JP5945271B2 - ニッキング酵素を用いたヘリカーゼ依存性等温増幅 - Google Patents

Description

本発明は、生物学及び化学の分野、特に分子生物学の分野に関連する。より具体的には、本発明は、核酸増幅のための方法及びキットに関する。

核酸増幅は、研究、診断、法医学、医学、食品科学、及び農業において広く用いられている。「ポイント・オブ・ケア検査」（“Point of Care Testing”;ＰＯＣＴ）は、患者ケア現場での又はその近傍での診断検査、即ち、例えば民営医療機関、小規模病院、薬局、或いはさらに野外、又は事故若しくはその他医療緊急事態の現場、又は救急車内でさえ実施され得る分散（de-centralized）検査に関する。ポイント・オブ・ケア診断は、迅速かつ簡易な試験を必要とする。従って、核酸に基づく検出法の場合、既に確立されているが、時間がかかるＰＣＲに基づく方法に対して、迅速な等温増幅技術が、近年、ますます重要になってきている。ＰＣＲは、ＤＮＡ等の二本鎖核酸の２つの鎖を分離するために、熱サイクリングを必要とする。対照的に、例えば等温増幅法はサーモサイクラーを必要としない。

最もよく知られた等温増幅法の１つとして、所謂ヘリカーゼ依存性増幅（Helicase Dependent Amplification; ＨＤＡ）がある[例えば、ビンセント（Ｖｉｎｃｅｎｔ）ら（２００４），エンボ・レポーツ（ＥＭＢＯ ｒｅｐｏｒｔｓ）５（８）：７９５−８００；ジョン（Ｊｅｏｎｇ）ら（２００９），セルラー・アンド・モレキュラー・ライフ・サイエンシーズ（Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ）６６：３３２５−３３３６；ＷＯ−Ａ２ ２００４／０２７０２５；ＷＯ−Ａ２ ２００６／０７４３３４に記載されており、これら全ては本明細書において援用される。]。ＨＤＡは、加熱又は熱サイクリングさえ必要無しに、二本鎖核酸、特にＤＮＡを巻き戻し出来る、ヘリカーゼの能力に基づくものである。ＨＤＡにおいては、ＤＮＡポリメラーゼ及び適切なオリゴヌクレオチド・プライマーを用いて、分離されたＤＮＡ鎖が複製される。従って、ＨＤＡは、天然の複製フォーク機構を模倣する。ＨＤＡは、ＡＴＰ、二価マグネシウムイオン及びｄＮＴＰの存在を必要とする。ＨＤＡに基づく方法の幾つかは、置換された（ｄｉｓｐｌａｃｅｄ）ＤＮＡ鎖をコーティングするため、一本鎖結合タンパク質（ＳＳＢ）をさらに利用する。原理的には、ＨＤＡ法は、用いる酵素に応じて、熱不安定性反応又は熱安定性反応で実施され得る。熱不安定性ＨＤＡ反応は、典型的には、２５℃から５０℃の間、好ましくは３７℃から４２℃の間の温度で実施される。一方、熱安定性ＨＤＡ又は好熱性ＨＤＡ（ｔＨＤＡ）反応は、５０℃を超える、典型的には６０℃から７０℃の間の温度で実施される。

ＨＤＡ反応は、２つのプライマーによって定義される標的配列を選択的に増幅する。ＨＤＡは、ＰＣＲにおけるように熱ではなく、ヘリカーゼ酵素を用いて、二本鎖核酸の２つの鎖を分離する。従って、ＨＤＡは、熱サイクリングの必要無しに、単一の温度で実施され得る。従来の標準的ＨＤＡ反応の工程が図１に示されいるが、第一の工程において、二本鎖核酸がヘリカーゼによって巻き戻され、（部分的に）一本鎖である配列が生じる。この後、プライマーが一本鎖領域に結合する。工程２において、ポリメラーゼが相補鎖を合成する。最終的に、ヘリカーゼ及びポリメラーゼは一緒に作用し、鋳型の増幅を生じる（工程３）。

その他等温増幅には、制限酵素を用いてＤＮＡの非修飾鎖をニッキングすること、並びにエキソヌクレアーゼ欠損ＤＮＡポリメラーゼの作用を介してニックの３’末端を伸長し、下流ＤＮＡ鎖を置換することに基づく、鎖置換増幅（ＳＤＡ）が含まれる。

さらに別の等温増幅として、ＤＮＡリガーゼを用いて鋳型ＤＮＡの２つの末端を連結させることによって生成した環状ｓｓＤＮＡ鋳型に直鎖ｓｓＤＮＡがアニールされる、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）がある。続いて、ＤＮＡポリメラーゼを用いて、アニールさせたプライマーを伸長させ、相補鋳型配列のタンデムに連結されたコピーが生成される。ＲＣＡ及びＳＤＡはどちらも、最初の熱変性工程を必要とする。

その他等温増幅には、例えばニッキング酵素増幅反応（Nicking Enzyme Amplification Reaction；NEAR）並びに関連する指数関数的増幅反応（Exponential Amplification Reaction；EXPAR）が含まれ、これらはどちらも、短い二本鎖鋳型配列の増幅のために、ニッキング酵素及びポリメラーゼを使用する［例えば、バン・ネス（ｖａｎ Ｎｅｓｓ）ら（２００３），米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．）１００（８）：４５０４−４５０９；ＵＳ−Ａ１ ２００３／００８２５９０；ＷＯ−Ａ２ ２００４／０２２７０１；ＷＯ−Ａ２ ２００９／０１２２４６；ＷＯ−Ａ２ ２００４／０６７７２６に記載されており、これらは全て本明細書において援用される。］。

しかしながら、上述した等温増幅法は全て、複雑な反応プロトコルを必要とし、比較的時間がかかり、及び／又は比較的短い鋳型配列に限定されるものである。

本発明は、先行技術のこれらの限界を克服する、核酸、好ましくは二本鎖核酸の増幅のための改良法を提供する。本発明の方法は、修正ＨＤＡ法に基づく。提供される方法は、従来のｔＨＤＡよりも迅速であり、かつ信頼性のある特異性を同時に有する。ＮＥＡＲ及びＥＸＰＡＲの如き方法と比較して、本発明の方法は、より長い鋳型核酸を増幅出来る。

本発明は、ニッキング・エンドヌクレアーゼの存在下で実施される、ＨＤＡ増幅法に関する。従って、本発明の場合には、鋳型核酸は、ヘリカーゼ、適切なポリメラーゼ、及びニッキング・エンドヌクレアーゼの存在下で増幅される。

特に、本発明は、鋳型核酸、特にＤＮＡを増幅するための方法であって、
前記方法は、ニッキング・エンドヌクレアーゼの存在下で、ヘリカーゼ依存性増幅（ＨＤＡ）反応、特に高熱性ＨＤＡ（ｔＨＤＡ）を用いて、前記鋳型核酸を増幅することを含み、
前記鋳型核酸が前記ニッキング・エンドヌクレアーゼによって認識される配列を含むか、又は前記ニッキング・エンドヌクレアーゼによって認識される配列が前記ＨＤＡ反応中に前記鋳型核酸内に導入される、方法に関する。

前記ニッキング・エンドヌクレアーゼによって認識される配列は、前記ニッキング・エンドヌクレアーゼによって認識される配列を含むオリゴヌクレオチド・プライマーを用いて、前記鋳型核酸に導入され得る。このプライマーは、鋳型核酸にハイブリダイズしないが、前記ニッキング・エンドヌクレアーゼによって認識される配列又はその一部を含む、５’タグ配列を含んでもよい。

本発明は、さらに、
−ニッキング・エンドヌクレアーゼ、
−ヘリカーゼ、及び
−ＤＮＡポリメラーゼ
を含む、核酸を増幅するためのキットに関する。

本発明の方法及びキットを、核酸増幅において用いられ得るだけでなく、核酸の検出及び／又は定量のためも用いられ得る。

図１は、先行技術による標準的なｔＨＤＡ反応であり、例えばバイオヘリックス／ニュー・イングランド・バイオラボ（ｂｉｏｈｅｌｉｘ／Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）から市販されており、即ちニッキング・エンドヌクレアーゼを欠くｔＨＤＡ反応のスキームを示す。 図２は、タグ化プライマーを用いた、本発明のニッキングｔＨＤＡの特定の実施形態による反応スキームを説明するものである。 図２は、タグ化プライマーを用いた、本発明のニッキングｔＨＤＡの特定の実施形態による反応スキームを説明するものである。 図３は、非タグ化プライマーを用いた、本発明のニッキングｔＨＤＡの特定の実施形態による反応スキームを説明するものである。 図４は、チューブスキャナ(Tube Scanner)における、実施例１由来の様々なリアルタイム（ニッキング）ｔＨＤＡ反応の結果（増幅プロット）を示す。図４に示されるものは、経時的な蛍光強度の生データである。 図５は、実施例１の増幅産物の融解曲線を示す。Ａ）標準的ｔＨＤＡ。 図５は、実施例１の増幅産物の融解曲線を示す。Ｂ）Ｎｂ．ＢｓｍＩ無しのニッキングｔＨＤＡ。 図５は、実施例１の増幅産物の融解曲線を示す。Ｃ）Ｎｂ．ＢｓｍＩ有りのニッキングｔＨＤＡ。 図６は、実施例１の個々の反応混合物の増幅及び電気泳動後のポリアクリルアミドゲルを示す。Ａ）染色前のゲル、Ｂ）ＥｔＢｒを用いた染色後のゲル。Ｃ）ゲル上の個々のバンドＢ１からＢ５の内容もまた、図６Ｂ１〜６Ｂ５に図示されている。 図７は、用いたプライマーと共に実施例２の標的ＤＮＡの配列を示す。 図８は、ニッキング・エンドヌクレアーゼの濃度に対する反応速度の依存性を示す。アンプリコンのシグナルが検出可能になるまでの時間であって、バックグラウンド・シグナルを有意に超える時間を分で示す。より低い濃度のニッキング・エンドヌクレアーゼの存在下では、シグナルは、ニッキング・エンドヌクレアーゼを含まない反応より約５分早く検出され、反応がより迅速であることが示された。 図９は、標準的ｔＨＤＡ、即ち如何なるニッキング・エンドヌクレアーゼも伴わないｔＨＤＡの増幅曲線（経時蛍光）を示す。３つの曲線がｃＤＮＡ鋳型の存在下で測定されたものであり、２つの曲線がｃＤＮＡ鋳型の非存在下で測定されたものである。 図１０は、０．１Ｕのニッキング・エンドヌクレアーゼ、Ｎｔ．ＢｓｔＮＢＩの存在下のｔＨＤＡ増幅曲線を示す。３つの曲線がｃＤＮＡ鋳型の存在下で測定されたものであり、２つの曲線がｃＤＮＡ鋳型の非存在下で測定されたものである。 図１１は、ニッキング・エンドヌクレアーゼ、Ｎｔ．ＢｓｔＮＢＩを伴わない標準的ｔＨＤＡ後の融解曲線解析を示す。融解曲線解析は、図９に示す反応を用いて実施した。３つの曲線がｃＤＮＡ鋳型の存在下で測定されたものであり、２つの曲線がｃＤＮＡ鋳型の非存在下で測定されたものである。 図１２は、０．１Ｕのニッキング・エンドヌクレアーゼ、Ｎｔ．ＢｓｔＮＢＩの存在下における、標準的ｔＨＤＡ後の融解曲線解析を示す。融解曲線解析は、図１０に示す反応を用いて実施した。３つの曲線がｃＤＮＡ鋳型の存在下で測定されたものであり、２つの曲線がｃＤＮＡ鋳型の非存在下で測定されたものである。 図１３は、ニッキング・エンドヌクレアーゼの存在に対する、反応速度の依存性を図示する。アンプリコンのシグナルが検出可能になるまでの時間であって、バックグラウンド・シグナルを有意に超える時間を分で示す。ニッキング・エンドヌクレアーゼの存在下では、シグナルは、ニッキング・エンドヌクレアーゼを含まない反応より約６分早く検出されており、反応がより迅速であることを示す。 図１４は、ナイセリア・ゴノレア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ；淋菌）ゲノムのポリン遺伝子の一部に関連する、実施例１のアンプリコンの一方の鎖の配列を図示する。プライマー及びプローブのハイブリダイズ領域が示されている。（Ａ）は標準的ｔＨＤＡであり、（Ｂ）はタグ化プライマーを用いた、本発明の方法によるニッキングｔＨＤＡであって、下線はＮｂ．ＢｓｍＩの認識配列であり、タグ化プライマーによって導入される配列がイタリック体で示されている。

本発明は、核酸、特にＤＮＡの増幅、及び任意に検出のための方法及びキットを提供する。本発明の方法は、ヘリカーゼ依存性増幅（ＨＤＡ）反応に基づく。しかしながら、先行技術のＨＤＡ反応とは異なり、本発明による増幅反応では、ニッキング・エンドヌクレアーゼが存在する。従って、本発明のキットは、また、ニッキング・エンドヌクレアーゼも含む。本発明の方法は、本明細書において、「ニッキングＨＤＡ」とも称され得る。

本発明による方法及びキットは、短いＤＮＡ配列、好ましくは４００ｂｐ未満、より好ましくは２００ｂｐ未満、さらにより好ましくは１５０ｂｐ以下、最も好ましくは７０ｂｐから１２０ｂｐの間の配列の増幅及び検出に特に有用である。典型的には、本発明の方法及びキットを用いて、二本鎖核酸を増幅するか又は検出する。しかしながら、実体的なＨＤＡに基づく増幅が開始する前に、一本鎖核酸が、ポリメラーゼを用いて核酸二重鎖、即ち二本鎖鋳型に転写される限り、そのような一本鎖核酸もまた、増幅及び検出することが出来る。

特に、本発明は、鋳型核酸を増幅するための方法であって、
前記方法は、ニッキング・エンドヌクレアーゼの存在下で、ヘリカーゼ依存性増幅（ＨＤＡ）反応を用いて、前記鋳型核酸を増幅することを含み、
前記鋳型核酸が前記ニッキング・エンドヌクレアーゼによって認識される配列を含むか、又は前記ニッキング・エンドヌクレアーゼによって認識される配列が前記ＨＤＡ反応中に前記鋳型核酸内に導入される、
方法に関する。

方法及びキットは、様々な鋳型核酸、好ましくは二本鎖核酸に用いることが出来る。典型的には、本発明のキット及び方法を用いて、ＤＮＡが増幅及び／又は検出される。従って、本発明の場合、鋳型核酸は、好ましくは二本鎖核酸であり、より好ましくはＤＮＡである。

増幅又は検出され得る配列は、例えば、直鎖又は環状ＤＮＡ中に存在するものであってもよい。ＤＮＡは、例えば、ゲノムＤＮＡ、例えば微生物ゲノムＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ及びｃＤＮＡから選択されてもよい。鋳型は、ＲＮＡ、特にｍＲＮＡから逆転写されてもよい。

本発明の場合、「ｄｓＤＮＡ」及び「ＤＮＡ」二重鎖は二本鎖ＤＮＡに関連し、「ｓｓＤＮＡ」は一本鎖ＤＮＡに関連し、「ｄｓＲＮＡ」は二本鎖ＲＮＡに関連し、かつ「ｓｓＲＮＡ」は一本鎖ＲＮＡに関連する。

ｄｓＲＮＡ又はＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドの如きその他核酸もまた、本発明のキット及び方法を用いて増幅することが出来る。ＨＤＡの前に、逆転写又はインビトロ転写の如きその他酵素工程を実施し、処理可能な核酸を形成してもよい。

本発明は、増幅しようとする鋳型核酸中に、ニッキング・エンドヌクレアーゼによって認識される配列が存在することを必要とする。増幅しようとする全ての標的配列が、このようなニッキング・エンドヌクレアーゼ認識配列を含む訳ではないため、適切なプライマーによって、このような配列が導入され得る。

従って、本発明の方法の好ましい実施形態においては、ニッキング・エンドヌクレアーゼによって認識される配列が、ニッキング・エンドヌクレアーゼによって認識される配列を含むオリゴヌクレオチド・プライマーを用いて、鋳型核酸に導入される。

特定の実施形態においては、ニッキング・エンドヌクレアーゼによって認識される配列を含むプライマーは、鋳型核酸にハイブリダイズしない５’タグ配列を含み、かつニッキング・エンドヌクレアーゼによって認識される配列が前記タグ配列に存在する。このようなプライマーは、本明細書において、「タグ化プライマー」と称され、これに対応する実施形態が図２に模式的に図示されている。

また、変異プライマー、即ち元の鋳型配列に１００％相補的ではないプライマーを用いることにより、ニッキング・エンドヌクレアーゼの適切な認識配列を導入してもよい。

本発明のＨＤＡ反応は、好ましくは好熱性ＨＤＡ（ｔＨＤＡ）であり、即ち用いられる酵素は、前記方法の温度で熱安定性である。熱安定性酵素は、典型的には、熱安定性生物に由来する酵素である。従って、本発明の方法は、好ましくは、６０℃を超える、より好ましくは６０℃から７０℃の間、さらにより好ましくは、６０℃から６５℃の間、最も好ましくは約６４℃から約６５℃の温度で実施される。前記温度は、例えば水槽、加熱ブロック、インキュベーター又はサーモサイクラーを用いて維持し得る。

本発明の方法は、一般的に、等温法であり、これは、前記方法が、例えばＰＣＲのように温度サイクリングの必要無しに、単一温度で実施されることを意味する。しかしながら、本発明の特定の実施形態においては、実際の一定反応温度で反応を実施する前に、典型的には９０℃を超える、好ましくは約９５℃の高温による熱変性工程が含まれてもよい。単一温度で実施される「一工程」プロトコルに対して、これを、以下、「二工程」反応と称する。特定の状況下では、二工程プロトコルが、より高い感度を生じ得る。従って、本発明の場合、二工程プロトコルが好ましい。

原理的には、本発明によるニッキングＨＤＡ法においては、鋳型核酸は、ヘリカーゼ、ポリメラーゼ、ニッキング酵素、並びに適切なフォワード・オリゴヌクレオチド・プライマー及びリバース・オリゴヌクレオチド・プライマーの存在下でインキュベートされる。さらに、増幅反応のため、ｄＮＴＰ、ＡＴＰ又はｄＡＴＰ及びマグネシウムイオンの如きさらなる試薬が存在する必要がある。反応混合物は、好ましくはまた緩衝剤、並びにＮａＣｌ及び／又はＫＣｌの如き塩も含む。

個々の酵素及び試薬は、増幅開始前に一緒に添加してもよいし、又は順に添加してもよい。幾つかの特定の実施形態においては、ニッキング・エンドヌクレアーゼは、その他の成分を添加した後に添加される。２工程プロトコルの好ましい実施形態においては、最初の熱変性工程の後に酵素が添加される。

「プライマー」と云う用語は、標的核酸上の一本鎖領域に結合し、標的核酸のポリメラーゼ依存性複製を促進することが可能な一本鎖核酸を指す。本発明の場合、１又は２以上のプライマーが鋳型核酸に対して添加される。１つのプライマーを用いると線形増幅に繋がるのに対し、２又は３以上のプライマーを用いると指数関数的増幅が生じる。

「ヘリカーゼ」と云う用語は、本明細書において、二本鎖核酸を酵素的に巻き戻し可能な任意の酵素を指す。例えば、ヘリカーゼは、全ての生物において、かつ複製、組換え、修復、転写、翻訳及びＲＮＡスプライシングの如き核酸を伴う全てのプロセスに見出される酵素である［コーンバーグ（Ｋｏｒｎｂｅｒｇ）及びベーカー（Ｂａｋｅｒ）、「ＤＮＡ複製（ＤＮＡ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）」、Ｗ．Ｈ．フリーマン・アンド・カンパニー（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ）（第２版（１９９２））、特にチャプター１１］。５’から３’方向に、又は反対に３’から５’方向に、ＤＮＡ又はＲＮＡに沿って移動する、任意のヘリカーゼが本発明の本実施形態において用いられ得る。これには、原核生物、ウイルス、古細菌、及び真核生物から得られるヘリカーゼ、又は天然に存在する酵素の組換え型、並びに前記特定の活性を有するアナログ又は誘導体が含まれる。コーンバーグ及びベーカーによって、彼らの本、「ＤＮＡ複製」、Ｗ．Ｈ．フリーマン・アンド・カンパニー（第２版（１９９２））のチャプター１１に記載される天然に存在するＤＮＡヘリカーゼの例には、エシェリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ヘリカーゼＩ、ＩＩ、ＩＩＩ及びＩＶ、Ｒｅｐ、ＤｎａＢ、ＰｒｉＡ、ＰｃｒＡ、Ｔ４ Ｇｐ４１ヘリカーゼ、Ｔ４ Ｄｄａヘリカーゼ、Ｔ７ Ｇｐ４ヘリカーゼ、ＳＶ４０ラージＴ抗原、酵母（ｙｅａｓｔ）ＲＡＤが含まれる。ＨＤＡにおいて有用であり得るさらなるヘリカーゼには、ＲｅｃＱヘリカーゼ［ハーモン（Ｈａｒｍｏｎ）及びコワルチコウスキー（Ｋｏｗａｌｃｚｙｋｏｗｓｋｉ），ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ，Ｃｈｅｍ．）２７６：２３２−２４３（２００１）］、Ｔ．テングコンゲンシス及びＴ．サーモフィルス由来の熱安定性ＵｖｒＤヘリカーゼ［コリンズ（Ｃｏｌｌｉｎｓ）及びマッカーシー（ＭｃＣａｒｔｈｙ），エクストリーモファイルズ(Ｅｘｔｒｅｍｏｐｈｉｌｅｓ．)７：３５−４１．（２００３）］、Ｔ．アクアティクス由来の熱安定性ＤｎａＢヘリカーゼ［カプラン（Ｋａｐｌａｎ）及びスタイツ（Ｓｔｅｉｔｚ），ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．）２７４： ６８８９−６８９７（１９９９）］、並びに古細菌及び真核生物由来のＭＣＭヘリカーゼ［グレインジ（Ｇｒａｉｎｇｅ）ら，ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．）３１：４８８８−４８９８（２００３）］が含まれる。

一般的に５’から３’方向に複製するヘリカーゼの例は、Ｔ７ Ｇｐ４ヘリカーゼ、ＤｎａＢヘリカーゼ及びＲｈｏヘリカーゼであるのに対し、３’から５’方向に複製するヘリカーゼの例には、ＵｖｒＤヘリカーゼ、ＰｃｒＡ、Ｒｅｐ、ＨＣＶのＮＳ３ ＲＮＡヘリカーゼが含まれる。

ヘリカーゼは、補因子、即ちヘリカーゼ巻き戻し活性に必要な小分子物質を必要とし得る。ヘリカーゼ補因子には、ヌクレオシド三リン酸（ＮＴＰ）及びデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）及びマグネシウム（又はその他二価カチオン）が含まれる。例えば、ＡＴＰ（アデノシン三リン酸）が、０．１から１００ｍＭの範囲で、好ましくは１から１０ｍＭの範囲で（例えば３ｍＭで）、ＵｖｒＤヘリカーゼの補因子として用いられ得る。同様に、ｄＴＴＰ（デオキシチミジン三リン酸）が、１から１０ｍＭの範囲で（例えば３ｍＭで）、Ｔ７ Ｇｐ４Ｂヘリカーゼの補因子として用いられ得る。

本発明の幾つかの実施形態においては、特に非好熱性ＨＤＡに関して、ヘリカーゼ活性を促進するために、トポイソメラーゼの如きさらなるタンパク質、又は一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（single-stranded DNA binding protein；SSB）の如き補助タンパク質が反応に存在してもよい。ヘリカーゼは、一本鎖結合タンパク質（ＳＳＢ）の存在下で、向上した活性を示す。これらの状況において、ＳＳＢの選択は、一般的に、特定のタンパク質に限定されない。一本鎖結合タンパク質の例は、Ｔ４遺伝子３２タンパク質、エシェリキア・コリ(E. coli)ＳＳＢ、Ｔ７ ｇｐ２．５ ＳＳＢ、ファージ・ファイ２９ ＳＳＢ［コーンバーグ及びベーカー、前記（１９９２）］、並びに前述のものの切断型がある。熱安定性ヘリカーゼを用いる場合、１又は２以上のＳＳＢ又はその他補助タンパク質の存在は任意である。

ＨＤＡ及びｔＨＤＡに用いるための、ヘリカーゼ及びヘリカーゼを含む調製物は、ＥＰ−Ｂ１ １ ５３９ ９７９、特にセクション［００３９］から［００６６］に、より詳細に記載されている。

本発明によるニッキングＨＤＡ増幅反応は、好ましくは、５０℃を超える、好ましくは５０℃から７０℃の間、より好ましくは６０℃から６５℃の間の温度で実施される。

本発明の場合、ヘリカーゼは、異なるファミリーのヘリカーゼ由来であってもよい。ヘリカーゼは、好ましくは、スーパーファミリーＩヘリカーゼ、スーパーファミリーＩＩヘリカーゼ、スーパーファミリーＩＩＩヘリカーゼ、ｄｎａＢ様スーパーファミリー由来のヘリカーゼ又はＲｈｏ様スーパーファミリー由来のヘリカーゼからなる群から選択される。ヘリカーゼは、中温性生物又は熱耐性生物に由来するものであってもよい。ヘリカーゼは、遺伝子操作されていてもよいし、又は化学修飾されていてもよい。スーパーファミリーＩヘリカーゼには、例えば、ｄｄａ、ｐｃｒＡ、Ｆ−プラスミドｔｒａＩタンパク質ヘリカーゼ及びＵｖｒＤが含まれる。スーパーファミリーＩＩヘリカーゼには、例えばｒｅｃＱ及びＮＳ３ヘリカーゼが含まれる。スーパーファミリーＩＩＩヘリカーゼには、例えばＡＡＶ ｒｅｐヘリカーゼが含まれる。ｄｎａＢ様スーパーファミリー由来のヘリカーゼには、例えばＴ７ファージヘリカーゼが含まれる。本発明の方法及びキットの場合、ヘリカーゼが熱安定性ヘリカーゼであることが好ましい。熱安定性Ｔｔｅ−ＵｖｒＤヘリカーゼが好ましい。

長ＨＤＡ(long HAD)反応においては、トポイソメラーゼを用い、ＨＤＡが長い標的アンプリコンを増幅する能力を増加させることも出来る。非常に長い直鎖ＤＮＡ二重鎖をヘリカーゼによって分離する場合、トポイソメラーゼの旋回（弛緩）機能がねじれを取り除き、巻き過ぎた状態を回避する[コーンバーグ及びベーカー、前記（１９９２）]。例えば、エシェリキア・コリ(E. coli)のトポイソメラーゼＩ［ファーメンタス（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）、リトアニア・ビリニュス］を用い、一方のＤＮＡ鎖内にニックを導入することによって、負の超らせん構造をとったＤＮＡを弛緩させることも出来る。これに対して、エシェリキア・コリ(E. coli)のＤＮＡジャイレース（トポイソメラーゼＩＩ）は、一過性の二本鎖中断をＤＮＡに導入し、ＤＮＡ鎖が互いに通り抜けるのを可能にする［コーンバーグ及びベーカー、前記（１９９２）］。

原理的には、所望の反応温度において、活性がある、つまり遊離３’−ＯＨ末端を伸長させることが出来る、あらゆるポリメラーゼが選択され得る。また、プルーフリーディング機能、エンドヌクレアーゼ活性、鎖置換活性及び／又は逆転写酵素活性の如きさらなる機能を有するポリメラーゼも、本発明の場合、用いられ得る。ポリメラーゼは、処理能力及び鎖置換活性に基づいて、ＨＤＡのために選択する。融解及びプライマーとのハイブリダイゼーションに続いて、核酸を重合工程に供する。増幅しようとする核酸がＤＮＡである場合、ＤＮＡポリメラーゼを選択する。最初の標的がＲＮＡである場合、最初に逆転写酵素を用い、ＲＮＡ標的をｃＤＮＡ分子にコピーし、次いで、選択したＤＮＡポリメラーゼによって、ＨＤＡにおいてｃＤＮＡをさらに増幅する。ＤＮＡポリメラーゼは、標的核酸に作用し、４つのｄＮＴＰの存在下で核酸鋳型にハイブリダイズしたプライマーを伸長させ、核酸鋳型上のヌクレオチド配列に相補的なプライマー伸張産物を形成する。

ＤＮＡポリメラーゼは、５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を欠き、かつ３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を任意に欠いていてもよい、ポリメラーゼの群から選択される。

適切なＤＮＡポリメラーゼの例には、エシェリキア・コリ（E. coli）ＤＮＡポリメラーゼＩのエキソヌクレアーゼ欠損クレノウ・フラグメント[ニュー・イングランド・バイオラボ社（マサチューセッツ州ビバリー）] 、エキソヌクレアーゼ欠損Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼ[シーケナーゼ（Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ）；ＵＳＢ（オハイオ州クリーブランド）] 、エシェリキア・コリ（E. coli）ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ・フラグメント[ ニュー・イングランド・バイオラボ社（マサチューセッツ州ビバリー）] 、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼのラージ・フラグメント[ニュー・イングランド・バイオラボ社（マサチューセッツ州ビバリー）]、クレンタック（ＫｌｅｎＴａｑ）ＤＮＡポリメラーゼ[ＡＢペプチド（ＡＢ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ）、（ミズーリ州セントルイス）]、Ｔ５ ＤＮＡポリメラーゼ（米国特許第５，７１６，８１９号）、及びＰｏｌ ＩＩＩ ＤＮＡポリメラーゼ（米国特許第６，５５５，３４９号）が含まれる。エシェリキア・コリ（E. coli）ＤＮＡポリメラーゼＩのエキソヌクレアーゼ欠損クレノウ・フラグメント、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼのラージ・フラグメント、及びシーケナーゼの如き、鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼは、本発明の場合に好ましい。Ｔ７ポリメラーゼは、Ｔａｑポリメラーゼより有意に低い、３．５×１０⁵のエラー率を有する、高忠実度ポリメラーゼである[ケハボン（Ｋｅｏｈａｖｏｎｇ）及びシリー（Ｔｈｉｌｌｙ），米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）８６，９２５３−９２５７（１９８９）]。しかしながら、Ｔ７ポリメラーゼは熱安定性ではないので、熱サイクリングを必要とする増幅系で用いるのには最適ではない。等温で実施可能なＨＤＡにおいては、Ｔ７シーケナーゼが、ＤＮＡ増幅のための好ましいポリメラーゼの１つである。

本発明の方法及びキットの場合、ポリメラーゼは、好ましくは熱安定性ポリメラーゼである。好ましくは、ポリメラーゼは、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ、パイロファージ（ＰｙｒｏＰｈａｇｅ）ポリメラーゼ、ディスプレスエース（ＤｉｓｐｌａｃｅＡｃｅ）ポリメラーゼ及びベント（Ｖｅｎｔ）（エキソ−;exo-）ポリメラーゼからなる群から選択される。それほどエキソヌクレアーゼ活性を有さないポリメラーゼが好ましい。

一般に、ＨＤＡ及びニッキングＨＤＡに用いるのに適当なプライマーは、例えば１０ヌクレオチドを超え、かつ５０ヌクレオチドより少ない長さを有する、短い合成オリゴヌクレオチドである。オリゴヌクレオチド・プライマーの設計は、文字列（ｓｔｒｉｎｇ）に基づくアラインメント・スコア、融解温度、プライマー長、及びＧＣ含量等の多様なパラメータを伴う[カンプケ（Ｋａｍｐｋｅ）ら，バイオインフォマティクス（Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ）１７：２１４−２２５（２００３）]。プライマーを設計する際、重要なファクターの１つは、標的断片内に、増幅しようとする核酸分子に特異的な配列を選択することである。その他の重要なファクターは、ＨＤＡ反応のためのプライマーの融解温度を決定することである。プライマーの融解温度は、そのオリゴヌクレオチドの長さ及びＧＣ含量によって決定される。好ましくは、プライマーの融解温度は、ハイブリダイゼーション及び増幅が生じる温度の範囲内である。例えば、エシェリキア・コリ（E. coli）ＵｖｒＤヘリカーゼ調製物を用いる際に、ハイブリダイゼーション及び増幅の温度を３７℃に設定するならば、この反応のために設計されるプライマー対の融解温度は、約３０℃〜５０℃の間の範囲でなければならない。ハイブリダイゼーション及び増幅の温度が６０℃ならば、この反応のために設計されるプライマー対の融解温度は、５５℃〜７０℃の間、好ましくは５５℃〜６５℃の間の範囲でなければならない。反応温度より遥かに高い融解温度を有するプライマーは、非特異的副反応を生じる可能性もあるので、あまり好ましくない。ＨＤＡ反応のための最適なプライマーを選択するため、様々な融解温度を有するプライマーセットを、平行アッセイにおいて試験してもよい。プライマー設計に関するさらなる情報は、カンプケ(Kampke)ら，バイオインフォマティクス（Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ）１７：２１４−２２５（２００３）に記載される。各プライマーは、標的核酸の各末端にハイブリダイズし、標的ヌクレオチド配列を鋳型として用いてポリメラーゼによって３’から５’方向に伸長され得る。ハイブリダイゼーションの条件は、「分子クローニング及び実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」第２版、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）、リッチ（Ｒｉｃｈ）及びマニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）監修、コールドスプリングハーバー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ）（２００３）に記載される通り標準的なものである。特異的増幅を達成するためには、相同プライマー又は完全にマッチしたプライマーが好ましい。しかしながら、プライマーは、５’末端に、標的ヌクレオチド配列（単数又は複数）に非相補的な配列を含んでもよい。或いは、プライマーは、標的核酸に正確に相補的でないヌクレオチド又は配列を全体に含有してもよい。プライマーは、所定の温度で、プライマーと鋳型との結合によって特異的ハイブリダイゼーションを達成し得る限り、類似プライマーであってもよく、或いはＨＤＡに用いるための非特異的プライマー又はユニバーサル・プライマーであってもよい。

プライマーには、デオキシリボヌクレオチド塩基Ａ、Ｔ、Ｇ若しくはＣ、並びに／又は１又は２以上のリボヌクレオチド塩基、Ａ、Ｃ、Ｕ、Ｇ、並びに／又は１又は２以上の修飾ヌクレオチド（デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド）の何れかを含んでよいが、修飾は核酸に対するプライマーのハイブリダイゼーション、又はプライマーの伸長、又は二本鎖分子の変性を妨げない。プライマーを、ホスホロチオエート若しくはメチルホスホネートの如き化学基、又は非ヌクレオチドリンカーで修飾し、プライマーの性能を強化したり、或いは増幅産物の特性解析を容易にしてもよい。

増幅産物を検出するために、プライマーは、蛍光標識又は化学発光標識、及びビオチン化の如き修飾を施してもよい。その他標識法には、放射性同位体、発色基（クロモフォア）、並びに直接検出可能でないが、特異的結合パートナー、例えばそれぞれアビジン及び抗体の標識型との反応によって、容易に検出可能である、ビオチン又はハプテンの如きリガンドが含まれる。本明細書に記載されるプライマーは、当業者に知られる方法によって調製されてもよい（例えば、米国特許第６，２１４，５８７号を参照されたい）。幾つかの実施形態においては、一方は標的配列の５’境界にハイブリダイズし、かつもう一方は標的の３’境界にハイブリダイズする、２つの配列特異的プライマーの対を、本発明の方法で用い、標的配列の指数関数的増幅を達成する。このアプローチは、リー（Ｌｅｅ）ら[ジャーナル・オブ・モケキュラー・バイオロジー（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．）３１６:１９−３４（２００２）]のものからは容易に区別可能である。多重反応において、異なる検出タグを用いて、複数の標的を同時に増幅するために、単一のＨＤＡ反応において、複数のプライマー対を利用してもよい。多重化は、ＳＮＰ解析において、並びに、病原体を検出する際に、一般的に用いられる[ジェシング（Ｊｅｓｓｉｎｇ）ら，ジャーナル・オブ・クリニカル・マイクロバイオロジー（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．）４１：４０９５−４１００（２００３）]。

ｔＨＤＡプライマーは、例えば、プライマークエスト（ＰｒｉｍｅｒＱｕｅｓｔ）プログラム（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｄｔｄｎａ．ｃｏｍ／Ｓｃｉｔｏｏｌｓ／Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ／Ｐｒｉｍｅｒｑｕｅｓｔ／Ａｄｖａｎｃｅｄ．ａｓｐｘ）又はプライマー３プログラム（ｈｔｔｐ：／／ｆｒｏｄｏ．ｗｉ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｐｒｉｍｅｒ３／ｐｒｉｍｅｒ３＿ｗｗｗ．ｃｇｉ）を用いて設計することが出来る。

本明細書において、「ニッキング」は、ニッキングを行う酵素によって認識される、ヌクレオチド配列に対して特定の位置における、完全二本鎖核酸分子、又は部分的二本鎖核酸分子の二本鎖部分の、一方の鎖のみの切断を指す。核酸がニッキングされる特定の位置を「ニッキング部位」と称する。

「ニッキング・エンドヌクレアーゼ」とは、完全に又は部分的に二本鎖である核酸分子の特定のヌクレオチド配列を認識し、かつ認識配列に対して特定の位置で、核酸分子の一方の鎖のみを切断する酵素である。「ニッキング・エンドヌクレアーゼ」は、本明細書において、完全に又は部分的に二本鎖である核酸分子のヌクレオチド配列を認識し、かつ認識配列に対して特定の位置で、核酸分子の一方の鎖のみを切断するエンドヌクレアーゼを指す。制限エンドヌクレアーゼは、典型的には、天然ヌクレオチドのみで構成されるヌクレオチド配列を認識し、かつ前記ヌクレオチド配列を含有する、完全に又は部分的に二本鎖である核酸の一方の鎖のみを切断する。

本発明記載の方法及びキットの場合には、ニッキング・エンドヌクレアーゼは、好ましくは、熱安定性ニッキング・エンドヌクレアーゼである。ニッキング・エンドヌクレアーゼは、例えばニュー・イングランド・バイオラボ（ＮＥＢ）等から市販されている。好ましくは、ニッキング・エンドヌクレアーゼは、Ｎｂ．ＢｓｍＩ、Ｎｔ．ＢｓｔＮＢＩ、Ｎｔ．ＣｖｉＰＩＩ、Ｎｂ．ＢｂｖＣＩ、Ｎｂ．ＢｓｒＤＩ、Ｎｂ．ＢｔｓＩ、Ｎｔ．ＢｓｍＡＩ、Ｎｔ．ＢｂｖＣＩ、Ｎｔ．ＢｓｐＱＩ及びＮｔ．ＡｌｗＩからなる群から選択される。Ｎｂ．ＢｓｍＩ及びＮｔ．ＢｓｔＮＢＩが特に好ましいニッキング・エンドヌクレアーゼである。例えば遺伝子操作標準的制限エンドヌクレアーゼによって得られるニッキング・エンドヌクレアーゼもまた、本発明の場合において用いることが出来る。Ｎｂ．ＢｓｍＩは、二本鎖ＤＮＡ基質上のＤＮＡの一方の鎖のみを切断するニッキング・エンドヌクレアーゼであり、前記酵素は、配列５’−ＧＡＡＴＧＣ−３’を認識し、５’−Ｇ／ＣＡＴＴＣ−３’のようにスラッシュによって示される通り、相補鎖上で切断する。Ｎｔ．ＢｓｔＮＢＩは、二本鎖ＤＮＡ基質上のＤＮＡの一方の鎖のみを切断する、部位特異的エンドヌクレアーゼであり、前記酵素は、認識配列５’−ＧＡＧＴＣ−３’の３’側を４塩基超えた単一鎖切断を触媒する。

本発明で用いる反応温度に応じて、その温度で活性である、適切なニッキング・エンドヌクレアーゼを選択する。

「タグ配列を含むプライマー」（「タグ化プライマー」）の場合、「ニッキング・エンドヌクレアーゼによって認識される配列」（「ニッキング・エンドヌクレアーゼ認識配列」）は、タグ配列中に完全又は部分的にあってもよい。切断部位はまた、タグ配列中にあってもよいし、或いは１又は数塩基対（ｂｐ）上流又は下流にあってもよい。切断部位（「ニッキング部位」）は、示す認識配列と同じ鎖上にあってもよいし、又はもう一方の鎖上にあってもよい。

本発明の方法は、一実施形態において、以下の工程を含むように記載され得る：
（ｉ）二本鎖鋳型核酸を提供すること、
（ｉｉ）鋳型核酸を、二本鎖鋳型核酸を巻き戻すためのヘリカーゼと接触させ、少なくとも部分的に一本鎖である鋳型核酸を形成すること、
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）の一本鎖鋳型にハイブリダイズさせるためのオリゴヌクレオチド・プライマーを添加すること、但し、少なくとも１つのオリゴヌクレオチド・プライマーがニッキング・エンドヌクレアーゼによって認識される配列を含む、
（ｉｖ）ポリメラーゼを用いて、一本鎖鋳型核酸に相補的であるオリゴヌクレオチド・プライマーの伸長産物を合成し、二本鎖鋳型核酸を形成すること、
（ｖ）工程（ｉｖ）で合成した二本鎖鋳型核酸を、鋳型核酸中にニックを導入するためのニッキング・エンドヌクレアーゼと接触させること、
（ｖｉ）工程（ｖ）の鋳型核酸を、二本鎖鋳型核酸を巻き戻すためのヘリカーゼと接触させ、少なくとも部分的に一本鎖である鋳型核酸を形成すること、
（ｖｉｉ）工程（ｖｉ）の一本鎖鋳型にハイブリダイズさせるためオリゴヌクレオチド・プライマーを添加すること、
（ｖｉｉｉ）ポリメラーゼを用いて、一本鎖鋳型核酸に相補的である、オリゴヌクレオチド・プライマーの伸長産物を合成し、二本鎖鋳型核酸を形成すること、
（ｉｘ）必要に応じて、工程（ｖ）から（ｖｉｉｉ）を反復し、鋳型核酸を増幅すること。

一本鎖鋳型核酸を増幅しようとする場合、例えば逆転写又はインビトロ転写によって、前記鋳型核酸を二本鎖核酸に転写しなければならない。

本発明の方法の特定の実施形態においては、ニッキング・エンドヌクレアーゼによって認識される、オリゴヌクレオチド・プライマーの配列は、鋳型核酸にハイブリダイズしない５’タグ配列に存在し、かつ前記方法は、工程（ｉｖ）及び（ｖ）の間に、以下の工程をさらに含む：
（ａ）工程（ｉｖ）の鋳型核酸を、二本鎖鋳型核酸を巻き戻すためのヘリカーゼと接触させ、少なくとも部分的に一本鎖である鋳型核酸を形成すること、
（ｂ）工程（ａ）の一本鎖鋳型にハイブリダイズさせるためオリゴヌクレオチド・プライマーを添加すること、
（ｃ）ポリメラーゼを用いて、一本鎖鋳型核酸に相補的である、オリゴヌクレオチド・プライマーの伸長産物を合成し、二本鎖鋳型核酸を形成すること。

図２には、タグ化プライマーを用いた、ＤＮＡに対するニッキングｔＨＤＡ反応の経過が模式的に示されているが、工程Ａでは、ｄｓＤＮＡ（「標的ＤＮＡ」、「鋳型ＤＮＡ」）を、ヘリカーゼによって巻き戻し、プライマー対が一本鎖ＤＮＡに結合する。プライマーの一方は、鋳型ＤＮＡにハイブリダイズしない５’タグ配列を有する。ＤＮＡポリメラーゼは、プライマーから始まる相補鎖の合成を開始する。工程Ｂでは、２つの二本鎖産物ＤＮＡが形成され、即ち、非タグ化プライマーに基づく産物１は鋳型ＤＮＡに相当し、工程Ａにおける反応に再び進入し、産物１’はタグ配列を含み、ヘリカーゼによって巻き戻される。工程Ｃでは、産物１’の相補鎖がＤＮＡポリメラーゼによって合成される。工程Ｄでは、一方の鎖が産物１’を生じ、工程Ｃにおける反応に再び進入し、もう一方の鎖は、機能するニッキング部位及びニッキング酵素認識配列を有するタグ配列を含む産物２を導く。工程Ｅでは、産物２の一方の鎖がニッキング部位で切断され、もう一方の末端からヘリカーゼによって巻き戻される。ＤＮＡポリメラーゼは、切断部位で３’末端を伸長し、鎖を置換する[「鎖置換増幅」（ＳＤＡ）]。プライマーは、もう一方の鎖に結合し、ＤＮＡポリメラーゼによって伸長される。工程Ｆでは、プライマー伸張は２つの産物を生じ、産物３はタグ配列を含み、産物３’はタグ配列を含まない。産物３は、再び、ニッキング部位で切断され、相補鎖が合成される。産物３’は、ヘリカーゼによって巻き戻される。工程Ｇ１では、産物３の増幅によって、工程Ｇ１に再び進入する産物３、及び工程Ｇ２に進入する産物３’が導かれる。工程Ｇ２では、両方のｓｓＤＮＡ鎖に対する相補鎖が合成され、それぞれ、工程Ｅ及びＧ２の反応に再び進入する、産物２及び３’が生じる。反応全体で、産物３の集積が導かれる。ハイブリダイゼーションプローブ、例えば増幅産物の逆鎖に相補的なものを用いて、産物を検出することが出来る。

図３には、非タグ化プライマーを用いた、ＤＮＡに対するニッキングｔＨＤＡ反応の経過が模式的に示されているが、工程Ａでは、少なくとも１つのプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、ヘリカーゼ及びニッキング・エンドヌクレアーゼを含む反応混合物をｄｓＤＮＡに添加する。プライマーは、ニッキング・エンドヌクレアーゼの認識配列を含む。ｄｓＤＮＡは、ヘリカーゼによって巻き戻され、プライマーが一本鎖にハイブリダイズし、伸長される。ニッキング・エンドヌクレアーゼ認識部位が一方の鎖に導入される。工程Ｂでは、生じたｄｓＤＮＡがニッキング・エンドヌクレアーゼによって切断される。工程Ｃでは、ヘリカーゼはｄｓＤＮＡを巻き戻し、古いプライマー又は新規に結合したプライマーのいずれかが、ＤＮＡポリメラーゼによって３’末端で伸長される。

以下において、一工程及び二工程のＤＮＡニッキングｔＨＤＡ反応に関する、典型的であるが、単なる例であり、かつこれらに限定されないプロトコルについて要約する。

二工程ｔＨＤＡプロトコル
１．鋳型ＤＮＡ、並びにフォワード・プライマー及びリバース・プライマーを、ｄＮＴＰ、ｄＡＴＰ又はＡＴＰ、マグネシウムイオン（例えば硫酸マグネシウム、ＭｇＳＯ₄として）、トリスＨＣｌ(Tris HCl)の如き緩衝剤、並びにNaCl及び／又はＫＣｌの如き塩を含む適切な水性反応緩衝液に添加する。反応容器として、例えば微量遠心分離機型のものを用いてもよい。
２．反応混合物を変性温度まで加熱し（例えば９５℃で例えば２分間）、任意に４℃に冷却するか又は氷上に置き、次いで短時間、実際の反応温度にする（例えば６４℃又は６５℃で例えば１から３分間）。次いで、任意に、反応混合物を氷上又は４℃に置く。
３．酵素、即ちヘリカーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ及びニッキング酵素を反応混合物に添加する。例えば短時間のボルテックスによって又はピペッティングによって、反応混合物を穏やかに混合してもよい。適切な緩衝液中で酵素を予め混合してもよい。
４．反応混合物を適切な時間、例えば６０〜９０分間、好ましくは６０〜７５分間、反応温度で、例えば６４℃又は６５℃でインキュベートする。

一工程ｔＨＤＡプロトコル
一工程プロトコルについては、二工程プロトコルの工程２をスキップする。工程１の後、直接、工程３に進む。

本発明の方法のための典型的な緩衝液条件は、以下の通りである：
−トリス（Ｔｒｉｓ）：５〜１００ｍＭ、好ましくは１０ｍＭ
−ｐＨ７．５〜９．５、好ましくはｐＨ８．８
−ＫＣｌ：０〜５０ｍＭ、好ましくは５ｍＭ
−ＭｇＳＯ₄：１〜６ｍＭ、好ましくは３．５ｍＭ
−ＮａＣｌ：０〜１００ｍＭ、好ましくは４０ｍＭ
−ｄＮＴＰ：０．１〜１ｍＭ、好ましくは０．４ｍＭ
−（ｄ）ＡＴＰ（即ちｄＡＴＰ及び／又はＡＴＰ）：１〜７ｍＭ、好ましくは３ｍＭ
−プライマー（フォワード）：０．０２〜１．５μＭ、好ましくは０．１μＭ
−プライマー（リバース）：０．０２〜１．５μＭ、好ましくは０．１μＭ
−ニッキング・エンドヌクレアーゼ：０．０１〜１０Ｕ／反応、好ましくは０．５〜３Ｕ／反応（２５μＬ反応）
−ポリメラーゼ：０．３〜３Ｕ／μＬ、好ましくは０．６〜２Ｕ／μＬ
−ヘリカーゼ：１〜１００ｎｇ／μＬ、好ましくは３〜２０ｎｇ／μＬ

任意に、ベタインを、好ましくは１００〜２０００ｍＭ、好ましくは７００〜１２００ｍＭの濃度で添加してもよい。

しかしながら、これらは、単なる例示の条件であり、前記条件は、用いられる特定の酵素、鋳型及び／又はプライマー配列又は温度の如き他のパラメータに応じて調整され得る。

特定の実施形態においては、本発明の方法は、増幅産物を検出する工程をさらに含む。増幅産物は、例えば、ゲル電気泳動、インターカレーター色素、又は特異的オリゴヌクレオチド・プローブを用いて検出し得る。

増幅された核酸産物を、エチジウムブロミド染色、並びに放射標識、蛍光標識、及び酵素からなる群から選択される標識による増幅配列の検出を含む、様々な方法によって、検出してもよい。例えば、ＨＤＡ増幅産物を、ヘアピン構造中、３’末端近傍にフルオロフォアを含むよう設計されたオリゴヌクレオチドである蛍光標識ラックス（ＬＵＸ）商標プライマー（インビトロジェン社、カリフォルニア州カールスバッド）を用いて、リアルタイムで検出してもよい。この立体配置は、本質的に、分離した消光部分なしに、蛍光消光能を与える。プライマーが二本鎖増幅産物に取り込まれると、フルオロフォアは脱消光され、蛍光シグナルの有意な増加を生じる。

オリゴヌクレオチド・プローブは、好ましくは、典型的には共有結合した、蛍光標識、即ち蛍光色素を含む。

特に、蛍光標識プローブを、ＦＡＭ、ＶＩＣ、ＮＥＤ、フルオレセイン、ＦＩＴＣ、ＩＲＤ−７００／８００、ＣＹ３、ＣＹ５、ＣＹ３．５、ＣＹ５．５、ＨＥＸ、ＴＥＴ、ＴＡＭＲＡ、ＪＯＥ、ＲＯＸ、ボディピィＴＭＲ（ＢＯＤＩＰＹ ＴＭＲ）、オレゴン・グリーン、ローダミン・グリーン、ローダミン・レッド、テキサス・レッド、ヤキマ・イエロー、アレクサ・フロー（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ）、及びＰＥＴからなる群から選択される色素で標識されてもよい。

適切なハイブリダイゼーションプローブには、ライトサイクラー（ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ）プローブ（ロシェ（Ｒｏｃｈｅ））、タックマン（ＴａｑＭａｎ）プローブ（ロシェ）、分子ビーコン、スコーピオン（Ｓｃｏｒｐｉｏｎ）プライマー、サンライズ（Ｓｕｎｒｉｓｅ）プライマー、ラックス（ＬＵＸ）プライマー、及びアンプリフルオロ（Ａｍｐｌｉｆｌｕｏｒｅ）プライマーが含まれる。本発明の場合には、タックマンプローブが好ましい。

本発明はまた、
−ニッキング・エンドヌクレアーゼ、
−ヘリカーゼ、及び
−ＤＮＡポリメラーゼ
を含む、核酸を増幅するためのキットにも関する。

本発明の方法に関しては、キットのヘリカーゼは、好ましくは、ｄｄａ、ｐｃｒＡ、Ｆ−プラスミドｔｒａＩタンパク質ヘリカーゼ及びＵｖｒＤの如きスーパーファミリーＩヘリカーゼ、ｒｅｃＱ及びＮＳ３−ヘリカーゼの如きスーパーファミリーＩＩヘリカーゼ、ＡＡＶ ｒｅｐヘリカーゼの如きスーパーファミリーＩＩＩヘリカーゼ、Ｔ７ファージヘリカーゼの如きｄｎａＢ様スーパーファミリー由来のヘリカーゼ、並びにrho様スーパーファミリー由来のヘリカーゼからなる群から選択される。ヘリカーゼが熱安定性ヘリカーゼであることが好ましい。熱安定性Ｔｔｅ−ＵｖｒＤヘリカーゼが特に好ましい。

キットのポリメラーゼは、好ましくは、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ、パイロファージ(PyroPhage)ポリメラーゼ、ディスプレスエース（Displaceace）ポリメラーゼ、及びベント（Exo-）ポリメラーゼからなる群から選択される。

キットのニッキング・エンドヌクレアーゼは、好ましくは、Ｎｂ．ＢｓｍＩ、Ｎｔ．ＢｓｔＮＢＩ、Ｎｔ．ＣｖｉＰＩＩ、Ｎｂ．ＢｂｖＣＩ、Ｎｂ．ＢｓｒＤＩ、Ｎｂ．ＢｔｓＩ、Ｎｔ．ＢｓｍＡＩ、Ｎｔ．ＢｂｖＣＩ、Ｎｔ．ＢｓｐＱＩ、及びＮｔ．ＡｌｗＩからなる群から選択される。

本発明のキットはさらに
−トリス（Tris）の如き緩衝剤、及び／又は
−ｄＮＴＰ、及び／又は
−（ｄ）ＡＴＰ、及び／又は
−リン酸マグネシウムの如きマグネシウム塩、及び／又は
−ＮａＣｌ、及び／又は
−ＫＣｌ
を含んでもよい。

本発明のキットはまた、トポイソメラーゼ及び／又はＳＳＢも含んでもよい。

キットの個々の要素は、１又は２以上の容器中に存在してもよい。２又は３以上の要素が、例えば、１つの容器、例えば反応チューブ又はバイアル中に共に存在してもよい。緩衝剤、塩、ｄＮＴＰ及び存在する場合（ｄ）ＡＴＰは、好ましくは予め混合された溶液中にある存在する。キットはまた、マニュアルも含んでもよい。

本発明はさらに、核酸の増幅及び／又は検出のための、本発明による方法及びキットの使用に関する。前記方法及びキットは、例えば、微生物、ウイルス、病原体、ヒトゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ等の検出に用いられ得る。核酸を検出する試料は、例えば、臨床試料（例えば、血液、血漿、血清及び尿の如き体液）であってもよいし、或いは環境、植物、動物由来、家畜由来、食品又は犯罪現場由来であってもよい。方法及びキットは、例えば、専用実験室で、ポイント・オブ・ケアで、又は野外で用いられ得る。核酸は、増幅前に試料から精製及び／又は単離されてもよいし、或いはこれらは試料中で直接増幅及び／又は検出されてもよい。

以下の実施例は、本発明の特定の実施形態を説明するものであるが、それらに限定されない。

実施例１：タグ化プライマーを用いたニッキングｔＨＤＡ
本実施例において、それぞれ、標準的ｔＨＤＡ及び本発明記載のニッキングｔＨＤＡ法を用いて、ナイセリア・ゴノレア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）ゲノムのポリン遺伝子由来の配列（配列番号１）を増幅し、かつ検出した。
5'ATTTGTTCCGAGTCAAAACAGCAAGTCCGCCTATACGCCTGCTACTTTCACGCTGGAAAGTAATCAGATGAAACCAGTTCCG-3'

ａ）材料：
Ｔｍ：融解温度；標準的ｔＨＤＡ：プライマーＰｏｒＡ Ｆ５及びＰｒｏＡ Ｒ５、プローブＰｏｒＡ５＿ＶＤ５ ＦＡＭ（６−ＦＡＭ及びＢＨＱ１で標識）；ニッキングｔＨＤＡ：プライマーＰｏｒＡ Ｆ５及びＰｒｏＡ ＮＳ、プローブＰｏｒＡ５＿ＶＤ５ ＦＡＭ（６−ＦＡＭ及びＢＨＱ１で標識）

反応混合物：
２．５μＬ １０×アニーリング緩衝液
０．２μＬ ５Ｍ ＮａＣｌ
０．４μＬ ２５ｍＭ ｄＮＴＰ混合物
０．７５μＬ １００ｍＭ ｄＡＴＰ
１μＬ １００ｍＭ ＭｇＳＯ₄
１０×アニーリング緩衝液：
１００ｍＭ ＫＣｌ
２００ｍＭ トリス（Ｔｒｉｓ）／ＨＣｌ ｐＨ８．８

電気泳動用の１２％ポリアクリルアミドゲル：
１２ｍＬ ３０％アクリルアミド／ビスアクリルアミド２９：１
３ｍＬ ＴＢＥ
１３ｍＬ Ｈ₂Ｏ
１５０μＬ １０％ ＡＰＳ
４０μＬ ＴＥＭＥＤ

ａ）方法：
−２２μＬのプレミックス１を８×ＰＣＲストリップ内にピペットで投入した。
−ＰＣＲサイクラー中、９５℃で２分間の変性工程、その後、４℃で直ちに冷却。
−次いでストリップをチューブ・スキャナ（ＥＳＥ ＧｍｂＨ）中、６５℃で１分間インキュベーションした。
−各３μＬのプレミックス２をストリップの蓋にピペットで添加し、前記蓋でしめた後、遠心分離した。
−反応混合物を振盪によって混合し、再び遠心分離し、そしてチューブ・スキャナに入れた。
−次いで、チューブを６５℃で６０分間インキュベートし、蛍光を３０秒ごとに読み取った。
−続いて、各１０μＬの反応をロータージーン（ＲｏｔｏｒＧｅｎｅ）チューブ内に移し、ロータージーンＱ[キアゲン社（ＱＩＡＧＥＮ ＧｍｂＨ）]を用いて融解曲線を測定した（５５〜９５℃、０．５℃増分、５秒間保持）。
−各４μＬの反応を１２％ポリアクリルアミドゲル（７０分間、１４０Ｖ）に投入した。

ｃ）結果
Ｉ）リアルタイム（ニッキング）ｔＨＤＡ：
図４は、チューブ・スキャナでの異なるリアルタイム（ニッキング）ｔＨＤＡ反応の結果（増幅プロット）を示す。経時的蛍光強度の生データを示す。
−全ての非鋳型コントロール反応（non-template control reaction;ＮＴＣ）は、非特異的増幅を示さなかった。
−標準的ｔＨＤＡに関する増幅曲線は、約１５分の上昇（ｔａｋｅ−ｏｆｆ）ポイントを有した。
−Ｎｂ．ＢｓｍＩを含まない（ｗ／ｏ）ニッキングｔＨＤＡに関する増幅曲線は、２４分の上昇ポイントを有し、他の２つの曲線と比較すると、かなり小さい傾斜を有した。
−Ｎｂ．ＢｓｍＩを含む（ｗ／）ニッキングｔＨＤＡに関する増幅曲線は、約１１分の上昇ポイントを有した。

ＩＩ）融解曲線：
図５は、増幅産物の融解曲線を示す。Ａ）標準的ｔＨＤＡ、Ｂ）Ｎｂ．ＢｓｍＩを含まないニッキングｔＨＤＡ、Ｃ）Ｎｂ．ＢｓｍＩを含むニッキングｔＨＤＡ。

標的（鋳型）ＤＮＡを含む全ての反応に関して、融解温度（Ｔｍ）によって、特異的増幅産物を同定してもよい。全てのＮＴＣ反応において、検出可能な増幅産物は観察されなかった。

ＩＩＩ）ポリアクリルアミドゲル：
図６は、増幅及び電気泳動後の各反応混合物のポリアクリルアミドゲルを示す。Ａ）染色前のゲル、Ｂ）ＥｔＢｒでの染色後のゲル。ゲル上の核バンドＢ１〜Ｂ５の内容が、また、図６Ｂ１〜６Ｂ５で模式的に図示されている。

レーン１：ナイセリア・ゴノレアｇＤＮＡ標準的ｔＨＤＡ。
レーン２：ＮＴＣ標準的ｔＨＤＡ。
レーン３：Ｎｂ．ＢｓｍＩを含まないナイセリア・ゴノレアｇＤＮＡニッキングｔＨＤＡ
レーン４：Ｎｂ．ＢｓｍＩを含まないＮＴＣニッキングｔＨＤＡ。
レーン５：Ｎｂ．ＢｓｍＩを含むナイセリア・ゴノレアｇＤＮＡニッキングｔＨＤＡ。
レーン６：Ｎｂ．ＢｓｍＩを含むＮＴＣニッキングｔＨＤＡ。
Ｌ：１０ｂｐラダー（サイズマーカー）。

未染色ゲル上のバンド（図６Ａ）は、蛍光標識プローブによる。これらのバンドは、プライマー及びニッキング・エンドヌクレアーゼの最初の量に対する産物の予期される依存性を示している（Ｂ１〜Ｂ３）。

染色されたゲル上では、ｄｓＤＮＡ増幅産物（Ｂ４、Ｂ５）、並びに未染色ゲル上でもまた視認される、プローブとのハイブリダイゼーション産物（Ｂ１〜Ｂ３）に関して、顕著なバンドが視認出来る。全てのＮＴＣ反応もまたバンドを示すが、この検出様式（プローブとｓｓＤＮＡ逆鎖との特異的ハイブリダイゼーション）では、非特異的な配列であるため、チューブ・スキャナ又はＴｍ解析における偽陽性シグナルは生じなかった。全てのＮＴＣ反応はまた、非染色ゲル中で、プローブとハイブリダイゼーションの指標となるバンドを示さなかった。

実施例２：非タグ化プライマーを用いたニッキングｔＨＤＡ
ａ）標的配列
標的配列（配列番号６）は、ヒトｐ５３遺伝子のｍＲＮＡに由来し、かつ配列ＮＭ００１１２６１１４のヌクレオチド残基３２２〜３９５を含む。

ニッキング・エンドヌクレアーゼによって認識される配列を含むプライマーの設計のため、リバース・プライマーＨＤＡ−ＴＰ５３ｒｅｖの元の配列を修正し、プライマー配列ＨＤＡ−ＴＰ５３ｒｅｖ７を作製した。これにより、酵素Ｎｔ．ＢｓｔＮＢＩのための認識配列を導入した（図７を参照されたい）。

ｂ）ヒトｃＤＮＡからのｐ５３の増幅
材料：
この反応のため、ヒトＲＮＡをｃＤＮＡに転写した。ｔＨＤＡ反応のため、１０ｎｇ ＲＮＡ由来のｃＤＮＡを用いた。反応を、表５に概略する緩衝液（反応混合物）中で行った。

反応混合物を氷上でセットアップし、続いてリアルタイムＰＣＲサイクラー中で６５℃で６０分間行った。

結果：
図８は、ニッキング・エンドヌクレアーゼの濃度に対する反応速度の依存性を図示する。アンプリコンのシグナルが検出可能になる、即ちバックグラウンド・シグナルより有意に高くなるまでの時間を分で示す。より低い濃度のニッキング・エンドヌクレアーゼの存在下では、シグナルは、ニッキング・エンドヌクレアーゼを含まない反応に関するより約５分早く検出されており、反応がより迅速であることを示す。

図９は、標準的ｔＨＤＡ、即ちいかなるニッキング・エンドヌクレアーゼも伴わないｔＨＤＡの増幅曲線（経時的蛍光）を示す。３つの曲線は、ｃＤＮＡ鋳型の存在下で測定され、２つの曲線は、ｃＤＮＡ鋳型の非存在下で測定されている。

図１０は、０．１Ｕのニッキング・エンドヌクレアーゼ、Ｎｔ．ＢｓｔＮＢＩの存在下でのｔＨＤＡの増幅曲線を示す。３つの曲線は、ｃＤＮＡ鋳型の存在下で測定され、２つの曲線は、ｃＤＮＡ鋳型の非存在下で測定されている。

図１１は、ニッキング・エンドヌクレアーゼ、Ｎｔ．ＢｓｔＮＢＩを伴わない標準的ｔＨＤＡ後の融解曲線解析を示す。図９に示す反応を用いて、融解曲線解析を行った。３つの曲線は、ｃＤＮＡ鋳型の存在下で測定され、２つの曲線は、ｃＤＮＡ鋳型の非存在下で測定されている。

図１２は、０．１Ｕのニッキング・エンドヌクレアーゼ、Ｎｔ．ＢｓｔＮＢＩの存在下での標準的ｔＨＤＡ後の融解曲線解析を示す。図１０に示す反応を用いて、融解曲線解析を行った。３つの曲線は、ｃＤＮＡ鋳型の存在下で測定され、２つの曲線は、ｃＤＮＡ鋳型の非存在下で測定されている。

ｃ）ヒトゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）からのｐ５３の増幅
１００ｎｇのヒトゲノムＤＮＡをこの反応に用い、９５℃加熱工程で変性した。表６に概略するような反応緩衝液中で反応を行った。

反応混合物を氷上でセットアップし、続いてリアルタイムＰＣＲサイクラー中で６５℃で６０分間行った。

結果：
図１３は、ニッキング・エンドヌクレアーゼの存在に対する、反応速度の依存性を図示する。アンプリコンのシグナルが検出可能になる、即ちバックグラウンド・シグナルより有意に高くなるまでの時間を分で示す。ニッキング・エンドヌクレアーゼの存在下では、シグナルは、ニッキング・エンドヌクレアーゼを含まない反応に関するより約６分早く検出されており、反応がより迅速であることを示す。

Claims (13)

1. 鋳型核酸を増幅するための方法であって、
   前記方法は、ニッキング・エンドヌクレアーゼの存在下で、ヘリカーゼを用いる増幅（ＨＤＡ）反応を用いて、前記鋳型核酸を増幅することを含み、
   前記鋳型核酸が前記ニッキング・エンドヌクレアーゼによって認識される配列を含むか、又は前記ニッキング・エンドヌクレアーゼによって認識される配列が前記ＨＤＡ反応中に前記鋳型核酸内に導入され、前記ＨＤＡ反応は好熱性ＨＤＡ（ｔＨＤＡ）であり、前記ニッキング・エンドヌクレアーゼによって認識される配列が、前記ニッキング・エンドヌクレアーゼによって認識される配列を含むオリゴヌクレオチド・プライマーを用いて、前記鋳型核酸に導入され、かつ前記増幅される１又は２以上の配列が少なくとも７０ｂｐの長さを有し、かつ４００ｂｐより短い、
   方法。
2. 前記ニッキング・エンドヌクレアーゼによって認識される配列を含むプライマーが、前記鋳型核酸にハイブリダイズしない５’タグ配列を含み、かつ前記ニッキング・エンドヌクレアーゼによって認識される配列が前記タグ配列に存在する、請求項１に記載の方法。
3. 前記鋳型核酸が、二本鎖鋳型核酸である、請求項１〜２の何れか１項に記載の方法。
4. ヘリカーゼが、スーパーファミリーＩヘリカーゼ、スーパーファミリーＩＩヘリカーゼ、スーパーファミリーＩＩＩヘリカーゼ、ｄｎａＢ様スーパーファミリー由来のヘリカーゼ、並びにrho様スーパーファミリー由来のヘリカーゼからなる群から選択される、請求項１〜３の何れか１項に記載の方法。
5. ポリメラーゼが、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ、パイロファージ(PyroPhage)ポリメラーゼ、ディスプレスエース(DisplaceAce)ポリメラーゼ、及びベント(Vent)(exo-)ポリメラーゼからなる群から選択される、請求項１〜４の何れか１項に記載の方法。
6. 前記ニッキング・エンドヌクレアーゼが、Ｎｂ．ＢｓｍＩ、Ｎｔ．ＢｓｔＮＢＩ、Ｎｔ．ＣｖｉＰＩＩ、Ｎｂ．ＢｂｖＣＩ、Ｎｂ．ＢｓｒＤＩ、Ｎｂ．ＢｔｓＩ、Ｎｔ．ＢｓｍＡＩ、Ｎｔ．ＢｂｖＣＩ、Ｎｔ．ＢｓｐＱＩ、及びＮｔ．ＡｌｗＩからなる群から選択される、請求項１〜５の何れか１項に記載の方法。
7. 前記ＨＤＡ増幅反応が、５０℃を超える温度で実施される、請求項１〜６の何れか１項に記載の方法。
8. さらに、最初の熱変性工程を含む、請求項１〜７の何れか１項に記載の方法。
9. さらに、増幅産物を検出する工程を含む、請求項１〜８の何れか１項に記載の方法。
10. 前記増幅産物が、ゲル電気泳動、インターカレーター色素、又は特異的オリゴヌクレオチド・プローブを用いて検出される、請求項９に記載の方法。
11. ニッキング・エンドヌクレアーゼ、
    ヘリカーゼ、及び
    ＤＮＡポリメラーゼ
    を含む、請求項１〜１０の何れか１項に記載の方法で用いるためのキット。
12. 緩衝剤、及び／又は
    ｄＮＴＰ、及び／又は
    （ｄ）ＡＴＰ、及び／又は
    マグネシウム塩、及び／又は
    ＮａＣｌ、及び／又は
    Ｋｃｌ
    をさらに含む、請求項１１に記載のキット。
13. 核酸配列を増幅し、かつ任意に検出するための、請求項１から１０の何れか１項に記載の方法又は請求項１１又は１２の何れか１項に記載のキットの使用。