JP5751631B2 - Ｔｏｌｌ様受容体３アンタゴニスト - Google Patents

Description

本出願は、その全容をいずれも本出願に参照により組み入れる、２００８年１０月３１日出願の米国仮特許出願第６１／１０９９７４号、及び２００９年３月２０日出願の米国仮特許出願第６１／１６１８６０号、及び２００９年３月３１日出願の米国仮特許出願第６１／１６５１００号、及び２００９年４月２９日出願の米国仮特許出願第６１／１７３６８６号の恩典を主張するものである。

（発明の分野）
本発明は、ＴＯＬＬ様受容体３（ＴＬＲ３）抗体アンタゴニスト、ＴＬＲ３抗体アンタゴニスト又はそのフラグメントをコードしたポリヌクレオチド、並びに上記を製造及び使用する方法に関する。

ＴＯＬＬ様受容体（ＴＬＲ）は、細菌、ウイルス、寄生虫、及び場合によりホスト由来のリガンドに応答して自然免疫反応の活性化を調節し、シグナル伝達カスケードを開始させることによって獲得免疫の発動に影響を及ぼす（Ｌａｎｃａｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ．５６３：９４５〜９５５，２００５）。細胞膜に局在するＴＬＲであるＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ４及びＴＬＲ６は、細菌及び真菌のタンパク質または脂質成分を含むリガンドを認識する。主として細胞内に存在するＴＬＲであるＴＬＲ３、ＴＬＲ７及びＴＬＲ９は、それぞれ２本鎖ＲＮＡ、１本鎖ＲＮＡ及び非メチル化ＣｐＧ ＤＮＡに対して応答する。ＴＬＲシグナル伝達の調節不全は様々な問題を引き起こすため、この系に対して治療法が開発されている（Ｈｏｆｆｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．４：８７９〜８８０，２００５；Ｒｅｚａｅｉ，Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ．６：８６３〜８６９，２００６；Ｗｉｃｋｅｌｇｒｅｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１２：１８４〜１８７，２００６）。例えば、ＴＬＲ４、並びにＴＬＲ７及び９のアンタゴニストがそれぞれ重度の敗血症及びループスに対して臨床開発中である（Ｋａｎｚｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１３：５５２〜５５９，２００７）。

ＴＬＲ３シグナル伝達は、炎症又はウイルス感染時に壊死細胞から放出される２本鎖ＤＮＡ、ｍＲＮＡ又はＲＮＡによって活性化される。ＴＬＲ３の活性化によってインターフェロン及び炎症性サイトカインの分泌が誘導され、特定の微生物感染において保護作用のある免疫細胞の活性化及び動員が誘発される。例えば、ドミナントネガティブなＴＬＲ３対立遺伝子では、小児期におけるＨＳＶ−１による一次感染時に単純ヘルペス脳炎を発症しやすくなることが示されている（Ｚｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１７：１５２２〜１５２７ ２００７）。．マウスではＴＬＲ３の欠損は、コクサッキーウイルスによるチャレンジ試験における生存率の低下との関連が示されている（Ｒｉｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ４：ｅ４１２７，２００９）。また一方、制御不能又は調節不全のＴＬＲ３シグナル伝達が、ウェストナイル、フレボウイルス、ワクシニア、及びＡ型インフルエンザなどの特定のウイルス感染モデルにおいて罹患率及び死亡率に寄与することが示されている（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１０：１３６６〜１３７３，２００４；Ｇｏｗｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７７：６３０１〜６３０７，２００６；Ｈｕｔｃｈｅｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８０：４８３〜４９１，２００８；Ｌｅ Ｇｏｆｆｉｃ ｅｔ ａｌ．，ＰｌｏＳ Ｐａｔｈｏｇ．２：Ｅ５３，２００６）。

ＴＬＲ３は、広範な炎症性疾患、免疫介在性疾患、及び自己免疫疾患の発症機序を発動させることが更に示されており、こうした疾患には、例えば敗血症性ショック（Ｃａｖａｓｓａｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２０５：２６０９〜２６２１，２００８）、急性肺傷害（Ｍｕｒｒａｙ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ Ｍｅｄ．１７８：１２２７〜１２３７，２００８）、リウマチ様関節炎（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．１２４：９〜１７，２００９；Ｂｒｅｎｔａｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ａｒｔｈ．Ｒｈｅｕｍ．５２：２６５６〜２６６５，２００５）、喘息（Ｓｕｇｉｕｒａ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐ．Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４０：６５４〜６６２，２００９；Ｍｏｒｉｓｈｉｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ａｒｃｈ．Ａｌｌｅｒｇｙ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４５：１６３〜１７４，２００８；Ｓｔｏｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｓｐｉｒ．Ｒｅｓ．１０：４３，２００９）、クローン病及び潰瘍性大腸炎などの炎症性腸疾患（Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７８：４５４８〜４５５６，２００７；Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）１０４：７５１２〜７５１５，２００７）、自己免疫性肝疾患（Ｌａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１６：２４５６〜２４６３，２００６）、並びにＩ型糖尿病（Ｄｏｇｕｓａｎ ｅｔ ａｌ．Ｄｉａｂｅｔｅｓ ５７：１２３６〜１２４５，２００８；Ｌｉｅｎ ａｎｄ Ｚｉｐｒｉｓ，Ｃｕｒｒ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．９：５２〜６８，２００９）が含まれる。更に、ＴＬＲ３発現の臓器特異的な増大が、肝組織の原発性胆汁性肝硬変（Ｔａｋｉｉ ｅｔ ａｌ．，Ｌａｂ Ｉｎｖｅｓｔ．８５：９０８〜９２０，２００５）、リウマチ様関節炎の関節（Ｏｓｐｅｌｔ ｅｔ ａｌ．，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ．５８：３６８４〜３６９２，２００８）、及びアレルギー性鼻炎患者の鼻粘膜（Ｆｒａｎｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｓｐｉｒ．Ｒｅｓ．６：１００，２００５）などの調節不全の局所炎症反応によって発動される多くの病的状態と相関していることが示されている。

壊死状態では、内因性のｍＲＮＡを含む細胞内容物が放出されることによってサイトカイン、ケモカイン、及び局所炎症を誘導し、死細胞の残留物の除去を促進し、損傷を修復する他の因子の分泌が誘発される。壊死はしばしば炎症反応を持続させ、慢性又は過剰な炎症に寄与する（Ｂｅｒｇｓｂａｋｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ ７：９９〜１０９，２００９）。壊死部位におけるＴＬＲ３の活性化は、これらの異常な炎症反応に寄与し、放出されたＴＬＲ３リガンドを介して更なる炎症性のポジティブなフィードバックループを生じうる。したがって、ＴＬＲ３に対する拮抗性は慢性及び過剰な炎症及び／又は壊死を含む様々な疾患において有用でありうる。

ＴＬＲ３の活性の下方調節も、腎細胞癌及び頭頸部扁平上皮癌を含む腫瘍学的適応症に対する新たな治療法を代表しうるものである（Ｍｏｒｉｋａｗａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１３：５７０３〜５７０９，２００７；Ｐｒｉｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．２１：２０９〜２１５，２００８）。更に、活性が低いタンパク質をコードするＴＬＲ３^L423F対立遺伝子は、進行した「萎縮型」加齢黄斑変性症に対する保護作用との関連が示されており（Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３５９：１４５６〜１４６３，２００８）、ＴＬＲ３アンタゴニストがこの疾患に有効である可能性を示唆するものである。

炎症状態にともなう病理及び感染症にともなう病理などの他の病理が健康及び経済に及ぼす影響は多大なものである。しかしながら、多くの医学領域における進歩にも関わらず、これらの状態の多くでは、治療上の選択肢及び治療法は比較的少ない。

したがって、ＴＬＲ３に関連する状態を治療するためにＴＬＲ３活性を抑制することが求められている。

本発明の一態様は、配列番号２の残基Ｋ４６７、Ｒ４８８又はＲ４８９からなる群から選択される少なくとも１つのＴＬＲ３アミノ酸残基に結合する単離された抗体又はその抗原結合フラグメントである。

本発明の一態様は、配列番号２の残基Ｄ１１６又はＫ１４５からなる群から選択される少なくとも１つのＴＬＲ３アミノ酸残基に結合する単離された抗体又はその抗原結合フラグメントである。

本発明の別の態様は、ＴＬＲ３に対する反応性を有する単離された抗体であって、以下の性質の少なくとも１つを有する抗体である。すなわち、
ａ．インビトロのポリ（Ｉ：Ｃ）ＮＦ−ｋＢレポーター遺伝子アッセイにおいてヒトＴＬＲ３の生物学的活性を１μｇ／ｍｌ未満で５０％よりも大きく低減させるか、
ｂ．１００ｎｇ／ｍｌ未満のポリ（Ｉ：Ｃ）で刺激したＢＥＡＳ−２Ｂ細胞からのＩＬ−６又はＣＸＣＬ１０／ＩＰ−１０の産生を１０μｇ／ｍｌ未満で６０％よりも大きく阻害するか、
ｃ．１００ｎｇ／ｍｌ未満のポリ（Ｉ：Ｃ）で刺激したＢＥＡＳ−２Ｂ細胞からのＩＬ−６又はＣＸＣＬ１０／ＩＰ−１０の産生を０．４μｇ／ｍｌ未満で５０％よりも大きく阻害するか、
ｄ．６２．５ｎｇ／ｍｌのポリ（Ｉ：Ｃ）で刺激したＮＨＢＥ細胞からのＩＬ−６の産生を５μｇ／ｍｌ未満で５０％よりも大きく阻害するか、
ｅ．６２．５ｎｇ／ｍｌのポリ（Ｉ：Ｃ）で刺激したＮＨＢＥ細胞からのＩＬ−６の産生を１μｇ／ｍｌ未満で５０％よりも大きく阻害するか、
ｆ．ポリ（Ｉ：Ｃ）により誘導したＩＦＮ−γ、ＩＬ−６又はＩＬ−１２のＰＢＭＣ細胞による産生を１μｇ／ｍｌ未満で２０％よりも大きく阻害するか、
ｇ．インビトロでのＮＦ−κＢレポーター遺伝子アッセイにおいてカニクイザルのＴＬＲ３の生物学的活性をＩＣ５０＜１０μｇ／ｍｌとなるように阻害するか、又は、
ｈ．インビトロでのＩＳＲＥレポーター遺伝子アッセイにおいてカニクイザルのＴＬＲ３の生物学的活性をＩＣ５０＜５μｇ／ｍｌとなるように阻害する。

本発明の別の態様は、特定の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）１、２及び３のアミノ酸配列、特定の軽鎖ＣＤＲ１、２及び３のアミノ酸配列、特定の重鎖可変領域（ＶＨ）のアミノ酸配列、又は特定の軽鎖可変領域（ＶＬ）のアミノ酸配列を有するモノクローナル抗体とＴＬＲ３との結合について競合する、ＴＬＲ３に対する反応性を有する単離された抗体である。

本発明の別の態様は、重鎖及び軽鎖可変領域を有する、ＴＬＲ３に対する反応性を有する単離された抗体であって、特定の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）１、２及び３、並びに特定の軽鎖ＣＤＲ１、２及び３のアミノ酸配列を有する抗体である。

本発明の別の態様は、重鎖及び軽鎖可変領域を有する、ＴＬＲ３に対する反応性を有する単離された抗体であって、特定の重鎖可変領域（ＶＨ）のアミノ酸配列、及び特定の軽鎖可変領域（ＶＬ）のアミノ酸配列を有する抗体である。

本発明の別の態様は、重鎖及び軽鎖可変領域を有する、ＴＬＲ３に対する反応性を有する単離された抗体であって、特定の重鎖のアミノ酸配列、及び特定の軽鎖のアミノ酸配列を有する抗体である。

本発明の別の態様は、配列番号６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１５９、１９８、２００、２０２、１６４、２１２、２１３、２１４、２１５又は２１６に示されるアミノ酸配列を有する、単離された抗体重鎖である。

本発明の別の態様は、配列番号５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、１２２、１２３、１９７、１９９、２０１、１６３、２０９、２１０又は２１１に示されるアミノ酸配列を有する、単離された抗体軽鎖である。

本発明の別の態様は、配列番号１０２、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１６０、２０４、２０６、２０８、２２０、１６６又は１６８に示されるアミノ酸配列を有する、単離された抗体重鎖である。

本発明の別の態様は、配列番号１５５、１５６、１５７、１５８、２０３、２０５、２０７、１６５又は１６７に示されるアミノ酸配列を有する、単離された抗体軽鎖である。

本発明の別の態様は、配列番号６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１５９、１９８、２００、２０２、１６４、２１２、２１３、２１４、２１５又は２１６に示されるアミノ酸配列を有する抗体重鎖をコードした、単離されたポリペプチドである。

本発明の別の態様は、配列番号５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、１２２、１２３、１９７、１９９、２０１、１６３、２０９、２１０又は２１１に示されるアミノ酸配列を有する抗体軽鎖をコードした、単離されたポリペプチドである。

本発明の別の態様は、配列番号１０２、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１６０、２０４、２０６、２０８、２２０、１６６又は１６８に示されるアミノ酸配列を有する抗体重鎖をコードした、単離されたポリペプチドである。

本発明の別の態様は、配列番号１５５、１５６、１５７、１５８、２０３、２０５、２０７、１６５又は１６７に示されるアミノ酸配列を有する抗体軽鎖をコードした、単離されたポリペプチドである。

本発明の別の態様は、本発明の単離された抗体及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物である。

本発明の別の態様は、少なくとも１つの本発明のポリヌクレオチドを含むベクターである。

本発明の別の態様は、本発明のベクターを有するホスト細胞である。

本発明の別の態様は、本発明のホスト細胞を培養することと、前記ホスト細胞によって産生された抗体を回収することとを含む、ＴＬＲ３に対する反応性を有する抗体の製造方法である。

本発明の別の態様は、本発明の単離された抗体の治療上の有効量を、炎症性疾患の治療又は予防を必要とする患者に、炎症性疾患を治療又は予防するうえで充分な時間にわたって投与することを含む、炎症性疾患の治療又は予防方法である。

本発明の別の態様は、本発明の単離された抗体の治療上の有効量を、全身性炎症性疾患の治療又は予防を必要とする患者に、全身性炎症性疾患を治療又は予防するうえで充分な時間にわたって投与することを含む、全身性炎症性疾患の治療又は予防方法である。

本発明の別の態様は、本発明の単離された抗体の治療上の有効量を、ＩＩ型糖尿病の治療を必要とする患者にＩＩ型糖尿病を治療するうえで充分な時間にわたって投与することを含む、ＩＩ型糖尿病の治療方法である。

本発明の別の態様は、本発明の単離された抗体の治療上の有効量を、高血糖の治療を必要とする患者に高血糖を治療するうえで充分な時間にわたって投与することを含む、高血糖の治療方法である。

本発明の別の態様は、本発明の単離された抗体の治療上の有効量を、高インスリン血症の治療を必要とする患者にインスリン抵抗性を治療するうえで充分な時間にわたって投与することを含む、高インスリン血症の治療方法である。

本発明の別の態様は、本発明の単離された抗体の治療上の有効量を、ウイルス感染の治療又は予防を必要とする患者に、ウイルス感染を治療又は予防するうえで充分な時間にわたって投与することを含む、ウイルス感染の治療又は予防方法である。

ＮＦ−κＢレポーター遺伝子アッセイにおける抗ヒトＴＬＲ３（ｈｕＴＬＲ３）ｍＡｂの作用を示す。 ＢＥＡＳ−２Ｂアッセイにおける抗ｈｕＴＬＲ３ ｍＡｂの作用（阻害率（％））を示す。 ＢＥＡＳ−２Ｂアッセイにおける抗ｈｕＴＬＲ３ ｍＡｂの作用（阻害率（％））を示す。 ＮＨＢＥアッセイにおける抗ｈｕＴＬＲ３ ｍＡｂの作用を示す。 ＮＨＢＥアッセイにおける抗ｈｕＴＬＲ３ ｍＡｂの作用を示す。 ＰＢＭＣアッセイにおける抗ｈｕＴＬＲ３ ｍＡｂの作用を示す。 ＨＡＳＭアッセイにおける抗ｈｕＴＬＲ３ ｍＡｂの作用を示す。 ＨＡＳＭアッセイにおける抗ｈｕＴＬＲ３ ｍＡｂの作用を示す。 ＴＬＲ３突然変異体に対する抗ｈｕＴＬＲ３ ｍＡｂの結合を示す。 ＴＬＲ３突然変異体に対する抗ｈｕＴＬＲ３ ｍＡｂの結合を示す。 ＴＬＲ３突然変異体に対する抗ｈｕＴＬＲ３ ｍＡｂの結合を示す。 ヒトＴＬＲ３のＥＣＤ上に重ね合わせたｍＡｂ １５ＥＶＱ（黒）及びＣ１０６８ ｍＡｂ（灰色）のエピトープ（上の画像）、並びにｍＡｂ １２ＱＶＱ／ＱＳＶ（黒、下の画像）のエピトープを示す。 ｍＡｂ １５ＥＶＱと複合体を形成させたＴＬＲ３ ＥＣＤタンパク質の局所的Ｈ／Ｄ交換撹乱マップを示す。 Ａ）ＮＦ−κＢ及びＢ）ＩＳＲＥレポーター遺伝子アッセイにおけるラット／マウス抗マウスＴＬＲ３ ｍＡｂ ｍＡｂ ５４２９（代理抗体）の作用を示す。 Ａ）ＮＦ−κＢ及びＢ）ＩＳＲＥレポーター遺伝子アッセイにおけるラット／マウス抗マウスＴＬＲ３ ｍＡｂ ｍＡｂ ５４２９（代理抗体）の作用を示す。 ＭＥＦ ＣＸＣＬ１０／ＩＰ−１０アッセイにおける代理ｍＡｂ（ｍＡｂ ５４２９、ｍＡｂｃ １８１１）の作用を示す。 ＴＬＲ３に対する代理ｍＡｂの結合の特異性を示す。上側のパネル：アイソタイプコントロール；下側のパネル：ｍＡｂ ｃ１８１１。 ＡＨＲモデルにおけるｐｅｎＨレベルに対する代理ｍＡｂの効果を示す。 ＡＨＲモデルにおけるＢＡＬ液中の全好中球数に対する代理ｍＡｂの効果を示す。 ＡＨＲモデルにおけるＢＡＬ液中のＣＸＣＬ１０／ＩＰ−１０レベルに対する代理ｍＡｂの効果を示す。 ＤＳＳモデルにおける組織病理学スコアに対する代理ｍＡｂの効果を示す。 Ｔ細胞移植モデルにおける、組織病理学スコアに対する代理ｍＡｂの効果を示す。 Ｔ細胞移植モデルにおける、好中球流入に対する代理ｍＡｂの効果を示す。 ＣＩＡモデルにおける臨床スコアに対する代理ｍＡｂの効果を示す。 ＣＩＡモデルにおける臨床ＡＵＣスコアに対する代理ｍＡｂの効果を示す。 インフルエンザＡ／ＰＲ／８／３４の鼻腔内投与後のＣ５７ＢＬ／６マウスの生存率に対する代理ｍＡｂの効果を示す。 インフルエンザＡ／ＰＲ／８／３４の投与後の臨床スコアに対する代理ｍＡｂの効果を示す。 インフルエンザＡ／ＰＲ／８／３４の投与後１４日間における体重に対する代理ｍＡｂの効果を示す。 グルコースチャレンジ後の野生型ＤＩＯにおける血中グルコースレベルに対する代理ｍＡｂの効果を示す。 グルコースチャレンジ後のＴＬＲ３ノックアウトＤＩＯ動物における血中グルコースレベルに対する代理ｍＡｂの効果を示す。 野生型ＤＩＯ動物のインスリンレベルに対する代理ｍＡｂの効果を示す。 ＮＨＢＥ細胞における、（Ａ）ＮＴＨｉ、及び（Ｂ）ライノウイルス誘導ＣＸＣＬ１０／ＩＰ−１０及びＣＣＬ５／ＲＡＮＴＥＳレベルに対するｍＡｂ １５ＥＶＱの効果を示す。 ＨＵＶＥＣ細胞における、ｓＩＣＡＭ−１レベルに対するｍＡｂ １５ＥＶＱの効果を示す。 ＨＵＶＥＣ細胞における、生存率に対するｍＡｂ １５ＥＶＱの効果を示す。

本明細書に引用する特許及び特許出願を含むがそれらに限定されないすべての刊行物は、あたかもその全体が記載されているのと同様に本願に参照によって組み入れるものである。

本明細書で用いる「アンタゴニスト」なる用語は、何らかの機構によって、受容体又は細胞内メディエーターなどの別の分子の作用を部分的又は完全に阻害する分子のことを意味する。

本明細書で用いる「ＴＬＲ３抗体アンタゴニスト」又は「ＴＬＲ３に対する反応性を有する」抗体とは、ＴＬＲ３の生物学的活性又はＴＬＲ４受容体の活性化を直接的又は間接的に実質上相殺、低減、又は阻害する能力を有する抗体のことを言う。例えば、ＴＬＲ３に対する反応性を有する抗体は、ＴＬＲ３に直接結合してＴＬＲ３の活性を中和する、すなわちＴＬＲ３のシグナル伝達を遮断することによって、サイトカイン及びケモカインの放出、又はＮＦ−κＢの活性化を低減させることができる。

本明細書で用いる「抗体」なる用語は広義に用いられ、ポリクローナル抗体、マウス、ヒト、ヒト適合化、ヒト化及びキメラモノクローナル抗体を含むモノクローナル抗体、並びに抗体フラグメントを含む、免疫グロブリン又は抗体分子を含む。

一般に抗体とは、特定の抗原に対する結合特異性を示すタンパク質又はペプチド鎖である。完全な抗体とは、２個の同じ軽鎖と２個の同じ重鎖とからなるヘテロ４量体の糖タンパク質である。通常、それぞれの軽鎖は１個の共有ジスルフィド結合によって重鎖と結合しているが、ジスルフィド結合の数は免疫グロブリンのアイソタイプが異なる重鎖の間で異なる。それぞれの重鎖及び軽鎖はまた、規則的な間隔をおいた鎖内ジスルフィド架橋も有する。それぞれの重鎖は可変領域（ＶＨ）を一端に有し、これに多数の定常領域が続く。それぞれの軽鎖は一端に可変領域（ＶＬ）を有し、もう一方の端に定常領域を有する。軽鎖の定常領域は重鎖の第１の定常領域と整列し、軽鎖の可変領域は重鎖の可変領域と整列している。あらゆる脊椎動物種の抗体の軽鎖は、定常領域のアミノ酸配列に基づいてカッパ（κ）及びラムダ（λ）の２つの明確に異なるタイプのうちの１つに分類することができる。

免疫グロブリンは、重鎖の定常領域のアミノ酸配列に応じて、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭの５つの大きなクラスに分類することができる。ＩｇＡ及びＩｇＧは、ＩｇＡ₁、ＩｇＡ₂、ＩｇＧ₁、ＩｇＧ₂、ＩｇＧ₃、ＩｇＧ₄というアイソタイプに更に分類される。

「抗体フラグメント」なる用語は、完全な抗体の部分、通常は完全な抗体の抗原結合領域又は可変領域を意味する。抗体フラグメントの例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）₂及びＦｖフラグメント、二重特異性抗体、単鎖抗体分子、並びに少なくとも２個の完全な抗体から形成された多重特異性抗体が挙げられる。

免疫グロブリンの軽鎖又は重鎖の可変領域は、３つの「抗体結合部位」を挟んだ「フレームワーク」領域からなっている。抗原結合部位は、以下のような様々な用語を用いて定義される。すなわち、（ｉ）相補性決定領域（ＣＤＲ）という用語は、配列の変異に基づいたものである（Ｗｕ ａｎｄ Ｋａｂａｔ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１３２：２１１〜２５０，１９７０）。一般に、抗原結合部位はＶＨ内に３つ（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３）及びＶＬ内に３つ（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３）の６つのＣＤＲを有している（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．，１９９１）。（ｉｉ）［超可変領域」、「ＨＶＲ」又は「ＨＶ」という用語は、クロチア（Chothia）及びレスク（Lesk）（Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１〜９１７，１９８７）により定義されるような構造の変化が特に大きい抗体の可変領域の特定の領域を指す。一般に抗原結合部位は、ＶＨ内に３つ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）及びＶＬ内に３つ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）の６つの超可変領域を有している。クロチア（Chothia）及びレスク（Lesk）は構造的に保存されたＨＶを「カノニカル（canonical）構造」と呼んでいる。（ｉｉｉ）ルフランク（Ｌｅｆｒａｎｃ ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖ．Ｃｏｍｐａｒａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２７：５５〜７７，２００３）によって提唱される「ＩＭＧＴ−ＣＤＲ」は、免疫グロブリンからのＶ領域とＴ細胞受容体との比較に基づいたものである。Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ（ＩＭＧＴ）データベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ＿ｉｍｇｔ＿ｏｒｇ）は、これらの領域の標準化された番号及び定義を提供している。各ＣＤＲ、ＨＶ、及びＩＭＧＴの表記間の対応についてはＬｅｆｒａｎｃ ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖ．Ｃｏｍｐａｒａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２７：５５〜７７，２００３に述べられている。（ｉｖ）抗原結合部位は、アルマグロ（Ａｌｍａｇｒｏ，Ｍｏｌ．Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．１７：１３２〜１４３，２００４）による特異性決定残基の慣用法（Specificity Determining Residue Usage（ＳＤＲＵ））に基づいて表記することもできるが、この場合の抗原決定残基（ＳＤＲ）とは抗原との接触に直接関与する免疫グロブリンのアミノ酸残基のことを指す。アルマグロ（Almagro）により定義されるＳＤＲＵは、抗原抗体複合体の結晶構造の分析によって定義される、異なるタイプの抗原のＳＤＲの数及び分布の正確な目安である。

本明細書で用いる「複合配列」なる用語は、カバット（Kabat）、クロチア（Chothia）又はＩＭＧＴによって個別に表記されるすべてのアミノ酸残基又は他の任意の好適な抗原結合領域の表記を含むものとして定義される抗原結合部位のことを意味する。

「フレームワーク」又は「フレームワーク配列」とは、可変領域の、抗原結合部位として定義される配列以外の残りの配列のことである。抗原結合部位は上記に述べたような様々な用語によって定義されうるため、フレームワークの正確なアミノ酸配列は抗原結合部位がどのように定義されるかによって決まる。

本明細書で用いる「抗原」なる用語は、直接的又は間接的に抗体を生成する能力を有するあらゆる分子を意味する。「抗原」の定義には、タンパク質をコードした核酸も含まれる。

本明細書で用いる「ホモログ」なる用語は、参照配列との配列同一性が４０％〜１００％であるタンパク質配列を意味する。ヒトＴＬＲ３のホモログには、既知のヒトＴＬＲ３配列との配列同一性が４０％〜１００％であるような他種由来のポリペプチドが含まれる。２つのペプチド鎖の配列の同一性（％）は、Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩバージョン９．０．０（インビトロジェン社（Invitrogen）、カリフォルニア州カールスバッド）のＡｌｉｇｎＸモジュールのデフォルト設定を使用して、配列をペアで並べることによって決定することができる。「ＴＬＲ３」とは、ヒトＴＬＲ３（ｈｕＴＬＲ３）及びそのホモログを意味する。完全長のｈｕＴＬＲ３のヌクレオチド及びアミノ酸配列をそれぞれ配列番号１及び配列番号２に示す。ｈｕＴＬＲ３の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）のヌクレオチド及びアミノ酸配列をそれぞれ配列番号３及び配列番号４に示す。

本明細書で用いる「ほぼ同じ」なる用語は、比較される２つの抗体又は抗体フラグメントのアミノ酸配列が同じか、又は「ごくわずかな差」を有することを意味する。ごくわずかな差とは、抗体又は抗体フラグメントのアミノ酸配列における１、２、３、４、５又は６個のアミノ酸の置換である。本明細書で開示する配列とほぼ同じアミノ酸配列も本願の一部である。特定の実施形態では、配列の同一性は、約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれよりも高い。同一性（％）は、上記に述べたようにして決定することができる。比較するペプチド鎖の例としては、重鎖又は軽鎖の可変領域がある。

本明細書で用いる「〜と組み合わせて」なる用語は、記載される薬剤を混合物中で同時に投与するか、単独の薬剤として同時に投与するか、あるいは単独の薬剤として任意の順序で順次、動物に投与することが可能であることを意味する。

本明細書で用いる「炎症状態」なる用語は、多くの場合、痛み、発赤、腫れ、及び組織機能の喪失によって特徴付けられる、サイトカイン、ケモカイン、又は炎症細胞（例えば好中球、単球、リンパ球、マクロファージ）の活性によって一部媒介される、細胞損傷に対する局所的な応答のことを意味する。本明細書で用いる「炎症性肺状態」なる用語は、肺を冒すか又は肺と関連した炎症状態のことを意味する。

本明細書で用いる「モノクローナル抗体」（ｍＡｂ）なる用語は、ほぼ均質な抗体の集団から得られる抗体（又は抗体フラグメント）のことを意味する。モノクローナル抗体は極めて特異性が高く、通常、単一の抗原決定基を標的とする。「モノクローナル」という修飾語は、抗体のほぼ均質な性質を指して言うものであり、抗体が特定の方法によって製造される必要はない。例えばマウスｍＡｂは、Ｋｏｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５〜４９７，１９７５のハイブリドーマ法によって製造することができる。ドナー抗体（通常はマウス）由来の軽鎖及び重鎖の可変領域を、アクセプター抗体（通常、例えばヒトなどの別の哺乳動物種）由来の軽鎖及び重鎖の定常領域とともに含むキメラｍＡｂを、米国特許第４，８１６，５６７号に開示される方法によって調製することができる。非ヒトドナー免疫グロブリン（通常はマウス）に由来するＣＤＲ、及び、１以上のヒト免疫グロブリンに由来する分子の残りの免疫グロブリン由来の部分を有するヒト適合化ｍＡｂを、米国特許第５，２２５，５３９号に開示されるような当業者には周知の方法によって調製することができる。ヒト適合化に有用なヒトフレームワーク配列は当業者であれば関連するデータベースから選択することができる。場合により、Ｑｕｅｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ），８６：１００２９〜１００３２，１９８９及びＨｏｄｇｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９：４２１，１９９１に開示されるような方法によって、結合親和性を維持するために変化させたフレームワーク支持残基を組み込むことによってヒト適合化ｍＡｂを更に改変することができる。

ヒト以外のいかなる配列も有さない完全なヒトｍＡｂは、例えば、Ｌｏｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３６８：８５６〜８５９，１９９４、Ｆｉｓｈｗｉｌｄ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４：８４５〜８５１，１９９６、及びＭｅｎｄｅｚ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １５：１４６〜１５６，１９９７に参照される方法により、ヒト免疫グロブリン形質転換マウスから調製することができる。ヒトｍＡｂは、例えば、Ｋｎａｐｐｉｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９６：５７〜８６，２０００及びＫｒｅｂｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．２５４：６７〜８４ ２００１に参照される方法により、ファージディスプレイライブラリーから調製及び最適化することもできる。

本明細書で用いる「エピトープ」なる用語は、抗体が特異的に結合する抗原の部分を意味する。エピトープは通常、アミノ酸及び多糖類側鎖のような化学的に活性な（極性、非極性又は疎水性）部分の表面における集団からなり、特定の３次元構造特性及び特定の帯電特性を有しうる。エピトープは直線状のものであってもよく、あるいはアミノ酸の直線状の配列によってではなく、抗原の連続していないアミノ酸間の空間的な関係によって形成される不連続エピトープ（例えば立体構造エピトープ）であってもよい。立体構造エピトープには、抗原の直線状配列の異なる部分のアミノ酸同士が３次元空間で近接するような抗原の折り畳みによって生じるエピトープが含まれる。

本明細書で用いる「特異的結合」なる用語は、抗体が特定の抗原と、他の抗原又はタンパク質に対するよりも高い親和性で結合することを指す。通常、抗体の結合における解離定数（Ｋ_D）は１０^-7Ｍ以下であり、抗体が特定の抗原と結合する際のＫ_Dは、特定の抗原以外の非特異的抗原（例えば、ＢＳＡ、カゼイン、又は他の任意の特定のポリペプチド）と結合する際のＫ_Dと比較して１／２以下である。本明細書では、「抗原を認識する抗体」及び「抗原に特異的な抗体」という語句を、「抗原と特異的に結合する抗体」又は「抗原特異的抗体」（例えばＴＬＲ３特異的抗体）という用語と互換可能に用いる。解離定数は後述するような標準的な方法を用いて測定することができる。

本明細書で用いる「ＴＬＲ３の生物学的活性」又は「ＴＬＲ３の活性化」という用語は、リガンドとＴＬＲ３との結合によって生ずる任意の活性を指す。ＴＬＲ３のリガンドには、２本鎖ＤＮＡ、ポリイノシンポリシチジン酸（ポリ（Ｉ：Ｃ））、及び例えば壊死細胞から放出される内因性ｍＲＮＡなどの内因性ｍＲＮＡが含まれる。ＴＬＲ３の活性化の一例では、ＴＬＲ３のリガンドに応じてＮＦ−κＢが活性化される。ＮＦ−κＢの活性化はポリ（Ｉ：Ｃ）により受容体を誘導し、レポーター遺伝子アッセイによってアッセイすることができる（Ａｌｅｘｏｐｏｕｌｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４１３：７３２〜７３８，２００１；Ｈａｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．１８：６９７３〜６９８２，１９９９）。別のＴＬＲ３の活性化の例では、ＴＬＲ３のリガンドに応じてインターフェロン応答因子（ＩＲＦ−３、ＩＲＦ−７）が活性化される。ＴＬＲ３によって媒介されるＩＲＦの活性化は、インターフェロン刺激応答配列（ＩＳＲＥ）によって制御されるレポーター遺伝子を用いてアッセイすることができる。別のＴＬＲ３の活性化の例では、例えばＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、ＣＸＣＬ５／ＩＰ−１０及びＲＡＮＴＥＳなどの炎症性サイトカイン及びケモカインが分泌される。細胞、組織からの、又は循環中へのサイトカイン及びケモカインの放出は、ＥＬＩＳＡ免疫アッセイなどのよく知られた免疫アッセイによって測定することができる。

本明細書では以下のような従来のアミノ酸の１文字及び３文字の略号を用いる。

物質の組成
本発明はＴＬＲ３の生物学的活性を阻害することが可能な抗体アンタゴニスト及びこうした抗体の使用法を提供する。こうしたＴＬＲ３アンタゴニストは、ＴＬＲ３に結合してＴＬＲ３の活性化を阻害する性質を有しうる。こうした抗体によってＴＬＲ３活性が阻害されうる機序の例としては、ＴＬＲ３へのリガンドの結合のインビトロ、インビボ、若しくはインサイチューでの阻害、受容体の２量化の阻害、エンドソーム区画へのＴＬＲ３の局在化の阻害、下流のシグナル伝達経路のキナーゼ活性の阻害、又はＴＬＲ３のｍＲＮＡの転写の阻害が挙げられる。他の機序によってＴＬＲ３の活性を阻害することが可能な他の抗体アンタゴニストもまた、本発明の異なる態様及び実施形態の範囲に含まれるものである。これらのアンタゴニストは、研究用試薬、診断用試薬及び治療薬として有用である。

抗体の多様性は、可変領域をコードする多数の生殖細胞遺伝子及び様々な体細胞イベントが用いられることによってもたらされる。こうした体細胞イベントとしては、完全なＶＨ領域を作るための可変（Ｖ）遺伝子セグメント、及び多様性（Ｄ）及び接合（Ｊ）遺伝子セグメントの組換え、並びに完全なＶＬ領域を作るための可変及び接合遺伝子セグメントの組換えがある。本明細書で開示するものと同じかあるいは似たＣＤＲ配列を有する抗体及び組成物は、独立に生成されたものである可能性は低い。組み立て及び体細胞突然変異後の抗体遺伝子の配列は極めて多様であり、これらの多様な遺伝子は１０¹⁰種類の異なる抗体分子をコードすると推定されている（Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｇｅｎｅｓ，２ｎｄ ｅｄ．，ｅｄｓ．Ｊｏｎｉｏ ｅｔ ａｌ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．，１９９５）。

本発明は、ヒト免疫グロブリンの遺伝子ライブラリーから誘導される抗原結合部位を提供する。抗原結合部位を担持させるための構造は一般に抗体の重鎖又は軽鎖若しくはそれらの部分であり、抗原結合部位は上記に述べたようにして調べた天然の抗原結合部位に配置される。

本発明は、重鎖及び軽鎖の可変領域の両方を有する、ＴＬＲ３に対する反応性を有する単離された抗体又はそのフラグメントを提供するものであり、該抗体は表１ａに示されるような重鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）のアミノ酸配列１、２及び３（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３）及び軽鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）のアミノ酸配列１、２及び３（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３）を有している。

特定の実施形態では、本発明は、重鎖及び軽鎖の可変領域の両方を有する、ＴＬＲ３に対する反応性を有する単離された抗体又はそのフラグメントを提供するものであり、該抗体は配列番号１９２に示されるようなＨＣＤＲ２のアミノ酸配列を有し、配列番号１９２のＨＣＤＲ２は下記式（Ｉ）に示されるように定義される。
Ｘａａ₆−Ｉ−Ｘａａ₇−Ｘａａ₈−Ｒ−Ｓ−Ｘａａ₉−Ｗ−Ｙ−Ｎ−Ｄ−Ｙ−Ａ−Ｖ−Ｓ−Ｖ−Ｋ−Ｓ，
（Ｉ）
（式中、
Ｘａａ₆は、Ａｒｇ又はＬｙｓであってよく、
Ｘａａ₇は、Ｔｙｒ、Ｈｉｓ又はＳｅｒであってよく、
Ｘａａ₈は、Ｍｅｔ、Ａｒｇ又はＴｙｒであってよく、
Ｘａａ₉は、Ｌｙｓ又はＡｒｇであってよい。）

他の実施形態では、本発明は、重鎖及び軽鎖の可変領域の両方を有する、ＴＬＲ３に対する反応性を有する単離された抗体又はそのフラグメントを提供するものであり、該抗体は配列番号１９４に示されるようなＨＣＤＲ２のアミノ酸配列を有し、配列番号１９４のＨＣＤＲ２は下記式（ＩＩＩ）に示されるように定義される。
Ｉ−Ｉ−Ｑ−Ｘａａ₁₅−Ｒ−Ｓ−Ｋ−Ｗ−Ｙ−Ｎ−Ｘａａ₁₆−Ｙ−Ａ−Ｘａａ₁₇−Ｓ−Ｖ−Ｋ−Ｓ，
（ＩＩＩ）
（式中、
Ｘａａ₁₅は、Ｌｙｓ、Ｔｈｒ又はＩｌｅであってよく、
Ｘａａ₁₆は、Ａｓｎ又はＡｓｐであってよく、
Ｘａａ₁₇は、Ｖａｌ又はＬｅｕであってよい。）

他の実施形態では、本発明は、重鎖及び軽鎖の可変領域の両方を有する、ＴＬＲ３に対する反応性を有する単離された抗体又はそのフラグメントを提供するものであり、該抗体は配列番号１９６に示されるようなＨＣＤＲ２のアミノ酸配列を有し、配列番号１９６のＨＣＤＲ２は下記式（Ｖ）に示されるように定義される。
Ｘａａ₂₄−Ｉ−Ｄ−Ｐ−Ｓ−Ｄ−Ｓ−Ｙ−Ｔ−Ｎ−Ｙ−Ｘａａ₂₅−Ｐ−Ｓ−Ｆ−Ｑ−Ｇ，
（Ｖ）
（式中、
Ｘａａ₂₄は、Ｐｈｅ又はＡｒｇであってよく、
Ｘａａ₂₅は、Ａｌａ又はＳｅｒであってよい。）

他の実施形態では、本発明は、重鎖及び軽鎖の可変領域の両方を有する、ＴＬＲ３に対する反応性を有する単離された抗体又はそのフラグメントを提供するものであり、該抗体は配列番号１９１に示されるようなＬＣＤＲ３のアミノ酸配列を有し、配列番号１９１のＬＣＤＲ３は下記式（ＩＩ）に示されるように定義される。
Ｘａａ₁−Ｓ−Ｙ−Ｄ−Ｘａａ₂−Ｘａａ₃−Ｘａａ₄−Ｘａａ₅−Ｔ−Ｖ，
（ＩＩ）
（式中、
Ｘａａ₁は、Ａｌａ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ又はＳｅｒであってよく、
Ｘａａ₂は、Ｇｌｙ、Ｇｌｕ又はＳｅｒであってよく、
Ｘａａ₃は、Ａｓｐ又はＡｓｎであってよく、
Ｘａａ₄は、Ｇｌｕ又はＳｅｒであってよく、
Ｘａａ₅は、Ｐｈｅ、Ａｌａ又はＬｅｕであってよい。）

他の実施形態では、本発明は、重鎖及び軽鎖の可変領域の両方を有する、ＴＬＲ３に対する反応性を有する単離された抗体又はそのフラグメントを提供するものであり、該抗体は配列番号１９３に示されるようなＬＣＤＲ３のアミノ酸配列を有し、配列番号１９３のＬＣＤＲ３は下記式（ＩＶ）に示されるように定義される。
Ｘａａ₁₀−Ｓ−Ｙ−Ｄ−Ｘａａ₁₁−Ｐ−Ｘａａ₁₂−Ｘａａ₁₃−Ｘａａ₁₄−Ｖ，
（ＩＶ）
（式中、
Ｘａａ₁₀は、Ｇｌｎ又はＳｅｒであってよく、
Ｘａａ₁₁は、Ｔｈｒ、Ｇｌｕ又はＡｓｐであってよく、
Ｘａａ₁₂は、Ｖａｌ又はＡｓｎであってよく、
Ｘａａ₁₃は、Ｔｙｒ又はＰｈｅであってよく、
Ｘａａ₁₄は、Ｓｅｒ、Ａｓｎ又はＧｌｎであってよい。）

他の実施形態では、本発明は、重鎖及び軽鎖の可変領域の両方を有する、ＴＬＲ３に対する反応性を有する単離された抗体又はそのフラグメントを提供するものであり、該抗体は配列番号１９５に示されるようなＬＣＤＲ３のアミノ酸配列を有し、配列番号１９５のＬＣＤＲ３は下記式（ＶＩ）に示されるように定義される。
Ｑ−Ｑ−Ｘａａ₁₈−Ｘａａ₁₉−Ｘａａ₂₀−Ｘａａ₂₁−Ｘａａ₂₂−Ｘａａ₂₃−Ｔ，
（ＶＩ）
（式中、
Ｘａａ₁₈は、Ｔｙｒ、Ｇｌｙ又はＡｌａであってよく、
Ｘａａ₁₉は、Ｇｌｙ、Ｇｌｕ又はＡｓｎであってよく、
Ｘａａ₂₀は、Ｓｅｒ又はＴｈｒであってよく、
Ｘａａ₂₁は、Ｖａｌ、Ｉｌｅ又はＬｅｕであってよく、
Ｘａａ₂₂は、Ｓｅｒ又はＬｅｕであってよく、
Ｘａａ₂₃は、Ｉｌｅ、Ｓｅｒ、Ｐｒｏ又はＴｙｒであってよい。）

本発明は、表１ａに示されるような重鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）のアミノ酸配列１、２及び３（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３）及び軽鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）のアミノ酸配列１、２及び３（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３）を有する、ＴＬＲ３に対する反応性を有する単離された抗体又はそのフラグメントを提供するものである。

抗原結合部位のアミノ酸配列が表１ａのもの（配列番号４９〜１２１及び１９１〜１９６）と大きく異ならない抗体は本発明の範囲に含まれるものである。一般に、これには１以上のアミノ酸残基を、同様の電荷、疎水性又は立体化学的特性を有するアミノ酸によって置換することが含まれる。抗原結合部位ではなく、フレームワーク領域における更なる置換も、これらの置換が抗体の性質に悪影響を及ぼさない限りは行うことができる。置換は、例えば安定性又は親和性といった抗体の性質を向上させる目的で行うことができる。１、２、３、４、５又は６個の置換を抗原結合部位に行うことができる。

保存的な改変では、こうした改変が行われた分子と同様の機能的及び化学的性質を有する分子が生ずる。分子の機能的及び／又は化学的特性における大幅な改変は、（１）置換領域における分子骨格の構造を例えばシート又はヘリックス立体構造として維持する、（２）標的部位における分子の電荷又は疎水性を維持する、又は（３）分子のサイズを維持する効果において大きく異なるアミノ酸配列中の置換を選択することによって実現することができる。例えば、「保存的アミノ酸置換」では、その位置におけるアミノ酸残基の極性又は電荷にほとんどあるいはまったく影響しないように内因性のアミノ酸残基を非内因性の残基と置換することができる。更に、アラニン系統的変異導入法についてこれまでに述べられているように（ＭａｃＬｅｎｎａｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｃｔａ Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｓｃａｎｄ．Ｓｕｐｐｌ．６４３：５５〜６７，１９９８；Ｓａｓａｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ａｄｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．３５：１〜２４，１９９８）、ポリペプチド内の任意の内因性の残基をアラニンで置換することもできる。所望のアミノ酸置換（保存的又は非保存的であるかによらず）は、当業者であればこうした置換が望ましい時点で決定することができる。例えば、アミノ酸置換を用いることによってその分子の配列の重要な残基を特定したり、又は本明細書で述べる分子の親和性を増大若しくは減少させることができる。アミノ酸置換の例を表１ｂに示す。

特定の実施形態においては、保存的アミノ酸置換には、生物学的システムによって合成されるのではなく、一般的に化学的ペプチド合成によって組み込まれる非天然のアミノ酸残基も含まれる。アミノ酸置換は、例えばＰＣＲ突然変異誘発（米国特許第４，６８３，１９５号）によって行うことができる。例えばランダムコドン（ＮＮＫ）又は例えば１１種類のアミノ酸（ＡＣＤＥＧＫＮＲＳＹＷ）をコードするＤＶＫコドンのような非ランダムコドンを用いて公知の方法によって変異体のライブラリーを作製し、実施例１に示されるような所望の性質を有する変異体についてライブラリーをスクリーニングすることができる。表１ｃは、抗体の性質を向上させるために３種類の親ＴＬＲ３抗体アンタゴニストのＬＣＤＲ３及びＨＣＤＲ２領域内に行った置換を示す。

抗原結合部位の表記に応じて、本発明の抗体の抗原結合部位、次いでフレームワーク残基は、各重鎖及び軽鎖ごとに若干異なりうる。表２ａ及び２ｂは、カバット（Kabat）、クロチア（Chothia）及びＩＭＧＴに基づいて表記された本発明の例示的抗体の抗原結合部位の残基及びそれらの複合配列を示したものである。

他の実施形態において、本発明は、重鎖及び軽鎖の可変領域の両方を有する、ＴＬＲ３に対する反応性を有する単離された抗体又はそのフラグメントを提供するものであり、該抗体は重鎖の可変領域（ＶＨ）及び軽鎖の可変領域（ＶＬ）のアミノ酸配列を有するとともに表３ａに示されるような単離された重鎖可変領域及び軽鎖可変領域のそれぞれを提供するものである。Ｆ１７、Ｆ１８及びＦ１９は、それぞれ、ファミリー１７、１８及び１９のコンセンサスなアミノ酸配列を有する抗体の変異体を表す（実施例１を参照）。

各実施例で説明する各実施形態は、１個が重鎖に由来し、１個が軽鎖に由来する２個の可変領域を有しているが、当業者であれば代替的な実施形態では１個の重鎖又は軽鎖の可変領域を有してもよい点は認識されるであろう。１個の可変領域を用いることで、例えばＴＬＲ３に結合することが可能な２ドメイン特異的抗原結合フラグメントを形成することが可能な可変ドメインについてスクリーニングを行うことができる。こうしたスクリーニングは、例えば国際特許出願公開第ＷＯ９２／０１０４７号に開示される階層的２重コンビナトリアルアプローチを用いたファージディスプレイスクリーニング法によって実現することが可能である。このアプローチでは、Ｈ又はＬ鎖のいずれかのクローンを含む個別のコロニーを用いて他方の鎖（Ｌ又はＨ）をコードしたクローンの完全なライブラリに感染させ、得られた２鎖特異的抗原結合ドメインを上記に述べたようなファージディスプレイ法に基づいて選択する。

他の実施形態では、本発明は、表３ａに示されるような可変領域のアミノ酸配列と少なくとも９５％同じアミノ酸配列を有する重鎖及び軽鎖の可変領域の両方を有し、ＴＬＲ３に対する反応性を有する単離された抗体又はそのフラグメントを提供する。

別の態様では、本発明は、表３ｂに示されるような特定の重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列を有する単離された抗体を提供する。

本発明の別の態様は、本発明の抗体又はその補体のいずれかをコードする単離されたポリヌクレオチドである。特定のポリヌクレオチドの例を本明細書に開示するが、遺伝暗号の縮重及び特定の発現系におけるコドンの選択性を考慮すると、本発明の抗体アンタゴニストをコードする他のポリヌクレオチドも本発明の範囲内に含まれる。

抗体アンタゴニストの例としては、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ又はＩｇＭアイソタイプの抗体が挙げられる。更にこうした抗体アンタゴニストは、グリコシル化、異性化、脱グリコシル化、又は、ポリエチレングリコール部分の付加（ペギレーション）及び脂質化など非天然の共有結合修飾などの反応によって翻訳後修飾されてもよい。こうした修飾はインビボあるいはインビトロで行われうる。例えば、本発明の抗体はポリエチレングリコールと接合する（ペギレート）することによって薬物動態的なプロファイルを向上させることができる。接合は当業者には周知の方法によって行うことができる。治療用抗体のＰＥＧとの接合によって機能を低下させずに薬力学的動態が向上することが示されている。Ｄｅｃｋｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ８７：３８２〜３９０，２０００；Ｋｎｉｇｈｔ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｔｅｌｅｔｓ １５：４０９〜４１８，２００４；Ｌｅｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｃｙｔｏｋｉｎｅ １６：１０６〜１１９，２００１；及びＹａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．１６：７６１〜７７０，２００３を参照されたい。

本発明の抗体の薬物動態的性質は、当業者には周知の方法により、Ｆｃ修飾によって向上させることも可能である。例えばＩｇＧ４アイソタイプの重鎖は、ヒンジ領域に重鎖間又は重鎖内ジスルフィド結合を形成することが可能なＣｙｓ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ（ＣＰＳＣ）というモチーフを含んでいる。すなわち、ＣＰＳＣモチーフ内の２個のＣｙｓ残基が他の重鎖の対応するＣｙｓ残基とジスルフィド結合する（重鎖間）か、あるいは特定のＣＰＳＣモチーフ内の２個のＣｙｓ残基が互いにジスルフィド結合しうる（重鎖内）。生体内のイソメラーゼ酵素は、ＩｇＧ４分子の重鎖間結合を重鎖内結合に変換し、またその逆反応を行うことが可能であると考えられている（Ａａｌｂｅｒｓｅ ａｎｄ Ｓｃｈｕｕｒｍａｎ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １０５：９〜１９，２００２）。したがって、ヒンジ領域に重鎖内結合を有するこうしたＩｇＧ４分子内の重鎖：軽鎖（Ｈ：Ｌ）の各ペアは互いに共有結合していないことからＨ：Ｌモノマーに解離し、更に他のＩｇＧ４分子に由来するＨ：Ｌモノマーと再結合して、２重特異的なヘテロダイマーのＩｇＧ４分子を形成する。２重特異的なＩｇＧ抗体では、抗体分子の２個のＦａｂはそれらが結合するエピトープが異なる。ＩｇＧ４のヒンジ領域のＣＰＳＣモチーフのＳｅｒ残基をＰｒｏで置換することによって「ＩｇＧ１様挙動」が生じる。すなわち、これらの分子は重鎖同士の間に安定したジスルフィド結合を形成するために他のＩｇＧ４分子とのＨ：Ｌ交換が起きない。一実施形態では、本発明の抗体はＣＰＳＣモチーフ内にＳ〜Ｐの突然変異を有するＩｇＧ４のＦｃドメインを有する。ＣＰＳＣモチーフの位置は通常、成熟した重鎖の残基２２８に見いだされるが、ＣＤＲの長さに応じて変化しうる。

更に、本発明の抗体のＦｃＲｎサルベージ受容体以外のＦｃ受容体への結合に影響する部位を除去することもできる。例えば、ＡＤＣＣ活性に関与するＦｃ受容体結合領域を本発明の抗体において除去することができる。例えば、ＩｇＧ１のヒンジ領域のＬｅｕ２３４／Ｌｅｕ２３５のＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａへの突然変異、又はＩｇＧ４のヒンジ領域のＰｈｅ２３５／Ｌｅｕ２３６のＰ２３５Ａ／Ｌ２３６Ａへの突然変異によって、ＦｃＲへの結合性が最小となり、補体依存性細胞傷害活性及びＡＤＣＣを媒介する免疫グロブリンの能力が低減する。一実施形態では、本発明の抗体は、Ｐ２３５Ａ／Ｌ２３６Ａ突然変異を有するＩｇＧ４のＦｃドメインを有する。上記で特定したこれらの残基の位置は成熟した重鎖においては典型的なものであるが、ＣＤＲの長さに応じて変化しうる。Ｐ２３５Ａ／Ｌ２３６Ａ突然変異を有する抗体の例としては、配列番号２１８、２１９又は２２０に示される配列によってコードされる重鎖を有する抗体がある。

完全なヒト、ヒト適合化、ヒト化、及び親和性成熟抗体分子又は抗体フラグメントは、融合タンパク質及びキメラタンパク質と同様、本発明の範囲に含まれる。抗原に対する抗体親和性は、ランダム又は部位特異的な突然変異誘発などの周知の方法を用いた合理的設計（rational design）又はランダムな親和性成熟によるか、あるいはファージディスプレイライブラリーを用いることによって高めることができる。例えば、米国特許第６，６３９，０５５号に示されるように多くがフレームワーク領域に存在するベルニエ領域（Vernier Zone）残基の変異を用いて抗体の親和性を調節することができる。近年、アルマグロ（Almagro）らは、ＣＤＲに存在し、これを操作することによって親和性を高めることができる「親和性決定残基」（ＡＤＲ）を定義している（Ｃｏｂａｕｇｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．３７８：６２２〜６３３，２００８）。

安定性、選択性、交差反応性、親和性、免疫原性、又はタンパク質の所望の生物学的若しくは生物物理学的性質を高めるように改変された完全なヒト、ヒト適合化、ヒト化、親和性成熟抗体分子又は抗体フラグメントは本発明の範囲に含まれる。抗体の安定性は、（１）内在的な安定性に影響する個々のドメインのコアパッキング、（２）重鎖と軽鎖とのペアリングに影響するタンパク質／タンパク質の界面相互作用、（３）極性及び荷電残基の埋め込み、（４）極性及び荷電残基の水素結合ネットワーク、及び（５）分子内及び分子間力の中でも特に表面電荷及び極性残基の分布、などの多くの因子によって影響される。構造を不安定化させる可能性のある残基は、抗体の結晶構造に基づいて、あるいは場合によっては分子モデリングによって特定することが可能であり、抗体の安定性に対するこれらの残基の影響を、特定された残基に突然変異を有する変異体を生成して評価することによって試験することができる。抗体の安定性を高める方法の１つは、示差走査熱量測定法（ＤＳＣ）によって測定される熱転移中点（Ｔｍ）を高くすることである。一般に、タンパク質のＴｍはその安定性との相関を示し、溶液中でのアンフォールディング及び変性のしやすさ、並びにそのタンパク質のアンフォールドのしやすさに依存する分解プロセスと負の相関を示す（Ｒｅｍｍｅｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｐｈａｒｍ．，１３：３６〜４６，２０００）。多くの研究によって、ＤＳＣにより熱安定性として測定される複数の配合物の物理的安定性の順位と、他の方法によって測定される物理的安定性との間に相関が示されている（Ｇｕｐｔａ ｅｔ ａｌ．，ＡＡＰＳ ＰｈａｒｍＳｃｉ．５Ｅ８，２００３；Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．９３：３０７６〜３０８９，２００４；Ｍａａ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．，１４０：１５５〜１６８，１９９６；Ｂｅｄｕ−Ａｄｄｏ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．，２１：１３５３〜１３６１，２００４；Ｒｅｍｍｅｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．，１５：２００〜２０８，１９９７）。これらの配合物の研究は、ＦａｂのＴｍが対応するｍＡｂの長期の物理的安定性と密接な関係があることを示唆している。フレームワーク又はＣＤＲ内におけるアミノ酸の違いは、Ｆａｂドメインの熱安定性に大きく影響しうる（Ｙａｓｕｉ，ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．３５３：１４３〜１４６，１９９４）。

本発明の抗体アンタゴニストは、約１０^-7、１０^-8、１０^-9、１０^-10、１０^-11又は１０^-12Ｍ以下のＫ_dでＴＬＲ３と結合することができる。抗体などの特定の分子のＴＬＲ３に対する親和性は、任意の適当な方法によって実験的に求めることができる。こうした方法では、当業者には周知であるＢｉａｃｏｒｅ又はＫｉｎＥｘａ装置、ＥＬＩＳＡ又は競合的結合アッセイを使用することができる。

特定のＴＬＲ３ホモログと所望の親和性で結合する抗体アンタゴニストは、抗体親和性成熟などの方法によって変異体又はフラグメントのライブラリーから選択することができる。抗体アンタゴニストは、任意の適当な方法を用いてＴＬＲ３の生物学的活性の阻害に基づいて同定することができる。こうした方法では、周知の方法を用いた、本願に述べるようなレポーター遺伝子アッセイ又はサイトカイン産生を測定するアッセイを利用することができる。

本発明の別の実施形態は、少なくとも１つの本発明のポリヌクレオチドを含むベクターである。こうしたベクターは、プラスミドベクター、ウイルスベクター、バキュロウイルス発現ベクター、トランスポゾンに基づいたベクター、又は任意の手段によって特定の生物又は遺伝子的バックグラウンドに本発明のポリヌクレオチドを導入するのに適した他の任意のベクターであってよい。

本発明の別の実施形態は、配列番号６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１５９、１９８、２００、２０２、１６４、２１２、２１３、２１４、２１５又は２１６に示されるアミノ酸配列を有する免疫グロブリン重鎖の可変領域、又は配列番号５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、１２２、１２３、１９７、１９９、２０１、１６３、２０９又は２１０に示されるアミノ酸配列を有する免疫グロブリン軽鎖の可変領域を含むポリペプチドをコードしたポリヌクレオチドなどの、本発明のポリヌクレオチドのいずれかを有するホスト細胞である。

本発明の別の実施形態は、配列番号１０２、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１６０、２０４、２０６、２０８、２２０、１６６又は１６８に示されるアミノ酸配列を有する免疫グロブリン重鎖の可変領域、又は配列番号１５５、１５６、１５７、１５８、２０３、２０５、２０７、１６５又は１６７に示されるアミノ酸配列を有する免疫グロブリン軽鎖の可変領域を含むポリペプチドをコードしたポリヌクレオチドを有するホスト細胞である。こうしたホスト細胞は、真核細胞、細菌細胞、植物細胞又は古細菌細胞であってよい。真核細胞の例としては、哺乳動物、昆虫、鳥類又は他の動物由来のものでよい。哺乳動物真核細胞としては、ＳＰ２／０（ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）、バージニア州マナッサス、ＣＲＬ−１５８１）、ＮＳ０（ＥＣＡＣＣ（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ）、英国、ウィルトシア、ソールズベリー、ＥＣＡＣＣ Ｎｏ．８５１１０５０３）、ＦＯ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１６４６）及びＡｇ６５３（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５８０）マウス細胞株などのハイブリドーマ又はミエローマなどの不死化細胞株が挙げられる。ヒトミエローマ細胞株の一例として、Ｕ２６６（ＡＴＴＣ ＣＲＬ−ＴＩＢ−１９６）がある。他の有用な細胞株としては、ＣＨＯ−Ｋ１ＳＶ（ロンザ・バイオロジックス社（Lonza Biologics）、メリーランド州ウォーカーズビル）、ＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−６１）、又はＤＧ４４などのチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞に由来するものが挙げられる。

本発明の別の実施形態は、本発明のホスト細胞を培養することと、前記ホスト細胞によって産生された抗体を回収することとを含む、ＴＬＲ３と反応性を有する抗体の製造方法である。抗体を製造して精製する方法は当該技術分野では周知のものである。

本発明の別の実施形態は、本発明の抗体を産生するハイブリドーマ細胞株である。

本発明の別の実施形態は、（ａ）配列番号２の残基Ｋ４６７、Ｒ４８８又はＲ４８９、（ｂ）配列番号２の残基Ｋ４６７、（ｃ）配列番号２の残基Ｒ４８９、（ｄ）配列番号２の残基Ｋ４６７及びＲ４８９、並びに（ｅ）配列番号２の残基Ｋ４６７、Ｒ４８８、及びＲ４８９からなる群から選択される少なくとも１つのＴＬＲ３のアミノ酸残基と結合する、ＴＬＲ３に対する反応性を有する単離された抗体又はそのフラグメントである。単離された抗体は、配列番号２の残基Ｙ４６５、Ｙ４６８、Ｎ５１７、Ｄ５３６、Ｑ５３８、Ｈ５３９、Ｎ５４１、Ｅ５７０又はＫ６１９から選択される少なくとも１つのＴＬＲ３のアミノ酸残基と更に結合しうる。

本発明の別の実施形態は、配列番号２の残基Ｄ１１６又はＫ１４５からなる群から選択される少なくとも１つのＴＬＲ３のアミノ酸残基と結合する、単離された抗体又はそのフラグメントである。

幾つかの周知の方法を用いて本発明の抗体の結合エピトープを決定することができる。例えば、両方の個別の要素の構造が分かっている場合、インシリコでタンパク質−タンパク質のドッキングを行って適合する相互作用の部位を同定することができる。抗原抗体複合体において水素−重水素（Ｈ／Ｄ）交換を行うことによって抗体が結合しうる抗原の領域をマッピングすることができる。抗原のセグメント及び点突然変異誘発を用いることにより、抗体の結合に重要なアミノ酸の位置を特定することができる。ＴＬＲ３のような大きなタンパク質では、最初にドッキング、セグメント突然変異誘発、又はＨ／Ｄ交換などによって結合部位の位置をそのタンパク質の特定の領域に限定することで点突然変異誘発によるマッピングが単純化される。

本発明の別の態様は、特定の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）１、２及び３のアミノ酸配列、特定の軽鎖ＣＤＲ １、２及び３のアミノ酸配列、特定の重鎖可変領域（ＶＨ）のアミノ酸配列、又は特定の軽鎖可変領域（ＶＬ）のアミノ酸配列を有するモノクローナル抗体とＴＬＲ３との結合について競合する、ＴＬＲ３に対する反応性を有する単離された抗体又はそのフラグメントである。本発明のモノクローナル抗体の例としては、配列番号２１６に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域及び配列番号４１に示される軽鎖可変領域のアミノ酸配列を有する単離された抗体、並びに配列番号２１４に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域及び配列番号２１１に示される軽鎖可変領域のアミノ酸配列を有する抗体がある。

ＴＬＲ３との結合についての競合は公知の方法によってインビトロでアッセイすることができる。例えば、非標識抗体の存在下でのＭＳＤ Ｓｕｌｆｏ−Ｔａｇ（商標）ＮＨＳ−エステル標識抗体のＴＬＲ３に対する結合をＥＬＩＳＡによって評価することができる。本発明の抗体の例としては、ｍＡｂ １２、ｍＡｂ １５及びｍＡｂ ｃ１８１１がある（表３ａを参照）。これまでに述べられている抗ＴＬＲ３抗体ｃ１０６８及びその誘導体（国際特許出願公開第ＷＯ０６／０６０５１３Ａ２号）、ＴＬＲ３．７（イー・バイオサイエンシーズ社（eBiosciences）、カタログ番号１４−９０３９）、並びにＩｍｇｅｎｅｘ ＩＭＧ−３１５Ａ（Ｉｍｇｅｎｅｘ ＩＭＧ−３１５Ａ；ヒトＴＬＲ３のアミノ酸５５〜７０（ＶＬＮＬＴＨＮＱＬＲＲＬＰＡＡＮ）に対して作製されたもの）は、実施例５に示されるようにｍＡｂ １２、１５、ｃ１８１１のいずれともＴＬＲ３に対する結合について競合しない。

本発明の別の態様は、ＴＬＲ３に対する反応性を有する単離された抗体であって、以下の性質の少なくとも１つを有する抗体である。すなわち、
ａ．インビトロのポリ（Ｉ：Ｃ）ＮＦ−κＢレポーター遺伝子アッセイにおいてヒトＴＬＲ３の生物学的活性を１μｇ／ｍｌ未満で５０％よりも大きく低減させるか、
ｂ．１００ｎｇ／ｍｌ未満のポリ（Ｉ：Ｃ）で刺激したＢＥＡＳ−２Ｂ細胞からのＩＬ−６又はＣＸＣＬ５／ＩＰ−１０の産生を１０μｇ／ｍｌ未満で６０％よりも大きく阻害するか、
ｃ．１００ｎｇ／ｍｌ未満のポリ（Ｉ：Ｃ）で刺激したＢＥＡＳ−２Ｂ細胞からのＩＬ−６又はＣＸＣＬ５／ＩＰ−１０の産生を０．４μｇ／ｍｌ未満で５０％よりも大きく阻害するか、
ｄ．６２．５ｎｇ／ｍｌのポリ（Ｉ：Ｃ）で刺激したＮＨＢＥ細胞からのＩＬ−６の産生を５μｇ／ｍｌ未満で５０％よりも大きく阻害するか、
ｅ．６２．５ｎｇ／ｍｌのポリ（Ｉ：Ｃ）で刺激したＮＨＢＥ細胞からのＩＬ−６の産生を１μｇ／ｍｌ未満で５０％よりも大きく阻害するか、
ｆ．ポリ（Ｉ：Ｃ）により誘導したＩＦＮ−γ、ＩＬ−６又はＩＬ−１２のＰＢＭＣ細胞による産生を１μｇ／ｍｌ未満で２０％よりも大きく阻害するか、
ｇ．インビトロでのＮＦ−κＢレポーター遺伝子アッセイにおいてカニクイザルのＴＬＲ３の生物学的活性をＩＣ５０＜１０μｇ／ｍｌとなるように阻害するか、又は、
ｈ．インビトロでのＩＳＲＥレポーター遺伝子アッセイにおいてカニクイザルのＴＬＲ３の生物学的活性をＩＣ５０＜５μｇ／ｍｌとなるように阻害する。

治療方法
本発明のＴＬＲ３アンタゴニスト、例えばＴＬＲ３抗体アンタゴニストは、免疫系を調節する目的で使用することができる。何らの特定の理論に束縛されることも望むものではないが、本発明のアンタゴニストは、ＴＬＲ３へのリガンドの結合、ＴＬＲ３の２量化、ＴＬＲ３の細胞内移行、又はＴＬＲ３の輸送を防止又は低減することによって免疫系を調節しうるものと考えられる。本発明の方法を用いて任意の分類に属する動物患者を治療することができる。こうした動物の例としては、ヒト、齧歯類、犬、猫、及び家畜などの哺乳動物が挙げられる。例えば本発明の抗体は、ＴＬＲ３活性の中和、炎症、炎症性及び代謝性疾患の治療に有用であるだけでなく、更にこうした治療のための薬剤の調製においても有用であり、その場合、薬剤は本明細書で定義する用量で投与されるように調製される。

一般的に、本発明のＴＬＲ３抗体アンタゴニストの投与によって予防又は治療することが可能な炎症状態、感染にともなう状態、又は免疫介在性炎症性疾患には、サイトカイン又はケモカインによって媒介されるもの、及びＴＬＲ３の活性化又はＴＬＲ３経路を介したシグナル伝達に全体的又は部分的に起因する状態が含まれる。こうした炎症性状態の例としては、敗血症にともなう状態、炎症性腸疾患、自己免疫性疾患、炎症性疾患、及び感染にともなう状態が挙げられる。更に、本発明のＴＬＲ３抗体アンタゴニストの投与によって癌、心血管及び代謝性の状態、神経病及び線維症の状態を予防又は治療することも可能であると考えられる。炎症は組織を冒し、全身性の症状となりうる。罹患する組織の例としては、気道、肺、消化管、小腸、大腸、結腸、直腸、心血管系、心組織、血管、関節、骨及び滑膜組織、軟骨、上皮、内皮、肝又は脂肪組織が挙げられる。全身性の炎症状態の例としては、サイトカインストームすなわち高サイトカイン血症、全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）、劇症型抗リン脂質症候群、重篤なウイルス感染、インフルエンザ、肺炎、ショック、又は敗血症がある。

炎症は、侵入する病原体を撃退するための生物による防御反応である。炎症は、多くの細胞性及び体液性のメディエーターが関与するカスケードイベントである。一方で炎症反応の抑制はホストを免疫無防備状態とするものであるが、炎症はそのまま放置しておくと慢性炎症性疾患（例えば、喘息、感染、関節炎、リウマチ様関節炎、多発性硬化症、炎症性腸疾患など）、敗血性ショック、及び多臓器不全などの重篤な合併症を引き起こしうる。重要な点として、これらの多様な疾患状態は、サイトカイン、ケモカイン、炎症細胞、及びこれらの細胞によって分泌される他のメディエーターなどの共通の炎症性メディエーターを共有している。

リガンドであるポリ（Ｉ：Ｃ）、２本鎖ＲＮＡ又は内因性のｍＲＮＡによってＴＬＲ３が活性化されるとシグナル伝達経路が活性化され、これにより炎症性サイトカインの合成及び分泌、マクロファージ、顆粒球、好中球及び好酸球などの炎症細胞の活性化及び動員、細胞死、並びに組織の破壊が引き起こされる。ＴＬＲ３は、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、ＴＮＦ−α、ＭＩＰ−１、ＣＸＣＬ５／ＩＰ−１０及びＲＡＮＴＥＳ、並びに免疫細胞の動員及び活性化に関わる他の炎症性サイトカイン及びケモカインの分泌を誘導することにより、自己免疫疾患及び他の炎症性疾患における組織の破壊に寄与する。ＴＬＲ３のリガンドである内因性のｍＲＮＡは炎症時に壊死細胞から放出され、ポジティブフィードバックループを引き起こすことによってＴＬＲ３を活性化し、炎症及び更なる組織破壊を持続させる。ＴＬＲ３抗体アンタゴニストのようなＴＬＲ３アンタゴニストはサイトカインの分泌を正常化し、炎症細胞の動員を低減し、組織破壊及び細胞死を低減させると考えられる。したがって、ＴＬＲ３アンタゴニストは炎症及び広範な炎症性状態を治療するうえで治療上の可能性を有するものである。

炎症性状態の１つの例は、全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）、敗血性ショック又は多臓器不全症候群（ＭＯＤＳ）が含まれうる、敗血症にともなう状態である。ウイルス、細菌、真菌、又は寄生虫感染によって、及び壊死細胞によって放出される２本鎖ＲＮＡは敗血症の発症に寄与しうる。特定の理論によって束縛されることを望むものではないが、ＴＬＲ３アンタゴニストによる治療は、敗血症にともなう炎症状態を有する患者における生存時間を延ばすか又は局所的な炎症性イベント（例えば肺の）が広がって全身症状となることを防止することにより、あるいは内在的な抗微生物活性を強化することにより、あるいは抗微生物剤と組み合わされる場合に相乗的な活性を示すことにより、あるいは病状に寄与する局所的炎症状態を抑制することにより、あるいは上記の任意の組合わせにより、所定の治療効果を与えうるものと考えられる。こうした介入は、患者の生存を確実にするために必要とされる更なる治療（例えば基礎となる炎症の治療又はサイトカインレベルの低減）を可能とするうえで充分なものとなりうる。敗血症はＤ−ガラクトサミン及びポリ（Ｉ：Ｃ）を投与することによってマウスなどの動物でモデル化することができる。こうしたモデルにおいて、Ｄ−ガラクトサミンは、敗血症感作物質として機能する肝臓毒素であり、ポリ（Ｉ：Ｃ）は２本鎖ＲＮＡを模倣してＴＬＲ３を活性化させる敗血症誘導分子である。ＴＬＲ３アンタゴニストによる治療は敗血症のマウスモデルにおける動物の生存率を高めうるものであり、したがってＴＬＲ３アンタゴニストは敗血症の治療に有用であると考えられる。

消化管の炎症は消化管の粘膜走の炎症であり、急性及び慢性の炎症状態が含まれる。急性炎症は、短時間の発症及び好中球の浸潤又は流入によって一般的に特徴付けられる。慢性炎症は、比較的長期の発症及び単核球の浸潤又は流入によって一般的に特徴付けられる。粘膜層は、腸（小腸及び大腸を含む）、直腸、胃（胃部）壁、又は口腔の粘膜であってよい。慢性の消化管炎症状態の例としては、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、外界からの刺激によって誘導される大腸炎（例えば、化学療法、放射線療法などの投与のような治療レジメンによって引き起こされるかあるいはこれにともなう（例えば副作用として）消化管炎症（例えば大腸炎））、感染性大腸炎、虚血性大腸炎、膠原性又はリンパ性大腸炎、壊死性腸炎、慢性肉芽腫症又はセリアック病などの状態における大腸炎、食品アレルギー、胃炎、感染性胃炎又は小腸結腸炎（例えばヘリコバクター・ピロリの感染による慢性活動性胃炎）、及び感染性病原体によって引き起こされる消化管炎症の他の形態がある。

炎症性腸疾患（ＩＢＤ）には、例えば潰瘍性大腸炎（ＵＣ）及びクローン病（ＣＤ）などの、一般に病因が不明の一群の慢性炎症性疾患が含まれる。臨床的及び実験的証拠は、ＩＢＤの病因が感受性遺伝子及び環境因子が関与する多因子的なものであることを示唆している。炎症性腸疾患では、組織の傷害は、腸内の微生物叢の抗原に対する不適切又は過剰な免疫反応によってもたらされる。炎症性腸疾患の幾つかの動物モデルが存在している。最も広く用いられているモデルとしては、結腸に慢性炎症及び潰瘍形成を誘発する２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸／エタノール（ＴＮＢＳ）誘発大腸炎モデル又はオキサゾロンモデルがある（Ｎｅｕｒａｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ １９：５１〜６２，２０００）。別のモデルでは、血性下痢、体重減少、結腸の短縮、及び好中球の浸潤をともなう粘膜の潰瘍形成として発現する急性大腸炎を誘発する硫酸デキストランナトリウム（ＤＳＳ）を使用する。ＤＳＳ誘発大腸炎は、リンパ組織過形成、陰窩傷害（focal crypt damage）、及び上皮潰瘍形成をともなう、基底膜内への炎症細胞の浸潤によって組織学的に特徴付けられる（Ｈｅｎｄｒｉｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ １５：７９〜９４，２００２）。別のモデルでは、ナイーブなＣＤ４５ＲＢ^high ＣＤ４ Ｔ細胞をＲＡＧ又はＳＣＩＤマウスに養子移入する。このモデルでは、ドナーのナイーブＴ細胞がレシピエントの腸を攻撃することにより、ヒトの炎症性腸疾患に似た慢性腸炎症及び症状を引き起こす（Ｒｅａｄ ａｎｄ Ｐｏｗｒｉｅ，Ｃｕｒｒ．Ｐｒｏｔｏｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｃｈａｐｔｅｒ１５ ｕｎｉｔ １５．１３，２００１）。これらのモデルのいずれかにおける本発明のアンタゴニストの投与を用いることによって、これらのアンタゴニストが、炎症性腸疾患などの腸内の炎症にともなう症状を改善し、疾患の経過を変化させる潜在的な有効性を評価することができる。ＩＢＤに対しては幾つかの治療の選択肢が存在し、例えば抗ＴＮＦα抗体による治療法がクローン病を治療する目的で１０年前から用いられている（Ｖａｎ Ａｓｓｃｈｅ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｐｕｂ Ｏｃｔ ２００９）。しかしながら、かなりの割合の患者が現在の治療法に応答しない（Ｈａｎａｕｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ ３５９：１５４１〜１５４９，２００２；Ｈａｎａｕｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ １３０：３２３〜３３３，２００６）ことから、難治性の患者集団を標的とした新たな治療法が求められている。

炎症状態の別の一例は炎症性の肺状態である。炎症性の肺状態の例としては、ウイルス、細菌、真菌、寄生虫又はプリオンによる感染にともなうものなどの感染により誘発される肺状態、アレルゲンにより誘発される肺状態、アスベスト症、珪肺症、又はベリリウム肺症などの汚染物質により誘発される肺状態、胃吸引により誘発される肺状態、嚢胞性線維症などの遺伝的素因にともなう免疫調節不全炎症状態、及び人工呼吸器傷害などの物理的外傷により誘発される肺状態が挙げられる。これらの炎症状態には更に、喘息、気腫、気管支炎、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、サルコイドーシス、ヒスチオサイトーシス、リンパ管筋腫症、急性肺傷害、急性呼吸窮迫症候群、慢性肺疾患、気管支肺異形成症、院外感染性肺炎、院内肺炎、人工呼吸器関連肺炎、敗血症、ウイルス性肺炎、インフルエンザ感染、パラインフルエンザ感染、ロタウイルス感染、ヒトメタニューモウイルス感染、呼吸系発疹ウイルス感染、及びアスペルギルス又は他の真菌感染も含まれる。感染にともなう炎症性疾患の例としては、重症肺炎、嚢胞性線維症、気管支炎、気道増悪、及び急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）を含むウイルス又は細菌性肺炎が挙げられる。こうした感染にともなう状態は、一次ウイルス感染及び二次ウイルス感染のように複数の感染をともなう場合がある。

喘息は、気道過敏症（ＡＨＲ）、気管支収縮、喘鳴、好酸球又は好中球性炎症、粘液分泌過多、上皮下線維症、及び高いＩｇＥレベルによって特徴付けられる肺の炎症性疾患である。喘息の患者は、最も一般的には気道の微生物感染（例えばライノウイルス、インフルエンザウイルス、ヘモフィルスインフルエンザなど）による症状の悪化である「増悪」を経験する。喘息の発作は、環境因子（例えば、回虫、昆虫、動物（例えばネコ、イヌ、ウサギ、マウス、ラット、ハムスター、モルモット及び鳥）、真菌、空気汚染物質（例えば煙草の煙））、刺激性ガス、フューム、蒸気、エアゾール、化学物質、花粉、運動、又は冷気によって誘発される。喘息以外にも、例えば慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、細菌性肺炎及び嚢胞性線維症などの幾つかの肺の慢性炎症性疾患が、気道への好中球の浸潤によって特徴付けられており（Ｌｉｎｄｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｊ．１５：９７３〜９７７，２０００；Ｒａｈｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１５：２６８〜２７６，２００５）、ＣＯＰＤ、アレルギー性鼻炎及び嚢胞性線維症などの疾患が気道過敏症によって特徴付けられている（Ｆａｈｙ ａｎｄ Ｏ’Ｂｙｒｎｅ，Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ Ｍｅｄ．１６３：８２２〜８２３，２００１）。喘息及び気道炎症の一般的に用いられる動物モデルとしては、オボアルブミンチャレンジモデル及びメタコリン感作モデル（Ｈｅｓｓｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２９３：４０１〜４１２，１９９５）がある。培養したヒト気管支上皮細胞、気管支線維芽細胞又は気道平滑筋細胞からのサイトカイン及びケモカインの産生の阻害をインビトロモデルとして用いることもできる。本発明のアンタゴニストをこれらのモデルのいずれかに投与することによって、喘息、気道炎症、ＣＯＰＤなどの症状を改善し、経過を変化させるためのこれらのアンタゴニストの使用を評価することができる。

本発明の方法によって予防又は治療しうる他の炎症状態及び神経障害は、自己免疫疾患によって引き起こされるものである。これらの状態及び神経障害としては、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、並びに、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、双極性疾患、及び筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）などの神経変性及び中枢神経系（ＣＮＳ）疾患、原発性胆汁性硬変、原発性硬化性胆管炎、非アルコール性脂肪性肝疾患／脂肪性肝炎、線維症、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、及びＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）などの肝臓疾患、糖尿病及びインスリン抵抗性、アテローム性動脈硬化症、脳出血、脳卒中、及び心筋梗塞などの心血管疾患、関節炎、関節リウマチ、乾癬性関節炎及び若年性関節リウマチ（ＪＲＡ）、骨粗鬆症、変形性関節症、膵炎、線維症、脳炎、乾癬、巨細胞動脈炎、強直性脊椎炎、自己免疫性肝炎、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、炎症性の皮膚状態、移植、癌、アレルギー、内分泌疾患、創傷治癒、他の自己免疫性疾患、気道過敏症、並びに、細胞、ウイルス又はプリオンによって媒介される感染症又は疾患が挙げられる。

変形性関節症、関節リウマチ、怪我による関節炎を有する関節などを含む関節炎は、本発明のアンタゴニストのような抗炎症性タンパク質の治療的使用によって利するところのある一般的な炎症状態である。例えば、関節リウマチ（ＲＡ）は全身を冒す全身性疾患であり、関節炎の最も一般的な形態の１つである。関節リウマチは組織の傷害を引き起こすため、ＴＬＲ３リガンドが炎症部位に存在しうる。ＴＬＲ３シグナル伝達の活性化によって、炎症を起こした関節の炎症及び更なる組織傷害が持続しうる。関節リウマチの幾つかの動物モデルが当該技術分野において知られている。例えばコラーゲン誘発関節炎（ＣＩＡ）モデルでは、ヒト関節リウマチとよく似た慢性炎症性関節炎をマウスに発症させる。本発明のＴＬＲ３アンタゴニストをＣＩＡモデルマウスに投与することによって、疾患の症状を改善して疾患の経過を変化させるためのこれらのアンタゴニストの使用を評価することができる。

真性糖尿病すなわち糖尿病は、複数の原因因子によって誘導される、高血糖によって特徴付けられる疾患プロセスのことを指し（ＬｅＲｏｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，（ｅｄｓ．），Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｍｅｌｌｉｔｕｓ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｐａ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１９９６）、すべての参考文献を本明細書に援用する。制御されない高血糖は、腎障害、神経障害、網膜障害、高血圧、脳血管疾患及び冠状動脈性心疾患などの微小血管及び大血管性疾患のリスクが増大するために死亡率が増加し、若年死をともなう。したがって、グルコースホメオスタシスの制御は糖尿病の治療にとって極めて重要なアプローチである。

基礎となる欠陥により、糖尿病は、患者の膵線にインスリンを産生するβ細胞が存在しない場合に発症する１型糖尿病（インスリン依存性糖尿病、ＩＤＤＭ）と、β細胞のインスリン分泌不全及び／又はインスリンの作用に対する抵抗性を有する患者において発症する２型糖尿病（インスリン非依存性糖尿病、ＮＩＤＤＭ）の２つの大きなグループに分類される。

２型糖尿病は、絶対的ではなく、相対的なインスリン欠乏をともなうインスリン抵抗性によって特徴付けられる。インスリン抵抗性の患者では、身体はこの欠陥を補償するために異常に高量のインスリンを分泌する。インスリン抵抗性を補償し、血糖値を適正に制御するために不適切な量のインスリンが存在すると、境界型糖尿病の状態が現れる。多くの患者でインスリン分泌は更に低下し、血漿グルコース濃度が上昇し、糖尿病の臨床状態がもたらされる。肥満症にともなう炎症は、インスリン抵抗性、２型糖尿病、脂質代謝異常、及び心血管疾患の発症に深く関わっていることが示唆されている。肥満脂肪はマクロファージを動員及び維持し、ＴＮＦ−α及びＩＬ−６などの炎症性サイトカイン、遊離脂肪酸及びアディポカインを過剰に産生しうるが、これらはインスリンシグナル伝達を妨害してインスリン抵抗性を誘発しうる。マクロファージのＴＬＲ３活性化は、こうした脂肪の炎症誘発状態に寄与しうる。インスリン抵抗性の幾つかの動物モデルが知られている。例えば、食餌誘発肥満モデル（ＤＩＯ）では、動物は体重増加をともなう高血糖症及びインスリン抵抗性を発症する。ＤＩＯモデルに本発明のＴＬＲ３アンタゴニストを投与することによって、２型糖尿病にともなう合併症を改善して疾患の経過を変化させるためのこれらのアンタゴニストの使用を評価することができる。

癌の例としては、白血病、急性白血病、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、Ｂ細胞又はＴ細胞のＡＬＬ、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、有毛細胞白血病、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、リンパ腫、ホジキン病、悪性リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫、多発性骨髄腫、カポジ肉腫、直腸結腸癌、膵臓癌、腎細胞癌、乳癌、鼻咽頭癌、悪性組織球増殖症、悪性の腫瘍随伴症候群／高カルシウム血症、固形腫瘍、腺癌、扁平上皮細胞癌、肉腫、悪性黒色腫、特に転移性黒色腫、血管腫、転移性疾患、癌関連骨吸収、及び癌関連骨痛を含む（ただしこれらに限定されない）、細胞、組織、臓器、動物、又は患者における少なくとも１つの悪性疾患が挙げられる。

心血管疾患の例としては、心臓性昏倒症候群、心筋梗塞、鬱血性心不全、卒中、虚血性卒中、出血、動脈硬化症、アテローム性硬化症、再狭窄、糖尿病性動脈硬化疾患、高血圧、動脈高血圧、腎血管性高血圧、失神、ショック、心血管系の梅毒、心不全、肺性心、原発性肺高血圧、心臓不整脈、心房異所性収縮、心房粗動、心房細動（持続性または痙攣性）、潅流後症候群、心肺バイパス炎症反応、多源性（chaotic or multifocal）心房頻拍、規則的で狭いＱＲＳ頻拍、特異的不整脈、心室細動、ヒス束不整脈、房室ブロック、脚ブロック、心筋虚血性障害、冠動脈疾患、狭心症、心筋梗塞、心筋症、拡張型うっ血性心筋症、拘束型心筋症、心臓弁疾患、心内膜炎、心臓周囲疾患、心臓腫瘍、大動脈および抹消動脈瘤、大動脈解離、大動脈の炎症、腹部大動脈およびその分枝の閉塞、抹消血管障害、閉塞性動脈障害、抹消性アテローム硬化疾患、閉塞性血栓血管炎、機能性抹消動脈障害、レイノー現象および障害、先端チアノーゼ、先端紅痛症、静脈疾患、静脈血栓症、静脈瘤血管、動静脈瘤、リンパ水腫、脂肪性浮腫、不安定狭心症、再潅流傷害、ポンプ後症候群、及び虚血性再潅流傷害を含む（ただしこれらに限定されない）、細胞、組織、臓器、動物または患者における心血管疾患が挙げられる。

神経性疾患の例としては、神経変性疾患、多発性硬化症、偏頭痛、ＡＩＤＳ痴呆複合症、例えば多発性硬化症及び急性横断性脊髄炎などの髄鞘脱落性疾患；例えば皮質脊髄系の病変などの錐体外路及び小脳疾患；基底核の疾患又は小脳疾患；脳幹神経節の障害；例えばハンチントン舞踏病及び老年舞踏病などの運動亢進性運動障害；例えばＣＮＳドーパミンレセプターを遮断する薬物によって誘導される運動障害などの薬物誘導性運動障害；例えばパーキンソン病などの運動低下性運動障害；進行性核上性麻痺；小脳の構造的病変；例えば脊髄性運動失調、フリードライヒ運動失調、小脳皮質変性、多発性系変性（Ｍｅｎｃｅｌ，Ｄｅｊｅｒｉｎｅ−Ｔｈｏｍａｓ，Ｓｈｉ−Ｄｒａｇｅｒ及びＭａｃｈａｄｏ−Ｊｏｓｅｐｈ）などの脊髄小脳の変性；全身性疾患（Ｒｅｆｓｕｍ’ｓ疾患、無β−リポタンパク血症、麻痺、毛細管拡張症及びミトコンドリア性多系疾患）；例えば多発性硬化症、急性横断性脊髄炎などの髄鞘脱落性コア疾患；及び神経性筋萎縮などの運動ユニットの障害（例えば筋委縮性測索硬化症、小児性脊髄性筋委縮及び若年性脊髄性筋委縮などの前角細胞変性）；アルツハイマー病；中年のダウン症候群；びまん性レビー小体病；レビー小体型の老年性認知症；ウェルニッケ‐コルサコフ症候群；慢性アルコール中毒；クロイツフェルト・ヤコブ病；亜急性硬化性全脳炎、ハラーフォルデン・シュパッツ病；ボクサー痴呆を含む（ただしこれらに限定されない）細胞、組織、臓器、動物又は患者における神経疾患が挙げられる。

線維症状態の例としては、肝臓線維症（アルコール性肝硬変、ウイルス性肝硬変、自己免疫性肝炎を含むがこれらに限定されない）；肺線維症（強皮症、特発性肺線維症を含むがこれらに限定されない）；腎臓線維症（強皮症、糖尿病性腎炎、糸球体腎炎、ループス腎炎を含むがこれらに限定されない）；皮膚線維症（強皮症、肥厚性及びケロイド瘢痕、火傷を含むがこれらに限定されない）；骨髄線維症；神経線維腫症；線維腫；腸線維症；及び外科手術による線維化付着などが挙げられる。こうした方法では、線維症は器官特異的な線維症又は全身性線維症でありうる。器官特異的な線維症は、肺線維症、肝線維症、腎線維症、心線維症、血管線維症、皮膚線維症、眼線維症、骨髄線維症、又はその他の線維症の少なくとも１つにともないうる。肺線維症は、特発性肺線維症、薬剤誘発性肺線維症、喘息、サルコイドーシス、又は慢性閉塞性肺疾患のうち少なくとも１つにともないうる。肝臓線維症は、肝硬変、住血吸虫症、又は胆管炎のうち少なくとも１つにともないうる。肝硬変は、アルコール性肝硬変、Ｃ型肝炎後肝硬変、原発性胆汁性肝硬変の中から選択されうる。胆管炎は硬化性胆管炎である。腎線維症は、糖尿病性腎障害又はループス糸球体腎炎にともないうる。心線維症は、心筋梗塞にともないうる。血管線維症は、血管形成術後動脈再狭窄、又はアテローム性動脈硬化にともないうる。皮膚線維症は、火傷瘢痕化、肥厚性瘢痕化、ケロイド、又は腎性線維性皮膚症にともないうる。眼線維症は、後眼窩線維症、白内障手術後又は増殖性硝子体網膜症にともないうる。骨髄線維症は、特発性骨髄線維症又は薬剤誘発性骨髄線維症にともないうる。他の線維症は、ペイロニー病、デュピュイトラン拘縮又は皮膚筋炎から選択されうる。全身性線維症は、全身性硬化症及び移植片体宿主病から選択されうる。

投与／医薬組成物
ＴＬＲ３活性の抑制が望ましい状態の治療又は予防に有効な薬剤の「治療上の有効量」は、標準的な研究法によって決定することができる。例えば、喘息、クローン病、潰瘍性大腸炎又は関節リウマチなどの炎症状態の治療又は予防において有効となる薬剤の用量は、本明細書に述べるモデルのような関連する動物モデルに薬剤を投与することによって決定することができる。

更に、場合によりインビトロアッセイを用いて最適な用量範囲を特定することができる。特定の有効用量の選択は、当業者であれば幾つかの因子の考慮に基づいて（例えば臨床試験によって）決定することができる。こうした因子には、治療又は防止しようとする疾患、関与する症状、患者の体重、患者の免疫状態、及び当業者には周知の他の因子が含まれる。製剤に使用される正確な用量は、投与経路、及び疾患の重篤度にも依存し、医師の判断及び各患者の状況に基づいて決定されなければならない。有効用量は、インビトロ又は動物モデル試験系から導出される用量反応曲線から外挿することができる。

本発明の方法では、ＴＬＲ３アンタゴニストは単独で、又は少なくとも１種類の他の分子と組み合わせて投与することができる。こうした更なる分子は、他のＴＬＲ３アンタゴニスト分子か、又はＴＬＲ３受容体のシグナル伝達によって媒介されない治療効果を有する分子であってよい。抗生剤、抗ウイルス剤、緩和剤、及びサイトカインのレベル又は活性を低減する他の化合物はこうした更なる分子の例である。

本発明の薬剤の治療上の使用のための投与方法は、薬剤をホストに送達する任意の好適な経路でよい。これらの薬剤の医薬組成物は、例えば、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、又は鼻腔内などの非経口投与に特に有用である。

本発明の薬剤は、有効量の薬剤を薬学的に許容される担体中の有効成分として含有する医薬組成物として調製することができる。「担体」なる用語は、活性化合物が一緒に投与される希釈剤、助剤、賦形剤、又は溶媒のことを指す。こうした医薬用溶媒は、落花生油、大豆油、鉱物油、ゴマ油などの、石油、動物、植物又は合成物由来の水及び油などの液体であってよい。例えば、０．４％生理食塩水及び０．３％グリシンを使用することができる。これらの溶液は滅菌され、粒子状物質を含まないものである。これらの溶液は、従来の公知の滅菌法（例えば濾過）によって滅菌することができる。前記組成物は、生理学的条件に近づけるために必要とされるｐＨ調整剤及び緩衝剤などの薬学的に許容される補助物質を含むことができる。こうした医薬製剤中の本発明の薬剤の濃度は、重量にして約０．５％未満、通常は約１％又は少なくとも約１％から、最大で１５又は２０％までと大きく異なってよく、選択される投与方法にしたがって、主として必要とされる用量、液体の体積、粘度などに基づいて選択される。

したがって、筋肉内注射用の本発明の医薬組成物は、１ｍＬの滅菌緩衝水、及び約１ｎｇ〜約１００ｍｇ、例えば約５０ｎｇ〜約３０ｍｇ、又はより好ましくは約５ｍｇ〜約２５ｍｇの本発明のＴＬＲ３アンタゴニストを含むように調製することができる。同様に、静脈内注射用の本発明の医薬組成物は、２５０ｍＬの滅菌リンゲル溶液、及び約１ｍｇ〜約３０ｍｇ、好ましくは５ｍｇ〜約２５ｍｇの本発明のアンタゴニストを含むように調製することができる。非経口投与可能な組成物を調製する実際の方法は周知のものであり、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，１５ｔｈ ｅｄ．，マック・パブリッシング社（Mack Publishing Company）ペンシルベニア州イーストン）により詳細に記載されている。

本発明の抗体アンタゴニストは凍結乾燥して保存することができ、使用の前に適切な溶媒中で還元することができる。この方法は従来の免疫グロブリン及びタンパク質の調製において有効であることが示されており、当該技術分野では周知の凍結乾燥及び還元の技術を使用することができる。

次に以下の具体的かつ非限定的な実施例を参照して本発明を説明する。

（実施例１）
抗ｈｕＴＬＲ３アンタゴニストｍＡｂの同定及び誘導
ＭｏｒｐｈｏＳｙｓ Ｈｕｍａｎ Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｌｉｂｒａｒｙ（ＨｕＣＡＬ（登録商標））Ｇｏｌｄファージディスプレイライブラリー（モルフォシス社（Morphosys AG）、マルティンスリート、ドイツ）をヒト抗体フラグメントの供給源として使用し、Ｃ末端にポリヒスチジンタグを有するヒトＴＬＲ３（ｈｕＴＬＲ３）（配列番号４）のアミノ酸１〜７０３の発現によって生成された精製ＴＬＲ３抗原に対してパンニングし、固定化金属アフィニティークロマトグラフィーによって精製した。アミノ酸１〜７０３はｈｕＴＬＲ３の予想される細胞外ドメイン（ＥＣＤ）と一致している。ｈｕＴＬＲ３と特異的に結合するＦａｂフラグメント（Ｆａｂ）を、多様な抗体フラグメント群を固有のものとして同定、配列決定及び確認できるように様々な方法でＴＬＲ３タンパク質を提示することによって選択した。異なるパンニングの手法により、６２種類の候補物質（Ｖ領域配列が異なる）がｈＴＬＲ３のＥＣＤに結合する固有の物質として同定された。

ｈｕＴＬＲ３のＥＣＤの結合物質として同定されたこれら６２種類の候補物質を、抗炎症活性の特定に関する広範な細胞アッセイにおいて中和活性についてスクリーニングした。予備活性データ（下記実施例２を参照）を用いて、ファミリー１６〜１９を形成する４種類の候補物質（Ｆａｂ １６〜１９）を、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）及び軽鎖ＣＤＲ２（ＬＣＤＲ２）のＣＤＲ成熟の親として６２種類の候補物質から選択した。これらの親候補物質の１つ（候補物質１９）でＨＣＤＲ２にＮ結合型グリコシル化部位が認められたため、この候補物質にＳｅｒ〜Ａｌａ（Ｓ〜Ａ）の突然変異を導入してこの部位を除去した。４種類の親候補物質のＣＤＲ成熟の後、全部で１５種類の子孫候補物質（候補物質１〜１５）が同定され、これを下記実施例２で述べるように更なる特性評価に供した。１９種類の候補物質のそれぞれに存在する軽鎖及び重鎖の可変領域のリストを上記表３に示した。ここで各候補物質は、Ｆａｂであるか完全長の抗体鎖としてクローニングされた（実施例３）ものであるかに応じてｍＡｂ １〜１９又はＦａｂ １〜１９と呼ぶものとする。発現ベクターの設計のため、すべての候補物質について可変領域の成熟したアミノ末端は重鎖ではＱＶＥであり、軽鎖ではＤＩであった。これらの末端の好ましい配列は、候補配列と高い相同性を有するそれぞれの生殖細胞遺伝子内の配列である。ファミリー１７及び１８では、生殖細胞系の配列はＶＨでＱＶＱ、ＶＬでＳＹである。ファミリー１９ではこの配列はＶＨでＥＶＱ、ＶＬでＤＩである。ＳＹ配列はλサブグループ３に固有であり、アミノ末端残基としてのＳ又はＹは種間で異なることが報告されている。したがって、有名なλサブグループ１からのＱＳＶコンセンサス末端は、ファミリー１７及び１８のＶＬのＤＩＥのより好適な置換になるものと考えられる。これらの改変を、ファミリー１８から候補物質９、１０及び１２に、ファミリー１９から候補物質１４及び１５に導入した。このプロセスでは、これらの抗体のＶＨ及びＶＬ領域のコドンを最適化した。候補物質９、１０及び１１の軽鎖可変領域のＮ末端生殖細胞変異体のアミノ酸配列を配列番号２０９〜２１１に示し、候補物質９、１０、１２、１４及び１５の重鎖可変領域のＮ末端生殖細胞変異体のアミノ酸配列を配列番号２１２〜２１６にそれぞれ示す。これらの候補物質のＮ末端変異体をここでは、候補物質／ｍＡｂ／Ｆａｂ ９ＱＶＱ／ＱＳＶ、１０ＱＶＱ／ＱＳＶ、１２ＱＶＱ／ＱＳＶ、１４ＥＶＱ又は１５ＥＶＱと呼ぶ。これらのＮ末端生殖細胞変異体をｍＡｂとして発現させたところ、それぞれの親候補物質と比較した場合にＴＬＲ３への結合についても、ＴＬＲ３の生物学的活性を阻害する能力においても何らの影響を示さなかった（データは示されていない）。

（実施例２）
インビトロでのＴＬＲ３アンタゴニスト活性の判定
上記に述べた１５種類のＣＤＲ成熟させた候補物質を潜在的なヒトの治療物質として選択し、広範な結合及び中和活性を調べた。４種類の親ＦａｂであるＦａｂ １６〜１９及び１５種類のＣＤＲ成熟であるＦａｂ １〜１５又はこれらの非生殖細胞Ｖ領域変異体について、活性のアッセイ及び結果を下記に述べる。

ＮＦ−κＢ及びＩＳＲＥシグナル伝達カスケードの阻害
熱で不活化したＦＢＳを添加したＤＭＥＭ及びＧｌｕｔａＭａｘ培地（インビトロジェン社（Invitrogen）、カリフォルニア州カールスバッド）中で２９３Ｔ細胞を増殖させ、３０ｎｇのｐＮＦ−κＢ又はＩＳＲＥホタルルシフェラーゼレポータープラスミド、１３．５ｎｇのｐｃＤＮＡ３．１ベクター、５ｎｇのｐｈＲＬ−ＴＫ、及び１．５ｎｇのＦＬ ＴＬＲ３をコードしたｐＣＤＮＡ（配列番号２）をトランスフェクトした。ｐｈＲＬ−ＴＫプラスミドは、ＨＳＶ−１チミジンキナーゼプロモーターによって制御されるウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子を有している（プロメガ社（Promega）ウィスコンシン州マディソン）。ＴＬＲ３抗体を３０〜６０分インキュベートした後、ポリ（Ｉ：Ｃ）（ジー・イー・ヘルスケア社（GE Healthcare）ニュージャージー州ピスカタウェイ）を加えた。各プレートを３７度で６時間又は２４時間インキュベートした後、Ｄｕａｌ−Ｇｌｏルシフェラーゼ試薬を加えて各プレートをＦＬＵＯｓｔａｒプレートリーダーで読み取った。ホタルの相対発光量（ＲＬＵ）をウミシイタケのＲＬＵで割ることによって正規化された値（ルシフェラーゼ比）を求めた。ＴＬＲ３アゴニストであるポリ（Ｉ：Ｃ）で刺激したところ、ＮＦ−κＢ又はＩＳＲＥシグナル伝達カスケードによって刺激されるホタルルシフェラーゼの産生は、刺激前に細胞を抗ＴＬＲ３抗体（０．４、２．０及び１０μｇ／ｍｌ）とインキュベートすることによって特異的に阻害された。ＮＦ−κＢアッセイの結果を図１に示し、５４６５をポジティブコントロール（抗ヒトＴＬＲ３ Ｍａｂを中和する）として、また抗ヒト組織因子ｍＡｂ（８５９）をヒトＩｇＧ４アイソタイプコントロールとして、ホタル／ウミシイタケ比の阻害率（％）として表した。０．４〜１０μｇのｍＡｂの濃度で５０％よりも高い阻害率が得られた。ｃ１０６８及びＴＬＲ３．７は、１０μｇ／ｍｌでＴＬＲ３の生物学的活性の約３８％及び８％を阻害した。同様の結果がＩＳＲＥレポーター遺伝子アッセイで得られた（データは示されていない）。

ＢＥＡＳ−２Ｂ細胞におけるサイトカイン放出
ＢＥＡＳ−２Ｂ細胞（ＳＶ−４０で形質転換した正常なヒト気管支上皮細胞）を、Ｉ型コラーゲンをコーティングした培養皿に播種し、抗ヒトＴＬＲ３抗体の存在下又は非存在下でインキュベートした後、ポリ（Ｉ：Ｃ）を加えた。処理の２４時間後に上清を回収し、カスタム多重ビーズアッセイを用いてサイトカイン及びケモカインレベルについてアッセイして、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＣＣＬ−２／ＭＣＰ−１、ＣＣＬ５／ＲＡＮＴＥＳ及びＣＸＣＬ１０／ＩＰ−１０を検出した。結果を、０．４、２．０及び１０μｇ／ｍｌのｍＡｂ処理後の個々のサイトカイン／ケモカインの阻害率（％）として図２に示す。５４６５はポジティブコントロールであり、８５９はアイソタイプコントロールである。

ＮＨＢＥ細胞におけるサイトカイン放出
サイトカインの放出を、正常なヒト気管支上皮（ＮＨＢＥ）細胞（ロンザ社（Lonza）、メリーランド州ウォーカーズビル）においてもアッセイした。ＮＨＢＥ細胞を増殖させ、コラーゲンコーティングした培養皿に移して４８時間インキュベートした後、培地を除去して０．２ｍｌの新鮮な培地を補充した。次いで細胞を抗ヒトＴＬＲ３ ｍＡｂの存在下又は非存在下で６０分間インキュベートした後、ポリ（Ｉ：Ｃ）を加えた。２４時間後に上清を回収して−２０℃で保存するか、直ちにＩＬ−６のレベルについてアッセイした。結果を、０．００１〜５０μｇ／ｍｌの用量を用いたｍＡｂ処理後のＩＬ−６の分泌の阻害率（％）として図３にグラフで示す。５４６５はポジティブコントロールであり、８５９はアイソタイプコントロールである。多くのｍＡｂは１μｇ／ｍｌでＩＬ−６の産生の少なくとも５０％を阻害し、５μｇ／ｍｌで７５％の阻害率を達成した。

ＰＢＭＣ細胞におけるサイトカイン放出
サイトカインの放出を、ヒト末梢血単核球細胞（ＰＢＭＣ）においてもアッセイした。ヒトドナーから全血をヘパリン回収試験管に回収し、これにＦｉｃｏｌｌ−ＰａｑｕｅＰｌｕｓ溶液を下側に層を形成するようにゆっくりと加えた。試験管を遠心してＦｉｃｏｌｌの直ぐ上に白色の層を形成しているＰＢＭＣを回収して播種した。この後、ＰＢＭＣを抗ヒトＴＬＲ３ｍＡｂの存在下又は非存在下でインキュベートした後、２５μｇ／ｍｌのポリ（Ｉ：Ｃ）を加えた。２４時間後に上清を回収し、Ｌｕｍｉｎｅｘ法によってサイトカインのレベルを調べた。結果を、５４６５をポジティブコントロールとし、ｈＩｇＧ４をアイソタイプコントロールとして、ｍＡｂの単回用量（０．４μｇ／ｍｌ）を用いてＩＦＮ−γ、ＩＬ−１２及びＩＬ−６の累積阻害率（％）として図４にグラフに示す。

ＨＡＳＭ細胞におけるサイトカイン放出
簡単に述べると、ヒト気道平滑筋（ＨＡＳＭ）細胞を抗ヒトＴＬＲ３ ｍＡｂの存在下又は非存在下でインキュベートした後、５００ｎｇ／ｍｌのポリ（Ｉ：Ｃ）及び１０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦ−αの相乗的な組合わせを加えた。２４時間後に上清を回収し、Ｌｕｍｉｎｅｘ法によってサイトカインのレベルを調べた。結果を、ｍＡｂの３つの用量（０．４、２及び１０μｇ／ｍｌ）を用いてＣＣＬ５／ＲＡＮＴＥＳのレベルとして図５にグラフで示す。５４６５はポジティブコントロールであり、ｈＩｇＧ４はアイソタイプコントロールである。

ヒト細胞におけるインビトロアッセイからの結果によって、ｈｕＴＬＲ３に結合することによりサイトカイン及びケモカインの放出を低減させる本発明の抗体の能力が確認された。

（実施例３）
完全長の抗体コンストラクト
４種類の親Ｆａｂ（候補物質番号１６〜１９）及び１５種類の子孫Ｆａｂ（候補物質番号１〜１５）の重鎖をＳ２２９Ｐ Ｆｃ突然変異を有するヒトＩｇＧ４バックグラウンド上にクローニングした。候補物質９ＱＶＱ／ＱＳＶ、１０ＱＶＱ／ＱＳＶ、１２ＱＶＱ／ＱＳＶ、１４ＥＶＱ又は１５ＥＶＱを、Ｆ２３５Ａ／Ｌ２３６及びＳ２２９Ｐ Ｆｃ突然変異を有するヒトＩｇＧ４バックグラウンド上にクローニングした。

成熟した完全長の重鎖アミノ酸配列を以下のように配列番号９０〜１０２及び２１８〜２２０に示す。

発現のため、これらの重鎖はＭＡＷＶＷＴＬＬＦＬＭＡＡＡＱＳＩＱＡ（配列番号１０３）のようなＮ末端のリーダー配列を有してもよい。リーダー配列を有する候補物質１４ＥＶＱ及び１５ＥＶＱの重鎖、及び成熟型（リーダー配列を有さない）をコードするヌクレオチド配列の例を、配列番号１０４及び１０５にそれぞれ示す。同様に、発現のため、本発明の抗体の軽鎖の配列は、ＭＧＶＰＴＱＶＬＧＬＬＬＬＷＬＴＤＡＲＣ（配列番号１０６）のようなＮ末端のリーダー配列を有してもよい。リーダー配列を有するコドン最適化された候補物質１５の軽鎖、及び成熟型（リーダー配列を有さない）をコードするヌクレオチド配列の例を、配列番号１０７及び１０８にそれぞれ示す。

（実施例４）
抗ＴＬＲ３ ｍＡｂの結合の特性評価
ヒトＴＬＲ３の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）に対するｍＡｂの結合のＥＣ５０値をＥＬＩＳＡによって求めた。ヒトＴＬＲ３のＥＣＤタンパク質をＰＢＳで２μｇ／ｍｌに希釈し、１００μｌの一定分量を９６穴プレート（コーニング社（Corning Inc.）、マサチューセッツ州アクトン）の各ウェルに分配した。４℃で一晩インキュベートした後、ＰＢＳに０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０（シグマアルドリッチ社（Sigma-Aldrich））を加えた洗浄緩衝液中で３回プレートを洗った。各ウェルを、２％のＩ−Ｂｌｏｃｋ（アプライド・バイオシステムズ社（Applied Biosystems）カリフォルニア州フォスターティー）及び０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０をＰＢＳに加えた２００μｌのブロッキング溶液でブロッキングした。室温で２時間ブロッキングした後、プレートを３回洗ってから、抗ＴＬＲ３ ｍＡｂの候補物質１〜１９をブロッキング緩衝液で希釈した連続希釈液を加えた。この抗ＴＬＲ３ ｍＡｂを室温で２時間インキュベートして３回洗った。この後、ブロッキング緩衝液で１：４０００に希釈したペルオキシダーゼ接合ヒツジ抗ヒトＩｇＧ（ジー・イー・ヘルスケア社（GE Healthcare）ニュージャージー州ピスカタウェイ）を加え、室温で１時間インキュベートした後、洗浄緩衝液中で３回洗った。結合は、ＴＭＢ−Ｓ（フィッツジェラルド・インダストリーズ・インターナショナル社（Fitzgerald Industries International,Inc.）マサチューセッツ州コンコード）中で１０〜１５分間インキュベートすることによって検出した。反応を２５μｌの２Ｎ Ｈ₂ＳＯ₄によって停止させ、吸光度をＳＰＥＣＴＲＡ Ｍａｘ分光光度計（モレキュラー・デバイシーズ社（Molecular Devices Corp.,）カリフォルニア州サニーベイル）を用いて４５０ｎｍで読み取り、６５０ｎｍで差をとった。ＥＣ５０値をＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍプリズムソフトウェア（グラフパッド・ソフトウェア社（GraphPad Software, Inc.）、カリフォルニア州サンディエゴ）を使用して非線形回帰によって求めた。

ｍＡｂを２．５μｇ／ｍｌ〜０．６ｐｇ／ｍｌまで４倍ずつ希釈した１００μｌの連続希釈液とインキュベートすることにより、ｈｕＴＬＲ３に対する結合についてＥＣ５０値を求めた（表４）。抗ヒト組織因子ｍＡｂ ８５９及びｈｕ ＩｇＧ４κをネガティブコントロールとして含めた。

ｈｕＴＬＲ３ ＥＣＤに対する結合親和性もＢｉａｃｏｒｅ分析によって求めた。データ（示されていない）は、ｍＡｂ １〜１９ではｈｕＴＬＲ３ ＥＣＤに対するＫｄが１０^-8Ｍ未満であることを示した。

（実施例５）
競合的エピトープ結合
抗ＴＬＲ３抗体競合グループ又は「エピトープビン」を決定するためにエピトープ結合実験を行った。

競合的ＥＬＩＳＡを行うため、実施例１に述べるようにして作製した５μｌ（２０μｇ／ｍｌ）の精製ヒトＴＬＲ３ ＥＣＤタンパク質をＭＳＤ ＨｉｇｈＢｉｎｄプレート（メソ・スケール・ディスカバリー社（Meso Scale Discovery）、メリーランド州ゲイザースバーグ）上に２時間室温で各ウェルにコーティングした。１５０μｌの５％ ＭＳＤブロッカーＡ緩衝液（メソ・スケール・ディスカバリー社（Meso Scale Discovery））を各ウェルに加えて室温で２時間インキュベートした。プレートを０．１Ｍ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ ７．４）で３回洗った後、標識した抗ＴＬＲ３ ｍＡｂと異なる競合物質との混合液を加えた。標識した抗体（１０ｎＭ）を濃度が増大する（１ｎＭ〜２μＭ）非標識抗ＴＬＲ３抗体とインキュベートした後、２５μｌの量の混合液を指定されたウェルに加えた。室温で穏やかに振盪しながら２時間インキュベートした後、プレートを０．１Ｍ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ ７．４）で３回洗った。ＭＳＤ Ｒｅａｄ緩衝液Ｔを蒸留水で希釈し（４倍）、１５０μｌ／ウェルの量で分配してＳＥＣＴＯＲ Ｉｍａｇｅｒ ６０００によって分析した。抗体を製造者（メソ・スケール・ディスカバリー社（Meso Scale Discovery））の指示にしたがってＭＳＤ Ｓｕｌｆｏ−Ｔａｇ（商標）ＮＨＳ−エステルで標識した。

以下の抗ＴＬＲ３抗体を評価した。すなわち、ＭｏｒｐｈｏＳｙｓ Ｈｕｍａｎ Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｌｉｂｒａｒｙより得たｍＡｂ １〜１９（表３に示すもの）；ｃ１０６８（国際特許出願公開第ＷＯ０６／０６０５１３Ａ２号に述べられるもの）、ｃ１８１１（マウスＴＬＲ３タンパク質で免役したラットから作製されるハイブリドーマが産生するラット抗マウスＴＬＲ３ ｍＡｂ）、ＴＬＲ３．７（イー・バイオサイエンシーズ社（eBiosciences）、カリフォルニア州サンディエゴ、カタログ番号１４−９０３９）、及びＩＭＧ−３１５Ａ（イムジェネックス社（Imgenex）、カリフォルニア州サンディエゴより入手されるヒトＴＬＲ３アミノ酸５５〜７０（ＶＬＮＬＴＨＮＱＬＲＲＬＰＡＡＮ）に対して作製されたもの）。ｍＡｂ ９、１０、１２、１４及び１５については、変異体９ＱＶＱ／ＱＳＶ、１０ＱＶＱ／ＱＳＶ、１２ＱＶＱ／ＱＳＶ、１４ＥＶＱ、又は１５ＥＶＱをこの実験で使用した。

競合アッセイに基づき、抗ＴＬＲ３抗体を５つの異なるビンに割り当てた。ビンＡ：ｍＡｂ １、２、１３、１４ＥＶＱ、１５ＥＶＱ、１６、１９；ビンＢ：ｍＡｂ ３、４、５、６、７、８、９ＱＶＱ／ＱＳＶ、１０ＱＶＱ／ＱＳＶ、１１、１２ＱＶＱ／ＱＳＶ、１７、１８；ビンＣ：抗体Ｉｍｇｅｎｅｘ ＩＭＧ−３１５Ａ；ビンＤ：抗体ＴＬＲ３．７、ｃ１０６８；及びビンＥ：抗体ｃ１８１１。

（実施例６）
エピトープマッピング
実施例５で述べた異なるエピトープビンからの代表的な抗体を更なるエピトープマッピングのために選択した。エピトープマッピングは、ＴＬＲ３分節スワッピング実験、突然変異誘発、Ｈ／Ｄ交換、及びインシリコタンパク質−タンパク質ドッキングを含む各種のアプローチを用いて行った（Ｔｈｅ Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｍａｐｐｉｎｇ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ ６，Ｇｌｅｎ Ｅ．Ｍｏｒｒｉｓ ｅｄ．，１９９６）。

ＴＬＲ３セグメントスワッピングＴＬＲ３ヒト−マウスキメラタンパク質を用いてＴＬＲ３上の全体の抗体結合ドメインの位置を特定した。ヒトＴＬＲ３タンパク質の細胞外ドメインを３つのセグメントに分割した（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００３２５６のヒトＴＬＲ３アミノ酸配列に基づくアミノ酸番号にしたがってａａ １−２０９、ａａ ２１０−４３６、ａａ ４３７−７０８）。ヒトＴＬＲ３のアミノ酸２１０〜４３６及び４３７〜７０８を対応するマウスのアミノ酸（マウスＴＬＲ３、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿５６９０５４、アミノ酸２１１〜４３７及び４３８〜７０９）と置き換えることによってＭＴ５４２０キメラタンパク質を作製した。ヒトアミノ酸の位置４３７〜７０８をマウスＴＬＲ３のアミノ酸（マウスＴＬＲ３、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿５６９０５４、アミノ酸４３８−７０９）で置き換えることによってＭＴ６２５１キメラを作製した。コンストラクトはすべて、標準的なクローニング手法を用いてｐＣＥＰ４ベクター（ライフ・テクノロジーズ社（Life Technologies）、カリフォルニア州カールスバッド）内で作製した。各タンパク質をＨＥＫ２９３細胞内でＶ５−Ｈｉｓ６ Ｃ末端融合タンパク質として一過性に発現させ、実施例１で述べたようにして精製した。

ｍＡｂ ｃ１０６８：ｍＡｂ ｃ１０６８は、ヒトＴＬＲ３ ＥＣＤに高い親和性で結合したがマウスＴＬＲ３にはよく結合しなかった。ｃ１０６８はＭＴ５４２０及びＭＴ６２５１のいずれにも結合する能力を失ったが、このことは結合部位が野生型ヒトＴＬＲ３タンパク質のアミノ酸４３７〜７０８内に位置していることを示している。

ｍＡｂ １２ＱＶＱ／ＱＳＶ：ｍＡｂ １２ＱＶＱ／ＱＳＶは両方のキメラに結合したが、このことはｍＡｂ １２ＱＶＱ／ＱＳＶの結合部位が配列番号２に示される配列を有するヒトＴＬＲ３タンパク質のアミノ酸１〜２０９内に位置していることを示している。

インシリコタンパク質−タンパク質ドッキングｍＡｂ １５ＥＶＱの結晶構造（下記参照）及び公表されているヒトＴＬＲ３の構造（Ｂｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ Ｒｅｓ．１２：３７５〜３７８，２００６）を、ドッキングの開始モデルとして使用するためにＣＨＡＲＭｍ内でエネルギー極小化した（Ｂｒｏｏｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｏｍｐｕｔａｔ．Ｃｈｅｍ．４：１８７〜２１７，１９８３）。タンパク質ドッキングは、ＺＤＯＣＫ ２．１（Ｃｈｅｎ ａｎｄ Ｗｅｎｇ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ５１：３９７〜４０８，２００３）と同様のＺＤＯＣＫｐｒｏ １．０（アクセルリス社（Ａｃｃｅｌｒｙｓ）、カリフォルニア州サンディエゴ）により６°の角度グリッドで行った。ヒトＴＬＲ３の公知のＮ結合型グリコシル化部位であるＡｓｎ残基（Ａｓｎ ５２、７０、１９６、２５２、２６５、２７５、２９１、３９８、４１３、５０７及び６３６）（Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８１：１１１４４〜１１１５１，２００６）をＺＤＯＣＫアルゴリズムのエネルギー項によって抗体−抗原複合体界面に参加しないようにブロックした。２０００個の最初のポーズを出力してクラスター化し、ドッキングポーズをリファインしてＲＤＯＣＫで再スコアリングを行った（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ５３：６９３〜７０７，２００３）。最初のＺＤＯＣＫスコアが最も高かった２００個のポーズ及びＲＤＯＣＫの上位２００個のポーズを視覚的に調べた。

ｍＡｂ １５ＥＶＱの結晶化を２０℃で蒸気拡散法によって行った（Ｂｅｎｖｅｎｕｔｉ ａｎｄ Ｍａｎｇａｎｉ，Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ２：１６３３〜５１，２００７）。最初のスクリーニングは、９６穴プレートでＨｙｄｒａロボットを使用してセットアップした。実験は、０．５μｌのタンパク質溶液を０．５μｌのリザーバ溶液と混合した液滴で構成した。液滴は９０μｌのリザーバ溶液に対して平衡化した。５０ｍＭのＮａＣｌを含む２０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ ７．４）中のＦａｂ溶液をＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ−５ｋＤａセルを使用して１４．３ｍｇ／ｍｌにまで濃縮した。スクリーニングは、Ｗｉｚａｒｄ Ｉ ＆ ＩＩ（エメラルド・バイオシステムズ社（Emerald BioSystems）、ワシントン州ベインブリッジアイランド）及びインハウス結晶化スクリーンによって行った。

Ｘ線回折データを収集し、Ｏｓｍｉｃ（商標）ＶａｒｉＭａｘ（商標）共焦光学系、Ｓａｔｕｒｎ ９４４ ＣＣＤ検出器、及びＸ−ｓｔｒｅａｍ（商標）２０００低温冷却システムを備えたＲｉｇａｋｕ ＭｉｃｒｏＭａｘ（商標）−００７ＨＦマイクロフォーカスＸ線発生装置（リガク社（Rigaku）、テキサス州ウッドランズ）を使用して処理した。回折強度は、１／２°のイメージ当たり１２０秒の露光時間で２７０°の結晶回転にわたって検出した。Ｘ線データをＤ^*ＴＲＥＫプログラム（リガク社（Rigaku））により処理した。構造は、Ｐｈａｓｅｒ又はＣＮＸプログラム（アクセルリス社（Accelrys）、カリフォルニア州サンディエゴ）を使用して分子置換法によって決定した。原子配置及び温度因子は、すべてのデータをｍＡｂ １５については１５〜２．２オングストーム、ｍＡｂ １２については５０〜１．９オングストロームの解像度範囲で使用してＲＥＦＭＡＣによりリファインした。水分子をカットオフレベルとして３σを用いて（Ｆ_o−Ｆ_c）電子密度ピークに加えた。すべての結晶学的計算は、ＣＣＰ４プログラムパッケージ（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｐｒｏｊｅｃｔ，Ｎｕｍｂｅｒ ４．１９９４．Ｔｈｅ ＣＣＰ４ ｓｕｉｔｅ：ｐｒｏｇｒａｍｓ ｆｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ．Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ｄ５０：７６０〜７６３）により行った。モデル調整は、ＣＯＯＴプログラム（Ｅｍｓｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ｄ６０：２１２６〜２１３２，２００４）を使用して行った。

解像されたｍＡｂ １５ＥＶＱの結晶構造は、抗体結合部位が重鎖の多数の負に帯電した残基（Ｄ５２、Ｄ５５、Ｅ９９、Ｄ１０６及びＤ１０９）によって特徴付けられることを示すものであった。したがってｍＡｂ １５ＥＱＶとＴＬＲ３との間の認識には、正に帯電した残基が関与している可能性が高いと考えられた。行ったタンパク質−タンパク質ドッキングシミュレーションは、複数の正に帯電した残基を含むＴＬＲ３上の２個の大きなパッチが、抗体に対して優れた相補性を示すことを示唆するものであった。シミュレートしたＴＬＲ３−抗ＴＬＲ３抗体複合体の界面内のＴＬＲ３上の残基は、Ｒ６４、Ｋ１８２、Ｋ４１６、Ｋ４６７、Ｙ４６８、Ｒ４８８、Ｒ４８９及びＫ４９３であった。

突然変異誘発実験単一及び組合わせの突然変異をＴＬＲ３ ＥＣＤの、上記でｍＡｂ １２及びｍＡｂ １５ＥＶＱのエピトープを含んでいることが特定された領域内の表面残基に導入し、突然変異タンパク質を抗体結合について試験した。

ヒトＴＬＲ３のアミノ酸１〜７０３（ＥＣＤ）をコードするヌクレオチド配列（配列番号４、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００３２５６）を標準的なプロトコールを用いてクローニングした。突然変異体はすべて、表５ａに示されるオリゴヌクレオチドを用い、製造者のプロトコールにしたがって、Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ Ｑｕｉｃｋｃｈａｎｇｅ ＩＩ ＸＬキット（ストラタジーン社（Stratagene）、カリフォルニア州サンディエゴ）を使用した部位特異的突然変異誘発によって作製した。突然変異はＤＮＡの配列決定によって確認した。タンパク質はＣＭＶプロモーターの制御下で、ＨＥＫ２９３細胞内でＣ末端ＨＩｓ−タグ融合タンパク質として発現させ、実施例１で述べたようにして精製した。

結合アッセイヒトＴＬＲ３に対するｍＡｂ １２ＱＶＱ／ＱＳＶ及びｍＡｂ １５ＥＶＱの結合活性及び生成された変異体をＥＬＩＳＡによって評価した。プロセスを促進するため、Ｃ末端ＨｉｓタグをｍＡｂ １２ＱＶＱ／ＱＳＶとともに含むＴＬＲ３ ＥＣＤ突然変異体をコトランスフェクトすることによって、予想されるｍＡｂ １５ＥＶＱ結合部位における突然変異体をＨＥＫ細胞内で同時発現させた後、金属アフィニティークロマトグラフィーにより精製した。回収された試料は、ＴＬＲ３突然変異体とｍＡｂとの複合体であった。このアプローチは、ｍＡｂ １２ＱＶＱ／ＱＳＶ及びｍＡｂ １５ＥＶＱの結合部位が互いに離れており、したがって一方の部位における点突然変異が他方の部位のエピトープに影響する可能性が低いことから実行可能である。これらの複合体をＥＬＩＳＡ結合アッセイで使用した。ＰＢＳに加えた２０μｇ／ｍｌ野生型ＴＬＲ３ ＥＣＤ又は突然変異タンパク質を各ウェル当たり５μｌずつ、ＭＳＤ ＨｉｇｈＢｉｎｄプレート（メソ・スケール・ディスカバリー社（Meso Scale Discovery）、メリーランド州ゲイザースバーグ）にコーティングした。プレートを室温で６０分間インキュベートし、ＭＳＤブロッカーＡ緩衝液（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）、メリーランド州ゲイザースバーグ）中、４℃で一晩ブロッキングした。翌日、プレートを洗い、ＭＳＤ Ｓｕｌｆｏ−タグ標識したｍＡｂ １５ＥＶＱを５００ｐＭ〜１ｐＭの濃度で１．５時間加えた。洗浄後、ＭＳＤ Ｒｅａｄ緩衝液Ｔを使用して標識抗体を検出し、ＳＥＣＴＯＲ Ｉｍａｇｅｒ ６０００を使用してプレートを読み取った。ヒトＴＬＲ３及び変異体に対するｍＡｂ １２ＱＶＱ／ＱＳＶの結合活性を評価するため、ｍＡｂ １５ＥＶＱとの同時発現を行い、検出抗体を標識ｍＡｂ １２ＱＶＱ／ＱＳＶとした以外はｍＡｂ １５ＥＶＱについて述べたのと同様にして結合ＥＬＩＳＡを行った。

ｍＡｂ １２ＱＶＱ／ＱＳＶ：ｍＡｂ １２ＱＶＱ／ＱＳＶの結合部位は、セグメントスワップ実験において決定されたようにヒトＴＬＲ３のアミノ酸１〜１０９内に位置が特定された。以下のＴＬＲ３突然変異体について評価を行った。すなわち、Ｄ１１６Ｒ、Ｎ１９６Ａ、Ｎ１４０Ａ、Ｖ１４４Ａ、Ｋ１４５Ｅ、Ｋ１４７Ｅ、Ｋ１６３Ｅ、及びＱ１６７Ａ。野生型ＴＬＲ３及びＶ１４４Ａ突然変異体は、ｍＡｂ １２ＱＶＱ／ＱＳＶに対して同等の結合性を示した（図６Ａ）。抗体はＴＬＲ３ Ｄ１１６Ｒ突然変異体には結合せず、Ｋ１４５Ｅ突然変異体に対しては大幅に低い結合親和性を示した。したがって、ＴＬＲ３上で近接して配置されている残基Ｄ１１６及びＫ１４５は、ｍＡｂ １２ＱＶＱ／ＱＳＶに対する中心的なエピトープ部位と特定された（図７Ａ）。

ｍＡｂ １２ＱＶＱ／ＱＳＶ結合エピトープのこれら２つの重要な残基は、ＴＬＲ３のエクトドメインのＮ末端セグメントの２本差ＲＮＡ結合部位の面の近くに位置が特定されている（Ｐｉｒｈｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｓｔｒｕｃｔ．＆ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１５：７６１〜７６３，２００８）。完全なエピトープは隣接領域に、実施した突然変異分析によっては明らかにされなかった他の残基を含むと考えられる。いずれの理論に束縛されることも望むものではないが、ｍＡｂ １２ＱＶＱ／ＱＳＶがそのＴＬＲ３エピトープに結合すると、ＴＬＲエクトドメインへの２本鎖ＲＮＡの結合と直接的又は間接的に干渉することにより、受容体の２量化及び下流のシグナル伝達経路の活性化が妨害されるものと考えられる。

ｍＡｂ １５ＥＶＱ：以下のＴＬＲ３突然変異体について評価を行った。すなわち、Ｒ６４Ｅ、Ｋ１８２Ｅ、Ｋ４１６Ｅ、Ｙ４６５Ａ、Ｋ４６７Ｅ、Ｒ４８８Ｅ、Ｒ４８９Ｅ、Ｎ５１７Ａ、Ｄ５３６Ａ、Ｄ５３６Ｋ、Ｑ５３８Ａ、Ｈ５３９Ａ、Ｈ５３９Ｅ、Ｎ５４１Ａ、Ｅ５７０Ｒ、Ｋ６１９Ａ、Ｋ６１９Ｅ、２重突然変異体Ｋ４６７Ｅ／Ｙ４６８Ａ、３重突然変異体Ｔ４７２Ｓ／Ｒ４７３Ｔ／Ｎ４７４Ｓ、及び３重突然変異体Ｒ４８８Ｅ／Ｒ４８９Ｅ／Ｋ４９３Ｅ。野生型ＴＬＲ３、Ｒ６４Ｅ、Ｋ１８２Ｅ、Ｋ４１６Ｅ突然変異体及び３重突然変異体Ｔ４７２Ｓ／Ｒ４７３Ｔ／Ｎ４７４Ｓは、ｍＡｂ １５ＥＶＱに対して同等の結合性を示した（図６Ｂ及び表５ｂ）。抗体は、ＴＬＲ３突然変異体Ｋ４６７Ｅ、Ｒ４８９Ｅ、Ｋ４６７Ｅ／Ｙ４６８Ａ及びＲ４８８Ｅ／Ｒ４８９Ｅ／Ｋ４９３Ｅには結合しなかった（図６Ｂ及び６Ｃ）。残りの変異体は中間的な結合性を示し、Ｒ４８８Ｅが最も高い作用を示した。これらの突然変異体のすべてがｍＡｂ １２ＱＶＱ／ＱＳＶに結合した。これらの結果は、残基Ｋ４６７及びＲ４８９がｍＡｂ １５ＥＶＱエピトープの重要な決定因子であることを示すものである。残基Ｒ４８８もエピトープに寄与した。これらの残基は、ＴＬＲ３の同じ表面上に近接して配置されていた（図７Ａ）。この結果はまた、いずれもＫ４６７、Ｒ４８８及びＲ４８９と同じ表面上に位置する残基Ｙ４６５、Ｙ４６８、Ｎ５１７、Ｄ５３６、Ｑ５３８、Ｈ５３９、Ｎ５４１、Ｅ５７０、及びＫ６１９がエピトープに寄与することを示している。この結果は、ｍＡｂ １５ＥＶＱを用いたＨ／Ｄ交換実験によって更に支持された。図７Ａは、ｍＡｂ １２ＱＶＱ／ＱＳＶ及び１５ＥＶＱ（黒）に対する結合エピトープ部位と、Ｃ１０６８ ｍＡｂ（灰色）に対する結合エピトープ部位とがヒトＴＬＲ３の構造上で重なっていることを示している。ｍＡｂ １５ＥＶＱに対するエピトープは、残基Ｙ４６５、Ｋ４６７、Ｙ４６８、Ｒ４８８、Ｒ４８９、Ｎ５１７、Ｄ５３６、Ｑ５３８、Ｈ５３９、Ｎ５４１、Ｅ５７０、及びＫ６１９の範囲にわたっている。

Ｈ／Ｄ交換実験Ｈ／Ｄ交換において抗体の撹乱を分析するために用いた方法は、過去に述べられた方法（Ｈａｍｕｒｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １４：１７１〜１８２，２００３；Ｈｏｒｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４５：８４８８〜８４９８，２００６）と同様の方法にいくつかの改変を行ったものである。組換えＴＬＲ３ ＥＣＤ（Ｃ末端Ｈｉｓタグを付加してＳｆ９細胞で発現させて精製したもの）を重水素化水溶液中で所定の時間インキュベートして、交換可能な水素原子に重水素を取り込ませた。重水素化ＴＬＲ３ ＥＣＤを、固定されたｍＡｂ １５ＥＶＱを含むカラムで捕捉した後、水性緩衝液で洗った。逆交換したＴＬＲ３ ＥＣＤタンパク質をカラムから溶出し、重水素含有フラグメントの局在性をプロテアーゼ消化及び質量分析により調べた。基準コントロールとして、ＴＬＲ３ ＥＣＤ試料を、抗体カラムで捕捉した後に重水素化水と接触させてから実験試料と同様にして洗浄及び溶出した点を除いて同様に処理した。抗体と結合する領域は比較的交換から保護される部位であり、そのため、基準ＴＬＲ３ ＥＣＤ試料と比較して高い割合の重水素を含むものと推測された。タンパク質の約８０％を特定のペプチドにマッピングすることができた。ｍＡｂ １５ＥＶＱによるＴＬＲ３ ＥＣＤのＨ／Ｄ交換の攪乱のマップを図７Ｂに示す。分かりやすさのために、ＴＬＲ３の、ｍＡｂ １５ＥＶＱに影響される部分の周囲のセグメントのみを示した。ＴＬＲ３ ＥＣＤのアミノ末端及びカルボキシル末端に延びるタンパク質の残りの部分は大きく影響されなかった。

Ｈ／Ｄ交換実験により、配列番号２のペプチドセグメント₄₆₅ＹＮＫＹＬＱＬ₄₇₁、₅₁₄ＳＮＮＮＩＡＮＩＮＤＤＭＬ₅₂₆及び₅₂₉ＬＥＫＬ₅₃₂が、ｍＡｂ １５ＥＶＱとの結合によってＴＬＲ３上の交換が特に変化する領域として特定された。その性質上、Ｈ／Ｄ交換は線形マッピング法であり、ペプチド内のどの残基が抗体結合によって最も影響されるかを定義することは通常できない。しかしながら、Ｈ／Ｄ交換と突然変異の結果が大きく重なっていることは、図７Ａに示される表面がｍＡｂ １５の結合部位であることの更なる確証を与えるものである。この結合部位は、ｍＡｂ ｃ１０６８について過去に述べられているもの（国際特許出願公開第ＷＯ０６／０６０５１３Ａ２号）と同じ直線状アミノ酸配列領域内にあったが、まったく重ならない表面（図７Ａ）上に位置することが判明し、これらの抗体間で交叉競合が見られないことと一致する。

ｍＡｂ １５ＥＶＱ結合エピトープは、ＴＬＲ３のＣ末端セグメントの２本鎖ＲＮＡと空間的に近接していた（Ｂｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）１０３：８７９２〜８７９７，２００６；Ｒａｎｊｉｔｈ−Ｋｕｍａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２８２：７６６８〜７６７８，２００７；Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３２０：３７９〜３８１，２００８）。いずれの特定の理論に束縛されることも望むものではないが、ｍＡｂ １５ＥＶＱがそのＴＬＲ３エピトープと結合すると、リガンドである２本鎖ＲＮＡ分子及び／又は２量体のもう一方との立体障害を生じ、リガンドの結合及びリガンドによって誘発される受容体の２量化が妨げられるものと考えられる。

（実施例７）
熱安定性が向上した変異体の作製
結晶構造に基づいた機能改変（Structure-based engineering）を行って高い熱安定性を有する抗体の変異体を作製すると同時に、生物学的活性を維持して免疫原性を最小に抑えることを試みた。

ｍＡｂ １５ＥＶＱを機能改変用に選択した。免疫原性を最小に抑えるため、構造的考慮に基づいて有益であることが予想される生殖細胞の突然変異のみを行った。ｍＡｂ １５ＥＶＱのＶＬ及びＶＨの配列（それぞれ配列番号４１及び配列番号２１６）を、ＢＬＡＳＴサーチを使用してヒト生殖細胞の遺伝子と並べた。同定された最も近い生殖細胞の配列は、ＶＨ及びＶＬについてそれぞれＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＣ０９０９３及びＸ５９３１８のものであった。生殖細胞のＶＨ及びＶＬとｍＡｂ １５ＥＶＱのＶＨ及びＶＬ配列との間で以下の違いが特定された。すなわち、（ＶＨ）Ｖ３４Ｉ、Ｇ３５Ｓ、Ｆ５０Ｒ、Ａ６１Ｓ、及びＱ６７Ｈ；（ＶＬ）Ｇ３０Ｓ、Ｌ３１Ｓ、及びＡ３４Ｎ。特定された配列の違いをｍＡｂ １５ＥＶＱの結晶構造上にマッピングし、パッキング及び界面相互作用を変化させることが予測される残基を機能改変用に選択した。抗体の結晶構造（実施例６を参照）に基づいて、構造を不安定化させる可能性のある残基を特定した。（１）ＶＨのコア内のＶ３４の近くに小さな包囲空洞が特定された。この空洞は、Ｉｌｅのようなわずかに大きな側鎖が収まるだけの充分な大きさを有していた。（２）ＶＨ ＣＤＲ３のＥ９９は、水素結合ネットワークなしでＶＨ／ＶＬ界面に埋め込まれていた。Ｅ９９の負に帯電したカルボキシレート基は概ね疎水性環境にあり、周囲の残基と主としてファンデルワールス（ｖｄｓ）接触状態にあった。荷電基を埋め込むことは通常はエネルギー的に好ましくなく、したがって不安定化作用をもたらす。（３）ＶＨのＦ５０は、ＶＨ／ＶＬの界面残基である。その芳香族側鎖は嵩張るため、ペアリングに負の影響を及ぼしうる。Ｆｖの水素結合及びｖｄｗパッキングネットワークを計算し、Ｐｙｍｏｌにより視覚的に調べた（ｗｗｗ：／／＿ｐｙｍｏｌ＿ｏｒｇ）。ＶＨ及びＶＬドメイン内の埋め込まれた空洞はＣａｖｅｒ（Ｐｅｔｒｅｋ ｅｔ ａｌ．，ＢＭＣ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，７：３１６，２００６）によって計算した。分子のグラフィック図はすべてＰｙｍｏｌで作製した。Ｑｕｉｃｋ Ｃｈａｎｇｅ ＩＩ ＸＬ部位特異的突然変異誘発キット（ストラタジーン社（Stratagene）、カリフォルニア州サンディエゴ）Ｃｈａｎｇｅ−ＩＴ多重突然変異部位特異的突然変異誘発キット（ユー・エス・ビー社（USB Corporation）、オハイオ州クリーブランド）、又はＱｕｉｃｋ Ｃｈａｎｇｅ ＩＩ部位特異的突然変異誘発キット（ストラタジーン社（Stratagene）、カリフォルニア州サンディエゴ）を使用し、標準的なクローニング法によって実施例３で述べたようにして作製したＦａｂフラグメント又はＩｇＧ４完全ヒト抗体をコードした発現ベクターに突然変異を導入した。反応は、それぞれの製造者の推奨するところにしたがって行った。得られたクローンは確認のために配列決定し、得られた機能改変された変異体をｍＡｂ １５−１〜１５−９と命名した。ｍＡｂ １５ＥＶＱ及びその機能改変された変異体のＣＤＲ、軽鎖及び重鎖の可変領域、並びに完全長の重鎖及び軽鎖の配列番号のリストを表６に示す。表７は、各変異体の作製用のプライマーを示す。

ＴＬＲ３に対するｍＡｂ １５−１〜１５−９の結合性をＥＬＩＳＡ免疫アッセイによって評価した。ヒトＴＬＲ３ ＥＣＤ（１００μｌの２μｇ／ｍｌ ＴＬＲ３ ＥＣＤ）を黒色のＭａｘｉｓｏｒｂプレート（イー・バイオサイエンス社（eBioscience））に４℃で一晩結合させた。プレートを洗ってブロッキングし、希釈した抗体をウェル上に各ウェル当たり５０μｌで２重に一定分量に分配した。プレートを穏やかに振盪しながら室温で２時間インキュベートした。発光ＰＯＤ基質（ロシュ・アプライド・サイエンス社（Roche Applied Science）、マンハイム、ドイツ、カタログ番号１１ ５８２ ９５０ ００１）及びヤギ抗ヒトＦｃ：ＨＲＰ（ジャクソン・イミュノリサーチ社（Jackson ImmunoResearch）、ペンシルベニア州ウェストグローブ、カタログ番号１０９−０３５−０９８）を使用して結合を検出し、プレートをＳｐｅｃｔｒａＭａｘプレートリーダー（モレキュラー・デバイシーズ社（Molecular Devices Corp.,）カリフォルニア州サニーベイル）によって読み取った。

^*ｐ５０６９は重鎖の１個の遺伝子ｐ５０６９の可変領域をｐ５０７０のバックボーンに交換。

ＤＳＣ実験をＭｉｃｒｏＣａｌ’ｓ ＡｕｔｏＶＰ−ｃａｐｉｌｌａｒｙ ＤＳＣシステム（マイクロカル社（ＭｉｃｒｏＣａｌ，ＬＬＣ）マサチューセッツ州ノーザンプトン）で行って基準細胞と試料細胞との間の温度差を継続的に測定して出力単位に較正した。試料は１０℃〜９５℃まで６０℃／時の加熱速度で加熱した。前走査時間は１５分とし、フィルタリング時間は１０秒間とした。ＤＳＣ実験で使用した濃度は約０．５ｍｇ／ｍｌである。得られたサーモグラムの分析はＭｉｃｒｏＣａｌ Ｏｒｉｇｉｎ ７ソフトウェア（マイクロカル社（MicroCal, LLC））を用いて行った。

作製した変異体の熱安定性（Ｔｍ）をＤＳＣによって測定した（表８）。ＴＬＲ３に対する抗体の変異体の結合性は親抗体の結合性と同等であった。

（実施例８）
代理抗ＴＬＲ３抗体の作製
実施例１で作製したヒト化抗体がマウスＴＬＲ３にたいして充分な特異性もアンタゴニスト活性も有さなかったことから、ここではｍＡｂ ５４２９と命名するキメラアンタゴニストであるラット／マウス抗マウスＴＬＲ３抗体を作製して様々なインビボモデルにおいてＴＬＲ３シグナル伝達を阻害する作用について評価を行った。この代理キメラｍＡｂ ５４２９及びその親ラット抗マウスＴＬＲ３抗体ｃ１８１１はインビトロ及びインビボでマウスのＴＬＲ３シグナル伝達を阻害し、いくつかのマウスの疾患モデルにおいて発症機構を改善した。

以下に考察するデータは、有害な炎症の誘発及び持続化におけるＴＬＲ３の役割を示唆するものであり、例えば高サイトカイン血症、喘息及び気道炎症、炎症性腸疾患及び関節リウマチ、ウイルス感染、及びＩＩ型糖尿病などの急性及び慢性の炎症状態におけるＴＬＲ３アンタゴニスト及びＴＬＲ３抗体アンタゴニストの治療的使用の根拠を与えるものである。

代理ｍＡｂ ５４２９の作製
ＣＤラットを常法によって作製した組換えマウスＴＬＲ３エクトドメイン（配列番号１６２のアミノ酸１〜７０３、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿５６９０５４）で免疫した。マウスＴＬＲ３に特異的な抗体価を示す２匹のラットからのリンパ球を融合してＦＯミエローマとした。マウスＴＬＲ３に反応性を示すモノクローナル抗体群を同定し、マウスルシフェラーゼレポーター及びマウス胚性線維芽細胞アッセイにおいてインビトロでのアンタゴニスト活性について試験を行った。ハイブリドーマ株Ｃ１８１１Ａを更なる研究のために選択した。機能する可変領域遺伝子をハイブリドーマによって分泌されるｍＡｂ ｃ１８１１から配列決定した。次いでクローニングされた重鎖及び軽鎖可変領域遺伝子をプラスミド発現ベクターにそれぞれ挿入したところ、このベクターによってｍＡｂ ５４２９と指定するキメララット／ＢａｌｂＣ ｍｕＩｇＧ１／κ ｍＡｂを常法によって作製するためのコード配列が与えられた。抗体を実施例３で述べたようにして発現させた。ｍＡｂ ５４２９の重鎖及び軽鎖可変領域のアミノ酸配列を配列番号１６４及び配列番号１６３にそれぞれ示し、重鎖及び軽鎖の完全長の配列を配列番号１６６及び配列番号１６５にそれぞれ示す。ｍＡｂ ｃ１８１１の重鎖及び軽鎖の完全長の配列を配列番号１６８及び配列番号１６７にそれぞれ示す。

ｍＡｂ ５４２９の特性評価
ｍＡｂ ５４２９を、ＴＬＲ３シグナル伝達に対する中和能力について一連のインビトロアッセイにおいて特性評価した。活性のアッセイ及び結果を以下に述べる。

マウスルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイ
マウスＴＬＲ３のｃＤＮＡ（配列番号１６１、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿１２６１６６）をマウス脾臓ｃＤＮＡ（ビー・ディー・バイオサイエンシーズ社（BD Biosciences）、マサチューセッツ州ベッドフォード）からＰＣＲによって増幅し、標準的な方法によってｐＣＥＰ４ベクター（ライフ・テクノロジーズ社（Life Technologies）、カリフォルニア州カールスバッド）にクローニングした。２００μｌのＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、完全ＤＭＥＭ中、４×１０⁴細胞／ウェルの濃度で９６穴白色透明底プレートに播種し、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（インビトロジェン社（Invitrogen）、カリフォルニア州カールスバッド）を使用し、３０ｎｇのｐＮＦ−κＢホタルルシフェラーゼ（ストラタジーン社（Stratagene）、カリフォルニア州サンディエゴ）又は３０ｎｇのｐＩＳＲＥホタルルシフェラーゼ（ビー・ディー・バイオサイエンシーズ社（BD Biosciences）、マサチューセッツ州ベッドフォード）、５ｎｇのｐｈＲＬ−ＴＫコントロールウミシイタケルシフェラーゼ（プロメガ社（Promega）ウィスコンシン州マディソン）レポータープラスミド、１．５ｎｇの完全長マウスＴＬＲ３をコードしたｐＣＥＰ４、及び１３．５ｎｇの空のｐｃＤＮＡ３．１ベクター（ライフ・テクノロジーズ社（Life Technologies）、カリフォルニア州カールスバッド）を使用して翌日トランスフェクションに使用して、全ＤＮＡ量を５０ｎｇ／ウェルとした。トランスフェクションの２４時間後、細胞を３７℃で３０分〜１時間、抗マウスＴＬＲ３抗体と新鮮な無血清ＤＭＥＭ中でインキュベートした後、０．１又は１μｇ／μｌのポリ（Ｉ：Ｃ）を加えた。２４時間後にＤｕａｌ−Ｇｌｏルシフェラーゼアッセイシステム（プロメガ社（Promega）、ウィスコンシン州マディソン）を使用してプレートを収穫した。相対的な光量単位を、ＦＬＵＯｓｔａｒ ＯＰＴＩＭＡ多重検出リーダーを使用し、ＯＰＴＩＭＡソフトウェア（ベー・エム・ゲー・ラブテック社（BMG Labtech GmbH）、ドイツ）により測定した。標準化された値（ルシフェラーゼ比）はホタルの相対光量単位（ＲＬＵ）をウミシイタケのＲＬＵで割ることによって得た。ｍＡｂ ５４２９、並びにその親ｍＡｂ ｃ１８１１及びｍＡｂ １５（表３ａ）は、用量依存的にポリ（Ｉ：Ｃ）誘発ＮＦ−κＢ及びＩＳＲＥ活性化を低下させ（図８Ａ及び８Ｂ）、ＴＬＲ３の活性を中和するこれらの抗体の能力が実証された。ＩＳＲＥアッセイにおいて測定されたＩＣ５０は、ｍＡｂ ５２４９、ｍＡｂ １５及びｍＡｂ ｃ１８１１についてそれぞれ０．５、２２、及び０．７μｇ／ｍｌであった。

マウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）アッセイ
Ｃ５７ＢＬ／６ ＭＥＦ細胞をアーティス・オプティマス社（Artis Optimus）より入手した（Ｏｐｔｉ−ＭＥＦ（商標）Ｃ５７ＢＬ／６−０００１）。細胞を、２００μｌのＭＥＦ培地（ｇｌｕｔａｍａｘ、１０％熱失活ＦＢＳ、１ｘ ＮＥＡＡ、及び１０μｇ／ｍｌゲンタマイシンを加えたＤＭＥＭ）中、９６穴平底プレート（ビー・ディー・ファルコン社（BD Falcon））に２００００細胞／ウェルで播種した。インキュベーションはすべて、３７℃／５％ＣＯ₂で行った。播種の２４時間後に、ｍＡｂ ５４２９又はｍＡｂ ｃ１８１１を各ウェルに加えた。プレートをｍＡｂと１時間インキュベートした後、各ウェルにポリ（Ｉ：Ｃ）を１μｇ／ｍｌで加えた。２４時間のインキュベーションの後、上清を回収した。製造者のプロトコールにしたがってビーズキット（インビトロジェン社（Invitrogen）、カリフォルニア州カールスバッド）を使用してサイトカインレベルを求めてＣＸＣＬ１０／ＩＰ−１０を検出した。結果をＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用してグラフ化した。いずれの抗体もポリ（Ｉ：Ｃ）誘発ＣＸＣＬ１０／ＩＰ−１０レベルを用量依存的に低下させ、これらの抗体が内因性のＴＬＲ３を中和してＴＬＲ３シグナル伝達を阻害する能力が実証された（図９）。

フローサイトメトリー−表面染色
各群１０匹ずつのＣ５７ＢＬ／６及びＴＬＲ３ノックアウトマウス（ＴＬＲ３ＫＯ）（Ｃ５７ＢＬ／６バックグラウンド；雌、８〜１２週齢、エース・アニマルズ社（Ace Animals,Inc.））に１ｍｌの３％チオグリコレート培地（シグマ社（Sigma））を腹腔内投与し、９６時間後にマウスを安楽死させ、各マウスからの腹膜を１０ｍｌの滅菌ＰＢＳで洗浄した。チオグリコレートにより腹膜に誘導されたマクロファージをＰＢＳ中に再懸濁し、細胞の生存率をＴｒｙｐａｎ Ｂｌｕｅ染色によって評価した。細胞を遠心してペレットとし、２５０μｌのＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ−Ｃａ²⁺−Ｍｇ²⁺、１％熱失活ＦＢＳ、０．０９％アジ化ナトリウム）に再懸濁し、濡れた氷上に保持した。ＣＤ１６／３２試薬（イー・バイオサイエンス社（eBioscience））を１０μｇ／１０⁶細胞で１０分間使用してマクロファージ上のＦｃ受容体をブロッキングした。細胞を１００μｌ／ウェル中、１０⁶細胞で分配して表面染色を行った。Ａｌｅｘａ−Ｆｌｕｏｒ ６４７（モレキュラー・プローブズ社（Molecular Probes））−接合ｍＡｂ ｃ１８１１及びｍＡｂ １６７９（ＴＬＲ３特異性を有さないことからアイソタイプコントロールとして用いられるラット抗マウスＴＬＲ３抗体）を０．２５μｇ／１０⁶細胞で加え、氷上、暗所で３０分間インキュベートした。細胞を洗い、２５０μｌのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁した。生存率染色として７−ＡＡＤ（ビー・ディー・バイオサイエンシーズ社（BD Biosciences）、マサチューセッツ州ベッドフォード）を５μｌ／ウェルで３０分を超えないように加えた後、ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒで試料を取得して死細胞集団を検出した。試料はＣｅｌｌ Ｑｕｅｓｔ Ｐｒｏソフトウェアを使用してＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒによって採取した。ＦＣＳ Ｅｘｐｒｅｓｓを使用して収集したデータをヒストグラムを作成することによって分析した。

Ｃ５７ＢＬ／６及びＴＬＲ３ノックアウトマウスからのマウスチオグリコレート誘導腹膜マクロファージに対するｍＡｂ ｃ１８１１の結合性をフローサイトメトリーにより評価して結合特異性を調べた。ｍＡｂ ５４２９は、このキメラ抗体のＦｃ領域が非特異的結合に寄与することが予想されることからこのアッセイでは用いなかった。ｍＡｂ ｃ１８１１はＴＬＲ３ノックアウトマクロファージに対する結合性を示さず、これはＴＬＲ３に対するこのｍＡｂの特異性を示唆するものである（図１０）。ｍＡｂ ｃ１８１１と同じ結合領域を有するｍＡｂ ５４２９は、ｍＡｂ ｃ１８１１と同じ結合特異性を有するものと考えられる。

（実施例９）
ＴＬＲ３抗体アンタゴニストはＴＬＲ３媒介性全身性炎症から防御する
モデル
ポリ（Ｉ：Ｃ）誘発全身性サイトカイン／ケモカインモデルをＴＬＲ３媒介性全身性炎症のモデルとして用いた。このモデルでは、腹腔内投与したポリ（Ｉ：Ｃ）（ＰＩＣ）により、ＴＬＲ３によって一部媒介される全身性のサイトカイン及びケモカイン応答を誘導した。

雌Ｃ５７ＢＬ／６マウス（８〜１０週齢）又は雌ＴＬＲ３ノックアウトマウス（Ｃ５７ＢＬ／６バックグラウンド；８〜１０週齢、エース・アニマルズ社（Ace Animals,Inc.））に、ｍＡｂ ５４２９を０．５ｍｌのＰＢＳ中、１０、２０又は５０ｍｇ／ｋｇで、ｍＡｂ ｃ１８１１を、０．５ｍｌのＰＢＳ中、２、１０又は２０ｍｇ／ｋｇで、又は０．５ｍｌのＰＢＳを単独（溶媒コントロール）で皮下に投与した。抗体投与の２４時間後、マウスに、０．１ｍｌのＰＢＳに加えた５０μｇのポリ（Ｉ：Ｃ）（アマシャム社（Amersham）カタログ番号２６−４７３２、ロット番号ＩＨ０１５６）を腹腔内投与した。ポリ（Ｉ：Ｃ）チャレンジの１及び４時間後に後眼窩より血液を採取した。全血より血清を調製してＬｕｍｉｎｅｘによりサイトカイン及びケモカインの濃度について分析した。

結果
腹腔内投与されたポリ（Ｉ：Ｃ）は、ＴＬＲ３ノックアウト動物におけるケモカイン及びサイトカイン群の産生が大幅に低減されたことによって示されるように、ＴＬＲ３によって一部媒介される全身性のサイトカイン及びケモカイン応答を誘導した（表９Ａ）。ＴＬＲ３依存性のポリ（Ｉ：Ｃ）誘導メディエーターは、ポリ（Ｉ：Ｃ）チャレンジの１時間後では、ＩＬ−６、ＫＣ、ＣＣＬ２／ＭＣＰ−１及びＴＮＦ−αであり、ポリ（Ｉ：Ｃ）チャレンジの４時間後では、ＩＬ−１α、ＣＣＬ５／ＲＡＮＴＥＳ及びＴＮＦ−αであった。ｍＡｂ ｃ１８１１及びｍＡｂ ５４２９はいずれもこれらのＴＬＲ３依存性メディエーターのレベルを大幅に低下させ、これらの抗体がインビボでＴＬＲ３シグナル伝達を低減させる能力が実証された（表９Ｂ）。表９の値は、１群当たり６匹の動物の平均のサイトカイン又はケモカイン濃度±平均値の標準誤差（ＳＥＭ）をｐｇ／ｍｌで示したものである。これらのデータは、ＴＬＲ３の拮抗作用が、サイトカインストーム又は致死的ショックなどの状態における過剰なＴＬＲ３媒介サイトカイン及びケモカインレベルを低減させるうえで有用となりうることを示唆するものである。

（実施例１０）
ＴＬＲ３抗体アンタゴニストは気道過敏症を軽減する
モデル
気道過敏症をポリ（Ｉ：Ｃ）によって誘発させた。

雌Ｃ５７ＢＬ／６マウス（１２週齢）又は雌ＴＬＲ３ノックアウトマウス（Ｃ５７ＢＬ／６バックグラウンド；１２週齢、エース・アニマルズ社（Ace Animals,Inc.））をイソフルランで麻酔し、５０μｌの滅菌ＰＢＳに加えたポリ（Ｉ：Ｃ）を数回の投与（１０〜１００μｇ）で鼻腔内投与した。各投与の間に２４時間の休止時間を置いてポリ（Ｉ：Ｃ）（又はＰＢＳ）を３回マウスに投与した。最後のポリ（Ｉ：Ｃ）（又はＰＢＳ）の投与の２４時間後に、全身プレチスモグラフィー（ブクスコ・システム社（BUXCO system））を用いて肺機能及びメタコリンに対する気道過敏症を測定した。マウスを全身プレチスモグラフチャンバに入れ、少なくとも５分間順応させた。ベースラインの読み取りの後、増加する量の霧状化したメタコリン（シグマ社（Sigma）、ミズーリ州セントルイス）にマウスを暴露した。霧状化メタコリンを２分間投与した後、５分間のデータ収集時間、その後、１０分間の休止時間を置いた後、メタコリンの用量を増大させた後続のチャレンジを行った。空気流の抵抗の増加をエンハンストポーズ（Enhanced Pause）（Ｐｅｎｈ）として測定し、５分間の記録時間にわたった平均のＰｅｎｈ値として表した（ブクスコ・システム社（BUXCO system））。肺機能の測定の後、マウスを安楽死させ、肺にカニューレを挿管した。肺に１ｍｌのＰＢＳを注入し、流出液を回収することによって気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）を行った。肺組織を切除して凍結した。ＢＡＬ液を遠心（１２００ｒｐｍ、１０分）し、細胞を含まない上清を回収して−８０℃で分析を行うまでの間保存した。細胞ペレットを２００μｌのＰＢＳに再懸濁して全細胞計数及び分画別の細胞計数を行った。製造者のプロトコール及びＭｕｌｔｉｐｌｅｘ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙキット（ミリポア社（Millipore）、マサチューセッツ州ビレリカ）にしたがって多重アッセイを行った。

結果
過去の観察により、ポリ（Ｉ：Ｃ）の鼻腔内投与はマウスの肺機能にＴＬＲ３によって媒介される障害を誘発し、全身プレチスモグラフィー（ブクスコ社（BUXCO））におけるベースラインのエンハンストポーズ（ＰｅｎＨ）測定値が高くなり、霧状化されたメタコリンに対する応答性が高くなることが示されている（国際特許出願公開第ＷＯ０６／０６０５１３Ａ２号）。肺機能のこうした障害は、肺への好中球の動員、及び肺における炎症性サイトカイン／ケモカインのレベルの上昇をともなった。この実験では、肺機能におけるポリ（Ｉ：Ｃ）誘発障害におけるｍＡｂ １８１１及びｍＡｂ ５４２９の作用を、ポリ（Ｉ：Ｃ）チャレンジに先立ってそれぞれの抗体を５０ｍｇ／ｋｇで皮下投与することによって評価した。

ＴＬＲ３によって媒介される肺機能の障害は、ポリ（Ｉ：Ｃ）チャレンジに先立って動物をＴＬＲ３抗体アンタゴニストで処置することによって大幅に軽減された。ＴＬＲ３によって媒介される、ベースラインＰｅｎＨ及びメタコリンに対する気道の感受性の増大は、抗ＴＬＲ３抗体で処置された動物では防止された（図１１）。更に、ＴＬＲ３によって媒介される、マウスの肺への好中球の動員及び気道におけるケモカインの生成は、抗ＴＬＲ３抗体で処置した動物では低減された。好中球の数（図１２）及びＣＸＣＬ１０／ＩＰ−１０のレベル（図１３）は、回収した気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）から測定した。この実験を少なくとも３回繰り返して同様の結果を得た。図１１、１２、及び１３に示されるデータは、１つの代表的な実験からのものである。各記号は１匹のマウスからのデータポイントを表し、横棒線は群の平均を示す。この実験によって、使用したモデルにおいて全身投与されたＴＬＲ３抗体アンタゴニストが肺に達し、ＴＬＲ３によって媒介される肺機能の障害、気道内への好中球の浸潤、ケモカインの生成及び気道の炎症を軽減したことが示された。したがって、ＴＬＲ３アンタゴニストは、喘息、アレルギー性鼻炎、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、及び嚢胞性線維症などの、気道過敏症によって特徴付けられる呼吸器疾患の治療又は予防に有用でありうる。

（実施例１１）
ＴＬＲ３抗体アンタゴニストは炎症性腸疾患から防御する
モデル
ＤＳＳ大腸炎モデルを炎症性腸疾患のモデルとして用いた。

雌Ｃ５７ＢＬ／６マウス（８週齢未満）又は雌ＴＬＲ３ノックアウトマウス（Ｃ５７ＢＬ／６バックグラウンド；８週齢未満で体重１６．５ｇ〜１８ｇ、エース・アニマルズ社（Ace Animals,Inc.））にγ線照射した餌を−１日目から与えた。ＤＳＳ（硫酸デキストラン）（エム・ピー・バイオメディカルズ社（MP Biomedicals）、オハイオ州オーロラ、カタログ番号：１６０１１０；３５〜５０ｋＤａ；硫黄１８〜２０％、ロット番号：８２４７Ｊ）をオートクレーブした酸性化飲用水で５％の最終濃度に希釈した。ＤＳＳ水を５日間投与し、その後、普通の水に代えた。マウスには実験全体を通じて自由に水を飲ませた。すべての水ボトルの重量を毎日測定して水の消費量を記録した。０、２、及び４日目にマウスに５ｍｇ／ｋｇ（０．１ｍｌ ＰＢＳに０．１ｍｇを加えた）のｍＡｂ ５４２９、マウス抗ＴＮＦ−α抗体、又はコントロールとしてのＰＢＳを腹腔内投与した。マウスを実験の全体を通じて毎日監視し、０〜４日目及び７日目に体重を測定した。マウスを実験の２日目及び７日目に安楽死させた。腹腔を開き、上行結腸を盲腸と接合する位置で切断した。結腸を採取し、１０％中性緩衝ホルマリン中で固定した。結腸をパラフィンに埋め込み、薄片にスライスし、Ｈ＆Ｅ染色（カルテック・モレキュラー・ラブズ社（Qualtek Molecular Labs）、カリフォルニア州サンタバーバラ）した。下記に述べるように獣医病理学者によって盲検により結腸の組織病理学的評価を行った（パソメトリクス社（PathoMetrix）カリフォルニア州サンホセ）。

組織病理学的評価
大腸、結腸、及び直腸の２つの切片を評価し、以下の変化についてスコア化した。すなわち、（ｉ）単一の細胞の壊死、（ｉｉ）上皮の潰瘍形成、（ｉｉｉ）ｊ上皮の脱落、（ｉｖ）陰窩腫瘍、（ｖ）細胞増殖、（ｖｉ）陰窩細胞増殖、（ｖｉｉ）粘膜固有層における肉芽組織形成、（ｖｉｉｉ）粘膜下組織における肉芽組織、（ｉｘ）粘膜下炎症細胞の浸潤物、好中球優勢、及び（ｘ）粘膜下浮腫。

重篤度の単一の全体的スコアを以下の基準に基づいて与えた。すなわち、
０−所見を認めず。
１−軽度、限局性、又は時折認められる。
２−軽度、多病巣である。
３−中度、頻繁だが限定された領域に認められる。
４−重度、提供された組織の多くの領域又は広範囲に認められる。
５−極めて重度、提供された組織の大部分に拡がっている。

結果
過去の観察によれば、ＴＬＲ３ノックアウト動物は、ＤＳＳの摂取によって誘発された炎症性腸疾患のモデルにおいて野生型マウスと比較して大幅に軽減された組織病理学的所見を示すことが実証されており（国際特許出願公開第ＷＯ０６／６０５１３Ａ２号）、このことはＴＬＲ３シグナル伝達がこのモデルにおける病因に一定の役割を有することを示唆するものである。壊死細胞から放出された共生細菌のＲＮＡ又は哺乳動物ＲＮＡがＴＬＲ３シグナル伝達を刺激する内因性のリガンドとして働きうることが報告されており（Ｋａｒｉｋｏ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ２３１６５〜２３１１７５ ２００５；Ｋａｒｉｋｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９：１２５４２〜１２５５０ ２００４）、したがって腸内の内因性リガンドによるＴＬＲ３刺激はＤＳＳ大腸炎モデルにおいて炎症を促進及び持続化させうるものである。

化合物組織病理学スコア（図１４）によって評価されるように、ＤＳＳに曝露した動物における疾患重篤度は、抗ＴＬＲ３抗体による処置によって改善された。図１４は、疾患重篤度スコアについて平均、標準偏差及び９５％信頼区間を横棒線として示している。抗ＴＬＲ３抗体で処置した野生型のＤＳＳ曝露動物では、非処置の野生型動物と比較してスコアの有意な低下が認められた（ｐ＜０．０５）。ＤＳＳに曝露したＴＬＲ３ノックアウト動物は、ＤＳＳによって誘発される変化から防御された。抗マウスＴＮＦ−α ｍＡｂを投与したＤＳＳ曝露動物では、ＤＳＳモデルにおいて組織病理学的所見の改善は認められなかった。したがって、ＤＳＳモデルは、抗ＴＮＦ−αによる治療に応答しないヒト患者集団を対象とする治療法の評価において有用であることが考えられ、抗ＴＬＲ３抗体を中和することは、抗ＴＮＦ−αによる治療に応答しない炎症性腸疾患の患者にとって利益となる可能性を有すると考えられる。

モデル
Ｔ細胞移植モデルを炎症性腸疾患のモデルとして用いた。このモデルでは、免疫応答能のあるマウスから得た制御性Ｔ細胞を含まないナイーブＴ細胞（腸粘膜の抗原提示細胞を攻撃する）の集団を移植することによってＳＣＩＤマウスに腸の炎症を誘発した。

ナイーブＴ細胞（ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＢ^high Ｔ細胞）をＳＣＩＤレシピエントに腹腔内注射することによって慢性大腸炎を誘発した。マウスに、ＰＢＳ（５００μｌ／マウスを腹腔内投与；溶媒コントロール）、ｍＡｂ ５４２９（０．１ｍｇ／マウスを腹腔内投与）、又は抗−ＴＮＦ−α抗体（０．０５ｍｇ／マウスを腹腔内投与；ポジティブコントロール）のいずれかを、Ｔ細胞の移植４８時間後から開始して毎週２回、８週間の実験期間全体を通じて投与した。Ｔ細胞の移植から８週間後（又はマウスが初期の体重の１５％以上を失った時点）に、動物を安楽死させて結腸を取り出した。結腸を固定し、パラフィンに埋め込んでＨ＆Ｅ染色した。組織病理学的所見（細胞浸潤、陰窩腫瘍、上皮びらん、杯細胞喪失、及び腸壁の肥厚）を盲検的に定量的に評価した。

結果
コントロール動物と比較した場合の組織病理学的スコアの合計の有意な低下（ｐ＜０．０５）（図１５Ａ）によって評価されるように、疾患重篤度はＴ細胞移植を受けた動物で抗ＴＬＲ３抗体による処置によって改善された。スコアの合計には、陰窩腫瘍、潰瘍形成、好中球流入、杯細胞喪失、異常陰窩、粘膜固有層の炎症、及び経壁併発（transmural involvement）を評価した。陰窩腫瘍、潰瘍形成、及び好中球流入では有意な低下が認められた（いずれもｐ＜０．０５）（図１５Ｂ）。抗ＴＮＦα抗体を、最適な効果を与えることが知られている用量でポジティブコントロールとして用いた。

ＤＳＳ及びＴ細胞移植モデルという２つの広く知られた炎症性腸疾患のモデルを用いた実験により、全身投与されたＴＬＲ３抗体アンタゴニストは腸粘膜に達し、２つの異なる病因機構によって誘発された消化管の炎症を軽減させることが実証された。したがって、ＴＬＲ３アンタゴニストは、抗ＴＮＦα不応性の症例及び消化管の他の免疫媒介性の病態を含む炎症性腸疾患の治療に有益であると考えられる。

（実施例１２）
ＴＬＲ３抗体アンタゴニストはコラーゲン誘発関節炎から防御する
モデル
コラーゲン誘発関節炎（ＣＩＡ）モデルを関節リウマチのモデルとして用いた。

雄Ｂ１０ＲＩＩＩマウス（６〜８週齢、ジャクソン・ラボラトリーズ社（Jackson Labs））を１群当たり１５匹（関節炎群）及び１群当たり４匹（コントロール群）の群に分けた。関節炎群をイソフルランで麻酔し、ＩＩ型コラーゲン（エラスチン・プロダクツ社（Elastin Products））、及び結核菌（M．tuberculosis）（ディフコ社（Difco））を添加したフロイント完全アジュバントを０及び１５日目に投与した。１２日目にＩＩ型コラーゲン関節炎を発症したマウスを治療群に体重についてランダム化し、ｍＡｂ ５４２９（２５ｍｇ／ｋｇ）、ネガティブコントロール抗体としてＣＶＡＭ（マウスに既知の特異性を示さない組換えｍＡｂ）（５ｍｇ／ｋｇ）、又は抗ＴＮＦ−α抗体（５ｍｇ／ｋｇ、ポジティブコントロール）を、１２、１７、及び２２日目（ｄ１２、ｄ１７、ｄ２２）に皮下投与（ＳＣ）した。更に、マウスのコントロール群に溶媒（ＰＢＳ）又はデキサメタゾン（０．５ｍｇ／ｋｇ、Ｄｅｘ、基準化合物）を１２〜２５日目まで毎日（ＱＤ）皮下投与（ＳＣ）した。動物を１２〜２６日まで毎日観察した。前足及び後足を臨床スコアシステム（下記に示す）によって評価した。実験２６日目に動物を安楽死させ、組織病理学的所見を盲検的に評価した（下記にスコアシステムを述べる）。有効性評価は、動物の体重及び臨床的関節炎スコアに基づいて行った。すべての動物が実験終了時まで生存した。

前足及び後足の臨床的スコア基準
０−正常
１−後足又は前足関節が冒されるか、わずかなびまん性紅斑及び腫脹。
２−後足又は前足関節が冒されるか、軽度のびまん性紅斑及び腫脹。
３−後足又は前足関節が冒されるか、中度のびまん性紅斑及び腫脹。
４−顕著なびまん性紅斑及び腫脹又は４本の指の関節が冒される。
５−足全体に重篤なびまん性紅斑及び重篤な腫脹、指を曲げられない。

ＩＩ型コラーゲン関節炎を有するマウス関節の組織病理学的スコアリング方法
ＩＩ型コラーゲン関節炎の病変を有するマウスの足又は足関節をスコア化する場合、変化の重篤度及び冒された個々の関節の数を考慮する。中手骨／中足骨／指又は足根骨／脛足根骨の多数の関節の可能性のうち、１〜３個のみの足又は足関節の関節が冒されている場合には、変化の重篤度に応じて下記のパラメータの１、２又は３の最大スコアが任意に与えられる。２個よりも多い関節が関与している場合には、最も重く冒された／大多数の関節に下記の基準を適用する。

足スコアの臨床データは、１〜１５日目についてＡＵＣによて分析し、コントロールからの阻害率（％）を計算した。

炎症
０−正常
１−冒された関節の滑膜及び関節周囲組織への炎症細胞の最小の浸潤。
２−足の場合には冒された関節に限定された軽度の浸潤。
３−足の場合には冒された関節に限定された中度の浸潤。
４−大部分の領域を侵す、顕著な浮腫をともなう顕著な浸潤。
５−重篤な浮腫をともなう重篤なびまん性浸潤。

パンヌス
０−正常
１−軟骨及び肋軟骨下骨へのパンヌスの最小の浸潤。
２−冒された関節の硬組織の周辺帯の破壊をともなう浸潤。
３−冒された関節の中度の高組織破壊をともなう中度の浸潤。
４−大部分の関節で顕著な関節構造の破壊をともなう顕著な浸潤。
５−全体的又はほぼ全体的な関節構造の破壊をともなう重篤な浸潤がすべての関節を冒す。

軟骨の傷害
０−正常
１−冒された関節に明らかな軟骨細胞の損失もコラーゲン破壊も認めない、トルイジンブルー染色の最小〜軽度の損失。
２−冒された関節に限局性の軽度（表在性）の軟骨細胞の損失及び／又はコラーゲン破壊を認める、トルイジンブルー染色の軽度の損失。
３−冒された関節に多病巣性の中度（深部又は中間層）の軟骨細胞の損失及び／又はコラーゲン破壊を認める、トルイジンブルー染色の中度の損失。
４−大部分の関節に多病巣性の顕著な（深部〜深層）軟骨細胞の損失及び／又はコラーゲン破壊を認める、トルイジンブルー染色の顕著な喪失。
５−すべての関節に多病巣性の重度（深部〜タイドマーク）の軟骨細胞の損失及び／又はコラーゲン破壊を認める、トルイジンブルー染色の重度の喪失。

骨吸収
０−正常
１−小さい範囲の吸収を認める最小の程度。低倍率では容易に確認できず、冒された関節に破骨細胞をほとんど認めない。
２−より多くの範囲の吸収を認める軽度。低倍率では容易に確認できず、冒された関節により多くの破骨細胞を認める。
３−皮質の厚さ全体の欠損をともなわない髄様骨梁（medullary trabecular）及び皮質骨の明らかな吸収を認める中度。一部の髄様骨梁が喪失し、低倍率で病変が明らかに確認できる。冒された関節により多くの破骨細胞を認める。
４−残存する皮質表面の断面の歪みをしばしばともなう、皮質骨の厚さ全体の欠損をともなう顕著な程度。髄様骨の顕著な損失、多数の破骨細胞を認める。大部分の関節が冒される。
５−皮質骨の厚さ全体の欠損及びすべての関節の関節構造の破壊をともなう重度。

結果
デキサメタゾン（Ｄｅｘ）及び抗マウスＴＮＦ−α抗体をポジティブコントロールとして用い、ＰＢＳを溶媒コントロールとして用い、ＣＶＡＭをネガティブコントロール抗体として用いた。すべての処置は、実験の１２日目の関節疾患が進行する間に開始した。溶媒で処置した疾患コントロール動物では疾患発症率は実験２２日目までに１００％となった。溶媒又はＣＶＡＭ抗体で処置したネガティブコントロール群では臨床スコアは最も高かった。Ｄｅｘ（ｄ１８〜ｄ２６についてｐ＜０．０５）、５ｍｇ／ｋｇの抗ＴＮＦ−α抗体（ｄ１８〜２６についてｐ＜０．０５）、又は２５ｍｇ／ｋｇのｍＡｂ ５４２９（ｄ１８〜ｄ２３及びｄ２５〜ｄ２６についてｐ＜０．０５）で処置した各群では有意に低い臨床スコアが認められた（図１６）。曲線下面積（ＡＵＣ）として表した臨床的関節炎スコアは、２５ｍｇ／ｋｇのｍＡｂ ５４２９（低下率４３％）、５ｍｇ／ｋｇの抗ＴＮＦ−α抗体（５２％）、又はＤｅｘ（６９％）による処置により、溶媒コントロールと比較して有意に低下した。図１７は、各群についてＡＵＣの平均及び標準偏差を示す。

各処置の組織病理学的作用についても評価を行った。足の骨吸収は、２５ｍｇ／ｋｇのｍＡｂ ５４２９（低下率４７％）による処置によって溶媒コントロールと比較して有意に低下した。．５ｍｇ／ｋｇの抗ＴＮＦ−α抗体で処置したポジティブコントロールマウスでは、足の炎症（３３％）、軟骨傷害（３８％）、及び足スコアの合計（３７％）は有意に低下した。Ｄｅｘによる処置によって、足の組織病理学的パラメータのすべてが有意に低下した（合計スコアにおいて７３％の低下率）。

これらのデータは、ＴＬＲ３抗体アンタゴニストが、ＣＩＡモデルにおいて臨床的及び組織病理学的疾患症状を改善することを示すものであり、関節リウマチの治療におけるＴＬＲ３アンタゴニストの使用を示唆するものである。

（実施例１４）
ＴＬＲ３抗体アンタゴニストは急性致死性ウイルス感染から防御する
モデル
インフルエンザＡウイルスチャレンジモデルを急性致死性ウイルス感染のモデルとして使用した。

−１、４、８及び１２日目に雌Ｃ５７ＢＬ／６マウス（１２週齢）又は雌ＴＬＲ３ノックアウトマウス（Ｃ５７ＢＬ／６バックグラウンド；１２週齢、エース・アニマルズ社（Ace Animals,Inc.）、１群当たり１５匹のマウス）に２０ｍｇ／ｋｇのｍＡｂ ５４２９又はＰＢＳ単独を皮下投与した。０日目にイソフルランでマウスを麻酔し、インフルエンザＡ／ＰＲ／８／３４ウイルス（ＡＴＣＣ、メリーランド州ロックランド、ロット番号２１８１７１）を２５μｌのＰＢＳに加えたもの（１０^5.55 ＣＥＩＤ５０に相当）を鼻腔内投与した。動物を体重変化及び生存率について１日２回、１４日間の期間にわたって観察した。臨床的スコアリングシステムを用いて疾患の進行のレベル及びインフルエンザＡウイルス治療に対するわずかな改善を評価した。

臨床スコア
０−正常。機敏で反応性があり、目に見える病気の兆候を認めない。
１−逆立った毛皮。歩行のわずかな低下を認める、または認めない。
２−歩行時に曲がった背中。歩行をいやがる。困難な呼吸。
３−逆立った毛皮、呼吸困難、運動失調、震え。
４−逆立った毛皮。そっと突いても歩行不可能。意識不明。触れると冷たく感じる。
５−死亡。

結果
この実験では、生存率、毎日の臨床スコア、及び体重変化を評価した。ｍＡｂ ５４２９（２０ｍｇ／ｋｇ）を投与したインフルエンザＡ感染野生型マウス及びｍＡｂ ５４２９を投与しないインフルエンザＡ感染ＴＬＲ３ノックアウトマウスのいずれも、インフルエンザウイルスを接種したＣ５７ＢＬ／６マウスと比較して生存率が統計的に有意に増大した（それぞれｐ＜０．００１及びｐ＜０．０１）が、このことは、ＴＬＲ３の阻害又は欠損がインフルエンザによって誘発される死を予防しうることを示すものである（図１８）。臨床スコアは、２０ｍｇ／ｋｇのｍＡｂ ５４２９を投与した群、及びＴＬＲ３ノックアウト群において有意に低下した（図１９）。マウスの体重をインフルエンザウイルス投与後１４日間にわたって観察した。インフルエンザＡウイルスを投与したＣ５７ＢＬ／６マウスでは体重は安定的に減少した。しかしながら、２０ｍｇ／ｋｇのｍＡｂ ５４２９を投与したＣ５７ＢＬ／６マウス及びＴＬＲ３ノックアウトマウスのいずれも、インフルエンザウイルスを接種した野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスに対して有意に大きな体重を示した（図２０）。これらの結果は、ＴＬＲ３抗体アンタゴニストが急性致死性インフルエンザウイルス感染モデルにおける臨床症状及び死亡率を低下させることを示すものであり、ＴＬＲ３アンタゴニストが急性の感染状態にあるヒトに防御を与えることを示唆するものである。

（実施例１５）
ＴＬＲ３抗体アンタゴニストは高血糖を改善し、血症インスリンを低下させる
モデル
食餌誘発肥満（ＤＩＯ）モデルを高血糖及びインスリン抵抗性、並びに肥満のモデルとして用いた。

Ｃ５７ＢＬ／６野生型動物（約３週齢、ジャクソン・ラボラトリーズ社（Jackson Labs））及びＴＬＲ３ノックアウト動物（Ｃ５７ＢＬ／６バックグラウンド；約３週齢、エース・アニマルズ社（Ace Animals,Inc.））を高脂肪の食餌に１２〜１６週間維持した。ＴＬＲ３ノックアウト及び野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスの両方に、通常の固形飼料又は６０．９％ｋｃａｌの脂肪及び２０．８％ｋｃａｌの炭水化物からなる高脂肪食餌（Ｐｕｒｉｎａ ＴｅｓｔＤｉｅｔカタログ番号５８１２６）のいずれかを与えた。マウスは、水及び食餌を自由摂取させ、１２時間／１２時間の明暗サイクルに維持した。各群の各マウスの体重を毎週測定した。ｍＡｂ ５４２９を第１週に週２回、その後は週１回全体で７週間腹腔内投与した。空腹時に後眼窩から採取した血清試料を、示した時点でのインスリンの測定に用いた。７週目に一晩絶食させた後、１．０ｍｇ／ｇ（体重）のグルコースを腹腔内投与することによって耐糖試験を行った。更に、空腹時のインスリン及びグルコースレベルを測定した。

以下の式を用いて、空腹時グルコースレベル及びインスリンレベルに基づきＨＯＭＡ−ＩＲを式から求めた。すなわち、ＨＯＭＡ−ＩＲ＝（（空腹時グルコース（ｍｍｏｌ／ｌ）ｘ空腹時インスリン（ｍＵ／ｌ））／２２．５（Ｗａｌｌａｃｅ ｅｔ ａｌ．，Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｃａｒｅ ２７：１４８７〜１４９５，，２００４）。空腹時血中グルコース（血糖値）（ＢＧ）をグルコースオキシダーゼアッセイによって求めた。空腹時インスリンレベルをインスリンラット／マウスＥＬＩＳＡキット（クリスタル・ケム社（Crystal Chem）カタログ番号９００６０）を使用して求めた。

結果
１２〜１６週間の高脂肪の食餌の後、野生型ＤＩＯ動物は高血糖及び高インスリンとなった。ｍＡｂ ５４２９による処置により、野生型ＤＩＯ動物では耐糖能が改善したがＴＬＲ３ノックアウトＤＩＯ動物では改善が見られなかった。グルコースチャレンジの６０、９０、１２０及び１８０分後に、ｍＡｂ ５４２９で処置した動物においてコントロール（ＰＢＳのみ）と比較して有意に低い血中グルコースレベルが観察された（図２１Ａ）。ｍＡｂ ５４２９で処置した野生型ＤＩＯ動物では、ｍＡｂを投与しない野生型ＤＩＯマウスと比較してＡＵＣの約２１％の低下が観察された。ｍＡｂ ５４２９で処置した野生型ＤＩＯ動物では空腹時インスリンレベルも低下した（図２２）。ＴＬＲ３ノックアウトＤＩＯ動物では、ｍＡｂ ５４２９による処置により空腹時インスリンに改善は認められなかった。インスリン抵抗性指数（Homeostatic model assessment）（ＨＯＭＡ）分析は、ｍＡｂ ５４２９で処置した野生型ＤＩＯ動物においてインスリン感受性の改善を示したが、ＴＬＲ３ノックアウトＤＩＯ動物では改善を示さなかった。．ＨＯＭＡ−ＩＲ値は、野生型ＤＩＯ、５ｍｇ／ｋｇの野生型ＤＩＯ（ｍＡｂ ５４２９投与）、及び２０ｍｇ／ｋｇの野生型ＤＩＯ（ｍＡｂ ５４２９投与）動物で、それぞれ１４．０±９．８、８．７±４．９、９．０±３．０であった。ＴＬＲ３ノックアウトＤＩＯ動物では何らの効果も認められなかった。

この実験により、ＴＬＲ３抗体アンタゴニストがＤＩＯモデルにおいて体重の損失をともなわずにインスリン抵抗性を改善し、空腹時グルコースを低下させることが示されたが、このことは、ＴＬＲ３アンタゴニストが高血糖症、インスリン抵抗性、及びＩＩ型糖尿病の治療に有用でありうることを示唆するものである。

（実施例１６）
ＴＬＲ３抗体アンタゴニストは細菌及びウイルス誘発炎症反応から防御する
試薬
細菌性増悪のＣＯＰＤ患者から単離された分類不能型ヘモフィルスインフルエンザ（Nontypeable Haemophilus influenza）（ＨＮＴＨｉ）株３５をＤｒ．Ｔ．Ｆ．Ｍｕｒｐｈｙより入手した（バッファロー・ＶＡ・メディカルセンター（Buffalo VA Medical Center）、ニューヨーク州バッファロー）。ヒトライノウイルス１６をアメリカ培養細胞系統保存機関（American Type Culture Collection）（ＡＴＣＣ）よりＴＣＩＤ（５０）＝２．８×１０⁷／ｍｌのものを入手した。

ＮＴＨｉ刺激アッセイ
ＮＨＢＥ細胞（ロンザ社（Lonza）、メリーランド州ウォーカーズビル）をＭｉｃｒｏｔｅｓｔ ９６穴組織培養プレート（ビー・ディー・バイオサイエンシーズ社（BD Biosciences）、マサチューセッツ州ベッドフォード）に１×１０⁵／ウェルで播いた。寒天プレート上で１６〜２０時間増殖させたＮＴＨｉを増殖培地に約２×１０⁸ｃｆｕ／ｍｌで再懸濁し、１００μｇ／ｍｌのゲンタマイシンで３０分間処理してから約２×１０⁷／ウェルでＮＨＢＥを含む９６穴プレートに加えた。３時間後に上清を除去し、抗体（０．０８〜５０μｇ／ｍｌの最終濃度）を加えた培地又は加えない新鮮な増殖培地に交換した。更に２４時間インキュベートした後、細胞上清中のサイトカイン及びケモカインの存在について、Ｌｕｍｉｎｅｘ １００ＩＳ多重蛍光分析器及びリーダーシステム（ルミネックス社（Luminex Corporation）、テキサス州オースチン）内でＣｙｔｏｋｉｎｅ ２５重ＡＢビーズキット、ヒト（ＩＬ−１β、ＩＬ−１ＲＡ、ＩＬ−２、ＩＬ−２Ｒ、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ１２ｐ４０ｐ７０、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−γ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＩＰ−１０、ＭＩＧ、エオタキシン、ＲＡＮＴＥＳ及びＭＣＰ−１を含む）によって３重にアッセイした。

ライノウイルス刺激アッセイ
ＮＨＢＥ細胞をＭｉｃｒｏｔｅｓｔ ９６穴組織培養プレート（ビー・ディー・バイオサイエンシーズ社（BD Biosciences）、マサチューセッツ州ベッドフォード）に１×１０⁵細胞／ウェルで播いた。翌日、抗体（０．０８〜５０μｇ／ｍｌの最終濃度）をＮＨＢＥ又はＢＥＡＳ−２Ｂ細胞に加えて１時間インキュベートした後、１０μｌ／ウェルのライノウイルスを加えた。更に２４時間アッセイした後、細胞上清中のサイトカイン及びケモカインの存在について上記に述べたようにｌｕｍｉｎｅｘアッセイによってアッセイを行った。

結果
ｍＡｂ １５ＥＶＱが、ＮＴＨｉにより誘導されたＩＰ−１０／ＣＸＣＬ１０及びＲＡＮＴＥＳ／ＣＣＬ５の産生を用量依存的に阻害したのに対して、コントロール抗体であるヒトＩｇＧ４（シグマ社（Sigma）ミズーリ州、セントルイス）はＮＴＨｉによる刺激に対して阻害作用を示さなかった（図２３Ａ）。ｍＡｂ １５ＥＶＱは、ライノウイルスにより誘導されたＣＸＣＬ１０／ＩＰ−１０及びＣＣＬ５／ＲＡＮＴＥＳの産生も阻害した（図２３Ｂ）。

（実施例１７）
ＴＬＲ３抗体アンタゴニストは星状細胞における炎症反応を抑制する
方法
２人のドナーから得た正常なヒト星状細胞（ロンザ社（Lonza）、メリーランド州ウォーカーズビル）を２４穴プレートに７５，０００細胞／ウェルで播き、一晩付着させた。翌日、星状細胞を２００ｎｇ／ｍｌのポリ（Ｉ：Ｃ）及び／又は１０μｇ／ｍｌのｍＡｂ １８で２４時間処理した。サイトカインをＬｕｍｉｎｅｘによって測定した。

結果
表１０に示されるように、ポリ（Ｉ：Ｃ）により誘導されたＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−γ、ＣＸＣＬ９／ＭＩＧ、ＣＣＬ３／ＭＩＰ−１ａ、ＣＣＬ４、ＣＣＬ５／ＲＡＮＴＥＳ及びＣＸＣＬ１０／ＩＰ−１０の産生はｍＡｂ １８によって阻害された。

（実施例１８）
ＴＬＲ３抗体アンタゴニストは上皮細胞における炎症反応を抑制する
方法
ＨＵＶＥＣ細胞（ロンザ社（Lonza）、メリーランド州ウォーカーズビル）をロンザ社の推奨する血清含有増殖培地中で培養した。細胞を無血清培地（ロンザ社（Lonza）、メリーランド州ウォーカーズビル）に再懸濁し、９６穴プレートに３×１０⁵細胞／ｍｌで播き、３７℃、５％ＣＯ２で２４時間インキュベートした。ポリ（Ｉ：Ｃ）（ジー・イー・ヘルスケア社（GE Healthcare）ニュージャージー州ピスカタウェイ）を濃度を増大させながら（１．５〜１００μｇ／ｍｌ）加え、更に２４時間３７℃でインキュベートした。サイトカイン阻害アッセイを行うため、ｍＡｂ １５ＥＶＱを細胞に異なる濃度（０〜５０μｇ／ｍｌ）で加えて３０分間インキュベートし、その後、２０μｇ／ｍｌのポリ（Ｉ：Ｃ）を２４時間加えた。細胞上清を回収し、ヒトサイトカイン３０重キット及びＬｕｍｉｎｅｘ ＭＡＰ技術（インビトロジェン社（Invitrogen）、カリフォルニア州カールスバッド）を用いてサイトカインレベルを測定した。ｓＩＣＡＭ−１の発現を測定するため、ＨＵＶＥＣ細胞を２０μｇ／ｍｌのポリ（Ｉ：Ｃ）及び異なる濃度のｍＡｂ １５ＥＶＱ（０．８〜５０μｇ／ｍｌ）で処理した。細胞上清をＥＬＩＳＡ（アール・アンド・ディー・システムズ社（R&D Systems））によりｓＩＣＡＭ−１の発現について分析した。細胞の生存率をＣｅｌｌＴｉｔｅｒＧｌｏキット（プロメガ社（Promega）、ウィスコンシン州マディソン）により測定した。

結果
ＨＵＶＥＣ細胞は、ポリ（Ｉ：Ｃ）に応答して以下のサイトカインを産生した。すなわち、ＩＬ−１ＲＡ、ＩＬ−２、ＩＬ−２Ｒ、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＣＸＣＬ８／ＩＬ−８、ＩＬ−１２（ｐ４０／ｐ７０）、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−γ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＣＣＬ３／ＭＩＰ−１α、ＣＣＬ４／ＭＩＰ−１β、ＣＸＣＬ１０／ＩＰ−１０、ＣＣＬ５／ＲＡＮＴＥＳ、ＣＣＬ２／ＭＣＰ−１、ＶＥＧＦ、Ｇ−ＣＳＦ、塩基性ＦＧＦ、及びＨＧＦ（表１１）。ｍＡｂ １５ＥＶＱは、ポリ（Ｉ：Ｃ）により誘導されたすべてのサイトカインのレベルを用量依存的に低下させた（表１２）。ポリ（Ｉ：Ｃ）により誘導されるＴＮＦ−α、ＣＣＬ２／ＭＣＰ−１、ＣＣＬ５／ＲＡＮＴＥＳ、及びＣＸＣＬ１０／ＩＰ−１０の産生を低下させるｍＡｂ １５ＥＶＱの能力は、ＴＬＲ３により媒介される活性の阻害が、アテローム性動脈硬化症につながりうる白血球及びＴ細胞の浸潤に対する防御を与えうることを示唆するものである。更に、ｍＡｂ １５ＥＶＱによるＶＥＧＦの阻害は、各種の癌及び加齢性黄斑変性などの眼疾患における脈管形成を含む、ＶＥＧＦによって媒介される病態におけるＴＬＲ３の遮断の潜在的な効果を示唆するものである。

ＴＮＦ−α及びＩＦＮ−γは白血球の動員において機能するとともに、活性化された内皮上の接着分子の発現を増大させる（Ｄｏｕｋａｓ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１４５：１３７〜４７，１９９４；Ｐｏｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１３３：４２６〜３３，１９８８）。ＣＣＬ２／ＭＣＰ−１、ＣＣＬ５／ＲＡＮＴＥＳ及びＣＸＣＬ１０／ＩＰ−１０は、単球及びＴ細胞の動員に関与していることが示されており、アテローム性動脈硬化症の発症に寄与する（Ｌｕｎｄｇｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００９）。内皮細胞によるＶＥＧＦの生成は、各種の癌において脈管形成時の異常な組織増殖又は腫瘍との関連が示されている（Ｌｉｖｅｎｇｏｏｄ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４９：５５〜６２，２００７）。

可溶性細胞内接着分子１（ｓＩＣＡＭ−１）はタンパク質切断によって生成し、内皮細胞活性化のマーカーである。ＩＣＡＭ−１は白血球の遊走及び活性化において重要な役割を有し、炎症時に内皮細胞及び上皮細胞において発現が上昇して、インテグリン分子ＬＦＡ−１及びＭａｃ−１を介した白血球への接着を媒介する。ポリ（Ｉ：Ｃ）は内皮細胞を活性化してｓＩＣＡＭ−１の発現を上昇させたが、この発現上昇はｍＡｂ １５ＥＶＱによる処理によって低減された（図２４Ａ）。

このことは、ＴＬＲ３抗体アンタゴニストが白血球のトラフィッキング、したがって炎症細胞の流入によって引き起こされる組織障害を阻害しうることを示すものである。

生存率アッセイを行うため、上記で述べたようにＨＵＶＥＣを培養、播種し、ポリ（Ｉ：Ｃ）で刺激した。ｍＡｂ １５ＥＶＱはポリ（Ｉ：Ｃ）により誘導されたＨＵＶＥＣ細胞の生存率の低下を用量依存的に回復させた（図２４Ｂ）。

内皮細胞の活性化の下方調節は、過剰な免疫細胞の浸潤を抑制し、炎症状態において増加するサイトカインによって引き起こされる組織障害を低減させうる。炎症及び内皮細胞におけるサイトカイン及び接着分子の過剰発現は、アテローム性動脈硬化症及び高血圧の発症の主要な寄与因子である。これらのデータは、脈管炎及び内皮機能不全をともなう血管疾患などの血管の疾患におけるＴＬＲ３アンタゴニストの使用の潜在的な有用性を探求することの根拠を与えるものである。炎症及び過剰発現したサイトカインによって引き起こされる別の疾患として、免疫抑制患者及びＨＩＶ感染患者において一般的に見られ、カポジ肉腫ヘルペスウイルス（ＫＳＨＶ）によって引き起こされるカポジ肉腫（ＫＳ）がある。ＶＥＧＦ及びサイトカインの産生はＫＳ細胞の生存に寄与する（Ｌｉｖｅｎｇｏｏｄ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４９：５５〜６２，２００７）。ＴＬＲ３アンタゴニストは、ＫＳ及び他の腫瘍にともなう血管新生のリスクを低減するうえで有用であるばかりでなく、細胞生存率の低下を防止し、内皮バリアの完全性を保護することによって、臓器不全及び敗血症などの重篤な炎症状態にともなう潜在的に重大な状態である血管漏出を防止するうえでも有用でありうる。ＴＬＲ３の阻害は、フラビウイルス科（例、デングウイルス、黄熱病ウイルス）、フィロウイルス科（エボラウイルス、マールブルグウイルス）、ブニヤウイルス科（例、ハンタウイルス、ナイロウイルス、フレボウイルス）、及びアレナウイルス科（例、ルヨ（Lujo）ウイルス、ラッサウイルス、アルゼンチン出血熱ウイルス、ボリビア出血熱ウイルス、ベネズエラ出血熱ウイルス）のウイルスによって引き起こされるウイルス性出血熱などの内皮細胞の病理が関与するウイルス感染においても有用でありうる（Ｓｉｈｉｂａｍｉｙａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ １１３：７１４〜７２２，２００９）。

（実施例１９）
ＴＬＲ３抗体アンタゴニストのカニクイザル及びマウスＴＬＲ３との交叉反応性
実施例２で述べたようにＩＳＲＥレポーター遺伝子アッセイを用いて、カニクイザル又はマウスＴＬＲ３に対する活性を評価した。上記に述べたようにしてカニクイザル（配列番号２１７）及びマウスＴＬＲ３ ｃＤＮＡ（配列番号１６１）を全血から増幅し、ｐＣＥＰ３ベクター（クロンテック社（Clontech））にクローニングして発現させた。ｍＡｂ １５ＥＶＱは、それぞれヒトＴＬＲ３ ＮＦ−κＢ及びＩＳＲＥアッセイにおけるＩＣ５０の値０．４４及び０．６５μｇ／ｍｌと比較して、カニクイザルＮＦ−κＢ及びＩＳＲＥアッセイにおけるＩＣ５０の値はそれぞれ４．１８μｇ／ｍｌ及び１．７４μｇ／ｍｌであった。アイソタイプコントロール抗体はこれらのアッセイでは何らの作用も示さなかった。

Claims (8)

1. ＴＬＲ３に対する反応性を有する単離された抗体又はその抗原結合フラグメントであって、
   カバット（Ｋａｂａｔ）の定義によるＮＹＷＶＧのアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、前記定義によるＦＩＤＰＳＤＳＹＴＮＹＡＰＳＦＱのアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２及び前記定義によるＥＬＹＱＧＹＭＤＴＦＤＳのアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３と、並びに
   前記定義によるＲＡＳＱＳＩＧＬＹＬＡのアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、前記定義によるＡＡＳＳＬＱＳのアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２及び前記定義によるＱＱＧＮＴＬＳＹＴのアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を、それぞれ含んでなるモノクローナル抗体とＴＬＲ３との結合について競合する、単離された抗体又はその抗原結合フラグメント
2. 重鎖及び軽鎖可変領域を含んでなるＴＬＲ３に対する反応性を有する単離された抗体又はその抗原結合フラグメントであって、
   Ｋａｂａｔの定義によるＮＹＷＶＧのアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
   式（Ｖ）
   Ｘａａ₂₄−Ｉ−Ｄ−Ｐ−Ｓ−Ｄ−Ｓ−Ｙ−Ｔ−Ｎ−Ｙ−Ｘａａ₂₅−Ｐ−Ｓ−Ｆ−Ｑ−Ｇ，
   （Ｖ）
   式中、
   Ｘａａ₂₄は、Ｐｈｅ又はＡｒｇであってよく、
   Ｘａａ₂₅は、Ａｌａ又はＳｅｒであってよい、
   に示されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２及び前記定義によるＥＬＹＱＧＹＭＤＴＦＤＳを含む重鎖ＣＤＲ３と、並びに前記定義によるＲＡＳＱＳＩＧＬＹＬＡのアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、前記定義によるＡＡＳＳＬＱＳのアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列及びＱＱＧＮＴＬＳＹＴのアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３
   を、それぞれ含んでなる、単離された抗体又はその抗原結合フラグメント。
3. 重鎖及び軽鎖可変領域を含むＴＬＲ３に対する反応性を有する単離された抗体又はその抗原結合フラグメントであって、
   Ｋａｂａｔの定義によるＮＹＷＶＧのアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、前記定義によるＦＩＤＰＳＤＳＹＴＮＹＡＰＳＦＱのアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２及び前記定義によるＥＬＹＱＧＹＭＤＴＦＤＳのアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３と、並びに
   前記定義によるＲＡＳＱＳＩＧＬＹＬＡのアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、前記定義によるＡＡＳＳＬＱＳのアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２及び前記定義によるＱＱＧＮＴＬＳＹＴのアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を、それぞれ含んでなる、単離された抗体又はその抗原結合フラグメント。
4. 抗体又はその抗原結合フラグメントが完全なヒト抗体又はヒト適合化されている、請求項１〜３のいずれかに記載の単離された抗体又はその抗原結合フラグメント。
5. 抗体がポリエチレングリコールと接合されている、請求項４に記載の単離された抗体又はその抗原結合フラグメント。
6. ＩｇＧ４アイソタイプを有する、請求項４に記載の単離された抗体又はその抗原結合フラグメント。
7. Ｆｃドメインが、Ｓ２２９Ｐ、Ｐ２３５Ａ又はＬ２３６Ａ突然変異を含む、請求項４に記載の単離された抗体又はその抗原結合フラグメント。
8. 請求項４に記載の単離された抗体又はその抗原結合フラグメント及び薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。

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