JP5855581B2 - 小分子の同時的な定量および同定のための質量タグ試薬 - Google Patents

Description

関連出願の相互参照
本出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、２０１０年１月２２日に出願された先願米国仮特許出願第６１／２９７，５０７号明細書の利益を主張するものである。

本教示は、マススペクトロメトリーならびに小分子の検出および定量の分野に関する。

タグ化した分析物複合体は、マススペクトロメーターでフラグメント化されて、荷電シグナチャーイオンを生成させる。このシグナチャーイオンは、タグ化分析物を定量するために用いられる。残念なことに、フラグメンテーションプロセスにおいて、正の電荷は、主にこのシグナチャーイオンに移り、分析物を含む分子の残りの電荷中性部分は、検出されないか、または不十分にしか検出されないまま残る。分析物を含む電荷中性部分のフラグメンテーションについてのその後の分析からは、分析物の一義的な同定がもたらされない。小分子、例えば、代謝物の同時的な定量および同定のための方法に対する必要性が存在する。

本教示の様々な実施形態によって、分析物の定量と同定の両方を含む分析物の分析方法が提供される。本方法は、タグを分析物に共有結合させて、標識分析物を形成することを含むことができる。本方法は、標識分析物を、標識分析物を解離しない第１の条件下で、マススペクトロメトリーフラグメンテーションの第１工程に供することを含むことができる。いくつかの実施形態では、本方法は次に、標識分析物を、第１の条件とは異なる第２の条件下で、マススペクトロメトリーフラグメンテーションの第２工程（ＭＳ−ＭＳまたはＭＳ^２）に供することを含むことができる。マススペクトロメトリーフラグメンテーションの第２工程は、マススペクトルを形成することができ、第２の条件は、標識分析物を、シグナチャーイオンを担持する分析物と、分離またはフラグメント化されたロス基（ｌｏｓｓ ｇｒｏｕｐ）とに解離する条件を含む。いくつかの実施形態では、このロス基は中性であることができる。いくつかの実施形態では、このロス基は電荷を帯びたものであることができる。次に、分析物をマススペクトルに基づいて定量することができる。

様々な実施形態によって、マススペクトロメトリーフラグメンテーションの第２工程から得られたシグナチャーイオンを担持する分析物を、マススペクトロメトリーフラグメンテーションの第３工程（ＭＳ^３）に供することができる。第３の条件は、第１の条件とは異なり、かつ第２の条件とも異なることができ、また、シグナチャーイオンを担持する分析物を、複数の荷電フラグメントに解離する条件を含むことができる。マススペクトロメトリーフラグメンテーションの第３工程は、第２のマススペクトルを形成することができる。いくつかの実施形態では、分析物を第２のマススペクトルに基づいて同定することができる。

様々な実施形態によって、分析物にコンジュゲートされた同定可能なシグナチャーイオンが、タンデムマススペクトロメトリーフラグメンテーション（ＭＳ^２）後、分析物に付着したまま残る、分子の同定および定量方法が提供される。その代わりに、シグナチャーイオンを含む複合体の「質量バランス」部分だけが、タンデムマススペクトロメトリーフラグメンテーションの下で、電荷中性基として失われる。このシグナチャーイオンを定量に用いることができ、さらなるフラグメンテーションによって、分析物の特徴を示すイオンシグナルを提供することもできる。いくつかの実施形態では、３回目のマススペクトロメトリーフラグメンテーション（ＭＳ^３）から生成されたイオンシグナルを、例えば、データベースからの既知のマススペクトルと比較して、分析物の一義的な同定を提供することができる。

本教示は、本教示を限定するのではなく、例示することが意図される添付の図面を参照して、より完全に理解されるであろう。
一実施形態において、たとえば、以下の項目が提供される。
（項目１）
分析物の分析方法であって、
質量タグを分析物に共有結合させて、標識分析物を形成すること；
前記標識分析物を、前記標識分析物を解離しない第１の条件下で、マススペクトロメトリーフラグメンテーションの第１工程に供すること；
前記標識分析物を、前記第１の条件とは異なる第２の条件下で、マススペクトロメトリーフラグメンテーションの第２工程に供することであって、前記マススペクトロメトリーフラグメンテーションの第２工程は、マススペクトルを形成し、前記第２の条件は、前記標識分析物を、シグナチャーイオンを担持する荷電分析物と、分離されたニュートラルロス基とに解離する条件を含む、こと；
前記分析物を前記マススペクトルに基づいて定量すること；
前記シグナチャーイオンを担持する荷電分析物を、前記第１の条件とは異なり、かつ前記第２の条件とも異なる第３の条件下で、マススペクトロメトリーフラグメンテーションの第３工程に供することであって、前記マススペクトロメトリーフラグメンテーションの第３工程は、第２のマススペクトル形成し、前記第３の条件は、前記シグナチャーイオンを担持する荷電分析物を、複数の荷電フラグメントに解離する条件を含む、こと；並びに
前記分析物を前記第２のマススペクトルに基づいて同定すること
を含む、方法。
（項目２）
前記マススペクトロメトリーフラグメンテーションの第１工程の前に、前記標識分析物をクロマトグラフィー分離に供することをさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記マススペクトロメトリーフラグメンテーションの第１工程の前に、前記標識分析物を液体クロマトグラフィー分離に供することをさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目４）
前記マススペクトロメトリーフラグメンテーションの第１工程の前に、前記標識分析物に標準標識分析物をスパイクすることをさらに含み、ここで、前記標準標識分析物は、前記標識分析物と同じ化学構造および質量であるが、同位体分布が異なる、項目１に記載の方法。
（項目５）
前記標識分析物が、炭素原子、窒素原子、酸素原子、硫黄原子、またはそれらの組合せから選択される少なくとも２つの原子を含む、項目４に記載の方法。
（項目６）
前記マススペクトルに基づいて前記分析物を定量することが、前記標識分析物に帰属可能なマススペクトルピークを、前記標準標識分析物に帰属可能なマススペクトルピークと比較することを含む、項目４に記載の方法。
（項目７）
前記第２のマススペクトルに基づいて前記分析物を同定することが、前記第２のマススペクトルを既知のマススペクトルと比較することを含む、項目１に記載の方法。
（項目８）
前記第２のマススペクトルを既知のマススペクトルと比較することが、データベースから既知のマススペクトルを検索することを含む、項目７に記載の方法。
（項目９）
前記質量タグが、図２Ａの複合体、図２Ｂの複合体、図２Ｃの複合体、図２Ｄの複合体、図２Ｅの複合体からなる群から選択される複合体を含む、項目１に記載の方法。
（項目１０）
前記質量タグが、トリメチルアンモニウムエチレンヒドロキシルアミンＨＣｌを含む、項目１に記載の方法。
（項目１１）
前記分析物がテストステロンを含む、項目１に記載の方法。
（項目１２）
前記分析物がエストロンを含む、項目１に記載の方法。
（項目１３）
前記分析物が、アルデヒド、ケトン、またはそれらの組合せを含む、項目１に記載の方法。
（項目１４）
質量タグと、方法を実施するための１セットの指示書とを含むキットであって、前記方法が、
前記質量タグを分析物に共有結合させて、標識分析物を形成すること；
前記標識分析物を、前記標識分析物を解離しない第１の条件下で、マススペクトロメトリーフラグメンテーションの第１工程に供すること；
前記標識分析物を、前記第１の条件とは異なる第２の条件下で、マススペクトロメトリーフラグメンテーションの第２工程に供することであって、前記マススペクトロメトリーフラグメンテーションの第２工程は、マススペクトルを形成し、前記第２の条件は、前記標識分析物を、シグナチャーイオンを担持する荷電分析物と、分離されたニュートラルロス基とに解離する条件を含む、こと；
前記分析物を前記マススペクトルに基づいて定量すること；
前記シグナチャーイオンを担持する荷電分析物を、前記第１の条件とは異なり、かつ前記第２の条件とも異なる第３の条件下で、マススペクトロメトリーフラグメンテーションの第３工程に供すること、前記マススペクトロメトリーフラグメンテーションの第３工程は、第２のマススペクトル形成し、前記第３の条件は、前記シグナチャーイオンを担持する荷電分析物を、複数の荷電フラグメントに分離する条件を含む；並びに
前記分析物を前記第２のマススペクトルに基づいて同定すること
を含む、キット。
（項目１５）
標準質量タグをさらに含み、ここで、前記標準質量タグは、前記質量タグと同じ化学構造および質量であるが、同位体分布が異なる、項目１４に記載のキット。
（項目１６）
前記質量タグが、炭素原子、窒素原子、酸素原子、硫黄原子、またはそれらの組合せから選択される少なくとも２つの原子を含む、項目１５に記載の方法。
（項目１７）
前記指示書が、標識分析物に帰属可能なマススペクトルピークを標準標識分析物に帰属可能なマススペクトルピークと比較することによって前記分析物を定量するための指示書を含む、項目１５に記載の方法。
（項目１８）
複数の異なる標準質量タグをさらに含み、ここで、各々の標準質量タグは、前記質量タグと同じ化学構造および質量であるが、同位体分布が異なる、項目１４に記載のキット。

本教示の様々な実施形態による分析物の同時的な定量および同定のための方法を示す流れ図である。 本教示の様々な実施形態によって用いて、小さい分析物の同時的な定量および同定をもたらすことができる５つの異なる質量タグ化試薬を示す。 本教示の様々な実施形態による、ＭＳ−ＭＳモードでのシグナチャーイオン含有分析物の生成を示す反応スキームである。 本教示の様々な実施形態による、ステロイドのテストステロンを検出および定量するのに有用な２重試薬構成のための２重反応スキームである。 本教示の様々な実施形態による、シグナチャーイオン含有試薬のトリメチルアンモニウムエチレンヒドロキシルアミンＨＣｌの合成のための反応スキームを示す。 本教示の様々な実施形態による、２つの異なる分析物の明確な同定イオンシグナルを生成させるのに有用な反応スキームを示す。 本教示の様々な実施形態による、１回目のマススペクトロメトリーによる分離から生成された、テストステロンの様々なフラグメントのマススペクトログラムである。 本教示の様々な実施形態による、２回のマススペクトロメトリーによる分離（ＭＳ−ＭＳ、またはタンデムマススペクトロメトリー）から生成された、テストステロンの様々なフラグメントのマススペクトログラムである。 本教示の様々な実施形態による、３回のマススペクトロメトリーによる分離（ＭＳ^３）から生成され、シグナチャーイオンを示す、テストステロンの様々なフラグメントのマススペクトログラムである。 データ源（この場合は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉから入手される、メタノール溶液中のテストステロンステロイドの製品情報シートからの抜粋である）から得られた、テストステロンの様々なフラグメントのマススペクトログラムである。 本教示の様々な実施形態による、１回目のマススペクトロメトリーによる分離から生成された、エストロンの様々なフラグメントのマススペクトログラムである。 本教示の様々な実施形態による、２回のマススペクトロメトリーによる分離（ＭＳ−ＭＳ、またはタンデムマススペクトロメトリー）から生成された、エストロンの様々なフラグメントのマススペクトログラムである。 本教示の様々な実施形態による、３回のマススペクトロメトリーによる分離（ＭＳ^３）から生成され、シグナチャーイオンを示す、エストロンの様々なフラグメントのマススペクトログラムである。

本教示の様々な実施形態によって、分析物の定量と同定の両方を含む分析物の分析方法が提供される。本方法は、タグ、例えば、シグナチャーイオン複合体を分析物に共有結合させて、標識分析物、例えば、結合したシグナチャーイオン複合体を形成することを含むことができる。いくつかの実施形態では、標識分析物は、結合した分析物部分、シグナチャーイオン部分、および質量バランス基部分を含むことができる。本方法は、標識分析物を、標識分析物を解離しない第１の条件下で、マススペクトロメトリーフラグメンテーションの第１工程に供することを含むことができる。いくつかの実施形態では、本方法は次に、標識分析物を、第１の条件とは異なる第２の条件下で、マススペクトロメトリーフラグメンテーションの第２工程（ＭＳ−ＭＳまたはＭＳ^２）に供することを含むことができる。マススペクトロメトリーフラグメンテーションの第２工程は、マススペクトルを形成することができ、第２の条件は、標識分析物を、シグナチャーイオンを担持する分析物と、分離またはフラグメント化されたロス基とに解離する条件を含む。次に、分析物をマススペクトルに基づいて定量することができる。

様々な実施形態によって、マススペクトロメトリーフラグメンテーションの第２工程から得られたシグナチャーイオンを担持する分析物を、マススペクトロメトリーフラグメンテーションの第３工程（ＭＳ^３）に供することができる。第３の条件は、第１の条件とは異なり、かつ第２の条件とも異なることができ、また、シグナチャーイオンを担持する分析物を、複数の荷電フラグメントに解離する条件を含むことができる。マススペクトロメトリーフラグメンテーションの第３工程は、第２のマススペクトルを形成することができる。いくつかの実施形態では、分析物を第２のマススペクトルに基づいて同定することができる。

いくつかの実施形態では、標識分析物を、マススペクトロメトリーフラグメンテーションの第１工程の前に、クロマトグラフィー分離に供することができ、例えば、マススペクトロメトリーフラグメンテーションの第１工程の前に、液体クロマトグラフィー分離に供することができる。

いくつかの実施形態では、本方法は、マススペクトロメトリーフラグメンテーションの第１工程の前に、標識分析物に標準標識分析物をスパイクするを含むことができる。標準標識分析物は、試料標識分析物と同じ化学構造および同じ質量であることができるが、同位体分布は異なることができる。いくつかの実施形態では、シグナチャーイオン複合体は、少なくとも１つが同位体である、炭素原子、窒素原子、酸素原子、硫黄原子、またはそれらの組合せから選択される少なくとも２つの原子含む。標準標識分析物中の標準シグナチャーイオン複合体は、少なくとも２つの原子について、同じ化学構造を有するが、異なる同位体分布を有することができる。

いくつかの実施形態では、定量は、第１のマススペクトルに基づくことができ、かつ本方法は、標識分析物に帰属可能なマススペクトルピークを標準標識分析物に帰属可能なマススペクトルピークと比較することを含むことができる。いくつかの実施形態では、同定は、第２のマススペクトルに基づくことができ、この第２のマススペクトルを、例えば、検索表から得られた、参照源から得られた、ライブラリーから得られた、および／またはデータベースから得られた既知のマススペクトル由来の既知のマススペクトルと比較することを含むことができる。

本教示の様々な実施形態によって、シグナチャーイオン複合体を分析物にコンジュゲートし、タンデムマススペクトロメトリーフラグメンテーション（ＭＳ−ＭＳまたはＭＳ^２）後に、複合体のシグナチャーイオンが分析物に付着したまま残る、分子の同定および定量方法が提供される。タンデムマススペクトロメトリーフラグメンテーションによって、シグナチャーイオン複合体の質量バランス部分は電荷中性基として失われるが、シグナチャーイオンは分析物に付着したまま残るように、シグナチャーイオン複合体を設計することができる。いくつかの実施形態では、シグナチャーイオンを、マススペクトロメトリーフラグメンテーションの第３工程または第３段階（ＭＳ^３）の後に、分析物からフラグメント化することができる。シグナチャーイオンを定量に用いることができ、かつさらなるフラグメンテーションによって、分析物に特徴的なイオンシグナルを提供することもできる。特徴的なイオンシグナルを様々な実施形態に従って用いて、分析物を同定することができる。いくつかの実施形態では、３回目のマススペクトロメトリーフラグメンテーション（ＭＳ^３）から生成したイオンシグナルを、例えば、参照またはデータベースからの既知のマススペクトルと比較して、分析物の一義的な同定を提供することができる。

図１は、本教示の様々な実施形態による、分析物を同時に定量および同定する方法を示す模式図である。模式図の左上に示すように、質量バランス基２０を、反応性末端２４を有する質量認識基２２と結合させて、複合体２６を形成する。以下で論じるように、質量認識基２２は、同定可能なシグナチャーイオンを、マススペクトロメトリーフラグメンテーションの３つの工程（ＭＳ^３）の後にのみ形成するように構成されている。複合体２６を、反応性末端２４での反応を介して分析物３０にコンジュゲートし、その結果物に標準複合体３２をスパイクする。その後、得られた混合物を液体クロマトグラフィーに供して、様々な成分を分離し、分離された成分をマススペクトロメトリーの第１工程（ＭＳ）に供する。

図１に示すように、シグナチャーイオンは、マススペクトロメトリーフラグメンテーションの第２工程（ＭＳ^２）の後、分析物３０から離れない。その代わりに、分子の質量バランス部分だけが、例えば、電荷中性基として失われる。この残りのシグナチャーイオンは、定量に用いられることができ、かつさらなるフラグメンテーションによって、分析物３０に特徴的なイオンシグナルを提供する。図１にさらに示されているように、検出されたイオンシグナルをデータベースと比較して、分析物３０の一義的な同定を提供することができる。

様々な実施形態によって、小分子の同時的な定量および同定を提供するために用いることができる質量タグ化試薬の例を図２Ａ〜２Ｅに示す。図２Ａに示す例示的な質量タグ化試薬の典型的なＭＳ^２フラグメンテーションパターンを図３に示す。図３に示すように、ＭＳ−ＭＳフラグメンテーションを受けている質量タグ化試薬との反応によって、分析物を含むシグナチャーイオンが生成され、かつ中性の質量補償基が生成される。

様々な実施形態によって、本教示は、小分子の同定および定量に２重試薬構成を利用する方法を提供する。図４に示すように、２重試薬構成は、ステロイドのテストステロン用に提供される。図４に示すように、テストステロン含有試料を第１の質量タグ化試薬で標識し、テストステロン含有標準を異なる質量タグ化試薬で標識し、ここで、両方のタグ化試薬は、同じ精密質量、特に、１２１．１２原子質量単位（ａｍｕ）を有する。それぞれのタグ化の後、テストステロン含有試料およびテストステロン含有標準を混合し、ＬＣ−ＭＳを行なった後、ＭＳ−ＭＳ（ＭＳ^２）を行なう。ＭＳ^３フラグメンテーションの後、イオンシグナルを参照またはデータベースと比較して、試料を同定することができる。様々な実施形態によって、質量タグ化試薬を合成する方法を提供し、図５に例示する。

図５は、トリメチルアンモニウムエチレンヒドロキシルアミン塩酸塩の合成を示す。タグ化試薬を用いて、テストステロンおよびエストロンを誘導体化することができ、その後、これらを、様々な実施形態による、定量および同定に供することができる。同定後、図６に示すように、マススペクトロメトリーデータを収集することができる。図６は、２つの異なる分析物に対して異なる同定イオンシグナルが提供される実施形態を示す。

図６は、２つの異なる分析物に対する異なる同定イオンシグナルを示す。例示的な実施形態では、インソース（ｉｎ−ｓｏｕｒｃｅ）フラグメンテーションが、シグナチャーイオンを生成させるのに十分であるように「高く」設定されたＡＰＩ ３２００ ＤＰ値を用いて、シグナチャーイオンをフラグメント化する本方法のＭＳ−ＭＳ工程を実施した。

本教示のさらに他の実施形態によって、本明細書に記載したようなシグナチャーイオン複合体の形態の少なくとも１つのタグ、および本明細書に記載したような方法を実施するための１セットの指示書を含むキットが提供される。キットは、標準標識分析物または標準シグナチャーイオン複合体も含むことができ、ここで、標準シグナチャーイオン複合体は、シグナチャーイオン複合体と同じ化学構造および同じ質量であるが、シグナチャーイオン複合体と同位体分布が異なる。指示書は、結合したシグナチャーイオン複合体に帰属可能なマススペクトルピークを、標準標識分析物または結合したシグナチャーイオン複合体に帰属可能なマススペクトルピークと比較することによって分析物を定量するための指示書を含むことができる。指示書は、マススペクトルを、例えば、検索表から、参照源から、ライブラリーから、データベースから、および／またはデータベースへのリンクから得られた既知のマススペクトルから得られたマススペクトルと比較することによって分析物を同定するための指示書を含むことができる。いくつかの実施形態では、キットはさらに、複数の異なる標準シグナチャーイオン複合体を含むことができ、ここで、各々の標準シグナチャーイオン複合体は、シグナチャーイオン複合体と同じ化学構造および同じ質量であるが、同位体分布が異なる。

いくつかの実施形態では、キットは、緩衝液および酵素、他の緩衝液、ならびに任意で他の試薬および／または成分を含む、酵素消化成分を含むことができる。いくつかの実施形態では、キットは、例えば、使用者が試料を添加する必要しかないようなホモジニアスアッセイを含むことができる。いくつかの実施形態では、キットは、較正または正規化用の試薬または標準を含むことができる。アッセイを実施するために用いることができるか、またはアッセイを実施するために用いるべき機器の設定に関する情報も、キットに含めることができる。試料調製、操作条件、容量、温度設定などに関する情報をキットに含めることができる。キットは、試料と1つ以上の対照試薬の比較測定を行なうのに有用な、異なるトランジション値および／または推奨設定を含むことができる。キットは、特定のトランジション値のペア、例えば、Ｑ１／Ｑ３トランジションペア、または1つ以上の異なるトランジションペアの値を測定するための指示書を含むことができる。

いくつかの実施形態では、キットは、1つ以上の試薬容器および適切な指示書を含む密閉容器に包装することができる。1つ以上のアッセイ、測定値、トランジションペア、操作指示書、操作を実行するためのソフトウェア、それらの組合せなどに関する電子情報をその上に保存した、電子媒体をキットに含めることができる。いくつかの実施形態では、キットは、情報、例えば、マススペクトルまたはマススペクトルデータをどこで見つけることができるかを示すポインタを含むことができる。ポインタは、例えば、ウェブアドレス、ユーザー名、パスワード、それらの組合せなどを含むことができる。

これから、以下の実施例を参照しながら本教示を示す。テストステロンおよびエストロンが分析物として例示されているが、例えば、他のステロイド、アルデヒド、ケトン、それらの組合せなどをはじめとする、種々の分析物のいずれかを本教示に従って定量および同定することができることが理解されるべきである。

２つの例示的実施形態において、シグナチャーイオン複合体１（図５）を図５に示す反応スキームに従って合成した。次に、テストステロンとエストロンを、各々、シグナチャーイオン複合体１で誘導体化した。図６は、本方法における次の工程を示す。この工程では、誘導体化されたテストステロンとエストロンを、液体クロマトグラフィー分離に供した後、マススペクトロメトリーによるフラグメンテーションに供し、そこからマススペクトロスコピーデータを収集した。図６に見ることができるように、２つの異なる明確なＩＤイオンシグナルのセットが、２つのそれぞれ異なる分析物について生成された。いくつかの実施形態、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣａｌｉｆｏｒｎｉａのＡＰＩ ３２００などの完全一体型の三連四重極マススペクトロメーターを用いる実施形態では、インソースフラグメンテーションによってシグナチャーイオンが発生し、シグナチャーイオンのＭＳ−ＭＳ（ＭＳ^２）が可能となるように、ＤＰ値を高く設定した。この方法から生成されたデータを図７〜９Ａおよび図１０〜１２に示す。

図７は、１回目のマススペクトロメトリーによる分離から生成された、テストステロンの様々なフラグメントのマススペクトログラムである。図８は、ＭＳ^２（ＭＳ−ＭＳ、またはタンデムマススペクトロメトリー）を用いる２回目のマススペクトロメトリーによる分離から生成された、テストステロンの様々なフラグメントのマススペクトログラムである。図９Ａは、マススペクトロメトリーによる分離の第３工程（ＭＳ^３）から生成され、シグナチャーイオンに対応するピークを示す、テストステロンの様々なフラグメントのマススペクトログラムである。

様々な実施形態に従って、シグナチャーイオンを既知の質量スペクトルから入手可能なデータと比較した。例えば、図９Ａに示す、本教示によるＭＳ^３からのテストステロンシグナチャーイオンを、テストステロンステロイドのマススペクトルから入手可能な標準データと比較した。データベースを用いることができるが、生成された、図９Ａに示すデータを、マススペクトルと比較し、図９Ｂに示すＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉから得た。図９Ｂのマススペクトルは、製品番号Ｔ ５４１１（テストステロンステロイド）のＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ製品情報シートから取られた抜粋である。図９Ｂは、メタノール溶液中の試料からのテストステロンの様々なフラグメントのマススペクトログラムである。

図１０は、１回目のマススペクトロメトリーによる分離から生成された、エストロンの様々なフラグメントのマススペクトログラムであり、図１１は、２回目のマススペクトロメトリーによる分離から生成された、エストロンの様々なフラグメントのマススペクトログラムであり、図１２は、３回目のマススペクトロメトリーによる分離（ＭＳ^３）から生成された、エストロンの様々なフラグメントのマススペクトログラムである。図１２は、シグナチャーイオンを示し、マススペクトルをデータベースから得られたマススペクトルと比較した。

本教示の他の実施形態は、本明細書の検討および本明細書に開示された本教示の実施から当業者に明らかになるであろう。本明細書および実施例は単に例示的なものと考えられることが意図される。

Claims (16)

1. 分析物の分析方法であって、
   質量タグを分析物に共有結合させて、標識分析物を形成し、前記質量タグは、
   
   およびトリメチルアンモニウムエチレンヒドロキシルアミンＨＣｌからなる群から選択される、こと；
   前記標識分析物を、前記標識分析物を解離しない第１の条件下で、マススペクトロメトリーフラグメンテーションの第１工程に供すること；
   前記標識分析物を、前記第１の条件とは異なる第２の条件下で、マススペクトロメトリーフラグメンテーションの第２工程に供することであって、前記マススペクトロメトリーフラグメンテーションの第２工程は、マススペクトルを形成し、前記第２の条件は、前記標識分析物を、シグナチャーイオンを担持する荷電分析物と、分離されたニュートラルロス基とに解離する条件を含む、こと；
   前記分析物を前記マススペクトルに基づいて定量すること；
   前記シグナチャーイオンを担持する荷電分析物を、前記第１の条件とは異なり、かつ前記第２の条件とも異なる第３の条件下で、マススペクトロメトリーフラグメンテーションの第３工程に供することであって、前記マススペクトロメトリーフラグメンテーションの第３工程は、第２のマススペクトルを形成し、前記第３の条件は、前記シグナチャーイオンを担持する荷電分析物を、複数の荷電フラグメントに解離する条件を含む、こと；並びに
   前記分析物を前記第２のマススペクトルに基づいて同定すること
   を含み、前記分析物は小分子である、方法。
2. 前記マススペクトロメトリーフラグメンテーションの第１工程の前に、前記標識分析物をクロマトグラフィー分離に供することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
3. 前記マススペクトロメトリーフラグメンテーションの第１工程の前に、前記標識分析物を液体クロマトグラフィー分離に供することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
4. 前記マススペクトロメトリーフラグメンテーションの第１工程の前に、前記標識分析物に標準標識分析物をスパイクすることをさらに含み、ここで、前記標準標識分析物は、前記標識分析物と同じ化学構造および質量であるが、同位体分布が異なる、請求項１に記載の方法。
5. 前記標識分析物が、炭素原子、窒素原子、酸素原子、硫黄原子、またはそれらの組合せから選択される少なくとも２つの原子を含む、請求項４に記載の方法。
6. 前記マススペクトルに基づいて前記分析物を定量することが、前記標識分析物に帰属可能なマススペクトルピークを、前記標準標識分析物に帰属可能なマススペクトルピークと比較することを含む、請求項４に記載の方法。
7. 前記第２のマススペクトルに基づいて前記分析物を同定することが、前記第２のマススペクトルを既知のマススペクトルと比較することを含む、請求項１に記載の方法。
8. 前記第２のマススペクトルを既知のマススペクトルと比較することが、データベースから既知のマススペクトルを検索することを含む、請求項７に記載の方法。
9. 前記分析物がテストステロンを含む、請求項１に記載の方法。
10. 前記分析物がエストロンを含む、請求項１に記載の方法。
11. 前記分析物が、アルデヒド、ケトン、またはそれらの組合せを含む、請求項１に記載の方法。
12. 質量タグと、方法を実施するための１セットの指示書とを含むキットであって、前記方法が、
    前記質量タグを分析物に共有結合させて、標識分析物を形成し、前記質量タグは、
    
    およびトリメチルアンモニウムエチレンヒドロキシルアミンＨＣｌからなる群から選択される、こと；
    前記標識分析物を、前記標識分析物を解離しない第１の条件下で、マススペクトロメトリーフラグメンテーションの第１工程に供すること；
    前記標識分析物を、前記第１の条件とは異なる第２の条件下で、マススペクトロメトリーフラグメンテーションの第２工程に供することであって、前記マススペクトロメトリーフラグメンテーションの第２工程は、マススペクトルを形成し、前記第２の条件は、前記標識分析物を、シグナチャーイオンを担持する荷電分析物と、分離されたニュートラルロス基とに解離する条件を含む、こと；
    前記分析物を前記マススペクトルに基づいて定量すること；
    前記シグナチャーイオンを担持する荷電分析物を、前記第１の条件とは異なり、かつ前記第２の条件とも異なる第３の条件下で、マススペクトロメトリーフラグメンテーションの第３工程に供すること、前記マススペクトロメトリーフラグメンテーションの第３工程は、第２のマススペクトルを形成し、前記第３の条件は、前記シグナチャーイオンを担持する荷電分析物を、複数の荷電フラグメントに分離する条件を含む；並びに
    前記分析物を前記第２のマススペクトルに基づいて同定すること
    を含み、前記分析物は小分子である、キット。
13. 標準質量タグをさらに含み、ここで、前記標準質量タグは、前記質量タグと同じ化学構造および質量であるが、同位体分布が異なる、請求項１２に記載のキット。
14. 前記質量タグが、炭素原子、窒素原子、酸素原子、硫黄原子、またはそれらの組合せから選択される少なくとも２つの原子を含む、請求項１２または１３に記載のキット。
15. 前記指示書が、標識分析物に帰属可能なマススペクトルピークを標準標識分析物に帰属可能なマススペクトルピークと比較することによって前記分析物を定量するための指示書を含む、請求項１２または１３に記載のキット。
16. 複数の異なる標準質量タグをさらに含み、ここで、各々の標準質量タグは、前記質量タグと同じ化学構造および質量であるが、同位体分布が異なる、請求項１３に記載のキット。