JP5610063B2 - 観察装置および観察方法 - Google Patents

Description

本発明は、観察装置および観察方法に関する。

非破壊断層計測技術の１つに光コヒーレンストモグラフィー（ＯＣＴ）がある（非特許文献１等を参照）。ＯＣＴは、波長幅の広い光をプローブとして用いることにより、被観察物の屈折率分布、分光情報、偏光情報等を計測することができる。そして、被観察物の３次元構造を、非染色・非侵襲で観察することができることが挙げられる。よって、ＯＣＴは、生体内細胞などに好適である。

E.A. Swanson, J.A. Izatt, M.R. Michael, D. Huang, C.P. Lin, J.S. Shuman, C.A. Puliafito, J.G. Fujimoto, 18 (21) 1864-1866, Optics Letters (1993)

一方、培養細胞や細胞内器官などにおいて、ＯＣＴを用い、非染色・非侵襲で被観察物の３次元構造を観察したいという要求もある。しかし、上述した培養細胞や細胞内器官などの被観察物は、一般的に透明の組織であるものが多く、後方散乱によって得られる散乱光が弱い。さらに、これらの被観察物は、スライドガラスやシャーレといった反射の強い容器に保持されている場合が多い。そのため、従来の反射型のＯＣＴをそのまま適用しただけでは、被観察物の観察を好適に行うことはできない。また、反射型のＯＣＴを透過型に変形しただけでは、被観察物全体を透過した透過光を検出するため、被観察物の深さ方向の分布を測定できなかった。

本発明は、上記課題に鑑みてなされたものであり、被観察物を透過した光に基づく検出が可能な観察装置および観察方法を提供することを目的とする。

本発明の観察装置の一態様は、入射した低コヒーレンス光源からの光を参照光と測定光とに分岐する分岐手段と、前記測定光を観察光学系の光軸に対して所定角度傾いた方向から被観察物に照射する照明光学系と、前記被観察物に対して前記照明光学系と異なる側に配置され、前記被観察物を介した前記測定光のうち前記所定角度傾いた方向以外の方向へ向かう観察光を受光する観察光学系と、前記参照光と、前記観察光学系において受光された観察光とを合成する（重ね合わせる）合成手段と、前記合成手段によって合成された前記参照光および前記観察光を分光して受光し、該参照光と該観察光との干渉強度をスペクトル信号として検出する検出装置と、前記スペクトル信号をフーリエ変換する演算装置と、を備える。

なお、前記分岐手段に入射する光は、所定の波長域の光を含み、前記分岐手段は、所定の波長域の光を前記参照光と前記測定光とに分岐し、前記検出装置は、前記合成手段によって合成された前記参照光および前記観察光を分光する分光素子と、前記分光素子によって分光された光を、波長域ごとに前記干渉強度を検出する検出素子と、を含んでもよい。

また、前記照明光学系は、入射した光の強度分布をその光束の断面に沿った方向に環状に形成し、前記環状に形成された光を用いて、前記観察光学系の光軸に対して所定角度傾いた方向から前記被観察物を照射する斜入射照明を行う斜入射手段を備えてもよい。

また、前記斜入射手段は、前記環状に形成された光を偏向する光学素子を含んでもよい。

また、前記斜入射手段は、照明光学系の光路に配置され、入射した光の強度分布をその光束の断面に沿った方向に環状に形成する形状制御手段を含んでもよい。

また、前記斜入射手段は、前記形状制御手段として、入射した光の一部を遮光する遮光手段を含んでもよい。

また、前記斜入射照射される前記測定光の開口数NAが０．４＜NA＜０．８であってもよい。

また、前記斜入射照射される前記測定光の開口数NAが０．８であってもよい。

また、前記照明光学系と前記被観察物の位置を相対的に移動する走査手段を備えても良い。

また、前記測定光と前記参照光との光路長差が４００μｍよりも短くても良い。

本発明の観察方法の一態様は、入射した光を参照光と測定光とに分岐することと、前記測定光を所定角度傾いた方向から被観察物に照射することと、前記被観察物に対して前記照明光を照射する側と異なる側から、前記被観察物を介した前記測定光のうち前記所定角度傾いた方向以外の方向へ向かう（進む）観察光を受光することと、前記参照光と前記受光した観察光とを合成する（重ね合わせる）ことと、前記合成された前記参照光および前記観察光を分光して受光し、該参照光と該観察光との干渉強度をスペクトル信号として検出することと、前記スペクトル信号をフーリエ変換することと、を含む。

なお、前記入射した光は、所定の波長域の光を含み、前記分岐することは、所定の波長域の光を前記参照光と前記測定光とに分岐し、前記検出することは、前記合成された前記参照光および前記観察光を分光することと、分光された前記参照光および前記観察光を、波長域ごとに前記干渉強度を検出することと、を含んでもよい。

第１実施形態のＯＣＴ装置の構成図である。 第１実施形態のＯＣＴ装置における光路を説明する図である。 第１実施形態のＯＣＴ装置におけるアパーチャー１３について説明する図である。 第２実施形態のＯＣＴ装置の構成図である。 第２実施形態のＯＣＴ装置における輪帯マスク２２について説明する図である。 第２実施形態のＯＣＴ装置における光路を説明する図である。 第２実施形態のＯＣＴ装置における輪帯マスク２２について説明する別の図である。 第１実施形態および第２実施形態の変形例におけるＯＣＴ装置の構成図である。 第３実施形態のＯＣＴ装置の構成図である。 ビームスキャン型のＯＣＴ装置について説明する図である。 ビームスキャン型のＯＣＴ装置について説明する別の図である。

［第１実施形態］
以下、本発明の第１実施形態のＯＣＴ装置を説明する。

図１は、第１実施形態のＯＣＴ装置の構成図である。図１に示すとおりＯＣＴ装置には、光源１、コリメートレンズ２、ビームスプリッタ３および４、アキシコンレンズ５、リレーレンズ６、全反射ミラー７および８、対物レンズ９および１０、サンプル１１、サンプルステージ１２、アパーチャー１３、分散補正用光学部材１４、シリンドリカルレンズ１５、スペクトル検出器１６、制御装置１７、演算装置１８等が配置される。制御装置１７は、光源１、サンプルステージ１２、スペクトル検出器１６の各部を制御するとともに、スペクトル検出器１６により取得したスペクトル信号を演算装置１８に送出する。

つまり、対物レンズ１０等の観察光学系は、被観察物であるサンプル１１に対して、光源１から対物レンズ９等の照明光学系と異なる側（つまり、照明光学系に対して被観察物を挟むように）に配置される。そして、対物レンズ１０等の観察光学系は、被観察物であるサンプル１１を介した測定光のうち、照明光学系による照明光の照射方向と異なる方向へ向かう（進む）観察光を受光する。

サンプル１１には、例えば、不図示の容器等に被観察物である培養細胞などが培養されている。なお、上述した容器としては、シャーレ、フラスコ、ウェルプレート、マイクロプレートなど、様々なものが使用できる。また、容器の代わりにスライドガラスを使用することもできる。

また、サンプル１１は、サンプルステージ１２上に設置される。サンプルステージ１２は、対物レンズ９および１０の光軸方向に垂直な面（ｘｙ面）内に移動可能であり、ＯＣＴ装置による検出時にｘｙ方向への走査を行う（詳細は後述する）。

以下、光源１は、時間コヒーレントの短い光を出射する場合について説明する。光源１には、例えば、スーパールミネッセンスダイオード（ＳＬＤ）、チタンサファイアレーザ、白色ＬＥＤなどが適用される。

なお、ＯＣＴ装置のｚ方向の分解能は、光源１のコヒーレント長に依存する。また、ＯＣＴ装置のｘｙ方向の分解能は、後述する集光点のサイズに依存し、その集光点のサイズは、対物レンズ９の性能に依存する。

光源１から射出した照明光Ｌ０は、コリメートレンズ２により所定のビーム径にコリメートされ、ビームスプリッタ３へ入射する。ビームスプリッタ３へ入射した照明光Ｌ０は、分散補正用光学部材１４の側へ向かう参照光Ｌｒと、サンプル１１の側へ向かう測定光Ｌｍとに分岐される。

参照光Ｌｒは、分散補正用光学部材１４、全反射ミラー８を介してビームスプリッタ４へ入射する。

ここで、分散補正用光学部材１４は、主にＯＣＴ装置における干渉計のバランスを保つための素子である。ここでいう干渉計のバランスとは、干渉計の、試料アームおよび参照アームの波長分散のバランスを指す。このバランスは、対物レンズなどの光学材料、および、サンプルに含まれる媒質（培養液など）に起因して崩れることがある。

そこで、分散補正用光学部材１４は、対物レンズなどの光学材料に起因するバランスの崩れを補正するための部材と、サンプルに含まれる媒質に起因するバランスの崩れを補正するための部材とを備える。上述した光学材料に起因するバランスの崩れを補正するための部材は、試料アームに配置される各光学部材に応じた補正量を有する。また、上述した媒質に起因するバランスの崩れを補正するための部材は、媒質の種類や量などに応じて補正量が可変な部材であることが好ましい。一例としては、光学材料に起因するバランスの崩れを補正するための部材としては、ガラスブロックなどが用いられる。また、媒質に起因するバランスの崩れを補正するための部材としては、ＡＯＰＤＦ（Acousto-Optic programmable dispersive filter）や挿入変化可能なプリズム対などが用いられる。また、補正量や補正内容を計算処理によって補正可能な場合は、分散補正用光学部材１４を演算処理で代用しても良い。

参照光Ｌｒは、このような分散補正用光学部材１４によって、試料アームとバランスの取れた分散を持つように調整される。なお、分散補正用光学部材１４を経た参照光Ｌｒを、以下では参照光Ｌｒ’と称する。

一般に、ＯＣＴ装置における測定光と参照光との光路長差は、光路長差が大きい程、（スペクトル方向の）干渉縞が細かくなることが知られている。そして、干渉縞が細かくなればなるほど、分光システムでスペクトル分解して検出することが難しくなる。つまり、光路長差の上限は、分光システム（の分光器部分）の分解能で決まることになる。

例えば、800nm付近で0.15nmの波長分解能を持つ分光システムを用いる場合を例に挙げると、サンプリング定理より、例えば、光路長差＞400μmであると、干渉縞の検出が難しくなる。そこで、例えば、光路長差＜400μmであることが望ましい。

一方、測定光Ｌｍは、アキシコンレンズ５へ入射して、アキシコンレンズ５の頂角に応じた角度で曲げられた後、リレーレンズ６に導光される。

ここで、アキシコンレンズ５は、コニカルレンズとも呼ばれる円錐型のレンズであって、環状ビーム（ドーナツ形状）やベッセルビーム(non diffractive Bessel beam) の形成に利用される。通常、環状の照明は、ベッセルビームなどによる焦点深度伸長の用途に導入されることが多い。図１では、凸型のアキシコンレンズを例示したが、凹型のアキシコンレンズを適用しても良い。また、アキシコンレンズに限らず、測定光Ｌｍを光速の断面で環状に変更可能な部材であればどのようなものであっても良い。例えば、複数のミラーを組み合わせることで測定光Ｌｍの少なくとも一部を環状に変更しても良い。また、本実施形態において、この環状の照明は、サンプル１１に対して測定光を斜入射するためのものである（詳細は後述する）。

アキシコンレンズ５により環状に形成された測定光（以下、測定光Ｌｍ’と称する）は、リレーレンズ６、全反射ミラー７を介して対物レンズ９に導光される。

なお、アキシコンレンズ５により環状に形成され、対物レンズ９によって瞳位置にできる光を「輪帯パターン」と称すると、輪帯パターンの数値例は以下のようになる。

例えば、Ｚ分解能を優先して高ＮＡが有利と考え、実現可能性も加味して、ＮＡ0.8の対物レンズを用いるとする。このとき、NA=0.8=sinθより、θ=54°となる。例えば、このときの光源１のコヒーレンス長が２μmであるとすると、Ｚ分解能は~10μmとなる。この時、上述した輪帯パターンの帯幅が200μmだとすると、焦点深度は~200/0.8 ~250μmとなる。

つまり、NA=0.8（θ=54°）で、帯幅が200μmの時、Ｚ分解能（10μm）と焦点深度（250μm）とのバランスが取れていて、例えば、観察対象が生体である場合、その構造観察に適正な仕様なので、特に有効である。

全反射ミラー７からの測定光Ｌｍ’は、対物レンズ９により集光され、サンプル１１の深部の１点（集光点）に向かって照射される。なお、サンプル１１と対物レンズ９とのｚ方向の相対位置は、対物レンズ１１の焦点面がサンプル１１中の被観察物（培養細胞など）の存在領域に掛かるよう予め調整されている。また、リレーレンズ６からサンプル１１までの間にサンプル１１内の照明面の瞳（フーリエ変換面）が少なくとも１つ存在する。図１のＦａに瞳位置を示す。この瞳位置は対物レンズ９の焦点面でもある。その焦点面で測定光Ｌｍ’が集光して点光源（２次光源）が形成されることで、サンプル１１に平行波（コリメートした光）が照明される。

サンプル１１のうち測定光Ｌｍ’の照射領域（以下、「照射スポット」と称す。）では、様々な角度の回折光が発生する可能性がある。それらの回折光のうち、集光点へ向かった測定光Ｌｍ’と同じ方向へ進行する光は、アパーチャー１３を介して対物レンズ１０によって捉えられる。

なお、対物レンズ１０の仕様は、上述した対物レンズ９の仕様と同じであり、対物レンズ１０の配置先は、サンプル１１を挟み対物レンズ９に対向する位置である。また、対物レンズ１０の焦点面は対物レンズ９の焦点面に一致し、かつ対物レンズ１０の焦点は対物レンズ９の焦点に一致している。

以下、照射スポットから対物レンズ１０の側へ向かった測定光のうち、対物レンズ１０によって捉えられた光を「測定光Ｌｍ”」と称す。この測定光Ｌｍ”は、対物レンズ１０を通過した後、ビームスプリッタ４へ入射する。

ここで、光源１から射出した照明光Ｌ０から、ビームスプリッタ４へ入射する測定光Ｌｍ”までの詳細を、図２を用いて説明する。

図２は、光源１から射出した照明光Ｌ０から、ビームスプリッタ４へ入射する測定光Ｌｍ”までの光路図である。図２に示すように、光源１から射出した照明光Ｌ０は、コリメートレンズ２により所定のビーム径にコリメートされる。そして、測定光Ｌｍは、アキシコンレンズ５によって環状に形成される。さらに、リレーレンズ６を経た測定光Ｌｍ’は、対物レンズ９によってサンプル１１に照射される。このとき、測定光Ｌｍ’は、サンプル１１に対して斜入射される。サンプル１１においては、サンプル１１の被観察物の内容に応じて、回折光が生じる。この回折光を、対物レンズ１０によりとらえる。ただし、この際に、アパーチャー１３は、０次の回折光成分を遮断する。アパーチャー１３は、図２に示すように、サンプル１２と対物レンズ１０との間に配置され、サンプル１１を透過した測定光のうち、サンプル１１による散乱成分を主に取り出すための絞りである。また、アパーチャー１３は、対物レンズ１０とビームスプリッタ４との間に配置されていても良い。その際、サンプル１１を透過した０次の回折光成分が集光する対物レンズ１０の集光面（フーリエ変換面）にアパーチャー１３が配置されていることが好ましい。

図３に、アパーチャー１３近傍の拡大図を示す。図３に示すように、アパーチャー１３は、所定の口径を有し、サンプル１１による回折光のうち、中央近傍の回折光（図３中斜線部分）のみを透過し、それ以外の光を遮断する。

そして、ビームスプリッタ４に入射した測定光Ｌｍ”は、参照アーム側からビームスプリッタ４へ入射した参照光Ｌｒ’と光路を統合され、シリンドリカルレンズ１５の側へ向かう。なお、統合された参照光Ｌｒ’と測定光Ｌｍ”とを纏めて「干渉光」と称す。シリンドリカルレンズ１５の側へ向かった干渉光は、シリンドリカルレンズ１５によってスペクトル検出器１６の入射スリットに導光される。

なお、ここで、スペクトル検出器１６の入射スリットに導光される干渉光には、光源１および対物レンズ９などの照明光学系により照明された光とは異なる様々な光（サンプル１１を透過した光、サンプル１１により反射された光、サンプル１１により回折された光な）の成分を含むことになる。

スペクトル検出器１６には、図１に示すように、干渉光の集光点にスリット開口を配したスリット板１６ａと、スリット板１６ａを通過した干渉光を平行光に変換するコリメートミラー１６ｂと、平行光となった干渉光を複数の波長成分に分離する反射型回折格子１６ｃと、それらの波長成分を互いにずれた位置へ集光させる集光ミラー１６ｄと、互いにずれた位置に集光する各波長成分の強度を個別に検出するラインセンサ１６ｅとが備えられる。この構成により、スペクトル検出器１６は、干渉光の波長成分毎の強度信号（すなわちスペクトル信号）を生成する。このスペクトル信号は、制御装置１７へ送出される。

ここで、前述したサンプルステージ１２は、制御装置１７の制御により、サンプル１１をｘｙ方向へ変位させることができる。よって、サンプルステージ１２が駆動されると、サンプル１１上の照射スポットがｘｙ方向に移動する。なお、干渉光のスペクトル分光および検出の形態は図１に限られることはない。

よって、制御装置１７は、サンプルステージ１２を駆動することにより照射スポットでサンプル１１上をｘｙ方向にかけて二次元走査し、照射スポットが各ｘｙ位置にあるときにラインセンサ１６ｅを駆動してスペクトル信号を取り込むことにより、各ｘｙ位置のスペクトル信号を取得する。これらのスペクトル信号は、演算装置１８へ送出される。

演算装置１８は、各ｘｙ位置のスペクトル信号を個別にフーリエ変換することにより、各ｘｙ位置のｚ方向の構造情報を取得する。これによって、ｘｙｚ方向の三次元画像情報が既知となる（詳細は後述する）。演算装置１８は、既知となったサンプル１１における構造情報を不図示のモニタに表示する。

以上説明したように、本実施形態によれば、分岐手段から導光された測定光を、アキシコンレンズを用いることにより被観察物に対して斜入射し、参照物を透過した参照光と被観察物を透過した測定光とを合成し、合成された参照光及び測定光からなる合成光の強度を検出する。したがって、被観察物を透過した光に基づき、被観察物の内部構造の検出を可能とすることができる。

特に、本実施形態によれば、被観察物が透明の組織である場合や、被観察物が反射の強い容器内に保持されている場合であっても、ＯＣＴによる好適な観察を行うことができる。

［第２実施形態］
以下、本発明の第２実施形態のＯＣＴ装置を説明する。

図４は、第２実施形態のＯＣＴ装置の構成図である。図４において図１に示した要素と同じものには同一の符号を付した。図４に示すとおり本実施形態のＯＣＴ装置には、図１に示したアキシコンレンズ５、リレーレンズ６が省略され、代わりに、ビームエキスパンダ２１、輪帯マスク２２が配置される。

ビームエキスパンダ２１は、ビームスプリッタ３と全反射ミラー７との間に配置され、ビーム径の変換を行う。なお、光源１から射出された光のビーム径が十分に広い場合には、ビームエキスパンダ２１を用いなくても良い。

また、輪帯マスク２２は、対物レンズ９の瞳位置（サンプル１１と反対側の瞳位置）に配置され、ビームスプリッタ３から導光され、ビームエキスパンダ２１によりビーム径が変換された測定光Ｌｍの一部を遮光する。輪帯マスク２２は、図５に示すように、環状の開口を有するマスクであり、その輪帯直径はｄである。開口の帯幅と、輪帯マスク２２から対物レンズ９の瞳位置までの距離との兼ね合いにより、対物レンズ９の瞳位置に帯幅ρの輪帯パターンが形成される。このとき、焦点深度について次式の関係が成り立つ。

焦点深度＝２ρｆ／Ｄ〜ρ／ＮＡ ・・・（式１）
式１において、ｆは対物レンズ９の焦点距離を示し、ＮＡは対物レンズの有効ＮＡを示す。

また、輪帯マスク２２による輪帯パターンの数値例は以下のようになる。

例えば、Ｚ分解能を優先して高ＮＡが有利と考え、実現可能性も加味して、ＮＡ0.8の対物レンズを用いるとする。このとき、NA=0.8=sinθより、θ=54°となる。例えば、このときの光源１のコヒーレンス長が２μmであるとすると、Ｚ分解能は~10μmとなる。この時、上述した輪帯パターンの帯幅ρ=200μmだとすると、焦点深度は~200/0.8 ~250μmとなる。

つまり、NA=0.8（θ=54°）で、帯幅ρ=200μmの時、Ｚ分解能（10μm）と焦点深度（250μm）とのバランスが取れていて、例えば、観察対象が生体である場合、その構造観察に適正な仕様なので、特に有効である。

ここで、光源１から射出した照明光Ｌ０から、ビームスプリッタ４へ入射する測定光Ｌｍ”までの詳細を、図６を用いて説明する。

図６は、光源１から射出した照明光Ｌ０から、ビームスプリッタ４へ入射する測定光Ｌｍ”までの光路図である。図６に示すように、光源１から射出した照明光Ｌ０は、コリメートレンズ２により所定のビーム径にコリメートされる。そして、測定光Ｌｍは、ビームエキスパンダ２１によって所定のビーム径に変換される。さらに、全反射ミラー７を経た測定光Ｌｍは、輪帯マスク２２に導光される。測定光Ｌｍは、輪帯マスク２２によって環状に形成され、環状に形成された測定光Ｌｍ’は、対物レンズ９によってサンプル１１に照射される。このとき、測定光Ｌｍ’は、第１実施形態と同様に、サンプル１１に対して斜入射される。サンプル１１においては、サンプル１１の被観察物の内容に応じて、回折光が生じる。この回折光のうち、サンプル１１を透過する成分を、対物レンズ１０によりとらえる。ただし、この際に、アパーチャー１３は、透過光の一部（０次の回折光成分）を遮断する。アパーチャー１３の構成及び作用は第１実施形態と同様である。

そして、ビームスプリッタ４に入射した測定光Ｌｍ”は、参照アーム側からビームスプリッタ４へ入射した参照光Ｌｒ’と光路を統合され、シリンドリカルレンズ１５の側へ向かう。以降のシリンドリカルレンズ１５、スペクトル検出器１６、制御装置１７、演算装置１８の構成及び作用は、第１実施形態と同様である。

以上説明したように、本実施形態によれば、分岐手段から導光された測定光を、輪帯マスクを用いることにより被観察物に対して斜入射し、参照物を透過した参照光と被観察物を透過した測定光とを合成し、合成された参照光及び測定光からなる合成光に含まれる干渉成分の強度を検出する。したがって、第１実施形態と同様の効果を得ることができる。

［第２実施形態の補足］
なお、第２実施形態のＯＣＴ装置では、図５に示した輪帯マスク２２を用いて斜入射を実現する例を示したが、本発明はこの例に限定されない。

例えば、単一の開口を有するマスクを輪帯マスク２２の代わりに用いても良い。図７Ａに示すように、ｘ軸状に対応する一点にピンホールを有するマスクの場合、ｘ方向及びｚ方向に分解能を有する。１個の開口を有するマスクを対物レンズ９の光軸周り１周分足し合わせることで、輪帯マスク２２を配置したときと同等の情報を得ることができる。この方法は、低強度光源を用いる場合などに、ダークノイズを軽減し、ＳＮ比を得やすくすることが可能である。

また、例えば、略一定の円上に離散または連続した複数の開口を有するマスクを輪帯マスク２２の代わりに用いても良い。また、図７Ｂに示すように、ｘ軸上に対応する一点、および、ｙ軸上に対応する一点にそれぞれピンホールを有するマスクの場合、３次元に分解能を有する。

さらに、図７Ｃに示すように、ｘ軸上に対応する対称な二点、および、ｙ軸上に対応する対称な二点にそれぞれピンホールを有するマスクの場合、３次元に分解能を有し、さらに、ＰＳＦの歪みを抑えるとともに、焦点深度を深くすることができる。

以上説明したように、２π／４Ｎ（ただし、Ｎ＝１、２、・・・・）個の開口を環状に形成し、Ｎを大きく設定するほど、好適な輪帯マスクとすることができる。なお、開口は必ずしも対称に配置される必要はない。また、複数の開口の形状は必ずしも同一である必要はない。

［第１実施形態および第２実施形態の変形例］
制御装置１７は、対物レンズ９および輪帯マスク２２を、サンプル１１に応じて、連動して制御する。このような制御により、サンプル１１に含まれる被観察物に対して、様々な方向からの測定光を照射することが可能になり、三次元構造をむらなく捉えることが可能になる。

このように、開口数が可変であって、分岐手段から導光された測定光を被観察物上に集光する対物レンズを備え、検出手段による検出の内容に応じて、対物レンズの開口数を制御する。したがって、被観察物に応じた好適な検出を可能とすることができる。

特に、被観察物が透明の組織である場合や、被観察物が反射の強い容器内に保持されている場合であっても、ＯＣＴによる好適な観察を行うことができる。

また、上述した対物レンズの開口数と連動して、輪帯マスクの輪帯直径を制御することにより、より細やかに被観察物に応じた検出を可能とすることができる。

また、実際の検出においては、どのような被観察物のどのような構造を検出したいかに応じて、ＯＣＴ装置に要求される分解能と焦点深度は異なる。例えば、被観察物が細胞スフェロイドのような比較的大きなスケールの観察物であり、その概観を観察したい場合は、スフェロイドサイズ程度の分解能と焦点深度が要求される。また、被観察物が細胞核のような微細な観察物であり、その詳細な構造を観察したい場合は、焦点深度を犠牲にしてでも高い分解能が要求される。上述のような処理によれば、被観察物のスケールによって、分解能を適宜変更することが可能である。

何れの場合においても、アキシコンレンズや輪帯マスクにより環状に形成され、対物レンズ９によって瞳位置にできる光を「輪帯パターン」と称すると、輪帯パターンの数値例は以下のようになる。

例えば、光源１のコヒーレンス長が２μmであるとし、NAが0.4<NA<0.8 で、輪帯パターンの帯幅が200μmの時、NA=sinθより、θの範囲は、6°<θ<55°となる。このときのＺ分解能は、10 (μm) < Ｚ分解能 < 50 (μm)となり、焦点深度は、250 (μm) < 焦点深度< 500 (μm)となる。つまり、0.4<NA<0.8で、帯幅が200μmの時、Ｚ分解能10（μm）〜50 (μm)と焦点深度250（μm）〜500 (μm)とのバランスが取れていて、例えば、観察対象が生体である場合、その構造観察に適正な仕様なので、特に有効である。

なお、斜入射照明を、反射型のＯＣＴ想定に適用しても良い。具体例を以下に示す。

図８は、本変形例のＯＣＴ装置の構成図である。図８において図１に示した要素と同じものには同一の符号を付した。図８に示すとおりＯＣＴ装置には、第１実施形態と同様の光源１、ビームスプリッタ３、対物レンズ９、サンプル１１、シリンドリカルレンズ１５、スペクトル検出器１６、制御装置１７、演算装置１８などに加えて、平面ミラー（参照ミラー）４１、光スキャナ４２が配置される。

光源１から射出した照明光Ｌ０は、ビームスプリッタ３へ入射し、参照ミラー４１の側へ向かう参照光Ｌｒと、サンプル１１の側へ向かう測定光Ｌｍとに分岐される。

参照光Ｌｒは、参照ミラー４１へ正面から入射すると、参照ミラー４１を反射して光路を折り返し、ビームスプリッタ３へ戻る。

一方、測定光Ｌｍは、光スキャナ４２を介して対物レンズ９へ入射すると、対物レンズ９の集光作用を受け、サンプル１１の深部の１点（集光点）に向かって集光する。なお、サンプル１１と対物レンズ９とのｚ方向の相対位置は、対物レンズ９の焦点面がサンプル１１中の被観察物（培養細胞など）の存在領域に掛かるよう予め調整されている。

サンプル１１のうち測定光Ｌｍの照射領域（以下、「照射スポット」と称す。）では、様々な角度の反射光が発生する可能性がある。それらの反射光のうち、集光点へ向かった測定光Ｌｍの光路を逆向きに辿る光は、対物レンズ９によって捉えられる。以下、照射スポットから対物レンズ９の側へ向かった反射光のうち、対物レンズ９によって捉えられた光を「測定光Ｌｍ’」と称す。この測定光Ｌｍ’は、測定光Ｌｍの光路を逆向きに辿り、光スキャナ４２を介してビームスプリッタ３へ入射する。

ビームスプリッタ３へ入射した測定光Ｌｍ’は、ビームスプリッタ３へ戻った参照光Ｌｒ’と光路を統合させ、シリンドリカルレンズ１５の側へ向かう。なお、ここで、参照光の単独光路の光路長（参照アームの光路長）と、測定光の単独光路の光路長（測定アームの光路長）とは一致している。

そして、統合された参照光Ｌｒ’と測定光Ｌｍ”とを纏めて「干渉光」と称す。シリンドリカルレンズ１５の側へ向かった干渉光は、シリンドリカルレンズ１５によってスペクトル検出器１６の入射スリットに導光される。

スペクトル検出器１６の構成および作用は、第１実施形態と同様である。

ここで、前述した光スキャナ４２が駆動されると、前述した集光点が対物レンズ９の視野内を移動するので、サンプル１１上の照射スポットがｘｙ方向に移動する。

よって、制御装置１７は、光スキャナ４２を駆動することにより照射スポットでサンプル１１上をｘｙ方向にかけて二次元走査し、照射スポットが各ｘｙ位置にあるときにラインセンサ１６ｅを駆動してスペクトル信号を取り込むことにより、各ｘｙ位置のスペクトル信号を取得する。これらのスペクトル信号は、演算装置１８へ送出される。

演算装置１８は、各ｘｙ位置のスペクトル信号を個別にフーリエ変換することにより、各ｘｙ位置のｚ方向の構造情報を取得する。これによって、ｘｙｚ方向の細胞分布が既知となる。演算装置１８は、既知となったサンプル１１における構造情報の分布を不図示のモニタに表示する。

制御装置１７は、対物レンズ９の開口数ＮＡを、サンプル１１に応じて制御する。このような制御により、サンプル１１に含まれる被観察物に対して、様々な方向からの測定光を照射することが可能になり、三次元構造をむらなく捉えることが可能になる。

以上説明したように、本変形例によれば、反射型のＯＣＴ装置においても、上記各実施形態と同様の効果を得ることができる。

［第３実施形態］
以下、本発明の第３実施形態のＯＣＴ装置を説明する。

図９は、第３実施形態のＯＣＴ装置の構成図である。図９において図１に示した要素と同じものには同一の符号を付した。図９に示すとおり本実施形態のＯＣＴ装置には、図１に示したアキシコンレンズ５、リレーレンズ６が省略され、代わりに、光スキャナ３１が配置される。

光スキャナ３１は、２枚の全反射ミラー３１ａおよび３１ｂを備え対物レンズ９への測定光Ｌｍの入射角を変更する。また、光スキャナ３１は、制御装置１７によって制御される。

制御装置１７は、光スキャナ３１と全反射ミラー７と全反射ミラー８とを連動して制御することにより、測定光Ｌｍ’をサンプル１１に対して斜入射する。このとき、例えば、斜入射する照射スポットを回転させて、輪帯状に照射を行えば、上述した第１実施形態および第２実施形態と略同様の検出を行うことができる。このような方法は、光源として低強度光源を用いる場合などに、ダークノイズを軽減し、ＳＮ比を得やすくすることが期待できる。

上述の光スキャナ３１によって、測定光Ｌｍ’は、第１実施形態と同様に、サンプル１１に対して斜入射される。以降のアパーチャー１３、ビームスプリッタ４、シリンドリカルレンズ１５、スペクトル検出器１６、制御装置１７、演算装置１８の構成及び作用は、第１実施形態と同様である。

以上説明したように、本実施形態によれば、分岐手段から導光された測定光を、輪帯ミラーを備えた光スキャンを用いることにより被観察物に対して斜入射し、参照物を透過した参照光と被観察物を透過した測定光とを合成し、合成された参照光及び測定光からなる合成光の強度を検出する。したがって、第１実施形態と同様の効果を得ることができる。

［第３実施形態の補足］
なお、第３実施形態のＯＣＴ装置においては、サンプルステージ１２によってｘｙ面における走査を行う代わりに、光スキャナ３１によって走査を行う構成としても良い。また、２つの走査方法を選択的に利用しても良いし、組み合わせて利用しても良い。

また、第３実施形態のＯＣＴ装置においては、光スキャナ３１によって斜入射を実現する例を示したが、本発明はこの例に限定されない。例えば、マイクロデバイスミラー、ＤＯＥ（高精度回折光学素子）、液晶などの空間変調素子などを用い、電気的な制御によって斜入射を実現しても良い。さらに、上述した空間変調素子などを用いて、第１実施形態および第２実施形態で説明したように、測定光を環状に形成しても良い。

［実施形態の変形例］
上述した各実施形態のＯＣＴ装置は、サンプルステージ１２を移動することにより、サンプル１１の側を変位させる方法（ステージスキャン型）を採用したが、照射スポットの側を変位させる方法（ビームスキャン型）を採用してもよい。また、２つの方法を選択的に利用しても良いし、組み合わせて利用しても良い。

図１０は、ビームスキャン型のＯＣＴ装置の一部の構成図である。図１０においては、図４における全反射ミラー７からビームスプリッタ４までの間に対応する部分を図示している。図１０に示すように、本変形例では、サンプルステージ１２が省略され、全反射ミラー５１、ミラー対５２ａおよび５２ｂ、ミラー対５３ａおよび５３ｂ、全反射ミラー５４の各部を備える。対物レンズ９、対物レンズ１０、アパーチャー１３は固定される。また、ミラー対５２ａおよび５２ｂの中心が対物レンズ９の瞳位置（図１０中Ｆａ）になるように配置されるとともに、ミラー対５３ａおよび５３ｂの中心が対物レンズ１０の瞳位置（図１０中Ｆｂ）になるように配置される。そして、制御装置１７は、ミラー対５２ａおよび５２ｂ、ミラー対５３ａおよび５３ｂの各部を同期して制御することにより、スキャンを行う。ミラー対５２ａおよび５２ｂは、図１１に示すような３次元の構造を有し、入射した光速を９０度曲げて射出する。ミラー対５３ａおよび５３ｂについても同様である。

また、上述した各実施形態のＯＣＴ装置は、光源（白色光源）を使用して白色の干渉光を分光検出する方法（フーリエドメイン型）を採用したが、光源波長を走査して各波長の干渉光を時分割で検出する方法（波長スキャン型）を採用してもよい。

因みに、波長スキャン型を採用した場合は、分光検出を行う必要が無いので、スペクトル検出器１８の代わりに撮像素子を使用することで、サンプル１１上のｘｙ方向各位置の干渉光強度を一括に検出してもよい。

また、上述した各実施形態のＯＣＴ装置は、光源（白色光源）を使用して干渉光を分光検出する方法（フーリエドメイン型）を採用したが、光源（白色光源）を使用し、かつ、測定光と参照光との光路長差を走査して白色の干渉光を走査位置毎に検出する方法（タイムドメイン型）を採用してもよい。

因みに、タイムドメイン型を採用した場合は、分光検出を行う必要が無いので、スペクトル検出器１８の代わりに撮像素子を使用することで、サンプル１１上のｘｙ方向各位置の干渉光強度を一括に検出してもよい。

また、上述した各実施形態では、照明光学系を制御（調整）することにより、被観察物に対して照明光を斜入射する例を示したが、本発明はこの例に限定されない。例えば、被観察物に対して照明光を垂直に入射した場合でも、被観察物であるサンプルのサンプルステージなどを傾ける制御（調整）を行うことにより、照明光を斜入射する場合と同様の効果を得ることができる。さらに、被観察物に対して照明光を斜入射する制御（調整）と、被観察物であるサンプルのサンプルステージなどを傾ける制御（調整）とを組み合わせて行っても良い。

また、上述した各実施形態のＯＣＴ装置において、偏光成分を利用しても良い。例えば、検出手段へ向かう参照光の偏光方向と、被観察物へ向かう測定光の偏光方向との間に差異を設け、検出手段へ向かう参照光と測定光との合成光から、干渉光を含む方向の偏光成分を透過させ、干渉光を含まない方向の偏光成分を除去することにより、偏光成分を利用した検出を行うことができる。

１…光源、３，４ビームスプリッタ、５…アキシコンレンズ、９，１０…対物レンズ、１１…サンプル、１３…アパーチャー、１４…分散補正用光学部材、１６…スペクトル検出器、１７…制御装置、１８…演算装置、２２…輪帯マスク、３１…光スキャナ

Claims (12)

1. 入射した低コヒーレンス光源からの光を参照光と測定光とに分岐する分岐手段と、
   前記測定光を観察光学系の光軸に対して所定角度傾いた方向から被観察物に照射する照明光学系と、
   前記被観察物に対して前記照明光学系と異なる側に配置され、前記被観察物を介した前記測定光のうち前記所定角度傾いた方向以外の方向へ向かう観察光を受光する観察光学系と、
   前記参照光と、前記観察光学系において受光された観察光とを合成する合成手段と、
   前記合成手段によって合成された前記参照光および前記観察光を分光して受光し、該参照光と該観察光との干渉強度をスペクトル信号として検出する検出装置と、
   前記スペクトル信号をフーリエ変換する演算装置と、
   を備えることを特徴とする観察装置。
2. 請求項１に記載の観察装置において、
   前記分岐手段に入射する光は、所定の波長域の光を含み、
   前記分岐手段は、所定の波長域の光を前記参照光と前記測定光とに分岐し、
   前記検出装置は、
   前記合成手段によって合成された前記参照光および前記観察光を分光する分光素子と、
   前記分光素子によって分光された光を、波長域ごとに前記干渉強度を検出する検出素子と、を含むことを特徴とする観察装置。
3. 請求項１又は請求項２に記載の観察装置において、
   前記照明光学系は、
   入射した光の強度分布をその光束の断面に沿った方向に環状に形成し、前記環状に形成された光を用いて、前記観察光学系の光軸に対して所定角度傾いた方向から前記被観察物を照射する斜入射照明を行う斜入射手段を備える
   ことを特徴とする観察装置。
4. 請求項３に記載の観察装置において、
   前記斜入射手段は、前記環状に形成された光を偏向する光学素子を含む
   ことを特徴とする観察装置。
5. 請求項３または請求項４に記載の観察装置において、
   前記斜入射手段は、
   前記照明光学系の光路に配置され、入射した光の強度分布をその光束の断面に沿った方向に環状に形成する形状制御手段を含む
   ことを特徴とする観察装置。
6. 請求項５に記載の観察装置において、
   前記斜入射手段は、前記形状制御手段として、入射した光の一部を遮光する遮光手段を含む
   ことを特徴とする観察装置。
7. 請求項１から請求項６の何れか一項に記載の観察装置において、
   前記斜入射照射される前記測定光の開口数NAが０．４＜NA＜０．８である
   ことを特徴とする観察装置。
8. 請求項１から請求項６の何れか一項に記載の観察装置において、
   前記斜入射照射される前記測定光の開口数NAが０．８である
   ことを特徴とする観察装置。
9. 請求項１から請求項８の何れか一項に記載の観察装置において、
   前記照明光学系と前記被観察物の位置を相対的に移動する走査手段を備える
   ことを特徴とする観察装置。
10. 請求項１から請求項９の何れか一項に記載の観察装置において、
    前記測定光と前記参照光との光路長差が４００μｍよりも短い
    ことを特徴とする観察装置。
11. 入射した光を参照光と測定光とに分岐することと、
    前記測定光を所定角度傾いた方向から被観察物に照射することと、
    前記被観察物に対して前記測定光を照射する側と異なる側から、前記被観察物を介した前記測定光のうち前記所定角度傾いた方向以外の方向へ向かう観察光を受光することと、
    前記参照光と前記受光した観察光とを合成することと、
    前記合成された前記参照光および前記観察光を分光して受光し、該参照光と該観察光との干渉強度をスペクトル信号として検出することと、
    前記スペクトル信号をフーリエ変換することと、
    を含むことを特徴とする観察方法。
12. 請求項１１に記載の観察方法において、
    前記入射した光は、所定の波長域の光を含み、
    前記分岐することは、
    所定の波長域の光を前記参照光と前記測定光とに分岐し、
    前記検出することは、
    前記合成された前記参照光および前記観察光を分光することと、
    分光された前記参照光および前記観察光を、波長域ごとに前記干渉強度を検出することと、を含むことを特徴とする観察方法。

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