JP5771635B2 - キャリブレーション方法 - Google Patents

Description

本発明は、細胞集塊を含む画像から細胞集塊の体積を推定する処理の精度を向上させるキャリブレーション方法に関する。

医薬品を研究・開発する過程では、医薬品の候補となる化合物を絞り込むスクリーニングが行われる。スクリーニングにおいては、例えば、細胞を投入した培養液を複数用意し、各培養液に、種々の条件を変更しつつ化合物を添加して、細胞を培養する。そして、細胞の培養状態に基づいて、医薬品の候補となる化合物を絞り込む。

このようなスクリーニングにおいては、従来、試薬を用いて細胞の培養状態を評価していた。具体的には、細胞に試薬をかけて、細胞内の特定の分子と当該試薬とを化学反応させ、その光学的な変化を吸光測定することにより、細胞の培養状態を判定していた。しかしながら、この方法には、高価な試薬が必要となる上、化学反応に時間が掛かっていた。また、試薬により細胞壁が破壊されるため、同一の細胞について経時的な変化を観察することができなかった。

また、近年では、より生体内に近い環境における医薬品の効用を調べるために、細胞を立体的に培養する三次元培養が行われている。このような三次元培養においては、複数の細胞が立体的に集合した細胞集塊（スフェロイド）の状態が、重要な観察対象となる。しかしながら、このような細胞集塊を観察する際にも、吸光測定を用いると、上記と同様に、高価な試薬が必要であり、化学反応に時間が掛かり、経時的な変化を観察できない、という問題があった。

このため、近年では、試薬を用いることなく、細胞を高解像度で撮影することによって、細胞集塊の培養状態を観察する装置の開発が試みられている。当該装置では、培養用の複数の窪部を有するウェルプレートを、所定時間おきに撮影し、得られた撮影画像から窪部ごとの画像を切り出す。そして、切り出された画像を表示部に表示して、当該画像を比較・分析することにより、各窪部における細胞集塊の培養状態を評価する。

細胞の画像を取得して画像処理を行う従来の装置については、例えば、特許文献１〜特許文献３に記載されている。

特表２０１０−５１０８１２号公報 特表２００１−５１２８２４号公報 米国特許第７７１８１３１号明細書

細胞集塊の培養状態を評価するときには、細胞集塊の体積が、重要な判断指標となる。このため、とりわけ近年では、細胞集塊の画像から、当該細胞集塊の体積を推定する技術の開発が進められている。細胞集塊の体積を推定するときには、例えば、画像内における細胞集塊の濃度を高さに換算し、換算後の高さと細胞集塊の面積とに基づいて、当該細胞集塊の体積を算出する。

しかしながら、画像内におけるピクセルの濃度と細胞集塊の高さとの関係は、細胞の種類や培養条件により変動する。したがって、細胞集塊の体積を精度よく求めるためには、観察対象ごとに、ピクセルの濃度と細胞集塊の高さとの関係を、キャリブレーションにより調整することが好ましい。

本発明は、このような事情に鑑みなされたものであり、細胞集塊を含む画像から細胞集塊の体積を推定する処理の精度を向上させるキャリブレーション方法を提供することを目的とする。

上記課題を解決するため、本願の第１発明は、細胞集塊を含む画像から前記細胞集塊の体積を推定する処理の精度を向上させるキャリブレーション方法であって、ａ）少なくとも底部が透光性を有する窪部内に保持された細胞集塊の上側および下側の一方から他方へ向けて光を照射するとともに、前記細胞集塊の他方側に配置された撮像装置で前記光を受光することにより、前記細胞集塊を含む画像を取得する工程と、ｂ）前記工程ａ）により取得された画像内における前記細胞集塊の濃度を測定する工程と、ｃ）前記窪部内に保持された前記細胞集塊の断面情報を取得し、前記断面情報に基づいて前記細胞集塊の上下方向の高さを求める工程と、ｄ）前記工程ｂ）において測定された濃度と、前記工程ｃ）において求められた高さとの関係を示すデータを取得する工程と、を含み、前記工程ｃ）では、１つの前記細胞集塊に対して、複数の前記断面情報を取得し、複数の前記断面情報に基づいて、前記細胞集塊の上下方向の高さを求める。

本願の第２発明は、第１発明のキャリブレーション方法であって、前記工程ｃ）では、前記窪部内に保持された前記細胞集塊の断面情報を、共焦点顕微鏡を用いて光学的に取得する。

本願の第３発明は、第１発明または第２発明のキャリブレーション方法であって、前記工程ｃ）では、前記窪部内に保持された前記細胞集塊を固定化した後、前記細胞集塊を物理的に切断することにより、前記細胞集塊の断面情報を取得する。

本願の第４発明は、第１発明から第３発明までのいずれかのキャリブレーション方法であって、前記工程ａ）より前に、前記窪部内の前記細胞集塊を、免疫染色により標識化する工程をさらに含む。

本願の第５発明は、第１発明から第３発明までのいずれかのキャリブレーション方法であって、前記工程ｃ）より前に、前記窪部内の前記細胞集塊を、免疫染色により標識化する工程をさらに含む。

本願の第６発明は、第１発明から第５発明までのいずれかのキャリブレーション方法であって、前記窪部内に複数の細胞集塊が保持され、前記工程ｂ）では、前記画像内に含まれる複数の前記細胞集塊から選択された１つ以上の細胞集塊の濃度を測定し、前記工程ｃ）では、前記１つ以上の細胞集塊の上下方向の高さを求める。

本願の第１発明〜第６発明によれば、画像内における細胞集塊の濃度と、断面情報に基づいて求められる細胞集塊の高さとの関係を示すデータを取得することにより、濃度を高さに換算する処理の精度を高めることができる。その結果、細胞集塊の体積を精度よく推定することができる。

特に、本願の第２発明によれば、細胞集塊を破壊することなく、細胞集塊の断面情報を取得できる。

特に、本願の第４発明によれば、免疫染色により、細胞集塊の視認性が向上する。これにより、画像内における細胞と他の部位との濃度差が大きくなる。したがって、濃度を高さに換算する処理の精度をより高めることができる。

特に、本願の第５発明によれば、免疫染色により、細胞集塊の視認性が向上する。これにより、断面情報において、細胞の分布を認識し易くなる。したがって、細胞集塊の高さを、より容易に求めることができる。

ウェルプレートの一例を示す斜視図である。 画像取得装置の構成を概念的に示した図である。 体積推定処理の流れを示すフローチャートである。 表示部に表示される窪部画像データの例を示した図である。 表示部に表示される窪部画像データの例を示した図である。 １つのオブジェクトを拡大して示した図である。 相関データの例を示した図である。 キャリブレーション処理の流れを示すフローチャートである。 画像取得装置から共焦点顕微鏡へ、ウェルプレートを移載する様子を概念的に示した図である。 共焦点顕微鏡における観察の様子を示した図である。 細胞集塊を物理的に切断する様子を示した図である。

以下、本発明の好適な実施形態について、図面を参照しつつ説明する。

＜１．画像取得装置の構成＞
図１は、画像取得装置１にセットされるウェルプレート９の一例を示す斜視図である。ウェルプレート９は、複数の窪部９１を有する略板状の試料容器である。ウェルプレート９の材料には、例えば、透明な樹脂が使用される。このため、各窪部９１の少なくとも底部は、上下方向に光を透過する。図１に示すように、複数の窪部９１は、ウェルプレート９の上面に、規則的に配列されている。各窪部９１内には、培養液９２とともに、複数の細胞集塊（スフェロイド）９３が保持される。また、各窪部９１内の培養液９２には、濃度や組成の異なる化合物が、それぞれ添加される。

図２は、本発明の一実施形態に係るキャリブレーション方法が適用される画像取得装置１の構成を、概念的に示した図である。この画像取得装置１は、ウェルプレート９内で培養される細胞集塊９３の画像を取得する装置である。画像取得装置１は、例えば、医薬品の研究開発分野において、医薬品の候補となる化合物を絞り込むスクリーニング工程に、使用される。スクリーニング工程の担当者は、この画像取得装置１を用いて、各ウェルプレート９の画像データを取得する。そして、取得された画像データに基づいて、各窪部９１内における細胞集塊９３の培養状態を比較・分析することにより、培養液９２に添加された化合物の効用を検証する。

図２に示すように、本実施形態の画像取得装置１は、プレート保持部１０、投光部２０、撮像部３０、表示部４０、入力部５０、およびコンピュータ６０を備えている。プレート保持部１０、投光部２０、撮像部３０、表示部４０、および入力部５０は、それぞれ、コンピュータ６０と電気的に接続されている。

プレート保持部１０は、ウェルプレート９を保持する載置台である。ウェルプレート９は、底部が下側となる水平姿勢で、プレート保持部１０にセットされる。投光部２０および撮像部３０は、プレート保持部１０に保持されたウェルプレート９の上側および下側に、それぞれ配置されている。投光部２０は、ウェルプレート９の上側から下方へ向けて、光を照射する。撮像部３０は、例えば、レンズ等の光学系と、ＣＣＤやＣＭＯＳ等の撮像素子とを有するラインセンサまたはエリアセンサにより実現される。

また、画像取得装置１は、投光部２０および撮像部３０を横方向に移動させる駆動機構（図示省略）を有している。駆動機構は、例えば、モータと、モータの駆動力を伝達するボールねじ等の動力伝達機構とで、構成される。ウェルプレート９を撮影するときには、投光部２０からウェルプレート９の一部分へ向けて光を照射しつつ、撮像部３０が、ウェルプレート９の当該一部分を撮影する。そして、駆動機構を動作させることにより、ウェルプレート９に対して投光部２０および撮像部３０を横方向に相対移動させながら、同様の撮影を繰り返す。その結果、ウェルプレート９全体の撮影画像データＤ１が取得される。

なお、投光部２０は、ウェルプレート９内に保持された細胞集塊９３に対して、光を照射するものであればよい。したがって、投光部２０の光源自体は、ウェルプレート９の上方から外れた位置に配置され、ミラー等の光学系を介して、ウェルプレート９に光が照射される構成であってもよい。また、投光部２０がウェルプレート９の下方に配置され、撮像部３０が、ウェルプレート９の上方に配置されていてもよい。

表示部４０は、画像取得装置１の画像処理に関わる種々の情報（後述する窪部画像データＤ２等）を表示するための部位である。表示部４０には、例えば、液晶ディスプレイが使用される。入力部５０は、コンピュータ６０に対して種々のコマンドを入力するための部位である。入力部５０には、例えば、キーボードやマウスが使用される。画像取得装置１のユーザは、表示部４０を確認しながら、入力部５０を操作して、種々のコマンドをコンピュータ６０に入力できる。

なお、表示部４０の機能と、入力部５０の機能との双方が、タッチパネル式のディスプレイなどの単一のデバイスにより、実現されていてもよい。

コンピュータ６０は、画像取得装置１の上記各部を動作制御する制御部としての機能と、取得された画像データに基づいて細胞集塊９３の体積を推定する画像処理部としての機能と、の双方を有する。コンピュータ６０は、ＣＰＵやメモリを有し、予め設定されたコンピュータプログラム６５１、入力信号、および種々のデータに従って、ＣＰＵが動作することにより、上述した駆動機構、投光部２０、および撮像部３０の動作を制御する。これにより、画像取得装置１におけるウェルプレート９の撮影が実行される。

また、図２において概念的に示したように、本実施形態のコンピュータ６０は、画像切り出し部６１、オブジェクト抽出部６２、濃度測定部６３、推定体積算出部６４、および記憶部６５を有している。画像切り出し部６１、オブジェクト抽出部６２、濃度測定部６３、および推定体積算出部６４の各機能は、コンピュータ６０のＣＰＵが、記憶部６５に記憶されたコンピュータプログラム６５１を参照しつつ演算処理を行うことにより、実現される。

記憶部６５は、画像取得装置１において取り扱われる種々のデータを記憶する部位である。記憶部６５は、例えば、ハードディスクドライブやＲＡＭ等の記憶装置により実現される。記憶部６５は、図２のように、コンピュータ６０を構成するハードウエアの一部であってもよく、あるいは、コンピュータ６０に接続された外付けの記憶装置であってもよい。

記憶部６５には、上述したコンピュータプログラム６５１が記憶されている。また、本実施形態の記憶部６５には、後述する体積推定処理の実行時に参照される相関データ６５２が、記憶されている。相関データ６５２は、画像データ内における細胞集塊９３の濃度と、細胞集塊９３の高さとの関係を、書き換え可能なデータとして保持している。

＜２．体積推定処理について＞
図３は、画像取得装置１において、観察対象となる細胞集塊９３の体積を推定する処理の流れを示したフローチャートである。図３の処理は、コンピュータ６０が、入力部５０からの入力信号、コンピュータプログラム６５１、および相関データ６５２を参照しながら、画像切り出し部６１、オブジェクト抽出部６２、濃度測定部６３、および推定体積算出部６４を動作させることにより、実行される。以下、図２および図３を参照しつつ、当該処理の流れについて説明する。

細胞集塊９３の体積を推定するときには、まず、ウェルプレート９を撮影して、撮影画像データＤ１を取得する（ステップＳ１１）。すなわち、投光部２０からウェルプレート９の一部分へ向けて光を照射しつつ、撮像部３０が、当該光を受光する。これにより、ウェルプレート９の当該一部分が撮影される。そして、投光部２０および撮像部３０を横方向に移動させながら、同様の撮影を繰り返す。その結果、ウェルプレート９全体の撮影画像データＤ１が取得される。

撮像部３０において撮影画像データＤ１が取得されると、当該撮影画像データＤ１は、コンピュータ６０内の画像切り出し部６１に入力される。画像切り出し部６１は、撮影画像データＤ１から、窪部９１ごとの画像データ（以下、「窪部画像データＤ２」と称する）を切り出す（ステップＳ１２）。

切り出された各窪部画像データＤ２は、表示部４０に表示される。図４は、表示部４０に表示される窪部画像データＤ２の例を示した図である。図４の例では、１つの窪部画像データＤ２内に、複数の細胞集塊９３の画像が含まれている。ただし、１つの窪部画像データＤ２内に含まれる細胞集塊９３の数は、１つのみであってもよい。投光部２０から照射される光の強度は、細胞集塊９３を通過する際に減衰する。このため、窪部画像データＤ２内における各細胞集塊９３の濃度は、窪部画像データＤ２内の細胞集塊９３の無い他の部分の濃度よりも高い。

次に、オブジェクト抽出部６２が、窪部画像データＤ２から、細胞集塊９３に相当するオブジェクト９３０を抽出する処理を行う（ステップＳ１３）。オブジェクト９３０を抽出する処理は、例えば、窪部画像データＤ２から、予め設定された閾値よりも高い濃度を有するピクセルを、抽出することにより行われる。なお、オブジェクト９３０の抽出に用いられる濃度の閾値は、抽出結果の適否に応じて、変更入力できるようになっていてもよい。

図５は、オブジェクト９３０抽出後に表示部４０に表示される窪部画像データＤ２の例を示した図である。図５の例では、抽出されたオブジェクト９３０の輪郭が、太い実線で強調表示されている。これにより、オブジェクト９３０と他の部位とが、視覚的に容易に区別できるようになっている。

続いて、窪部画像データＤ２内における各オブジェクト９３０の濃度を測定する（ステップＳ１４）。図６は、１つのオブジェクト９３０を拡大して示した図である。図６中に網点で表したように、オブジェクト９３０は、光の透過量に応じた濃度分布を有している。すなわち、細胞集塊９３の高さが低い部分については、光の透過量が多くなるため、濃度が比較的薄くなる。また、細胞集塊９３の高さが高い部分については、光の透過量が少なくなるため、濃度が比較的濃くなる。

ステップＳ１４では、濃度測定部６３が、オブジェクト９３０を構成する各ピクセルの濃度を測定する。これにより、当該オブジェクト９３０の濃度分布を示す濃度データＤ３が得られる。また、濃度測定部６３は、窪部画像データＤ２内に含まれる複数のオブジェクト９３０のそれぞれについて、同様に濃度データＤ３を取得する。

その後、得られた濃度データＤ３に基づいて、各オブジェクト９３０の体積を推定する（ステップＳ１５）。ここでは、まず、推定体積算出部６４が、記憶部６５から相関データ６５２を読み出す。図７は、相関データ６５２の例を示した図である。図７に示すように、相関データ６５２には、複数の濃度と、各濃度に対応する高さとの対応関係が、規定されている。すなわち、図７の左欄に示された濃度と、図７の右欄に示された高さとが、それぞれ対応付けられている。

推定体積算出部６４は、相関データ６５２に応じた換算式を用いて、濃度データＤ３に含まれる複数の濃度を、高さに換算する。これにより、各細胞集塊９３の高さ分布の情報が得られる。そして、オブジェクト９３０を構成する各ピクセルの面積と高さとを積算することにより、ピクセル毎の体積を求め、それらを加算することにより、当該オブジェクト９３０から推定される細胞集塊９３の体積を求める。

なお、図７に例示した相関データ６５２は、濃度と高さとが１対１に対応したテーブルデータの形式であったが、相関データ６５２は、濃度を高さに換算するための情報であれば、他の形式であってもよい。

＜３．キャリブレーション処理について＞
続いて、上述した体積推定処理の精度を向上させるためのキャリブレーション処理について、説明する。図８は、キャリブレーション処理の流れを示すフローチャートである。

図８に示すように、キャリブレーション処理を行うときには、まず、画像取得装置１において、撮影画像データＤ１の取得（ステップＳ２１）、窪部画像データＤ２の切り出し（ステップＳ２２）、およびオブジェクト９３０の抽出（ステップＳ２３）の各処理を行う。このステップＳ２１〜Ｓ２３の処理は、上述したステップＳ１１〜Ｓ１３の処理と同様であるため、重複説明を省略する。

次に、窪部画像データＤ２に含まれる複数のオブジェクト９３０から、キャリブレーションに用いる１つ以上のオブジェクト９３０を選択する（ステップＳ２４）。オブジェクト９３０の選択は、画像取得装置１のユーザが、表示部４０に表示された窪部画像データＤ２を確認しながら、入力部５０を操作することにより行ってもよく、あるいは、コンピュータ６０が、コンピュータプログラム６５１に基づいて自動的に行ってもよい。

オブジェクト９３０が選択されると、続いて、当該オブジェクト９３０の濃度が測定される（ステップＳ２５）。ここでは、濃度測定部６３が、オブジェクト９３０を構成する各ピクセルの濃度を測定する。これにより、当該オブジェクト９３０の濃度分布を示す濃度データＤ３が得られる。また、選択されたオブジェクト９３０が複数ある場合は、濃度測定部６３は、複数のオブジェクト９３０のそれぞれについて、同様に濃度データＤ３を取得する。

次に、画像取得装置１のユーザは、プレート保持部１０からウェルプレート９を取り出し、取り出されたウェルプレート９を、共焦点顕微鏡２にセットする。すなわち、図９に示すように、画像取得装置１から共焦点顕微鏡２へ、ウェルプレート９を移載する（ステップＳ２６）。そして、上述したステップＳ２４において選択されたオブジェクト９３０に相当する細胞集塊９３を、共焦点顕微鏡２で観察する。

共焦点顕微鏡２は、ピンホールを有する光学系を用いることによって、焦点位置から外れた位置で反射した光を除去し、焦点位置において反射した光７０のみを検出することで、焦点位置の画像を鮮明に観察することができる顕微鏡である。また、共焦点顕微鏡２では、光路上のレンズの位置をずらすことで、焦点位置を変化させることができる。このため、図１０に示すように、細胞集塊９３の複数の断面９３１について、細胞の分布を観察することができる。すなわち、１つの細胞集塊９３に対して、複数の断面情報を光学的に取得することができる（ステップＳ２７）。

複数の断面情報が得られると、それらの断面情報から、細胞集塊９３全体の立体的な細胞の分布を、精度よく知ることができる。したがって、細胞集塊９３の各位置における上下方向の高さを、精度よく求めることができる。その結果、図９中に概念的に示したように、細胞集塊９３の高さ分布を示す高さデータＤ４を取得することができる（ステップＳ２８）。

高さデータＤ４を取得した後、画像取得装置１のユーザは、当該高さデータＤ４を、画像取得装置１のコンピュータ６０に入力する。高さデータＤ４は、ユーザが入力部５０を操作することにより入力されてもよく、ネットワークを介して共焦点顕微鏡２から画像取得装置１へ転送されてもよい。

これにより、画像取得装置１は、濃度データＤ３と、当該濃度データＤ３に対応する高さデータＤ４とを、取得したこととなる。画像取得装置１のコンピュータ６０は、記憶部６５に記憶された相関データ６５２に、濃度データＤ３および高さデータＤ４の情報を追加する（ステップＳ２９）。これにより、相関データ６５２に、新たな濃度と高さとの関係を示す情報が追加される。その結果、窪部画像データ内の細胞集塊９３の濃度を細胞集塊８３の高さに換算するための情報である相関データ６５２が、較正される。

このように、本実施形態のキャリブレーション処理によれば、窪部画像データＤ２内における細胞集塊９３の濃度と、断面情報に基づいて求められる細胞集塊９３の高さとの関係を示す情報を取得する。そして、当該情報を相関データ６５２に追加する。これにより、濃度を高さに換算する処理の精度を高めることができる。その結果、細胞集塊９３の体積を精度よく推定することができる。

特に、観察対象となる細胞集塊９３の種類や培養条件ごとに、キャリブレーション処理を行って、相関データ６５２を更新すれば、より精度の高い推定を行うことができる。

＜４．変形例＞
以上、本発明の一実施形態について説明したが、本発明は、上記の実施形態に限定されるものではない。

上記の実施形態では、共焦点顕微鏡２を用いて細胞集塊９３の断面情報を光学的に取得した。このようにすれば、細胞集塊９３を破壊することなく、細胞集塊９３の断面情報を取得できる。しかしながら、他の方法により、細胞集塊９３の断面情報を取得してもよい。例えば、窪部９１内に保持された細胞集塊９３を、凍結またはパラフィン包埋した後、図１１のように、当該細胞集塊９３を、物理的に切断することによって、複数の薄片９３２を形成してもよい。細胞集塊９３の切断は、例えば、ミクロトームにより行えばよい。そして、各薄片９３２を顕微鏡で観察することによって、細胞集塊９３の断面情報を取得してもよい。

また、画像取得装置１における撮影前または断面情報の取得前に、窪部９１内の細胞集塊９３を、蛍光色素または酵素を用いた免疫染色により標識化してもよい。例えば、細胞内の特定の分子と結合する蛍光タンパク質を細胞内に導入することによって、観察対象となる細胞集塊９３を蛍光標識してもよい。また、細胞内の特定のタンパク質と結合する酵素を用いて、観察対象となる細胞集塊９３に対して、酵素抗体法に基づく免疫染色を施してもよい。

免疫染色を行えば、細胞集塊９３の視認性が向上する。特に、画像取得装置１における撮影より前に、免疫染色を行えば、窪部画像データＤ２における細胞集塊９３と他の部位との濃度差が大きくなる。したがって、濃度を高さに換算する処理の精度をより高めることができる。また、断面情報を取得する前に、免疫染色を行えば、断面における、細胞の分布を認識し易くなる。したがって、細胞集塊の高さを、より容易に求めることができる。

また、上記実施形態のキャリブレーション処理では、画像取得装置１で濃度データＤ３を取得した後に、共焦点顕微鏡２で高さデータＤ４を取得していたが、これとは逆に、共焦点顕微鏡２で高さデータＤ４を取得した後に、画像取得装置１で濃度データＤ３を取得してもよい。すなわち、まず、図８のステップＳ２７〜Ｓ２８を行い、次に、共焦点顕微鏡２から画像取得装置１へウェルプレート９を移載し、その後、ステップＳ２１〜Ｓ２５を行い、最後に、ステップＳ２９を行ってもよい。

また、ウェルプレート９に含まれる窪部９１の数は、図１の例と相違していてもよい。また、各窪部９１の形状は、図１のように上面視において円形であってもよく、矩形等の他の形状であってもよい。

また、上記の実施形態や変形例に登場した各要素を、矛盾が生じない範囲で、適宜に組み合わせてもよい。

１ 画像取得装置
２ 共焦点顕微鏡
９ ウェルプレート
１０ プレート保持部
２０ 投光部
３０ 撮像部
４０ 表示部
５０ 入力部
６０ コンピュータ
６１ 画像切り出し部
６２ オブジェクト抽出部
６３ 濃度測定部
６４ 推定体積算出部
６５ 記憶部
９１ 窪部
９２ 培養液
９３ 細胞集塊
６５１ コンピュータプログラム
６５２ 相関データ
９３０ オブジェクト
９３１ 断面
９３２ 薄片
Ｄ１ 撮影画像データ
Ｄ２ 窪部画像データ
Ｄ３ 濃度データ
Ｄ４ 高さデータ

Claims (6)

1. 細胞集塊を含む画像から前記細胞集塊の体積を推定する処理の精度を向上させるキャリブレーション方法であって、
   ａ）少なくとも底部が透光性を有する窪部内に保持された細胞集塊の上側および下側の一方から他方へ向けて光を照射するとともに、前記細胞集塊の他方側に配置された撮像装置で前記光を受光することにより、前記細胞集塊を含む画像を取得する工程と、
   ｂ）前記工程ａ）により取得された画像内における前記細胞集塊の濃度を測定する工程と、
   ｃ）前記窪部内に保持された前記細胞集塊の断面情報を取得し、前記断面情報に基づいて前記細胞集塊の上下方向の高さを求める工程と、
   ｄ）前記工程ｂ）において測定された濃度と、前記工程ｃ）において求められた高さとの関係を示すデータを取得する工程と、
   を含み、
   前記工程ｃ）では、１つの前記細胞集塊に対して、複数の前記断面情報を取得し、複数の前記断面情報に基づいて、前記細胞集塊の上下方向の高さを求めるキャリブレーション方法。
   
2. 請求項１に記載のキャリブレーション方法であって、
   前記工程ｃ）では、前記窪部内に保持された前記細胞集塊の断面情報を、共焦点顕微鏡を用いて光学的に取得するキャリブレーション方法。
3. 請求項１または請求項２に記載のキャリブレーション方法であって、
   前記工程ｃ）では、前記窪部内に保持された前記細胞集塊を固定化した後、前記細胞集塊を物理的に切断することにより、前記細胞集塊の断面情報を取得するキャリブレーション方法。
4. 請求項１から請求項３までのいずれかに記載のキャリブレーション方法であって、
   前記工程ａ）より前に、前記窪部内の前記細胞集塊を、免疫染色により標識化する工程をさらに含むキャリブレーション方法。
5. 請求項１から請求項３までのいずれかに記載のキャリブレーション方法であって、
   前記工程ｃ）より前に、前記窪部内の前記細胞集塊を、免疫染色により標識化する工程をさらに含むキャリブレーション方法。
6. 請求項１から請求項５までのいずれかに記載のキャリブレーション方法であって、
   前記窪部内に複数の細胞集塊が保持され、
   前記工程ｂ）では、前記画像内に含まれる複数の前記細胞集塊から選択された１つ以上の細胞集塊の濃度を測定し、
   前記工程ｃ）では、前記１つ以上の細胞集塊の上下方向の高さを求めるキャリブレーション方法。

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