JP5718450B2

JP5718450B2 - 抗悪性腫瘍剤およびその製造方法と用途

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Publication number: JP5718450B2
Application number: JP2013502361A
Authority: JP
Inventors: 洋供田; 大介松田; 龍児内田; 高橋　洋子; 洋子高橋; 大村　智; 智大村
Original assignee: Kitasato Institute
Current assignee: Kitasato Institute
Priority date: 2011-02-28
Filing date: 2012-02-28
Publication date: 2015-05-13
Anticipated expiration: 2032-02-28
Also published as: WO2012118068A1; JPWO2012118068A1

Description

本発明は、悪性腫瘍のような細胞の増殖異常等に起因する疾病の予防や治療に有用な、新規3787-5-1物質およびその製造方法と用途に関する。

ヒトの身体を構成する細胞は、分裂・増殖とアポトーシスを繰り返しており、正常な状態では細胞数をほぼ一定に保つような制御機構が働いている。しかし、遺伝子変異等によりコントロールを失うと、細胞は無制限に増殖し、腫瘍が形成される。

腫瘍には良性と悪性が存在する。身体の他の部分に浸潤や転移はせず、肥大化も見られない腫瘍は良性腫瘍と呼ばれ、一方、他の部分に浸潤や転移する腫瘍は悪性腫瘍と呼ばれる。特に問題となるのは悪性腫瘍である。

悪性腫瘍の発生に関与する重要な因子である考えられているのは、src、ras、myc等のがん原遺伝子といわれる遺伝子群の変異による細胞の恒常的活性化、並びにp53、Rb、BRCA1等のがん抑制遺伝子といわれる遺伝子群の変異による細胞の機能不全である (非特許文献１)。がん抑制タンパク質の機能は、細胞周期チェックポイント制御、転写因子制御、転写、ＤＮＡ修復など多岐にわたっている。

悪性腫瘍の治療に対しては、1) ニトロジェンマスタード類、ニトロソ尿素類などに代表されるアルキル化薬、2) プリン類縁体、ピリミジン類縁体、葉酸代謝拮抗薬などに代表される代謝拮抗薬、3) アントラサイクリン類、アントラセンジオン類、ブレオマイシン類、マイトマイシン類などに代表される抗腫瘍性抗生物質、4) ビンカアルカロイド、タキソイド、ＤＮＡトポイソメラーゼ阻害薬などに代表される植物アルカロイド、5) 白金化合物、6) 抗エストロゲン薬、アロマターゼ阻害薬、LH-RH刺激薬、黄体ホルモン薬、抗アンドロゲン薬、糖質コルチコイド、エストロゲン薬、アンドロゲン薬などに代表されるホルモン関連薬、7) 分子標的薬、8) サイトカインなどの多様な薬剤が開発され、臨床現場で用いられている。

しかし、一般的に、ほとんどの抗悪性腫瘍薬は他の疾病の治療薬よりも毒性が強く、副作用に問題があることが知られている (非特許文献２)。そこで、がん細胞の増殖を抑制する新しいタイプの抗悪性腫瘍剤の開発が望まれている。

新たな薬剤の一つとして、抗悪性腫瘍剤の薬理活性を、悪性腫瘍細胞特異的に強めることができる抗悪性腫瘍活性増強剤が挙げられる。
正常な細胞には、Ｇ１期とＧ２期にＤＮＡ傷害を修復する機構 (細胞周期チェックポイント, cell cycle checkpoints) が存在し、主にＧ１期におけるチェックポイント (G1 checkpoint) でＤＮＡ傷害の修復が行われる。しかし、がん抑制遺伝子が変異した多くの悪性腫瘍細胞においては、このG1期修復機構 (G1 checkpoint) が機能せず、G2期修復機構 (G2 checkpoint) でＤＮＡ傷害が修復されることが知られている (非特許文献３)。

そこで、微量のＤＮＡ傷害剤の投薬及び／又は軽微な放射線照射等の治療と併用して、G2 checkpoint阻害剤を投与すると、正常細胞はG1 checkpointでＤＮＡ傷害を修復することができるのに対し、悪性腫瘍細胞はG1 checkpoint 及びG2 checkpointのいずれでもＤＮＡ傷害を修復できないため、悪性細胞内にＤＮＡ傷害が蓄積して細胞増殖ができなくなると考えられる。すなわち、G2 checkpointを阻害する薬剤は、悪性腫瘍細胞特異的に抗悪性腫瘍剤の効果を高めることができる新しいタイプの抗腫瘍剤になるものと期待されている (特許文献１および非特許文献４)。

WO 2001/021771

Hanahan et al., Cell, Vol. 100, pp. 57-70、2000 山田安彦編著、薬学生・薬剤師のためのがんの薬物治療学、化学同人社, pp. 43-57, 2009 Zhou et al., Cancer Biol. Ther., Vol. 4, Suppl. 1, pp. S16-S22、2003 Zabludoff et al., Mol. Cancer Ther., Vol. 7, pp. 2955-2966, 2008。

本発明は、単独であるいは他の抗悪性腫瘍剤と組み合わせて投与した時に悪性腫瘍の発症と進展を抑止することができる、安全で効果的な医薬品となる新規化合物とその製造方法及び用途とを提供することを目的とする。

本発明者らは、微生物が生産する代謝産物を対象に、単独で抗悪性腫瘍活性を有し、さらに他の抗悪性腫瘍剤の活性を増強する薬剤の探索を行った結果、日本沖縄県石垣島の土壌から新たに分離した放線菌ファイトハビタンス・エスピー3787-5 (Phytohabitans sp. 3787-5) 株（特許微生物寄託センター受託番号NITE BP-1137）の培養液中に目的の活性を有する物質が産生されていることを見いだした。次いで、該培養物から抗悪性腫瘍活性増強物質を分離、精製した結果、この物質は後述の化学構造を有する新規化合物であることを見出し、本物質を新たに3787-5-1と命名した。

本発明は、かかる知見に基づいて完成されたものであって、下記の式[I]で表される化合物である3787-5-1物質及びその塩に関する。

本発明はまた、ファイトハビタンス属に属し、上記3787-5-1物質を生産する能力を有する微生物を培地で培養して培養物中に3787-5-1物質を蓄積せしめ、該培養物から3787-5-1物質を採取することを特徴とする、3787-5-1物質の製造法に関する。

上記製造法において、微生物はファイトハビタンス・エスピー3787-5 (Phytohabitans sp. 3787-5) 株（NITE BP-1137）であることが好ましい。
さらに本発明は、上記の3787-5-1物質又はその薬学的に許容される塩からなる抗悪性腫瘍剤又は抗悪性腫瘍活性増強剤、或いは上記の3787-5-1物質又はその薬学的に許容される塩の抗悪性腫瘍剤又は抗悪性腫瘍活性増強剤としての使用にも関する。

また、本発明は、上記3787-5-1物質又はその薬学的に許容される塩を有効成分とする、特に細胞の増殖異常に起因する疾病、典型的には悪性腫瘍の予防又は治療用の医薬組成物、並びに有効量の上記3787-5-1物質又はその薬学的に許容される塩を必要とする患者に投与することからなる、ヒトを含む哺乳動物における細胞の増殖異常に起因する疾病、特に、悪性腫瘍を予防又は治療する方法にも関する。本発明はまた、有効量の上記3787-5-1物質又はその薬学的に許容される塩を、ヒトを含む哺乳動物に投与することからなる、抗悪性腫瘍剤の活性を増強する方法にも関する。

本発明によれば、単独で抗悪性腫瘍活性を示し、かつ他の抗悪性腫瘍剤と組み合わせて投与した場合に抗悪性腫瘍活性増強作用を有する、新規物質3787-5-1が提供される。この物質を有効成分とする医薬組成物は、悪性腫瘍の予防または治療に使用できる。

さらに、本発明によれば、新規物質3787-5-1を生産する微生物と、この微生物を利用した新規物質3787-5-1の製造方法とが提供される。

本発明に係る3787-5-1物質の紫外部吸収スペクトル（メタノール溶液中）を示す図である。本発明に係る3787-5-1物質の赤外部吸収スペクトル（臭化カリウム法）を示す図である。本発明に係る3787-5-1物質のプロトン核磁気共鳴スペクトル（重クロロホルム中）を示す図である。本発明に係る3787-5-1物質のカーボン核磁気共鳴スペクトル（重クロロホルム中）を示す図である。

本発明に係る新規化合物である3787-5-1物質は、ファイトハビタンス属に属し、3787-5-1物質を生産する能力を有する微生物を培地で培養して培養物中に3787-5-1物質を蓄積せしめ、該培養物から3787-5-1物質を採取することにより製造することができる。

本発明の3787-5-1物質を生産するために使用される菌株の一例として、本発明者等によって土壌より新に分離されたファイトハビタンス・エスピー3787-5株（Phytohabitans sp. 3787-5）（2011年8月26日に独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物センターに寄託、受託番号NITE BP-1137、受託日2011年9月28日）が挙げられる。本菌株の菌学的性質は以下の通りである。

本菌株は、一般的な放線菌用の液体培地、例えば酵母エキス・デキストロース培地やスターチ・グルコース培地（スターチ、グルコース、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、炭酸カルシウム）での生育に２７℃で２〜３週間を要し、菌体は橙色を呈する。またスターチ・無機塩寒天 (ISP 4) およびイースト・麦芽エキス寒天 (ISP 2) 上では２７℃、２週間の培養で薄いアイボリーのコロニーをわずかに形成し、白色の短い気菌糸を着生する。可溶性色素は産生しない。

本菌株の16S rRNA遺伝子のうち1281塩基の配列を決定し、EzTaxon server 2.1 (http://147.47.212.35:8080/）を用いて、その配列を承認されている放線菌種のＤＮＡデータベースから検索した結果、本菌株はPhytohabitans suffuscus と100％の相同性を示し、Phytohabitans属に属する１菌種であると判断された。

本発明の3787-5-1物質を製造するには、ファイトハビタンス・エスピー3787-5株を用いるのが好ましいが、これに限定されることなく、該株の人工変異株や自然変異株も含めた、ファイトハビタンス属に属し、3787-5-1物質を生産する能力を有する微生物であればすべて使用することができる。

上記微生物を培養するための培地としては、栄養源に微生物が同化し得る炭素源、消化し得る窒素源、さらに必要に応じて無機塩、ビタミン等を含有させた栄養培地が使用される。同化し得る炭素源としては、グルコース、フラクトース、マルトース、ラクトース、ガラクトース、デキストリン、澱粉等の糖類、大豆油等の植物性油脂類が単独でまたは組み合わせて用いられる。消化し得る窒素源としては、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、大豆粉、綿実粉、コーン・スティープ・リカー、麦芽エキス、カゼイン、アミノ酸、尿素、アンモニウム塩類、硝酸塩類が単独でまたは組み合わせて用いられる。その他必要に応じてリン酸塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩などの塩類、鉄塩、マンガン塩、銅塩、コバルト塩、亜鉛塩等の重金属塩類やビタミン類、その他3787-5-1物質の生産に好適な成分を適宜添加してもよい。

培養の際、発泡が激しいときには、必要に応じて液体パラフィン、動物油、植物油、シリコン、界面活性剤等の消泡剤を添加してもよい。上記の培養に使用する培地は、上記栄養源を含有すれば、液体でも固体でもよいが、通常は液体培地を用いて培養するのが好ましい。目的物質を大量に工業生産する場合には、通気攪拌培養するのが好ましい。培養を大きなタンクで行う場合には、生産工程において菌の生育遅延を防止するために、はじめに比較的少量の培地に生産菌を接種培養した後、次に培養物を大きなタンクに移して、そこで生産培養するのが好ましい。この場合、前培養に使用する培地および生産培養に使用する培地の組成は、同一であっても異なっていてもよい。培養を通気攪拌条件で行う場合は、例えばプロペラやその他機械による攪拌、ファーメンターの回転または振盪、ポンプ処理、空気の吹き込み等、既知の方法が適宜使用される。通気用の空気は滅菌したものを使用する。

培養温度は、本3787-5-1物質の生産菌がこの物質を生産する範囲内で適宜変更し得るが、通常は20〜30℃、好ましくは27℃前後である。培養は、振盪培養と静置培養の一方、又は両方を適宜組み合わせて行うことができる。3787-5-1物質の生産には振盪培養を用いるのが好ましく、培養時間は培養条件によっても異なるが、振盪培養の場合で通常10〜50日程度である。

培養物に蓄積された本発明の新規物質を採取するには、微生物培養物から代謝産物を採取するのに通常使用される方法を用いることができる。例えば、有機溶媒による抽出、濃縮、乾燥、吸着、濾過、遠心分離、クロマトグラフィーなどから選ばれた１種または２種以上の方法により目的物質を分離・精製する。

本発明の3787-5-1物質をファイトハビタンス・エスピー3787-5株の培養物から採取する方法の１例は次の通りである。培養物から菌体をエタノール等の水混和性有機溶媒で抽出し、抽出液を減圧蒸留して有機溶媒を留去した後、得られた残渣を酢酸エチル等の水不混和性有機溶媒で抽出する。こうして採取された物質に対して、脂溶性物質の精製に用いられる公知のクロマトグラフィー処理、例えば吸着クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー、遠心向流分配クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー等から選ばれた方法を適宜組み合わせ、または繰り返すことによって、3787-5-1物質を精製することができる。

このようにして得られた、本発明の3787-5-1物質の理化学的性状について以下に説明する。
（１）性状：褐色粉末；
（２）分子式：Ｃ₂₆Ｈ₃₈Ｏ
HREI-MS (m/z) [M]⁺ 計算値366.2923, 実測値366.2929；
（３）分子量：366
EI-MS(m/z) で[M]⁺ 366を観測；
（４）紫外部吸収スペクトル：メタノール溶液中で測定した紫外部吸収スペクトルは図１に示すとおりであり、λmax (MeOH,ε): 221 (8052), 234 (3294), 284 (3587) nmの吸収を示す；
（５）赤外部吸収スペクトル：臭化カリウム錠剤法で測定した赤外吸収スペクトルは図２に示すとおりであり、νmax 3509, 3428, 2929, 2851, 1711, 1614, 1461, 1380, 1338, 1264, 1185 cm^-1等に特徴的な吸収極大を示す；
（６）比旋光度： [α] D22 -41.60°（c=0.1、メタノール）；
（７）溶剤に対する溶解性：メタノール、エタノール、アセトニトリル、酢酸エチル、ジメチルスルホキサイドに可溶。クロロホルムに易溶；
（８）プロトン及びカーボン核磁気共鳴スペクトル：重クロロホルム中で、バリアン社製600 MHz核磁気共鳴スペクトロメータで測定した水素の化学シフト（ppm）及び炭素の化学シフト（ppm）は下記に示すとおりである；
δH : 0.33 (3H), 0.73 (3H), 0.78 (3H), 0.82 (1H), 0.84 (1H) 0.85 (3H, 1H), 1.02 (1H), 1.06 (3H), 1.15 (1H, 1H), 1.26 (1H), 1.36 (1H), 1.40 (1H), 1.43 (1H), 1.46 (1H), 1.54 (1H), 1.56 (1H), 1.72 (1H, 1H), 1.82 (1H), 2.25 (1H), 2.58 (1H), 2.94 (1H), 4.68 (1H), 6.54 (1H), 6.55 (1H), 6.96 (1H) ppm；
δC : 16.4, 16.4, 18.2, 18.4, 18.6, 21.5, 31.0, 33.3, 33.4, 33.5, 35.0, 37.4, 37.4, 40.1, 42.2, 43.0, 46.2, 56.8, 58.0, 63.1, 107.8, 112.6, 124.6, 135.9, 153.8, 154.2 ppm。

重クロロホルム中でのプロトン核磁気共鳴スペクトルを図３に、カーボン核磁気共鳴スペクトルを図４にそれぞれ示す。
上述した3787-5-1物質の各種理化学性状やスペクトルデータを詳細に検討した結果、3787-5-1 物質は下記の式 [I] で表される化学構造であることが決定された。

本発明は、上記の式[I]で示される3787-5-1物質の塩、特に薬学的に許容される塩も包含する。塩としては、ナトリウム塩などのアルカリ金属塩、アンモニウム塩が例示される。これらの塩は常法に従って製造することができる。例えば、3787-5-1物質をエタノールなどの水混和性有機溶媒に溶解させ、得られた溶液を同じ溶媒に溶解させたアルカリ金属水酸化物の溶液と反応させるか、この溶液にアンモニアガスを通じることにより、アルカリ金属塩又はアンモニウム塩を製造することができる。

本発明の3787-5-1物質は、後述の試験例に示すように、単独で抗悪性腫瘍作用を示し、さらに、組み合わせて用いた他の抗悪性腫瘍剤の抗悪性腫瘍活性増強作用を有する。従って、本物質は、単独であるいは他の抗悪性腫瘍剤と組み合わせて、悪性腫瘍の発症および進展を抑えることができ、悪性腫瘍やそれに起因する疾病、より広義には細胞の異常増殖に起因する疾患、の予防薬または治療薬として有用である。

単独であるいは組み合わせることで抗悪性腫瘍活性を示す化合物が効果を示す疾患の例としては、胃の悪性腫瘍、間質性肺炎、関節リウマチ、肝内胆管の悪性腫瘍、肝の悪性腫瘍、気胸、急性気管支炎、急性細気管支炎、急性白血病、胸壁腫瘍、胸膜腫瘍、後腹膜疾患、黒色腫、骨髄増殖性疾患、骨軟部の悪性腫瘍、子宮頸部の悪性腫瘍、子宮体部の悪性腫瘍、子宮付属器の悪性腫瘍、自己免疫疾患、小腸の悪性腫瘍、食道の悪性腫瘍、縦隔悪性腫瘍、縦隔・胸膜の悪性腫瘍、腎盂の悪性腫瘍、腎腫瘍、膵臓の腫瘍、精巣腫瘍、前立腺の悪性腫瘍、大腸の悪性腫瘍、多発性骨髄腫、胆外胆管の悪性腫瘍、胆管炎、胆管結石、胆のうの悪性腫瘍、腸閉塞、直腸肛門の悪性腫瘍、頭頸部悪性腫瘍、乳房の悪性腫瘍、尿管の悪性腫瘍、脳梗塞、脳腫瘍、肺炎、肺の悪性腫瘍、脾臓の腫瘍、非ホジキンリンパ腫、膀胱腫瘍、ホジキン病、慢性Ｃ型肝炎、慢性白血病、免疫系悪性新生物、卵巣の悪性腫瘍、緑内障などが挙げられるが、これらに限定されない。

本発明の3787-5-1物質を単独で、又は他の抗悪性腫瘍剤と組み合わせて悪性腫瘍やその関連疾患の予防薬または治療薬として使用する場合、製剤化は常法によればよい。例えば、本発明物質を有効成分とし、慣用の担体や賦形剤、必要に応じて結合剤、崩壊剤、滑沢剤、緩衝剤、懸濁化剤、安定化剤、pH調節剤、着色剤、矯味剤、香料などを添加し、溶液、懸濁液、錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤などに製剤化することができる。

本発明の3787-5-1物質を、他の抗悪性腫瘍剤の抗悪性腫瘍活性を増強させるための薬剤として使用する場合、本発明の3787-5-1物質によりその抗悪性腫瘍活性が増強される抗悪性腫瘍剤として、例えば、ブレオマイシンやアドリアマイシン (ドキソルビシン) といった抗腫瘍性抗生物質などが挙げられる。抗悪性腫瘍剤は副作用が問題となるものが多いが、本発明の3787-5-1物質を併用投与することによって抗悪性腫瘍剤の活性を高めることにより、その抗悪性腫瘍剤の投与量の低減及び／又は投与期間の短縮を図ることができ、該薬剤の副作用を減ずることが可能となる。

前記の他の抗悪性腫瘍剤と本発明の3787-5-1物質は、同時にまたは逐次的に投与することができる。
本発明の3787-5-1物質又はその製薬学的に許容される塩を含む医薬組成物は、その投与形態に合わせて、必要に応じて担体等とともに常法に従い製剤化することができる。経口投与のための製剤としては、錠剤、丸剤、顆粒剤、カプセル剤、散剤、液剤、懸濁剤、シロップ剤、舌下剤等が挙げられる。また非経口投与のための製剤としては、注射剤、経皮吸収剤、吸入剤、坐剤等が挙げられる。製剤化に際しては、界面活性剤、賦形剤、安定化剤、湿潤剤、崩壊剤、溶解補助剤、等張剤、緩衝剤、着色料、着香料等の医薬用添加剤を適宜使用する。なお、他の抗悪性腫瘍剤と併用する場合、他の抗悪性腫瘍剤と3787-5-1物質の剤形及び投与経路は必ずしも同一である必要はない。例えば、一方を経口で、他方を非経口で投与することができる。

担体としては製薬学上許容されるものを用いることができ、その種類及び組成は投与経路や投与方法によって適宜決定することができる。例えば、液状担体として水、アルコール、大豆油、ゴマ油等を用いることができる。固体担体としてマルトース、スクロースなどの糖類、リジンなどのアミノ酸類、ヒドロキシプロピルセルロースなどのセルロース誘導体、シクロデキストリンなどの多糖類、ステアリン酸マグネシウムなどの有機酸塩等を使用できる。注射剤として製剤化する場合には、液状担体は一般に生理食塩水、各種緩衝液、グルコース等の糖類溶液を用いることができる。

本発明の3787-5-1物質又はその薬学的に許容される塩を医薬組成物の形で投与する場合、その投与量は、患者の年齢、体重、疾病の種類や程度、投与経路、他の薬剤の有無などの因子により異なり、動物試験の結果など種々の状況を勘案して、総投与量が一定量を越えない範囲で決定できる。具体的には、ヒトに経口投与する場合には、成人一人当たり一日に１〜１０００ｍｇ／ｋｇ、静脈投与の場合には同じく０.１〜１００ｍｇ／ｋｇの範囲内で投与することができる。具体的な投与量は、悪性腫瘍の予防または治療に有効な量であり、患者ごとに異なるので、主治医により決定される。

医薬組成物が、3787-5-1物質に加えて、他の抗悪性腫瘍剤をさらに含有している場合も、上記と同様に製剤化することができる。その場合、他の抗悪性腫瘍剤の投与量は、その抗悪性腫瘍剤に対して規定されている量とする。3787-5-1物質の投与量は、組み合わせる抗悪性腫瘍剤の抗悪性腫瘍活性の増強に有効な量とし、好ましくは、後述する試験例２に示した方法で求めた増強活性比が２以上、より好ましくは５以上となる量とする。

以下に実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれのみに限定されるものではない。

3787-5-1物質の製造方法
寒天斜面培地（スターチ1.0％（関東化学）、エヌ・ゼット・アミン0.3％（和光純薬）、酵母エキス0.1％（オリエンタル酵母）、肉エキス0.1％（極東製薬工業）、炭酸カルシウム0.3％（関東化学）、寒天1.2％（清水食品）pH 7.0に調整）で培養したファイトハビタンス・エスピー3787-5株を、種培地 (グルコース2％ (和光純薬)、ポリペプトン0.5 ％ (和光純薬)、MgSO₄・7H₂O 0.05％ (和光純薬)、酵母エキス0.2％ (オリエンタル酵母)、KH₂PO₄0.1％ (関東化学)、寒天 0.1％（清水食品）pH 6.0に調整) 10 mlを分注した大試験管に一白金耳ずつ接種し、27℃で3日間ロータリーシェイカー (210 rpm)で培養した。得られた種培養液を、生産培地 (可溶性スターチ1.0％ (Becton Dickinson)、グルコース1.0％ (関東化学)、酵母エキス0.2％（オリエンタル酵母）、大豆粉2.0％ (Becton Dickinson)、金属塩溶液0.1％（FeSO₄・7H₂O 0.1％（関東化学）、MnCl₂・4H₂O 0.1％（関東化学）、ZnSO₄・7H₂O 0.1％（関東化学）、CuSO₄・5H₂O 0.1％（関東化学）、CoCl₂・6H₂O 0.1％（和光純薬）、pH 7.0) 4.0 lを100 mlずつ分注した500 ml容三角フラスコに1％ずつ植菌し、27℃で30日間振とう培養を行った。

培養終了後、合わせて得られた培養液 (4.5 l) を3,000 rpmで10分間遠心分離し、沈殿した菌体にエタノール（2.0 l）を加え、充分に撹拌後、１時間超音波処理して抽出液を得た。この抽出液を、減圧下でエタノールを留去することにより0.8 lの濃縮液とした。この濃縮液より酢酸エチル（0.8 l）で活性成分を抽出し、酢酸エチル層を濃縮乾固し、褐色活性粗物質（2.34 g）を得た。この粗物質をODS (オクタデシルシリル) カラム（PEGASIL、センシュー科学製、125 g）を用いたクロマトグラフィー処理により粗精製した。クロマトグラフィーは、60％アセトニトリル水溶液800 ml、100％アセトニトリル1.2 l、そして100％アセトン1.2 lを展開溶媒として用い、いずれの展開溶媒でも溶出液を200 mlずつ分画した。3787-5-1物質を含む画分（100％アセトンフラクションの1本目と2本目）を濃縮することで、褐色物質81.4 mgを得た。この物質を少量のメタノールに溶解し、分取HPLC (カラム : PEGASIL C4、20φ×250 mm、株式会社センシュー科学) により最終精製を行った。0.05％リン酸を含むアセトニトリル水溶液を移動相とし、45分間で85％から90％のアセトニトリル濃度の直線的濃度勾配にて溶出した。8 ml/minの流速において、UV 210 nm の吸収をモニターした。保持時間27分に活性を示すピークが観察され、このピークを分取して分取液を減圧下濃縮し、褐色粉末の3787-5-1物質を収量16.41 mgで単離した。同定データは上述した通りである。

（試験例１）
チアゾリルブルー臭化テトラゾリルを用いたMTT評価法 (Mosmann et al., J Immunol. Methods, Vol. 65, pp. 55-63, 1983) により、本発明の3787-5-1物質の抗悪性腫瘍活性について調べた。

メタノールで0.001、0.01、0.1、1 mg/ml濃度に調整した3787-5-1物質の溶液を96穴プレートに10μlずつ添加し、クリーンベンチ内で風乾した。
次に、ヒトT細胞性白血病細胞株であるJurkat細胞を、5％ウシ胎児血清 (Hyclone社)とペニシリン／ストレプトマイシン (Invitrogen社) を含むRPMI-1640培地 (Invitrogen社) で、5.0×10⁵ cells/mlに調製した後、各穴に100μlずつまき、5％炭酸ガスインキュベーター内にて37℃で一晩培養した。

次に、5.5 mg/mlに溶解したチアゾリルブルー臭化テトラゾリル水溶液を10μlずつ各穴に加え、さらに3時間培養した。
各穴に溶解液 (40％Ｎ,Ｎ−ジメチルホルムアミド、2％酢酸、20％ドデシル硫酸ナトリウム、0.03Ｎ塩酸) を90μlずつ加え、3時間振とうした。

各穴の570 nmにおける吸光度をマイクロプレートリーダー(Elx808、BIO-TEK Instruments社製)で測定し、下記式により生存率を測定した。
生存率 (％)＝100×[1-((試験化合物添加時の吸光度)−(バックグラウンド))／((コントロールの吸光度)−(バックグラウンド))]
生存率を50％阻害する濃度（ＩＣ₅₀）を抗悪性腫瘍活性の指標として求めた結果、本発明の3787-5-1物質のＩＣ₅₀値は、142μMと算出され、本物質が単独で抗悪性腫瘍活性を示すことが明らかとなった。

（試験例２）
Jurkat細胞は、p53が変異しているためにG1 checkpointが機能せず、G2 checkpointに依存してＤＮＡ傷害を修復することが知られている (Suganuma et al., Cancer Res., Vol. 59, pp. 5887-5891, 1999)。すなわち、Jurkat細胞におけるＤＮＡ傷害剤の抗悪性腫瘍活性は、G2 checkpoint阻害活性を反映すると考えられている (Arai et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., Vol. 317, pp. 817-822, 2004)。

MTT評価法により、本発明の3787-5-1物質のブレオマイシンに対する抗悪性腫瘍活性の増強効果について調べた。
メタノールで0.01 mg/mlに調整した3787-5-1物質を96穴プレートに9.5μl添加し、クリーンベンチ内で風乾した。

次に、Jurkat細胞を、5％ウシ胎児血清 (Hyclone社)とペニシリン／ストレプトマイシン (Invitrogen社) および30μg/ml塩酸ブレオマイシン (日本化薬株式会社製) を含むRPMI-1640培地 (Invitrogen社) で5.0×10⁵ cells/mlに調製してから、各穴に100μlずつまき、5％炭酸ガスインキュベーター内にて37℃で一晩培養した。

各穴の570 nmにおける吸光度をマイクロプレートリーダー(Elx808、BIO-TEK Instruments社製)で測定し、試験例１と同様にＩＣ₅₀値を測定した。
さらに、ブレオマイシンの抗悪性腫瘍活性を基準とし、3787-5-1物質による抗悪性腫瘍活性の活性増強比を以下の式により算定した。

活性増強比＝（ブレオマイシンのIC₅₀）／（3787-5-1物質存在下でのブレオマイシンのIC₅₀）
ＩＣ₅₀値と増強活性比について、得られた結果を下記の表１に示した。

ブレオマイシンのみをJurkat細胞に作用させた場合のブレオマイシンのＩＣ₅₀値は236μg/mlと算定された。ブレオマイシンと共に3787-5-1物質を0.78μg/mlで作用させると、ブレオマイシンのＩＣ₅₀値は23.9μg/mlと算定され、ブレオマイシンの抗悪性腫瘍活性は9.9倍増強された。

（試験例３）
フローサイトメーターを用いて細胞周期を測定し、Suganuma等の方法 (Suganuma et al., Cancer Res., Vol. 59, pp. 5887-5891, 1999) を参考に、3787-5-1物質のG2 checkpoint阻害活性について解析した。

メタノールで0.1、1、10 mg/mlに調整した3787-5-1物質を96穴プレートに各1μlずつ添加し、クリーンベンチ内で風乾した。
次に、Jurkat細胞を、5％ウシ胎児血清 (Hyclone社)とペニシリン／ストレプトマイシン (Invitrogen社) および、必要に応じて30μg/ml塩酸ブレオマイシン (日本化薬株式会社製) を含むRPMI-1640培地 (Invitrogen社) で5.0×10⁵ cells/mlに調製してから、各穴に100μlずつまき、5％炭酸ガスインキュベーター内にて37℃で一晩培養した。

各穴に染色液 (0.2% sodium citrate (SIGMA社), 100 mg/ml propidium iodide (SIGMA社), 40 mg/ml ribonuclease A (SIGMA社), 0.6% IGEPAL CA-630 (SIGMA社)) を100μlずつ加え、10分間振とうした。

フローサイトメーター (FACSCalibur, Becton Dickinson社製)で細胞周期を測定し、Cell Questで各期に分布する細胞の割合を算出した。
さらに、30μg/ml塩酸ブレオマイシンの非存在下および存在下の両条件下にて、3787-5-1物質を作用させない場合を基準とし、G2/M期の細胞の割合を50%に低下させる3787-5-1物質の濃度を算出し、ＥＣ₅₀とした。

ＥＣ₅₀について、得られた結果を下記の表２に示した。

3787-5-1物質のみをJurkat細胞に作用させた場合のＥＣ₅₀は273μM以上と算定された。ブレオマイシンと共に3787-5-1物質を作用させると3787-5-1物質のＥＣ₅₀は3.55μMと算定された。即ち、3787-5-1物質はブレオマイシンにより引き起こされるG2 checkpoint (Ｇ２期修復機構)を阻害することが明らかとなった。

本発明に係る化合物は、G2 checkpoint阻害活性を示し、さらにブレオマイシンの抗悪性腫瘍活性の増強活性を示すことから、抗悪性腫瘍剤および抗悪性腫瘍活性増強剤として、細胞増殖異常により引き起こされる悪性腫瘍等の疾患の治療に有用であると期待される。

ＮＩＴＥＢＰ−１１３７

Claims

下記式[I]で表される化合物である3787-5-1物質又はその塩。
請求項１記載の物質又はその薬学的に許容される塩を含有する抗悪性腫瘍剤。
請求項１記載の物質又はその薬学的に許容される塩を含有する抗悪性腫瘍活性増強剤。
請求項１記載の物質又はその薬学的に許容される塩を有効成分として含有する、細胞増殖異常に起因する疾患の予防または治療用医薬組成物。
他の抗悪性腫瘍剤をさらに含有する、請求項４に記載の医薬組成物。
他の抗悪性腫瘍剤が抗腫瘍性抗生物質である、請求項５に記載の医薬組成物。
請求項１記載の物質又はその薬学的に許容される塩を有効成分として含有する、G2期修復機構阻害用医薬組成物。
請求項１に記載の3787-5-1物質の製造方法であって、3787-5-1物質を生産する能力を有するファイトハビタンス・エスピー3787-5株（受託番号NITE BP-1137）またはその変異株である微生物を培地で培養して培養物中に3787-5-1物質を蓄積せしめ、該培養物から3787-5-1物質を採取することを特徴とする方法。