JP5786295B2 - 核酸等温増幅反応用マイクロチップ及びその製造方法並びに核酸等温増幅方法 - Google Patents

Description

本発明は、核酸等温増幅反応用マイクロチップ及びその製造方法並びに核酸等温増幅方法に関する。より詳しくは、核酸増幅反応の反応時間を正確に制御するための核酸等温増幅反応用マイクロチップ等に関する。

従来、核酸増幅方法として、ＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）法が用いられてきている。ＰＣＲ法は、（１）熱変性、（２）アニーリング、（３）伸長反応の３つのステップからなる温度サイクルを繰り返すことによって、鋳型となる核酸鎖の増幅を行うものである。

ステップ（１）の熱変性は、鋳型核酸鎖を二本鎖から一本鎖に解離させるためのステップである。熱変性時の反応温度は、通常９４℃前後とされる。ステップ（２）のアニーリングは、一本鎖に解離した鋳型核酸鎖にオリゴヌクレオチドプライマーを結合させるためのステップである。アニーリング時の反応温度は、通常５０〜６０℃程度とされる。ステップ（３）の伸長反応は、ＤＮＡポリメラーゼによって、オリゴヌクレオチドプライマーが結合した部分を起点として一本鎖部分と相補的なＤＮＡを合成するステップである。伸長反応時の反応温度は、通常７２℃前後とされる。

近年、核酸増幅方法として、温度サイクルの繰り返しを要せず、より簡便な等温増幅と呼ばれる方法が用いられるようになっている。例えば、ＬＡＭＰ（Ｌｏｏｐ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法では、オリゴヌクレオチドプライマー、鎖置換型ＤＮＡ合成酵素、核酸モノマー等の試薬と鋳型核酸鎖を混合し、一定温度（６５℃付近）で保温することによって反応が進行する。このため、ＬＡＭＰ法によれば、１ステップで核酸の増幅を行うことできる。

本発明に関連して、近年、マイクロチップのウェル内で核酸増幅反応を進行させ、増幅核酸鎖を光学的に検出あるいは定量する核酸増幅装置（例えば、リアルタイムＰＣＲ装置）が開発されている。

特許文献１には、流路内に、核酸増幅反応に必要なオリゴヌクレオチドプライマー、基質、酵素及びその他の試薬が固体状態で入れられたマイクロ流体チップが開示されている。このマイクロ流体チップは、反応に必要な残りの試薬を液体状態で流路に送液することで、液体状態の試薬と固体状態の試薬が接触し、固体状態の試薬が溶解することにより反応が開始されるものである。

特開２００７−４３９９８号公報

ＰＣＲ法では、反応時間を厳密に制御するため、ホットスタート法と称される方法が採用されている。ホットスタート法は、オリゴヌクレオチドプライマーのミスアニーリングに起因する非特異的増幅反応を回避し、目的の増幅産物を得るための方法である。ホットスタート法は、ＤＮＡポリメラーゼ以外の試薬及び標的核酸鎖の混合液を、一旦、オリゴヌクレオチドプライマーの変性温度まで加温し、変性温度下で初めて酵素を添加後、温度サイクルを実施することで達成される。

一方、等温増幅方法では、一定温度の１ステップで反応を行なうために、ホットスタート法を採用できず、試薬と鋳型核酸鎖を混合した時点で反応が緩徐に進行してしまうため、反応時間を厳密に制御することが難しい。

従来、マイクロチップ型の核酸増幅装置では、試薬と鋳型核酸鎖を予め混合し、この混合液をマイクロチップのウェル内に導入して反応を行なう方法が採られている。そのため、混合液を調製する間、あるいは混合液をウェル内に導入する間に、混合液内で反応が進行してしまう場合があり、反応時間を厳密に制御できず、増幅核酸鎖の定量性に問題が生じていた。

そこで、本発明は、等温増幅方法において、反応時間を正確に制御するための技術を提供することを主な目的とする。

上記課題解決のため、本発明は、核酸の等温増幅反応の反応場となる反応領域内に、反応に必要な物質の少なくとも一部が、常温より高く前記反応の反応温度より低い温度で融解する薄膜により被覆された状態で存在する核酸等温増幅反応用マイクロチップを提供する。
この核酸増幅反応用マイクロチップでは、反応に必要な物質の少なくとも一部を被覆する前記薄膜上に、反応に必要な他の物質の少なくとも一部が固着されて存在することが好適となる。
この核酸等温増幅反応用マイクロチップにおいて、前記反応領域内に存在する物質は、オリゴヌクレオチドプライマー及び酵素、核酸モノマーから選択される一以上とすることができる。
この核酸等温増幅反応用マイクロチップでは、予め反応領域内に収容された物質を被覆する薄膜を、残りの物質と標的核酸鎖を含むサンプル溶液を反応領域内に供給した後に加熱融解させることによって、任意のタイミングで反応を開始できる。
また、核酸等温増幅反応用マイクロチップでは、酵素を被覆する前記薄膜上に、オリゴヌクレオチドプライマーが固着されて存在することが好適となる。
この核酸等温増幅反応用マイクロチップにおいて、前記薄膜は、ステアリン酸又はパラフィンワックスの材料の蒸着によって形成することが好適となる。
また、この核酸等温増幅反応用マイクロチップは、外部から液体が導入される導入口と、複数の前記反応領域と、導入口から導入される液体を各反応領域内に供給する流路と、が配設されることが好適となる。

本発明は、また、核酸の等温増幅反応の反応場となる反応領域内に収容された、反応に必要な物質の少なくとも一部を、常温より高く前記反応の反応温度より低い温度で融解する薄膜により被覆する工程を含む核酸等温増幅反応用マイクロチップの製造方法を提供する。

本発明は、さらに、核酸の等温増幅反応に必要な物質の少なくとも一部が、常温より高く前記反応の反応温度より低い温度で融解する薄膜により被覆されて存在する反応領域内に、反応に必要な残りの物質を導入し、反応温度まで昇温する手順を含む核酸等温増幅方法をも提供する。

本発明において、「核酸等温増幅反応」には、温度サイクルを伴わない各種増幅反応が含まれる。等温増幅反応としては、例えば、ＬＡＭＰ（Ｌｏｏｐ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法やＳＭＡＰ（ＳＭａｒｔＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｐｒｏｃｅｓｓ）法、ＮＡＳＢＡ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ−Ｂａｓｅｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＩＣＡＮ（Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｎｄ Ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｐｒｉｍｅｒ−ｉｎｉｔｉａｔｅｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ）法（登録商標）、ＴＲＣ（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｃｏｎｃｅｒｔｅｄ）法、ＳＤＡ（ｓｔｒａｎｄ ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＴＭＡ（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＲＣＡ（ｒｏｌｌｉｎｇ ｃｉｒｃｌｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法等が挙げられる。この他、「核酸増幅反応」には、核酸の増幅を目的とする等温による核酸増幅反応が広く包含されるものとする。また、これらの核酸増幅反応には、リアルタイム（ＲＴ）−ＬＡＭＰ法などの核酸鎖の増幅とともに増幅された核酸鎖の定量を伴う反応も包含される。

また、「反応に必要な物質」には、核酸等温増幅反応において増幅核酸鎖を得るために必要な物質であって、具体的には、標的核酸鎖に相補的な塩基配列とされたオリゴヌクレオチドプライマー、核酸モノマー（ｄＮＴＰ）、酵素、反応緩衝液（バッファー）溶質などが含まれる。

本発明により、等温増幅方法において、反応時間を正確に制御するための技術が提供される。

本発明に係る核酸増幅反応用マイクロチップの上面模式図である。 マイクロチップの断面模式図（図１、Ｐ−Ｐ断面）である。 マイクロチップのウェル内に存在する反応に必要な物質を説明するための模式図である。 本発明に係る核酸増幅反応用マイクロチップの製造方法を説明するためのフローチャートである。 変形例に係るマイクロチップのウェル内に存在する反応に必要な物質を説明するための模式図である。 変形例に係る核酸増幅反応用マイクロチップの製造方法を説明するためのフローチャートである。 プライマーをステアリン酸あるいはパラフィンワックスで被覆して固着した反応系でのＬＡＭＰ反応の結果を示す図である（実施例２）。 酵素をステアリン酸あるいはパラフィンワックスで被覆して固着した反応系でのＬＡＭＰ反応の結果を示す図である（実施例２）。

以下、本発明を実施するための好適な形態について図面を参照しながら説明する。なお、以下に説明する実施形態は、本発明の代表的な実施形態の一例を示したものであり、これにより本発明の範囲が狭く解釈されることはない。なお、説明は以下の順序により行う。

１．核酸増幅反応用マイクロチップと核酸等温増幅方法
２．核酸増幅反応用マイクロチップの製造方法
（２−１）基板層ａ_１の成形
（２−２）ウェルへの物質の収容
（２−３）薄膜による被覆
（２−４）基板層ａ_１，ａ_２の表面活性化と貼り合せ
３．本実施形態の変形例に係る核酸増幅反応用マイクロチップ及びその製造方法

１．核酸等温増幅反応用マイクロチップと核酸等温増幅方法
［核酸等温増幅反応用マイクロチップ］
本発明に係る核酸等温増幅反応用マイクロチップ（以下、単に「マイクロチップ」とも称する）の上面模式図を図１に、断面模式図を図２に示す。図２は、図１中Ｐ−Ｐ断面に対応する。

符号Ａで示すマイクロチップには、外部から液体（サンプル溶液）が導入される導入口１と、核酸増幅反応の反応場となる複数のウェル（反応領域）と、一端において導入口１に連通する主流路２と、この主流路２から分岐する分岐流路３が配設されている。主流路２の他端は、サンプル溶液を外部に排出する排出口５として構成されており、分岐流路３は、主流路２の導入口１への連通部と排出口５への連通部との間において主流路２から分岐し、各ウェルに接続されている。サンプル液には、核酸増幅反応において鋳型核酸鎖となるＤＮＡやゲノムＲＮＡ、ｍＲＮＡなどが含まれ得る。

ここでは、マイクロチップＡに縦横３例で合計９つのウェルを均等間隔で配設する場合を例として、これら９つのウェルを３区分し、図１上段の３つのウェルを符号４１で、中段の３つのウェルを符号４２で、下段の３つのウェルを符号４３で示す。導入口１から導入されたサンプル溶液は、主流路２を排出口５に向かって送液され、送液方向上流に配設された分岐流路３及びウェルから順に内部に供給される。なお、マイクロチップＡにおいて、排出口５は必須の構成とはならないものとする。すなわち、マイクロチップＡは、導入口１から導入されたサンプル溶液が外部に排出されない構成でもよい。

マイクロチップＡは、導入口１、主流路２、分岐流路３、ウェル４１，４２，４３及び排出口５を形成した基板層ａ_１に基板層ａ_２を貼り合わせて構成されている。基板層ａ_１，ａ_２の材質は、ガラスや各種プラスチック（ポリプロピレン、ポリカーボネート、シクロオレフィンポリマー、ポリジメチルシロキサン）とすることができる。ウェル４１，４２，４３内で増幅された核酸鎖の検出あるいは定量を光学的に行う場合には、基板層ａ_１，ａ_２の材質は、光透過性を有し、自家蛍光が少なく、波長分散が小さいために光学誤差の少ない材料を選択することが好ましい。

ウェル４１，４２，４３内には、反応に必要な物質の少なくとも一部が、加熱融解性を有する薄膜６により被覆された状態で存在している。図３に、各ウェル内に収容された物質を示す。図３（Ａ）はウェル４１、（Ｂ）はウェル４２、（Ｃ）はウェル４３内に収容された物質を示している。

ウェル内に存在する物質は、核酸等温増幅反応において増幅核酸鎖を得るために必要な物質であって、具体的には、標的核酸鎖に相補的な塩基配列とされたオリゴヌクレオチドプライマー、核酸モノマー（ｄＮＴＰ）、酵素、反応緩衝液（バッファー）溶質などとされる。ウェル内に存在する物質は、これらのうち１あるいは２以上とできる。また、ウェル内には、増幅核酸鎖を得るために必須ではないが、蛍光試薬（蛍光色素）やリン光試薬（リン光色素）などの増幅核酸鎖の検出及び定量のために必要な試薬を、必要に応じて収容しておくこともできる。

ここでは、ウェル４１，４２，４３内にオリゴヌクレオチドプライマー（以下、単に「プライマー」とも称する」）Ｐ_１，Ｐ_２，Ｐ_３を収容する場合を図示している。

プライマーＰ_１，Ｐ_２，Ｐ_３は、同一の塩基配列を有するプライマーであってもよいが、マイクロチップＡにおいて複数の標的核酸鎖の増幅を行う場合には、異なる塩基配列を有するプライマーとされる。例えば、マイクロチップＡを用いて遺伝子型の判定を行う場合には、各遺伝子型の塩基配列に応じて異なる塩基配列を有するプライマーを、それぞれウェル４１，４２，４３内に収容しておく。また、マイクロチップＡを用いて感染病原体の判定を行う場合には、各ウイルスや微生物の遺伝子配列に応じて異なる塩基配列を有するプライマーを同様に収容する。

プライマーＰ_１，Ｐ_２，Ｐ_３は、常温より高く、かつ核酸等温増幅反応の反応温度よりも低い温度で加熱融解する薄膜６により被覆されて各ウェル内に存在している。

薄膜６は、融解温度未満（室温を含む）では、流動性を失って固形状態となり、融解温度以上では、融解あるいは流動化して液状あるいはゲル状となる材料によって形成される。薄膜６により被覆されたプライマーＰ_１，Ｐ_２，Ｐ_３は、融解温度未満では固形状態の薄膜６内に外部から隔絶されて存在し、融解温度以上では流動化して崩壊した薄膜６から放出されて外部と接触可能な状態とされる。

核酸等温増幅反応の反応温度は、通常５０〜７５℃であり、薄膜６の融解温度あるいは流動化温度は、常温（室温）である２５℃前後よりも高く、反応温度である５０〜７５℃よりも低く設定される。薄膜６の融解温度等をこの範囲に設計することで、プライマーＰ_１，Ｐ_２，Ｐ_３を、融解温度未満において確実に外部から隔絶するとともに、融解温度以上において迅速に放出させることができる。

融解温度未満におけるプライマーＰ_１，Ｐ_２，Ｐ_３の外部からの隔絶を確実にするため、薄膜６は撥水性を有することが好ましい。薄膜６に撥水性を付与することで、ウェル内に導入されたサンプル溶液によって融解温度未満で薄膜６が溶解することを防止できる。

薄膜６の材料は、上記の融解温度等と、好ましくは撥水性とを具備する材料であれば特に限定されない。薄膜６の材料としては、ステアリン酸、パラミチン酸、又はミリスチン酸などの脂肪酸、ヘベニルアルコール、アガロース、パラフィンワックス、マイクロクリスタリンワックス、ゼラチンなどが挙げられる。
各材料の融点は、ステアリン酸６９℃、パラミチン酸６３℃、ミリスチン酸５４℃、ヘベニルアルコール６５〜７３℃、アガロース６５℃、パラフィンワックス４０〜７０℃、マイクロクリスタリンワックス６０〜９０℃、ゼラチン４０〜５０℃である。

また、薄膜６の天然材料として以下が挙げられる。ヤシ科植物の葉の分泌物から得られ、ヒドロキシ酸エステルを多く（30-35％）含むカルナバワックス。北アフリカ南部の乾燥地帯に植生する植物から得られ、炭化水素比率が高い（40-50%）キャンデリラワックス。ハゼの実から得られ、グリセライドを主成分とする木蝋。この他の植物性硬化油脂。
各材料の融点は、カルナバワックス８０〜８６℃、キャンデリラワックス６６〜７１℃、木蝋５０〜５６℃であり、植物性硬化油脂には融点が４８〜７０℃のものが多くある。

さらに、薄膜６の材料として以下の化合物も上記の融解温度等を具備する。Ｎｂ（ＮｔＣ_５Ｈ_１１）[Ｎ（ＣＨ_３）_２]_３（融点４７℃）、シクロペンタジエニル（ｔＣｐ）錯体であるトリ(エチルシクロペンタジエニル)プラセオジム（Ｐｒ（ＥｔＣｐ）_３）（７０〜７３℃）、ＴａＮバリヤ膜形成用材料として用いられるＴａ（ＮｔＣ_５Ｈ_１１）[Ｎ（ＣＨ_３）_２]_３（３６℃）、スチレン系樹脂であるトリエチレングリコール-ビス[３−（３−ｔ−ブチル−５−メチル−４−ヒドロキシフェニル)プロピオネート（７６〜７９℃）、酸化防止剤として用いられる２, ２−チオ-ジエチレンビス[３−（３，５−ジ−ｔ−ブチル−４−ヒドロキシフェニル)プロピオネート（６３℃以上）やオクタデシル−３−（３，５−ジ−ｔ−ブチル−４−ヒドロキシフェニル)プロピオネート（５０〜５３℃）、重曹（７０℃）、イオン液体である１−エチルー３−メチルイミダゾリウムバイフルオライド（５１℃）。

薄膜６の材料は、サンプル液中に融解、混合して、核酸増幅反応を阻害しないような材料を選択すること望ましい。実施例で後述するように、例えば、ステアリン酸やパラフィンワックスは反応阻害性がない。あるいは、薄膜６の膜厚を、サンプル液中に融解、混合した際の反応阻害を無視し得るような薄さとすることが望ましい。薄膜６の膜厚は、例えば１０００ｎｍ（体積１ｎｌ）以下とすることで、薄膜６が融解した際のサンプル液中における材料の濃度を０．１％程度に抑え、反応阻害を生じないようにできる。薄膜６の膜厚は、上記材料の蒸着によって形成することで、１０００ｎｍから１０ｎｍ程度までの範囲の任意の厚さとできる。

［核酸等温増幅方法］
次に、マイクロチップＡを用いた核酸等温増幅方法について説明する。

まず、薄膜６により被覆された状態で予め各ウェル内に収容されたプライマー以外の反応に必要な物質（酵素、ｄＮＴＰ、バッファー溶質など）と標的核酸鎖とを含むサンプル溶液を導入口１から各ウェル内に供給する。このとき、サンプル溶液は常温に維持されており、薄膜６により被覆されたプライマーはサンプル溶液から隔絶された状態とされている。そのため、プライマーとサンプル溶液が混合して反応が進行することはない。

各ウェル内にサンプル液を供給した後、サンプル溶液を反応温度まで昇温する。これにより、薄膜６が流動化して崩壊し、プライマーが放出されてサンプル溶液と混合し、反応が開始される。

このように、マイクロチップＡでは、サンプル溶液を各ウェル内に供給した後、反応温度まで昇温することによって初めて反応が開始される。そのため、マイクロチップＡでは、反応時間を厳密に制御することが可能である。

ここでは、反応に必要な物質としてプライマーを薄膜６により被覆された状態で予めウェル内に収容しておく場合を例に説明したが、ウェル内に収容する物質は、酵素、ｄＮＴＰあるいはバッファー溶質であってもよい。また、ウェル内には、プライマーと酵素、プライマーとｄＮＴＰ、プライマーと酵素とｄＮＴＰというように２以上を組み合わせて収容してもよい。

本発明に係るマイクロチップでは、反応に必要な物質を加熱融解性を有する薄膜により被覆された状態で予めウェル内に収容し、残りの物質と標的核酸鎖を含むサンプル溶液をウェル内に供給した後、反応温度まで昇温することにより、任意のタイミングで反応を開始できる。従って、このマイクロチップによれば、反応時間を厳密に制御でき、増幅核酸鎖の定量を高精度に行うことができる。

なお、本発明に係るマイクロチップにおいて、ウェルの数や配設位置は任意とでき、ウェルの形状も図に示した円柱形状に限定されない。また、導入口１に導入されたサンプル溶液を各ウェル内に供給するための流路の構成も、図に示した主流路２及び分岐流路３の態様に限定されない。さらに、ここでは、導入口１等を基板層ａ_１に形成する場合を説明したが、導入口１等は基板層ａ_１及び基板層ａ_２の両方に一部ずつ形成されていてもよい。マイクロチップを構成する基板層も２以上であってよい。

２．核酸増幅反応用マイクロチップの製造方法
続いて、図４に示すフローチャートを参照して、本発明に係るマイクロチップの製造方法を説明する。以下、上述のマイクロチップＡを例に説明する。

（２−１）基板層ａ_１の成形
図４中、符号Ｓ_１は、基板層ａ_１の成形工程である。本工程では、基板層ａ_１に、導入口１、主流路２、分岐流路３、ウェル４１，４２，４３及び排出口５を成形する。基板層ａ_１への導入口１等の成形は、例えば、ガラス製基板層のウェットエッチングやドライエッチングによって、あるいはプラスチック製基板層のナノインプリントや射出成型、切削加工によって行うことができる。

（２−２）ウェル内への物質の収容
符号Ｓ_２は、反応に必要な物質をウェル内へ収容する工程である。本工程では、ウェル４１，４２，４３内にそれぞれプライマーＰ_１，Ｐ_２，Ｐ_３の溶液を滴下し乾燥させることにより、プライマーをウェル内に収容する。既に説明したように、ウェル内に収容する物質は、オリゴヌクレオチドプライマーに限定されず、ｄＮＴＰ、酵素、バッファー溶質などであってもよい。

滴下したプライマー溶液は、風乾、真空乾燥あるいは凍結乾燥等によって、好ましくは緩徐に乾燥させる。ウェル内に収容する物質を酵素とする場合には、活性の低下や失活を防止するため、滴下した酵素溶液は、臨界点乾燥により乾燥させることが好ましい。

（２−３）薄膜による被覆
符号Ｓ_３は、ウェル内に収容した物質を薄膜６により被覆する工程である。

薄膜６は、ウェル内に収容されたプライマー上に、薄膜６の材料溶液を滴下し乾燥させることにより形成できる。薄膜６の材料溶液は、プライマーの溶解や変質を防止するため、プライマーと接触すると同時に硬化させることが好ましい。また、薄膜６は、好適には、ウェル内にプライマーを収容した基板層ａ_１を真空蒸着槽に入れ、薄膜６の材料を蒸着させることによって形成する。薄膜６の蒸着は、汎用の真空蒸着装置を使用し、材料に応じて適宜条件を設定することにより行う。ウェル内に酵素を収容しておく場合には、酵素の失活を防ぐため、基板を３０℃以下の温度に制御する機構を有する装置を使用することが好ましい。

（２−４）基板層ａ_１，ａ_２表面の活性化と貼り合せ
符号Ｓ_４は、基板層ａ_１，ａ_２表面の活性化工程である。また、符号Ｓ_５は、基板層ａ_１，ａ_２の貼り合せ工程である。

基板層ａ_１と基板層ａ_２の貼り合わせは、例えば、基板層の表面を酸素プラズマ処理又は真空紫外光処理により活性化して貼り合せる方法を採用できる。ポリジメチルシロキサン等のプラスチックとガラスは親和性が高く、表面を活性化処理して接触させると、ダングリングボンドが反応して強固な共有結合であるＳｉ−Ｏ−Ｓｉシラノール結合を形成し、十分な強度の接合が得られる。酸素プラズマ処理又は真空紫外光処理は、基板層の材料に応じて適宜な条件を設定して行う。

このとき、基板層の表面を酸素プラズマ処理又は真空紫外光処理により活性化する際に、薄膜６がプライマーを保護するため、プラズマや紫外線の照射などによるプライマーの劣化や変性を防止できる。特にウェル内に予め収容する物質を酵素とする場合には、薄膜６により、プラズマや紫外線の照射などによる酵素の活性低下や失活を効果的に防止できる。

３．本実施形態の変形例に係る核酸増幅反応用マイクロチップ及びその製造方法
次に、上述した本実施形態の変形例に係る核酸増幅反応用マイクロチップ及びその製造方法について説明する。なお、本変形例において、本実施形態と実質的に同一の機能構成を有する構成要素については、同一の符号を付することにより重複説明を省略する。

［核酸増幅反応用マイクロチップ］
本変形例に係るマイクロチップＡ２（図示せず）に設けられる、導入口１、主流路２、分岐流路３、ウェル４１、４２、４３、排出口５、及び薄膜６は、上述した本実施形態に係るマイクロチップＡと同一の機能構成を有するものである。本変形例に係るマイクロチップＡ２において、反応に必要な物質の少なくとも一部が被覆された薄膜上に、反応に必要な他の物質の少なくとも一部が固着されている点以外は、本実施形態に係るマイクロチップＡと実質的に同一である。そのため、ここでは、ウェル内において反応に必要な物質の少なくとも一部が被覆された薄膜上に、反応に必要な他の物質の少なくとも一部が固着されている点についてのみ説明する。

また、ウェル内に存在する物質のうち、何れの物質が薄膜６により被覆され、何れの物質が薄膜６上に固着されるかについては、特に限定されるものではないが、以下では、酵素を被覆する薄膜６上に、プライマーが固着されている場合を例に説明する。

図５に各ウェル内に収容された物質を示す。図５（Ａ）はウェル４１、（Ｂ）はウェル４２、（Ｃ）はウェル４３に収容された物質を示している。ここでは、ウェル４１、４２、４３内に酵素Ｅを収容し、且つ酵素Ｅを被覆する薄膜６上にプライマーＰ_１１、Ｐ_１２、Ｐ_１３が固着されている場合を図示している。

薄膜６により被覆された酵素Ｅは、融解温度未満では固形状態の薄膜６内に外部から隔絶されて存在し、融解温度以上では流動化して崩壊した薄膜６から放出されて外部と接触可能な状態とされる。

プライマーＰ_１１、Ｐ_１２、Ｐ_１３は、薄膜６上で固着されており、ウェル内にサンプル溶液が供給されることで再溶解される。また、プライマーＰ_１１、Ｐ_１２、Ｐ_１３は、上述したプライマーＰ_１、Ｐ_２、Ｐ_３と同様に、同一の塩基配列を有するプライマーであってもよいが、マイクロチップＡ２において複数の標的核酸鎖の増幅を行う場合には、異なる塩基配列を有するプライマーとされる。

［核酸等温増幅方法］
本変形例に係るマイクロチップＡ２を用いた核酸等温増幅方法は、反応に必要な物質の少なくとも一部が被覆された薄膜上に、反応に必要な他の物質の少なくとも一部が固着されている点以外は、本実施形態に係る核酸等温増幅方法と実質的に同一である。

すなわち、本変形例に係るマイクロチップＡ２において、まず、酵素が薄膜６により被覆された状態で、薄膜６上にプライマーが固着される。そして、各ウェル内に収容された酵素及びプライマー以外の反応に必要な物質（ｄＮＴＰ、バッファー溶質など）を含む常温のサンプル溶液を導入口１から各ウェル内に供給する。サンプル溶液のウェル内への供給後においては、本実施形態に係る核酸等温増幅方法と同様にして核酸等温増幅方法が行われる。

まず、薄膜６により被覆された状態で予め各ウェル内に収容された酵素及びプライマー以外の反応に必要な物質（ｄＮＴＰ、バッファー溶質など）と標的核酸鎖とを含むサンプル溶液を導入口１から各ウェル内に供給する。これにより、プライマーはサンプル溶液によって再溶解される。このとき、サンプル溶液は常温に維持されており、薄膜６により被覆された酵素はサンプル溶液から隔絶された状態とされている。そのため、酵素とサンプル溶液が混合して反応が進行することはない。

各ウェル内にサンプル液を供給した後、サンプル溶液を反応温度まで昇温する。これにより、薄膜６が流動化して崩壊し、酵素が放出されてサンプル溶液と混合し、反応が開始される。

このように、マイクロチップＡでは、サンプル溶液を各ウェル内に供給した後、反応温度まで昇温することによって初めて反応が開始される。そのため、マイクロチップＡでは、反応時間を厳密に制御することが可能である。

更に、本変形例に係る核酸等温増幅方法は、酵素を薄膜に被覆させ、薄膜上にプライマーを固着してから行われる。そのため、複数のウェルに酵素及び異なるプライマーを収容した場合、反応時間を正確に制御しつつ、且つ感染病原体判定等を容易に行うことができる。

［核酸増幅反応用マイクロチップの製造方法］
次に、図６に示すフローチャートを参照して、本変形例に係るマイクロチップの製造方法を説明する。以下、上述のマイクロチップＡ２を例に説明する。ただし、符号Ｓ_１、Ｓ_３、Ｓ_４、Ｓ_５における工程は、本実施形態に係る核酸増幅反応用マイクロチップＡの製造方法と実質的に同一である。そのため、ここでは、符合Ｓ_６、Ｓ_７における工程についてのみ説明する。

図６中、符号Ｓ_６は、反応に必要な物質をウェル内へ収容する工程である。本工程では、ウェル４１、４２、４３内にそれぞれ酵素Ｅの溶液を滴下し乾燥させることにより、酵素Ｅをウェル内に収容する。既に説明したように、ウェル内に収容する物質は、酵素に限定されず、ｄＮＴＰ、プライマー、バッファー溶質などであってもよい。本変形例に示すように、ウェル内に収容する物質を酵素とする場合には、活性の低下や失活を防止するため、滴下した酵素溶液は、臨界点乾燥により乾燥させることが好ましい。

また、符合Ｓ_７は、薄膜６上に反応に必要な物質を固着させる工程である。本工程では、薄膜６上にそれぞれプライマーＰ_１１、Ｐ_１２、Ｐ_１３の溶液を滴下し乾燥させることにより、プライマーをウェル内に収容する。本工程においても、既に説明したように、ウェル内に収容する物質は、プライマーに限定されず、ｄＮＴＰ、酵素、バッファー溶質などの物質、すなわち、薄膜６により被覆される物質以外の反応に必要な物質であってもよい。滴下したプライマー溶液は、風乾、真空乾燥あるいは凍結乾燥等によって、好ましくは緩徐に乾燥させる。

＜実施例１＞
１．核酸等温増幅反応用マイクロチップの作製
（１）プライマーの固着化
鋳型核酸鎖に対して、「表１」に示す6種のＬＡＭＰ用プライマーを設計した。ＰＤＭＳ製基板に形成したウェル内にプライマー溶液を０．５μｌ滴下し、真空乾燥（室温、０．１Pa、５分）によりウェル内に固着させた。

（２）薄膜の被覆
タングステン製の蒸着ボートにステアリン酸をのせ、熱電ヒーターを接続し、真空蒸着槽内に配置した。ウェル内にプライマーを固着させた基板を真空蒸着槽内に入れて、真空（1.0×10^-6Torr）とし、熱電ヒーターに電流を流してタングステンボードを加熱した。ステアリン酸が蒸着ボート上で溶液化し始めた時点でシャッターを開け、蒸着を開始した。

蒸着は、真空飽和蒸気圧が０．１Ｔｏｒｒになるように、ステアリン酸（融点69℃）を８５℃に加熱して行った。蒸着は、基板温度３０℃にて膜厚が１００ｎｍになるように行った。

蒸着後、真空蒸着槽から取り出し、ウェル内に固着されたプライマーの表面にステアリン酸が皮膜を作っていることを干渉色で確認した。その後、基板表面をDPアッシング（O2：10cc, 100W, 30sec）により親水化し、カバーガラスと貼り合わせてマイクロチップを得た。

２．ＬＡＭＰ反応
鋳型核酸鎖と酵素、インターカレーター蛍光色素（SYBR Green I, Molecular Probes Inc.）、核酸モノマー、バッファーを混合し、反応液を調製した。実施例１で作製したマイクチップの流路に反応液を注入し、ウェル内に導入した。ウェル毎に蛍光検出部や加熱部を備えた蛍光検出装置にマイクチップをセットし、反応を開始した。蛍光色素の蛍光強度に基づいて、標的核酸鎖の増幅量をリアルタイムで測定した。

結果、ＬＡＭＰ反応開始後１０分程度で増幅核酸鎖が検出され、良好な標的核酸鎖の定量性が確認された。

＜実施例２＞
２．薄膜材料の検討
（１）ＬＡＭＰ反応
マイクロチューブに「表１」に示したプライマーの溶液を分注し、真空乾燥（室温、０．１Pa、５分）によりチューブ内に固着させた。ステアリン酸あるいはパラフィンワックス（Paraffin 115, 125, 130, 135, 140）をマイクロチューブに分注した後、反応液を添加した。

また、マイクロチューブに酵素溶液を分注し、真空乾燥（室温、０．１Pa、５分）によりチューブ内に固着させた。ステアリン酸あるいはパラフィンワックス（Paraffin 115, 125, 130, 135, 140）をマイクロチューブに分注した後、プライマー溶液と、酵素以外の試薬を含む反応液とを添加した。

チューブ毎に蛍光検出部や加熱部を備えた蛍光検出装置にマイクロチューブをセットし、反応を開始した。蛍光色素の蛍光強度に基づいて、標的核酸鎖の増幅量をリアルタイムで測定した。

結果を、図７・８に示す。図７は、固着したプライマーをステアリン酸あるいはパラフィンワックスで被覆した反応系の結果、図８は、酵素を固着させてステアリン酸あるいはパラフィンワックスで被覆した反応系の結果を示す。いずれも、ＬＡＭＰ反応開始後１０〜１５分程度で増幅核酸鎖が検出され、パラフィンワックスについても反応阻害性がないことが確認できた。

本発明に係る核酸増幅反応用マイクロチップ等によれば、反応時間を正確に制御して、高精度な分析を行うことができる。そのため、本発明に係る核酸増幅反応用マイクロチップ等は、遺伝子型判定や感染病原体判定などのためのマイクロチップ型の核酸増幅装置に好適に用いられ得る。

Ａ：核酸等温増幅反応用マイクロチップ、Ｐ_１，Ｐ_２，Ｐ_３：プライマー、１：導入口、２：主流路、３：分岐流路、４１，４２，４３：ウェル、５：排出口、Ｅ：酵素

Claims (7)

1. 核酸の等温増幅反応の反応場となる反応領域内に、反応に必要な第一の物質の少なくとも一部が、常温より高く前記反応の反応温度より低い温度で融解する薄膜により被覆された状態で存在し、
   前記反応に必要な第一の物質の少なくとも一部を被覆する前記薄膜上に、前記反応に必要な第二の物質の少なくとも一部が固着されて存在し、更に、
   前記第一の物質と第二の物質以外に前記反応に必要な物質と標的核酸鎖とを含む液体を前記反応領域内に供給する流路が配設される核酸等温増幅反応用マイクロチップ。
2. 前記薄膜が、ステアリン酸又はパラフィンワックスの蒸着によって形成された請求項１記載の核酸等温増幅反応用マイクロチップ。
3. 前記反応領域内に存在する第一の物質が、オリゴヌクレオチドプライマー及び酵素、核酸モノマーから選択される一以上である請求項２記載の核酸等温増幅反応用マイクロチップ。
4. 前記薄膜が被覆された第一の物質は酵素であり、前記第二の物質はオリゴヌクレオチドプライマーである請求項１記載の核酸等温増幅反応用マイクロチップ。
5. 外部から液体が導入される導入口と、複数の前記反応領域と、が配設された請求項１に記載の核酸等温増幅反応用マイクロチップ
6. 核酸の等温増幅反応の反応場となる反応領域内に収容された、反応に必要な第一の物質の少なくとも一部を、常温より高く前記反応の反応温度より低い温度で融解する薄膜により被覆する工程と、
   前記薄膜上に反応に必要な第二の物質を固着させる工程と、
   を含む核酸等温増幅反応用マイクロチップの製造方法。
7. 核酸の等温増幅反応に必要な第一の物質の少なくとも一部が、常温より高く前記反応の反応温度より低い温度で融解する薄膜により被覆されて存在すると共に前記反応に必要な第一の物質の少なくとも一部を被覆する前記薄膜上に、前記反応に必要な第二の物質の少なくとも一部が固着されて存在する反応領域内に、第一の物質及び第二の物質以外の前記反応に必要な物質と標的核酸鎖とを含む液体を導入して当該液体に第二の物質を溶解させ、反応温度まで昇温する手順を含む核酸等温増幅方法。

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