JP5827701B2

JP5827701B2 - Immunodetection method for influenza virus H5 subtype

Info

Publication number: JP5827701B2
Application number: JP2014004593A
Authority: JP
Inventors: 宏喜田; 義博迫田; 靖治難波
Original assignee: BL KK
Current assignee: BL KK
Priority date: 2005-08-19
Filing date: 2014-01-14
Publication date: 2015-12-02
Anticipated expiration: 2026-08-18
Also published as: JPWO2007021002A1; JP5525688B2; WO2007021002A1; JP2014095720A

Description

本発明は、インフルエンザウイルスＨ５亜型のエンベロープ表面上の分子であるヘマグルチニン (HA) 蛋白に対する抗体を用いたインフルエンザウイルスＨ５亜型の免疫検出法、詳しくは、サンドイッチ式免疫測定法、特に、イムノクロマトグラフィー測定法およびイムノクロマト法テストストリップに関するものであり、高病原性鳥インフルエンザウイルスなどのインフルエンザウイルスＨ５亜型の感染を迅速かつ簡便に診断するために有用な検出法に関する。 The present invention relates to a method for immunodetection of influenza virus H5 subtype using an antibody against hemagglutinin (HA) protein, which is a molecule on the envelope surface of influenza virus H5 subtype, and in particular, sandwich immunoassay, particularly immunochromatography. The present invention relates to a measurement method and an immunochromatographic test strip, and relates to a detection method useful for diagnosing infection of influenza virus H5 subtype such as highly pathogenic avian influenza virus quickly and easily.

高病原性鳥インフルエンザは、鶏などに高致死性の病原性を示すインフルエンザウイルスによる感染症で、家きんペストとも呼ばれ、わが国では家畜伝染病予防法の法定伝染病に指定されており、世界獣医事務局（ＯＩＥ）ではリストＡ疾病として掲げられている。 Highly pathogenic avian influenza is an infectious disease caused by influenza virus that is highly lethal to chickens, and is also called poultry plague. In Japan, it is designated as a legal infectious disease in the Livestock Infectious Disease Prevention Law. Listed as List A disease by the Veterinary Secretariat (OIE).

今までに高病原性鳥インフルエンザを引き起こしたインフルエンザウイルスはインフルエンザＡ型ウイルスのＨ５亜型及びＨ７亜型のみである。これらの亜型が総て強毒性であるわけではないが、わが国では、強毒性及び弱毒性であるかにかかわらずこれらの亜型に家畜が感染した場合、すべて屠殺処分することとされている。 To date, the only influenza viruses that have caused highly pathogenic avian influenza are H5 and H7 subtypes of influenza A virus. Although not all of these subtypes are highly toxic, in Japan, all livestock infected with these subtypes, regardless of whether they are strong or weakly toxic, are to be slaughtered. .

Ｈ５Ｎ１亜型による高病原性鳥インフルエンザは、１９９７年に香港で流行し、さらに、２００３年から２００４年にはアジアの数カ国で大流行し、人への感染及び死亡例も報告された。
したがって、高病原性鳥インフルエンザの感染を迅速に発見することは、大規模なインフルエンザ感染拡大を防ぐ上で重要な課題である。
高病原性鳥インフルエンザ診断は、現状では、ウイルス感染が疑われる病鳥から気管スワブまたはクロアカスワブ（総排泄腔スワブ）を採取し、これを発育鶏卵に接種して培養した後、ウイルスを分離する方法により行われている。しかし、この方法は、結果が得られるまでに数日を要し、迅速に結果が求められない点で不利である。また、近年開発された遺伝子検査（PCR法、LAMP法）を用いることにより、結果を得るまでにかかる時間は大幅に短縮されるが、かかる遺伝子検査には特別な機器及び技術を要するため、養鶏現場等で検査を行うことは出来ない。 Highly pathogenic avian influenza caused by the H5N1 subtype was prevalent in Hong Kong in 1997, and was also prevalent in several Asian countries from 2003 to 2004, and cases of human infection and death were also reported.
Therefore, the rapid detection of highly pathogenic avian influenza infection is an important issue in preventing the spread of large-scale influenza infection.
Diagnosis of highly pathogenic avian influenza is currently a method of isolating a virus after collecting tracheal swabs or cloacas swabs (total excretory swabs) from diseased birds with suspected viral infections, inoculating them into embryonated chicken eggs and culturing them It is done by. However, this method is disadvantageous in that it takes several days to obtain a result and the result cannot be obtained quickly. In addition, the time taken to obtain results is greatly shortened by using recently developed genetic tests (PCR method, LAMP method). However, because such genetic tests require special equipment and technology, poultry farming It is not possible to inspect on site.

特表2004-509648号公報Special Table 2004-509648 特開平11-108932号公報Japanese Patent Laid-Open No. 11-108932 特開2001-215228号公報Japanese Patent Laid-Open No. 2001-215228

Hinshaw VSら，「Specific antibody responses and generation of antigenic variants in chickens immunized against a virulent avian influenza virus」，Avian Dis. 1990, 34(1): 80-6Hinshaw VS et al., “Specific antibody responses and generation of antigenic variants in chickens immunized against a virulent avian influenza virus”, Avian Dis. 1990, 34 (1): 80-6 Kaverin NVら，「Structure of antigenic sites on the haemagglutinin molecule of H5 avian influenza virus and phenotypic variation escape mutants」，J. Gen. Virol. 2002, 83(pt10): 2497-505Kaverin NV et al., “Structure of antigenic sites on the haemagglutinin molecule of H5 avian influenza virus and phenotypic variation escape mutants”, J. Gen. Virol. 2002, 83 (pt10): 2497-505

そこで、本発明は、インフルエンザウイルスＨ５亜型のエンベロープ表面上の分子であるヘマグルチニン(HA)蛋白対する抗体を用いたインフルエンザウイルスＨ５亜型の免疫検出法、とりわけ、サンドイッチ式免疫測定法、特に、イムノクロマトグラフィー測定法およびイムノクロマト法テストストリップを提供することにより、迅速かつ簡便に鳥インフルエンザ診断を行えるようにすることを目的とする。 Therefore, the present invention relates to an immunodetection method for influenza virus H5 subtype using an antibody against hemagglutinin (HA) protein, which is a molecule on the envelope surface of influenza virus H5 subtype, particularly sandwich immunoassay, particularly immunochromatography. It is an object of the present invention to provide a rapid and simple diagnosis of avian influenza by providing a chromatographic measurement method and an immunochromatographic test strip.

本発明者等は、インフルエンザウイルスＨ５亜型を免疫原としてマウスを免疫して該ウイルスのヘマグルチニン(HA)蛋白に対する抗体を取得することに成功し、当該抗体を免疫測定法、特にサンドイッチ式免疫測定法、とりわけイムノクロマトグラフィー測定法で使用することにより、インフルエンザウイルスＨ５亜型を特異的に検出し得ることを見出し、本発明を完成するに至った。 The present inventors succeeded in obtaining an antibody against the hemagglutinin (HA) protein of the virus by immunizing a mouse using the influenza virus H5 subtype as an immunogen, and using the antibody as an immunoassay, particularly a sandwich immunoassay. It was found that the influenza virus H5 subtype can be specifically detected by using the method, particularly immunochromatographic assay, and the present invention has been completed.

すなわち、本発明の一局面によれば、インフルエンザウイルスＨ５亜型のヘマグルチニン蛋白に対する抗体を用いる免疫測定法からなるインフルエンザウイルスＨ５亜型の検出法が提供される。
この検出法における免疫測定法としては、特に限定されるものではないが、サンドイッチ式免疫測定法、とりわけＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔａｓｓａｙ）法、イムノクロマトグラフィー測定法などが好ましい。 That is, according to one aspect of the present invention, there is provided a method for detecting influenza virus H5 subtype comprising an immunoassay using an antibody against hemagglutinin protein of influenza virus H5 subtype.
The immunoassay method in this detection method is not particularly limited, but a sandwich immunoassay method, particularly an ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay) method, an immunochromatographic assay method and the like are preferable.

したがって、本発明の他の局面によれば、インフルエンザウイルスＨ５亜型のヘマグルチニン蛋白に対する第一の抗体と第二の抗体とを用いたサンドイッチ式免疫測定法からなることを特徴とするインフルエンザウイルスＨ５亜型の検出法が提供される。
また、本発明の好ましい実施形態によれば、インフルエンザウイルスＨ５亜型のヘマグルチニン蛋白に対する第一の抗体を予め所定位置に固定せしめて形成された捕捉部位を備える膜担体を用意し、インフルエンザウイルスＨ５亜型のヘマグルチニン蛋白に対する第二の抗体と所定量の被験試料との混合液を、前記捕捉部位に向けて前記膜担体にてクロマト展開せしめ、前記被験試料中に含まれるインフルエンザウイルスＨ５亜型と前記第二の抗体とを備えた複合体を前記捕捉部位に捕捉させることを特徴とするイムノクロマトグラフィー測定法が提供される。 Therefore, according to another aspect of the present invention, an influenza virus H5 sub-type comprising a sandwich immunoassay using a first antibody and a second antibody against hemagglutinin protein of influenza virus H5 subtype. A mold detection method is provided.
In addition, according to a preferred embodiment of the present invention, a membrane carrier having a capture site formed by preliminarily fixing a first antibody against hemagglutinin protein of influenza virus H5 subtype in a predetermined position is prepared, and influenza virus H5 A mixture of a second antibody against a type of hemagglutinin protein and a predetermined amount of a test sample is chromatographed on the membrane carrier toward the capture site, and the influenza virus H5 subtype contained in the test sample and the There is provided an immunochromatographic measurement method characterized in that a complex comprising a second antibody is captured at the capture site.

また、本発明の好ましい実施形態によれば、インフルエンザウイルスＨ５亜型のヘマグルチニン蛋白に対する第一の抗体と第二の抗体と膜担体とを少なくとも備え、前記第一の抗体は前記膜担体の所定位置に予め固定されて捕捉部位を形成し、前記第二の抗体は適当な標識物質で標識され、かつ、前記捕捉部位から離隔した位置で前記膜担体にてクロマト展開可能なように配置されてなるインフルエンザウイルスＨ５亜型検出用イムノクロマト法テストストリップが提供される。 According to a preferred embodiment of the present invention, at least a first antibody against influenza virus H5 subtype hemagglutinin protein, a second antibody, and a membrane carrier are provided, and the first antibody is a predetermined position of the membrane carrier. The second antibody is labeled with an appropriate labeling substance and arranged so that it can be chromatographed on the membrane carrier at a position separated from the capture site. An immunochromatographic test strip for detecting influenza virus H5 subtype is provided.

本発明で使用するインフルエンザウイルスＨ５亜型のヘマグルチニン蛋白に対する抗体は、ポリクローナル抗体であっても、モノクローナル抗体であってもよいが、反応特異性の観点から、モノクローナル抗体とすることが好ましい。イムノクロマトグラフィー測定法などのサンドイッチ式免疫測定法の場合も、そこで使用する第一の抗体及び第二の抗体は、それぞれ、ポリクローナル抗体であっても、モノクローナル抗体であってもよいが、反応特異性の観点から、一般に、少なくとも一方の抗体をモノクローナル抗体とすることが好ましく、両方の抗体をモノクローナル抗体とすることが特に好ましい。 The antibody against influenza virus H5 subtype hemagglutinin protein used in the present invention may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody, but is preferably a monoclonal antibody from the viewpoint of reaction specificity. In the case of a sandwich immunoassay such as an immunochromatography assay, the first antibody and the second antibody used there may be either a polyclonal antibody or a monoclonal antibody. In general, at least one of the antibodies is preferably a monoclonal antibody, and both antibodies are particularly preferably a monoclonal antibody.

本発明で使用する抗体は、インフルエンザウイルスＨ５亜型のヘマグルチニン蛋白に対する抗体であり、したがって、インフルエンザウイルスＨ５亜型と特異的に反応し、インフルエンザウイルスＨ５亜型以外のインフルエンザウイルスとは反応しないものである。インフルエンザウイルスＨ５Ｎ１型（A/Hong Kong/156/97(H5N1))）のヘマグルチニン蛋白の全アミノ酸配列は、配列番号１に示されるとおり公知である（Science 279 (5349), 393-396 (1998)）。本発明で使用する好ましい抗体は、配列番号１に示されるヘマグルチニン蛋白のアミノ酸配列の１６８番目のアミノ酸を含むエピトープを認識する抗体、特にモノクローナル抗体である。このエピトープは、上記アミノ酸配列の１６８番目のアミノ酸残基を含むその前後の数個のアミノ酸残基から構成されるものと考えられ、通常、当該１６８番目のアミノ酸残基を中心とする６〜１０個のアミノ酸残基から構成されると考えられる。 The antibody used in the present invention is an antibody against hemagglutinin protein of influenza virus H5 subtype, and therefore reacts specifically with influenza virus H5 subtype and does not react with influenza viruses other than influenza virus H5 subtype. is there. The entire amino acid sequence of the hemagglutinin protein of influenza virus H5N1 (A / Hong Kong / 156/97 (H5N1)) is known as shown in SEQ ID NO: 1 (Science 279 (5349), 393-396 (1998)). ). A preferred antibody used in the present invention is an antibody that recognizes an epitope containing the amino acid at position 168 of the amino acid sequence of the hemagglutinin protein shown in SEQ ID NO: 1, particularly a monoclonal antibody. This epitope is considered to be composed of several amino acid residues before and after the 168th amino acid residue of the above amino acid sequence, and usually 6 to 10 centered on the 168th amino acid residue. It is considered to be composed of amino acid residues.

かくして、本発明の他の局面によれば、配列番号１に示されるヘマグルチニン蛋白のアミノ酸配列の１６８番目のアミノ酸を含むエピトープを認識するモノクローナル抗体（以下、「第一のモノクローナル抗体」ともいう）が提供される。しかしながら、当該第一のモノクローナル抗体は、蛍光抗体法によれば、インフルエンザウイルスH5弱毒株に対して全般的に反応するが、A/tn/S.Africa/61、A/swan/Shima/449/83 (24a5b)、A/HongKong/156/97、A/HongKong/483/97、 A/duck/Yokohama/aq-10/2003 及びA/chicken/Yamaguchi/7/04からなる群より選ばれた強毒株の少なくとも１つには反応しないか又は弱毒株に対するよりも反応性が弱い。 Thus, according to another aspect of the present invention, there is provided a monoclonal antibody that recognizes an epitope containing the 168th amino acid of the amino acid sequence of the hemagglutinin protein represented by SEQ ID NO: 1 (hereinafter also referred to as “first monoclonal antibody”). Provided. However, according to the fluorescent antibody method, the first monoclonal antibody generally reacts against an influenza virus H5 attenuated strain, but A / tn / S. Africa / 61, A / swan / Shima / 449 / Strongness selected from the group consisting of 83 (24a5b), A / HongKong / 156/97, A / HongKong / 483/97, A / duck / Yokohama / aq-10 / 2003 and A / chicken / Yamaguchi / 7/04 Does not respond to at least one of the virulence strains or is less reactive than the attenuated strain.

かくして、本発明のさらに他の局面によれば、インフルエンザウイルスH5亜型であるA/tn/S.Africa/61、A/swan/Shima/449/83 (24a5b)、A/HongKong/156/97、A/HongKong/483/97、 A/duck/Yokohama/aq-10/2003 及びA/chicken/Yamaguchi/7/04の全てに対して反応するモノクローナル抗体（以下、「第二のモノクローナル抗体」ともいう）が提供される。第二のモノクローナル抗体は、蛍光抗体法によれば、上記強毒株の全てに対して強く反応する点で、第一のモノクローナル抗体と明確に区別されるものであり、第一のモノクローナル抗体と異なるエピトープを認識するものと考えられる。第二のモノクローナル抗体は、広範囲の強毒株及び弱毒株に対して反応するので、インフルエンザウイルスH5亜型を広く検出するのに好適であり、とりわけ、強毒株の検出用に好適である。 Thus, according to yet another aspect of the present invention, influenza virus H5 subtypes A / tn / S. Africa / 61, A / swan / Shima / 449/83 (24a5b), A / HongKong / 156/97 , A / HongKong / 483/97, A / duck / Yokohama / aq-10 / 2003 and A / chicken / Yamaguchi / 7/04 monoclonal antibodies (hereinafter referred to as “second monoclonal antibodies”) Say). According to the fluorescent antibody method, the second monoclonal antibody is clearly distinguished from the first monoclonal antibody in that it reacts strongly with all of the above virulent strains. It is thought that it recognizes a different epitope. The second monoclonal antibody reacts against a wide range of virulent and attenuated strains and is therefore suitable for broad detection of influenza virus H5 subtypes, particularly for the detection of virulent strains.

なお、第一のモノクローナル抗体及び第二のモノクローナル抗体の何れも、インフルエンザウイルスＨ５亜型以外のインフルエンザウイルスとは反応しないものであり、したがって、インフルエンザウイルスＨ５亜型のヘマグルチニン蛋白に対して特異的に反応する抗体である。 Note that neither the first monoclonal antibody nor the second monoclonal antibody reacts with influenza viruses other than the influenza virus H5 subtype, and therefore specific to the hemagglutinin protein of the influenza virus H5 subtype. It is an antibody that reacts.

本発明によれば、免疫測定法による検出法において、インフルエンザウイルスＨ５亜型のヘマグルチニン蛋白に対する抗体を用いることとしたので、当該抗体のインフルエンザウイルスＨ５亜型のヘマグルチニン蛋白に対する特異的反応性を利用して、インフルエンザウイルスＨ５亜型を選択的に検出することができ、鳥、ヒト等のインフルエンザウイルスＨ５亜型による感染症の診断に広く適用できる。 According to the present invention, since an antibody against influenza virus H5 subtype hemagglutinin protein is used in the detection method by immunoassay, the specific reactivity of the antibody against influenza virus H5 subtype hemagglutinin protein is utilized. Thus, the influenza virus H5 subtype can be selectively detected and can be widely applied to the diagnosis of infectious diseases caused by influenza virus H5 subtypes such as birds and humans.

また、本発明のイムノクロマトグラフィー測定法およびイムノクロマト法テストストリップによれば、特殊な機器及び熟練した技術を必要とすることなく、養鶏現場等において簡便かつ迅速に鳥インフルエンザウイルスの検出及び該ウイルスによる感染を診断することが可能となる。 In addition, according to the immunochromatography measurement method and immunochromatography test strip of the present invention, detection of avian influenza virus and infection by the virus can be carried out easily and quickly at poultry farming sites without the need for special equipment and skilled techniques. Can be diagnosed.

本発明において、抗体の製造および該抗体を使用する検出法および測定法における各ステップは、それぞれ、それ自体、公知の免疫学的手法に準拠して行なわれる。
本発明において、ポリクローナル抗体は、例えば、配列番号１に記載されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列のうち、該アミノ酸配列の１６８番目のアミノ酸残基を含む部分に対応するＤＮＡ断片をクローニングし、当該クローン化遺伝子を大腸菌などの宿主で遺伝子工学的に発現させて発現蛋白を抽出および精製し、この精製蛋白を抗原として常法に従って動物を免疫し、その抗血清から取得することができる。また、前記第二のモノクローナル抗体が認識するインフルエンザウイルス強毒株ヘマグルチニン蛋白のエピトープに対応するアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を取得し、上記と同様に免疫抗原として使用してもよい。 In the present invention, each step in the production of an antibody and the detection method and measurement method using the antibody is performed according to a known immunological technique.
In the present invention, for example, a polyclonal antibody is obtained by cloning a DNA fragment corresponding to a portion containing the 168th amino acid residue of the amino acid sequence of the DNA sequence encoding the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1, The cloned gene can be expressed by genetic engineering in a host such as Escherichia coli, and the expressed protein can be extracted and purified. The purified protein can be used as an antigen to immunize an animal according to a conventional method, and can be obtained from the antiserum. Alternatively, a DNA sequence encoding an amino acid sequence corresponding to the epitope of the influenza virus virulent strain hemagglutinin protein recognized by the second monoclonal antibody may be obtained and used as an immunizing antigen in the same manner as described above.

本発明において、モノクローナル抗体は、例えば、上記と同様に得られた精製蛋白を抗原としてマウスのような動物を免疫したのち、この免疫された動物の脾臓細胞とミエローマ細胞とを細胞融合して得られた融合細胞をＨＡＴ含有培地でセレクトした後に増殖せしめ、増殖せしめた株を前記のようにして得られた精製蛋白を使用して、たとえば、酵素標識免疫法などにより選別することで、取得することができる。
別法として、上記モノクローナル抗体は、例えば、Ｈ５亜型のインフルエンザウイルス自体を抗原としてマウスのような動物を免疫したのち、この免疫された動物の脾臓細胞とミエローマ細胞とを細胞融合して得られた融合細胞をＨＡＴ含有培地でセレクトした後に増殖せしめ、増殖せしめた株から、Ｈ５亜型のインフルエンザウイルスとは反応するが、Ｈ５亜型以外のインフルエンザウイルスの総てとは反応しない株を選別することで、取得することができる。 In the present invention, a monoclonal antibody is obtained, for example, by immunizing an animal such as a mouse using the purified protein obtained in the same manner as described above as an antigen, and then cell-splitting spleen cells and myeloma cells of the immunized animal. Obtained by selecting the fused cells obtained after selection with a HAT-containing medium and selecting the grown strains by, for example, enzyme-labeled immunization using the purified protein obtained as described above. be able to.
Alternatively, the monoclonal antibody can be obtained, for example, by immunizing an animal such as a mouse using the H5 subtype influenza virus itself as an antigen, and cell fusion of the spleen cells and myeloma cells of the immunized animal. The selected fused cells are grown in a HAT-containing medium and grown, and from the grown strains, a strain that reacts with H5 subtype influenza virus but does not react with all influenza viruses other than H5 subtype is selected. It can be acquired.

被験試料中のインフルエンザウイルスＨ５亜型を検出するための本発明のイムノクロマトグラフィー測定法は、公知のイムノクロマト法テストストリップの構成に準拠して容易に実施できる。
一般に、かかるイムノクロマト法テストストリップは、抗原の第一の抗原決定基にて抗体抗原反応可能な第一の抗体と、前記抗原の第二の抗原決定基にて抗体抗原反応可能で且つ標識された第二の抗体と、膜担体とを少なくとも備え、前記第一の抗体は前記膜担体の所定位置に予め固定されて捕捉部位を形成し、前記第二の抗体は前記捕捉部位から離隔した位置で前記膜担体にてクロマト展開可能なように配置されて構成される。第一の抗体および第二の抗体は、上述のように、それぞれポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であっても良いが、少なくとも何れか一方がモノクローナル抗体であることが好ましい。通常は、第一の抗体及び第二の抗体は「ヘテロ」の組み合わせで用いられ、すなわち、抗原上の位置および構造の何れもが異なる各抗原決定基をそれぞれ認識する第一の抗体及び第二の抗体が組み合わせて用いられる。しかしながら、第一の抗原決定基と第二の抗原決定基は抗原上の位置が異なっていれば構造的に同一であってもよく、その場合、第一の抗体および第二の抗体は上記「ホモ」の組み合わせのモノクローナル抗体であってよく、すなわち、第一の抗体および第二の抗体の両方に同一のモノクローナル抗体が使用できる。 The immunochromatographic assay method of the present invention for detecting influenza virus H5 subtype in a test sample can be easily performed according to the configuration of a known immunochromatographic test strip.
In general, such an immunochromatographic test strip is labeled with a first antibody capable of reacting with an antibody at the first antigenic determinant of the antigen and an antibody antigen reactive with the second antigenic determinant of the antigen. At least a second antibody and a membrane carrier, wherein the first antibody is preliminarily fixed at a predetermined position of the membrane carrier to form a capture site, and the second antibody is separated from the capture site. The membrane carrier is arranged and configured to be chromatographed. As described above, each of the first antibody and the second antibody may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody, but at least one of them is preferably a monoclonal antibody. Usually, the first antibody and the second antibody are used in a “hetero” combination, that is, the first antibody and the second antibody, each recognizing each antigenic determinant differing in position and structure on the antigen. These antibodies are used in combination. However, the first antigenic determinant and the second antigenic determinant may be structurally the same as long as the positions on the antigen are different. It may be a “homo” combination of monoclonal antibodies, ie the same monoclonal antibody can be used for both the first antibody and the second antibody.

イムノクロマト法テストストリップの具体例としては、例えば、図１に示されるテストストリップが挙げられる。図１において、数字１は粘着シート、２は含浸部材、３は膜担体、３１は捕捉部位、４は吸収用部材、５は試料添加用部材を示している。
図示の例では、膜担体３は、幅５ｍｍ、長さ３６ｍｍの細長い帯状のニトロセルロース製メンブレンフィルターで作成されている。
該膜担体３には、そのクロマト展開始点側の末端から７．５ｍｍの位置に、第一の抗体が固定され、検体の捕捉部位３１が形成される。
図示の例では、膜担体３は、ニトロセルロース製メンブレンフィルターを用いているが、被験試料に含まれる検体をクロマト展開可能で、かつ、上記捕捉部位３１を形成する抗体を固定可能なものであれば、いかなるものであってもよく、他のセルロース類膜、ナイロン膜、ガラス繊維膜なども使用できる。 A specific example of the immunochromatographic test strip is, for example, the test strip shown in FIG. In FIG. 1, numeral 1 is an adhesive sheet, 2 is an impregnation member, 3 is a membrane carrier, 31 is a capture site, 4 is an absorption member, and 5 is a sample addition member.
In the example shown in the figure, the membrane carrier 3 is made of a strip-like nitrocellulose membrane filter having a width of 5 mm and a length of 36 mm.
The first antibody is fixed to the membrane carrier 3 at a position 7.5 mm from the end on the side of the chromatographic expansion start point, and a specimen capture site 31 is formed.
In the illustrated example, the membrane carrier 3 uses a nitrocellulose membrane filter. However, the membrane carrier 3 should be capable of chromatographic development of the specimen contained in the test sample and immobilize the antibody forming the capture site 31. Any cellulose membrane, nylon membrane, glass fiber membrane, etc. can be used.

含浸部材２は、前記第一の抗体が結合する第一の抗原決定基と異なる部位に位置する第二の抗原決定基にて前記抗原と抗体抗原反応する第二の抗体を含浸せしめた部材からなる。当該第二の抗体は、適当な標識物質で予め標識される。
図示の例では、含浸部材２として、５ｍｍ×１５ｍｍの帯状のガラス繊維不織布を用いているが、これに限定されるものではなく、例えば、セルロース類布（濾紙、ニトロセルロース膜等）、ポリエチレン、ポリプロピレン等の多孔質プラスチック布類なども使用できる。 The impregnated member 2 is a member impregnated with a second antibody that reacts with the antigen with the second antigen determinant located at a different site from the first antigen determinant to which the first antibody binds. Become. The second antibody is previously labeled with an appropriate labeling substance.
In the illustrated example, a 5 mm × 15 mm strip-shaped glass fiber nonwoven fabric is used as the impregnating member 2, but is not limited thereto, and examples thereof include cellulose cloth (filter paper, nitrocellulose membrane, etc.), polyethylene, Porous plastic cloths such as polypropylene can also be used.

第二の抗体の標識物質としては、使用可能なものであればいかなる物質であってもよく、呈色標識物質、酵素標識物質、放射線標識物質などが挙げられる。
このうち、捕捉部位３１での色の変化を肉眼で観察することにより迅速かつ簡便に判定できる点から、呈色標識物質を用いることが好ましい。
呈色標識物質としては、金コロイド、白金コロイド等の金属コロイドの他、赤色および青色などのそれぞれの顔料で着色されたポリスチレンラテックスなどの合成ラテックスや、天然ゴムラテックスなどのラテックスが挙げられ、このうち、金コロイドなどの金属コロイドが特に好ましい。
当該含浸部材２は、標識された第二の抗体の懸濁液を前記ガラス繊維不織布等の部材に含浸せしめ、これを乾燥させることなどによって作製できる。 The labeling substance for the second antibody may be any substance as long as it can be used, and examples thereof include a coloring labeling substance, an enzyme labeling substance, and a radiation labeling substance.
Among these, it is preferable to use a color labeling substance from the viewpoint that the color change at the capturing site 31 can be determined quickly and easily by observing with the naked eye.
Examples of the color labeling substance include metal colloids such as gold colloid and platinum colloid, synthetic latex such as polystyrene latex colored with respective pigments such as red and blue, and latex such as natural rubber latex. Of these, metal colloids such as gold colloid are particularly preferred.
The impregnated member 2 can be produced by impregnating the labeled second antibody suspension into a member such as the glass fiber non-woven fabric and drying it.

図１に示されるように、膜担体３を粘着シート１の中程に貼着し、該膜担体３のクロマト展開の開始点側（すなわち図１の左側、以下「上流側」と記す、また、その逆の側、すなわち図１の右側を、以下「下流側」と記す）の末端の上に、含浸部材２の下流側末端を重ね合わせて連接するとともに、この含浸部材２の上流側部分を粘着シート１に貼着して本発明のイムノクロマト法テストストリップを作成できる。
さらに、必要に応じて、含浸部材２の上面に試料添加用部材５の下流側部分を載置するとともに、該試料添加用部材５の上流側部分を粘着シート１に貼着してもよく、また、膜担体３の下流側部分の上面に吸収用部材４の上流側部分を載置するとともに、該吸収用部材４の下流側部分を粘着シート１に貼着せしめることもできる。 As shown in FIG. 1, the membrane carrier 3 is stuck in the middle of the pressure-sensitive adhesive sheet 1 and the chromatographic development start side of the membrane carrier 3 (that is, the left side of FIG. 1, hereinafter referred to as “upstream side”, The downstream side of the impregnation member 2 is overlapped and connected to the opposite end, that is, the right side of FIG. Can be attached to the pressure-sensitive adhesive sheet 1 to produce the immunochromatographic test strip of the present invention.
Further, if necessary, the downstream portion of the sample addition member 5 may be placed on the upper surface of the impregnation member 2, and the upstream portion of the sample addition member 5 may be attached to the adhesive sheet 1. Further, the upstream portion of the absorbing member 4 can be placed on the upper surface of the downstream portion of the membrane carrier 3, and the downstream portion of the absorbing member 4 can be attached to the adhesive sheet 1.

試料添加用部材５としては、例えば、多孔質ポリエチレンおよび多孔質ポリプロピレンなどのような多孔質合成樹脂のシートまたはフィルム、ならびに、濾紙および綿布などのようなセルロース製の紙または織布もしくは不織布を用いることができる。
吸収用部材４は、液体をすみやかに吸収、保持できる材質のものであればよく、綿布、濾紙、およびポリエチレン、ポリプロピレン等からなる多孔質プラスチック不織布等を挙げることができるが、特に濾紙が最適である。 As the sample addition member 5, for example, a porous synthetic resin sheet or film such as porous polyethylene or porous polypropylene, and a paper or woven or non-woven fabric made of cellulose such as filter paper and cotton cloth are used. be able to.
The absorbing member 4 may be of any material that can absorb and hold liquid quickly, and examples thereof include cotton cloth, filter paper, and porous plastic nonwoven fabric made of polyethylene, polypropylene, etc., and filter paper is particularly suitable. is there.

さらに、市販品の場合、図１のイムノクロマト法テストストリップは、試料添加用部材５と捕捉部位３１の上方にそれぞれ被験試料注入部と判定部が開口された適当なプラスチック製ケース内に収容されて提供される。 Further, in the case of a commercially available product, the immunochromatographic test strip of FIG. 1 is accommodated in a suitable plastic case in which a test sample injection part and a judgment part are opened above the sample addition member 5 and the capture part 31, respectively. Provided.

かくして、生体試料などからなる被験試料を必要に応じて適当な展開溶媒と混合してクロマト展開可能な混合液を得た後、当該混合液を図１に示されるイムノクロマト法テストストリップの試料添加用部材５上に注入すると、該混合液は、該試料添加用部材５を通過して含浸部材２において、標識された第二の抗体と混合する。
その際、該混合液中に検体が存在すれば、抗原抗体反応により検体と第二の抗体との複合体が形成される。
この複合体は、膜担体３中をクロマト展開されて捕捉部位３１に到達し、そこに固定された第一の抗体と抗原抗体反応して捕捉される。
このとき、標識物質として金コロイドなどの呈色標識物質が使用されていれば、当該呈色標識物質の集積により捕捉部位３１が発色するので、直ちに、検体を定性的または定量的に測定することができる。 Thus, after mixing a test sample composed of a biological sample with an appropriate developing solvent as necessary to obtain a mixed solution that can be chromatographed, the mixed solution is added to the sample of the immunochromatographic test strip shown in FIG. When injected onto the member 5, the mixed solution passes through the sample addition member 5 and is mixed with the labeled second antibody in the impregnating member 2.
At that time, if a sample is present in the mixed solution, a complex of the sample and the second antibody is formed by the antigen-antibody reaction.
This complex is chromatographed in the membrane carrier 3 to reach the capture site 31, where it is captured by an antigen-antibody reaction with the first antibody immobilized thereon.
At this time, if a colored labeling substance such as colloidal gold is used as the labeling substance, the capture site 31 is colored due to the accumulation of the colored labeling substance. Therefore, the sample should be measured qualitatively or quantitatively immediately. Can do.

被験試料としては、特に制限はないが、例えば、クロアカスワブ、気管スワブ、糞便、鼻腔吸引液、鼻腔ぬぐい液および咽頭ぬぐい液、血液（全血でも、血清でも、血漿でもよい）、唾液、尿、臓器乳剤等が挙げられる。被験試料は、展開溶媒などの適当な希釈液で希釈して膜担体に注入してもよい。
なお、全血を被験試料として用いるときで、特に標識抗体の標識物質として金コロイドなどの呈色標識物質が用いられる場合、前記試料添加用部材に血球捕捉膜部材を配置しておくことが好ましい。血球捕捉膜部材は、前記含浸部材と前記試料添加用部材との間に積層することが好ましい。これにより、赤血球が膜担体に展開されるのが阻止されるので、膜担体の捕捉部位における呈色標識の集積の確認が容易になる。血球捕捉膜部材としては、カルボキシメチルセルロース膜が用いられ、具体的には、アドバンテック東洋株式会社から販売されているイオン交換濾紙ＣＭ（商品名）や、ワットマンジャパン株式会社から販売されているイオン交換セルロースペーパーなどを用いることができる。 The test sample is not particularly limited, for example, cloacaswab, tracheal swab, stool, nasal aspirate, nasal swab and throat swab, blood (whether whole blood, serum or plasma), saliva, urine, And organ emulsions. The test sample may be diluted with an appropriate diluent such as a developing solvent and injected into the membrane carrier.
When whole blood is used as a test sample, and particularly when a colored labeling substance such as gold colloid is used as the labeling substance of the labeled antibody, it is preferable to dispose a blood cell capturing membrane member on the sample addition member. . The blood cell trapping membrane member is preferably laminated between the impregnation member and the sample addition member. This prevents red blood cells from being developed on the membrane carrier, so that it is easy to confirm the accumulation of the colored label at the capture site of the membrane carrier. As the blood cell capturing membrane member, a carboxymethylcellulose membrane is used. Specifically, ion exchange filter paper CM (trade name) sold by Advantech Toyo Co., Ltd. or ion exchange cellulose sold by Whatman Japan Co., Ltd. Paper or the like can be used.

下記の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこの実施例に限定されるものではない。 The present invention will be described more specifically with reference to the following examples, but the present invention is not limited to these examples.

実施例１（抗インフルエンザウイルスH5亜型モノクローナル抗体の作出）
インフルエンザウイルスH5亜型であるA/duck/Pennsylvania/10128/84(H5N2)株を11日齢の孵化鶏卵の羊膜腔に接種し、培養した。数日後に羊水を採取しウイルスを得た。
得られたウイルスを抗原として、当該ウイルスに対するモノクローナル抗体を作出した。モノクローナル抗体の作出は常法に従っておこなった。
すなわち、100μgのウイルス抗原と等量のAdjuvant Complete Freund (Difco)を混合して、マウス（BALB/c、5週齢、日本SLC）に3回免疫し、その脾臓細胞を細胞融合に用いた。細胞融合には、マウスの骨髄腫細胞であるSp2/0-Ag14細胞（Shulmanら、1978）を用いた。 Example 1 (Production of anti-influenza virus H5 subtype monoclonal antibody)
Influenza virus H5 subtype A / duck / Pennsylvania / 10128/84 (H5N2) strain was inoculated into the amniotic cavity of 11-day-old embryonated chicken eggs and cultured. Several days later, the amniotic fluid was collected to obtain the virus.
Using the obtained virus as an antigen, a monoclonal antibody against the virus was produced. Monoclonal antibodies were produced according to a conventional method.
Specifically, 100 μg of viral antigen and an equal amount of Adjuvant Complete Freund (Difco) were mixed, and mice (BALB / c, 5 weeks old, Japan SLC) were immunized 3 times, and the spleen cells were used for cell fusion. Sp2 / 0-Ag14 cells (Shulman et al., 1978), which are mouse myeloma cells, were used for cell fusion.

得られた融合細胞をＨＡＴ含有培地でセレクトした後に増殖せしめ、増殖せしめた融合細胞から、インフルエンザウイルスＨ５亜型の上記株と反応するモノクローナル抗体産生細胞を最終的に15クローン得た。
作出した15クローンのモノクローナル抗体と各種インフルエンザウイルスH5亜型との反応性を蛍光抗体法により確認し、結果を表1に示した。なお、蛍光抗体法は下記手順に従った。 The obtained fused cells were selected after being grown in a HAT-containing medium, and finally 15 clones of monoclonal antibody producing cells that reacted with the above strain of influenza virus H5 subtype were obtained from the grown fused cells.
The reactivity of the produced 15 clone monoclonal antibodies with various influenza virus H5 subtypes was confirmed by the fluorescent antibody method, and the results are shown in Table 1. The fluorescent antibody method followed the following procedure.

蛍光抗体法
イヌ腎臓由来株化細胞（Madin-Darby canine kidney cell : MDCK細胞）を用いて蛍光抗体法を行った。MDCK細胞の培養にはイーグル最小必須培地（日水製薬）に56℃で30分間加熱非動化した10% Bovine calf serum（Roche）、0.3mg/ml L-グルタミン、100単位/mLペニシリンGカリウム、100μg/ml硫酸ストレプトマイシンを加えた後、炭酸水素ナトリウムでpHを調整した培地を用いた。
蛍光抗体法はOffice International Des Epizooties (2000)の方法に従った。Lab-Tek II Chamber Slide System (Nunc)に単層を形成させたMDCK細胞に10⁴ TCID₅₀/mlでウイルスを接種し、35℃で8時間培養後、培養上清を除去し、感染細胞をPBSで1回洗浄した。細胞を20分間100%冷アセトン（和光純薬）に浸し固定した後、乾燥させた。モノクローナル抗体を含むマウス腹水、もしくは培養上清を抗体希釈液（1% BSA及び0.05% Tween20を含むPBS）で800倍に希釈し、これを1次抗体液として添加し、室温で1時間反応させた。PBSで1回洗浄後、抗体希釈液で1000倍に希釈したFluerescence-conjugated Goat IgG Fraction to Mouse IgG (ICN Biomedicals)を2次抗体液として添加し、室温で1時間反応させた。PBSで1回洗浄後、細胞を封入剤（Glycerol for fluerescence microscopy (Merck) と0.5M 炭酸重炭酸バッファー(pH9.5)を比率3:1で混合したもの）で封入した後、蛍光顕微鏡（Axiovert 200, ZEISS）を用い、FITC Filter (Chroma) で観察した。判定は目視により核および細胞質に緑色の特異的な細胞内蛍光を確認することで陽性（＋）と判定した。 Fluorescent antibody method The fluorescent antibody method was performed using a canine kidney-derived cell line (Madin-Darby canine kidney cell: MDCK cell). 10% Bovine calf serum (Roche), heat-immobilized for 30 minutes at 56 ° C in Eagle's minimum essential medium (Nissui Pharmaceutical) for MDCK cell culture, 0.3 mg / ml L-glutamine, 100 units / mL penicillin G potassium After adding 100 μg / ml streptomycin sulfate, a medium whose pH was adjusted with sodium bicarbonate was used.
The fluorescent antibody method followed the method of Office International Des Epizooties (2000). MDCK cells with a monolayer formed in Lab-Tek II Chamber Slide System (Nunc) were inoculated with virus at 10 ⁴ TCID ₅₀ / ml, cultured at 35 ° C for 8 hours, the culture supernatant was removed, and the infected cells were removed. Washed once with PBS. The cells were fixed by soaking in 100% cold acetone (Wako Pure Chemical Industries) for 20 minutes and then dried. Mouse ascites containing monoclonal antibody or culture supernatant was diluted 800 times with antibody diluent (PBS containing 1% BSA and 0.05% Tween20), added as primary antibody solution, and allowed to react at room temperature for 1 hour. It was. After washing once with PBS, Fluorescence-conjugated Goat IgG Fraction to Mouse IgG (ICN Biomedicals) diluted 1000-fold with an antibody diluent was added as a secondary antibody solution and reacted at room temperature for 1 hour. After washing once with PBS, the cells were sealed with a mounting medium (Glycerol for fluerescence microscopy (Merck) and 0.5M carbonate bicarbonate buffer (pH 9.5) mixed at a ratio of 3: 1), and then fluorescence microscope (Axiovert 200, ZEISS) and observed with FITC Filter (Chroma). The determination was positive (+) by visually confirming specific intracellular fluorescence of green in the nucleus and cytoplasm.

表１において、A/duck/Mi/54/76 (H5N3)、A/duck/HongKong/342/78 (H5N2)、A/duck/HongKong/698/79 (H5N3)、A/duck/Pennsylvania/10128/84 (H5N2)、A/swan/Hokkaido/4/96 (H5N3)、A/swan/Hokkaido/51/96 (H5N3)、A/swan/Hok/kaido/67/96 (H5N3)、A/duck/Hokkaido/69/00 (H5N3)、A/duck/Hokkaido/447/00 (H5N3)、A/duck/Mongolia/54/01 (H5N2)、A/duck/Mongolia/500/01 (H5N3)、A/duck/Mongolia/596/01 (H5N3)及びA/duck/Hokkaido/84/02 (H5N3)の１３種はインフルエンザウイルスH5弱毒株であり、A/tn/S.Africa/61 (H5N3)、A/swan/Shima/449/83 (24a5b) (H5N3)、A/HongKong/156/97 (H5N1)、A/HongKong/483/97 (H5N1)、 A/duck/Yokohama/aq-10/2003 (H5N1) 及びA/chicken/Yamaguchi/7/04 (H5N1)の６種はインフルエンザウイルスH5強毒株である。
なお、表１において、A/duck/Mongolia/500/01(H5N3)及びA/duck/Mongolia/596/01(H5N3)は、それぞれ、A/duck/Mongolia/3/01(H5N3)及びA/duck/Mongolia/10/01(H5N3)と同等であることが知られている。 In Table 1, A / duck / Mi / 54/76 (H5N3), A / duck / HongKong / 342/78 (H5N2), A / duck / HongKong / 698/79 (H5N3), A / duck / Pennsylvania / 10128 / 84 (H5N2), A / swan / Hokkaido / 4/96 (H5N3), A / swan / Hokkaido / 51/96 (H5N3), A / swan / Hok / kaido / 67/96 (H5N3), A / duck / Hokkaido / 69/00 (H5N3), A / duck / Hokkaido / 447/00 (H5N3), A / duck / Mongolia / 54/01 (H5N2), A / duck / Mongolia / 500/01 (H5N3), A 13 species of / duck / Mongolia / 596/01 (H5N3) and A / duck / Hokkaido / 84/02 (H5N3) are influenza virus H5 attenuated strains, A / tn / S. Africa / 61 (H5N3), A / swan / Shima / 449/83 (24a5b) (H5N3), A / HongKong / 156/97 (H5N1), A / HongKong / 483/97 (H5N1), A / duck / Yokohama / aq-10 / 2003 (H5N1 ) And A / chicken / Yamaguchi / 7/04 (H5N1) are influenza virus H5 virulent strains.
In Table 1, A / duck / Mongolia / 500/01 (H5N3) and A / duck / Mongolia / 596/01 (H5N3) are A / duck / Mongolia / 3/01 (H5N3) and A / d, respectively. It is known to be equivalent to duck / Mongolia / 10/01 (H5N3).

表１から、クローンNo.25, 40, 48, 64, A25, B168及びD31は、上記蛍光抗体法において、表１に示される１３種の弱毒株及び６種の強毒株の全てに対して反応するものであることがわかる。これに対し、クローンNo.145, B220, 3, A27, B9, A310 B29及びB59は、上記蛍光抗体法において、表１に示される１３種の弱毒株の全てに対して反応するが、６種の強毒株の少なくとも一つに対しては反応しないか又は弱毒株よりも反応性が低いことがわかる。 From Table 1, clones Nos. 25, 40, 48, 64, A25, B168 and D31 were obtained for all 13 attenuated strains and 6 highly toxic strains shown in Table 1 in the fluorescent antibody method. It turns out that it reacts. In contrast, clones Nos. 145, B220, 3, A27, B9, A310 B29 and B59 react with all 13 attenuated strains shown in Table 1 in the fluorescent antibody method. It can be seen that at least one of the highly virulent strains does not react or is less reactive than the attenuated strain.

表1に示した15クローンより12種のクローンNo.3, A27, B29, 25, 40, 48, A25, 64, D31, B9, A310及びB168を選定し（なお、3種のクローンNo.3、A27及びB29については、以下、それぞれ、クローン3/3、A27/1及びB29/1と表記する）、これら12種のクローンのアイソタイプ及びA/duck/Pennsylvania/10128/84(H5N2)株を固相化抗原に用いたELISA法における力価を調べ、その結果を表2に示した。なお、表2中、Mabはクローンの種類を示し、Isotypeはモノクローナル抗体のイムノグロブリンアイソタイプを示し、ELISA titerはA/duck/Pennsylvania/10128/84(H5N2)株に対するELISA法による力価を示す。作出したモノクローナル抗体のアイソタイプは、Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Reagents（Sigma）を用いてELISAで同定した。 From the 15 clones shown in Table 1, 12 clone Nos. 3, A27, B29, 25, 40, 48, A25, 64, D31, B9, A310 and B168 were selected (in addition, 3 clones No. 3 A27 and B29 are hereinafter referred to as clone 3/3, A27 / 1 and B29 / 1, respectively), the isotypes of these 12 clones and the A / duck / Pennsylvania / 10128/84 (H5N2) strain. The titer in the ELISA method used for the immobilized antigen was examined, and the results are shown in Table 2. In Table 2, Mab represents the type of clone, Isotype represents the immunoglobulin isotype of the monoclonal antibody, and ELISA titer represents the titer of the A / duck / Pennsylvania / 10128/84 (H5N2) strain by the ELISA method. The isotype of the produced monoclonal antibody was identified by ELISA using Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Reagents (Sigma).

また、上記の選定した１２種のクローンについて、インフルエンザウイルスＨ５亜型以外のインフルエンザウイルスとの反応性をELISA法により確認し、結果を表３に示した。なお、表３の結果は１２種のクローンに共通である。 Further, the reactivity of the selected 12 clones with influenza viruses other than the influenza virus H5 subtype was confirmed by ELISA, and the results are shown in Table 3. The results in Table 3 are common to 12 clones.

表３から明らかなように、上記１２種のクローンはインフルエンザウイルスＨ５亜型以外のインフルエンザウイルスとは反応せず、したがって、インフルエンザウイルスＨ５亜型と特異的に反応するものであることがわかった。
また、上記クローンのうち、クローン3/3、A27/1及びB29/1から得られたモノクローナル抗体とA/duck/Pennsylvania/10128/84(H5N2)株とを混合して11日齢の孵化鶏卵の羊膜腔に接種し、培養し、数日後に羊水を採取しウイルスを得た。得られたウイルスは、上記モノクローナル抗体の選択圧がかかっているため、上記モノクローナル抗体が結合する部位に変異を生じている可能性が高い。
そこで、得られたウイルスのヘマグルチニン遺伝子をシークエンスし、そのアミノ酸配列を配列番号１の配列と比較したところ、前者のアミノ酸配列は、配列番号１のアミノ酸配列の１６８番目のアミノ酸残基が変異していることがわかった。
したがって、上記３種のクローン3/3、A27/1及びB29/1は、インフルエンザウイルスH5亜型のヘマグルチニン蛋白に特異的に結合するものであり、さらには、配列番号１の１６８番目のアミノ酸残基を含むエピトープを認識するものであることが示された。 As is apparent from Table 3, the 12 clones did not react with influenza viruses other than the influenza virus H5 subtype, and thus were found to react specifically with the influenza virus H5 subtype.
In addition, among the above clones, 11 days old embryonated chicken eggs mixed with monoclonal antibodies obtained from clones 3/3, A27 / 1 and B29 / 1 and A / duck / Pennsylvania / 10128/84 (H5N2) strain The amnion was inoculated and cultured, and after several days, the amniotic fluid was collected to obtain a virus. Since the obtained virus is under the selection pressure of the monoclonal antibody, there is a high possibility that the site to which the monoclonal antibody binds is mutated.
Therefore, when the hemagglutinin gene of the obtained virus was sequenced and its amino acid sequence was compared with the sequence of SEQ ID NO: 1, the former amino acid sequence was mutated at the 168th amino acid residue of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1. I found out.
Therefore, the above three clones 3/3, A27 / 1 and B29 / 1 bind specifically to the hemagglutinin protein of influenza virus H5 subtype, and furthermore, the 168th amino acid residue of SEQ ID NO: 1 remains. It was shown to recognize epitopes containing groups.

実施例２（抗インフルエンザウイルスH5亜型抗体を用いたイムノクロマトキットの作製）
（１）抗インフルエンザウイルスH5亜型抗体（抗H5抗体）の調製
実施例1で得られた１２種のクローンのそれぞれを、マウス腹腔に接種し、抗H5抗体を含んだ腹水を得た。さらに、常法によりプロテインG吸着体を用いたIgG精製を行い、抗H5抗体とした。 Example 2 (Production of immunochromatography kit using anti-influenza virus H5 subtype antibody)
(1) Preparation of anti-influenza virus H5 subtype antibody (anti-H5 antibody) Each of the 12 clones obtained in Example 1 was inoculated into the abdominal cavity of the mouse to obtain ascites containing the anti-H5 antibody. Furthermore, IgG purification using a protein G adsorbent was performed by a conventional method to obtain an anti-H5 antibody.

（２）金コロイド溶液の調製
加熱によって沸騰させた超純水99mlに、1%（v/w）塩化金酸水溶液1mlを加え、さらに、その１分後に1%（v/w）クエン酸ナトリウム水溶液1.5mlを加えて加熱し5分間沸騰させた後、室温に放置して冷却した。次いで、この溶液に200mM炭酸カリウム水溶液を加えてpH9.0に調製し、これに超純水を加えて全量を100mlとして金コロイド溶液を得た。 (2) Preparation of colloidal gold solution To 99 ml of ultrapure water boiled by heating, add 1 ml of 1% (v / w) chloroauric acid aqueous solution, and 1 minute later, 1% (v / w) sodium citrate After 1.5 ml of an aqueous solution was added and heated to boil for 5 minutes, it was allowed to cool to room temperature. Subsequently, 200 mM potassium carbonate aqueous solution was added to this solution to adjust to pH 9.0, and ultrapure water was added thereto to make a total volume of 100 ml to obtain a gold colloid solution.

（３）金コロイド標識抗H5抗体溶液の調製
上記（１）で得られた１２種のクローン由来の抗H5抗体を下記の手順でそれぞれ金コロイド標識した。
抗H5抗体の蛋白換算重量1μg（以下、抗体の蛋白換算重量を示すとき、単に、その精製蛋白質の重量分析による重量数値で示す）と上記（２）の金コロイド溶液1mlとを混合し、室温で2分間静置してこの抗体のことごとくを金コロイド粒子表面に結合させた後、金コロイド溶液における最終濃度が1%となるように10%ウシ血清アルブミン（以下、「BSA」と記す）水溶液を加え、この金コロイド粒子の残余の表面をことごとくこのBSAでブロックして、金コロイド標識抗H5抗体（以下、「金コロイド標識抗体」と記す）溶液を調製した。この溶液を遠心分離（5600×G、30分間）して金コロイド標識抗体を沈殿せしめ、上清液を除いて金コロイド標識抗体を得た。この金コロイド標識抗体を10%サッカロース・1%BSA・0.5%トリトン（Triton）-X100を含有する50mMトリス塩酸緩衝液（pH7.4）に懸濁して金コロイド標識抗体溶液を得た。 (3) Preparation of gold colloid-labeled anti-H5 antibody solution The anti-H5 antibodies derived from the 12 clones obtained in (1) above were each labeled with gold colloid according to the following procedure.
The protein equivalent weight of the anti-H5 antibody is 1 μg (hereinafter, the protein equivalent weight of the antibody is simply indicated by the weight value by weight analysis of the purified protein) and 1 ml of the colloidal gold solution described in (2) above. Let the antibody stand for 2 minutes to bind all of these antibodies to the gold colloid particle surface, and then add 10% bovine serum albumin (hereinafter referred to as “BSA”) aqueous solution so that the final concentration in the gold colloid solution is 1%. And the rest of the gold colloid particles were completely blocked with this BSA to prepare a gold colloid-labeled anti-H5 antibody (hereinafter referred to as “gold colloid-labeled antibody”) solution. This solution was centrifuged (5600 × G, 30 minutes) to precipitate colloidal gold labeled antibody, and the supernatant was removed to obtain colloidal gold labeled antibody. The colloidal gold labeled antibody was suspended in a 50 mM Tris-HCl buffer (pH 7.4) containing 10% sucrose, 1% BSA, 0.5% Triton-X100 to obtain a colloidal gold labeled antibody solution.

（４）抗インフルエンザウイルスH5亜型測定用イムノクロマト法テストストリップの作成
図１に示されるイムノクロマト法テストストリップを下記の手順で作成した。
（４−１）抗H5抗体と金コロイド標識抗体との複合体の捕捉部位
幅5mm、長さ36mmの細長い帯状のニトロセルロース膜をクロマトグラフ媒体のクロマト展開用膜担体３として用意した。
抗H5抗体1.0mg/mlが含有されてなる溶液0.5μlを、このクロマト展開用膜担体３におけるクロマト展開開始点側の末端から7.5mmの位置にライン状に塗布して、これを室温で乾燥し、インフルエンザウイルスＨ５亜型と金コロイド標識抗体との複合体の捕捉部位３１とした。抗H5抗体として、表４−１及び表４−２に記載のクローン由来のモノクローナル抗体を用いた。 (4) Preparation of immunochromatographic test strip for measuring anti-influenza virus H5 subtype The immunochromatographic test strip shown in FIG. 1 was prepared by the following procedure.
(4-1) Capturing site of complex of anti-H5 antibody and colloidal gold labeled antibody A strip-like nitrocellulose membrane having a width of 5 mm and a length of 36 mm was prepared as a membrane carrier 3 for chromatographic development of a chromatographic medium.
0.5 μl of a solution containing 1.0 mg / ml of anti-H5 antibody is applied in a line at a position 7.5 mm from the end of the chromatographic development start side of the membrane carrier 3 for chromatographic development and dried at room temperature. The capture site 31 of the complex of influenza virus H5 subtype and colloidal gold labeled antibody was used. As anti-H5 antibodies, monoclonal antibodies derived from the clones described in Table 4-1 and Table 4-2 were used.

（４−２）金コロイド標識抗体含浸部材
5mm×15mmの帯状のガラス繊維不織布に、金コロイド標識抗体溶液37.5μlを含浸せしめ、これを室温で乾燥させて金コロイド標識抗体含浸部材２とした。金コロイド標識抗体として、表４−１及び表４−２に記載のクローン由来の金コロイド標識抗体を用いた。
（４−３）イムノクロマト法テストストリップの作成
上記クロマト展開用膜担体３、上記標識抗体含浸部材２の他に、試料添加用部材５として綿布と、吸収用部材４として濾紙を用意した。そして、これらの部材を用いて、図１と同様のクロマト法テストストリップを作成した。 (4-2) Colloidal gold labeled antibody impregnated member
A 5 mm × 15 mm strip-shaped glass fiber nonwoven fabric was impregnated with 37.5 μl of a colloidal gold labeled antibody solution, which was dried at room temperature to obtain a colloidal gold labeled antibody impregnated member 2. As the gold colloid-labeled antibody, the gold colloid-labeled antibodies derived from the clones shown in Table 4-1 and Table 4-2 were used.
(4-3) Preparation of immunochromatographic test strip In addition to the chromatographic development membrane carrier 3 and the labeled antibody-impregnated member 2, a cotton cloth as a sample addition member 5 and a filter paper as an absorbing member 4 were prepared. Then, using these members, a chromatographic test strip similar to that shown in FIG. 1 was prepared.

（５）試験−１（弱毒株検出）
金コロイド標識抗体及び捕捉部位形成抗体（抗H5抗体）として表４−１に記載のものを用いた全５種類のイムノクロマト法テストストリップを用意した。
A/duck/Pennsylvania/10128/84(H5N2)株を検体希釈液で希釈して２．５μｇ／ｍＬに調整し、被験試料とした。そして、被験試料100μlを上記（４）で得られたテストストリップの試料添加用部材５にマイクロピペットで滴下してクロマト展開し、室温で15分放置後、上記捕捉部位３１で捕捉されたA/duck/Pennsylvania/10128/84 (H5N2)株と金コロイド標識抗体との複合体の捕捉量を肉眼で観察した。捕捉量は、その量に比例して増減する赤紫色の呈色度合いを肉眼で、−（着色なし）、±（微弱な着色）、＋（明確な着色）、＋＋（顕著な着色）の４段階（但し、ｗは弱めを示す）に区分して判定した。対照として、検体希釈液100μlを同様にクロマト展開し呈色度合いを観察した。その結果を表４−１に示した。 (5) Test-1 (Attenuated strain detection)
All five types of immunochromatographic test strips using the colloidal gold labeled antibody and the capture site forming antibody (anti-H5 antibody) described in Table 4-1 were prepared.
The A / duck / Pennsylvania / 10128/84 (H5N2) strain was diluted with a specimen diluent to adjust to 2.5 μg / mL, and used as a test sample. Then, 100 μl of the test sample is dropped with a micropipette onto the sample addition member 5 of the test strip obtained in the above (4), chromatographed, left at room temperature for 15 minutes, and then A / A captured at the capture site 31 is collected. The capture amount of the complex of duck / Pennsylvania / 10128/84 (H5N2) strain and colloidal gold labeled antibody was observed with the naked eye. The captured amount is 4 (colorless), ± (weak coloration), + (clear coloration), and ++ (significant coloration). Judgment was made by dividing into stages (however, w indicates weakness). As a control, 100 μl of the sample diluent was chromatographed in the same manner, and the degree of coloration was observed. The results are shown in Table 4-1.

表４−１から明らかなように、表４−１の何れの組合せの場合でも、インフルエンザウイルスＨ５亜型を検出できることがわかった。 As apparent from Table 4-1, it was found that the influenza virus H5 subtype can be detected in any combination of Table 4-1.

（６）試験−２（強毒株検出）
金コロイド標識抗体及び捕捉部位形成抗体（抗H5抗体）として表４−２に記載のものを用いた全１４４種類のイムノクロマト法テストストリップを用意した。なお、表４−２中、捕捉部位形成抗体はメンブレン固相化抗体と表記している。
インフルエンザウイルスH5強毒株であるA/Chicken/Yamaguchi/7/04（H5N1）株（HA価：1024HA）を検体希釈液で625倍に希釈して被験試料とした。そして、被験試料100μlを上記（４）で得られたテストストリップの試料添加用部材５にマイクロピペットで滴下してクロマト展開し、室温で15分放置後、上記捕捉部位３１で捕捉されたA/Chicken/Yamaguchi/7/04（H5N1）株と金コロイド標識抗体との複合体の捕捉量を肉眼で観察した。捕捉量は、その量に比例して増減する赤紫色の呈色度合いを肉眼で−（着色なし）、±（微弱な着色）、＋（明確な着色）の３段階に区分して判定した。対照として、検体希釈液100μlを同様にクロマト展開し呈色度合いを観察した。その結果を表４−２に示した。 (6) Test-2 (Strongly virulent strain detection)
A total of 144 types of immunochromatographic test strips using the colloidal gold labeled antibody and the capture site forming antibody (anti-H5 antibody) described in Table 4-2 were prepared. In Table 4-2, the capture site-forming antibody is expressed as a membrane-immobilized antibody.
A / Chicken / Yamaguchi / 7/04 (H5N1) strain (HA value: 1024HA), an influenza virus H5 virulence strain, was diluted 625 times with a sample diluent to prepare a test sample. Then, 100 μl of the test sample is dropped with a micropipette onto the sample addition member 5 of the test strip obtained in the above (4), chromatographed, left at room temperature for 15 minutes, and then A / A captured at the capture site 31 is collected. The captured amount of the complex of Chicken / Yamaguchi / 7/04 (H5N1) strain and colloidal gold labeled antibody was observed with the naked eye. The amount of capture was determined by classifying the degree of reddish purple coloration that increases or decreases in proportion to the amount into three stages:-(no coloring), ± (weak coloring), and + (clear coloring). As a control, 100 μl of the sample diluent was chromatographed in the same manner, and the degree of coloration was observed. The results are shown in Table 4-2.

表４−２から明らかなように、クローン64, A25, 25, 48の４種がインフルエンザウイルスH5強毒株の検出に好適であることがわかった。なお、クローンA27及びA310については、表１の結果において少なくとも１つのインフルエンザウイルスH5強毒株に対して反応しないので、インフルエンザウイルスH5強毒株の検出には不適と判断した。 As is clear from Table 4-2, four types of clones 64, A25, 25, and 48 were found to be suitable for detecting influenza virus H5 virulent strains. It should be noted that clones A27 and A310 did not react with at least one influenza virus H5 virulent strain in the results shown in Table 1, and thus were judged unsuitable for detection of influenza virus H5 virulent strain.

実施例３（ニワトリの類似疾病病原体を用いた特異性試験）
実施例2にて作製したイムノクロマトキット（捕捉部位に固定する抗H5抗体としてB29/1を用い、金コロイド標識抗体の抗H5抗体としてA27/1を用いた）を使用し、ニワトリにおける類似疾病病原体の特異性試験を実施した。試験は、各病原体ウイルスを検体希釈液で希釈して２．５μｇ／ｍＬに調整して被験試料とした以外、実施例２と同様の方法で行った。 Example 3 (Specificity test using a similar pathogen of chicken)
Using the immunochromatography kit prepared in Example 2 (using B29 / 1 as the anti-H5 antibody immobilized on the capture site and using A27 / 1 as the anti-H5 antibody of the colloidal gold-labeled antibody), a similar disease pathogen in chicken Specificity tests were performed. The test was carried out in the same manner as in Example 2, except that each pathogen virus was diluted with a sample diluent and adjusted to 2.5 μg / mL to obtain a test sample.

病原体Newcastle disease virus（株名NDV/Mongoria/705/02（APMV-1））、Avian paramyxovirus（血清型2）（株名 Chicken/California/Yucaipa/56（APMV-2））、Avian paramyxovirus（血清型3）（株名 Turkey/Wisconsin/68（APMV-3））、Avian paramyxovirus（血清型4）（株名 Duck/Mississippi/320/75（APMV-4））、Avian paramyxovirus（血清型5）（株名 Budgerigar/Kunitachi/74（APMV-5））、Avian paramyxovirus（血清型6）（株名 Duck/HongKong/199/77（APMV-6））、Avian paramyxovirus（血清型7）（株名 Dove/Tennessee/4/75（APMV-7））、Coronavirus（株名 B-42）、Herpesvirus（株名 NS1751）、Poxvirus（泗水）、Pasteurella multocida（血清型5A, 8A, 9A）、Haemophilus Paragallinarum（株名 HK-1）、Mycoplasma gallisepticum, M. synoviae（株名 C5PT）、Aspergillus fumigates, A. flavus（株名 KI-102162）を試験に供したが、表５の結果に示すとおり、いずれの病原体についても捕捉部位３１での呈色は見られなかった。従って、表５に挙げた病原体すべてにおいて本発明のインフルエンザウイルスH5亜型検出用イムノクロマトキットの捕捉部位が呈色せず、反応しないことが確認された。なお、用いた病名、病原体名、株名を表５に併記した。表５中、−は捕捉部位の着色が無いことを示す。 Pathogens Newcastle disease virus (strain name NDV / Mongoria / 705/02 (APMV-1)), Avian paramyxovirus (serotype 2) (strain name Chicken / California / Yucaipa / 56 (APMV-2)), Avian paramyxovirus (serotype) 3) (strain name Turkey / Wisconsin / 68 (APMV-3)), Avian paramyxovirus (serotype 4) (strain name Duck / Mississippi / 320/75 (APMV-4)), Avian paramyxovirus (serotype 5) (strain) Name Budgerigar / Kunitachi / 74 (APMV-5)), Avian paramyxovirus (serotype 6) (strain name Duck / HongKong / 199/77 (APMV-6)), Avian paramyxovirus (serotype 7) (strain name Dove / Tennessee / 4/75 (APMV-7)), Coronavirus (strain name B-42), Herpesvirus (strain name NS1751), Poxvirus (salted water), Pasteurella multocida (serotype 5A, 8A, 9A), Haemophilus Paragallinarum (strain name HK -1), Mycoplasma gallisepticum, M. synoviae (strain name C5PT), Aspergillus fumigates, A. flavus (strain name KI-102162) were used for the test. As shown in the results of Table 5, any pathogens were captured. Site 31 The coloration was observed. Therefore, it was confirmed that the capture site of the immunochromatography kit for detecting influenza virus H5 subtype of the present invention was not colored and did not react in all the pathogens listed in Table 5. The disease names, pathogen names, and strain names used are also shown in Table 5. In Table 5,-shows that there is no coloring of a capture part.

実施例4（感染実験用インフルエンザウイルスH5N1及びH9N2との反応性実験）
実施例2にて作製したイムノクロマトキット（捕捉部位に固定する抗H5抗体としてB29/1を用い、金コロイド標識抗体の抗H5抗体としてA27/1を用いた）を使用し、感染実験用インフルエンザウイルスH5N1及びH9N2の反応性実験を実施した。インフルエンザウイルスH5N1として株名A/Ck/Yamaguchi/7/04(H5N1)、HA価1024を原液として用い、当該原液及び希釈度（10^-1、10^-2、10^-3、10^-4）に調製した希釈液を被験試料として反応に供した。また、インフルエンザウイルスH9N2として株名A/Ck/Y-55/01(H9N2)、HA価4096を原液として用い、当該原液及び希釈度（10^-1、10^-2）に調製した希釈液を被験試料として反応に供した。結果は表６に示した。表６中、−は捕捉部位の着色が無いことを示し、＋は捕捉部位の着色が見られたことを示す。
表６から明らかなように、インフルエンザウイルスH5N1では原液から希釈度10^-3までは反応性が確認されたが、希釈度10^-4では反応性が確認できなかった。またインフルエンザウイルスH9N2では原液及びすべての希釈液で反応性は確認されなかった。 Example 4 (Reactivity experiment with influenza viruses H5N1 and H9N2 for infection experiments)
Influenza virus for infection experiments using the immunochromatography kit prepared in Example 2 (B29 / 1 was used as the anti-H5 antibody immobilized on the capture site and A27 / 1 was used as the anti-H5 antibody of the colloidal gold-labeled antibody) H5N1 and H9N2 reactivity experiments were performed. Influenza virus H5N1, using the stock name A / Ck / Yamaguchi / 7/04 (H5N1), HA value 1024 as the stock solution, the stock solution and dilution (10 ^-1 , 10 ^-2 , 10 ^-3 , 10 ^-4 ) The prepared diluted solution was subjected to the reaction as a test sample. In addition, using the stock name A / Ck / Y-55 / 01 (H9N2) as the influenza virus H9N2 and HA value 4096 as the stock solution, test the stock solution and the diluted solution prepared in the dilution (10 ^-1 , 10 ^-2 ) It used for reaction as a sample. The results are shown in Table 6. In Table 6, “-” indicates that the capture site is not colored, and “+” indicates that the capture site is colored.
As is clear from Table 6, reactivity was confirmed from the stock solution to a dilution of 10 ^{−3 with} influenza virus H5N1, but no reactivity was confirmed at a dilution of 10 ⁻⁴ . For influenza virus H9N2, no reactivity was confirmed in the stock solution and all dilutions.

実施例5（インフルエンザウイルスH5N1を接種したニワトリのクロアカスワブ等からのウイルス抗原の検出）
インフルエンザウイルスH5N1をニワトリに接種し、当該ウイルスを感染させたニワトリのクロアカスワブを採取しウイルス抗原の検出を実施した。
感染対象鳥として白色レグホン種を用いた。供試ウイルスは株名A/chicken/Yamaguchi/7/04(H5N1)を用い、ウイルス液を経鼻的にニワトリに接種し、死亡するまで毎日クロアカスワブを採取した。このニワトリは感染後3日目に死亡し、その直後に気管スワブ及び各種臓器を採取した。
気管スワブ及びクロアカスワブは検体希釈液に懸濁し被験試料とした。各種臓器はそれぞれを無菌的に採材し、採材した各臓器重量に対し9倍量のPBSを添加し、磨り潰すことで10％臓器乳剤を作製した。そして、本乳剤を遠心分離し、遠心分離上清を被験試料とした。これらの被験試料を、実施例2にて作製したイムノクロマトキット（捕捉部位に固定する抗H5抗体としてB29/1を用い、金コロイド標識抗体の抗H5抗体としてA27/1を用いた）の試験に供した。また、各種臓器についてウイルス分離を実施した。その結果を表７及び表８に示す。表７及び表８中、−は捕捉部位の着色が無いことを示し、＋は捕捉部位の着色が見られたことを示す。 Example 5 (Detection of virus antigens from chicken cloacaswab inoculated with influenza virus H5N1)
Influenza virus H5N1 was inoculated into chickens, and chicken cloacas swabs infected with the virus were collected to detect virus antigens.
A white leghorn species was used as the target bird. The test virus was strain name A / chicken / Yamaguchi / 7/04 (H5N1). The virus solution was inoculated nasally into chickens, and cloacaswab was collected every day until death. The chicken died 3 days after infection, and immediately after that tracheal swabs and various organs were collected.
Tracheal swabs and cloacaswab were suspended in a specimen diluent and used as test samples. Various organs were sampled aseptically, and 9% PBS was added to the weight of each organ collected and ground to prepare a 10% organ emulsion. Then, the emulsion was centrifuged, and the centrifuged supernatant was used as a test sample. These test samples were tested in the immunochromatography kit prepared in Example 2 (using B29 / 1 as the anti-H5 antibody immobilized on the capture site and A27 / 1 as the anti-H5 antibody of the colloidal gold-labeled antibody). Provided. In addition, virus isolation was performed on various organs. The results are shown in Tables 7 and 8. In Tables 7 and 8,-indicates that the capture site is not colored, and + indicates that the capture site is colored.

表７から、ウイルス接種後1、2日とも抗原検出が見られたため、本発明によれば、感染後数日経過後の感染鳥であれば、クロアカスワブからのウイルス抗原の検出が可能であることが示された。 From Table 7, since antigen detection was observed on days 1 and 2 after virus inoculation, according to the present invention, it is possible to detect virus antigens from cloacaswab in the case of infected birds several days after infection. Indicated.

表８から、本発明によれば、気管スワブ及びすべての臓器乳剤からウイルス抗原を検出することが可能であり、臓器乳剤については、その検出結果はウイルス分離結果ともすべて一致することが示された。以上の結果より、本発明によれば、感染鳥の各種部位から採取した検体を用いてウイルス抗原を高感度に検出できることが確認された。
なお、表８にウイルス分離結果として示された数値は、ウイルス感染価（10^X EID₅₀/ml or g）であり、上記１０％臓器乳剤の１０倍希釈系列を作成し、各希釈液を９〜１１日齢発育鶏卵に接種して２日間培養した後、該発育鶏卵から尿液を採取してＨＡ試験に供し、その結果から算出した。 Table 8 shows that according to the present invention, it was possible to detect viral antigens from tracheal swabs and all organ emulsions, and for the organ emulsions, the detection results were all consistent with the virus isolation results. . From the above results, according to the present invention, it was confirmed that virus antigens can be detected with high sensitivity using specimens collected from various parts of infected birds.
The numerical values shown as virus separation results in Table 8 are the virus infectivity titer (10 ^X EID ₅₀ / ml or g). A 10-fold dilution series of the above 10% organ emulsion was prepared. After inoculating ˜11 day-old chicken eggs and culturing for 2 days, urine was collected from the chicken eggs and subjected to HA test, and the results were calculated.

実施例6（インフルエンザウイルスH5N1との反応性試験）
実施例２にて作製したイムノクロマトキット（捕捉部位に固定する抗H5抗体としてNo.64を用い、金コロイド標識抗体の抗H5抗体としてNo.64を用いた）を使用し、インフルエンザウイルスH5N1との反応性試験を実施した。インフルエンザウイルスH5N1原液として、A/Chicken/Yamaguchi/7/04（HA価：1024HA），A/Hongkong/483/97（HA価：512HA），A/Chicken/Suphanburi/1/04（HA価：512HA），A/Vietnam/1194/04（HA価：512HA），A/Whooperswan/Mongolia/3/05（HA価：16HA）を用いた。対照のインフルエンザウイルス原液としてA/Swan/Hokkaido/51/96（H5N3）（HA価：256HA），A/Chicken/Ibaraki/1/05（H5N2）（HA価：512HA）およびA/Chicken/Italy/99（H7N1）（HA価：512HA），A/Chicken/Netherlands/03（H7N7）（HA価：512HA）を用いた。これらのウイルス原液を検体希釈液にて希釈して被験試料を調製し、反応に供した。なお、A/Chicken/Yamaguchi/7/04はウイルス原液を６２５倍に希釈して被験試料とし、それ以外の株は１２５倍に希釈して被験試料とした。
結果を図２に示した。図２から明らかなように、このイムノクロマトキットは、すべてのH5亜型に対し反応性を示し、また対照としたH7亜型に対しては、反応性は示さなかった。 Example 6 (Reactivity test with influenza virus H5N1)
Using the immunochromatography kit prepared in Example 2 (No. 64 was used as the anti-H5 antibody immobilized on the capture site and No. 64 was used as the anti-H5 antibody of the gold colloid-labeled antibody), and the influenza virus H5N1 A reactivity test was performed. As influenza virus H5N1 stock solution, A / Chicken / Yamaguchi / 7/04 (HA value: 1024HA), A / Hongkong / 483/97 (HA value: 512HA), A / Chicken / Suphanburi / 1/04 (HA value: 512HA) ), A / Vietnam / 1194/04 (HA value: 512HA), A / Whooperswan / Mongolia / 3/05 (HA value: 16HA). A / Swan / Hokkaido / 51/96 (H5N3) (HA value: 256HA), A / Chicken / Ibaraki / 1/05 (H5N2) (HA value: 512HA) and A / Chicken / Italy / 99 (H7N1) (HA value: 512HA) and A / Chicken / Netherlands / 03 (H7N7) (HA value: 512HA) were used. These virus stock solutions were diluted with a specimen diluent to prepare test samples, which were subjected to the reaction. In A / Chicken / Yamaguchi / 7/04, the virus stock solution was diluted 625 times to obtain a test sample, and other strains were diluted 125 times to serve as test samples.
The results are shown in FIG. As is apparent from FIG. 2, this immunochromatography kit showed reactivity to all H5 subtypes and no reactivity to the control H7 subtype.

さらに、上記のイムノクロマトキット（捕捉部位に固定する抗H5抗体としてNo.64を用い、金コロイド標識抗体の抗H5抗体としてNo.64を用いた）及び別のイムノクロマトキット（捕捉部位に固定する抗H5抗体としてNo. B29/1を用い、金コロイド標識抗体の抗H5抗体としてNo. A27/1を用いた）を用意し、A/Chicken/Yamaguchi/7/04，A/Hongkong/483/97，A/Chicken/Suphanburi/1/04，A/Vietnam/1194/04，A/Whooperswan/Mongolia/3/05，A/Swan/Hokkaido/51/96（H5N3）及びA/Chicken/Ibaraki/1/05（H5N2）の各ウイルス原液を検体希釈液で２５、１２５及び６２５倍に希釈した被験試料を調製し、反応に供した。
結果を表９に示した。表９から明らかなように、抗H5抗体としてNo.64を用いたイムノクロマトキットは、インフルエンザウイルスH5強毒株及び弱毒株と良好に反応し、とりわけ、インフルエンザウイルスH5強毒株の検出に好適である。 Furthermore, the above immunochromatography kit (No. 64 was used as the anti-H5 antibody immobilized on the capture site and No. 64 was used as the anti-H5 antibody of the colloidal gold labeled antibody) and another immunochromatography kit (anti-immobilization immobilized on the capture site). No. B29 / 1 was used as the H5 antibody and No. A27 / 1 was used as the anti-H5 antibody of the colloidal gold labeled antibody), and A / Chicken / Yamaguchi / 7/04, A / Hongkong / 483/97 , A / Chicken / Suphanburi / 1/04, A / Vietnam / 1194/04, A / Whooperswan / Mongolia / 3/05, A / Swan / Hokkaido / 51/96 (H5N3) and A / Chicken / Ibaraki / 1 / Test samples were prepared by diluting each virus stock solution of 05 (H5N2) 25, 125, and 625 times with a sample diluent, and subjected to the reaction.
The results are shown in Table 9. As is apparent from Table 9, the immunochromatography kit using No. 64 as an anti-H5 antibody reacts well with influenza virus H5 virulence strain and attenuated strain, and is particularly suitable for detection of influenza virus H5 virulence strain. is there.

上記のイムノクロマトキット（捕捉部位に固定する抗H5抗体としてNo.64を用い、金コロイド標識抗体の抗H5抗体としてNo.64を用いた）を使用し、動物由来インフルエンザウイルスH1からH15の各亜型に対する反応性試験を実施した。各ウイルス株を検体希釈液にて希釈して調製し、被験試料とした。そして、被験試料100μlを滴下してクロマト展開し、室温で15分放置後に目視判定を行った。結果を表１０に示した。 Using the above immunochromatography kit (No. 64 was used as the anti-H5 antibody immobilized on the capture site and No. 64 was used as the anti-H5 antibody of the colloidal gold-labeled antibody), each of the subtypes of animal-derived influenza viruses H1 to H15 was used. A reactivity test on the mold was performed. Each virus strain was prepared by diluting with a specimen diluent and used as a test sample. Then, 100 μl of a test sample was dropped and chromatographed, and after standing at room temperature for 15 minutes, visual judgment was performed. The results are shown in Table 10.

表１０から明らかなように、このイムノクロマトキットは、インフルエンザウイルスH5亜型以外のインフルエンザウイルスとは反応せず、H5亜型に対して特異的に反応することが示された。 As is clear from Table 10, this immunochromatography kit did not react with influenza viruses other than the influenza virus H5 subtype, but was shown to react specifically with the H5 subtype.

実施例７（インフルエンザウイルスH5N1を接種したニワトリのクロアカスワブ等からのウイルス抗原の検出）
インフルエンザウイルスH5N1（A/Chicken/Yamaguchi/7/04、以下「山口株」と略称）をニワトリに接種し、当該ウイルスを感染させたニワトリの気管スワブ及びクロアカスワブを採取し、イムノクロマトキットによるウイルス抗原の検出を実施した。また死亡鳥から気管、腎臓、結腸を採取し、臓器乳剤を作製し、イムノクロマトキットによるウイルス抗原の検出を実施した。
感染対象鳥として、ボリスブラウン種を用いた。ウイルス液を経鼻的にニワトリに接種し、死亡するまで毎日クロアカスワブ及び気管スワブを接種した。
気管スワブ及びクロアカスワブは検体希釈液に懸濁し被験試料とした。各種臓器はそれぞれ無菌的に採材し、採材した各臓器重量に対し9倍量のPBSを添加し、磨り潰すことで10％臓器乳剤を作製した。そして本乳剤を遠心分離し、遠心分離上清を被験試料とした。これらの被験試料を実施例２にて作製したイムノクロマトキット（捕捉部位に固定する抗H5抗体としてNo.64を用い、金コロイド標識抗体の抗H5抗体としてNo.64を用いた）の試験に供した。そして、捕捉部位の呈色の程度を、目視で、−（着色なし）、±（微弱な着色）、＋（明確な着色）、＋＋（顕著な着色）、＋＋＋（より顕著な着色）の５段階で評価した。結果を表１１及び表１２に示した。なお、表１１及び表１２中、ｄは日数を示し、（Ｄ）はその日に死亡したことを意味する。
また、上記気管スワブ及び上記クロアカスワブ並びに各種臓器の上記10％臓器乳剤を用いて実施例５と同様の方法でウイルス感染価（10^X EID₅₀/ml or g）を算出し、結果を表１１及び表１２に示した。 Example 7 (Detection of virus antigen from cloacaswab of chicken inoculated with influenza virus H5N1)
Inoculate a chicken with influenza virus H5N1 (A / Chicken / Yamaguchi / 7/04, hereinafter abbreviated as “Yamaguchi strain”), collect tracheal swab and cloacaswab from the chicken infected with the virus, Detection was performed. In addition, trachea, kidney and colon were collected from dead birds, organ emulsions were prepared, and virus antigens were detected with an immunochromatography kit.
Boris Brown was used as the target bird. Viral fluid was inoculated nasally in chickens and daily inoculated with cloacas and tracheal swabs until death.
Tracheal swabs and cloacaswab were suspended in a specimen diluent and used as test samples. Various organs were collected aseptically, and 9% of PBS was added to the weight of each collected organ and ground to prepare a 10% organ emulsion. Then, the emulsion was centrifuged, and the centrifuged supernatant was used as a test sample. These test samples were subjected to the immunochromatography kit prepared in Example 2 (No. 64 was used as the anti-H5 antibody immobilized on the capture site and No. 64 was used as the anti-H5 antibody of the colloidal gold labeled antibody). did. Then, the degree of coloration of the capturing site is visually determined as 5 (no coloring), ± (weak coloring), + (clear coloring), ++ (conspicuous coloring), and +++ (more remarkable coloring). Rated by stage. The results are shown in Tables 11 and 12. In Tables 11 and 12, d indicates the number of days, and (D) means that the person died on that day.
Further, the virus infectivity titer (10 ^X EID ₅₀ / ml or g) was calculated in the same manner as in Example 5 using the tracheal swab, the cloacaswab and the 10% organ emulsion of various organs. It is shown in Table 12.

表１１よりウイルス接種２日後より気管スワブ及びクロアカスワブにおいて抗原検出が確認された。したがって、本発明によれば感染後数日経過後の感染鳥であれば、気管及びクロアカからのウイルス抗原の検出が可能である。また、表１１から、本発明のイムノクロマト法による検出結果は、ウイルス分離によるウイルス感染価とも一致することがわかる。 From Table 11, antigen detection was confirmed in the tracheal swab and cloacaswab 2 days after the virus inoculation. Therefore, according to the present invention, it is possible to detect viral antigens from the trachea and cloaca as long as it is an infected bird several days after infection. Moreover, it can be seen from Table 11 that the detection result by the immunochromatography method of the present invention coincides with the virus infectivity value by virus separation.

表１２から、本発明によれば、すべての臓器乳剤からウイルス抗原を検出することが可能であることがわかる。以上の結果より、本発明によれば、感染鳥の各種部位から採取した検体を用いてウイルスを高感度に検出できることが確認された。また、表１２から、本発明のイムノクロマト法による検出結果は、ウイルス分離によるウイルス感染価とも一致することがわかる。 From Table 12, it can be seen that according to the present invention, it is possible to detect viral antigens from all organ emulsions. From the above results, according to the present invention, it was confirmed that viruses can be detected with high sensitivity using specimens collected from various parts of infected birds. Further, from Table 12, it can be seen that the detection result by the immunochromatography method of the present invention coincides with the virus infectivity value by virus separation.

本発明は、インフルエンザウイルスＨ５亜型のヘマグルチニン蛋白に対する抗体を用いたサンドイッチ式免疫測定法、特に、イムノクロマトグラフィー測定法およびイムノクロマト法テストストリップを提供するものであり、インフルエンザウイルスＨ５亜型に属するウイルスを特異的に簡単な方法で迅速に検出できるので、当該ウイルスに起因する鳥、ヒト等の疾病を迅速かつ簡便に診断するために有用である。 The present invention provides a sandwich immunoassay method using an antibody against hemagglutinin protein of influenza virus H5 subtype, in particular, an immunochromatographic assay method and an immunochromatographic test strip, and a virus belonging to influenza virus H5 subtype is provided. Since it can be rapidly detected by a specific and simple method, it is useful for quickly and easily diagnosing diseases such as birds and humans caused by the virus.

ａはイムノクロマト法テストストリップの平面図、ｂはａで示されたイムノクロマト法テストストリップの縦断面図。a is a plan view of an immunochromatographic test strip, and b is a longitudinal sectional view of the immunochromatographic test strip indicated by a. 実施例６の結果を示すグラフである。10 is a graph showing the results of Example 6.

１粘着シート
２含浸部材
３膜担体
３１捕捉部位
４吸収用部材
５試料添加用部材 DESCRIPTION OF SYMBOLS 1 Adhesive sheet 2 Impregnation member 3 Membrane carrier 31 Capture part 4 Absorption member 5 Sample addition member

Claims

An influenza virus H5 subtype detection method comprising an immunoassay using an antibody against hemagglutinin protein of influenza virus H5 subtype, wherein said antibody is influenza virus H5 subtype A / tn / S. Africa / 61, A / swan / Shima / 449/83 (24a5b), A / HongKong / 156/97, A / HongKong / 483/97, A / duck / Yokohama / aq-10 / 2003 and A / chicken / Yamaguchi / 7/04 A detection method that is a monoclonal antibody that reacts against all of the above.

The monoclonal antibodies are further attenuated strains of influenza virus H5 subtype A / duck / Mi / 54/76, A / duck / HongKong / 342/78, A / duck / HongKong / 698/79, A / duck / Pennsylvania / 10128/84, A / swan / Hokkaido / 4/96, A / swan / Hokkaido / 51/96, A / swan / Hokkaido / 67/96, A / duck / Hokkaido / 69/00, A / duck For all of / Hokkaido / 447/00, A / duck / Mongolia / 54/01, A / duck / Mongolia / 500/01, A / duck / Mongolia / 596/01 and A / duck / Hokkaido / 84/02 The detection method according to claim 1, wherein

The monoclonal antibodies are influenza viruses other than H5 subtypes A / duck / Tottori / 723/80, A / duck / Hokkaido / 17/01, A / duck / Mongolia / 4/03, A / duck / Czech / 56, A / turkey / Massachusetts / 3740/65, A / seal / Massachusetts / 1/80, A / turkey / Ontario / 67, A / turkey / Wisconsin / 66, A / chicken / Germany / N / 49, A / Does not react with any of duck / England / 56, A / duck / Alberta / 60/76, A / gull / Maryland / 704/77, A / mallard / Astrakhan / 263/82 and A / duck / Australia / 341/83 The detection method according to claim 2, wherein

The monoclonal antibodies are further influenza virus H5 subtypes A / Vietnam / 1194/04, A / Chicken / Suphanburi / 1/04, A / Whooperswan / Mongolia / 3/05 and A / Chicken / Ibaraki / 1 / The detection method according to claim 3, which reacts with all of 05.

The detection method according to claim 4, wherein the monoclonal antibody further does not react with any of A / Chicken / Italy / 99 and A / Chicken / Netherlands / 03, which are influenza viruses other than the H5 subtype.

A method for detecting influenza virus H5 subtype comprising a sandwich immunoassay using a first antibody and a second antibody against hemagglutinin protein of influenza virus H5 subtype, wherein said first antibody and said second antibody A / tn / S.Africa / 61, A / swan / Shima / 449/83 (24a5b), A / HongKong / 156/97, A / HongKong, at least one of the antibodies of which is influenza virus H5 subtype / 483/97, A / duck / Yokohama / aq-10 / 2003 and A / chicken / Yamaguchi / 7/04, a detection method that is a monoclonal antibody that reacts with all.

The monoclonal antibodies are further attenuated strains of influenza virus H5 subtype A / duck / Mi / 54/76, A / duck / HongKong / 342/78, A / duck / HongKong / 698/79, A / duck / Pennsylvania / 10128/84, A / swan / Hokkaido / 4/96, A / swan / Hokkaido / 51/96, A / swan / Hokkaido / 67/96, A / duck / Hokkaido / 69/00, A / duck For all of / Hokkaido / 447/00, A / duck / Mongolia / 54/01, A / duck / Mongolia / 500/01, A / duck / Mongolia / 596/01 and A / duck / Hokkaido / 84/02 The detection method according to claim 6, wherein

The monoclonal antibodies are influenza viruses other than H5 subtypes A / duck / Tottori / 723/80, A / duck / Hokkaido / 17/01, A / duck / Mongolia / 4/03, A / duck / Czech / 56, A / turkey / Massachusetts / 3740/65, A / seal / Massachusetts / 1/80, A / turkey / Ontario / 67, A / turkey / Wisconsin / 66, A / chicken / Germany / N / 49, A / Does not react with any of duck / England / 56, A / duck / Alberta / 60/76, A / gull / Maryland / 704/77, A / mallard / Astrakhan / 263/82 and A / duck / Australia / 341/83 The detection method according to claim 7, wherein

The monoclonal antibodies are further influenza virus H5 subtypes A / Vietnam / 1194/04, A / Chicken / Suphanburi / 1/04, A / Whooperswan / Mongolia / 3/05 and A / Chicken / Ibaraki / 1 / The detection method according to claim 8, which reacts with all of 05.

The detection method according to claim 9, wherein the monoclonal antibody further does not react with any of A / Chicken / Italy / 99 and A / Chicken / Netherlands / 03, which are influenza viruses other than the H5 subtype.

The detection method according to any one of claims 6 to 10, wherein either one of the first antibody and the second antibody is immobilized on a carrier.

A membrane carrier having a capture site formed by preliminarily immobilizing a first antibody against influenza virus H5 subtype hemagglutinin protein in a predetermined position, a second antibody against influenza virus H5 subtype hemagglutinin protein and a predetermined amount The mixed solution with the test sample is chromatographed on the membrane carrier toward the capture site, and a complex comprising the influenza virus H5 subtype and the second antibody contained in the test sample is obtained. An immunochromatographic measurement method for capturing at a capture site, wherein at least one of the first antibody and the second antibody is an influenza virus H5 subtype A / tn / S. Africa / 61, A / All of swan / Shima / 449/83 (24a5b), A / HongKong / 156/97, A / HongKong / 483/97, A / duck / Yokohama / aq-10 / 2003 and A / chicken / Yamaguchi / 7/04 Monochrome that reacts to Measurement method, which is a monoclonal antibody.

The monoclonal antibodies are further attenuated strains of influenza virus H5 subtype A / duck / Mi / 54/76, A / duck / HongKong / 342/78, A / duck / HongKong / 698/79, A / duck / Pennsylvania / 10128/84, A / swan / Hokkaido / 4/96, A / swan / Hokkaido / 51/96, A / swan / Hokkaido / 67/96, A / duck / Hokkaido / 69/00, A / duck For all of / Hokkaido / 447/00, A / duck / Mongolia / 54/01, A / duck / Mongolia / 500/01, A / duck / Mongolia / 596/01 and A / duck / Hokkaido / 84/02 The measurement method according to claim 12, which reacts with each other.

The monoclonal antibodies are influenza viruses other than H5 subtypes A / duck / Tottori / 723/80, A / duck / Hokkaido / 17/01, A / duck / Mongolia / 4/03, A / duck / Czech / 56, A / turkey / Massachusetts / 3740/65, A / seal / Massachusetts / 1/80, A / turkey / Ontario / 67, A / turkey / Wisconsin / 66, A / chicken / Germany / N / 49, A / Does not react with any of duck / England / 56, A / duck / Alberta / 60/76, A / gull / Maryland / 704/77, A / mallard / Astrakhan / 263/82 and A / duck / Australia / 341/83 The measurement method according to claim 13.

The monoclonal antibodies are further influenza virus H5 subtypes A / Vietnam / 1194/04, A / Chicken / Suphanburi / 1/04, A / Whooperswan / Mongolia / 3/05 and A / Chicken / Ibaraki / 1 / The method according to claim 14, which reacts to all of 05.

The measurement method according to claim 15, wherein the monoclonal antibody further does not react with any of A / Chicken / Italy / 99 and A / Chicken / Netherlands / 03, which are influenza viruses other than the H5 subtype.

The method according to any one of claims 12 to 16, wherein the second antibody is labeled with a metal colloid or latex.

The measurement method according to claim 12, wherein the membrane carrier is a nitrocellulose membrane.

A first antibody against influenza virus H5 subtype hemagglutinin protein, a second antibody, and a membrane carrier, wherein the first antibody is preliminarily fixed at a predetermined position of the membrane carrier to form a capture site, The second antibody is an immunochromatographic test strip for detecting influenza virus H5 subtype, which is labeled with an appropriate labeling substance and arranged so as to be chromatographed on the membrane carrier at a position separated from the capture site. A / tn / S. Africa / 61, A / swan / Shima / 449/83 (24a5b) wherein at least one of the first antibody and the second antibody is an influenza virus H5 subtype Immunochromatography, a monoclonal antibody that reacts with all of A / HongKong / 156/97, A / HongKong / 483/97, A / duck / Yokohama / aq-10 / 2003 and A / chicken / Yamaguchi / 7/04 Law test strip.

The monoclonal antibodies are further attenuated strains of influenza virus H5 subtype A / duck / Mi / 54/76, A / duck / HongKong / 342/78, A / duck / HongKong / 698/79, A / duck / Pennsylvania / 10128/84, A / swan / Hokkaido / 4/96, A / swan / Hokkaido / 51/96, A / swan / Hokkaido / 67/96, A / duck / Hokkaido / 69/00, A / duck For all of / Hokkaido / 447/00, A / duck / Mongolia / 54/01, A / duck / Mongolia / 500/01, A / duck / Mongolia / 596/01 and A / duck / Hokkaido / 84/02 The immunochromatographic test strip according to claim 19, wherein the immunochromatographic test strip is reacted.

The monoclonal antibodies are influenza viruses other than H5 subtypes A / duck / Tottori / 723/80, A / duck / Hokkaido / 17/01, A / duck / Mongolia / 4/03, A / duck / Czech / 56, A / turkey / Massachusetts / 3740/65, A / seal / Massachusetts / 1/80, A / turkey / Ontario / 67, A / turkey / Wisconsin / 66, A / chicken / Germany / N / 49, A / Does not react with any of duck / England / 56, A / duck / Alberta / 60/76, A / gull / Maryland / 704/77, A / mallard / Astrakhan / 263/82 and A / duck / Australia / 341/83 21. The immunochromatographic test strip according to claim 20.

The monoclonal antibodies are further influenza virus H5 subtypes A / Vietnam / 1194/04, A / Chicken / Suphanburi / 1/04, A / Whooperswan / Mongolia / 3/05 and A / Chicken / Ibaraki / 1 / The immunochromatographic test strip according to claim 21, which reacts with all of 05.

The immunochromatographic test strip according to claim 22, wherein the monoclonal antibody further does not react with any of A / Chicken / Italy / 99 and A / Chicken / Netherlands / 03, which are influenza viruses other than the H5 subtype.

The immunochromatographic test strip according to any one of claims 19 to 23, wherein the second antibody is labeled with a metal colloid or latex.

The immunochromatographic test strip according to any one of claims 19 to 24, wherein the membrane carrier is a nitrocellulose membrane.

Influenza virus H5 subtype A / tn / S. Africa / 61, A / swan / Shima / 449/83 (24a5b), A / HongKong / 156/97, A / HongKong / 483/97, A / duck / Monoclonal antibodies that react against all of Yokohama / aq-10 / 2003 and A / chicken / Yamaguchi / 7/04.

Further, the monoclonal antibodies are attenuated strains of influenza virus H5 subtypes A / duck / Mi / 54/76, A / duck / HongKong / 342/78, A / duck / HongKong / 698/79, A / duck / Pennsylvania / 10128/84, A / swan / Hokkaido / 4/96, A / swan / Hokkaido / 51/96, A / swan / Hokkaido / 67/96, A / duck / Hokkaido / 69/00, A / duck For all of / Hokkaido / 447/00, A / duck / Mongolia / 54/01, A / duck / Mongolia / 500/01, A / duck / Mongolia / 596/01 and A / duck / Hokkaido / 84/02 27. The monoclonal antibody according to claim 26, which reacts with the reaction.

The monoclonal antibodies are influenza viruses other than H5 subtypes A / duck / Tottori / 723/80, A / duck / Hokkaido / 17/01, A / duck / Mongolia / 4/03, A / duck / Czech / 56, A / turkey / Massachusetts / 3740/65, A / seal / Massachusetts / 1/80, A / turkey / Ontario / 67, A / turkey / Wisconsin / 66, A / chicken / Germany / N / 49, A / Does not react with any of duck / England / 56, A / duck / Alberta / 60/76, A / gull / Maryland / 704/77, A / mallard / Astrakhan / 263/82 and A / duck / Australia / 341/83 28. The monoclonal antibody according to claim 27, which is an antibody.

The monoclonal antibodies are further influenza virus H5 subtypes A / Vietnam / 1194/04, A / Chicken / Suphanburi / 1/04, A / Whooperswan / Mongolia / 3/05 and A / Chicken / Ibaraki / 1 / The monoclonal antibody according to claim 28, which reacts with all of 05.

30. The monoclonal antibody according to claim 29, wherein the monoclonal antibody further does not react with any of A / Chicken / Italy / 99 and A / Chicken / Netherlands / 03, which are influenza viruses other than the H5 subtype.