JP5673641B2 - Immune inducer and its use - Google Patents
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Description
本発明は、ヒトの癌に特異的なタンパク質又はその部分ペプチドを含む免疫誘導剤に関する。さらに本発明は、上記ペプチドによって刺激され誘導された活性化Ｔ細胞、該ペプチドとＨＬＡ分子の複合体を含む抗原提示細胞、上記活性化Ｔ細胞又は上記抗原提示細胞を有効成分として含む医薬、前記タンパク質の遺伝子発現量を指標とした癌の検出方法、及び該タンパク質に対する抗体を含む癌の診断剤に関する。 The present invention relates to an immunity-inducing agent comprising a protein specific to human cancer or a partial peptide thereof. Furthermore, the present invention provides an activated T cell stimulated and induced by the peptide, an antigen-presenting cell containing a complex of the peptide and an HLA molecule, a medicament containing the activated T cell or the antigen-presenting cell as an active ingredient, The present invention relates to a cancer detection method using a gene expression level of a protein as an index, and a cancer diagnostic agent containing an antibody against the protein.
癌は全死亡原因の第一位を占める疾患であり、現在行われている治療は手術療法を主体に放射線療法と化学療法を組み合わせたものである。近年の新しい手術法の開発や新たな抗癌剤の発見にも関わらず、一部の癌を除いて、癌の治療成績はあまり向上していないのが現状である。 Cancer is the leading cause of all deaths, and the current treatment is a combination of radiation therapy and chemotherapy, mainly surgery. Despite the recent development of new surgical methods and the discovery of new anti-cancer drugs, the therapeutic results of cancer have not improved much except for some cancers.
近年、分子生物学や癌免疫学の進歩で癌に反応する細胞障害性Ｔ細胞により認識される癌抗原や癌抗原をコードする遺伝子が同定されてき、抗原特異性免疫療法への期待が高まっている（非特許文献１を参照）。１９９１年、ベルギーLudwig研究所のBoonらは自己癌細胞株と癌反応性Ｔ細胞を用いたｃＤＮＡ発現クローニング法によりＣＤ８陽性Ｔ細胞が認識するヒトメラノーマ抗原ＭＡＧＥ１を単離した（非特許文献２を参照）。Boonの報告後ＣＤ８陽性Ｔ細胞の認識する抗原としてtyrosinase（非特許文献３を参照）、MART1/MelanA（非特許文献４を参照）、ｇｐ１００（非特許文献５を参照）などの単離が行われた。 In recent years, advances in molecular biology and cancer immunology have identified cancer antigens recognized by cytotoxic T cells that respond to cancer and genes encoding cancer antigens, and expectations for antigen-specific immunotherapy have increased. (See Non-Patent Document 1). In 1991, Boon et al., Ludwig Laboratories, Belgium, isolated human melanoma antigen MAGE1 recognized by CD8 positive T cells by cDNA expression cloning using autologous cancer cell lines and cancer reactive T cells (see Non-Patent Document 2). reference). After Boon's report, isolation of tyrosine (see Non-Patent Document 3), MART1 / MelanA (see Non-Patent Document 4), gp100 (see Non-Patent Document 5), etc. as antigens recognized by CD8-positive T cells It was broken.
免疫療法においては、副作用を軽減するため、その抗原として認識されるタンパク質は、正常細胞には少なく、癌細胞に過剰に存在していることが望ましい。 In immunotherapy, in order to reduce side effects, it is desirable that the amount of protein recognized as an antigen is small in normal cells and excessive in cancer cells.
本発明の目的は、癌の治療及び／又は予防剤として有用なペプチドを見出し、該ペプチドの発現量を指標とした癌の検出方法を提供することである。さらに、本発明の目的は、前記ペプチドに対する抗体又はその抗原結合性断片の、癌の診断剤としての用途を提供することである。 An object of the present invention is to find a peptide useful as an agent for treating and / or preventing cancer, and to provide a method for detecting cancer using the expression level of the peptide as an index. Furthermore, an object of the present invention is to provide use of an antibody against the peptide or an antigen-binding fragment thereof as a diagnostic agent for cancer.
本願発明者らは、鋭意研究の結果、カルモジュリン２（以下ＣＡＬＭ２と略記することがある）がヒトの腫瘍組織において、正常組織と比較して有意に高発現していることを見出した（実施例１を参照）。そして、配列番号２で示されるアミノ酸配列を有する上記ＣＡＬＭ２タンパク中の部分ペプチドが、抗原提示細胞により提示されて、該ペプチドに特異的な細胞障害性Ｔ細胞を活性化及び増殖させる能力（免疫誘導活性）を有すること、このため、該ペプチドが癌の治療及び／又は予防に有用であり、また、該ペプチドと接触した抗原提示細胞や、該抗原提示細胞と接触したＴ細胞が癌の治療及び／又は予防に有用であることを見出し、本発明を完成した。 As a result of intensive studies, the present inventors have found that calmodulin 2 (hereinafter sometimes abbreviated as CALM2) is significantly expressed in human tumor tissues as compared with normal tissues (Examples). 1). And the partial peptide in the CALM2 protein having the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 2 is presented by antigen-presenting cells, and is capable of activating and proliferating cytotoxic T cells specific to the peptide (immunity induction) Therefore, the peptide is useful for the treatment and / or prevention of cancer, and antigen-presenting cells in contact with the peptide and T-cells in contact with the antigen-presenting cells are used for cancer treatment and / or prevention. The present invention was completed by finding it useful for prevention.
すなわち、本発明は、癌であるか否かを検出すべき患者から得た食道組織試料における、配列番号１に示す塩基配列を有するコード領域を有するカルモジュリン２遺伝子の発現を調べ、健常者由来の食道組織試料中の該遺伝子の発現量と比較することを含む、食道癌の検出方法であって、前記患者から分離された食道組織試料における該遺伝子の発現量が、健常者由来の食道組織試料中の該遺伝子の発現量よりも有意に高い場合に、前記患者における食道癌の存在が検出される、方法を提供する。さらに、本発明は、配列番号２で表されるアミノ酸配列を有するカルモジュリン２タンパク質と抗原抗体反応する抗体又はその抗原結合性断片を含む食道癌の診断剤を提供する。さらに、本発明は、癌であるか否かを検出すべき患者から得た食道組織試料における、配列番号２で表されるアミノ酸配列を有するカルモジュリン２タンパク質の蓄積量を調べ、健常者由来の食道組織試料中の該タンパク質の蓄積量と比較することを含む、食道癌の検出方法であって、前記患者から分離された食道組織試料における該タンパク質の蓄積量が、健常者由来の食道組織試料中の該タンパク質の蓄積量よりも有意に高い場合に、前記患者における食道癌の存在が検出される、方法を提供する。
That is, the present invention examines the expression of the
本発明により、癌の治療及び／又は予防や、そのための抗原提示細胞やＴ細胞の誘導に有用なペプチドが新規に同定され、医学分野における該ペプチドの各種用途が提供された。下記実施例において具体的に示されるように、前記ペプチドにより活性化されたＣＤ８陽性Ｔ細胞は、ＣＡＬＭ２を発現する癌細胞に対して優れた細胞障害活性を示す。従って、本発明で用いられるペプチドは、これをヒトに投与することにより、又はこれを用いてインビトロで活性化Ｔ細胞をヒトに投与することにより、癌の治療及び／又は予防に有効である。 According to the present invention, peptides useful for the treatment and / or prevention of cancer and the induction of antigen-presenting cells and T cells therefor have been newly identified, and various uses of the peptides in the medical field have been provided. As specifically shown in the Examples below, CD8 positive T cells activated by the peptide exhibit excellent cytotoxic activity against cancer cells expressing CALM2. Therefore, the peptide used in the present invention is effective for the treatment and / or prevention of cancer by administering it to humans, or by using this to administer activated T cells to humans in vitro.
本発明の免疫誘導剤に有効成分として含まれるペプチドとしては、以下のものが挙げられる。なお、「ペプチド」とは、複数のアミノ酸がペプチド結合することによって形成される分子をいい、構成するアミノ酸数が少ない低分子量の分子（オリゴペプチド）のみならず、アミノ酸数が多いポリペプチドやタンパク質も包含され、本発明ではカルモジュリン２の全長タンパク質も包含される。
(a) 配列番号２で表されるアミノ酸配列を有するカルモジュリン２タンパク質（以下ＣＡＬＭ２タンパク質と略記することがある）。
(b) (a)の断片であって、連続する７個以上のアミノ酸配列からなり、免疫誘導活性を有する断片（以下、便宜的に「免疫誘導性断片」と言うことがある）。
(c) (a)のカルモジュリン２タンパク質又は(b)の断片と、８０％以上の相同性を有し、免疫誘導活性を有するペプチド（以下、便宜的に「免疫誘導性修飾ペプチド」と言うことがある）。
(d) (a)のカルモジュリン２タンパク質、(b)の断片または(c)のペプチドを部分配列として含み、免疫誘導活性を有するペプチド（以下、便宜的に「免疫誘導性付加ペプチド」と言うことがある）。
Examples of the peptide contained as an active ingredient in the immunity-inducing agent of the present invention include the following. The term “peptide” refers to a molecule formed by peptide bonding of a plurality of amino acids. Not only a low molecular weight molecule (oligopeptide) having a small number of amino acids but also a polypeptide or protein having a large number of amino acids. In the present invention, the full-length protein of
(sometimes abbreviated as follows CALM2 protein)
(b) A fragment of (a), comprising a continuous 7 or more amino acid sequence and having immunity-inducing activity (hereinafter sometimes referred to as “immunity-inducing fragment” for convenience).
and fragment (c)
(d)
なお、本発明において、「アミノ酸配列を有する」とは、アミノ酸残基がそのような順序で配列しているという意味である。従って、例えば、「配列番号３で示されるアミノ酸配列を有するペプチド」とは、Thr Ile Asp Phe Pro Glu Phe Leu Thr Metのアミノ酸配列を持つ１０アミノ酸残基のサイズのペプチドを意味する。また、例えば、「配列番号３で示されるアミノ酸配列を有するペプチド」を「配列番号３のペプチド」と略記することがある。「塩基配列を有する」という表現についても同様である。 In the present invention, “having an amino acid sequence” means that amino acid residues are arranged in such an order. Therefore, for example, “a peptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3” means a peptide having a size of 10 amino acid residues having an amino acid sequence of Thr Ile Asp Phe Pro Glu Phe Leu Thr Met. In addition, for example, “a peptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3” may be abbreviated as “a peptide of SEQ ID NO: 3”. The same applies to the expression “having a base sequence”.
ここで、「免疫誘導活性」は、ＣＡＬＭ２を発現する癌細胞に反応するＴ細胞を活性化および増殖させる能力を意味し、具体的には、下記実施例に詳述する方法により測定される、ペプチドで刺激されたＴ細胞のIFN-γ産生能力及び／又はＣＡＬＭ２発現癌細胞に対する細胞障害活性が、ペプチドで刺激していない対照のＴ細胞よりも高く、かつ、ペプチドで刺激されたＴ細胞が、ペプチドで刺激していない対照のＴ細胞よりもよく増殖することを意味する。増殖は、目視観察、フローサイトメトリー、培地中のトリチウムチミジンの細胞内への取り込み量等により確認することができる。なお、下記実施例で採用したIFN-γ産生能力の測定は、例えばJ.Immunol.,154,p2257,1995に記載されており、また、細胞障害活性の測定は、Int.J.Cancer,58:p317,1994に記載された51Ｃｒリリースアッセイと呼ばれる公知の方法に準拠している。 Here, “immunity-inducing activity” means the ability to activate and proliferate T cells that respond to cancer cells that express CALM2, and is specifically measured by the methods detailed in the Examples below. The peptide-stimulated T cells have higher IFN-γ production capacity and / or cytotoxic activity against CALM2-expressing cancer cells than control T cells not stimulated with peptides, and T cells stimulated with peptides Means that it proliferates better than control T cells not stimulated with peptide. Proliferation can be confirmed by visual observation, flow cytometry, the amount of tritium thymidine in the medium incorporated into cells, and the like. The measurement of IFN-γ production ability employed in the following examples is described, for example, in J. Immunol., 154, p2257, 1995, and the measurement of cytotoxic activity is performed in Int. J. Cancer, 58 : P317,1994 conforms to a known method called 51 Cr release assay described in.
上記(a)のカルモジュリン２タンパク質をコードするＣＡＬＭ２遺伝子は、本願発明者らが、ＤＮＡマイクロアレイ解析により、ヒトの腫瘍組織において、正常組織と比較して有意に高発現していることを初めて見出したものである（実施例１を参照）。
CALM2
上記(b)の免疫誘導性断片は、配列番号２で表されるアミノ酸配列を有するカルモジュリン２タンパク質の断片であって、免疫誘導活性を有するものである。該断片は、配列番号２のアミノ酸配列中の連続する７個以上のアミノ酸からなり、好ましくは連続する９個以上のアミノ酸からなる。
Immunity-inducing fragments of (b) above is a fragment of
上記(c)の免疫誘導性修飾ペプチドは、前記(a)のカルモジュリン２タンパク質又は前記(b)の免疫誘導性断片のうちの少数のアミノ酸残基が置換し、欠失し及び／又は挿入され、元の配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上の同一性を有し、かつ、免疫誘導活性を有するペプチドである。ここで、アミノ酸配列の「同一性」とは、両者のアミノ酸配列残基ができるだけ多く一致するように（必要ならばギャップを挿入する）両アミノ酸配列を整列させ、一致したアミノ酸残基数を、全アミノ酸残基数（両者の配列で全アミノ酸残基数が異なる場合には長い方の配列の全アミノ酸残基数）で除したものを百分率で表したものであり、BLASTのような周知のソフトを用いて容易に算出することができる。また、該免疫誘導性修飾ペプチドは、前記(a)のカルモジュリン２タンパク質又は前記(b)の免疫誘導性断片のうちの１ないし数個のアミノ酸残基が置換し、欠失し及び／又は挿入されたペプチドであることも好ましい。なお、天然のタンパク質を構成する２０種類のアミノ酸は、低極性側鎖を有する中性アミノ酸（Gly, Ile, Val, Leu, Ala, Met, Pro)、親水性側鎖を有する中性アミノ酸（Asn, Gln, Thr, Ser, Tyr Cys)、酸性アミノ酸(Asp, Glu)、塩基性アミノ酸(Arg, Lys, His)、芳香族アミノ酸(Phe, Tyr, Trp)のように類似の性質を有するものにグループ分けでき、これらの間での置換であればペプチドの性質が変化しないことが多いことが知られている。従って、上記本発明の免疫誘導性部分ペプチド中のアミノ酸残基を置換する場合には、これらの各グループの間で置換することにより、免疫誘導活性を維持できる可能性が高くなる。
In the immunity-inducing modified peptide of (c), a small number of amino acid residues in the
上記(d)の免疫誘導性付加ペプチドは、前記(a)のカルモジュリン２タンパク質、前記(b)の免疫誘導性断片又は前記(c)の免疫誘導性修飾ペプチドを部分配列として含み、免疫誘導活性を有するペプチドである。すなわち、(a)のタンパク質、(b)の断片又は(c)のペプチドの一端又は両端に他のペプチドが付加されたものであって、免疫誘導活性を有するペプチドである。これらのペプチドも、本発明の免疫誘導剤等の調製に用いることができる。
Immunity-inducing added peptides (d) above comprises,
本発明で用いられる上記ペプチドの好ましい例として、配列番号２中の(1)aa9〜17の９アミノ酸の領域、(2)aa63〜72の１０アミノ酸の領域、(3)aa65〜73の９アミノ酸の領域又は(4)aa121〜129の９アミノ酸の領域を含む、９アミノ酸以上のペプチドを挙げることができる。なお、(1)ないし(4)の領域のアミノ酸配列は、配列表中にそれぞれ配列番号５、配列番号３、配列番号７、配列番号６として示されている。 Preferred examples of the peptide used in the present invention include (1) a region of 9 amino acids of aa9 to 17 in SEQ ID NO: 2, (2) a region of 10 amino acids of aa63 to 72, and (3) 9 amino acids of aa65 to 73 Or a peptide of 9 amino acids or more including the region of (4) 9 amino acids of aa121 to 129. The amino acid sequences of the regions (1) to (4) are shown in the sequence listing as SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 7, and SEQ ID NO: 6, respectively.
本発明で用いられる上記ペプチドは、例えば市販のペプチド合成機を用いて常法により容易に調製することができる。また、公知の遺伝子工学的手法を用いて容易に調製することができる。例えば、カルモジュリン２遺伝子を発現している組織から抽出したＲＮＡから、カルモジュリン２遺伝子のcDNAをＲＴ−ＰＣＲにより調製し、該cDNAの全長又は所望の一部を発現ベクターに組み込んで、宿主細胞中に導入し、目的とするペプチドを得ることができる。ＲＮＡの抽出、ＲＴ−ＰＣＲ、ベクターへのcDNAの組み込み、ベクターの宿主細胞への導入は周知の方法により行なうことができる。また、用いるベクターや宿主細胞も周知であり、種々のものが市販されている。
The peptide used in the present invention can be easily prepared by a conventional method using, for example, a commercially available peptide synthesizer. Moreover, it can prepare easily using a well-known genetic engineering method. For example, a cDNA of
下記実施例に具体的に記載されるように、上記ペプチドは、免疫誘導活性を示す。すなわち、該ペプチドで刺激したＴ細胞は、ＣＡＬＭ２を発現する癌細胞に対して細胞障害活性を示し、増殖する。従って、該ペプチドを有効成分として含む免疫誘導剤を生体に投与することにより、癌を治療及び／又は予防することができる。従って、本発明の免疫誘導剤は、癌の治療及び／又は予防剤として用いることができる。なお、下記実施例では、免疫誘導活性が高い領域を選択して用いているが、例えばカルモジュリン２タンパク質の全長を用いた場合であっても、生体内で分解され、結果として免疫誘導活性の高い領域を含む断片を生じることになるので、本発明では該タンパク質全長や、アミノ酸数が３０を超えるその断片、特に全長の半分以上のサイズを有する大きな断片を用いることもできる。
As specifically described in the examples below, the peptide exhibits immunity-inducing activity. That is, T cells stimulated with the peptide exhibit cytotoxic activity against cancer cells expressing CALM2 and proliferate. Therefore, cancer can be treated and / or prevented by administering an immunity-inducing agent containing the peptide as an active ingredient to a living body. Therefore, the immunity-inducing agent of the present invention can be used as a therapeutic and / or prophylactic agent for cancer. In the following examples, but the immune-inducing activity are selected and used a high area, for example even in the case of using the full length of the
本発明の免疫誘導剤を癌の治療及び／又は予防剤として用いる場合、対象となる癌としては、ＣＡＬＭ２を発現している癌を挙げることができ、脳腫瘍、頭、首、肺、子宮又は食道の扁平上皮癌、メラノーマ、肺または子宮の腺癌、腎癌等を挙げることができる。また、投与対象は、哺乳動物であり、特にヒトが好ましい。 When the immunity-inducing agent of the present invention is used as a therapeutic and / or prophylactic agent for cancer, the target cancer can include cancer expressing CALM2, and can include brain tumor, head, neck, lung, uterus or esophagus. Squamous cell carcinoma, melanoma, adenocarcinoma of the lung or uterus, renal cancer and the like. Further, the administration subject is a mammal, and a human is particularly preferable.
本発明の免疫誘導剤の生体への投与経路は、経口投与でも非経口投与でもよいが、筋肉内投与、皮下投与、静脈内投与、動脈内投与等の非経口投与が好ましい。また、投与量は、免疫誘導するのに有効な量、すなわち、ＣＡＬＭ２を発現する癌細胞に反応するＴ細胞を活性化および増殖させるのに有効な量であればよく、例えば癌の治療及び／又は予防に用いるのであれば、癌の治療及び／又は予防に有効な量であればよい。投与量は、症状、使用目的等に応じて適宜選択されるが、通常、0.0001μｇ〜1000μｇ、好ましくは0.001μｇ〜1000μｇであり、これを数日ないし数月に１回投与するのが好ましい。 The administration route to the living body of the immunity-inducing agent of the present invention may be oral administration or parenteral administration, but parenteral administration such as intramuscular administration, subcutaneous administration, intravenous administration and intraarterial administration is preferred. The dose may be an amount effective for inducing immunity, that is, an amount effective for activating and proliferating T cells responding to cancer cells expressing CALM2, for example, cancer treatment and / or Or if it is used for prevention, it may be an amount effective for the treatment and / or prevention of cancer. The dosage is appropriately selected according to symptoms, intended use, etc., but is usually 0.0001 μg to 1000 μg, preferably 0.001 μg to 1000 μg, and it is preferable to administer this once every several days to several months.
本発明の免疫誘導剤は、ペプチドのみから成っていてもよいし、各投与形態に適した、薬理学的に許容される担体及び／又は希釈剤を用いて製剤することができる。製剤方法及びそのための各種担体は、医薬製剤の分野において周知である。薬理学的に許容される担体又は希釈剤は、例えば、生理緩衝液のような緩衝液や、賦形剤（砂糖、乳糖、コーンスターチ、リン酸カルシウム、ソルビトール、グリシン等）であってよく、結合剤（シロップ、ゼラチン、アラビアゴム、ソルビトール、ポリビニルクロリド、トラガント等）、滑沢剤（ステアリン酸マグネシウム、ポリエチレングリコール、タルク、シリカ等）等が適宜混合されていてもよい。投与形態としては、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤などによる経口剤、吸入剤、注射剤、座剤、液剤などによる非経口剤などを挙げることができる。これらの製剤は一般的に知られている製法によって作ることができる。 The immunity-inducing agent of the present invention may consist of a peptide alone or can be formulated using a pharmacologically acceptable carrier and / or diluent suitable for each dosage form. Formulation methods and various carriers therefor are well known in the field of pharmaceutical formulation. The pharmacologically acceptable carrier or diluent may be, for example, a buffer solution such as a physiological buffer solution or an excipient (sugar, lactose, corn starch, calcium phosphate, sorbitol, glycine, etc.), and a binder ( Syrup, gelatin, gum arabic, sorbitol, polyvinyl chloride, tragacanth, etc.), lubricant (magnesium stearate, polyethylene glycol, talc, silica, etc.) and the like may be appropriately mixed. Examples of the dosage form include oral preparations such as tablets, capsules, granules, powders, and syrups, and parenteral preparations such as inhalants, injections, suppositories, and liquids. These preparations can be made by generally known production methods.
また、上記ペプチドを生体内に投与することにより、該ペプチドを生体内で抗原として認識させ、生体にあらかじめ該ペプチドに対する免疫を誘導することができる。従って、上記ペプチドを有効成分として含有する本発明の免疫誘導剤は、ワクチンとして用いることができる。この場合には、免疫誘導剤は、有効成分として含む上記ペプチドに加えてアジュバントを含むことが好ましい。アジュバントは、抗原の貯蔵所（細胞外またはマクロファージ内）を提供し、マクロファージを活性化し、かつ特定組のリンパ球を刺激することにより、免疫学的応答を強化し得る。多数の種類のアジュバントが、当業界で周知である。具体例としては、ＭＰＬ（SmithKline Beecham）、サルモネラ属のSalmonella minnesota Re 595リポ多糖類の精製および酸加水分解後に得られる同類物；ＱＳ２１（SmithKline Beecham）、Quillja saponaria抽出物から精製される純ＱＡ−２１サポニン；ＰＣＴ出願ＷＯ９６／３３７３９（SmithKline Beecham）に記載されたＤＱＳ２１；ＱＳ−７、ＱＳ−１７、ＱＳ−１８およびＱＳ−Ｌ１（ソ（So）、外１０名、「モレキュルズ・アンド・セル（Molecules and cells）」、１９９７年、第７巻、ｐ．１７８−１８６）；フロイントの不完全アジュバント；フロイントの完全アジュバント；ビタミンＥ；モンタニド；ミョウバン；ＣｐＧオリゴヌクレオチド（例えば、クレイグ（Kreig）、外７名、「ネイチャー（Nature）」、第３７４巻、ｐ．５４６−５４９）を参照）；ポリＩＣ；ポリＩＣＬＣ；ならびにスクアレンおよび／またはトコフェロールのような生分解性油から調製される種々の油中水エマルションが挙げられる。 In addition, by administering the peptide in vivo, the peptide can be recognized as an antigen in vivo, and immunity to the peptide can be induced in the body in advance. Therefore, the immunity-inducing agent of the present invention containing the peptide as an active ingredient can be used as a vaccine. In this case, the immunity-inducing agent preferably contains an adjuvant in addition to the above-mentioned peptide contained as an active ingredient. Adjuvants can enhance the immunological response by providing a reservoir of antigen (extracellular or in macrophages), activating macrophages and stimulating specific sets of lymphocytes. Many types of adjuvants are well known in the art. Specific examples include MPL (SmithKline Beecham), Salmonella minnesota Re 595 lipopolysaccharide of the genus Salmonella and the like obtained after acid hydrolysis; QS21 (SmithKline Beecham), pure QA- purified from Quillja saponaria extract 21 saponins; DQS21 described in PCT application WO 96/33739 (SmithKline Beecham); QS-7, QS-17, QS-18 and QS-L1 (So, outside 10 persons, “Molecules and Cell ( Molecules and cells), 1997, 7, p. 178-186); Freund's incomplete adjuvant; Freund's complete adjuvant; Vitamin E; Montanide; Alum; CpG oligonucleotide (eg, Kreig, et al. 7 (see “Nature”, Vol. 374, pages 546-549)); Poly IC; Poly ICLC; and various water-in-oil emulsions prepared from biodegradable oils such as squalene and / or tocopherol.
ワクチンとして免疫誘導剤を用いる場合、有効成分として含有されるペプチドは、好ましくはＤＱＳ２１／ＭＰＬの組合せと混合されて投与される。ＤＱＳ２１対ＭＰＬの比は、典型的には約１：１０〜１０：１，好ましくは約１：５〜５：１、さらに好ましくは約１：１である。典型的には、ヒト投与に関しては、ＤＱＳ２１およびＭＰＬは、約１μｇ〜約１００μｇの範囲でワクチン処方物中に存在する。その他のアジュバントが当業界で既知であり、本発明に用いられ得る（例えば、ゴッディング（Goding）著,「モノクローナル・アンチボディーズ：プリンシプル・アンド・プラクティス（Monoclonal Antibodies:Principles and Practice）」、第２版、１９８６年を参照）。ペプチドおよびアジュバントの混合物またはエマルションの調製方法は、予防接種の当業者には周知である。 When using an immunity-inducing agent as a vaccine, the peptide contained as an active ingredient is preferably administered mixed with a combination of DQS21 / MPL. The ratio of DQS21 to MPL is typically about 1:10 to 10: 1, preferably about 1: 5 to 5: 1, more preferably about 1: 1. Typically, for human administration, DQS21 and MPL are present in the vaccine formulation in the range of about 1 μg to about 100 μg. Other adjuvants are known in the art and can be used in the present invention (eg, Goding, “Monoclonal Antibodies: Principles and Practice”, 2nd edition). 1986). Methods for preparing peptide and adjuvant mixtures or emulsions are well known to those skilled in vaccination.
対象の免疫応答を刺激するその他の因子も、対象に投与され得る。例えばその他のサイトカインも、リンパ球刺激特性の結果として、予防接種プロトコルに有用である。このような目的のために有用な多数のサイトカインは当業者に既知であり、その例としては、ワクチンの防御作用を強化することが示されているインターフェロン、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１８およびＦｌｔ３リガンドが挙げられる。投与される場合、本発明の治療用組成物は、製薬上許容可能な調製物中で投与される。このような調製物は、製薬上許容可能な濃度の塩、緩衝剤、防腐剤、相溶性担体、補助免疫増強剤、例えばアジュバントおよびサイトカイン、ならびに任意にその他の療法的作用物質をルーチンに含有し得る。 Other factors that stimulate the subject's immune response may also be administered to the subject. For example, other cytokines are also useful in vaccination protocols as a result of lymphocyte stimulatory properties. Numerous cytokines useful for such purposes are known to those of skill in the art, examples of which include interferon, interleukin-12 (IL-12), which has been shown to enhance the protective effects of vaccines, GM-CSF, IL-18 and Flt3 ligand. When administered, the therapeutic composition of the present invention is administered in a pharmaceutically acceptable preparation. Such preparations routinely contain pharmaceutically acceptable concentrations of salts, buffers, preservatives, compatible carriers, co-immune enhancing agents such as adjuvants and cytokines, and optionally other therapeutic agents. obtain.
下記実施例において具体的に記載されるように、本発明で用いられる上記ペプチドと、抗原提示細胞をインビトロで接触させることにより、該ペプチドを抗原提示細胞に提示させることができる。すなわち、本発明の免疫誘導剤は、抗原提示細胞の処理剤として用いることができる。ここで、抗原提示細胞としては、ＨＬＡクラスI分子を保有する樹状細胞又はＢ細胞を好ましく用いることができる。種々のＨＬＡクラスI分子が同定されており、周知である。ＨＬＡクラスI分子としては、HLA-A、HLA-B、HLA-Cを挙げることができ、より具体的には、HLA-A1, HLA-A0201, HLA-A0204, HLA-A0205, HLA-A0206, HLA-A0207, HLA-A11, HLA-A24, HLA-A31, HLA-A6801, HLA-B7, HLA-B8, HLA-B2705, HLA-B37, HLA-Cw0401, HLA-Cw0602などを挙げることができる。 As specifically described in the following Examples, the peptide used in the present invention can be presented to antigen-presenting cells by contacting the antigen-presenting cells in vitro. That is, the immunity-inducing agent of the present invention can be used as a treatment agent for antigen-presenting cells. Here, as the antigen-presenting cell, a dendritic cell or a B cell possessing an HLA class I molecule can be preferably used. Various HLA class I molecules have been identified and are well known. Examples of HLA class I molecules include HLA-A, HLA-B, and HLA-C. More specifically, HLA-A1, HLA-A0201, HLA-A0204, HLA-A0205, HLA-A0206, HLA-A0207, HLA-A11, HLA-A24, HLA-A31, HLA-A6801, HLA-B7, HLA-B8, HLA-B2705, HLA-B37, HLA-Cw0401, HLA-Cw0602 and the like.
ＨＬＡクラスI分子を保有する樹状細胞又はＢ細胞は、周知の方法により末梢血から調製することができる。例えば、骨髄、臍帯血あるいは患者末梢血から、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）とIL-3（あるいはIL-4）を用いて樹状細胞を誘導し、その培養系に腫瘍関連ペプチドを加えることにより、腫瘍特異的な樹状細胞を誘導することができる。この樹状細胞を有効量投与することで、癌の治療に望ましい応答を誘導できる。用いる細胞は、健康人から提供された骨髄や臍帯血、患者本人の骨髄や末梢血等を用いることができるが、患者本来の自家細胞を使う場合は、安全性が高く、重篤な副作用を回避することも期待できる。末梢血または骨髄は新鮮試料、低温保存試料及び凍結保存試料のいずれでもよい。末梢血は、全血を培養してもよいし、白血球成分だけを分離して培養してもよいが、後者の方が効率的で好ましい。さらに白血球成分の中でも単核球を分離してもよい。また、骨髄や臍帯血を起源とする場合には、骨髄を構成する細胞全体を培養してもよいし、これから単核球を分離して培養してもよい。末梢血やその白血球成分、骨髄細胞には、樹状細胞の起源となる単核球、造血幹細胞又は未成熟樹状細胞やＣＤ４陽性細胞等が含まれている。用いられるサイトカインは、安全性と生理活性が確認された特性のものであれば、天然型、あるいは遺伝子組み換え型等、その生産手法については問わないが、好ましくは医療用に用いられる品質が確保された標品が必要最低量で用いられる。添加するサイトカインの濃度は、樹状細胞が誘導される濃度であれば特に限定されず、通常サイトカインの合計濃度で10〜1000ng/mL程度が好ましく、さらに好ましくは20〜500ng/mL程度である。培養は、白血球の培養に通常用いられている周知の培地を用いて行うことができる。培養温度は白血球の増殖が可能であれば特に限定されないが、ヒトの体温である37℃程度が最も好ましい。また、培養中の気体環境は白血球の増殖が可能であれば特に限定されないが、5％ＣＯ２を通気することが好ましい。さらに培養期間は、必要数の細胞が誘導される期間であれば特に限定されないが、通常3日〜2週間の間で行われる。細胞の分離や培養に供される機器は、適宜適当なものを用いることができるが、医療用に安全性が確認され、かつ操作が安定して簡便であることが好ましい。特に細胞培養装置については、シャーレ、フラスコ、ボトル等の一般的容器に拘わらず、積層型容器や多段式容器、ローラーボトル、スピナー式ボトル、バッグ式培養器、中空糸カラム等も用いることができる。 Dendritic cells or B cells carrying HLA class I molecules can be prepared from peripheral blood by well-known methods. For example, dendritic cells are induced from bone marrow, umbilical cord blood, or patient peripheral blood using granulocyte macrophage colony stimulating factor (GM-CSF) and IL-3 (or IL-4), and tumor-related peptides are introduced into the culture system. Can be added to induce tumor-specific dendritic cells. By administering an effective amount of this dendritic cell, a desired response for cancer treatment can be induced. The cells used can be bone marrow and umbilical cord blood provided by healthy people, the patient's own bone marrow and peripheral blood, etc., but when using the patient's own autologous cells, it is highly safe and has serious side effects. It can also be expected to avoid it. Peripheral blood or bone marrow may be a fresh sample, a cryopreserved sample, or a cryopreserved sample. As the peripheral blood, whole blood may be cultured, or only the leukocyte component may be separated and cultured, but the latter is more efficient and preferable. Furthermore, mononuclear cells may be separated among the leukocyte components. Moreover, when originating in bone marrow or umbilical cord blood, the whole cells constituting the bone marrow may be cultured, or mononuclear cells may be separated and cultured from this. Peripheral blood, its white blood cell components, and bone marrow cells include mononuclear cells, hematopoietic stem cells, immature dendritic cells, CD4 positive cells, and the like that are the origin of dendritic cells. As long as the cytokine used has a property that has been confirmed to be safe and physiologically active, it does not matter whether it is a natural type or a genetically engineered type, and its production method is preferably ensured. Are used in the minimum amount required. The concentration of the cytokine to be added is not particularly limited as long as it is a concentration at which dendritic cells are induced, and is usually preferably about 10 to 1000 ng / mL, more preferably about 20 to 500 ng / mL as the total concentration of cytokines. The culture can be performed using a well-known medium usually used for culturing leukocytes. The culture temperature is not particularly limited as long as leukocyte growth is possible, but is most preferably about 37 ° C. which is the human body temperature. Further, the gas environment during the culture is not particularly limited as long as leukocytes can be grown, but it is preferable to aerate 5% CO 2 . Further, the culture period is not particularly limited as long as a necessary number of cells are induced, but it is usually performed for 3 days to 2 weeks. As a device used for cell separation and culture, an appropriate device can be used as appropriate, but it is preferable that safety is confirmed for medical use and that the operation is stable and simple. In particular, for cell culture devices, stacked containers, multistage containers, roller bottles, spinner bottles, bag-type incubators, hollow fiber columns, etc. can be used regardless of general containers such as petri dishes, flasks, and bottles. .
本発明で用いられる上記ペプチドと抗原提示細胞をインビトロで接触させる方法自体は周知の方法により行なうことができ、下記実施例にも具体的に記載されている。すなわち、抗原提示細胞を、上記ペプチドを含む培養液中で培養することにより行なうことができる。培地中のペプチド濃度は、特に限定されないが、通常、１μg/mlないし100μg/ml程度、好ましくは5μg/mlないし20μg/ml程度である。培養時の細胞密度は特に限定されないが、通常、10３細胞/mlから107細胞/ml程度、好ましくは5x10４細胞/mlから５x106細胞/ml程度である。培養は、常法に従い、３７℃、５％CO2雰囲気中で行なうことが好ましい。なお、抗原提示細胞が表面上に提示できるペプチドの長さは、通常、最大で３０アミノ酸残基程度である。従って、特に限定されないが、抗原提示細胞とペプチドをインビトロで接触させる場合、該ペプチドをおよそ３０アミノ酸残基以下の長さに調製してもよい。 The method of contacting the peptide used in the present invention with an antigen-presenting cell in vitro can be performed by a well-known method, and is also specifically described in the following examples. That is, it can be performed by culturing antigen-presenting cells in a culture solution containing the peptide. The peptide concentration in the medium is not particularly limited, but is usually about 1 μg / ml to 100 μg / ml, preferably about 5 μg / ml to 20 μg / ml. The cell density at the time of culture is not particularly limited, but is usually about 10 3 cells / ml to 10 7 cells / ml, preferably about 5 × 10 4 cells / ml to 5 × 10 6 cells / ml. Cultivation is preferably carried out in a 37 ° C., 5% CO 2 atmosphere according to a conventional method. The length of the peptide that can be presented on the surface by antigen-presenting cells is usually about 30 amino acid residues at the maximum. Therefore, although not particularly limited, when an antigen-presenting cell is contacted with a peptide in vitro, the peptide may be prepared to a length of about 30 amino acid residues or less.
上記したペプチドの共存下において抗原提示細胞を培養することにより、ペプチドが抗原提示細胞のHLA分子に取り込まれ、抗原提示細胞の表面に提示される。本発明は、このような、上記ペプチドとＨＬＡ分子の複合体を含む、単離抗原提示細胞をも提供する。このような抗原提示細胞は、生体内又はインビトロにおいて、Ｔ細胞に対して該ペプチドを提示し、該ペプチドに特異的な細胞障害性Ｔ細胞を誘導し、増殖させる。 By culturing antigen-presenting cells in the presence of the above-described peptide, the peptide is taken up by the HLA molecule of the antigen-presenting cell and presented on the surface of the antigen-presenting cell. The present invention also provides an isolated antigen-presenting cell containing such a complex of the peptide and the HLA molecule. Such antigen-presenting cells present the peptide to T cells in vivo or in vitro, and induce and proliferate cytotoxic T cells specific for the peptide.
上記のようにして調製される、上記ペプチドとＨＬＡ分子の複合体とを含む抗原提示細胞を、Ｔ細胞とインビトロで接触させることにより、該ペプチドに特異的な細胞障害性Ｔ細胞を誘導し、増殖させることができる。これは、上記抗原提示細胞とＴ細胞とを液体培地中で共存培養することにより行なうことができる。例えば、抗原提示細胞を液体培地に懸濁して、マイクロプレートのウェル等の容器に入れ、これにＴ細胞を添加して培養することにより行なうことができる。共存培養時の抗原提示細胞とＴ細胞の混合比率は、特に限定されないが、通常、細胞数の比率で１：１〜１：１００程度、好ましくは１：５〜１：２０程度である。また、液体培地中に懸濁する抗原提示細胞の密度は、特に限定されないが、通常、１００〜１０００万細胞/ml程度、好ましくは１００００〜１００万細胞/ml程度である。共存培養は、常法に従い、３７℃、５％CO2雰囲気中で行なうことが好ましい。培養時間は、特に限定されないが、通常、２日〜３週間、好ましくは４日〜２週間程度である。また、共存培養は、IL-2、IL-6、IL-7及びIL-12のようなインターロイキンの１種又は複数の存在下で行なうことが好ましい。この場合、IL-2及びIL-7の濃度は、通常、5U/mlから20U/ml程度、IL-6の濃度は通常、500U/mlから2000U/ml程度、IL-12の濃度は通常、5ng/mlから20ng/ml程度であるが、これらに限定されるものではない。上記の共存培養は、新鮮な抗原提示細胞を追加して１回ないし数回繰り返してもよい。例えば、共存培養後の培養上清を捨て、新鮮な抗原提示細胞の懸濁液を添加してさらに共存培養を行なうという操作を、１回ないし数回繰り返してもよい。各共存培養の条件は、上記と同様でよい。なお、本明細書において、上記のように、ペプチドを抗原提示細胞の表面に提示させるためにペプチドを抗原提示細胞の培養液に加えることを、「ペプチドで細胞をパルスする」と呼ぶことがある。また、上記ペプチドを提示する抗原提示細胞とＴ細胞を接触させることを、「ペプチドでＴ細胞を刺激する」と呼ぶことがある。 Inducing cytotoxic T cells specific to the peptide by contacting the antigen-presenting cells prepared as described above containing the complex of the peptide and the HLA molecule with T cells in vitro, Can be propagated. This can be done by co-culturing the antigen-presenting cells and T cells in a liquid medium. For example, it can be carried out by suspending antigen-presenting cells in a liquid medium, placing them in a container such as a well of a microplate, adding T cells thereto, and culturing. The mixing ratio of antigen-presenting cells and T cells during co-culture is not particularly limited, but is usually about 1: 1 to 1: 100, preferably about 1: 5 to 1:20 in terms of the number of cells. The density of antigen-presenting cells suspended in the liquid medium is not particularly limited, but is usually about 1 to 10 million cells / ml, preferably about 10,000 to 1 million cells / ml. The coculture is preferably performed in a 37 ° C., 5% CO 2 atmosphere according to a conventional method. The culture time is not particularly limited, but is usually 2 days to 3 weeks, preferably about 4 days to 2 weeks. The coculture is preferably performed in the presence of one or more interleukins such as IL-2, IL-6, IL-7 and IL-12. In this case, the concentration of IL-2 and IL-7 is usually about 5 U / ml to about 20 U / ml, the concentration of IL-6 is usually about 500 U / ml to about 2000 U / ml, and the concentration of IL-12 is usually about Although it is about 5 ng / ml to 20 ng / ml, it is not limited to these. The above co-culture may be repeated once to several times by adding fresh antigen-presenting cells. For example, the operation of discarding the culture supernatant after co-culture, adding a fresh antigen-presenting cell suspension, and further co-culturing may be repeated once to several times. The conditions for each co-culture may be the same as described above. In the present specification, as described above, adding a peptide to a culture solution of an antigen-presenting cell in order to present the peptide on the surface of the antigen-presenting cell is sometimes referred to as “pulse the cell with the peptide”. . Further, contacting an antigen-presenting cell presenting the peptide with a T cell may be referred to as “stimulating the T cell with a peptide”.
上記の共存培養により、該ペプチドに特異的な細胞障害性Ｔ細胞が誘導され、増殖される。本発明は、このような、上記ペプチドとＨＬＡ分子の複合体を選択的に結合する、単離Ｔ細胞をも提供する。 By the co-culture described above, cytotoxic T cells specific for the peptide are induced and proliferated. The present invention also provides an isolated T cell that selectively binds the complex of the peptide and the HLA molecule.
上記ペプチドを提示する上記抗原提示細胞は、生体内においても該ペプチドに特異的な細胞障害性Ｔ細胞を誘導し、増殖させることができるので、これを生体に投与することにより癌の治療及び／又は予防を行なうことができる。また、上記ペプチドとＨＬＡ分子の複合体を選択的に結合する、Ｔ細胞は、ＣＡＬＭ２を発現する癌細胞に対して細胞障害活性を示すので、該Ｔ細胞を生体に投与することによっても癌の治療及び／又は予防を行なうことができる。従って、本発明は、上記本発明の抗原提示細胞を有効成分として含有する医薬、並びに癌の治療及び／又は予防剤、並びに上記本発明のＴ細胞を有効成分として含有する医薬、並びに癌の治療及び／又は予防剤をも提供する。治療対象となる癌の例としては、当然ながら、上記ペプチドを有効成分として含有する癌の治療及び／又は予防剤の対象として上記した癌を挙げることができる。 Since the antigen-presenting cells presenting the peptide can induce and proliferate cytotoxic T cells specific to the peptide in vivo, administration of this to the body can treat cancer and / or Or prevention can be performed. In addition, T cells that selectively bind a complex of the peptide and the HLA molecule exhibit cytotoxic activity against cancer cells that express CALM2. Therefore, administration of the T cells to a living body also causes cancer. Treatment and / or prevention can be performed. Therefore, the present invention provides a medicament containing the antigen-presenting cell of the present invention as an active ingredient, and a therapeutic and / or prophylactic agent for cancer, a medicament containing the T cell of the present invention as an active ingredient, and a treatment for cancer. And / or a prophylactic agent. As an example of cancer to be treated, of course, the above-mentioned cancer can be mentioned as a therapeutic and / or preventive agent for cancer containing the peptide as an active ingredient.
生体に投与する抗原提示細胞又はＴ細胞は、これらの細胞を異物として攻撃する生体内での免疫応答を回避するために、治療を受ける患者から採取した抗原提示細胞又はＴ細胞を、上記のように本発明で用いられる上記ペプチドを用いて調製したものであることが好ましい。 Antigen presenting cells or T cells administered to a living body are antigen-presenting cells or T cells collected from a patient to be treated in order to avoid an in vivo immune response that attacks these cells as foreign substances. It is preferable that the peptide is prepared using the peptide used in the present invention.
抗原提示細胞又はＴ細胞を有効成分として含む癌の治療及び／又は予防剤の投与経路は、静脈内投与や動脈内投与のような非経口投与が好ましい。また、投与量は、症状や投与目的等に応じて適宜選択されるが、通常1個〜10兆個、好ましくは100万個〜10億個であり、これを数日ないし数月に１回投与するのが好ましい。製剤は、例えば、細胞を生理緩衝食塩水に懸濁したもの等であってよく、他の抗癌剤やサイトカイン等と併用することもできる。また、製剤分野において周知の１又は２以上の添加剤を添加することもできる。 The administration route of the therapeutic and / or prophylactic agent for cancer containing antigen-presenting cells or T cells as an active ingredient is preferably parenteral administration such as intravenous administration or intraarterial administration. The dose is appropriately selected according to symptoms, purpose of administration, etc., but is usually 1 to 10 trillion, preferably 1 million to 1 billion, and this is once every few days to several months. Administration is preferred. The preparation may be, for example, one in which cells are suspended in physiological buffer saline, and can be used in combination with other anticancer agents, cytokines, and the like. In addition, one or two or more additives well known in the pharmaceutical field can be added.
本発明が開示する、癌の治療及び／又は予防に用いることができるＣＡＬＭ２タンパク質のアミノ酸配列自体は、配列番号２に示すとおり公知であり、ＣＡＬＭ２遺伝子のコード領域の塩基配列も配列番号１に示すとおり公知である。従って、ＣＡＬＭ２タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含み、哺乳動物細胞中で該ポリヌクレオチドを発現することができる組換えベクターを調製することができ、該組換えベクターを癌の治療及び／又は予防のための遺伝子ワクチンとして利用することができる。 The present invention is disclosed, the amino acid sequence itself of CALM2 proteins that can be used in the treatment and / or prevention of cancer are known as shown in SEQ ID NO: 2, also in SEQ ID NO: 1 nucleotide sequence of the coding region of CALM2 gene As shown, it is known. Therefore, CALM2 includes polynucleotides encoding the protein, in mammalian cells it is possible to prepare recombinant vectors capable of expressing the polynucleotide, a recombinant vector of cancer treatment and / or prophylaxis It can be used as a genetic vaccine for
ベクターに挿入するポリヌクレオチドとしては、配列番号１に示される塩基配列を有するポリヌクレオチドであってもよく、また、上記した免疫誘導性断片をコードする領域の塩基配列を有するものであってもよい。あるいは、その保存的置換塩基配列（コードするアミノ酸配列が同じで塩基配列が異なるもの）を用いることができる。なお、各アミノ酸をコードするコドンは公知であるから、特定のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの塩基配列は容易に特定することができる。従って、上記した免疫誘導性修飾ペプチド及び免疫誘導性付加ペプチドをコードするポリヌクレオチドの塩基配列も容易に特定することができる。これらのポリヌクレオチドは、市販の核酸合成機を用いて常法により合成することができる。これらのポリヌクレオチドをベクターに挿入してもよい。また、ポリヌクレオチドはＤＮＡでもＲＮＡでもよい。 The polynucleotide to be inserted into the vector may be a polynucleotide having the base sequence shown in SEQ ID NO: 1, or may have a base sequence of the region encoding the above-described immunity-inducing fragment. . Alternatively, conservative substitution base sequences (same amino acid sequences but different base sequences) can be used. In addition, since the codon which codes each amino acid is well-known, the base sequence of the polynucleotide which codes a specific amino acid sequence can be specified easily. Therefore, the nucleotide sequence of the polynucleotide encoding the above-described immunity-inducing modified peptide and immunity-inducing added peptide can also be easily specified. These polynucleotides can be synthesized by a conventional method using a commercially available nucleic acid synthesizer. These polynucleotides may be inserted into the vector. The polynucleotide may be DNA or RNA.
哺乳動物細胞に遺伝子導入するためのベクターとしては、プラスミドベクターでもウイルスベクターでもよく、これら自体は周知であり、種々のものが市販されているので、市販のベクターを利用することができる。市販のベクターのマルチクローニング部位に上記したポリヌクレオチドを挿入することにより、前記組換えベクターを得ることができる。 The vector for introducing a gene into a mammalian cell may be a plasmid vector or a viral vector, and these are well known per se, and various vectors are commercially available, and commercially available vectors can be used. The recombinant vector can be obtained by inserting the above-described polynucleotide into a multicloning site of a commercially available vector.
遺伝子ワクチンの投与経路は、好ましくは筋肉内投与、皮下投与、静脈内投与、動脈内投与等の非経口投与経路であり、投与量は、抗原の種類等に応じて適宜選択することができるが、通常、体重１ｋｇ当たり、遺伝子ワクチンの重量で0.1μg〜100mg程度、好ましくは1μg〜10mg程度である。 The administration route of the gene vaccine is preferably a parenteral administration route such as intramuscular administration, subcutaneous administration, intravenous administration or intraarterial administration, and the dosage can be appropriately selected according to the type of antigen and the like. Usually, the weight of the genetic vaccine per kg body weight is about 0.1 μg to 100 mg, preferably about 1 μg to 10 mg.
ウイルスベクターによる方法としては、例えばレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス、シンドビスウイルス等のＲＮＡ ウイルスまたはＤＮＡ ウイルスに本発明のＤＮＡ を組み込んで導入する方法が挙げられる。この中で、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ワクシニアウイルス等を用いた方法が特に好ましい。 As a method using a viral vector, for example, the DNA of the present invention is incorporated into a retrovirus, adenovirus, adeno-associated virus, herpes virus, vaccinia virus, poxvirus, poliovirus, Sindbis virus or the like by incorporating the DNA of the present invention. A method is mentioned. Of these, methods using retroviruses, adenoviruses, adeno-associated viruses, vaccinia viruses and the like are particularly preferred.
その他の方法としては、発現プラスミドを直接筋肉内に投与する方法（ＤＮＡワクチン法）、リポソーム法、リポフェクチン法、マイクロインジェクション法、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法等が挙げられ、特にＤＮＡワクチン法、リポソーム法が好ましい。 Examples of other methods include a method in which an expression plasmid is directly administered into muscle (DNA vaccine method), a liposome method, a lipofectin method, a microinjection method, a calcium phosphate method, an electroporation method, and the like. The method is preferred.
本発明で用いられる上記ペプチドをコードする遺伝子を実際に医薬として作用させるには、遺伝子を直接体内に導入するin vivo方法、およびヒトからある種の細胞を採取し体外で遺伝子を該細胞に導入しその細胞を体内に戻すex vivo方法がある（日経サイエンス，１９９４年４月，ｐ２０−４５、月刊薬事，１９９４年，第３６巻，第１号，ｐ．２３−４８、実験医学増刊，１９９４年，第１２巻，第１５号、およびこれらの引用文献等）。in vivo方法がより好ましい。 In order for the gene encoding the peptide used in the present invention to actually act as a medicine, an in vivo method in which the gene is directly introduced into the body, and a certain type of cell is collected from a human and introduced into the cell outside the body. There is an ex vivo method for returning the cells to the body (Nikkei Science, April 1994, p20-45, Monthly Pharmaceutical Affairs, 1994, Vol. 36, No. 1, p.23-48, Experimental Medicine Extra Number, 1994. Year, Vol. 12, No. 15, and references cited therein). In vivo methods are more preferred.
in vivo方法により投与する場合は、治療目的の疾患、症状等に応じた適当な投与経路により投与され得る。例えば、静脈、動脈、皮下、筋肉内などに投与することが出来る。in vivo方法により投与する場合は、例えば、液剤等の製剤形態をとりうるが、一般的には、有効成分である本発明で用いられる上記ペプチドをコードするＤＮＡを含有する注射剤等とされ、必要に応じて、慣用の担体を加えてもよい。また、該ＤＮＡを含有するリポソームまたは膜融合リポソーム（センダイウイルス（ＨＶＪ）−リポソーム等）においては、懸濁剤、凍結剤、遠心分離濃縮凍結剤等のリポソーム製剤の形態とすることができる。 When administered by an in vivo method, it can be administered by an appropriate route according to the disease, symptom or the like for the purpose of treatment. For example, it can be administered intravenously, artery, subcutaneously, intramuscularly. When administered by an in vivo method, for example, it can take a pharmaceutical form such as a solution, but is generally an injection containing a DNA encoding the peptide used in the present invention as an active ingredient, etc. If necessary, a conventional carrier may be added. In addition, the liposome or membrane-fused liposome (Sendai virus (HVJ) -liposome etc.) containing the DNA can be in the form of a liposome preparation such as a suspension, a freezing agent, a centrifugal concentrated freezing agent and the like.
一方、大腸菌や酵母菌などの微生物用のベクターも周知であり、種々のものが市販されている。微生物用のベクターに上記ポリヌクレオチドを組み込んだ組換えベクターは、本発明で用いられる上記ペプチドを遺伝子工学的に大量生産するために用いることができる。微生物への組換えベクターの組み込みは周知の方法により行なうことができる。 On the other hand, vectors for microorganisms such as Escherichia coli and yeast are well known, and various types are commercially available. A recombinant vector in which the polynucleotide is incorporated into a vector for microorganisms can be used for mass production of the peptide used in the present invention by genetic engineering. Integration of the recombinant vector into the microorganism can be performed by a well-known method.
下記実施例１に記載される通り、カルモジュリン２遺伝子（そのコード領域の塩基配列を配列番号１に示す）は、食道癌組織において正常食道組織よりも有意に高発現している。従って、癌の疑いのある患者から得た食道組織試料における、該カルモジュリン２遺伝子の発現量を、健常者から得た食道組織試料における発現量と比較することにより、該患者が食道癌であるか否かを調べることができる。発現量の比較は、例えば以下のようにして行うことができる。先ず、食道癌を罹患していることが分かっている複数の患者と、複数の健常者とから食道組織試料を得て、カルモジュリン２遺伝子の発現量を調べ、癌患者集団と健常者集団それぞれについてカルモジュリン２遺伝子発現量の基準値を定める。そして、癌であるか否かを診断すべき患者から食道組織試料を得て、該試料中のカルモジュリン２遺伝子発現量を調べ、前記基準値と比較する。発現量が健常者基準値よりも有意に高く、癌患者基準値に近ければ、その患者は食道癌である可能性が高いと考えられる。健常者基準値との比較のみでも食道癌の検出は可能であるが、癌患者基準値とも比較することにより、さらに検出精度を高めることができる。なお、前記基準値は、例えば、各試料における発現量を数値化し、その平均値を算出することによって定めることができる。なお、遺伝子の発現量は、該遺伝子から生産されるmRNA又はタンパク質の量を測定することにより調べることができる。試料としては、例えばヒト由来の食道組織を用いることができる。mRNA又はタンパク質の量は常法により測定することができる。例えば、カルモジュリン２のmRNAは、該mRNAを鋳型とするリアルタイム検出RT-PCRのような常法により定量することができ、常法であるノーザンブロットにおける染色強度等によっても概ね定量することができる。また、タンパク質の量は、常法である免疫測定により定量することができる。
As described in Example 1 below, the
カルモジュリン２タンパク質と抗原抗体反応する抗体又はその抗原結合性断片を作製し、これを用いて免疫測定を行うことにより、試料中のカルモジュリン２タンパク質の検出又は定量を行うことができる。食道癌組織中では正常食道組織よりも有意にカルモジュリン２遺伝子の発現量が高いので、該遺伝子にコードされるカルモジュリン２タンパク質の蓄積量も有意に高いと考えられる。従って、そのような抗体又はその抗原結合性断片を用いることによっても、上記の通り食道癌の検出を行うことができる。すなわち、本発明は、カルモジュリン２タンパク質と抗原抗体反応する抗体又はその抗原結合性断片を含む食道癌の診断剤をも提供する。本発明の食道癌の診断剤を用いた食道癌の検出は、上記したカルモジュリン２遺伝子の発現量を指標とする食道癌の検出方法と同様に、癌の疑いのある患者由来の食道組織試料と健常者由来の食道組織試料との間でのタンパク質蓄積量の比較に基づいて行うことができる。
Antibody or antigen-binding fragment thereof that
ここで、抗原結合性断片とは、抗体分子中に含まれるFab断片やF(ab')2断片のような、抗原との結合能を有する抗体断片を意味する。抗体はポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でもよいが、免疫測定等のためには、再現性の高いモノクローナル抗体が好ましい。ペプチドを免疫原とするポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体の調製方法は周知であり、常法により容易に行なうことができる。例えば、ペプチドをキーホールリンペットヘモシアニン(KLH)やカゼイン等のキャリアタンパク質に結合させたものを免疫原とし、アジュバントと共に動物に免疫することにより該ペプチドに対する抗体を誘起することができる。免疫した動物から採取した脾細胞やリンパ球のような抗体産生細胞をミエローマ細胞と融合させてハイブリドーマを調製し、本発明のペプチドと結合する抗体を産生するハイブリドーマを選択し、これを増殖させて培養上清から本発明のペプチドを対応抗原とするモノクローナル抗体を得ることができる。なお、上記の方法は周知の常法である。 Here, the antigen-binding fragment means an antibody fragment having the ability to bind to an antigen, such as a Fab fragment or F (ab ′) 2 fragment contained in an antibody molecule. The antibody may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody, but a highly reproducible monoclonal antibody is preferable for immunoassay and the like. Methods for preparing polyclonal and monoclonal antibodies using a peptide as an immunogen are well known and can be easily performed by conventional methods. For example, an antibody against a peptide can be induced by immunizing an animal with an adjuvant using a peptide bound to a carrier protein such as keyhole limpet hemocyanin (KLH) or casein as an immunogen. Hybridomas are prepared by fusing antibody-producing cells such as spleen cells and lymphocytes collected from immunized animals with myeloma cells, and hybridomas producing antibodies that bind to the peptides of the present invention are selected and proliferated. A monoclonal antibody having the peptide of the present invention as a corresponding antigen can be obtained from the culture supernatant. The above method is a well-known ordinary method.
免疫測定自体はこの分野において周知であり、反応様式で分類すると、サンドイッチ法、競合法、凝集法、ウェスタンブロット法等があり、フローサイトメトリーも免疫測定の１種と考えることができる。また、標識で分類すると、放射免疫測定、蛍光免疫測定、酵素免疫測定、ビオチン免疫測定等があり、上記抗体又はその抗原結合性断片はこれらのいずれにも用いることができる。癌の診断剤として用いる場合は、操作が簡便で大掛かりな装置等を必要としないサンドイッチELISAや凝集法を適用することが好ましい。なお、本発明で用いられる上記ペプチドは、該ペプチドを発現する細胞を競合法で検出又は測定する場合の免疫測定用試薬として用いることもできる。 Immunoassays themselves are well known in this field. When classified by reaction mode, there are a sandwich method, a competition method, an agglutination method, a Western blot method, and the like, and flow cytometry can also be considered as one type of immunoassay. Further, when classified by label, there are radioimmunoassay, fluorescent immunoassay, enzyme immunoassay, biotin immunoassay and the like, and the above antibody or antigen-binding fragment thereof can be used for any of these. When used as a diagnostic agent for cancer, it is preferable to apply a sandwich ELISA or an agglutination method that is simple in operation and does not require a large-scale apparatus. In addition, the said peptide used by this invention can also be used as a reagent for immunoassay in the case of detecting or measuring the cell which expresses this peptide by a competition method.
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。 Hereinafter, the present invention will be described more specifically based on examples.
実施例１：癌組織のDNAマイクロアレイ解析
（１）実験者の臨床病理学的所見
インフォームドコンセントを得た１１９名の食道ガン患者から、食道ガン摘出手術時又は食道生検実施時に食道の摘出組織を得た。摘出された組織片について肉眼的及び／又は病理組織学的に食道ガン組織を判断し、食道ガン病変部と正常組織部を分けてただちに凍結し、液体窒素中で保存した。
Example 1: DNA microarray analysis of cancer tissue (1) Clinicopathological findings of experimenter From 119 esophageal cancer patients who obtained informed consent, the esophageal excision tissue at the time of esophageal cancer excision surgery or esophageal biopsy Got. Esophageal cancer tissue was determined macroscopically and / or histopathologically for the excised tissue piece, and the esophageal cancer lesion and normal tissue were separated and immediately frozen and stored in liquid nitrogen.
（２）全ＲＮＡ抽出とｃＤＮＡの調製
試料として食道ガン患者の食道組織における食道ガン病変部の組織、及び同一食道組織における非ガン組織（正常組織）を用いた。おのおのの組織から、Trizol reagent（Invitrogen社）を用いて、同社推奨のプロトコールにより全ＲＮＡを調製した。
(2) Extraction of total RNA and preparation of cDNA As a sample, a tissue of an esophageal cancer lesion in an esophageal tissue of an esophageal cancer patient and a non-cancerous tissue (normal tissue) in the same esophageal tissue were used. Total RNA was prepared from each tissue using Trizol reagent (Invitrogen) according to the recommended protocol.
上述の方法で得られた全ＲＮＡ １μｇについて、oligo(dT)プライマー及びランダムノナマーを併用し、CyScribe First-Strand CDNA Labeling Kit（ＧＥヘルスケア社）を用いてメーカー推奨のプロトコールで逆転写反応を行った。正常組織由来又は食道ガン組織由来の全ＲＮＡにはCy3-dUTP（ＧＥヘルスケア社）を、リファレンス全ＲＮＡ（Stratagene社）にはCy5-dUTP（ＧＥヘルスケア社）を添加して、メーカー推奨のプロトコールで逆転写反応時にｃＤＮＡの標識を行った。標識されたｃＤＮＡはQIA quick PCR purification Kit（QIAGEN社）で精製してからハイブリダイズに用いた。 For 1 μg of total RNA obtained by the above method, reverse transcription reaction using oligo (dT) primer and random nonamer and CyScribe First-Strand CDNA Labeling Kit (GE Healthcare) according to the manufacturer's recommended protocol went. Add Cy3-dUTP (GE Healthcare) to total RNA from normal tissue or esophageal cancer tissue, and add Cy5-dUTP (GE Healthcare) to reference total RNA (Stratagene). The cDNA was labeled during the reverse transcription reaction according to the protocol. The labeled cDNA was purified by QIA quick PCR purification Kit (QIAGEN) and used for hybridization.
（３）オリゴＤＮＡマイクロアレイの作製
オリゴＤＮＡマイクロアレイとしてはAffymetrix社GeneChip（登録商標）(Human Genome U133 A)及び本明細書中で述べる方法に従って作製したＤＮＡチップを使用した。
(3) Production of Oligo DNA Microarray As oligo DNA microarray, Affymetrix GeneChip (registered trademark) (Human Genome U133 A) and a DNA chip produced according to the method described in this specification were used.
ＤＮＡチップの作製方法を以下に示す。最初に搭載するオリゴＤＮＡの種類を決定するために、Affymetrix社GeneChip（登録商標）を用いて遺伝子の絞込みを行った。GeneChip（登録商標）の操作については、Complete GeneChip（登録商標） Instrument System及び添付の指示書に基づいて実施した。Complete GeneChip（登録商標）を用いた解析の結果、食道ガンによって発現変動が起こる可能性がある遺伝子及び実験対照となりうる遺伝子を計８９６１種抽出した。 A method for producing a DNA chip is shown below. In order to determine the type of oligo DNA to be loaded first, genes were narrowed down using Affymetrix GeneChip (registered trademark). The operation of GeneChip (registered trademark) was performed based on Complete GeneChip (registered trademark) Instrument System and the attached instructions. As a result of the analysis using Complete GeneChip (registered trademark), a total of 8961 genes that may change expression due to esophageal cancer and genes that can serve as experimental controls were extracted.
抽出した８９６１種の遺伝子について、配列の重複をおこさないように配列特異性が高い部位の配列６０−７０ｍｅｒをそれぞれ選択して合成した。４倍に希釈したSolution I（タカラバイオ社）に３０μＭとなるように溶解した、８９６１種の６０又は７０ｍｅｒからなる合成オリゴＤＮＡを、MATSUNAMI ＤＮＡマイクロアレイ用コートグラスＤＭＳＯ対応TypeIアミノ修飾オリゴＤＮＡ固定コート（松浪硝子工業株式会社）上にスポッター（GMS417arrayer，Affymetrix社）を用いて湿度環境５０−６０％でスポットした。 With respect to the extracted 8961 genes, sequences 60-70mer having a high sequence specificity were selected and synthesized so as not to cause sequence duplication. 8961 kinds of 60 or 70mer synthetic oligo DNA dissolved in Solution I (Takara Bio Inc.) diluted 4-fold was applied to a MTSUNAMI DNA microarray coated glass DMSO-compatible Type I amino-modified oligo DNA fixed coat ( Spotted in a humidity environment of 50-60% using a spotter (GMS417arrayer, Affymetrix) on Matsunami Glass Industrial Co., Ltd.
（４）ハイブリダイゼーション
標識したｃＤＮＡ 1μgをアンチセンスオリゴカクテル（QIAGEN）に溶解し、Ｇａｐカバーグラス（松浪硝子工業）を載せたＤＮＡチップにアプライし、４２℃で１６時間ハイブリダイズを行った。ハイブリダイズ終了後、ＤＮＡチップを２ｘＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ、１ｘＳＳＣ、０．２ｘＳＳＣで順次洗浄した。
(4)
（５）遺伝子発現量の測定
上述の方法によりハイブリダイゼーションを行ったＤＮＡチップをAgilentマイクロアレイスキャナー（Agilent社）を用いてスキャンし、画像を取得して蛍光強度を数値化した。統計学的処理はSpeed T.著「Statistical analysis of gene expression microarray data」Chapman & Hall/CRC，及びCauston H.C.ら著「A beginner's guide Microarray gene expression data analysis」Blackwell publishingを参考にして行った。すなわちハイブリダイズ後の画像解析から得られたデータについて、それぞれの対数値をとり、global normalizationとLOWESS（locally weighted scatterplot smoother）による平滑化を行い、ＭＡＤによるスケーリング処理によってノーマライゼーション補正を行った。その結果、食道ガン病変部における発現量が、非ガン組織部よりも多い遺伝子として、ＣＡＬＭ２を見出すことができた。
(5) Measurement of gene expression level The DNA chip hybridized by the above-mentioned method was scanned using an Agilent microarray scanner (Agilent), the image was acquired, and the fluorescence intensity was digitized. Statistical processing was performed with reference to Speed T. "Statistical analysis of gene expression microarray data" Chapman & Hall / CRC and Causton HC et al. "A beginner's guide Microarray gene expression data analysis" Blackwell publishing. That is, the logarithmic values of the data obtained from the image analysis after hybridization were taken, smoothed by global normalization and LOWESS (locally weighted scatterplot smoother), and normalized by the scaling process by MAD. As a result, CALM2 could be found as a gene whose expression level in esophageal cancer lesions was higher than that in non-cancerous tissues.
実施例２：ＣＡＬＭ２由来ペプチドエピトープ反応性ＣＤ８陽性Ｔ細胞の誘導
（１）ヒトＣＡＬＭ２タンパク質のアミノ酸配列の情報をGenBankから得た。HLA-A0201結合モチーフ予測のため、公知のＢＩＭＡＳソフト（http://bimas.dcrt.nih.gov/molbio/hla_bind/で利用可能）を用いたコンピューター予測プログラムを用いてヒトＣＡＬＭ２タンパク質のアミノ酸配列を解析し、ＨＬＡクラスI分子に結合可能と予想されるペプチド２４種類を選択した。
Example 2: Induction of CALM2-derived peptide epitope-reactive CD8-positive T cells (1) Information on the amino acid sequence of human CALM2 protein was obtained from GenBank. For prediction of HLA-A0201 binding motif, the amino acid sequence of human CALM2 protein was calculated using a computer prediction program using known BIMAS software (available at http://bimas.dcrt.nih.gov/molbio/hla_bind/) Analyzed and selected 24 peptides that were expected to be able to bind to HLA class I molecules.
（２）HLA-A0201陽性の健常人から末梢血を分離し、Lymphocyte separation medium（OrganonpTeknika, Durham, NC）に重層して1,500rpmで室温で２０分間遠心分離した。ＰＢＭＣを含有する画分を回収し、冷リン酸塩緩衝液中で３回（またはそれ以上）洗浄し、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を得た。得られたＰＢＭＣをＡＩＭ−Ｖ培地（Life Technololgies, Inc., 米国ニューヨーク州Grand Island）２０ｍｌに懸濁し、培養フラスコ（Falcon）中に３７℃、５％ＣＯ２の条件下で２時間付着させた。非付着細胞はＴ細胞調製に用い、付着細胞は樹状細胞を調製するために用いた。 (2) Peripheral blood was separated from HLA-A0201-positive healthy individuals, layered on a Lymphocyte separation medium (OrganonpTeknika, Durham, NC), and centrifuged at 1,500 rpm at room temperature for 20 minutes. Fractions containing PBMC were collected and washed three times (or more) in cold phosphate buffer to obtain peripheral blood mononuclear cells (PBMC). The obtained PBMC was suspended in 20 ml of AIM-V medium (Life Technololgies, Inc., Grand Island, NY, USA), and allowed to adhere in a culture flask (Falcon) for 2 hours under conditions of 37 ° C. and 5% CO 2 . . Non-adherent cells were used for T cell preparation, and adherent cells were used to prepare dendritic cells.
一方、付着細胞をＡＩＭ−Ｖ培地中でＩＬ−４（１０００Ｕ／ｍｌ）およびＧＭ−ＣＳＦ（１０００Ｕ／ｍｌ）の存在下で培養した。６日後にＩＬ−４（１０００Ｕ／ｍｌ）、ＧＭ−ＣＳＦ（１０００Ｕ／ｍｌ）、ＩＬ−６（１０００Ｕ／ｍｌ、Genzyme, Cambridge, MA）、ＩＬ−１β（１０ｎｇ／ｍｌ、Genzyme, Cambridge, MA）およびＴＮＦ−α（１０ｎｇ／ｍｌ、Genzyme, Cambridge, MA）を添加したＡＩＭ−Ｖ培地に交換してさらに２日間培養した後得られた非付着細胞集団を樹状細胞として用いた。 Meanwhile, adherent cells were cultured in AIM-V medium in the presence of IL-4 (1000 U / ml) and GM-CSF (1000 U / ml). 6 days later, IL-4 (1000 U / ml), GM-CSF (1000 U / ml), IL-6 (1000 U / ml, Genzyme, Cambridge, MA), IL-1β (10 ng / ml, Genzyme, Cambridge, MA) The non-adherent cell population obtained after the AIM-V medium supplemented with TNF-α (10 ng / ml, Genzyme, Cambridge, MA) and further cultured for 2 days was used as dendritic cells.
（３）調製した樹状細胞をＡＩＭ−Ｖ培地中に１×１０６細胞／ｍｌの細胞密度で懸濁し、選択したペプチドを１０μｇ／ｍｌの濃度で添加し、９６穴プレートを用いて３７℃、５％ＣＯ２の条件下で４時間培養した。培養後、Ｘ線照射（３０００ｒａｄ）し、ＡＩＭ−Ｖ培地で洗浄し、１０％ヒトＡＢ血清（Nabi, Miami, FL）、ＩＬ−６（１０００Ｕ／ｍｌ）およびＩＬ−１２（１０ｎｇ／ｍｌ、Genzyme, Cambridge, MA）を含有するＡＩＭ−Ｖ培地で懸濁し、２４穴プレート１穴当りにそれぞれ１×１０５細胞づつ添加した。さらに調製したＴ細胞集団を１穴当りそれぞれ１×１０６細胞添加し、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で培養した。７日後、それぞれの培養上清を捨て、上記と同様にして得た各ペプチドで処理後Ｘ線照射した樹状細胞を１０％ヒトＡＢ血清（Nabi, Miami, FL）、ＩＬ−７（１０Ｕ／ｍｌ、Genzyme, Cambridge, MA）およびＩＬ−２（１０Ｕ／ｍｌ、Genzyme, Cambridge, MA）を含有するＡＩＭ−Ｖ培地で懸濁し（細胞密度：１×１０５細胞／ｍｌ）、２４穴プレート１穴当りにそれぞれ１×１０５細胞づつ添加し、さらに培養した。同様の操作を７日間おきに４〜６回繰返した後刺激されたＴ細胞を回収し，フローサイトメトリーによりＣＤ８陽性Ｔ細胞の誘導を確認した。
(3) The prepared dendritic cells are suspended in AIM-V medium at a cell density of 1 × 10 6 cells / ml, the selected peptide is added at a concentration of 10 μg / ml, and 37 ° C. using a 96-well plate. The cells were cultured for 4 hours under the condition of 5% CO 2 . After incubation, X-ray irradiation (3000 rad), washed with AIM-V medium, 10% human AB serum (Nabi, Miami, FL), IL-6 (1000 U / ml) and IL-12 (10 ng / ml, Genzyme) , Cambridge, MA) and suspended in AIM-V medium and added at 1 × 10 5 cells per well of a 24-well plate. Further, the prepared T cell population was added at 1 × 10 6 cells per well, and cultured under conditions of 37 ° C. and 5% CO 2 . After 7 days, the respective culture supernatants were discarded, and the dendritic cells treated with each peptide obtained in the same manner as described above and then irradiated with X-rays were treated with 10% human AB serum (Nabi, Miami, FL), IL-7 (10 U / Suspended in AIM-V medium (ml, Genzyme, Cambridge, MA) and IL-2 (10 U / ml, Genzyme, Cambridge, MA) (cell density: 1 × 10 5 cells / ml), 24-
実施例３：HLA-A0201陽性ＣＤ８陽性Ｔ細胞を刺激するＣＡＬＭ２由来細胞障害性Ｔ細胞抗原エピトープの決定
（１）上記で誘導した各穴のＴ細胞の内、配列番号３、５、６又は７に示すアミノ酸配列を有するペプチドで刺激されたＴ細胞が増殖していることが顕微鏡下における細胞数計測により確認された。増殖が見られたＴ細胞それぞれについて、パルスに用いた各ペプチドに対する特異性を調べるために、ペプチドでパルスされた、HLA-A0201分子を発現するＴ２細胞（Salter RD et al.,Immunogenetics, 21:235-246(1985)、ＡＴＣＣより購入）（１０μｇ／ｍｌの濃度でＡＩＭ−Ｖ培地中各ペプチドを添加し、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で４時間培養）５×１０４個に対して、５×１０３個のＴ細胞を添加し、１０％ヒトＡＢ血清を含むＡＩＭ−Ｖ培地中で９６穴プレートにて２４時間培養した。培養後の上清を取って、ＩＦＮ−γの産生量をＥＬＩＳＡ法により測定した。その結果、ペプチドをパルスしていないＴ２細胞を用いた穴の培養上清に比べて、配列番号３、５、６又は７のペプチドをパルスしたＴ２細胞を用いた穴の培養上清において、ＩＦＮ−γ産生が確認された（図１）。中でも、配列番号３のペプチドでパルスした場合におけるＩＦＮ−γ産生量が顕著に高かった。従って、配列番号３、５、６及び７のペプチドは特異的にHLA-A0201陽性ＣＤ８陽性Ｔ細胞を増殖刺激させ、ＩＦＮ−γ産生を誘導する能力を有するＴ細胞エピトープペプチドであることが判明した。
Example 3: Determination of CALM2-derived cytotoxic T cell antigen epitope that stimulates HLA-A0201-positive CD8-positive T cells (1) Among the T cells in each well induced above, SEQ ID NO: 3, 5, 6 or 7 It was confirmed by cell count measurement under a microscope that T cells stimulated with a peptide having the amino acid sequence shown in FIG. In order to investigate the specificity for each peptide used in the pulse for each T cell in which proliferation was observed, T2 cells pulsed with the peptide and expressing the HLA-A0201 molecule (Salter RD et al., Immunogenetics, 21: 235-246 (1985), purchased from ATCC) (each peptide was added in AIM-V medium at a concentration of 10 μg / ml and cultured for 4 hours under conditions of 37 ° C. and 5% CO 2 ) 5 × 10 4 In contrast, 5 × 10 3 T cells were added and cultured in 96-well plates for 24 hours in AIM-V medium containing 10% human AB serum. The supernatant after the culture was taken, and the amount of IFN-γ produced was measured by ELISA. As a result, in the culture supernatant of the wells using T2 cells pulsed with the peptide of SEQ ID NO: 3, 5, 6 or 7, compared with the culture supernatant of the wells using T2 cells not pulsed with peptide, IFN -Γ production was confirmed (FIG. 1). Among them, the amount of IFN-γ produced when pulsed with the peptide of SEQ ID NO: 3 was remarkably high. Therefore, the peptides of SEQ ID NOs: 3, 5, 6 and 7 were found to be T cell epitope peptides having the ability to specifically stimulate HLA-A0201-positive CD8-positive T cells to proliferate and induce IFN-γ production. .
なお、図１中、縦軸の参照番号１は、配列番号３で示されるアミノ酸配列を有するペプチドについての結果を示す。参照番号７、８及び９はそれぞれ配列番号５、６及び７のペプチドについての結果を示す。参照番号２はＣＡＬＭ２由来ペプチドの１つであるが本発明の範囲外のペプチドＡＥＬＲＨＶＭＴＮＬ（配列番号４）についての結果を示す（比較例１）。参照番号３はペプチドを添加せずに上記処理を行なった場合についての結果を示す（比較例２）。
In FIG. 1,
（２）次に、本発明で用いられるペプチドの１つである配列番号３のペプチドが、HLA-A0201陽性でＣＡＬＭ２を発現する腫瘍細胞上のHLA-A0201分子上に提示されるものであるか、また本ペプチドで刺激されたＣＤ８陽性Ｔ細胞がHLA-A0201陽性でＣＡＬＭ２を発現する腫瘍細胞を障害することができるかを検討した。ＣＡＬＭ２の発現が確認されている悪性脳腫瘍細胞株、Ｔ９８Ｇ（Stein GH et al.,J. Cell Physiol., 99:43-54(1979)、ＡＴＣＣより購入）を１０５個５０ｍｌ容の遠心チューブに集め、１００μＣｉのクロミウム５１を加え３７℃で２時間インキュベートした。その後１０％ヒトＡＢ血清を含むＡＩＭ−Ｖ培地で３回洗浄し、９６穴Ｖ底プレート１穴あたり１０３個づつ添加し、さらにこれに後１０％ヒトＡＢ血清を含むＡＩＭ−Ｖ培地で懸濁された１０５、５ｘ１０４、２．５ｘ１０４および１．２５ｘ１０４個の配列番号３のペプチドで刺激されたHLA-A0201陽性のＣＤ８陽性Ｔ細胞をそれぞれ添加して、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で４時間培養した。培養後、障害を受けた腫瘍細胞から放出される培養上清中のクロミウム５１の量を測定することによって、配列番号３のペプチドで刺激されたＣＤ８陽性Ｔ細胞細胞の細胞障害活性を算出した。その結果、本ペプチドで刺激されたHLA-A0201陽性のＣＤ８陽性Ｔ細胞がＴ９８Ｇに対する細胞障害活性を有することが判明した（図２）。従って、本発明で用いられるペプチドの１つである配列番号３のペプチドは、HLA-A0201陽性でＣＡＬＭ２を発現する腫瘍細胞上のHLA-A0201分子上に提示されるものであり、さらに本ペプチドは、このような腫瘍細胞を障害することができるＣＤ８陽性細胞障害性Ｔ細胞を誘導する能力があることが明らかになった。
(2) Next, whether the peptide of SEQ ID NO: 3, which is one of the peptides used in the present invention, is presented on the HLA-A0201 molecule on tumor cells that are positive for HLA-A0201 and express CALM2. In addition, it was examined whether CD8-positive T cells stimulated with this peptide can damage tumor cells expressing HAL-A0201 and expressing CALM2. Malignant brain tumor cell lines expressing the CALM2 has been confirmed, T98G (Stein GH et al, J Cell Physiol, 99:... 43-54 (1979), purchased from ATCC) to
同様にして、配列番号５，６及び７のペプチドで刺激されたHLA-A0201陽性のＣＤ８陽性Ｔ細胞は、Ｔ９８Ｇに対して細胞障害活性を示した（図４）。なお、図４中、横軸の参照番号１３、１４および１５は、それぞれ配列番号５，６および７のペプチドについての結果を示す。さらに、横軸の参照番号１６はＣＡＬＭ２由来ペプチドの１つであるが本発明の範囲外のペプチドである配列番号４のペプチドについての結果（比較例５）、横軸の参照番号１７はペプチドを添加せずに上記処理を行なった場合についての結果を示す（比較例６）。
Similarly, HLA-A0201-positive CD8-positive T cells stimulated with the peptides of SEQ ID NOs: 5, 6 and 7 showed cytotoxic activity against T98G (FIG. 4). In FIG. 4,
さらに、配列番号３，５，６及び７のペプチドで刺激されたHLA-A0201陽性のＣＤ８陽性Ｔ細胞は、ＣＡＬＭ２の発現が確認されている別の悪性脳腫瘍細胞株、Ｕ８７ ＭＧ（Beckman G et al.,Hum.Hered., 21:238-241(1971)、ＡＴＣＣより購入）に対して細胞障害活性を示した（図３）。 Furthermore, HLA-A0201-positive CD8-positive T cells stimulated with the peptides of SEQ ID NOs: 3, 5, 6 and 7 are another malignant brain tumor cell line with confirmed CALM2 expression, U87 MG (Beckman G et al ., Hum. Hered., 21: 238-241 (1971), purchased from ATCC) (FIG. 3).
なお、細胞障害活性は、上記のように、本発明で用いられる各ペプチドで刺激誘導されたCD8陽性T細胞１０５個とクロミウム５１を取り込ませた１０３個の悪性脳腫瘍細胞株Ｔ９８ＧおよびＵ８７ ＭＧとを混合して４時間培養し、培養後培地に放出されたクロミウム５１の量を測定して、以下計算式＊により算出したCD8陽性T細胞のＴ９８ＧおよびＵ８７ ＭＧに対する細胞障害活性を示した結果である。＊式：細胞障害活性（％）＝CD8陽性T細胞を加えた際のＴ９８ＧおよびＵ８７ ＭＧからのクロミウム５１遊離量÷１Ｎ塩酸を加えた標的細胞からのクロミウム５１遊離量×１００ In addition, as described above, the cytotoxic activity was determined by stimulating each peptide used in the present invention with 10 5 CD8 positive T cells and 10 3 malignant brain tumor cell lines T98G and U87 MG incorporating chromium 51. And the amount of chromium 51 released into the culture medium after the culture was measured, and the results showed the cytotoxic activity against T98G and U87 MG of CD8-positive T cells calculated by the following formula * It is. * Formula: cytotoxic activity (%) = chromium 51 release from T98G and U87 MG when CD8 positive T cells are added ÷ chromium 51 release from target cells added with 1N hydrochloric acid × 100
なお、図３中、横軸の参照番号４、１０，１１および１２は、それぞれ配列番号３、５，６および７のペプチドについての結果を示す。さらに、横軸の参照番号５はＣＡＬＭ２由来ペプチドの１つであるが本発明の範囲外のペプチドである配列番号４のペプチドについての結果（比較例３）、横軸の参照番号６はペプチドを添加せずに上記処理を行なった場合についての結果を示す（比較例４）。
In FIG. 3,
本発明で用いられるペプチドは、免疫誘導剤、特に癌の治療及び／又は予防剤の有効成分として有用であり、また、癌の治療及び／又は予防剤として利用できる抗原提示細胞やＴ細胞の誘導に有用である。 The peptide used in the present invention is useful as an active ingredient of an immunity-inducing agent, particularly a cancer treatment and / or prevention agent, and induces antigen-presenting cells and T cells that can be used as a cancer treatment and / or prevention agent. Useful for.
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