する方法も提供する。

加えて、粘膜限定抗原の少なくとも１つのエピトープを認識するＴ細胞受容体タンパク質、または粘膜限定抗原の少なくとも１つのエピトープに結合する抗体の少なくとも機能性フラグメントおよびヌクレオチド配列が細胞内で発現されるときに、融合タンパク質を膜結合型タンパク質にする部分に対するコード配列を含む癌粘膜抗原結合性膜結合型融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を提供する。

このような核酸分子を含むＴ細胞も提供される。

発明の詳細な説明
定義
本明細書において使用される「粘膜組織」は、鼻、口、肺および消化管を含む体中のいくつかの臓器および体腔を裏打ちする湿潤組織である粘膜の組織を示す。粘膜組織は、限定はしないが、口、例えば、頬、舌下および口腔粘膜組織；鼻、例えば、嗅粘膜組織；肺；消化管、例えば、食道、胃、十二指腸、小腸および大腸、結腸、直腸および肛門；ならびに泌尿生殖器、例えば、膀胱、尿道、膣の一部、陰茎および子宮の一部を含む体のいくつかの様々な一部において見ることができる。粘膜組織は、また、乳房、腎臓および眼の一部として見出される。

本明細書において使用される「粘膜組織の癌になりやすいと疑われる個体」は、粘膜組織の癌を発症する平均より高い危険性がある個体を示すことを意図する。粘膜組織の癌を発症する特定の危険性がある個体の例は、その家族の病歴が家族のメンバー中の粘膜組織の癌の平均より高い発生率を示す個体、および／または、存在が粘膜癌の高い発生率と相関性がある遺伝子マーカーを有する個体、および／または、以前に粘膜組織の癌を発症しており、処置されており、したがって疾患の進行、回帰もしくは再発の危険性を抱える個体である。粘膜組織の癌を発症する平均より高い危険性の一因となり得、それにより粘膜組織の癌になりやすいと疑われる個体に分類される因子は、個体の特定の遺伝的、医薬的および／または行動的背景および特性に基づき得る。

本明細書において使用される「粘膜限定抗原」は、正常非粘膜細胞では発現されないが、正常粘膜細胞において発現される抗原を示すことを意図する。粘膜限定抗原の例は、グアニル酸シクラーゼＣ、ＣＤＸ−１、ＣＤＸ−２、スクラーゼイソマルターゼ、マンマグロビン、小乳房上皮性ムチン、腸特異的ホメオボックス、ＲＥＬＭベータ（ＦＩＺＺ２）、ビリン、Ａ３３、ラクターゼ（ラクターゼ−フロリジンヒドロラーゼ）、Ｈ（＋）／ペプチド共輸送体１（ＰＥＰＴ１、ＳＬＣ１５Ａ１）、インテクチン(Intectin)、炭酸脱水酵素、マンマグロビン、Ｂ７２６Ｐ、小乳房上皮性ムチン（ＳＢＥＭ）、ＬＵＮＸおよびＴＳＣ４０３を含む。

本明細書において使用される「粘膜限定抗原の少なくとも１つのエピトープを認識する単離された複数のＴ細胞」なる用語は、それぞれ粘膜限定抗原の少なくとも１つのエピトープに対して反応性である生体外に維持された少なくとも１×１０^６個のＴ細胞の集団を示す。いくつかの態様において、単離された複数のＴ細胞は、生体外に維持された少なくとも１×１０^７個のこのようなＴ細胞の集団を含む。いくつかの態様において、単離された複数のＴ細胞は、生体外に維持された少なくとも１×１０^８個のこのようなＴ細胞の集団を含む。いくつかの態様において、単離された複数のＴ細胞は、生体外に維持された少なくとも１×１０^９個のこのようなＴ細胞の集団を含む。いくつかの態様において、単離された複数のＴ細胞は、生体外に維持された少なくとも１×１０^１０個のこのようなＴ細胞の集団を含む。いくつかの態様において、単離された複数のＴ細胞は、生体外に維持された少なくとも１×１０^１１個のこのようなＴ細胞の集団を含む。集団は、複数の容器または単一の容器内に維持され得る。

本明細書において使用される「粘膜限定抗原の少なくとも１つのエピトープ」なる用語は、全長粘膜限定抗原またはそのフラグメントを含む粘膜限定抗原と免疫学的に交差反応性である分子を示すことを意図する。

本明細書において使用される「ＣＭＡ結合性膜結合型融合タンパク質」なる用語は、粘膜限定抗原の少なくとも１つのエピトープを認識する抗体の少なくとも機能性フラグメント、およびＴ細胞において発現されたとき、タンパク質を膜結合型タンパク質にする部分を含むタンパク質を示す。

本明細書において使用される「ＣＤ４＋ヘルパーエピトープ」は、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラス２ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）と複合体を形成し、ＣＤ４＋Ｔ細胞上のＴ細胞受容体により認識されるペプチド配列である。ペプチド、例えば、ＣＤ４＋ヘルパーエピトープは、ＭＨＣと複合体を形成し、該複合体は特定のＴ細胞受容体により認識され得る。ＭＨＣ／ペプチド複合体とＴ細胞受容体間の相互作用は、ＭＨＣを発現する細胞とＴ細胞受容体を発現するＴ細胞間のシグナルをもたらす。ＭＨＣクラスＩＩの場合、ペプチドおよびＭＨＣクラスＩＩ複合体により形成される複合体は、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞のＴ細胞受容体と相互作用する。したがって、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞のＴ細胞受容体により複合体として認識され得るＭＨＣクラスＩＩ分子との複合体を形成することができるペプチドは、ＣＤ４＋ヘルパーエピトープである。

本明細書において使用される「分泌シグナル」および「分泌ペプチド」および「シグナルペプチド」は、互換的に使用され、存在するとき、細胞の外部にタンパク質の輸送および分泌をもたらすタンパク質のアミノ酸配列を示すことを意味する。分泌シグナルは、一般的に、前駆体タンパク質のＮ末端または該Ｎ末端付近で開裂可能な前駆体タンパク質の疎水性セグメントである。分泌プロセスにおいて、このような分泌シグナルは、酵素的に除去され、タンパク質の成熟形態、すなわち分泌シグナルを欠いているタンパク質の形態の分泌をもたらす。いくつかの態様において、分泌シグナルは、粘膜限定抗原に由来する。いくつかの態様において、分泌シグナルは、別の供給源に由来する。分泌シグナルの例は、粘膜限定抗原上に存在するものまたは他の供給源に由来するものを含む。前者の場合、シグナル配列を含む粘膜限定抗原のコード配列は、そのままで使用される。後者の場合、シグナル配列をコードするヌクレオチド配列は、粘膜限定抗原のコード配列に連結される。このような場合において、シグナル配列は、遺伝的構築物が投与される個体の細胞中で機能性であるあらゆる配列であり得る。

概観
米国仮シリアル番号６１／０９９，３９８（これは、出典明示により本明細書に包含させる）は、癌粘膜抗原（ＣＭＡ）と称される粘膜（気道消化器、泌尿生殖器、乳房、その他）から生じる腫瘍に対するワクチン標的の１つのクラスを標的化するワクチンを記載している。２００４年７月２２日に公開された米国公開特許出願第２００４０１４１９９０号（これは、出典明示により本明細書に包含させる）は、転移性結腸直腸癌に対するワクチンを記載している。米国公開特許出願第２００１００３９０１７、２００１００３６６３５、２００１００２９０２０および２００１００２９０１９号（これらは、それぞれ出典明示により本明細書に包含させる）は、それぞれ、消化管起源の癌細胞を標的化するワクチンを記載している。

本明細書において粘膜限定抗原とも称されるＣＭＡは、通常、粘膜区画のみにおいて発現され、これらの発現は、粘膜細胞が悪性形質転換を受け、癌細胞になった後に存続する。さらに、これらの抗原は、これらの腫瘍細胞が転移した後に発現され続ける。免疫治療標的としてこれらの抗原を使用することにおいていくつかの利点がある。通常、これらの抗原に対して未感作の全身的区画において部分的にのみ耐性であり得、抗転移腫瘍の有効性を提供する全身的処置を可能にする。さらに、粘膜炎症および自己免疫の回避を提供し得る交差区画免疫応答の欠如が存在する。

粘膜限定抗原の少なくとも１つのエピトープ、例えば、全長粘膜限定抗原またはそのフラグメントを含むタンパク質は、粘膜組織の癌の粘膜限定抗原と免疫原性的に交差反応性である。

いくつかの癌患者の免疫化は、年齢、疾患および集団中の遺伝的多型と関連した免疫における変化を不十分であることが反映して、および自己タンパク質に対する免疫応答の産生の制限により、観察されている。Ｔ細胞免疫応答を生産するために患者を免疫する代わりに、大量の特定のＴ細胞が患者に投与され得る。

Ｔ細胞が粘膜限定抗原を発現する粘膜癌細胞に結合し、それにより癌細胞と、または癌細胞に対して免疫学的に反応するように、粘膜限定抗原の少なくとも１つのエピトープを認識するＴ細胞を提供する。粘膜限定抗原の少なくとも１つのエピトープを認識する複数のＴ細胞を製造する何らかの特定の方法に限定されることは望まないが、３つの方法が本明細書において提供される。粘膜限定抗原の少なくとも１つのエピトープを認識する複数のＴ細胞を得るための第１の方法は、粘膜限定抗原の少なくとも１つのエピトープを認識するＴ細胞を単離し、培養技術を使用して、Ｔ細胞の数を指数関数的に増大させ、複数のこのような細胞を生産する方法である。粘膜限定抗原の少なくとも１つのエピトープを認識する複数のＴ細胞を得るための第２の方法は、個体からＴ細胞を単離し、それを粘膜限定抗原の少なくとも１つのエピトープを認識するＴ細胞受容体をコードする核酸分子で形質転換し、培養技術を使用して、形質転換されたＴ細胞の数を指数関数的に増殖させ、複数のこのような細胞を生産する方法である。粘膜限定抗原の少なくとも１つのエピトープを認識する複数のＴ細胞を得るための第３の方法は、個体からＴ細胞を単離し、それを粘膜限定抗原の少なくとも１つのエピトープに結合する抗体の機能性フラグメントおよび細胞、例えばＴ細胞において発現するとき、タンパク質を膜結合型タンパク質にする部分を含む融合タンパク質をコードする核酸分子で形質転換する方法である。

これらのＴ細胞は、粘膜限定抗原を発現する細胞を含む粘膜組織の癌に対する治療および予防に使用される。

出発物質としての抗ＣＭＡ Ｔ細胞
粘膜限定抗原の少なくとも１つのエピトープを認識するＴ細胞のクローン性増殖は、細胞ドナーからこのようなＴ細胞を単離すること、および、培養技術を使用して、細胞分裂を促進する条件下で維持することにより細胞の数を指数関数的に増大させることを含む。

細胞ドナーは、増殖された細胞の集団が投与される個体、すなわち自己細胞ドナーであり得る。あるいは、Ｔ細胞は、Ｔ細胞が投与される個体と異なる個体である細胞ドナーから得ることができる（すなわち同種Ｔ細胞）。同種Ｔ細胞が使用される場合、ドナーは、型が合うこと、すなわちレシピエントと同じ、またはほぼ同じ白血球抗原のセットを発現すると同定されることが好ましい。

Ｔ細胞は、細胞ドナーから、日常的な方法により、例えば、血液分画、特に末梢血単球細胞成分、または骨髄サンプルからの単離により得ることができる。

Ｔ細胞が細胞ドナーから得られると、標準技術を使用して、粘膜限定抗原の少なくとも１つのエピトープを認識するＴ細胞を同定し、サンプルから単離してもよい。粘膜限定抗原の少なくとも１つのエピトープを含むタンパク質を、固体支持体に付着させ、サンプルと接触させてもよい。次に、洗浄後に表面上に残るＴ細胞をさらに試験し、粘膜限定抗原の少なくとも１つのエピトープを認識するＴ細胞を同定する。アフィニティー単離方法、例えば、カラム、細胞に結合する標識化されたタンパク質、細胞分別機技術も、種々に使用され得る。粘膜限定抗原の少なくとも１つのエピトープを認識するＴ細胞は、また、それらの反応性により、粘膜限定抗原の少なくとも１つのエピトープを有するタンパク質の存在下で同定され得る。

Ｔ細胞が粘膜限定抗原の少なくとも１つのエピトープを認識するＴ細胞と同定されると、それは、細胞増殖および分裂を促進および維持する条件で組織培養技術を使用してクローン的に増殖させ、指数関数的な数の同一の細胞を生産してもよい。増殖されたＴ細胞集団は、患者への投与のために回収され得る。

いくつかの態様において、細胞ドナーは、Ｔ細胞免疫応答を含む粘膜限定抗原の少なくとも１つのエピトープに対する免疫応答を誘導するために、Ｔ細胞を含むサンプルの除去の前にワクチンを接種される。いくつかの態様において、粘膜限定抗原の少なくとも１つのエピトープを認識するＴ細胞を同定し、単離すること、このような細胞の数を増大するために細胞を培養すること、および複数のこのような細胞を、ワクチンを接種された細胞ドナーと同じ個体（自己処理）またはワクチンを接種された細胞ドナーと異なる個体（同種処理）であり得るレシピエントに投与することを含む処置の一部として、細胞ドナーは、Ｔ細胞免疫応答を含む粘膜限定抗原の少なくとも１つのエピトープに対する免疫応答を誘導するために、Ｔ細胞を含むサンプルの除去の前にワクチンを接種される。

粘膜限定抗原の少なくとも１つのエピトープを認識するＴ細胞受容体を含むＴ細胞を誘導するために使用され得るワクチンおよびワクチン接種の例は、本明細書に記載されているものならびに本明細書において出典明示により包含されている特許および公開された特許出願に記載されているものを含む。

抗ＣＭＡＴ細胞受容体で形質転換されたＴ細胞
粘膜限定抗原の少なくとも１つのエピトープを認識する複数のＴ細胞は、細胞ドナーからＴ細胞を単離すること、それを粘膜限定抗原の少なくとも１つのエピトープを認識するＴ細胞受容体をコードする核酸分子で形質転換すること、および、該形質転換された細胞を培養して、形質転換されたＴ細胞の数を指数関数的に増大させ、このような複数の細胞を生産することにより得ることができる。

細胞ドナーは、増殖された細胞の集団が投与される個体、すなわち自己細胞ドナーであり得る。あるいは、Ｔ細胞は、Ｔ細胞が投与される個体と異なる個体である細胞ドナーから得ることができる（すなわち同種Ｔ細胞）。同種Ｔ細胞が使用される場合、細胞ドナーは、型が合うこと、すなわちレシピエントと同じ、またはほぼ同じ白血球抗原のセットを発現すると同定されることが好ましい。

Ｔ細胞は、細胞ドナーから、日常的な方法により、例えば、血液分画、特に末梢血単球細胞成分、または骨髄サンプルからの単離により得ることができる。

Ｔ細胞が細胞ドナーから得られると、１つ以上のＴ細胞は、粘膜限定抗原の少なくとも１つのエピトープを認識するＴ細胞受容体をコードする核酸で形質転換され得る。

粘膜限定抗原の少なくとも１つのエピトープを認識するＴ細胞受容体をコードする核酸分子は、粘膜限定抗原の少なくとも１つのエピトープを認識するＴ細胞受容体を発現するＴ細胞を有する「ＴＣＲ遺伝子ドナー」から粘膜限定抗原の少なくとも１つのエピトープを認識するＴ細胞を単離することにより得ることができる。このようなＴＣＲ遺伝子ドナーは、ワクチン接種以外の免疫原への暴露から生じる免疫応答のため、粘膜限定抗原の少なくとも１つのエピトープを認識するＴ細胞を有し得、または、このようなＴＣＲ遺伝子ドナーは、粘膜限定抗原の少なくとも１つのエピトープを認識するＴ細胞の生産を誘導するワクチンを受けたもの、すなわちワクチンを接種されたＴＣＲ遺伝子ドナーと同定され得る。ワクチンを接種されたＴＣＲ遺伝子ドナーは、以前にワクチンを接種されていてもよく、または特に、Ｔ細胞を粘膜限定抗原の少なくとも１つのエピトープを認識するＴ細胞受容体をコードする核酸分子で形質転換すること、細胞数を増大すること、および増大された形質転換されたＴ細胞の集団を個体に投与することを含む方法における使用のために、粘膜限定抗原の少なくとも１つのエピトープを認識するこのようなＴ細胞を産生する目的の一環として、ワクチンを投与してもよい。

ＴＣＲ遺伝子ドナーは、形質転換されたＴ細胞のレシピエントである個体または形質転換されたＴ細胞のレシピエントである個体と異なる個体であり得る。ＴＣＲ遺伝子ドナーは、細胞ドナーと同じ個体であり得、またはＴＣＲ遺伝子ドナーは、細胞ドナーと異なる個体であり得る。いくつかの態様において、細胞ドナーは、形質転換されたＴ細胞のレシピエントであり、ＴＣＲ遺伝子ドナーは、異なる個体である。いくつかの態様において、細胞ドナーは、ＴＣＲ遺伝子ドナーと同じ個体であり、形質転換されたＴ細胞のレシピエントと異なる個体である。いくつかの態様において、細胞ドナーは、ＴＣＲ遺伝子ドナーと同じ個体および形質転換されたＴ細胞のレシピエントと同じ個体である。

粘膜限定抗原の少なくとも１つのエピトープを認識するＴ細胞受容体を含むＴ細胞を誘導するために使用され得るワクチンの例は、本明細書に記載されているものならびに本明細書において出典明示により包含されている特許および公開された特許出願に記載されているものを含む。

粘膜限定抗原の少なくとも１つのエピトープを認識するＴ細胞受容体をコードする核酸分子、すなわちＴＣＲコード配列は、ＤＮＡまたはＲＮＡ分子であり得る。核酸分子は、ドナーＴ細胞におけるＴＣＲコード配列の発現のために必要な調節因子に作動可能に連結され得る。いくつかの態様において、ＴＣＲコード配列を含む核酸分子は、プラスミドＤＮＡ分子である。いくつかの態様において、ＴＣＲコード配列を含む核酸分子は、発現ベクターであるプラスミドＤＮＡ分子であって、該ＴＣＲコード配列は、ドナーＴ細胞におけるＴＣＲコード配列の発現のために必要であるプラスミド中の調節因子に作動可能に連結されているＤＮＡ分子である。いくつかの態様において、ＴＣＲコード配列を含む核酸分子は、ドナーＴ細胞に感染させるために使用されるウイルス粒子に組み込まれ得る。このような粒子を製造するためのパッケージング技術は知られている。粒子に組み込まれたＴＣＲコード配列は、ドナーＴ細胞におけるＴＣＲコード配列の発現のために必要であるプラスミド中の調節因子に作動可能に連結され得る。いくつかの態様において、ＴＣＲコード配列を含む核酸分子は、ウイルスゲノムに組み込まれる。いくつかの態様において、ウイルスゲノムは、ドナーＴ細胞に感染させるために使用されるウイルス粒子に組み込まれる。核酸分子を細胞に送達するためのウイルスベクターは、よく知られており、例えば、ワクチンウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ポックスウイルスならびに種々のレトロウイルスに基づくウイルスベクターを含む。ウイルスゲノムに組み込まれたＴＣＲコード配列は、ドナーＴ細胞におけるコード配列の発現のために必要であるプラスミド中の調節因子に作動可能に連結され得る。

形質転換されたＴ細胞における核酸の発現時に、該形質転換された細胞は、粘膜限定抗原の少なくとも１つのエピトープを認識するＴ細胞を同定するために試験され得る。このような形質転換されたＴ細胞は、標準技術を使用して、同定し、サンプルから単離してもよい。粘膜限定抗原の少なくとも１つのエピトープを含むタンパク質を、固体支持体に付着させ、サンプルと接触させてもよい。次に、洗浄後に表面上に残るＴ細胞をさらに試験し、粘膜限定抗原の少なくとも１つのエピトープを認識するＴ細胞を同定する。アフィニティー単離方法、例えば、カラム、細胞に結合する標識化されたタンパク質、細胞分別機技術も、種々に使用され得る。粘膜限定抗原の少なくとも１つのエピトープを認識するＴ細胞は、また、それらの反応性により、粘膜限定抗原の少なくとも１つのエピトープを有するタンパク質の存在下で同定され得る。

Ｔ細胞が粘膜限定抗原の少なくとも１つのエピトープを認識するＴ細胞と同定されると、それは、細胞増殖および分裂を促進および維持する条件で組織培養技術を使用してクローン的に増殖させ、指数関数的な数の同一の細胞を生産してもよい。増殖されたＴ細胞の集団は、患者への投与のために回収され得る。

抗ＣＭＡ膜結合型融合タンパク質で形質転換されたＴ細胞
粘膜限定抗原の少なくとも１つのエピトープを認識する複数のＴ細胞は、細胞ドナーからＴ細胞を単離すること、それを、粘膜限定抗原の少なくとも１つのエピトープに結合する抗体の機能性結合フラグメントおよび細胞、例えば、Ｔ細胞において発現するとき、タンパク質を膜結合型タンパク質にする部分を含むＣＭＡ結合性膜結合型融合タンパク質をコードする核酸分子で形質転換すること、および、該形質転換された細胞を培養して、形質転換されたＴ細胞の数を指数関数的に増大させ、このような複数の細胞を生産することにより得ることができる。

細胞ドナーは、増殖された細胞の集団が投与される個体、すなわち自己細胞ドナーであり得る。あるいは、Ｔ細胞は、Ｔ細胞が投与される個体と異なる個体である細胞ドナーから得ることができる（すなわち同種Ｔ細胞）。同種Ｔ細胞が使用される場合、ドナーは、型が合うこと、すなわち、レシピエントと同じ、またはほぼ同じ白血球抗原のセットを発現すると同定されることが好ましい。

Ｔ細胞は、細胞ドナーから、日常的な方法により、例えば、血液分画、特に末梢血単球細胞成分、または骨髄サンプルからの単離により得ることができる。

Ｔ細胞が細胞ドナーから得られると、１つ以上のＴ細胞は、粘膜限定抗原の少なくとも１つのエピトープに結合する抗体の機能性結合フラグメントおよび細胞、例えば、Ｔ細胞において発現するとき、タンパク質を膜結合型タンパク質にする部分を含むＣＭＡ結合性膜結合型融合タンパク質をコードする核酸で形質転換され得る。

ＣＭＡ結合性膜結合型融合タンパク質をコードする核酸分子は、粘膜限定抗原の少なくとも１つのエピトープを認識する抗体を生産するＢ細胞を有する「抗体遺伝子ドナー」から粘膜限定抗原の少なくとも１つのエピトープを認識する抗体を生産するＢ細胞を単離することにより得ることができる。このような抗体遺伝子ドナーは、ワクチン接種以外の免疫原への暴露から生じる免疫応答のため、粘膜限定抗原の少なくとも１つのエピトープを認識するＢ細胞を有し得、または、このような抗体遺伝子ドナーは、粘膜限定抗原の少なくとも１つのエピトープを認識する抗体を生産するＢ細胞の生産を誘導するワクチンを受けたもの、すなわちワクチンを接種された抗体遺伝的ドナーと同定され得る。ワクチンを接種された抗体遺伝的ドナーは、以前にワクチンを接種されていてもよく、または特に、Ｔ細胞をＣＭＡ結合性膜結合型融合タンパク質をコードする核酸分子で形質転換すること、細胞数を増大すること、および増大された形質転換されたＴ細胞の集団を個体に投与することを含む方法における使用のために、粘膜限定抗原の少なくとも１つのエピトープを認識する抗体を生産するこのようなＢ細胞を産生する目的の一環として、ワクチンを投与してもよい。

抗体遺伝子ドナーは、形質転換されたＴ細胞のレシピエントである個体または形質転換されたＴ細胞のレシピエントである個体と異なる個体であり得る。抗体遺伝子ドナーは、細胞ドナーと同じ個体であり得、または抗体遺伝子ドナーは、細胞ドナーと異なる個体であり得る。いくつかの態様において、細胞ドナーは、形質転換されたＴ細胞のレシピエントであり、抗体遺伝子ドナーは、異なる個体である。いくつかの態様において、細胞ドナーは、抗体遺伝子ドナーと同じ個体であり、形質転換されたＴ細胞のレシピエントと異なる個体である。いくつかの態様において、細胞ドナーは、抗体遺伝子ドナーと同じ個体および形質転換されたＴ細胞のレシピエントと同じ個体である。

粘膜限定抗原の少なくとも１つのエピトープを認識する抗体を生産するＢ細胞を誘導するために使用され得るワクチンの例は、本明細書に記載されているものならびに本明細書において出典明示により包含されている特許および公開された特許出願に記載されているものを含む。

ＣＭＡ結合性膜結合型融合タンパク質をコードする核酸分子は、膜結合型タンパク質である発現されたタンパク質を提供するタンパク質配列に連結した、粘膜限定抗原の少なくとも１つのエピトープを認識する抗体の機能性結合フラグメントをコードするコード配列を含む。コード配列は、発現される単一の生産物をコードするように連結される。

粘膜限定抗原の少なくとも１つのエピトープを認識する抗体の機能性結合フラグメントをコードするコード配列は、抗体遺伝子ドナー由来のＢ細胞から単離され得る。このようなＢ細胞は得ることができ、遺伝情報は単離することができる。いくつかの態様において、Ｂ細胞は、抗体を発現し、したがって抗体コード配列を有するハイブリッド細胞を産生するために使用される。抗体コード配列は、ＣＭＡ結合性膜結合型融合タンパク質を製造するために、決定され、クローニングされ、使用され得る。粘膜限定抗原の少なくとも１つのエピトープを認識する抗体の機能性フラグメントは、形質転換されたＴ細胞において発現されるとき、粘膜限定抗原の少なくとも１つのエピトープに対する結合活性を保持するいくつか、または全ての抗体タンパク質を含み得る。

膜結合型タンパク質であるように発現されたタンパク質を提供するタンパク質配列のコード配列は、膜結合型細胞タンパク質に由来し、膜貫通ドメイン、ならびに所望により少なくとも細胞質ドメインの一部、および／または細胞外ドメインの一部、ならびに発現されたタンパク質を細胞膜へ移行するためのシグナル配列を含む。

粘膜限定抗原の少なくとも１つのエピトープを認識するＣＭＡ結合性膜結合型融合タンパク質をコードする核酸分子、すなわちＣＭＡ結合性膜結合型コード配列は、ＤＮＡまたはＲＮＡ分子であり得る。核酸分子は、ドナーＴ細胞におけるコード配列の発現のために必要な調節因子に作動可能に連結され得る。いくつかの態様において、ＣＭＡ結合性膜結合型コード配列を含む核酸分子は、プラスミドＤＮＡ分子である。いくつかの態様において、ＣＭＡ結合性膜結合型コード配列を含む核酸分子は、発現ベクターであるプラスミドＤＮＡ分子であって、該コード配列は、ドナーＴ細胞におけるＣＭＡ結合性膜結合型コード配列の発現のために必要であるプラスミド中の調節因子に作動可能に連結されているＤＮＡ分子である。いくつかの態様において、ＣＭＡ結合性膜結合型コード配列を含む核酸分子は、ドナーＴ細胞に感染させるために使用されるウイルス粒子に組み込まれ得る。このような粒子を製造するためのパッケージング技術は知られている。粒子に組み込まれたコード配列は、ドナーＴ細胞におけるＣＭＡ結合性膜結合型コード配列の発現のために必要であるプラスミド中の調節因子に作動可能に連結され得る。いくつかの態様において、ＣＭＡ結合性膜結合型コード配列を含む核酸分子は、ウイルスゲノムに組み込まれる。いくつかの態様において、ウイルスゲノムは、ドナーＴ細胞に感染させるために使用されるウイルス粒子に組み込まれる。核酸分子を細胞に送達するためのウイルスベクターは、よく知られており、例えば、ワクチンウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ポックスウイルスならびに種々のレトロウイルスに基づくウイルスベクターを含む。ウイルスゲノムに組み込まれたＣＭＡ結合性膜結合型コード配列は、ドナーＴ細胞におけるＣＭＡ結合性膜結合型コード配列の発現のために必要であるプラスミド中の調節因子に作動可能に連結され得る。

形質転換された細胞における核酸の発現時に、該形質転換された細胞は、粘膜限定抗原の少なくとも１つのエピトープを認識するＴ細胞を同定するために試験され得る。このような形質転換された細胞は、標準技術を使用して、同定し、サンプルから単離してもよい。粘膜限定抗原の少なくとも１つのエピトープを含むタンパク質を、固体支持体に付着させ、サンプルと接触させてもよい。次に、洗浄後に表面上に残るＴ細胞をさらに試験し、粘膜限定抗原の少なくとも１つのエピトープを認識するＴ細胞を同定する。アフィニティー単離方法、例えば、カラム、細胞に結合する標識化されたタンパク質、細胞分別機技術も、種々に使用され得る。粘膜限定抗原の少なくとも１つのエピトープを認識するＴ細胞は、また、それらの反応性により粘膜限定抗原の少なくとも１つのエピトープを有するタンパク質の存在下で同定され得る。

Ｔ細胞が粘膜限定抗原の少なくとも１つのエピトープを認識するＴ細胞と同定されると、それは、細胞増殖および分裂を促進および維持する条件で組織培養技術を使用してクローン的に増殖させ、指数関数的な数の同一の細胞を生産してもよい。増殖されたＴ細胞の集団は、患者への投与のために回収され得る。

ワクチン
ワクチンは、粘膜限定抗原の１つ以上のエピトープに対する免疫応答を誘導するため、およびＣＭＡ結合性膜結合型融合タンパク質を製造するために有用なＴＣＲ遺伝子ドナーおよび／またはＢ細胞のドナーを生産するために使用され得る。ＣＤ４＋ヘルパーエピトープは、広範囲にわたる免疫応答を誘導するために提供される。ワクチンの例は、限定はしないが、以下のワクチン技術を含む。
１）感染性ベクター介在ワクチン、例えば、組換えアデノウイルス、ワクシニア、ポックスウイルス、ＡＡＶ、サルモネラおよびＢＣＧであって、該ベクターは、感染性ベクターが個体に投与されるとき、キメラタンパク質が発現され、広範囲にわたる免疫応答を誘導するような、粘膜限定抗原の少なくとも１つのエピトープ、ＣＤ４＋ヘルパーエピトープ、および所望により、分泌シグナルを含み、そして粘膜限定抗原を標的化するキメラタンパク質をコードする遺伝情報を有する；
２）ＤＮＡワクチン、すなわちワクチンであって、該ＤＮＡは、感染性ベクターが個体に投与されるとき、キメラタンパク質が発現され、広範囲にわたる免疫応答を誘導するような、粘膜限定抗原の少なくとも１つのエピトープ、ＣＤ４＋ヘルパーエピトープ、および所望により、分泌シグナルを含み、そして粘膜限定抗原を標的化するキメラタンパク質をコードする；
３）死滅または不活化ワクチンであって、該ワクチンは、ａ）粘膜限定抗原の少なくとも１つのエピトープおよびＣＤ４＋ヘルパーエピトープを含むキメラタンパク質を示す死滅細胞または不活化ウイルス粒子のいずれかを含み、そしてｂ）個体に投与されるとき、粘膜限定抗原を標的化する免疫応答を誘導する；
４）ハプテン化された死滅または不活化ワクチンであって、該ワクチンは、ａ）粘膜限定抗原の少なくとも１つのエピトープおよびＣＤ４＋ヘルパーエピトープを含むキメラタンパク質を示す死滅細胞または不活化ウイルス粒子のいずれかを含み、ｂ）さらなる免疫原性となるようにハプテン化され、そしてｃ）個体に投与されるとき、粘膜限定抗原を標的化する免疫応答を誘導する；
５）サブユニットワクチンであって、該ワクチンは、粘膜限定抗原の少なくとも１つのエピトープおよびＣＤ４＋ヘルパーエピトープを含むキメラタンパク質を含む；ならびに
６）ハプテン化されたサブユニットワクチンであって、該ワクチンは、ａ）粘膜限定抗原の少なくとも１つのエピトープおよびＣＤ４＋ヘルパーエピトープを含むキメラタンパク質を含み、そしてｂ）さらなる免疫原性となるようにハプテン化される。

粘膜限定タンパク質
粘膜限定タンパク質は、一般的に、粘膜の外側で発現されない。したがって、粘膜限定タンパク質は、粘膜の外側で存在するとき、免疫系の種々の成分の少なくともいくつかに対して免疫原性であるため、粘膜限定タンパク質を標的とする全身免疫応答が産生され得る。すなわち、それは免疫系が免疫応答を引き起こすことができない自己タンパク質ではない。一般的に、粘膜限定タンパク質は、正常粘膜ならびに粘膜細胞起源の癌細胞、またはそうでなければ粘膜細胞由来の癌細胞で発現される細胞タンパク質である。したがって、粘膜限定タンパク質に対する免疫応答は、粘膜限定タンパク質を発現する粘膜の外側の細胞、例えば、転移性癌細胞を認識し、攻撃する。一般的に、ＣＤ４＋免疫応答は、粘膜限定タンパク質が粘膜の外側の組織または体液に導入されているとき、存在しないか、または有意に減少している。

粘膜限定タンパク質のいくつかの例は、限定はしないが、通常、結腸直腸特異的タンパク質、例えば、グアニル酸シクラーゼＣ、ＣＤＸ−１、ＣＤＸ−２、スクラーゼイソマルターゼ、ＲＥＬＭベータ（ＦＩＺＺ２）(Holcomb IN, Kabakoff RC, Chan B, Baker TW, Gurney A, Henzel W, Nelson C, Lowman HB, Wright BD, Skelton NJ, Frantz GD, Tumas DB, Peale FV, Jr., Shelton DL, Hebert CC. FIZZ1, a novel cysteine-rich secreted protein associated with pulmonary inflammation, defines a new gene family. EMBO J 2000;19:4046-55.)；ビリン（腎臓粘膜においても見られる）(Wang Y, Srinivasan K, Siddiqui MR, George SP, Tomar A, Khurana S. A novel role for villin in intestinal epithelial cell survival and homeostasis. J Biol Chem 2008.)、Ａ３３(Johnstone CN, White SJ, Tebbutt NC, Clay FJ, Ernst M, Biggs WH, Viars CS, Czekay S, Arden KC, Heath JK. Analysis of the regulation of the A33 antigen gene reveals intestine-specific mechanisms of gene expression. J Biol Chem 2002;277:34531-9.)、ラクターゼ（ラクターゼ−フロリジンヒドロラーゼ）(Lee SY, Wang Z, Lin CK, Contag CH, Olds LC, Cooper AD, Sibley E. Regulation of intestine-specific spatiotemporal expression by the rat lactase promoter. J Biol Chem 2002; 277:13099-105.)、Ｈ（＋）／ペプチド共輸送体１（ＰＥＰＴ１、ＳＬＣ１５Ａ１）(Daniel H. Molecular and integrative physiology of intestinal peptide transport. Annu Rev Physiol 2004;66:361-84; Terada T, Inui K. Peptide transporters: structure, function, regulation and application for drug delivery. Curr Drug Metab 2004;5:85-94;およびShimakura J, Terada T, Shimada Y, Katsura T, Inui K. The transcription factor Cdx2 regulates the intestine-specific expression of human peptide transporter 1 through functional interaction with Sp1. Biochem Pharmacol 2006;71:1581-8.)；インテクチン(Kitazawa H, Nishihara T, Nambu T, Nishizawa H, Iwaki M, Fukuhara A, Kitamura T, Matsuda M, Shimomura I. Intectin, a novel small intestine-specific glycosylphosphatidylinositol-anchored protein, accelerates apoptosis of intestinal epithelial cells. J Biol Chem 2004; 279:42867-74.)；および炭酸脱水酵素 (Drummond F, Sowden J, Morrison K, Edwards YH. The caudal-type homeobox protein Cdx-2 binds to the colon promoter of the carbonic anhydrase 1 gene. Eur J Biochem 1996; 236:670-81.)を含む細胞タンパク質である。

粘膜限定タンパク質のいくつかの例は、限定はしないが、通常、乳房特異的タンパク質、例えば、マンマグロビン(Watson MA, Fleming TP. Mammaglobin, a mammary-specific member of the uteroglobin gene family, is overexpressed in human breast cancer. Cancer Res 1996;56:860-5; Berger J, Mueller-Holzner E, Fiegl H, Marth C, Daxenbichler G. Evaluation of three mRNA markers for the detection of lymph node metastases. Anticancer Res 2006; 26:3855-60; Fleming TP, Watson MA. Mammaglobin, a breast-specific gene, and its utility as a marker for breast cancer. Ann N Y Acad Sci 2000;923:78-89.)；Ｂ７２６Ｐおよび小乳房上皮性ムチン（ＳＢＥＭ）(Miksicek RJ, Myal Y, Watson PH, Walker C, Murphy LC, Leygue E. Identification of a novel breast- and salivary gland-specific, mucin-like gene strongly expressed in normal and tumor human mammary epithelium. Cancer Res 2002;62:2736-40.)を含む細胞タンパク質である。

粘膜限定タンパク質のいくつかの例は、限定はしないが、通常、肺特異的タンパク質、例えば、ＬＵＮＸ(Iwao K, Watanabe T, Fujiwara Y, Takami K, Kodama K, Higashiyama M, Yokouchi H, Ozaki K, Monden M, Tanigami A. Isolation of a novel human lung-specific gene, LUNX, a potential molecular marker for detection of micrometastasis in non-small-cell lung cancer. Int J Cancer 2001;91:433-7;およびCheng M, Chen Y, Yu X, Tian Z, Wei H. Diagnostic utility of LunX mRNA in peripheral blood and pleural flu id in patients with primary non-small cell lung cancer. BMC Cancer 2008;8:156.)およびＴＳＣ４０３(Ozaki K, Nagata M, Suzuki M, Fujiwara T, Ueda K, Miyoshi Y, Takahashi E, Nakamura Y. Isolation and characterization of a novel human lung-specific gene homologous to lysosomal membrane glycoproteins 1 and 2: significantly increased expression in cancers of various tissues. Cancer Res 1998; 58:3499-503.)を含む細胞タンパク質である。

ＣＤ４＋Ｔヘルパーエピトープ
ＣＤ４＋ヘルパーエピトープ中、ワクチンの製造において有用であり得るものは、ＭＨＣクラスＩＩ ＨＬＡ血清型ＨＬＡ−ＤＰ、ＨＬＡ−ＤＱおよびＨＬＡ−ＤＲと複合体を形成する物である。一般的に、自己分子は、ＭＨＣクラスＩＩ ＨＬＡと複合体を形成せず、次に複合体がＣＤ４＋Ｔ細胞受容体に結合する。したがって、ＣＤ４＋ヘルパーエピトープは、一般的に異なる種、最も一般的には病原性種に由来する。いくつかの型のＭＨＣクラスＩＩ ＨＬＡと複合体を形成し、次に複合体がＣＤ４＋Ｔ細胞受容体に結合するＣＤ４＋ヘルパーエピトープは、ユニバーサルＣＤ４＋ヘルパーエピトープと称される。

それぞれの血清型内で、それぞれの血清型のいくつかの型がある。ＭＨＣクラスＩＩ分子は、ヘテロダイマー複合体である。ＨＬＡ−ＤＰは、ＨＬＡ−ＤＰＡ１遺伝子座（約２３個の対立遺伝子）によってコードされるα鎖およびＨＬＡ−ＤＰＢ１遺伝子座（約１２７個の対立遺伝子）によってコードされるβ鎖を含む。したがって、ＨＬＡ−ＤＰについて約２５５２個の組合せがある。ＨＬＡ−ＤＱは、ＨＬＡ−ＤＱＡ１遺伝子座（約３４個の対立遺伝子）によってコードされるα鎖およびＨＬＡ−ＤＱＢ１遺伝子座（約８６個の対立遺伝子）によってコードされるβ鎖を含む。したがって、ＨＬＡ−ＤＱについて約１７０８個の組合せがある。ＨＬＡ−ＤＲは、ＨＬＡ−ＤＲＡ遺伝子座（約３個の対立遺伝子）によってコードされるα鎖およびＨＬＡ−ＤＲＢ１（約５７７個の対立遺伝子）、ＤＲＢ３、ＤＲＢ４、ＤＲＢ５遺伝子座（約７２個の対立遺伝子）によってコードされる４つの（４）β鎖（これについて、あらゆる人が、一人当たり３個の可能性があり得る）を含む。したがって、ＨＬＡ−ＤＲについて約１３９８個の組合せがある。ＨＬＡ−ＤＲの約１６個の共通の型（ＤＲ１−ＤＲ１６）がある。

個体は、いくつかの型を発現するが、他のものを発現しない。一般的に、個体は、特定の個体により発現される多数のＨＬＡ型および組合せを有するが、恐らく唯一でなく、全体として集団のサブセットを定義する。個体により発現される型の同一性は、よく知られている、および広く利用できる技術を使用して、日常的に解明され得る。したがって、個体は、どの型を発現し、したがってどの型の免疫応答に関与するか決定するように「分類され」得る。

特定のＣＤ４＋ヘルパーエピトープは、１つの個体上に存在するが別の個体上に存在しないＨＬＡクラスＩＩ分子により認識され得る。したがって、有効なＣＤ４＋ヘルパーエピトープを有する製品は、製品が個体のＣＤ４＋Ｔ細胞上で発現されるＨＬＡ型により認識されるＣＤ４＋ヘルパーエピトープを含むように、個体に対して合わせなければならない。したがって、個体は、呈示するＭＨＣクラスＩＩ型を決定して分類し、次に、多数のＣＤ４＋ヘルパーエピトープ、例えば、個体により発現されるＨＬＡ型により認識される１つ以上のもののいずれかを含むワクチン、または、個体により発現されるＨＬＡ型により認識されるＣＤ４＋ヘルパーエピトープを含む、すなわち個体に合わせられているワクチンを投与され得る。

あるいは、ワクチン製品は、全ての、または多数のＨＬＡ型により認識されるＣＤ４エピトープを集合的に有する複数の種々のキメラタンパク質を含み得、したがって少なくとも１つが任意の与えられる個体において有効である可能性が高まる。同様に、ワクチン製品は、全ての、または多数のＨＬＡ型により認識されるＣＤ４エピトープを集合的に有する種々のキメラタンパク質をコードする複数の種々のキメラタンパク質を含み得、したがって、個体に投与され、発現されるとき、少なくとも１つが任意の与えられる個体において有効である可能性が高まる。

したがって、ワクチンは、個体に合わせるか、または与えられる個体のＣＤ４＋Ｔ細胞上に発現されるＨＬＡ型による認識を確実にするために十分な数の種々のＣＤ４＋ヘルパーエピトープを含むいずれかである。

ＨＬＡ型を合わせる必要性の除去および複数の可能性のある合うものを投与する必要性の除去を可能にする代替アプローチは、ユニバーサルＣＤ４＋ヘルパーエピトープを含むキメラタンパク質を含むワクチン製品またはユニバーサルＣＤ４＋ヘルパーエピトープを含むキメラタンパク質をコードするキメラ遺伝子を提供する。ユニバーサルＣＤ４＋ヘルパーエピトープは、多数のＨＬＡ型に合い、したがって多数のＨＬＡ型により認識されるペプチド配列である。

ユニバーサルＣＤ４＋ヘルパーエピトープの例は、ＰＡＤＲＥである。ＰＡＤＲＥペプチドは、ＨＬＡ−ＤＲの最も一般的な型の１６個の少なくとも１５個と複合体を形成する。ヒトは少なくとも１つのＤＲを有し、ＰＡＤＲＥはその型中の多くに結合するため、ＰＡＤＲＥは多数のヒトにおいて有効である可能性が高い。いくつかの態様において、ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープは、ユニバーサルＨＬＡ−ＤＲエピトープＰＡＤＲＥ（ＫＸＶＡＡＷＴＬＫＡ）由来である(Alexander, J, delGuercio, MF, Maewal, A, Qiao L, Fikes J, Chestnut RW, Paulson J, Bundle DR, DeFrees S, and Sette A, Linear PADRE T Helper Epitope and Carbohydrate B Cell Epitope Conjugates Induce Specific High Titer IgG Antibody Responses, J. Immunol, 2000 Feb 1, 164(3):1625-33; Wei J, Gao W, Wu J, Meng K, Zhang J, Chen J, Miao Y. Dendritic Cells Expressing a Combined PADRE/MUC4-Derived Polyepitope DNA Vaccine Induce Multiple Cytotoxic T-Cell Responses. Cancer Biother Radiopharm 2008, 23:121-8; Bargieri DY, Rosa DS, Lasaro MA, Ferreira LC, Soares IS, Rodrigues MM. Adjuvant requirement for successful immunization with recombinant derivatives of Plasmodium vivax merozoite surface protein-1 delivered via the intranasal route. Mem Inst Oswaldo Cruz 2007, 102:313-7; Rosa DS, Iwai LK, Tzelepis F, Bargieri DY, Medeiros MA, Soares IS, Sidney J, Sette A, Kalil J, Mello LE, Cunha-Neto E, Rodrigues MM. Immunogenicity of a recombinant protein containing the Plasmodium vivax vaccine candidate MSP1(19) and two human CD4+ T-cell epitopes administered to non-human primates (Callithrix jacchus jacchus). Microbes Infect 2006, 8:2130-7; Zhang X, Issagholian A, Berg EA, Fishman JB, Nesburn AB, BenMohamed L. Th-cytotoxic T-lymphocyte chimeric epitopes extended by Nepsilon-palmitoyl lysines induce herpes simplex virus type 1-specific effector CD8+ Tc1 responses and protect against ocular infection. J Virol 2005; 79:15289-301 and Agadjanyan MG, Ghochikyan A, Petrushina I, Vasilevko V, Movsesyan N, Mkrtichyan M, Saing T, Cribbs DH. Prototype Alzheimer's disease vaccine using the immunodominant B cell epitope from beta-amyloid and promiscuous T cell epitope pan HLA DR-binding peptide. J Immunol 2005; 174:1580-6)。

ユニバーサルＣＤ４＋ヘルパーエピトープ、例えば、ＰＡＤＲＥおよび他のものは、Ｓｅｔｔｅらによる１９９８年４月７日取得米国特許第５，７３６，１４２号；Ｓｅｔｔｅらによる２００２年７月２日取得米国特許第６，４１３，９３５号；およびＳｅｔｔｅらによる２００７年４月１０日取得米国特許第７，２０２，３５１号に記載されている。いくつかのＤＲ型に結合することが報告されている他のペプチドは、Buschら Int. Immunol. 2, 443-451 (1990); Panina-Bordignonら Eur. J. Immunol. 19, 2237-2242 (1989); Sinigaglia et al., Nature 336, 778-780 (1988); O'Sullivanら J. Immunol. 147, 2663-2669 (1991) Roacheら J. Immunol. 144, 1849-1856 (1991);およびHillら J. Immunol. 147, 189-197 (1991)に記載されているものを含む。さらに、Ｓｅｔｔｅらによる２００２年７月２日取得米国特許第６，４１３，５１７号は、広範に反応性のＤＲ限定エピトープの同定を記載している。

粘膜限定抗原−融合パートナーとしての使用のためのＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープが由来し得る多数の既知の候補タンパク質がある。本明細書において提供されるものは、このようなＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープを含むタンパク質の例である種々のタンパク質および種々のペプチドの例である。これらのタンパク質およびペプチドは、ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープの非限定的な例であることが意図される。

いくつかの態様において、ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープは、破傷風毒素に由来し得る(Renard V, Sonderbye L, Ebbehoj K, Rasmussen PB, Gregorius K, Gottschalk T, Mouritsen S, Gautam A, Leach DR. HER-2 DNA and protein vaccines containing potent Th cell epitopes induce distinct protective and therapeutic antitumor responses in HER-2 transgenic mice. J Immunol 2003;171:1588-95; Moro M, Cecconi V, Martinoli C, Dallegno E, Giabbai B, Degano M, Glaichenhaus N, Protti MP, Dellabona P, Casorati G. Generation of functional HLA-DR*1101 tetramers receptive for loading with pathogen- or tumour-derived synthetic peptides. BMC Immunol 2005;6:24; BenMohamed L, Krishnan R, Longmate J, Auge C, Low L, Primus J, Diamond DJ. Induction of CTL response by a minimal epitope vaccine in HLA A*0201/DR1 transgenic mice: dependence on HLA class II restricted T(H) response. Hum Immunol 2000;61:764-79;およびJames EA, Bui J, Berger D, Huston L, Roti M, Kwok WW. Tetramer-guided epitope mapping reveals broad, individualized repertoires of tetanus toxin-specific CD4+ T cells and suggests HLA-based differences in epitope recognition. Int Immunol 2007;19:1291-301)。いくつかの態様において、ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープは、インフルエンザヘマグルチニンに由来し得る(Moro M, Cecconi V, Martinoli C, Dallegno E, Giabbai B, Degano M, Glaichenhaus N, Protti MP, Dellabona P, Casorati G. Generation of functional HLA-DR*1101 tetramers receptive for loading with pathogen- or tumour-derived synthetic peptides. BMC Immunol 2005;6:24)。

いくつかの態様において、ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープは、Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）に由来し得る(Litjens NH, Huisman M, Baan CC, van Druningen CJ, Betjes MG. Hepatitis B vaccine-specific CD4(+) T cells can be detected and characterised at the single cell level: limited usefulness of dendritic cells as signal enhancers. J Immunol Methods 2008;330:1-11)。

いくつかの態様において、ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープは、細菌性病原体（例えば、アナプラズマ・マージナーレ(Anaplasma marginale)）の外膜タンパク質（ＯＭＰ）に由来し得る(Macmillan H, Norimine J, Brayton KA, Palmer GH, Brown WC. Physical linkage of naturally complexed bacterial outer membrane proteins enhances immunogenicity. Infect Immun 2008;76:1223-9)。いくつかの態様において、ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープは、エンテロウイルス７１（ＥＶ７１）株４１由来のＶＰ１カプシドタンパク質に由来し得る(Wei Foo DG, Macary PA, Alonso S, Poh CL. Identification of Human CD4(+) T-Cell Epitopes on the VP1 Capsid Protein of Enterovirus 71. Viral Immunol 2008)。いくつかの態様において、ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープは、ＥＢＶ ＢＭＬＦ１に由来し得る(Schlienger K, Craighead N, Lee KP, Levine BL, June CH. Efficient priming of protein antigen-specific human CD4(+) T cells by monocyte-derived dendritic cells. Blood 2000;96:3490-8; Neidhart J, Allen KO, Barlow DL, Carpenter M, Shaw DR, Triozzi PL, Conry RM. Immunization of colorectal cancer patients with recombinant baculovirus-derived KSA (Ep-CAM) formulated with monophosphoryl lipid A in liposomal emulsion, with and without granulocyte-macrophage colony-stimulating factor. Vaccine 2004;22:773-80; Piriou ER, van Dort K, Nanlohy NM, van Oers MH, Miedema F, van Baarle D. Novel method for detection of virus-specific CD4+ T cells indicates a decreased EBV-specific CD4+ T cell response in untreated HIV-infected subjects. Eur J Immunol 2005;35:796-805; Heller KN, Upshaw J, Seyoum B, Zebroski H, Munz C. Distinct memory CD4+ T-cell subsets mediate immune recognition of Epstein Barr virus nuclear antigen 1 in healthy virus carriers. Blood 2007;109:1138-46)。

いくつかの態様において、ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープは、ＥＢＶ ＬＭＰ１に由来し得る(Kobayashi H, Nagato T, Takahara M, Sato K, Kimura S, Aoki N, Azumi M, Tateno M, Harabuchi Y, Celis E. Induction of EBV-latent membrane protein 1-specific MHC class II-restricted T-cell responses against natural killer lymphoma cells. Cancer Res 2008;68:901-8)。

いくつかの態様において、ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープは、ＨＩＶ ｐ２４３７に由来し得る(Pajot A, Schnuriger A, Moris A, Rodallec A, Ojcius DM, Autran B, Lemonnier FA, Lone YC. The Th1 immune response against HIV-1 Gag p24-derived peptides in mice expressing HLA-A02.01 and HLA-DR1. Eur J Immunol 2007;37:2635-44)。

いくつかの態様において、ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープは、アデノウイルスのヘキソンタンパク質に由来し得る(Leen AM, Christin A, Khalil M, Weiss H, Gee AP, Brenner MK, Heslop HE, Rooney CM, Bollard CM. Identification of hexon-specific CD4 and CD8 T-cell epitopes for vaccine and immunotherapy. J Virol 2008;82:546-54)。ワクシニアウイルスタンパク質からの多数のＭＨＣ−ＩＩハプロタイプに対する＞３０個の同定されたＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープ(Calvo-Calle JM, Strug I, Nastke MD, Baker SP, Stern LJ. Human CD4+ T cell epitopes from vaccinia virus induced by vaccination or infection. PLoS Pathog 2007;3:1511-29)および２４個の種々のワクシニアタンパク質からの多数のＭＨＣ−ＩＩハプロタイプに対する＞２５個の同定されたＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープがある。

いくつかの態様において、ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープは、熱ショックタンパク質に由来する(Liu DW, Tsao YP, Kung JT, Ding YA, Sytwu HK, Xiao X, Chen SL. Recombinant adeno-associated virus expressing human papillomavirus type 16 E7 peptide DNA fused with heat shock protein DNA as a potential vaccine for cervical cancer. J Virol 2000;74:2888-94.)。

いくつかの態様において、ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープは、ＩｇＧのＦｃ部分に由来する(You Z, Huang XF, Hester J, Rollins L, Rooney C, Chen SY. Induction of vigorous helper and cytotoxic T cell as well as B cell responses by dendritic cells expressing a modified antigen targeting receptor-mediated internalization pathway. J Immunol 2000;165:4581-91)。

いくつかの態様において、ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープは、リソソーム膜タンパク質に由来する(Su Z, Vieweg J, Weizer AZ, Dahm P, Yancey D, Turaga V, Higgins J, Boczkowski D, Gilboa E, Dannull J. Enhanced induction of telomerase-specific CD4(+) T cells using dendritic cells transfected with RNA encoding a chimeric gene product. Cancer Res 2002;62:5041-8)。

いくつかの態様において、ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープは、破傷風毒素由来のＴヘルパーエピトープに由来する(Renard V, Sonderbye L, Ebbehoj K, Rasmussen PB, Gregorius K, Gottschalk T, Mouritsen S, Gautam A, Leach DR. HER-2 DNA and protein vaccines containing potent Th cell epitopes induce distinct protective and therapeutic antitumor responses in HER-2 transgenic mice. J Immunol 2003;171:1588-95)。

ＨＬＡハプロタイプのサンプルならびに示されるＨＬＡ分子に対する典型的なＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープは、限定はしないが、以下のものを含む：
ＨＬＡ−ＤＲ＊１１０１−破傷風菌トキソイドペプチド残基８２９−８４４、血球凝集素ペプチド残基３０６−３１８(Moro M, Cecconi V, Martinoli C, Dallegno E, Giabbai B, Degano M, Glaichenhaus N, Protti MP, Dellabona P, Casorati G. Generation of functional HLA-DR*1101 tetramers receptive for loading with pathogen- or tumour-derived synthetic peptides. BMC Immunol 2005;6:24)。

ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０１０１（ＤＲ１）−破傷風菌トキソイドペプチド残基６３９−６５２、８３０−８４３または９４７−９６７および１４個の他の破傷風菌トキソイドペプチド(BenMohamed L, Krishnan R, Longmate J, Auge C, Low L, Primus J, Diamond DJ. Induction of CTL response by a minimal epitope vaccine in HLA A*0201/DR1 transgenic mice: dependence on HLA class II restricted T(H) response. Hum Immunol 2000;61:764-79;およびJames EA, Bui J, Berger D, Huston L, Roti M, Kwok WW. Tetramer-guided epitope mapping reveals broad, individualized repertoires of tetanus toxin-specific CD4+ T cells and suggests HLA-based differences in epitope recognition. Int Immunol 2007;19:1291-301)。

ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０３０１−ＥＶ７１ ＶＰ１残基１４５−１５９または２４７−２６１および５個の種々の破傷風菌トキソイドペプチド(Wei Foo DG, Macary PA, Alonso S, Poh CL. Identification of Human CD4(+) T-Cell Epitopes on the VP1 Capsid Protein of Enterovirus 71. Viral Immunol 2008;およびJames EA, Bui J, Berger D, Huston L, Roti M, Kwok WW. Tetramer-guided epitope mapping reveals broad, individualized repertoires of tetanus toxin-specific CD4+ T cells and suggests HLA-based differences in epitope recognition. Int Immunol 2007;19:1291-301)。

ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４０５−ＥＶ７１ ＶＰ１残基１４５−１５９または２４７−２６１(Wei Foo DG, Macary PA, Alonso S, Poh CL. Identification of Human CD4(+) T-Cell Epitopes on the VP1 Capsid Protein of Enterovirus 71. Viral Immunol 2008)。

ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１３０１−ＥＶ７１ ＶＰ１残基１４５−１５９または２４７−２６１(Wei Foo DG, Macary PA, Alonso S, Poh CL. Identification of Human CD4(+) T-Cell Epitopes on the VP1 Capsid Protein of Enterovirus 71. Viral Immunol 2008)。

ＨＬＡ−ＤＲ９−エプスタイン・バーウイルス(Epstein Barr virus)（ＥＢＶ）潜伏膜タンパク質１（ＬＭＰ１）残基１５９−１７５(Kobayashi H, Nagato T, Takahara M, Sato K, Kimura S, Aoki N, Azumi M, Tateno M, Harabuchi Y, Celis E. Induction of EBV-latent membrane protein 1-specific MHC class II-restricted T-cell responses against natural killer lymphoma cells. Cancer Res 2008;68:901-8)。

ＨＬＡ−ＤＲ５３−ＥＢＶ ＬＭＰ１残基１５９−１７５(Kobayashi H, Nagato T, Takahara M, Sato K, Kimura S, Aoki N, Azumi M, Tateno M, Harabuchi Y, Celis E. Induction of EBV-latent membrane protein 1-specific MHC class II-restricted T-cell responses against natural killer lymphoma cells. Cancer Res 2008;68:901-8)。

ＨＬＡ−ＤＲ１５−ＥＢＶ ＬＭＰ１残基１５９−１７５(Kobayashi H, Nagato T, Takahara M, Sato K, Kimura S, Aoki N, Azumi M, Tateno M, Harabuchi Y, Celis E. Induction of EBV-latent membrane protein 1-specific MHC class II-restricted T-cell responses against natural killer lymphoma cells. Cancer Res 2008;68:901-8)。

ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４０１−１５個の種々の破傷風菌トキソイドペプチド(James EA, Bui J, Berger D, Huston L, Roti M, Kwok WW. Tetramer-guided epitope mapping reveals broad, individualized repertoires of tetanus toxin-specific CD4+ T cells and suggests HLA-based differences in epitope recognition. Int Immunol 2007;19:1291-301)。

ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０７０１−９個の種々の破傷風菌トキソイドペプチド(James EA, Bui J, Berger D, Huston L, Roti M, Kwok WW. Tetramer-guided epitope mapping reveals broad, individualized repertoires of tetanus toxin-specific CD4+ T cells and suggests HLA-based differences in epitope recognition. Int Immunol 2007;19:1291-301)。

ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５０１−７個の種々の破傷風菌トキソイドペプチド(James EA, Bui J, Berger D, Huston L, Roti M, Kwok WW. Tetramer-guided epitope mapping reveals broad, individualized repertoires of tetanus toxin-specific CD4+ T cells and suggests HLA-based differences in epitope recognition. Int Immunol 2007;19:1291-301)。

ＨＬＡ−ＤＲＢ５＊０１０１−８個の種々の破傷風菌トキソイドペプチド(James EA, Bui J, Berger D, Huston L, Roti M, Kwok WW. Tetramer-guided epitope mapping reveals broad, individualized repertoires of tetanus toxin-specific CD4+ T cells and suggests HLA-based differences in epitope recognition. Int Immunol 2007;19:1291-301)。

分泌シグナル
分泌された抗原は、筋肉内免疫化後により強力なＣＤ４、ＣＤ８および抗体応答を誘導する(Boyle JS, Koniaras C, Lew AM. Influence of cellular location of expressed antigen on the efficacy of DNA vaccination: cytotoxic T lymphocyte and antibody responses are suboptimal when antigen is cytoplasmic after intramuscular DNA immunization. Int Immunol 1997;9:1897-906;およびQiu JT, Liu B, Tian C, Pavlakis GN, Yu XF. Enhancement of primary and secondary cellular immune responses against human immunodeficiency virus type 1 gag by using DNA expression vectors that target Gag antigen to the secretory pathway. J Virol 2000;74:5997-6005)。

一般的に、免疫応答を誘導し、分泌シグナルを含む粘膜限定タンパク質を認識するＴ細胞およびＢ細胞を生産するために使用されるワクチンは、分泌シグナルのコード配列が、発現されるとき、分泌シグナルを含む融合タンパク質の生産をもたらすキメラ遺伝子の一部である核酸ベースのワクチンを含むものであり得る。このような融合タンパク質の分泌シグナルの存在は、発現されたタンパク質の輸送および分泌をもたらす。いくつかの態様において、分泌シグナルは、細胞からタンパク質の分泌時に、１つ以上の粘膜限定抗原エピトープおよび１つ以上のＣＤ４＋ヘルパーＴエピトープを含む融合タンパク質の残りから削除され得る。いくつかの態様において、１つ以上の粘膜限定抗原エピトープおよび１つ以上のＣＤ４＋ヘルパーＴエピトープを含む融合タンパク質は、無傷な分泌シグナルと共に細胞から分泌される。

分泌シグナルは、よく知られており、融合タンパク質および他の組換えタンパク質において広く使用されている。当業者は、容易に、ワクチンが投与される種において機能性である既知の分泌シグナルを選択し、機能性分泌シグナル、１つ以上の粘膜限定抗原エピトープおよび１つ以上のＣＤ４＋ヘルパーＴエピトープを含む融合タンパク質をコードするキメラ遺伝子を設計し得る。

分泌シグナルおよびそれらの設計の例は、vonHeijne G 1985 Signal sequences: the limits of variation J Mol Biol 184:99およびgeneral vonHeijne G 1990 Protein Targeting Signals Curr Opin Cell Biol 6:604に記載されている。さらに、Kuchler K and J Thorner 1992 Secretion of Peptides and Proteins Lacking Hydrophobic Signal Sequences: The Role of Adenosine Triphosphate-Driven Membrane Translocators Endocrine Reviews 13(3)499-514は、タンパク質が分泌され得るさらなるメカニズムを記載している。

いくつかの態様において、粘膜限定抗原は、膜結合型細胞タンパク質由来である。膜結合型細胞タンパク質は、しばしば、細胞外ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含む。１つ以上のＣＤ４＋Ｔヘルパーエピトープに連結した粘膜限定抗原の１つ以上のエピトープを含むワクチンにおいて、粘膜限定抗原のエピトープは、いくつかの、または全ての細胞外ドメイン、一般的に不完全な膜貫通ドメインを含み、細胞質ドメインを含まない。このような融合タンパク質は、細胞外ドメインが膜を介して移行するように輸送されるが、膜貫通ドメインは、存在する限り、タンパク質が細胞から放出されるような完全に機能性ではない。

核酸ベースのワクチン
粘膜限定タンパク質の少なくとも１つのエピトープを認識するＴ細胞およびＢ細胞を含む免疫応答を誘導するために有用ないくつかのワクチンは、個体に投与され、それにより、核酸分子は個体の細胞により取り込まれ、発現され、核酸分子によってコードされるタンパク質を生産する核酸分子を含む。個体自身の細胞内でタンパク質を生産することにより、タンパク質は、細胞性免疫応答を確保するように処理され、標的免疫原に対する広くより有効な免疫応答を生産することができる。

感染性ベクター介在ワクチンおよびＤＮＡワクチンは、個体に投与される核酸分子を含むワクチンである。感染性ベクター介在ワクチンおよびＤＮＡワクチンは、キメラタンパク質をコードするキメラ遺伝子を含む核酸分子を含む。キメラ遺伝子は、キメラタンパク質がワクチンの核酸分子を取り込む少なくともいくつかの細胞において生産できるように、細胞において機能性である調節因子に作動可能に連結している。

キメラタンパク質は、１）粘膜限定抗原の少なくとも１つのエピトープ、２）ＣＤ４＋ヘルパーエピトープ、および所望により、３）分泌シグナルを含む。このような態様において、核酸分子は、ワクチンが投与される個体における細胞に導入され、そこでそれらは発現され、細胞においてキメラタンパク質を生産する。キメラタンパク質の細胞内生産は、広範囲にわたる免疫応答を引き起こす。いくつかの態様において、キメラは、キメラタンパク質が分泌シグナルを含むように分泌シグナルをさらにコードする。分泌シグナルを含むキメラタンパク質は、分泌用の細胞により処理される。キメラタンパク質配列の分泌は、免疫系プロセスおよびより広範囲にわたる免疫応答のさらなる関わりをもたらす。

感染ベクターは、一般的に、組換え感染性ベクターを示す。細胞内でのタンパク質生産は、広範囲にわたる免疫応答の局面に関与する細胞内プロセスを確保するために有用であるため、細胞に感染し、細胞内でタンパク質を生産するウイルスベクターおよび他のベクターは、特に有効である。同様に、ＤＮＡワクチンは、ＤＮＡ分子、通常プラスミドが、ワクチン接種を受けた個体における細胞により取り込まれるように設計される。細胞内に生産されるタンパク質配列は、例えば、Ｔ細胞受容体へのＭＨＣ分子によるエピトープの呈示を介して、細胞性免疫応答の産生において標的として使用され得る。

組換え感染性ベクターおよび技術の例は、感染性ベクター介在ワクチン、例えば、組換えアデノウイルス、ＡＡＶワクシニア、サルモネラおよびＢＣＧを含む。それぞれの場合において、ベクターは、キメラタンパク質をコードするキメラ遺伝子を有する。

上記のとおり、核酸ベースのワクチンの利点は、粘膜限定抗原の１つ以上のエピトープを含むタンパク質の細胞内生産である。タンパク質は、細胞内でプロセッシングされ、細胞性免疫系を保証する様式で与えられ得、粘膜限定抗原の１つ以上のエピトープを呈示する細胞に向けられた細胞毒性Ｔ細胞を含む細胞性免疫応答をもたらす。

ＣＤ４＋ヘルパーエピトープの存在は、キメラタンパク質上に存在する粘膜限定抗原の１つ以上のエピトープに向けられた免疫応答におけるＣＤ４＋免疫細胞の確保を提供する。ＣＤ４＋ヘルパーエピトープなしで、粘膜限定抗原の１つ以上のエピトープに対する免疫応答は、粘膜限定抗原の１つ以上のエピトープに特異的なＣＤ４＋免疫細胞の欠如により限定され得る。粘膜限定抗原の１つ以上のエピトープと共にＣＤ４＋ヘルパーエピトープが提供されることにより、粘膜限定抗原の１つ以上のエピトープに対する免疫応答は、個体のＣＤ４＋免疫細胞により認識され、応答を引き起こすことができるＣＤ４＋ヘルパーエピトープの同時確保によって、広くより完全であり得る。したがって、粘膜限定抗原の１つ以上のエピトープおよびＣＤ４＋ヘルパーエピトープの組合せを有するキメラタンパク質は、ＣＤ４＋ヘルパーエピトープなしで粘膜限定抗原の１つ以上のエピトープにより引き起こされる免疫応答と比較して、さらにより有効な免疫応答をもたらす。

任意のシグナル配列を含むことは、粘膜限定抗原の１つ以上のエピトープで指向される免疫応答のさらなる増強を提供し得る。キメラタンパク質中にシグナル配列を含むことは、細胞からおよび細胞外環境へのキメラタンパク質の輸送および分泌を容易にし、そこで、キメラタンパク質のエピトープは、それらを認識することができる免疫細胞を確保することができる。この確保は、より広くより有効な免疫応答を引き起こし得、シグナル配列に関するキメラ遺伝子上のコード配列の存在により有意に容易にされる。一般的に、細胞内でこのような構築物から生産されたキメラタンパク質は、分泌プロセスの一部として除去されるシグナル配列を有し、したがってシグナル配列をもはや含まないキメラタンパク質の成熟形態を分泌する。

粘膜限定抗原の少なくとも１つのエピトープ、ＣＤ４＋ヘルパーエピトープ、および所望により、分泌シグナルを含むキメラタンパク質は、感染性ベクターにより感染された細胞において生産される。粘膜限定抗原エピトープの存在は、免疫応答に対する標的として働く。ＣＤ４＋ヘルパーエピトープは、ＣＤ４＋細胞介在免疫応答の確保をもたらす。分泌シグナルは、細胞からのタンパク質の分泌を容易にし、その存在を細胞外に提供し、そこでそれは免疫応答の種々の局面と関連する種々のプロセスに対する標的として働くことができる。

１つ以上の粘膜限定抗原エピトープは、粘膜限定抗原の完全長形態または切断形態の一部であり得る。いくつかの粘膜限定抗原は、シグナル配列を含む。したがって、１つ以上の粘膜限定抗原エピトープは、粘膜限定抗原のシグナル配列を含む粘膜限定抗原の完全長形態または切断形態の一部であり得る。キメラタンパク質の発現が、ＣＤ４＋ヘルパーエピトープおよび１つ以上の粘膜限定抗原エピトープ、例えば、粘膜限定抗原の完全長形態または切断形態を含む成熟キメラタンパク質の分泌をもたらすように、ＣＤ４＋ヘルパーエピトープのコード配列は、１つ以上の粘膜限定抗原エピトープ、例えば、粘膜限定抗原の完全長形態または切断形態のコード配列へシグナル配列を用いて連結され得る。

ＤＮＡワクチンは、米国特許第５，５８０，８５９、５，５８９，４６６、５，５９３，９７２、５，６９３，６２２号およびＰＣＴ／ＵＳ９０／０１５１５（これらは出典明示により本明細書に包含させる）に記載されている。他のものは、リポソーム介在ＤＮＡ移動、微粒子銃を使用するＤＮＡ送達の使用を教示している（Ｓａｎｆｏｒｄらによる１９９０年７月３１日取得米国特許第４，９４５，０５０号（これは出典明示により本明細書に包含させる））。それぞれの場合において、ＤＮＡは、細菌において生産され、単離され、処置される動物に投与されるプラスミドＤＮＡであり得る。プラスミドＤＮＡ分子は、動物の細胞により取り込まれ、そこで興味あるタンパク質をコードする配列は発現される。したがって、生産されるタンパク質は、動物における治療または予防効果を提供する。

個体における治療的および／または予防的免疫学的効果を生産するために、核酸分子を個体の細胞へ送達するウイルスベクターを含むベクターおよび他の手段の使用は、同様によく知られている。ワクシニアベクターを使用する組換えワクチンは、例えば、Ｓｔｕｎｎｅｎｂｅｒｇらによる１９９１年５月２１日取得米国特許第５，０１７，４８７号（これは出典明示により本明細書に包含させる）に記載されている。ポックスウイルスを使用する組換えワクチンは、例えば、米国特許第５，７４４，１４１、５，７４４，１４０、５，５１４，３７５、５，４９４，８０７、５，３６４，７７３および５，２０４，２４３号（これらは出典明示により本明細書に包含させる）に記載されている。アデノウイルス関連ウイルスを使用する組換えワクチンは、例えば、米国特許第５，７８６，２１１、５，７８０，４４７、５，７８０，２８０、５，６５８，７８５、５，４７４，９３５、５，３５４，６７８および４，７９７，３６８号（これらは出典明示により本明細書に包含させる）に記載されている。アデノウイルス関連ウイルスを使用する組換えワクチンは、例えば、米国特許第５，５８５，３６２、５，６７０，４８８、５，７０７，６１８および５，８２４，５４４号（これらは出典明示により本明細書に包含させる）に記載されている。

死滅または不活化ワクチン
ワクチンの他の形態は、ハプテン化されているか、またはハプテン化されていない死滅または不活化ワクチンを含む。死滅または不活化ワクチンは、粘膜限定抗原の少なくとも１つのエピトープおよびＣＤ４＋ヘルパーエピトープを含むキメラタンパク質を示す死滅細胞または不活化ウイルス粒子を含み得る。個体に投与されるとき、死滅または不活化ワクチンは、粘膜限定抗原を標的化する免疫応答を誘導する。いくつかの死滅または不活化ワクチンは、ハプテン化されている。すなわち、それらは、その存在が粘膜限定抗原の１つ以上のエピトープに対する免疫応答を含む死滅または不活化ワクチンに対する免疫応答を増加させるさらなる成分、ハプテンを含む。ハプテン化された死滅または不活化ワクチンは、粘膜限定抗原の少なくとも１つのエピトープおよびＣＤ４＋ヘルパーエピトープを含むキメラタンパク質を示す死滅細胞または不活化ウイルス粒子のいずれかを含み、ハプテン化されている死滅または不活化ワクチンを含む。死滅または不活化ワクチン、または、ハプテン化された死滅または不活化ワクチンを個体に投与されたとき、粘膜限定抗原を標的化する免疫応答が誘導される。

いくつかの態様において、粘膜限定抗原の少なくとも１つのエピトープおよびＣＤ４＋ヘルパーエピトープを含む細胞を提供する。いくつかの態様において、細胞はヒト細胞である。いくつかの態様において、細胞は非ヒト細胞である。いくつかの態様において、細胞は細菌細胞である。いくつかの態様において、細胞はヒト癌細胞である。細胞は死滅されていてもよい。

タンパク質ベースのワクチン
ワクチンの他の形態は、ハプテン化されたサブユニットワクチンを含むサブユニットワクチンを含む。サブユニットワクチンは、一般的に、免疫応答が望まれる免疫原性標的を含む単一のタンパク質またはタンパク質複合体を示す。サブユニットワクチンは、本明細書において、粘膜限定抗原の少なくとも１つのエピトープおよびＣＤ４＋ヘルパーエピトープを含むキメラタンパク質を含む。サブユニットワクチンは、タンパク質をさらに免疫原性にするためにハプテン化され得る。すなわち、ハプテン化は、粘膜限定抗原の１つ以上のエピトープに対する増強された免疫応答をもたらす。

サブユニットワクチンの製造および使用はよく知られている。当業者は、粘膜限定抗原またはそのフラグメントに連結したＣＤ４＋ヘルパーエピトープをコードする核酸分子を単離することができる。単離されると、標準技術を使用して、核酸分子を発現ベクターに挿入することができ、容易に出発物質として利用できる。粘膜限定抗原またはそのフラグメントに連結したＣＤ４＋ヘルパーエピトープを含むタンパク質を単離することができる。

組換え発現ベクターは、粘膜限定抗原またはそのフラグメントに連結したＣＤ４＋ヘルパーエピトープをコードする核酸分子をコードするヌクレオチド配列を含み得る。本明細書において使用される「組換え発現ベクター」なる用語は、適当な宿主に導入されるとき、タンパク質をコードするコード配列の発現を指向するために必要な遺伝因子を含む、プラスミド、ファージ、ウイルス粒子または他のベクターを示すことを意図する。コード配列は、必要な調節配列に作動可能に連結している。発現ベクターはよく知られており、容易に利用できる。発現ベクターの例は、プラスミド、ファージ、ウイルスベクターおよび宿主細胞を形質転換させ、コード配列の発現を容易にするために有用なビヒクルを含む他の核酸分子または核酸分子を含む。本発明の組換え発現ベクターは、本発明の単離されたタンパク質を製造するための組換え発現系を製造するために、宿主を形質転換するために有用である。

いくつかの態様は、組換え発現ベクターを含む宿主細胞に関する。タンパク質の生産のためのよく知られている組換え発現系における使用のための宿主細胞は、よく知られており、容易に利用できる。宿主細胞の例は、細菌細胞、例えば、大腸菌、酵母細胞、例えば、サッカロミセス・セレビシエ(S. cerevisiae)、昆虫細胞、例えば、スポドプテラ・フルギペルダ(S. frugiperda)、非ヒト哺乳動物組織培養細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞およびヒト組織培養細胞、例えば、ＨｅＬａ細胞を含む。いくつかの態様において、例えば、よく知られている技術を使用して、当業者は、これらの発現系または他のよく知られている発現系における使用のための市販の発現ベクターにこのようなＤＮＡ分子を挿入することができる。

いくつかの態様は、ワクチン組成物において使用されるタンパク質をコードする核酸配列を含む組換え発現ベクターを含むトランスジェニック非ヒト哺乳動物に関する。組換えタンパク質を生産するために有用なトランスジェニック非ヒト哺乳動物、トランスジェニック動物を産生するために必要な発現ベクターおよび産生するための技術は、よく知られている。一般的に、トランスジェニック動物は、粘膜限定抗原またはそのフラグメントに連結したＣＤ４＋ヘルパーエピトープをコードするヌクレオチド配列が、乳房細胞特異的プロモーターに作動可能に連結しており、それによりコード配列は乳房細胞においてのみ発現され、発現された組換えタンパク質は畜乳から回収される、組換え発現ベクターを含む。当業者は、標準技術、例えば、Ｗａｇｎｅｒによる１９８９年１０月１０日取得米国特許第４，８７３，１９１号およびＬｅｄｅｒによる１９８８年４月１２日取得米国特許第４，７３６，８６６号（これら両方を出典明示により本明細書に包含させる）に教示されているものを使用して、ワクチンの製造に、またはワクチンの製造のために有用であり得るタンパク質を生産するトランスジェニック動物を生産することができる。動物の例は、ヤギおよび齧歯動物、特にラットおよびマウスである。

組換え技術によりこれらのタンパク質を生産することに加えて、自動ペプチド合成装置を、また、粘膜限定抗原またはそのフラグメントに連結したＣＤ４＋ヘルパーエピトープを含むタンパク質を生産するために使用され得る。このような技術は、当業者によく知られており、誘導体がＤＮＡコードタンパク質生産において提供されない置換を有するときに有用である。

ハプテン化
いくつかの態様において、ワクチンは、サブユニットワクチンを構成するタンパク質または死滅または不活化ワクチンの細胞または粒子である。いくつかの態様において、このようなサブユニットワクチンを構成するタンパク質または死滅または不活化ワクチンの細胞または粒子は、免疫原性を増加させるためにハプテン化され得る。いくつかの場合において、ハプテン化は、大型分子構造を粘膜限定抗原もしくはそのフラグメントまたは粘膜限定抗原もしくはそのフラグメントを含むタンパク質と結合させることである。いくつかの場合において、患者由来の腫瘍細胞は、有効なワクチン製品を製造するための手段として死滅およびハプテン化される。粘膜限定抗原もしくはそのフラグメントまたは粘膜限定抗原もしくはそのフラグメントを含むタンパク質を製造する、および示すために遺伝情報で提供される他の細胞、例えば、細菌または真核細胞が、死滅され、活性なワクチン成分として使用される場合において、このような細胞は、免疫原性を増加させるためにハプテン化される。ハプテン化は、よく知られており、容易に行うことができる。

細胞、一般的に腫瘍細胞をハプテン化する方法は、特にBerdら May 1986 Cancer Research 46:2572-2577およびBerdら May 1991 Cancer Research 51:2731-2734（これらを出典明示により本明細書に包含させる）に記載されている。さらなるハプテン化プロトコールは、Millerら 1976 J. Immunol. 117(5:1):1591-1526に記載されている。

ハプテン化組成物および本発明のハプテン化された免疫原を製造するために使用されるように構成され得る方法は、Ｓｔｒａｈｉｌｅｖｉｔｚによる１９９１年８月６日取得米国特許第５，０３７，６４５号；Ｓｈｉｏｓａｋａらによる１９９２年５月１２日取得米国特許第５，１１２，６０６号；Ｓｔｅｖｅｎｓによる１９８５年７月２日取得米国特許第４，５２６７１６号；Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｏｎらによる１９８２年５月１１日取得米国特許第４，３２９，２８１号；およびＧｒｏｓｓによる１９７７年５月１０日取得米国特許第４，０２２，８７８号（これらそれぞれを出典明示により本明細書に包含させる）に記載されているものを含む。ペプチドワクチンおよび本発明の免疫原を修飾するように構成され得るペプチドの免疫原性を増強する方法は、また、Francisら 1989 Methods of Enzymol. 178:659-676（これを出典明示により本明細書に包含させる）に記載されている。Sadら 1992 Immunolology 76:599-603（これを出典明示により本明細書に包含させる）は、ゴナドトロピン放出ホルモンをジフテリアトキソイドへ接合することにより免疫治療ワクチンを製造する方法を教示している。免疫原は、本発明の免疫治療ワクチンを生産するために同様に接合され得る。MacLeanら 1993 Cancer Immunol. Immunother. 36:215-22.2（これを出典明示により本明細書に包含させる）は、本発明の免疫治療ワクチンを生産するために適合できる免疫治療ワクチンを生産するための接合方法論を記載している。ハプテンは、免疫原へ接合され得るキーホールリンペットヘモシアニンである。

いくつかの態様におけるワクチンは、核酸分子、核酸分子を含むベクター、例えば、ウイルス、タンパク質または細胞であり得る活性剤と組み合わせて薬学的に許容される担体を含む。医薬製剤はよく知られており、このような活性剤を含む医薬組成物は、当業者により日常的に製剤化され得る。適当な医薬担体は、この分野における標準文献であるRemington's Pharmaceutical Sciences, A. Osol（これを出典明示により本明細書に包含させる）に記載されている。本発明は、薬学的に許容される担体および活性剤を含む注射可能な医薬組成物に関する。該組成物は、好ましくは滅菌され、発熱源(pyrogen)を含まない。

いくつかの態様において、例えば、活性剤は、薬学的に許容されるビヒクルと共に溶液、懸濁液、エマルジョンまたは凍結乾燥粉末として製剤化することができる。このようなビヒクルの例は、水、塩水、リンガー溶液、デキストロース溶液および５％のヒト血清アルブミンである。リポソームおよび非水性ビヒクル、例えば、固定油も使用され得る。ビヒクルまたは凍結乾燥粉末は、等張性（例えば、塩化ナトリウム、マンニトール）および化学安定性（例えば、バッファーおよび防腐剤）を維持する付加物を含み得る。製剤は、一般的に使用される技術により滅菌される。

注射可能な組成物は、賦形剤、例えば、例えば、滅菌水、電解質／デキストロース、植物性の脂肪油、脂肪エステルまたはポリオール、例えば、プロピレングリコールおよびポリエチレングリコール中の免疫原を含み得る。注射可能な組成物は、滅菌され、発熱源を含まないべきである。

ワクチンは、免疫原性応答の認識および誘導のために免疫原を身体の免疫系へ提供することを可能にする任意の方法により投与され得る。医薬組成物は、非経腸的、すなわち、静脈内、皮下、筋肉内に投与され得る。

用量は、活性剤および既知の因子の性質、例えば、特定の薬剤の薬物動力学特性、およびその様式および投与経路；レシピエントの年齢、健康状態および体重；症状の性質および程度、同時処置の種類、処置の頻度、ならびに所望の効果に依存して変化する。免疫原の量は、予防または治療に有効な免疫応答を誘導するように送達される。当業者は、日常的な方法により、範囲および最適用量を容易に決定することができる。

処置方法
本発明の局面は、粘膜組織の癌を有する個体を処置する方法を含む。該処置は、全身的に提供される。本明細書に記載されている粘膜限定抗原の少なくとも１つのエピトープを認識する複数のＴ細胞でこのような個体を処置することにより、Ｔ細胞は、特に個体の免疫系の非粘膜区画において、粘膜限定抗原を発現する癌細胞を特異的に標的する。すなわち、Ｔ細胞は、粘膜の外側に存在する粘膜組織から生じるあらゆる癌細胞を攻撃する。粘膜限定抗原の少なくとも１つのエピトープを認識する複数のＴ細胞は、同定された転移性疾患、ならびに、あらゆる検出されていない転移、例えば、微小転移を含むあらゆる転移性疾患を処置するために特に有用である。

粘膜限定抗原の少なくとも１つのエピトープを認識する複数のＴ細胞は、粘膜組織に関連する癌の診断において提供される通常の処置および／または癌ワクチン処置と共にアジュバント治療処置を提供する。当業者は、癌を粘膜組織に関連する癌として診断することができる。転移性疾患の検出は日常的な方法論を使用して行うことができるが、小さいレベルの癌は癌の最初の診断時に検出不可能であり得る。治療の典型的な様式は、外科的、化学療法または放射線療法、または種々の組合せを含む。粘膜限定抗原の少なくとも１つのエピトープを認識する複数のＴ細胞は、転移によって粘膜の外側であるが粘膜組織由来の癌細胞を選択的に検出し、除去するさらなる攻撃手段を提供する。

したがって、いくつかの態様において、個体は癌を有すると診断され、癌は一種の粘膜組織由来と同定される。粘膜組織の癌は、当該分野で受け入れられる臨床的および実験的病理学的プロトコールを使用して、当業者により診断され得る。癌の由来が粘膜組織の特定の型の同一性は決定することができ、このような粘膜組織型と関連する粘膜限定抗原を選択され得る。粘膜限定抗原の少なくとも１つのエピトープを認識する複数のＴ細胞は、単独で、または、外科的および／または放射線処置および／または他の抗癌剤の投与および／または癌ワクチンの投与を含む処置レジメンの一部として、患者に投与される。

予防方法
粘膜限定抗原の少なくとも１つのエピトープを認識する複数のＴ細胞は、また、粘膜組織癌を発症する危険性がある個体において予防的に使用され得る。集団と比較して上昇した、または特に高い危険性がある個体を同定するいくつかの方法がある。いくつかの癌の危険性は、ファミリーの病歴および／または遺伝子マーカーの存在に基づいて予測することができる。ある挙動またはある環境因子への暴露によって、個体を高い危険性がある集団に分類され得る。除去されたまたは寛解期の原発性疾患との以前の診断は、個体をより高い危険性に分類される。当業者は、個体の危険性を評価すること、および個体が粘膜組織由来の癌の上昇した、または高い危険性があるか否かを決定することができる。

粘膜組織癌を発症する危険性がある個体は、個体が検出可能な疾患を有する前に、粘膜限定抗原の少なくとも１つのエピトープを認識する複数のＴ細胞を投与され得る。

組成物、製剤、投与およびレジメン
いくつかの態様における粘膜限定抗原の少なくとも１つのエピトープを認識する複数のＴ細胞は、該細胞と共に薬学的に許容される担体を含む。細胞を含む医薬製剤はよく知られており、当業者により日常的に製剤化され得る。適当な医薬担体は、この分野における標準文献であるRemington's Pharmaceutical Sciences, A. Osol（これを出典明示により本明細書に包含させる）に記載されている。本発明は、注入用の医薬組成物に関する。

いくつかの態様において、例えば、該複数の細胞は、薬学的に許容されるビヒクルと共に懸濁液として製剤化することができる。このようなビヒクルの例は、水、塩水、リンガー溶液、デキストロース溶液および５％のヒト血清アルブミンである。ビヒクルは、等張性（例えば、塩化ナトリウム、マンニトール）および化学安定性（例えば、バッファーおよび防腐剤）を維持する付加物を含み得る。ビヒクルは、一般的に使用される技術により、細胞への添加の前に滅菌される。

該複数の細胞は、それらが癌細胞と接触することが可能である任意の方法により投与され得る。医薬組成物は、例えば、静脈内に投与され得る。

用量は、該複数の細胞の性質、レシピエントの年齢、健康状態および体重、症状の性質および程度、同時処置の種類、処置の頻度、ならびに所望の効果に依存して変化する。一般的に、１×１０^１０から１×１０^１２個のＴ細胞を投与するが、より多いまたはより少ない、例えば、１×１０^９から１×１０^１３個の細胞を投与され得る。一般的に、１×１０^１１個のＴ細胞を投与する。送達される細胞の数は、予防または治療応答を誘導するために十分な量である。当業者は、日常的な方法により、範囲および最適用量を容易に決定することができる。

本明細書中で引用されている特許、公開特許出願および文献は、出典明示により本明細書に包含させる。

以下の実施例は、単に典型的な態様として提供し、本発明の範囲を限定することを意図しない。

実施例１
Ｔ細胞は、白血球除去輸血による結腸直腸癌患者のＰＢＭＣから、または、結腸直腸癌患者の腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）から回収され得る。ＴＩＬ外植片またはＰＢＭＣ由来Ｔ細胞を、６０００ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２を含む完全培地（１０％のヒト血清を補ったＲＰＭＩ１６４０ベース培地）中で培養する。培養物は、数百万のＴＩＬ細胞は利用するまで、通常２−４週間、１ｍｌあたり５×１０^５から２×１０^６細胞の細胞濃度で維持してもよい。多数の独立した培養物を、ＣＭＡエピトープの認識のためのサイトカイン分泌アッセイによりスクリーニングしてもよい。最も高いサイトカイン分泌を示す２から６つの独立したＴＩＬ培養物を、細胞数が５×１０^７個を越えるまで（この細胞数には、一般的に、腫瘍切除後に３−６週間で達する）、１ｍｌあたり６０００ＩＵのＩＬ−２を有する完全培地中でさらに増殖させてもよい。ＣＭＡ認識を維持したＴＩＬ培養物を、照射された同種異系の支持細胞、ＯＫＴ３（抗ＣＤ３）抗体、および１ｍｌあたり６０００ＩＵのＩＬ−２での迅速な拡張プロトコールの１サイクルを使用して、処置のために増殖させる。この迅速な拡張プロトコールは、一般的に、拡張の開始後１４−１５日間の投与時間により１０００倍の細胞の拡張をもたらす。患者は、０．５から１時間にわたって、１×１０^１１個の細胞のボーラス静脈内注入を受けてもよい。

実施例２
操作するためのＴ細胞は、５０ｎｇ／ｍｌのＯＫＴ３を補った、３００ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、１．２５μｇ／ｍｌのアンホテリシン、１０μｇ／ｍｌのシプロフロキサシンおよび５％のヒトＡＢ血清を有するＴ細胞培養培地ＡＩＭ−Ｖ（Invitrogen Corp, Grand Isle, NY）中で１×１０^６／ｍｌの濃度で細胞を培養することによる白血球の採取の後にＰＢＭＣから得ることができる。培養の２日後、細胞を回収し、ＯＫＴ３を含まない新鮮なＴ細胞培養培地に再懸濁する。マウス幹細胞ウイルス（ＭＳＣＶ）末端反復（ＬＴＲ）および高度に効率的な内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）を使用して、ＣＭＡ特異的ＴＣＲαおよびβ鎖またはＣＭＡ結合性膜結合型融合タンパク質のいずれかを発現するレトロウイルスベクター（例えば、ｐＭＳＧＶ１）は、ヒトポリオウイルス（ＴＣＲのみに対する）に由来であった。臨床等級のレトロウイルスベクター上清は、商業的に生産されており、任意の選択方法の使用なしに高度に効率的な遺伝子導入をもたらす固相形質導入プロトコールにおいて使用される。最大５×１０^８個の細胞の形質導入を、６ｍｌのベクターおよび１ウェルあたり最大５×１０^６個の細胞を使用して、Ｒｅｔｒｏｎｅｃｔｉｎ（ＣＨ−２９６、Takara Bio. Inc, Japanから購入したＧＭＰ等級Ｒｅｔｒｏｎｅｃｔｉｎ）で被覆され、ベクターで前負荷された６ウェルの組織培養プレート上での一晩培養により行う。患者は、０．５から１時間にわたって、１×１０^１０−１０^１１個の細胞のボーラス静脈内注入を受けてもよい。

実施例３
ＣＭＡ反応性Ｔ細胞を、ＰＢＭＣまたはＴＩＬから上記のとおり増殖させる。個々の全長ｃＤＮＡ鎖のクローニングのためにＰＣＲプライマーを設計するようにＴＣＲαおよびβ鎖使用を決定するために、ＣＭＡ反応性Ｔ細胞クローンから単離されたＲＮＡを、ＲＡＣＥ（ｃＤＮＡ末端の迅速な増幅）ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）およびＤＮＡ配列分析に付す。ＰｏｌｙＡ＋ＲＮＡは、Ｐｏｌｙ（Ａ） Ｐｕｒｅ ｍＲＮＡ精製キット（Ambion, Austin, TX）を使用してＴ細胞から単離される。逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）は、再配列されたαおよびβＴＣＲ鎖に対するオリゴヌクレオチドプライマーの対を使用するＴｉｔａｎ Ｏｎｅ Ｔｕｂｅ ＲＴ−ＰＣＲキット（Roche, Indianapolis, IN）を使用して行った。増幅された産物をゲル精製し、レトロウイルスベクター骨格にクローニングする。クローニングされたαおよびβセグメントを、シーケンシングにより確認する。

実施例４
ＣＭＡ特異的Ｂ細胞ハイブリドーマを生産する。マウスをＣＭＡ特異的Ｂ細胞（抗体）応答を生産するためにＣＭＡで免疫化する。脾臓を回収し、抗体を生産するＢ細胞を回収する。これらを、メチルセルロースベースの培地系、ＣｌｏｎａＣｅｌｌ−ＨＹモノクローナル抗体生産キット（StemCell Technologies, Inc.）を使用して、ＳＰ２／０−Ａｇ１４骨髄腫細胞系と融合させる。融合した細胞を限界希釈法によりクローニングし、ＣＭＡ特異的抗体生産のためにスクリーニングし、ＣＭＡ抗体を生産するハイブリドーマを同定する。これらを、ＣＭＡ特異的モノクローナル抗体の恒久的な供給源として維持する。

重鎖および軽鎖の抗体配列を、選択されたハイブリドーマからクローニングし、ＰＣＲによりｓｃＦＶ（一本鎖Ｆｖ）抗体を産生する。ｃＤＮＡを、縮退オリゴヌクレオチド（ｏｌｉｇｏｄＴ）を使用してハイブリドーマＲＮＡから生産する。ＶＬおよびＶＨ（重鎖および軽鎖可変セグメント）を、確立したオリゴヌクレオチドで３工程ＰＣＲアプローチを使用して、増幅させ、ｓｃＦＶに集合させる。ＣＭＡ特異的ハイブリドーマから生産されたｓｃＦＶを使用して、キメラ抗原受容体（ＣＭＡ結合性膜結合型融合タンパク質またはＴ−ｂｏｄｙ）を生産する。

Ｔ−ｂｏｄｙ遺伝子は、ＣＭＡ特異的ｓｃＦｖがＰＣＲによりＣＤ２８細胞外ドメイン（リガンド結合領域が切断されている）を介してＦｃＲＩγ鎖の細胞内部分に連結している３つの構成のものである。Ｔ−ｂｏｄｙ ｃＤＮＡ構築物を、レトロウイルスベクターにクローニングし、治療のためにＴ−ｂｏｄｙを発現するＴ細胞を生産するように、Ｔ細胞にトランスフェクトするために使用する（上記）。

実施例５
トランスファー(Transfer)は、サイトカイン投与（主にＩＬ−２）、ＣＭＡ指向性ワクチン接種および／または抗体治療、化学療法、シクロホスファミドおよびフルダラビン全身照射（ＴＢＩ）での宿主調製リンパ球枯渇、その他の可能性のある補助剤処置を含む種々の処置と組み合わせてもよい。

参考文献

Claims (9)

1. グアニル酸シクラーゼＣの少なくとも１つのエピトープを認識する複数のＴ細胞であって、該複数のＴ細胞が、グアニル酸シクラーゼＣの少なくとも１つのエピトープを認識する抗体の少なくとも機能性抗原結合フラグメントを含むグアニル酸シクラーゼＣ結合性膜結合型融合タンパク質をコードする核酸分子で形質転換されたＴ細胞のクローン性増殖に由来する、複数のＴ細胞。
2. 請求項１に記載の複数のＴ細胞の有効量を個体に投与する工程を含む、グアニル酸シクラーゼＣを発現する癌細胞を有する癌と診断された個体を処置する方法において有用な医薬の製造のための、請求項１に記載の複数のＴ細胞の使用。
3. 請求項１に記載の複数のＴ細胞の有効量を個体に投与する工程を含む、グアニル酸シクラーゼＣを発現する癌細胞を有する癌を発症する危険性が高いと同定された個体においてグアニル酸シクラーゼＣを発現する癌細胞を有する癌を予防する方法において有用な医薬の製造のための、請求項１に記載の複数のＴ細胞の使用。
4. Ｔ細胞をグアニル酸シクラーゼＣの少なくとも１つのエピトープを認識する抗体の少なくとも機能性抗原結合フラグメントを含むグアニル酸シクラーゼＣ結合性膜結合型融合タンパク質をコードする核酸配列で形質転換すること、ここに、発現時に、該融合タンパク質は膜結合型タンパク質である；および
   該形質転換されたＴ細胞を、その複製を促進する条件下でグアニル酸シクラーゼＣを認識する複数のＴ細胞を生産するために十分な期間培養すること
   を含む、グアニル酸シクラーゼＣの少なくとも１つのエピトープを認識する複数のＴ細胞を製造する方法。
5. グアニル酸シクラーゼＣ結合性膜結合型融合タンパク質をコードする核酸配列が、グアニル酸シクラーゼＣの少なくとも１つのエピトープを認識する抗体を生産するＢ細胞からグアニル酸シクラーゼＣの少なくとも１つのエピトープを認識する抗体をコードする核酸配列を単離すること、グアニル酸シクラーゼＣの少なくとも１つのエピトープを認識する抗体の機能性フラグメントおよび該融合タンパク質を膜結合型タンパク質にするタンパク質配列をコードするキメラ遺伝子を製造すること、および該キメラ遺伝子を含む発現ベクターを製造することにより得られる、請求項４に記載の方法。
6. グアニル酸シクラーゼＣ結合性膜結合型融合タンパク質をコードする核酸配列が、細胞内で発現されるとき、グアニル酸シクラーゼＣの少なくとも１つのエピトープに結合する抗体の少なくとも機能性フラグメントおよび融合タンパク質を膜結合型タンパク質にする部分に対するコード配列を含む、グアニル酸シクラーゼＣ結合性膜結合型融合タンパク質をコードする核酸配列を含む核酸分子であって、該グアニル酸シクラーゼＣ結合性膜結合型融合タンパク質をコードする核酸配列が所望により調節因子に作動可能に連結している、核酸分子。
7. グアニル酸シクラーゼＣに結合する一本鎖Ｆｖ抗体をコードする核酸配列；
   リガンド結合領域が切断されているＣＤ２８細胞外ドメインをコードする核酸配列；および
   ＦｃＲＩγ鎖の細胞内配列をコードする核酸配列
   を含む、請求項６に記載の核酸分子。
8. 核酸分子がプラスミドまたはウイルスゲノムである、請求項６または７に記載の核酸分子。
9. 請求項６から８のいずれかに記載の核酸分子を含むＴ細胞。