JP5883271B2 - 人造ポリペプチド極細繊維の製造方法 - Google Patents

Description

本発明は合成タンパク質繊維の一種である人造ポリペプチド極細繊維の製造方法に関する。

クモ糸繊維は、高い強度とタフネスを有する繊維であり、高張力鋼、ナイロン６繊維、アラミド繊維、炭素繊維などよりも高い強度とタフネスを有することが知られている。加えて、石油を原料とせず、原料をバイオマス化できる利点もある。人工クモ糸繊維もいくつか提案されており、例えば特許文献１には合成タンパク質紡糸溶液を、湿式紡糸し、９０％メタノールからなる凝固浴中に押し出して繊維とすることが提案されている。特許文献２には湿式紡糸し、２００ＭＰａまたはそれ以上の引張強度を有する本繊維が提案されている。非特許文献１には、湿式紡糸し、メタノール浴と水浴で延伸倍率５倍により強度１．９１〜２．２６ｇ／ｄ、伸度４３．４〜５９．６％の延伸糸が開示されている。非特許文献２には湿式紡糸し、延伸倍率を５倍とすることにより応力６００ＭＰａ、伸度２５％の延伸糸が開示されている。非特許文献３には、湿式紡糸した未延伸糸をスチーム中に５分間滞留させて５倍に延伸させることにより応力２８０〜３５０ＭＰａ、伸度３０〜４０％の延伸糸が開示されている。

しかし、従来の人工クモ繊維は湿式紡糸によって製造されており、湿式紡糸法では、極細繊維を得ることは困難であり、とりわけ直径８μｍ（単繊維繊度で約１deci tex）以下の繊維を安定して得ることは困難であった。

特表２００４−５０３２０４号公報 特表２００９−５２１９２１号公報

Anthoula Lazaris,et.al.,"Spider Silk Fiber Spun from Soluble Recombinant Silk Produced in Mammalian Cells",Science,295,p472,2002年1月18日 Xiao-Xia Xia,et.al.,"Native-sized recombinant spider silk protein produced in metabolically engineered Escherichia coil results in a strong fiber",PNAS,vol.107,No.32,p14059-14063,2010年8月10日 M. Elice,et.al.,"Bioinspired Fibers Follow the Track of Natural Spider Silk",Macromolecules,Vol. 44,No.5,p1166-1176,2011年4月2日

本発明は前記従来の問題を解決するため、単繊維直径の細い人造ポリペプチド極細繊維の製造方法を提供する。

本発明の人造ポリペプチド極細繊維シートの製造方法は、天然クモ糸タンパク質(spider silk proteins)に由来するポリペプチドを含む紡糸液をエレクトロスピニングして得られる人造ポリペプチド極細繊維シートの製造方法であって、前記ポリペプチドを溶媒に溶解して紡糸液とする工程と、前記紡糸液を、電圧をかけた口金からエレクトロスピニングにより吐出させて繊維形成する工程と、減圧乾燥により前記繊維から溶媒を脱離させる工程を含み、前記極細繊維の単繊維の平均直径は１μｍ以下であり、かつ前記極細繊維の単繊維直径は、０．１〜１μｍの間で変動しており、前記極細繊維自体の絡み合いによりシートとすることを特徴とする。

本発明は、天然クモ糸タンパク質に由来するポリペプチドを溶媒に溶解させた紡糸液を、電圧をかけた口金からエレクトロスピニングにより吐出させて繊維形成し、前記繊維から溶媒を脱離させることにより、湿式紡糸法では得ることができない極細繊維を得ることができる。

図１は本発明の一実施例のエレクトロスピニング装置の説明図である。 図２は本発明の別の実施例のエレクトロスピニング装置の説明図である。 図３は本発明の実施例１で得られた人造ポリペプチド極細繊維シートの応力−変位（ひずみ）曲線である。 図４は本発明の実施例２で得られた人造ポリペプチド極細繊維シートの応力−変位（ひずみ）曲線である。 図５は本発明の実施例２で得られた人造ポリペプチド極細繊維シートの走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）写真である。

（１）ポリペプチド
本発明においては、原料として天然型クモ糸タンパク質に由来するポリペプチドを用いる。前記ポリペプチドは、天然型クモ糸タンパク質に由来するものであればよく、特に限定されない。前記ポリペプチドは、強靭性に優れるという観点からクモの大瓶状線で産生される大吐糸管しおり糸タンパク質に由来するポリペプチドであることが好ましい。前記大吐糸管しおり糸タンパク質としては、アメリカジョロウグモ(Nephila clavipes)に由来する大瓶状線スピドロインＭａＳｐ１やＭａＳｐ２、二ワオニグモ(Araneus diadematus)に由来するＡＤＦ３やＡＤＦ４などが挙げられる。前記大吐糸管しおり糸タンパク質に由来するポリペプチドは、大吐糸管しおり糸タンパク質の変異体、類似体又は誘導体などを含む。

前記大吐糸管しおり糸タンパク質に由来するポリペプチドとしては、式１：ＲＥＰ１−ＲＥＰ２（１）で示されるアミノ酸配列の単位を２以上、好ましくは５以上、より好ましくは１０以上含むポリペプチドが挙げられる。或いは、前記大吐糸管しおり糸タンパク質に由来するポリペプチドは、式１：ＲＥＰ１−ＲＥＰ２（１）で示されるアミノ酸配列の単位を含み、かつＣ末端配列が配列番号１〜３のいずれかに示されるアミノ酸配列又は配列番号１〜３のいずれかに示されるアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であるポリペプチドであってもよい。なお、前記大吐糸管しおり糸タンパク質に由来するポリペプチドにおいて、式（１）：ＲＥＰ１−ＲＥＰ２（１）で示されるアミノ酸配列の単位は、同一であってもよく、異なっていてもよい。上記大吐糸管しおり糸タンパク質に由来するポリペプチドは、大腸菌等の微生物を宿主とした組み換えタンパク質生産を行う場合、生産性の観点から、分子量が５００ｋＤａ以下であることが好ましく、より好ましくは３００ｋＤａ以下であり、さらに好ましくは２００ｋＤａ以下である。

前記式（１）において、ＲＥＰ１は、ポリアラニンを意味しており、アラニンが連続して２〜２０残基、より好ましくは３〜１６残基、さらに好ましくは４〜１２残基、最も好ましくは５〜８残基並んでいるアミノ酸配列である。前記式（１）において、ＲＥＰ２は、１０〜２００残基のアミノ酸からなるアミノ酸配列であり、前記アミノ酸配列中に含まれるグリシン、セリン、グルタミン及びアラニンの合計残基数がアミノ酸残基数全体に対して４０％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上である。

大吐糸管しおり糸において、上記ＲＥＰ１は、繊維内で結晶βシートを形成する結晶領域に該当し、上記ＲＥＰ２は、繊維内でより柔軟性があり大部分が規則正しい構造を欠いている無定型領域に該当する。そして、上記［ＲＥＰ１−ＲＥＰ２］は、結晶領域と無定型領域からなる繰り返し領域（反復配列）に該当し、しおり糸タンパク質の特徴的配列である。

配列番号１に示されるアミノ酸配列は、ＡＤＦ３（ＧＩ：１２６３２８７）のアミノ酸配列のＣ末端の５０残基のアミノ酸からなるアミノ酸配列と同一であり、配列番号２に示されるアミノ酸配列は、配列番号１に示されるアミノ酸配列のＣ末端から２０残基取り除いたアミノ酸配列と同一であり、配列番号３に示されるアミノ酸配列は、配列番号１に示されるアミノ酸配列のＣ末端から２９残基取り除いたアミノ酸配列と同一である。

前記式１：ＲＥＰ１−ＲＥＰ２（１）で示されるアミノ酸配列の単位を含み、かつＣ末端配列が配列番号１〜３のいずれかに示されるアミノ酸配列又は配列番号１〜３のいずれかに示されるアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドとしては、例えば、配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを用いることができる。配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは、Ｎ末端に開始コドン、Ｈｉｓ１０タグ及びＨＲＶ３Ｃプロテアーゼ（Human rhinovirus 3Cプロテアーゼ）認識サイトからなるアミノ酸配列（配列番号５）を付加したＡＤＦ３のアミノ酸配列において、第１〜１３番目の反復領域をおよそ２倍になるように増やすとともに、翻訳が第１１５４番目アミノ酸残基で終止するように変異させたものである。配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドにおいて、Ｃ末端配列は、配列番号３に示すアミノ酸配列と同一である。

また、前記式１：ＲＥＰ１−ＲＥＰ２（１）で示されるアミノ酸配列の単位を含み、かつＣ末端配列が配列番号１〜３のいずれかに示されるアミノ酸配列又は配列番号１〜３のいずれかに示されるアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドとしては、配列番号４に示されるアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、結晶領域と無定型領域からなる繰り返し領域を有するタンパク質を用いることができる。本発明において、「１若しくは複数個」とは、例えば、１〜４０個、１〜３５個１〜３０個、１〜２５個、１〜２０個、１〜１５個、１〜１０個、又は１若しくは数個を意味する。また、本発明において、「１若しくは数個」は、１〜９個、１〜８個、１〜７個、１〜６個、１〜５個、１〜４個、１〜３個、１〜２個、又は１個を意味する。

配列番号９に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド（以下において、ＡＤＦ３ｋａｉ−Ｆと記す。）は、ＡＤＦ３のアミノ酸配列（ＧＩ：１２６３２８７）のＮ末端に開始コドン、Ｈｉｓ１０タグ及びＨＲＶ３Ｃプロテアーゼ認識サイトからなるアミノ酸配列（配列番号５）が付加され、Ｃ末端から２９個のアミノ酸残基が削除され、すなわちＣ末端に配列番号１０に示されるアミノ酸配列が配置されたアミノ酸配列（配列番号７）において、第２２、３１及び３２番目のＧｌｎがＬｙｓに置換され、第２６番目のアルギニン（Ａｒｇ）がＬｙｓに置換されたものである。

前記ポリペプチドは、ポリペプチドをコードする遺伝子を含有する発現ベクターで形質転換した宿主を用いて製造することができる。遺伝子の製造方法は特に制限されず、天然型クモ糸タンパク質をコードする遺伝子をクモ由来の細胞からポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などで増幅しクローニングするか、若しくは化学的に合成する。遺伝子の化学的な合成方法も特に制限されず、例えば、ＮＣＢＩのウェブデータベースなどより入手した天然型クモ糸タンパク質のアミノ酸配列情報をもとに、ＡＫＴＡ ｏｌｉｇｏｐｉｌｏｔ ｐｌｕｓ １０／１００（ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社）などで自動合成したオリゴヌクレオチドをＰＣＲなどで連結して合成することができる。この際に、タンパク質の精製や確認を容易にするため、上記のアミノ酸配列のＮ末端に開始コドン及びＨｉｓ１０タグからなるアミノ酸配列を付加したアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子を合成してもよい。上記発現ベクターとしては、ＤＮＡ配列からタンパク質を発現し得るプラスミド、ファジー、ウイルスなどを用いることができる。上記プラスミド型発現ベクターとしては、宿主細胞内で目的の遺伝子が発現し、かつ自身が増幅することのできるものであればよく、特に限定されない。例えば宿主として大腸菌Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）を用いる場合は、ｐＥＴ２２ｂ（＋）プラスミドベクター、ｐＣｏｌｄプラスミドベクターなどを用いることができる。中でも、タンパク質の生産性の観点から、ｐＥＴ２２ｂ（＋）プラスミドベクターを用いることが好ましい。上記宿主としては、例えば動物細胞、植物細胞、微生物などを用いることができる。

（２）紡糸液
紡糸液（ドープ液）は、前記ポリペプチドに溶媒を加え、紡糸できる粘度に調整して作成する。例えば前記ポリペプチドがニワオニグモに由来する場合、溶媒は前記ポリペプチドを溶解することができるものであればどのようなものでも良い。一例としてヘキサフルオロイソプロパノール（ＨＦＩＰ）、ヘキサフルオロアセトン（ＨＦＡ）、蟻酸、尿素、グアニジン、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、臭化リチウム、塩化カルシウム、チオシアン酸リチウム等を含む水溶液等などを溶媒とし、適量加えて溶液粘度を１００〜１０，０００ｃＰ（センチポイズ）とする。これを紡糸液とする。アルカリ金属ハロゲン化物は、ＬｉＣｌ，ＮａＣｌ等がある。

（３）エレクトロスピニング
エレクトロスピニング法（静電紡糸法）は、供給側電極(紡糸口金と兼用できる)と捕集側電極(例えば金属ロール又は金属ネット等)間に電圧を印加し、紡糸口金から押し出したドープ液に電荷を与えて捕集側電極に吹き飛ばす。この際にドープ液は伸張されて繊維形成される。本発明において、好ましい印加電圧は、５〜１００ｋＶであり、さらに好ましくは１０〜５０ｋＶである。電圧が５ｋＶ未満であると、雰囲気中の空間（電極間）において電極間の抵抗があるため、電子の流れが悪くなり、ドープ液が帯電しにくくなる。また、１００ｋＶを超えると、電極間でスパークがおこり、ドープ液に引火する恐れがある。電極間距離は１〜２５ｃｍが好ましく、さらに好ましくは２〜２０ｃｍである。電極間距離が１ｃｍ未満であると電極間でスパークが起こりやすくなり、ドープ液に引火する恐れがあり、２５ｃｍを超えると、電極間の抵抗が高くなり、電子の流れが妨げられ、ドープ液が帯電しにくくなる。

図１は本発明の一実施例のエレクトロスピニング装置１０の説明図である。まず金属製口金ノズル３と金属製ロール４との間に電源５により電圧をかけておく。マイクロシリンジ１内にドープ液２を入れておき、シリンジポンプを用いて矢印Ｐ方向に移動させ、金属製口金ノズル３からドープ液２を押し出し、電荷によってドープ液を吹き飛ばし繊維状物６にして金属ロール４の表面に堆積すると同時に巻き上げる。７は巻き上げられたシート状(不織布状)極細繊維である。シート状(不織布状)極細繊維は、次に溶媒を脱離する。溶媒を脱離する方法は、減圧乾燥又は脱溶媒槽への浸漬であることが好ましい。

図２は本発明の別の実施例のエレクトロスピニング装置２０の説明図である。図１と異なる点は、捕集側電極として金属ネット８を使用した点である。供給側電極の紡糸口金ノズル３と金属ネット8との間に電圧をかけ、電荷によってドープ液を伸張し繊維状物６にして金属製ネット８の表面に堆積させる。９は堆積されたシート状(不織布状)極細繊維である。シート状(不織布状)極細繊維は、次に溶媒を脱離する。溶媒を脱離する方法は、減圧乾燥又は脱溶媒槽への浸漬であることが好ましい。金属製ネットを使用する利点は、様々な形状の金属製ネットを使用できる点にある。例えばお椀状、ボール状、波状等、ネット自体の形状に沿ってシート状(不織布状)極細繊維を形成できる。本発明の繊維は極細であることから繊維自体が絡み合い、シートを形成している。

本発明の人造ポリペプチド繊維は平均直径が１μｍ以下であり、０．１〜１μｍの範囲が好ましい。前記の範囲であれば安定して繊維を得ることができる。より好ましい平均直径は０．２〜０．９μｍの範囲、さらに好ましくは０．３〜０．８μｍの範囲である。また、本発明の極細繊維の単繊維直径は、０．１〜１μｍの間で変動している。これはエレクトロスピニング特有の現象である。本発明の繊維の比重は１．３４である。繊度（単位：ｔｅｘまたはｄｅｃｉ ｔｅｘ）を算出する場合は、繊維断面が丸の場合は前記繊維直径から計算される断面積と比重と長さから算出する。なお、本発明の人造ポリペプチド繊維は、断面が円形とは限らず様々な形状を含むため、断面を円形と想定した場合の平均径をいう。繊維直径は前記の範囲で変動している。

前記ポリペプチドは、ニワオニグモ（Ａｒａｎｅｕｓ ｄｉａｄｅｍａｔｕｓ）の２つの主要なしおり糸タンパク質の一つであるＡＤＦ３由来のポリペプチドであることが好ましい。このポリペプチドは強伸度及びタフネスが基本的に高く、合成し易いことも利点として上げられる。

本発明の人造ポリペプチド繊維は延伸後、フィブロイン繊維内のポリペプチド分子間について化学的に架橋させてもよい。ポリペプチドにおいて架橋に使える官能基は例えばアミノ基、カルボキシル基、チオール基、ヒドロキシ基等があるが、これに限定されるものではない。ポリペプチドに含まれるリジン側鎖のアミノ基は、グルタミン酸若しくはアスパラギン酸側鎖のカルボキシル基と脱水縮合によりアミド結合で架橋できる。架橋は真空加熱下で脱水縮合反応を行なっても良いし、カルボジイミド等の脱水縮合剤により架橋させても良い。また、グルタルアルデヒド等の架橋剤を用いても良い。また、トランスグルタミナーゼ等の酵素により架橋することもできる。一例として、カルボジイミド、グルタルアルデヒド等の架橋剤で架橋反応させても良い。カルボジイミドは一般式Ｒ¹Ｎ＝Ｃ＝ＮＲ²（但し、Ｒ¹，Ｒ²は炭素数１〜６のアルキル基、シクロアルキル基を含む有機基を示す。）で示され、具体的化合物は１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリノエチル）カルボジイミド、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）などがある。この中でもＥＤＣ、ＤＩＣはペプチド鎖のアミド結合形成能が高く、架橋反応し易いことから好ましい。架橋処理は、延伸糸に架橋剤を付与して真空熱乾燥で重合するのが好ましい。架橋剤は１００％品を繊維に付与しても良いし、炭素数１〜５の低級アルコールや緩衝液などで希釈して０．００５〜１０質量％の濃度で繊維に付与しても良い。処理条件は、温度２０〜４５℃で３〜４２時間が好ましい。架橋剤による架橋処理により、人造ポリペプチド繊維の強度、タフネス、耐薬品性等を上げることができる。

以下実施例を用いて、本発明をさらに具体的に説明する。なお、本発明は下記の実施例に限定されるものではない。

（実施例１）
＜遺伝子合成＞
（１）ＡＤＦ３Ｋａｉの遺伝子の合成
ニワオニグモの２つの主要なしおり糸タンパク質の一つであるＡＤＦ３（ＧＩ：１２６３２８７）の部分的なアミノ酸配列をＮＣＢＩのウェブデータベースより取得し、同配列のＮ末端に開始コドン、Ｈｉｓ１０タグ及びＨＲＶ３Ｃプロテアーゼ認識サイトからなるアミノ酸配列（配列番号５）を付加したアミノ酸配列（配列番号６）からなるタンパク質をコードする遺伝子を、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社に合成受託した。その結果、配列番号１１に示す塩基配列からなるＡＤＦ３Ｋａｉの遺伝子が導入されたｐＵＣ５７ベクター（遺伝子の５’末端直上流にＮｄｅ Ｉサイト、及び５’末端直下流にＸｂａ Ｉサイト有り）を取得した。その後、同遺伝子をＮｄｅ Ｉ及びＥｃｏＲ Ｉで制限酵素処理し、ｐＥＴ２２ｂ（＋）発現ベクターに組み換えた。

（２）ＡＤＦ３Ｋａｉ−ＮＲＳＨ１の合成
ＡＤＦ３Ｋａｉの遺伝子が導入されたｐＥＴ２２ｂ（＋）発現ベクターを鋳型に、ＰｒｉｍｅＳｔａｒ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｂａｓａｌ Ｋｉｔ（タカラバイオ株式会社製）を用いた部位特異的変異導入により、ＡＤＦ３Ｋａｉのアミノ酸配列（配列番号６）の第６３２番目のアミノ酸残基Ｇｌｙに対応するコドンＧＧＣを終止コドンＴＡＡに変異させ、配列番号１２に示すＡＤＦ３Ｋａｉ−ＮＲＳＨ１の遺伝子をｐＥＴ２２ｂ（＋）上に構築した。変異の導入の正確性については、３１３０ｘｌ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いたシーケンス反応により確認した。なお、ＡＤＦ３Ｋａｉ−ＮＲＳＨ１のアミノ酸配列は配列番号７に示すとおりである。

（３）ＡＤＦ３Ｋａｉ−Ｂの合成
ＡＤＦ３Ｋａｉ−ＮＲＳＨ１の遺伝子が導入されたｐＥＴ２２ｂ（＋）発現ベクターを鋳型に、ＰｒｉｍｅＳｔａｒ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｂａｓａｌ Ｋｉｔ（タカラバイオ株式会社製）を用いた部位特異的変異導入により、ＡＤＦ３Ｋａｉ−ＮＲＳＨ１のアミノ酸配列（配列番号７）の第２２番目のアミノ酸残基Ｇｌｎに対応するコドンＣＡＡをＬｙｓをコードするコドンＡＡＡに変異させ、配列番号１３に示すＡＤＦ３Ｋａｉ−Ｂの遺伝子をｐＥＴ２２ｂ（＋）上に構築した。変異の導入の正確性については、３１３０ｘｌ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いたシーケンス反応により確認した。なお、ＡＤＦ３Ｋａｉ−Ｂのアミノ酸配列は配列番号８に示すとおりである。

（４）ＡＤＦ３Ｋａｉ−Ｆの合成
ＡＤＦ３Ｋａｉ−Ｂの遺伝子が導入されたｐＥＴ２２ｂ（＋）発現ベクターを鋳型に、ＰｒｉｍｅＳｔａｒ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｂａｓａｌ Ｋｉｔ（タカラバイオ株式会社製）を用いた部位特異的変異導入により、ＡＤＦ３Ｋａｉ−Ｂのアミノ酸配列（配列番号８）の第２６番目のアミノ酸残基Ａｒｇに対応するコドンＣＧＡをＬｙｓをコードするコドンＡＡＡに、第３１番目のアミノ酸残基Ｇｌｎに対応するコドンＣＡＡをＬｙｓをコードするコドンＡＡＡに、第３２番目のアミノ酸残基Ｇｌｎに対応するコドンＣＡＡをＬｙｓをコードするコドンＡＡＡに変異させ、配列番号１４に示すＡＤＦ３Ｋａｉ−Ｆの遺伝子をｐＥＴ２２ｂ（＋）上に構築した。変異の導入の正確性については、３１３０ｘｌ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いたシーケンス反応により確認した。なお、ＡＤＦ３Ｋａｉ−Ｆのアミノ酸配列は配列番号９に示すとおりである。

＜タンパク質の発現＞
ＡＤＦ３Ｋａｉ、ＡＤＦ３Ｋａｉ−ＮＲＳＨ１、ＡＤＦ３Ｋａｉ−Ｂ又はＡＤＦ３Ｋａｉ−Ｆの遺伝子を含むｐＥＴ２２ｂ（＋）発現ベクターを大腸菌Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）に形質転換した。得られたシングルコロニーを、アンピシリンを含む２ｍＬのＬＢ培地で１５時間培養後、同培養液を、アンピシリンを含む１４０ｍＬのＬＢ培地に１．４ｍＬ添加し、３７℃、２００ｒｐｍの条件下で、培養液のＯＤ₆₀₀が３．５になるまで培養した。次に、ＯＤ₆₀₀が３．５の培養液を、アンピシリンを含む７Ｌの２×ＹＴ培地に５０％グルコース１４０ｍＬと共に加え、ＯＤ₆₀₀が４．０になるまで培養した。その後、得られたＯＤ₆₀₀が４．０の培養液に、終濃度が０．５ｍＭになるようにイソプロピル−β−チオガラクトビラノシド（ＩＰＴＧ）を添加してタンパク質発現を誘導した。ＩＰＴＧを添加してから２時間経過した時点で、培養液を遠心分離により回収した。ＩＰＴＧ添加前とＩＰＴＧ添加後の培養液から調製したタンパク質溶液をポリアクリルアミドゲルで電気泳動させ、ＩＰＴＧ添加に依存して目的サイズ（ＡＤＦ３Ｋａｉ約５８．８ｋＤａ、ＡＤＦ３Ｋａｉ−ＮＲＳＨ１約５５．９ｋＤａ、ＡＤＦ３Ｋａｉ−Ｂ約５５．９ｋＤａ、ＡＤＦ３Ｋａｉ−Ｆ約５５．９ｋＤａ）のバンドが観察されたことから、目的とするタンパク質が発現していることを確認した。

＜精製＞
ＩＰＴＧを添加してから２時間後に回収した菌体を２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）で洗浄した後、高圧ホモジナイザー（ＧＥＡ Ｎｉｒｏ Ｓｏａｖｉ社）で細胞を破砕した。破砕した細胞を遠心分離し、得られた沈殿物を７．５ＭＵｒｅａ ＤＢ緩衝液（７．５Ｍ尿素、１０ｍＭリン酸二水素ナトリウム、２０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．０）で溶解し、スターラーで撹拌した後、透析チューブ（三光純薬株式会社セルロースチューブ３６／３２）を用いて水で透析を行った。透析後に得られた白色の凝集タンパク質を遠心分離により回収し、凍結乾燥機で水分をのぞき、凍結乾燥粉末を回収した。上記凍結乾燥粉末における目的タンパク質の精製度を下記のように測定した結果、ＡＤＦ３Ｋａｉ、ＡＤＦ３Ｋａｉ−ＮＲＳＨ１、ＡＤＦ３Ｋａｉ−Ｂ又はＡＤＦ３Ｋａｉ−Ｆの精製度は、それぞれ、７３．０％、９４．７％、９５．２％、９７．４％であった。

≪精製度の測定≫
凍結乾燥粉末における目的タンパク質の精製度は、凍結乾燥粉末のポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果をＴｏｔａｌｌａｂ（ｎｏｎｌｉｎｅａｒ ｄｙｎａｍｉｃｓ ｌｔｄ．）を用いて画像解析することにより測定した。まず、精密天秤を用いて凍結乾燥粉末をエッペンチューブに４ｍｇ測り取った後、７．５ＭＵｒｅａ ＤＢ緩衝液（７．５Ｍ尿素、１０ｍＭリン酸二水素ナトリウム、２０ｍＭＮａＣｌ、１ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．０）１ｍＬを加え、ボルテックス２０分間、室温放置３０分間により十分に溶解させた。

≪溶解性の評価≫
（１）紡糸液（ドープ液）の調製
上記で得られたＡＤＦ３Ｋａｉ−Ｆ（分子量６万）の凍結乾燥粉末を、真空ポンプ（ＵＬＶＡＣ Ｇ−５０ＤＡ）を使用して約２時間程度真空乾燥し、凍結乾燥したタンパク質粉末から完全に水分を除去した。その後、乳鉢を使用して、水分を除去したタンパク質を出来るだけ優しく押しつぶし、約１ｍｍの粒径を有するタンパク質粉末にした。次に、得られたタンパク粉末にＨＦＩＰを添加し、２５℃で１８０ｒｐｍのシェーカーで振動を与えながら約１９．５時間溶解し、タンパク質の濃度が７質量％のドープ液を調製した。

（５）エレクトロスピニング
図１に示すエレクトロスピニング装置１０を用いて紡糸した。マイクロシリンジ１内のドープ液２の押し出し速度は２．４ｍｌ／ｈとし、金属製口金ノズル３と金属製ロール４との間の電圧は１３．１ｋＶ、距離は７５ｍｍとした。金属製口金ノズル３の内直径は０．３２ｍｍとし、４本ノズルとした。金属製ロール４（直径２１４ｍｍ）の回転数は１７０ｒｐｍとし、巻き取り速度は１１４．２ｍ／ｍｉｎとした。この条件で４時間紡糸した。金属ロール４の表面に巻き上げられたシート状(不織布状)極細繊維７は、０．１Ｐａ、３５℃、１時間の真空乾燥により溶媒のＨＦＩＰを除去した。

＜物性測定＞
（ａ）引張り試験
得られた人造ポリペプチド極細繊維シート（幅８ｍｍ、長さ２０ｍｍ、厚さ０．０３６ｍｍ、単位面積当たりの質量（目付け）５．６８ｇ／ｍ²）の引張り速度１０ｍｍ／ｍｉｎにおける引張り試験結果は、次の表１に示すとおりであった。

（ｂ）走査型電子顕微鏡による表面の観察
走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）を使用して5500倍で観察し、単繊維の直径を測定した。その結果、側定数５（0.335μｍ,0.392μｍ,0.402μｍ,0.556μｍ,0.602μｍ）の平均直径は0.457μｍであった。図３に実施例１で得られた人造ポリペプチド極細繊維シートの応力−変位（ひずみ）曲線を示す。

（実施例２）
＜遺伝子合成＞
（１）ＡＤＦ３Ｋａｉ−Ｌａｒｇｅの遺伝子の合成
ＡＤＦ３Ｋａｉを鋳型にＴ７プロモータープライマー（配列番号１８）とＲｅｐ Ｘｂａ Ｉプライマー（配列番号１９）を用いてＰＣＲ反応を行い、ＡＤＦ３Ｋａｉの遺伝子配列における５’側半分の配列（以下、配列Ａと記す。）を増幅し、同断片をＭｉｇｈｔｙ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（タカラバイオ株式会社製）を使用して、予めＮｄｅ Ｉ及びＸｂａ Ｉで制限酵素処理をしておいたｐＵＣ１１８ベクターに組み換えた。同様に、ＡＤＦ３Ｋａｉを鋳型にＸｂａ Ｉ Ｒｅｐプライマー（配列番号２１）とＴ７ターミネータープライマー（配列番号２０）を用いてＰＣＲ反応を行い、ＡＤＦ３Ｋａｉの遺伝子配列にける３’側半分の配列（以下、配列Ｂと記す。）を増幅し、同断片をＭｉｇｈｔｙ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（タカラバイオ株式会社製）を使用して、予めＸｂａ Ｉ、ＥｃｏＲ Ｉで制限酵素処理をしておいたｐＵＣ１１８ベクターに組み換えた。配列Ａの導入されたｐＵＣ１１８ベクターをＮｄｅ Ｉ、Ｘｂａ Ｉで、配列Ｂの導入されたｐＵＣ１１８ベクターをＸｂａ Ｉ、ＥｃｏＲ Ｉでそれぞれ制限酵素処理し、ゲルの切り出しによって配列ＡのＤＮＡ断片及び配列ＢのＤＮＡ断片を精製した。ＤＮＡ断片Ａ、ＤＮＡ断片Ｂ及び予めＮｄｅ Ｉ及びＥｃｏＲ Ｉで制限酵素処理をしておいたｐＥＴ−２２ｂ（＋）をライゲーション反応させ、大腸菌ＤＨ５αに形質転換した。Ｔ７プロモータープライマー及びＴ７ターミネータープライマーを用いたコロニーＰＣＲにより、目的ＤＮＡ断片の挿入を確認した後、目的サイズ（約３．６ｋｂｐ）付近のバンドが得られたコロニーからプラスミドを抽出し、３１３０ｘｌ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いたシーケンス反応により全塩基配列を確認した。その結果、配列番号１６に示す塩基配列からなるＡＤＦ３Ｋａｉ−Ｌａｒｇｅの遺伝子の構築が確認された。なお、ＡＤＦ３Ｋａｉ−Ｌａｒｇｅのアミノ酸配列は配列番号４に示すとおりである。

（２）ＡＤＦ３Ｋａｉ−Ｌａｒｇｅ−ＮＲＳＨ１の遺伝子の合成
ＡＤＦ３Ｋａｉ−Ｌａｒｇｅの遺伝子が導入されたｐＥＴ２２ｂ（＋）ベクターを鋳型に、ＰｒｉｍｅＳｔａｒ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｂａｓａｌ Ｋｉｔ（タカラバイオ株式会社製）を用いた部位特異的変異導入によりＡＤＦ３Ｋａｉ−Ｌａｒｇｅのアミノ酸配列（配列番号４）の第１１５５番目のアミノ酸残基Ｇｌｙに対応するコドンＧＧＣを終止コドンＴＡＡに変異させ、配列番号１７に示す塩基配列からなるＡＤＦ３Ｋａｉ−Ｌａｒｇｅ−ＮＲＳＨ１の遺伝子をｐＥＴ２２ｂ（＋）上に構築した。変異の導入の正確性については、３１３０ｘｌ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いたシーケンス反応により確認した。なお、ＡＤＦ３Ｋａｉ−Ｌａｒｇｅ−ＮＲＳＨ１のアミノ酸配列は配列番号１５に示すとおりである。

上記のようにして得られたＡＤＦ３Ｋａｉ−Ｌａｒｇｅ−ＮＲＳＨ１（分子量約１０万）を使用して実施例１と同様に精製し、ドープ濃度を４質量％とした以外は実施例と同様にドープ液を作成し、エレクトロスピニングを行った。

＜物性測定＞
（ａ）引張り試験
得られた人造ポリペプチド極細繊維シート（幅８ｍｍ、長さ２０ｍｍ、厚さ０．０２４ｍｍ、単位面積当たりの質量（目付け）３．５８ｇ／ｍ²）の引張り速度１０ｍｍ／ｍｉｎにおける引張り試験結果は、次の表２に示すとおりであった。

（ｂ）走査型電子顕微鏡による観察
走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）を使用して5500倍で観察し、単繊維の直径を測定した。その結果、側定数５（０．２５９μｍ,０．２３０μｍ,０．２５７μｍ,０．１８１μｍ,０．１８１μｍ）の平均直径は０．２２μｍであった。図４に実施例２で得られた人造ポリペプチド極細繊維シートの応力−変位（ひずみ）曲線を示し、図５にＳＥＭの写真を示す。

本発明の人造ポリペプチド繊維は、樹脂や金属の強化繊維、複合材料、射出成形等に好適に使用できる。その用途は、自動車等の輸送機器部材、タイヤの補強繊維等に適用できる。また形態としては織物、編物、組み物、不織布などに応用できる。

１ マイクロシリンジ
２ ドープ液
３ 口金ノズル
４ 金属ロール
５ 電源
６ 繊維状物
７，９ シート状(不織布状)極細繊維
８ 金網ネット
１０，２０ エレクトロスピニング装置

配列番号１〜１０、１５ アミノ酸配列
配列番号１１〜１４、１６、１７ 塩基配列
配列番号１８〜２１ プライマーシーケンス

Claims (4)

1. 天然クモ糸タンパク質(spider silk proteins)に由来するポリペプチドを含む紡糸液をエレクトロスピニングして得られる人造ポリペプチド極細繊維シートの製造方法であって、
   前記ポリペプチドを溶媒に溶解して紡糸液とする工程と、
   前記紡糸液を、電圧をかけた口金からエレクトロスピニングにより吐出させて繊維形成する工程と、
   減圧乾燥により前記繊維から溶媒を脱離させる工程を含み、
   前記極細繊維の単繊維の平均直径は１μｍ以下であり、かつ前記極細繊維の単繊維直径は、０．１〜１μｍの間で変動しており、
   前記極細繊維自体の絡み合いによりシートとすることを特徴とする人造ポリペプチド極細繊維シートの製造方法。
2. 前記人造ポリペプチド極細繊維は、さらに前記繊維に含まれるポリペプチド分子間の一部において化学的に架橋されている請求項１に記載の人造ポリペプチド極細繊維シートの製造方法。
3. 前記架橋は、カルボジイミド及びグルタルアルデヒドから選ばれる少なくとも一つの架橋剤を反応させた架橋である請求項２に記載の人造ポリペプチド極細繊維シートの製造方法。
4. 前記口金から吐出させた繊維形成物質をローラーに巻き取るか又は金網に捕集してシートとする請求項１〜３のいずれかに記載の人造ポリペプチド極細繊維シートの製造方法。