JP5669090B2 - 細胞の状態を評価する方法 - Google Patents
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Description
本出願は、２００８年１１月２１日出願の日本特願２００８−２９８８１９号の優先権を主張し、その全記載は、ここに特に開示として援用される。
本発明は、細胞の状態を評価する方法、例えば、分化誘導した幹細胞または前駆細胞の分化のレベルを評価する方法、特に、心筋細胞または神経細胞へ分化誘導した、幹細胞または前駆細胞の分化のレベルを評価する方法に関する。
細胞工学、再生医療の発展に伴い、細胞の状態を定量的かつ迅速に評価する方法が求められている。従来においては特定の遺伝子やタンパク質の発現レベルから細胞の状態を評価する方法が広く使われている。
以下一例を挙げる。幹細胞（例えば、iPS細胞、ES細胞等として知られている）や前駆細胞の分化誘導についての研究は、1970年代より行われてきた。1990年代までは主に、特異的抗体を用いた組織染色やフローサイトメトリーにより発現タンパク質を検出することでその細胞の分化のレベルを議論していた。そのため、半定量的な情報しか得られなかった。しかし、2000年以降、定量的RT-PCR法が一般的に使用されるようになり、分化に特異的な遺伝子の転写を絶対定量的に検出することが可能となった (非特許文献1)。しかし、細胞分化に際して、転写はされても翻訳に至らない遺伝子も存在しており、遺伝子の転写レベルがそのまま分化レベルを反映しているわけではないことが示唆されている（非特許文献２）。
以下一例を挙げる。幹細胞（例えば、iPS細胞、ES細胞等として知られている）や前駆細胞の分化誘導についての研究は、1970年代より行われてきた。1990年代までは主に、特異的抗体を用いた組織染色やフローサイトメトリーにより発現タンパク質を検出することでその細胞の分化のレベルを議論していた。そのため、半定量的な情報しか得られなかった。しかし、2000年以降、定量的RT-PCR法が一般的に使用されるようになり、分化に特異的な遺伝子の転写を絶対定量的に検出することが可能となった (非特許文献1)。しかし、細胞分化に際して、転写はされても翻訳に至らない遺伝子も存在しており、遺伝子の転写レベルがそのまま分化レベルを反映しているわけではないことが示唆されている（非特許文献２）。
分化誘導後に培地に放出される特異的タンパク質を検出することにより、分化レベルの絶対定量を行う方法も存在する（特許文献1）。しかし、特異的タンパク質を検出するでは、検出感度の悪化が懸念される。その上、適当な分泌タンパク質が存在しない場合にはレポーター遺伝子の導入が必要である（特許文献2）。
特開2007-228873（P2007-228873A）
特開2007-37434（P2007-37434A）
WO2004/058687
Bustin, S.A. J Mol Endocrinol. 25: 69-193 (2000)
Wen, J. et al., J Cellular Biochem 102: 149-160 (2007)
現代化学、東京化学同人、435、55-61(2007)
M. Yamaguchi et al., ABSTRACTS 24thInternational Carbohydrate Symposium. Oslo, Norway 27. July-1. August, 2008. C-P040上記特許文献1，2及び3、並びに非特許文献1〜4の全記載は、ここに特に開示として援用される。
上述したように、細胞の状態、例えば細胞分化に伴う遺伝子の転写変化の追跡は、一般に定量性に優れてはいるが、必ずしも細胞の状態を反映しているものではない（非特許文献２）。
一方、翻訳産物であるタンパク質の検出は、分化等の細胞の状態を検出する上で、確かな評価基準となり得る。しかし、適当な特異抗体がなかったり、その検出感度が優れなかったりする場合に、定量的解析が困難となり、結果的に汎用性が低くなってしまう。
そこで本発明が解決しようとする課題は、遺伝子やタンパク質に代わる細胞の状態、例えば分化のレベルの新たな指標を見出すこと、さらに、この新たな指標を可能な限り定量的に把握できる手段を見出すこと、加えて、この新たな指標を用いて、特定の細胞に分化させた細胞の分化レベルを把握する手段を提供することにある。
本発明では、細胞の状態の変化、例えば分化状態の変化によりその糖鎖プロファイルが定量的に変化しうることに着目した(非特許文献4)。
従来の糖鎖構造の分類方法は、その生合成経路に基づき、ハイマンノース型、ハイブリッド型、コンプレックス型の３つに分けるものであった。しかし、図５に示すように、ハイブリッド型とコンプレックス型を分けてしまうと、細胞の分化を判定できないことを本発明者らは見出した。Ratioは百分率（%）、totalは発現量（pmol）を表す。質量分析により糖鎖構造決定を行う方法では、ハイブリッド型かコンプレックス型か、１次解析だけでは決定が不可能な構造がある。このような構造については、図５のグラフ中でN/Iと示した。
そこで本発明では、西村らにより開発された高速網羅的糖鎖エンリッチ技術（グライコブロッティング法）(特許文献3、非特許文献3)に基づき、細胞の状態変化、例えば分化前後の細胞から糖鎖を網羅的に捕捉し、MALDI-TOF/MS等の質量分析技術により各細胞中に存在する糖鎖の定量的発現プロファイルを明らかにした。これをもとに、細胞の分化レベル（細胞の分化ステージあるいはタイプ）と結びつけ、変動する糖鎖を見出した。つまり、分化マーカーとなる糖鎖、あるいは、変動する糖鎖を同定し、感度・特異性ともに高い、分化レベルを定量的に判定する方法を確立した。さらに、ここで得られる情報をもとに、「糖鎖タイプ」という概念を導入することで、細胞をサブグループ化できることを見出し、これに基づき細胞分化の程度を定量的に判定できるという本発明を完成した（図６）。
具体的には、糖鎖の分類方法として、ハイマンノース型とそれ以外（ノンハイマンノース）の型の２つに分け、ノンハイマンノース型をさらに(1)バイセクトの有無、(2)フコースの数（０、１または２以上）、(3)シアル酸の有無および修飾の種類、(4)分岐度（２または３以上）のカテゴリーに分けることにより、細胞の分化を定量的に判定できることを見いだした。
本発明によれば、感度ならびに特異性において従来法を上回る、あるいは相補的な優位性を有した方法により、細胞の状態、例えば前駆細胞や幹細胞などの分化のレベル、すなわち品質を、定量的に判定・管理することが可能となる。さらに、幹細胞などの分化のレベルの高感度かつ定量的な測定が可能となることで、品質と安全性管理のシステムが向上することとなり、再生医療への貢献が期待できる。
[細胞の状態を評価するために用いる糖鎖のカテゴリーの決定方法]
本発明の第1の態様は、細胞の状態を評価するために用いる糖鎖のカテゴリーの決定方法である。この方法は、以下の工程を含む。
(1-1)状態変化前の細胞に含まれるN-結合型糖鎖について定量的プロファイルを取得すること、
(1-2)状態変化後の細胞に含まれるN-結合型糖鎖について定量的プロファイルを取得すること、
(1-3)前記2つの定量的プロファイル中の存在量の間に変動がある糖鎖群の少なくとも一部を抽出すること、
(1-4)抽出した糖鎖群に含まれる各糖鎖を糖鎖タイプに基づいて、ハイマンノース型とノンハイマンノース型のカテゴリーに分け、かつノンハイマンノース型をさらに(1)バイセクトの有無、(2)フコースの数（０、１または２以上）、(3)シアル酸の有無、及び(4)分岐度（２または３以上）のカテゴリーに分けること、
(1-5)前記5つのカテゴリーの中から、細胞の状態を評価するのに適した糖鎖のカテゴリーを少なくとも１つ決定すること
本発明の第1の態様は、細胞の状態を評価するために用いる糖鎖のカテゴリーの決定方法である。この方法は、以下の工程を含む。
(1-1)状態変化前の細胞に含まれるN-結合型糖鎖について定量的プロファイルを取得すること、
(1-2)状態変化後の細胞に含まれるN-結合型糖鎖について定量的プロファイルを取得すること、
(1-3)前記2つの定量的プロファイル中の存在量の間に変動がある糖鎖群の少なくとも一部を抽出すること、
(1-4)抽出した糖鎖群に含まれる各糖鎖を糖鎖タイプに基づいて、ハイマンノース型とノンハイマンノース型のカテゴリーに分け、かつノンハイマンノース型をさらに(1)バイセクトの有無、(2)フコースの数（０、１または２以上）、(3)シアル酸の有無、及び(4)分岐度（２または３以上）のカテゴリーに分けること、
(1-5)前記5つのカテゴリーの中から、細胞の状態を評価するのに適した糖鎖のカテゴリーを少なくとも１つ決定すること
本発明の上記糖鎖カテゴリーの決定方法における細胞変化は、幹細胞または前駆細胞の分化の他に、細胞分裂、形態変化、細胞死、癌化などが挙げられるが、本発明はそれらに限定されるものではない。また、細胞の状態とは細胞の静的状態及び動的状態(経時的な状態の変化)も含むものである。
前記(1-1)〜(1-5)の各工程については、後述する、分化レベルを評価するために用いる糖鎖のカテゴリーの決定方法において、分化レベルを評価するために用いる糖鎖のカテゴリーの決定を例に説明する。
[細胞の状態を評価する方法]
本発明の第２の態様は、細胞の状態を評価する方法である。この方法は、上記本発明の第１の態様である糖鎖カテゴリーの決定方法において決定された糖鎖のカテゴリーの少なくとも１つを用いて、細胞の状態を評価する方法である。
本発明の第２の態様は、細胞の状態を評価する方法である。この方法は、上記本発明の第１の態様である糖鎖カテゴリーの決定方法において決定された糖鎖のカテゴリーの少なくとも１つを用いて、細胞の状態を評価する方法である。
本発明の第２の態様である細胞の状態を評価する方法は、
(2-1)状態変化の前後における細胞に含まれるN-結合型糖鎖について定量的プロファイルを取得すること、
(2-2)前記定量的プロファイル中から請求項1に記載の方法で決定された糖鎖のカテゴリーの少なくとも１つについて、該カテゴリーに含まれる糖鎖(群)の存在量または存在割合の状態変化の前後における変化を求めること
を含む。
(2-1)状態変化の前後における細胞に含まれるN-結合型糖鎖について定量的プロファイルを取得すること、
(2-2)前記定量的プロファイル中から請求項1に記載の方法で決定された糖鎖のカテゴリーの少なくとも１つについて、該カテゴリーに含まれる糖鎖(群)の存在量または存在割合の状態変化の前後における変化を求めること
を含む。
本発明の第２の態様である細胞状態評価方法についても、後述する、分化を誘導した幹細胞または前駆細胞の分化レベルを評価する方法において、分化レベルを評価する方法を例に説明する。
[幹細胞または前駆細胞の分化レベルを評価するために用いる糖鎖のカテゴリーの決定方法]
本発明の第３の態様は、分化を誘導した幹細胞または前駆細胞の分化レベルを評価するために用いる糖鎖のカテゴリーの決定方法である。この方法は、以下の工程を含む。
(3-1)分化誘導剤の非存在下で培養した幹細胞または前駆細胞に含まれるN-結合型糖鎖について定量的プロファイルを取得すること、
(3-2)分化誘導剤の存在下で培養した幹細胞または前駆細胞に含まれるN-結合型糖鎖について定量的プロファイルを取得すること、
(3-3)前記2つの定量的プロファイル中の存在量に変動がある糖鎖群の少なくとも一部を抽出すること、
(3-4)抽出した糖鎖群に含まれる各糖鎖を糖鎖タイプに基づいて、ハイマンノース型とノンハイマンノース型のカテゴリーに分け、かつノンハイマンノース型をさらに(1)バイセクトの有無、(2)フコースの数（０、１または２以上）、(3)シアル酸の有無、及び(4)分岐度（２または３以上）のカテゴリーに分けること、
(3-5)前記5つのカテゴリーの中から、幹細胞または前駆細胞の分化レベルを評価するのに適した糖鎖のカテゴリーを少なくとも１つ決定すること
本発明の第３の態様は、分化を誘導した幹細胞または前駆細胞の分化レベルを評価するために用いる糖鎖のカテゴリーの決定方法である。この方法は、以下の工程を含む。
(3-1)分化誘導剤の非存在下で培養した幹細胞または前駆細胞に含まれるN-結合型糖鎖について定量的プロファイルを取得すること、
(3-2)分化誘導剤の存在下で培養した幹細胞または前駆細胞に含まれるN-結合型糖鎖について定量的プロファイルを取得すること、
(3-3)前記2つの定量的プロファイル中の存在量に変動がある糖鎖群の少なくとも一部を抽出すること、
(3-4)抽出した糖鎖群に含まれる各糖鎖を糖鎖タイプに基づいて、ハイマンノース型とノンハイマンノース型のカテゴリーに分け、かつノンハイマンノース型をさらに(1)バイセクトの有無、(2)フコースの数（０、１または２以上）、(3)シアル酸の有無、及び(4)分岐度（２または３以上）のカテゴリーに分けること、
(3-5)前記5つのカテゴリーの中から、幹細胞または前駆細胞の分化レベルを評価するのに適した糖鎖のカテゴリーを少なくとも１つ決定すること
工程(3-1)及び(3-2)
工程(3-1)では、分化誘導剤の非存在下で培養した幹細胞または前駆細胞に含まれるN-結合型糖鎖について定量的プロファイルを取得する。工程(3-2)では、分化誘導剤の存在下で培養した幹細胞または前駆細胞に含まれるN-結合型糖鎖について定量的プロファイルを取得する。工程(3-1)及び(3-2)は、逐次で行っても、同時並行して行ってもよい。逐次で行う場合、どちらの工程を先に実施しても構わない。
工程(3-1)では、分化誘導剤の非存在下で培養した幹細胞または前駆細胞に含まれるN-結合型糖鎖について定量的プロファイルを取得する。工程(3-2)では、分化誘導剤の存在下で培養した幹細胞または前駆細胞に含まれるN-結合型糖鎖について定量的プロファイルを取得する。工程(3-1)及び(3-2)は、逐次で行っても、同時並行して行ってもよい。逐次で行う場合、どちらの工程を先に実施しても構わない。
本発明において、以下の別の態様も含め、「幹細胞」とは、多能性または多分化能を有する細胞を意味する。「幹細胞」の例としては、例えば、胚性幹細胞、組織幹細胞、生体幹細胞、または人工多能性幹細胞(iPS細胞)を挙げることができる。但し、多能性または多分化能を有する細胞であれば、上記例示に限定される意図はない。
本発明において、以下の別の態様も含め、「前駆細胞」は、上記幹細胞を分化誘導した細胞であり、かつ多能性を有する細胞である。幹細胞を分化誘導すると、分化の程度により、幹細胞よりは未分化の程度が低いが、依然として多能性を有する細胞がある。本発明においては、これらの細胞の総称として「前駆細胞」と呼ぶ。「前駆細胞」は、多能性を有する細胞であれば、特に制限はない。実施例1および実施例２で使用したP19CL6、P19C6細胞株は、いずれも前駆細胞である。
上記「幹細胞」及び「前駆細胞」は、動物由来のものであることができ、例えば、哺乳類、魚類等であることができる。哺乳類の例としては、ヒト、マウス、ラット、ヒツジ、ブタ、サル等を挙げることができ、魚類の例としては、メダカ、ゼブラフィッシュ等を挙げることができる。但し、これらの例に限定される意図ではない。
本発明の第3の態様においては、分化誘導剤の非存在下または存在下で行う、幹細胞または前駆細胞の培養は、幹細胞または前駆細胞の培養方法として、公知の方法で行うことができる。分化誘導剤は、特に制限はなく、幹細胞または前駆細胞の種類に応じて、適宜選択することができる。但し、本発明の第1の態様は、幹細胞または前駆細胞の分化レベルを評価するために用いる糖鎖のカテゴリーの決定方法であるので、分化誘導の効果が高く、確実に分化誘導を起こし得る分化誘導剤を用いる方が、糖鎖のカテゴリーの決定が容易であるという観点からは好ましい。しかし、分化誘導剤の種類によっては、分化レベル(細胞の分化ステージあるいはタイプ)が異なる場合もあることから、常に、確実に分化誘導を起こし得る分化誘導剤を用いることが推奨される訳ではなく、目的とする分化レベルに応じて、使い分けることができることは勿論である。また、培養における分化誘導剤の種類は1つでも複数を組み合わせても良く、また、培養(培地)における分化誘導剤の濃度も適宜選択することができる。
培養した幹細胞または前駆細胞は、細胞に含まれるN-結合型糖鎖を分離、精製する処理に付され、分離、精製されたN-結合型糖鎖について定量的プロファイルを取得することが適当である。N-結合型糖鎖の分離及び精製は、例えば、特許文献3及び非特許文献3に記載されたグライコブロッティング法によりなされることが、N-結合型糖鎖を漏れなく、かつ迅速に分離、精製できるという観点から好ましい。定量的プロファイルは、分化誘導剤とともに培養した幹細胞または前駆細胞の分化がある程度以上、即ち、分化の進捗が明らかになる程度行うことが適当である。但し、分化の進捗が明らかになる程度は、細胞の種類、分化誘導剤の種類、培養の条件等により変動するので、これらの条件を考慮して適宜決定することが適当である。
定量的プロファイルは、好ましくは、分離、精製されたN-結合型糖鎖をMALDI-TOF/MS (matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight/ mass spectrometry）またはLC-ESI/SSI-TOF/MS (liquid chromatography-electrospray ionization/sonic spray ionization-time of flight/ mass spectrometry）により得られる。MALDI-TOF/MSまたはLC-ESI/SSI-TOF/MSを用いることで、迅速にかつ高精度にN-結合型糖鎖を定量し、定量的プロファイルを得ることができる。
工程(3-3)及び(3-4)
工程(3-3)では、前記工程(3-1)及び(3-2)でそれぞれ得られた2つの定量的プロファイル中の存在量の間に変動がある糖鎖群の少なくとも一部を抽出する。さらに工程(3-4)では、工程(3-3)で抽出した糖鎖群に含まれる各糖鎖を糖鎖タイプに基づいて、ハイマンノース型とノンハイマンノース型のカテゴリーに分け、かつノンハイマンノース型をさらに(1)バイセクトの有無、(2)フコースの数（０、１または２以上）、(3)シアル酸の有無、及び(4)分岐度（２または３以上）のカテゴリーに分ける。
工程(3-3)では、前記工程(3-1)及び(3-2)でそれぞれ得られた2つの定量的プロファイル中の存在量の間に変動がある糖鎖群の少なくとも一部を抽出する。さらに工程(3-4)では、工程(3-3)で抽出した糖鎖群に含まれる各糖鎖を糖鎖タイプに基づいて、ハイマンノース型とノンハイマンノース型のカテゴリーに分け、かつノンハイマンノース型をさらに(1)バイセクトの有無、(2)フコースの数（０、１または２以上）、(3)シアル酸の有無、及び(4)分岐度（２または３以上）のカテゴリーに分ける。
本発明者らは、実験の結果、幹細胞または前駆細胞の分化レベルを評価するために用いる糖鎖のカテゴリーとしては上記5つのカテゴリーを挙げることができることを見出した。
定量的プロファイル中の糖鎖群は、細胞の種類並びに分化の方向及び程度によって異なる場合があるが、通常は数十〜百数十程度である。その中から、存在量が、分化レベルに応じて変動する糖鎖群の少なくとも一部を抽出し、かつ抽出した糖鎖群を、上記の糖鎖タイプに基づいて5つのカテゴリーに分ける。
工程(3-5)
工程(3-5)では、前記5つのカテゴリーの中から、細胞の状態を評価するのに適した糖鎖のカテゴリーを少なくとも１つ決定する。細胞の状態を評価するのに適した糖鎖のカテゴリーは、例えば、分化誘導剤の非存在下で培養した幹細胞または前駆細胞においては、存在量または存在割合の経時的変動が有意ではないが、分化誘導剤の存在下で培養した幹細胞または前駆細胞においては、存在量または存在割合の経時的変動が有意である糖鎖が分類されるカテゴリーであることができる。
ここで選択、決定された糖鎖のカテゴリーは、後述する分化を誘導した幹細胞または前駆細胞の分化レベルを評価する方法において、分化レベルの評価指標として使用できる。
工程(3-5)では、前記5つのカテゴリーの中から、細胞の状態を評価するのに適した糖鎖のカテゴリーを少なくとも１つ決定する。細胞の状態を評価するのに適した糖鎖のカテゴリーは、例えば、分化誘導剤の非存在下で培養した幹細胞または前駆細胞においては、存在量または存在割合の経時的変動が有意ではないが、分化誘導剤の存在下で培養した幹細胞または前駆細胞においては、存在量または存在割合の経時的変動が有意である糖鎖が分類されるカテゴリーであることができる。
ここで選択、決定された糖鎖のカテゴリーは、後述する分化を誘導した幹細胞または前駆細胞の分化レベルを評価する方法において、分化レベルの評価指標として使用できる。
[分化を誘導した幹細胞または前駆細胞の分化レベルを評価する方法]
本発明の第４の態様は、分化を誘導した幹細胞または前駆細胞の分化レベルを評価する方法である。この方法は以下の工程を含む。
(4-1)分化誘導剤の存在下で培養した幹細胞または前駆細胞に含まれるN-結合型糖鎖について定量的プロファイルを経時的に取得すること、
(4-2)前記定量的プロファイル中から、本発明の第3の態様の方法で決定された糖鎖のカテゴリーの少なくとも１つについて、該カテゴリーに含まれる糖鎖(群)の存在量または存在割合の経時的変化を求めること。
本発明の第４の態様は、分化を誘導した幹細胞または前駆細胞の分化レベルを評価する方法である。この方法は以下の工程を含む。
(4-1)分化誘導剤の存在下で培養した幹細胞または前駆細胞に含まれるN-結合型糖鎖について定量的プロファイルを経時的に取得すること、
(4-2)前記定量的プロファイル中から、本発明の第3の態様の方法で決定された糖鎖のカテゴリーの少なくとも１つについて、該カテゴリーに含まれる糖鎖(群)の存在量または存在割合の経時的変化を求めること。
工程(4-1)
工程(4-1)における、分化誘導剤の存在下で培養した幹細胞または前駆細胞に含まれるN-結合型糖鎖についての定量的プロファイルの取得は、上記工程(3-2)と同様に実施することができる。但し、工程(4-1)においては、定量的プロファイルは経時的に取得される。具体的には、培養時間の経過にともない、培養物をサンプリングし、サンプリングした培養物から分離、精製されたN-結合型糖鎖について定量的プロファイルを取得する。定量的プロファイルの経時的な取得は、培養開始後少なくとも1回は行われ、好ましくは、2回以上、例えば、2回、3回または4回であることができる。但し、4回を超えて行うこともできる。
工程(4-1)における、分化誘導剤の存在下で培養した幹細胞または前駆細胞に含まれるN-結合型糖鎖についての定量的プロファイルの取得は、上記工程(3-2)と同様に実施することができる。但し、工程(4-1)においては、定量的プロファイルは経時的に取得される。具体的には、培養時間の経過にともない、培養物をサンプリングし、サンプリングした培養物から分離、精製されたN-結合型糖鎖について定量的プロファイルを取得する。定量的プロファイルの経時的な取得は、培養開始後少なくとも1回は行われ、好ましくは、2回以上、例えば、2回、3回または4回であることができる。但し、4回を超えて行うこともできる。
工程(4-2)
工程(4-2)においては、本発明の第３の態様の方法で決定された糖鎖のカテゴリーの少なくとも１つについて、定量的プロファイル中の、前記カテゴリーに含まれる糖鎖(群)の存在量または存在割合の経時的変化を求める。
工程(4-2)においては、本発明の第３の態様の方法で決定された糖鎖のカテゴリーの少なくとも１つについて、定量的プロファイル中の、前記カテゴリーに含まれる糖鎖(群)の存在量または存在割合の経時的変化を求める。
本発明の第３の態様の糖鎖カテゴリー決定方法によって、以下に説明する心筋分化レベル評価方法及び神経細胞分化レベル評価方法で用いられる分化マーカーとして使用できる糖鎖タイプ(糖鎖カテゴリー)を見出した。詳細は実施例において示すが、心筋分化レベル評価方法に使用できる分化マーカーとしては、フコースを1つ有するタイプの糖鎖群、フコースを2つ有するタイプの糖鎖群から成る群から選ばれる少なくとも1つを用いることができることが見出された。また、神経細胞分化レベル評価方法に使用できる分化マーカーとしては、バイセクト構造を有するタイプの糖鎖群、バイセクト構造を有さないタイプの糖鎖群から選ばれる少なくとも1つを用いることができることが見出された。
以下に、上記で見出された分化マーカーを用いる分化レベル評価方法について説明する。
[心筋分化レベル評価方法]
本発明の第５の態様は、幹細胞または前駆細胞の心筋分化レベルを評価する方法である。
この方法は
(5-1)心筋分化誘導剤の存在下で培養した幹細胞または前駆細胞に含まれるN-結合型糖鎖について定量的プロファイルを経時的に取得すること、
(5-2)前記定量的プロファイル中のフコースを1つ有するタイプの糖鎖群の存在量または存在割合、フコースを2つ有するタイプの糖鎖群の存在量または存在割合及びハイマンノース型の糖鎖群の存在量または存在割合から成る群から選ばれる少なくとも1つを求めること、
を含む。
本発明の第５の態様は、幹細胞または前駆細胞の心筋分化レベルを評価する方法である。
この方法は
(5-1)心筋分化誘導剤の存在下で培養した幹細胞または前駆細胞に含まれるN-結合型糖鎖について定量的プロファイルを経時的に取得すること、
(5-2)前記定量的プロファイル中のフコースを1つ有するタイプの糖鎖群の存在量または存在割合、フコースを2つ有するタイプの糖鎖群の存在量または存在割合及びハイマンノース型の糖鎖群の存在量または存在割合から成る群から選ばれる少なくとも1つを求めること、
を含む。
工程(5-1)
心筋分化誘導剤としては、例えば、ジメチルスルホキシド(DMSO)、オキシトシン等を挙げることができる。N-結合型糖鎖についての定量的プロファイルの経時的取得は、上記第3の態様の工程(3-2)と同様に行うことができる。但し、用いる分化誘導剤は、心筋分化誘導剤である。
心筋分化誘導剤としては、例えば、ジメチルスルホキシド(DMSO)、オキシトシン等を挙げることができる。N-結合型糖鎖についての定量的プロファイルの経時的取得は、上記第3の態様の工程(3-2)と同様に行うことができる。但し、用いる分化誘導剤は、心筋分化誘導剤である。
本発明の方法で用いられる幹細胞または前駆細胞は、前記第1の態様で示したものであるが、特に、P19CL6細胞、ES細胞、iPS細胞等が好ましい。
工程(5-2)
定量的プロファイル中のフコースを1つ有するタイプの糖鎖群の存在量または存在割合、フコースを2つ有するタイプの糖鎖群の存在量または存在割合及びハイマンノース型の糖鎖群の存在量または存在割合から成る群から選ばれる少なくとも1つを求める。本発明では、これらのいずれかの糖鎖群の存在量または存在割合に基づいて、心筋分化レベルを評価することができるが、好ましくはこれら3つの糖鎖群の存在量または存在割合に基づいて、総合的に評価する。
定量的プロファイル中のフコースを1つ有するタイプの糖鎖群の存在量または存在割合、フコースを2つ有するタイプの糖鎖群の存在量または存在割合及びハイマンノース型の糖鎖群の存在量または存在割合から成る群から選ばれる少なくとも1つを求める。本発明では、これらのいずれかの糖鎖群の存在量または存在割合に基づいて、心筋分化レベルを評価することができるが、好ましくはこれら3つの糖鎖群の存在量または存在割合に基づいて、総合的に評価する。
フコースを1つ有するタイプの糖鎖群とは、例えば、表１中の化3、化19、化31である。
フコースを2つ有するタイプの糖鎖群とは、例えば、表１中の化20、化28、化34である。
ハイマンノース型の糖鎖群とは、例えば、表１中の化5、化8、化14である。
フコースを2つ有するタイプの糖鎖群とは、例えば、表１中の化20、化28、化34である。
ハイマンノース型の糖鎖群とは、例えば、表１中の化5、化8、化14である。
実施例１において示すように、マウスの前駆細胞においては、上記定量的プロファイル中のフコースを1つ有するタイプの糖鎖群の存在量または存在割合が培養によって増大した細胞は、心筋分化レベルが高まったものである。同様に、フコースを2つ有するタイプの糖鎖群の存在量または存在割合が前記培養によって減少した細胞は、心筋分化レベルが高まったものである。
[神経細胞への分化レベル評価方法（１）]
本発明の第6の態様は、マウス由来の幹細胞または前駆細胞の神経細胞への分化レベルを評価する方法である。
この方法は、
(6-1)神経細胞への分化誘導剤の存在下で培養した幹細胞または前駆細胞に含まれるN-結合型糖鎖について定量的プロファイルを経時的に取得すること、
(6-2)前記定量的プロファイル中のバイセクト構造を有するタイプの糖鎖群の存在量または存在割合、バイセクト構造を有さないタイプの糖鎖群の存在量または存在割合の存在量または存在割合から成る群から選ばれる少なくとも1つを求めること、
を含む。
本発明の第6の態様は、マウス由来の幹細胞または前駆細胞の神経細胞への分化レベルを評価する方法である。
この方法は、
(6-1)神経細胞への分化誘導剤の存在下で培養した幹細胞または前駆細胞に含まれるN-結合型糖鎖について定量的プロファイルを経時的に取得すること、
(6-2)前記定量的プロファイル中のバイセクト構造を有するタイプの糖鎖群の存在量または存在割合、バイセクト構造を有さないタイプの糖鎖群の存在量または存在割合の存在量または存在割合から成る群から選ばれる少なくとも1つを求めること、
を含む。
工程(6-1)
神経細胞への分化誘導剤としては、例えば、レチノイン酸、DMSO等を挙げることができる。N-結合型糖鎖についての定量的プロファイルの経時的取得は、上記第1の態様の工程(3-2)と同様に行うことができる。但し、用いる分化誘導剤は、神経細胞への分化誘導剤である。
神経細胞への分化誘導剤としては、例えば、レチノイン酸、DMSO等を挙げることができる。N-結合型糖鎖についての定量的プロファイルの経時的取得は、上記第1の態様の工程(3-2)と同様に行うことができる。但し、用いる分化誘導剤は、神経細胞への分化誘導剤である。
本発明の方法で用いられる幹細胞または前駆細胞は、前記第1の態様で示したものであるが、特に、P19細胞、P19C6細胞、ES細胞、iPS細胞等が好ましい。
工程(6-2)
定量的プロファイル中のバイセクト構造を有するタイプの糖鎖群の存在量または存在割合、バイセクト構造を有さないタイプの糖鎖群の存在量または存在割合及びハイマンノース型の糖鎖群の存在量または存在割合から成る群から選ばれる少なくとも1つを求める。本発明では、これらのいずれかの糖鎖群の存在量または存在割合に基づいて、神経細胞への分化レベルを評価することができるが、好ましくはこれら3つの糖鎖群の存在量または存在割合に基づいて、総合的に評価する。
定量的プロファイル中のバイセクト構造を有するタイプの糖鎖群の存在量または存在割合、バイセクト構造を有さないタイプの糖鎖群の存在量または存在割合及びハイマンノース型の糖鎖群の存在量または存在割合から成る群から選ばれる少なくとも1つを求める。本発明では、これらのいずれかの糖鎖群の存在量または存在割合に基づいて、神経細胞への分化レベルを評価することができるが、好ましくはこれら3つの糖鎖群の存在量または存在割合に基づいて、総合的に評価する。
バイセクト構造とは、バイセクトGlcNAcを有する糖鎖の構造である。骨格の糖鎖の構造にバイセクトGlcNAcが付加すると、それ以上枝分かれが伸びたり、糖鎖が切断されることがなくなることが知られている。また、糖鎖構造にバイセクトGlcNAcが付加する反応は、GnT-IIIと呼ばれる酵素により触媒される。(Ikeda, Y., et al., Trends in Glycoscience and Glycotechnology 13: 167-176 (この文献の全記載は、ここに特に開示として援用される。)
バイセクト構造を有するタイプの糖鎖群とは、例えば、表２中の化15、化45、化64である。
バイセクト構造を有さないタイプの糖鎖群とは、例えば、表２中の化17、化21、化68である。
ハイマンノース型の糖鎖群は、前述の第5の態様で説明したものと同様である。
バイセクト構造を有さないタイプの糖鎖群とは、例えば、表２中の化17、化21、化68である。
ハイマンノース型の糖鎖群は、前述の第5の態様で説明したものと同様である。
実施例２において示すように、マウスの前駆細胞においては、前記バイセクト構造を有するタイプの糖鎖群の存在量または存在割合が培養によって増大した細胞は、神経細胞への分化レベルが高まったものである。さらに、前記バイセクト構造を有さないタイプの糖鎖群の存在量または存在割合が培養によって減少した細胞は、神経細胞への分化レベルが高まったものである。また、前記ハイマンノース型の糖鎖群の存在量または存在割合が前記培養によって減少した細胞は、神経細胞への分化レベルが高まったものである。
実施例３において示すように、マウスのＥＳ細胞においても、バイセクト構造を有するタイプの糖鎖群の存在量または存在割合が培養によって増大した細胞は、神経細胞への分化レベルが高まったものである。さらに、バイセクト構造を有さないタイプの糖鎖群の存在量または存在割合が培養によって減少した細胞は、神経細胞への分化レベルが高まったものである。また、ハイマンノース型の糖鎖群の存在量または存在割合が前記培養によって減少した細胞は、神経細胞への分化レベルが高まったものである。
[神経細胞への分化レベル評価方法（２）]
本発明の第7の態様は、ヒト由来の幹細胞または前駆細胞の神経細胞への分化レベルを評価する方法である。
この方法は、
(7-1)神経細胞への分化誘導剤の存在下で培養した幹細胞または前駆細胞に含まれるN-結合型糖鎖について定量的プロファイルを経時的に取得すること、
(7-2)前記定量的プロファイル中のフコースを１つ有するタイプの糖鎖群の存在量または存在割合、シアル酸を有さないタイプの糖鎖群の存在量または存在割合及びハイマンノース型の糖鎖群の存在量または存在割合から成る群から選ばれる少なくとも1つの経時的変化を求めること、
を含む。
本発明の第7の態様は、ヒト由来の幹細胞または前駆細胞の神経細胞への分化レベルを評価する方法である。
この方法は、
(7-1)神経細胞への分化誘導剤の存在下で培養した幹細胞または前駆細胞に含まれるN-結合型糖鎖について定量的プロファイルを経時的に取得すること、
(7-2)前記定量的プロファイル中のフコースを１つ有するタイプの糖鎖群の存在量または存在割合、シアル酸を有さないタイプの糖鎖群の存在量または存在割合及びハイマンノース型の糖鎖群の存在量または存在割合から成る群から選ばれる少なくとも1つの経時的変化を求めること、
を含む。
工程(7-1)
神経細胞への分化誘導剤としては、工程(6-1)と同様に、例えば、レチノイン酸、DMSO等を挙げることができる。N-結合型糖鎖についての定量的プロファイルの経時的取得は、上記第1の態様の工程(3-2)と同様に行うことができる。但し、用いる分化誘導剤は、神経細胞への分化誘導剤である。
神経細胞への分化誘導剤としては、工程(6-1)と同様に、例えば、レチノイン酸、DMSO等を挙げることができる。N-結合型糖鎖についての定量的プロファイルの経時的取得は、上記第1の態様の工程(3-2)と同様に行うことができる。但し、用いる分化誘導剤は、神経細胞への分化誘導剤である。
本発明の方法で用いられるヒト由来の幹細胞または前駆細胞は、前記第1の態様で示したものであるが、特に、ES細胞、iPS細胞等が好ましい。
工程(7-2)
定量的プロファイル中のフコースを１つ有するタイプの糖鎖群の存在量または存在割合、シアル酸を有さないタイプの糖鎖群の存在量または存在割合及びハイマンノース型の糖鎖群の存在量または存在割合から成る群から選ばれる少なくとも1つの経時的変化を求める。本発明では、これらのいずれかの糖鎖群の存在量または存在割合に基づいて、神経細胞への分化レベルを評価することができるが、好ましくはこれら3つの糖鎖群の存在量または存在割合に基づいて、総合的に評価する。
定量的プロファイル中のフコースを１つ有するタイプの糖鎖群の存在量または存在割合、シアル酸を有さないタイプの糖鎖群の存在量または存在割合及びハイマンノース型の糖鎖群の存在量または存在割合から成る群から選ばれる少なくとも1つの経時的変化を求める。本発明では、これらのいずれかの糖鎖群の存在量または存在割合に基づいて、神経細胞への分化レベルを評価することができるが、好ましくはこれら3つの糖鎖群の存在量または存在割合に基づいて、総合的に評価する。
フコースを1つ有するタイプの糖鎖、シアル酸を有さないタイプの糖鎖及びハイマンノース型の糖鎖は、例えば、実施例4の表４に示した糖鎖であることができる。
実施例４において示すように、ヒトのＥＳ細胞においては、フコースを１つ有するタイプの糖鎖群の存在量または存在割合が培養によって増大した細胞は、神経細胞への分化レベルが高まったものである。さらに、シアル酸を有さないタイプの糖鎖群（Ｎｏｎ−ＳＡ）の存在量または存在割合が培養によって増大した細胞は、神経細胞への分化レベルが高まったものである。また、ハイマンノース型の糖鎖群の存在量または存在割合が前記培養によって減少した細胞は、神経細胞への分化レベルが高まったものである。
第5の態様〜第7の態様では、実施例においては、各糖鎖群の存在量または存在割合の経時的変化の傾向に注目しているが、各糖鎖群の存在量または存在割合の経時的変化と分化のステージやタイプとの関係に関する情報を入手及び集積することで、各糖鎖群の存在量または存在割合から、分化のステージやタイプを定量的に把握することも可能になる。例えば、再生医療において分化細胞を用いる場合、未分化状態の細胞が含まれないことが安全上好ましい。従って、培養により得られた細胞の分化ステージを正確に把握することが重要である。また、目的とする細胞に分化していることを確認することも重要であることから、分化のタイプを正確に把握することも求められる。本発明の方法では、各糖鎖群の存在量または存在割合から、分化のステージやタイプを定量的に把握することも可能である。
以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明する。
細胞グライコミクスプロトコール
実施例において用いられた細胞グライコミクス（ｇｌｙｃｏｍｉｃｓ）は、以下のプロトコールに従って実施した。
＜セルライセートの作製とN-Glycanの遊離＞
・ 10mM EDTA/PBS中、セルスクレイパーを用いて細胞をディッシュより回収、PBSにて洗浄を行う
・ 1%（終濃度）TritonX-100を加え、氷上にて１時間インキュベートし、細胞を可溶化する。
・ 80%（終濃度）acetoneを加え、-20℃にて一晩インキュベートし、タンパク質画分を沈殿させる。
・ 遠心後、沈殿をacetonitrileにて洗浄し、acetoneを完全に除去する。
・ 沈殿を風乾後、0.2% PHM (1-propanesulfonic acid, 2-hydroxyl-3-myristamido)を含む80mM ammonium bicarbonateを50μL加え、60℃にて10分間インキュベートし、可溶化する。
・ 可溶化後のタンパク質画分に、終濃度10mM DTTを加え、60℃にて30分間還元反応を行う。
・ 20mM iodoacetamideを加え、室温にて30分間、遮光下でインキュベートを行うことで、6.により還元されたアミノ酸残基をアルキル化する。
・ 800 U Trypsinを加え、37℃で一晩インキュベートする。
・ 90℃にて10分間Trypsinを失活させ、Peptide N-Glycanase Fを2 U加え、N-結合型糖鎖を遊離させる。
・ 遊離させた糖鎖は、内部標準として15pmolのA2 amide Glycanを加えた後、SpeedVacにて濃縮し、終容量20μLとした。
実施例において用いられた細胞グライコミクス（ｇｌｙｃｏｍｉｃｓ）は、以下のプロトコールに従って実施した。
＜セルライセートの作製とN-Glycanの遊離＞
・ 10mM EDTA/PBS中、セルスクレイパーを用いて細胞をディッシュより回収、PBSにて洗浄を行う
・ 1%（終濃度）TritonX-100を加え、氷上にて１時間インキュベートし、細胞を可溶化する。
・ 80%（終濃度）acetoneを加え、-20℃にて一晩インキュベートし、タンパク質画分を沈殿させる。
・ 遠心後、沈殿をacetonitrileにて洗浄し、acetoneを完全に除去する。
・ 沈殿を風乾後、0.2% PHM (1-propanesulfonic acid, 2-hydroxyl-3-myristamido)を含む80mM ammonium bicarbonateを50μL加え、60℃にて10分間インキュベートし、可溶化する。
・ 可溶化後のタンパク質画分に、終濃度10mM DTTを加え、60℃にて30分間還元反応を行う。
・ 20mM iodoacetamideを加え、室温にて30分間、遮光下でインキュベートを行うことで、6.により還元されたアミノ酸残基をアルキル化する。
・ 800 U Trypsinを加え、37℃で一晩インキュベートする。
・ 90℃にて10分間Trypsinを失活させ、Peptide N-Glycanase Fを2 U加え、N-結合型糖鎖を遊離させる。
・ 遊離させた糖鎖は、内部標準として15pmolのA2 amide Glycanを加えた後、SpeedVacにて濃縮し、終容量20μLとした。
＜グライコブロッティング＞
上記10.で得られたN-結合型糖鎖を、BlotGlyco(R)H(住友ベークライト株式会社)を用いたグライコブロッティング法によりエンリッチした。この方法は、下記の文献に記載の方法に従って実施した。具体的な方法は以下の文献に示す。以下の4つの文献の全記載は、ここに特に開示として援用される。
・Furukawa J-i., et al., Anal. Chem., 4: 1094-1101 (2008)
・Baudino L., et al., J. Immunol., 181: 4107-4112 (2008)
・Baudino L., et al., J. Immunol., 181: 6664-6669 (2008)
・ Uematsu R., et al., Mol. Cell. Proteom., in press (2008)
上記10.で得られたN-結合型糖鎖を、BlotGlyco(R)H(住友ベークライト株式会社)を用いたグライコブロッティング法によりエンリッチした。この方法は、下記の文献に記載の方法に従って実施した。具体的な方法は以下の文献に示す。以下の4つの文献の全記載は、ここに特に開示として援用される。
・Furukawa J-i., et al., Anal. Chem., 4: 1094-1101 (2008)
・Baudino L., et al., J. Immunol., 181: 4107-4112 (2008)
・Baudino L., et al., J. Immunol., 181: 6664-6669 (2008)
・ Uematsu R., et al., Mol. Cell. Proteom., in press (2008)
＜BlotGlyco(R) Hビーズを用いたグライコブロッティング＞
・ Peptide N-Glycanase Fにより遊離させ、内部標準として15pmolのA2 amide Glycanを加えた後、SpeedVacにて濃縮し、終容量20μLとしたN-結合型糖鎖をBlotGlyco(R) Hビーズ5mgに加える。
・ 2% 酢酸を含むアセトニトリル180μLを1.に加える。
・ 80℃にて45分間静置する。
・ 2M グアニジン-塩酸を含む16.6mM 重炭酸アンモニウム溶液、純水、1% トリエチルアミンを含むメタノール溶液 各200μLで２回ずつビーズを洗浄する。
・ 10% 無水酢酸を含むメタノール溶液100μLを加え、室温にて30分間静置する。
・ 溶液を除いた後、10mM 塩酸、メタノール、ジオキサン 各200μLで２回ずつビーズを洗浄する。
・ 100mM 3-メチル1-p-トリルトリアゼンを含むジオキサン溶液100μLを加え、60℃にて１時間〜１時間半静置する。
・ ジオキサン、純水、メタノール、純水の順にそれぞれ200μLずつで洗浄を行う。
・ 20mMアミノオキシ-WRを20μLと2% 酢酸を含むアセトニトリル180μLを加える。
・ 80℃にて45分間静置する。
・ 100μLの純水で溶出する。
・ Peptide N-Glycanase Fにより遊離させ、内部標準として15pmolのA2 amide Glycanを加えた後、SpeedVacにて濃縮し、終容量20μLとしたN-結合型糖鎖をBlotGlyco(R) Hビーズ5mgに加える。
・ 2% 酢酸を含むアセトニトリル180μLを1.に加える。
・ 80℃にて45分間静置する。
・ 2M グアニジン-塩酸を含む16.6mM 重炭酸アンモニウム溶液、純水、1% トリエチルアミンを含むメタノール溶液 各200μLで２回ずつビーズを洗浄する。
・ 10% 無水酢酸を含むメタノール溶液100μLを加え、室温にて30分間静置する。
・ 溶液を除いた後、10mM 塩酸、メタノール、ジオキサン 各200μLで２回ずつビーズを洗浄する。
・ 100mM 3-メチル1-p-トリルトリアゼンを含むジオキサン溶液100μLを加え、60℃にて１時間〜１時間半静置する。
・ ジオキサン、純水、メタノール、純水の順にそれぞれ200μLずつで洗浄を行う。
・ 20mMアミノオキシ-WRを20μLと2% 酢酸を含むアセトニトリル180μLを加える。
・ 80℃にて45分間静置する。
・ 100μLの純水で溶出する。
実施例1
マウス胎児性ガン細胞由来細胞P19CL6を心筋細胞へ分化誘導させ、未分化及び分化後の細胞のグライコミクスを行った。
マウス胎児性ガン細胞由来細胞P19CL6を心筋細胞へ分化誘導させ、未分化及び分化後の細胞のグライコミクスを行った。
3.7x105cells/6cm-ディッシ(dish)のマウス胎児性ガン細胞由来細胞P19CL6を、10%ウシ胎児血清を含むDMEM培地中に撒種し、分化誘導群については1% ジメチルスルホキシド（DMSO）を添加後、コントロール群についてはそのまま何も添加せず培養を行った。培養開始後16日目に、分化誘導群全体の拍動を確認後、両群とも細胞を回収し、上記グライコブロッティング（Glycoblotting）法により、細胞中の全N-結合型糖鎖の捕捉・精製を行った。200μg相当の全細胞タンパク質について解析を行い、MALDI-TOF/MSにより定量的プロファイルを取得した。図1-1に示す各糖鎖の発現量は、内部標準として加えた既知量オリゴ糖とのスペクトル上の面積比より算出した糖鎖の絶対定量値を用いている。この結果から、有意な変動が認められる42種類の糖鎖を確認できた。分化に伴い、Fucを１つ有するタイプの糖鎖では、11種類の構造について増加傾向が認められたが、Fucを２つ持つ糖鎖タイプの6種類の構造については、分化誘導群で有意に減少することを見出した。このように、糖鎖タイプによりサブグループ化することで、細胞分化のレベルを定量的に判定できることが判明した（図1-2）。
尚、分化誘導した後の細胞及び分化誘導することなく培養した細胞について以下の条件で免疫細胞染色を行った。その結果は、図1-3に示すように、分化誘導後の細胞においてのみ、心筋細胞に特異的なタンパク質であるサルコメアミオシンの発現が確認され、分化誘導せずに培養した細胞においては、これが見出されなかった。このことから、分化誘導後の細胞のみが、心筋細胞に分化していることが明らかであった。
1次抗体： MF20 (mouse monoclonal anti-sarcomere myosin)
2次抗体 ： HRP-polymer conjugated anti-IgG
発色基質： Diaminobenzidine (DAB)
1次抗体： MF20 (mouse monoclonal anti-sarcomere myosin)
2次抗体 ： HRP-polymer conjugated anti-IgG
発色基質： Diaminobenzidine (DAB)
さらに、分化誘導した後の細胞及び分化誘導することなく培養した細胞について拍動の確認（目視評価）を行った。その結果、分化誘導なしの群では、拍動が観察されなかったが、分化誘導ありの群では、約80%の細胞において、拍動が観察された。
尚、有意な変動が認められる42種類の糖鎖、Fucを１つ有するタイプの11種類の糖鎖、Fucを２つ持つタイプの6種類の糖鎖、ハイマンノース型の糖鎖はそれぞれ以下のとおりである。
フコースを1つ有するタイプの糖鎖群とは、表１中 化2、化3、化6、化10、化12、化15、化16、化19、化24、化25、化27、化30、化31、化33、化36、化37、化39、化40、化41、化42である。
フコースを2つ有するタイプの糖鎖群とは、表１中 化20、化22、化28、化29、化34、化35、化38である。
ハイマンノース型の糖鎖とは、化5、化8、化14、化17である。
フコースを1つ有するタイプの糖鎖群とは、表１中 化2、化3、化6、化10、化12、化15、化16、化19、化24、化25、化27、化30、化31、化33、化36、化37、化39、化40、化41、化42である。
フコースを2つ有するタイプの糖鎖群とは、表１中 化20、化22、化28、化29、化34、化35、化38である。
ハイマンノース型の糖鎖とは、化5、化8、化14、化17である。
実施例２
マウス胚性腫瘍細胞P19C6を神経細胞へ分化誘導させ、以下に示す3つの各ステップ、つまり未分化、分化中間体、分化後の細胞のグライコミクスを行った。
マウス胚性腫瘍細胞P19C6を神経細胞へ分化誘導させ、以下に示す3つの各ステップ、つまり未分化、分化中間体、分化後の細胞のグライコミクスを行った。
ステップ1：未分化細胞
P19C6細胞を細胞培養皿(cell culture dish)で15%FBS/DMEMを培地として、数日間接着培養を行った。80〜90%コンフルエントになったところで、細胞を回収しグライコミクスへ、あるいは分化誘導するためにステップ2へと進めた。
P19C6細胞を細胞培養皿(cell culture dish)で15%FBS/DMEMを培地として、数日間接着培養を行った。80〜90%コンフルエントになったところで、細胞を回収しグライコミクスへ、あるいは分化誘導するためにステップ2へと進めた。
ステップ2：分化中間体細胞
ステップ1で80〜90%コンフルエントになった細胞をトリプシン処理により細胞懸濁液を調製し、バクテリアグレードのペトリ皿(dish)で懸滴培養(Hanging drop culture)を行った。この時、10cm皿(dish) の蓋に10μLの細胞懸濁液(105 cells/mL)を100spotsアプライし、浮遊培養を行い細胞の凝集塊を形成させた。培地には分化を誘導するために1μMのレチノイン酸を添加した10%FBS/αMEMを用いた。４日後に細胞の凝集塊を回収し、グライコミクスへ、あるいはさらに分化誘導するためにステップ3へと進めた。
ステップ1で80〜90%コンフルエントになった細胞をトリプシン処理により細胞懸濁液を調製し、バクテリアグレードのペトリ皿(dish)で懸滴培養(Hanging drop culture)を行った。この時、10cm皿(dish) の蓋に10μLの細胞懸濁液(105 cells/mL)を100spotsアプライし、浮遊培養を行い細胞の凝集塊を形成させた。培地には分化を誘導するために1μMのレチノイン酸を添加した10%FBS/αMEMを用いた。４日後に細胞の凝集塊を回収し、グライコミクスへ、あるいはさらに分化誘導するためにステップ3へと進めた。
ステップ3、分化後細胞
回収した細胞の凝集塊をトリプシン処理により細胞懸濁液を調製し、ポリリジンコートした6cm皿(dish)に5 x 104cells/cm2になるように細胞を播種し、接着培養を行った。培地には、N-2サプリメント及びフィブロネクチンを添加したDMEM/F12を用いた。5日後に、細胞を回収し、グライコミクスを行った。
回収した細胞の凝集塊をトリプシン処理により細胞懸濁液を調製し、ポリリジンコートした6cm皿(dish)に5 x 104cells/cm2になるように細胞を播種し、接着培養を行った。培地には、N-2サプリメント及びフィブロネクチンを添加したDMEM/F12を用いた。5日後に、細胞を回収し、グライコミクスを行った。
グライコミクス
回収した細胞のペレットを1%Triton/PBSでタンパク質を可溶化した後、200μg相当のタンパク質をアセトン沈殿させ、還元アルキル化、トリプシン消化した。その後、PNGaseFによりN-結合型糖鎖を遊離させ、グライコブロッティング（Glycoblotting）法により糖鎖補足・精製を行い、MALDI-TOF/MSにより定量的プロファイルを取得した。未分化、分化中間体、分化後細胞の各スペクトルについて、内部標準として加えた濃度既知のオリゴ糖由来のシグナルの面積と細胞が発現している糖鎖由来シグナルの面積を比較することで、糖鎖発現量を定量的に解析した（図2-1）。その結果、分化に伴い有意に糖鎖構造が変化していることがわかった。この結果をもとに、バイセクトGlcNAcを有すると考えられる構造と、そうでないタイプの糖鎖でサブグループ化を行うと、図2-2のようになり、細胞分化を定量的にモニタリングできることが明らかになった。
回収した細胞のペレットを1%Triton/PBSでタンパク質を可溶化した後、200μg相当のタンパク質をアセトン沈殿させ、還元アルキル化、トリプシン消化した。その後、PNGaseFによりN-結合型糖鎖を遊離させ、グライコブロッティング（Glycoblotting）法により糖鎖補足・精製を行い、MALDI-TOF/MSにより定量的プロファイルを取得した。未分化、分化中間体、分化後細胞の各スペクトルについて、内部標準として加えた濃度既知のオリゴ糖由来のシグナルの面積と細胞が発現している糖鎖由来シグナルの面積を比較することで、糖鎖発現量を定量的に解析した（図2-1）。その結果、分化に伴い有意に糖鎖構造が変化していることがわかった。この結果をもとに、バイセクトGlcNAcを有すると考えられる構造と、そうでないタイプの糖鎖でサブグループ化を行うと、図2-2のようになり、細胞分化を定量的にモニタリングできることが明らかになった。
尚、分化誘導した後の細胞及び未分化状態のP19C6細胞について以下の条件で免疫細胞染色を行った。その結果は、図2-3に示すように、分化誘導した後の細胞においてのみ、ニューロンフィラメントが検出され、神経細胞に分化したことが明らかであった。
1次抗体： mouse monoclonal anti-neurofilament 160
2次抗体： HRP-polymer conjugated IgG
発色基質： Diaminobenzidine (DAB)
1次抗体： mouse monoclonal anti-neurofilament 160
2次抗体： HRP-polymer conjugated IgG
発色基質： Diaminobenzidine (DAB)
尚、バイセクトGlcNAcを有するタイプの糖鎖、バイセクトGlcNAcを有さないタイプの糖鎖、さらには、ハイマンノース型の糖鎖は、それぞれ以下のとおりである。
バイセクト構造を有するタイプの糖鎖群とは、表２中 化15、化22、化23、化30、化36、化37、化38、化44、化45、化46、化48、化53、化55、化56、化60、化61、化64、化67である。
バイセクト構造を有さないタイプの糖鎖群とは、表２中 化6、化8〜化10、化12〜14、化17〜化21、化25〜化29、化32〜化35、化40〜化43、化47、化50〜化52、化54、化57〜化59、化62、化63、化65、化66である。
ハイマンノース型の糖鎖群とは、表２中 化5、化7、化11、化16、化24、化31、化39である。
バイセクト構造を有さないタイプの糖鎖群とは、表２中 化6、化8〜化10、化12〜14、化17〜化21、化25〜化29、化32〜化35、化40〜化43、化47、化50〜化52、化54、化57〜化59、化62、化63、化65、化66である。
ハイマンノース型の糖鎖群とは、表２中 化5、化7、化11、化16、化24、化31、化39である。
実施例３
マウスのＥＳ細胞をレチノイン酸で分化誘導させ、未分化、及び分化後の細胞のグライコミクスを行った。分化誘導方法及び糖鎖発現量の定量的な解析は、実施例２と同様に行った。糖鎖発現量の定量的に解析した結果を図3-1及び3-2(図3-1の縦軸拡大)に示した。さらに、この結果をもとに、バイセクトGlcNAcを有すると考えられる構造と、そうでないタイプの糖鎖でサブグループ化を行い、結果を図3-3に示す。この結果は、この方法により細胞分化を定量的にモニタリングできることを示す。
マウスのＥＳ細胞をレチノイン酸で分化誘導させ、未分化、及び分化後の細胞のグライコミクスを行った。分化誘導方法及び糖鎖発現量の定量的な解析は、実施例２と同様に行った。糖鎖発現量の定量的に解析した結果を図3-1及び3-2(図3-1の縦軸拡大)に示した。さらに、この結果をもとに、バイセクトGlcNAcを有すると考えられる構造と、そうでないタイプの糖鎖でサブグループ化を行い、結果を図3-3に示す。この結果は、この方法により細胞分化を定量的にモニタリングできることを示す。
尚、バイセクトGlcNAcを有するタイプの糖鎖、バイセクトGlcNAcを有さないタイプの糖鎖、さらには、ハイマンノース型の糖鎖は、それぞれ以下のとおりである。
バイセクト構造を有するタイプの糖鎖群とは、表３中 化29、化37、化38、化58、化59、化60、化67である。
バイセクト構造を有さないタイプの糖鎖群とは、表３中 化4、化7、化8、化11、化13、化16、化18、化19、化20、化26、化27、化31、化32、化33、化34、化35、化36、化40、化41、化42、化43、化44、化45、化46、化47、化52、化53、化54、化55、化56、化57、化62、化63、化64、化65、化69、化70、化71、化72である。
ハイマンノース型の糖鎖群とは、表３中 化12、化17、化22、化30、化39、化51、化61である。
バイセクト構造を有さないタイプの糖鎖群とは、表３中 化4、化7、化8、化11、化13、化16、化18、化19、化20、化26、化27、化31、化32、化33、化34、化35、化36、化40、化41、化42、化43、化44、化45、化46、化47、化52、化53、化54、化55、化56、化57、化62、化63、化64、化65、化69、化70、化71、化72である。
ハイマンノース型の糖鎖群とは、表３中 化12、化17、化22、化30、化39、化51、化61である。
実施例４
ヒトのＥＳ細胞をレチノイン酸添加により分化誘導させ、レチノイン酸添加前を未分化、添加後を分化後として細胞のグライコミクスを行った。分化誘導方法及び糖鎖発現量の定量的に解析は、実施例２と同様とした。糖鎖発現量の定量的に解析した結果を図4-1及び4-2(図4-1の縦軸拡大)に示した。さらに、この結果をもとに、フコースを1つ有するタイプと、そうでないタイプの糖鎖でサブグループ化を行い、結果を図4-3に示す。さらに、シアル酸を有さないタイプと、そうでないタイプの糖鎖でサブグループ化を行い、結果を図4-4に示す。これらの結果は、この方法により細胞分化を定量的にモニタリングできることを示す。
ヒトのＥＳ細胞をレチノイン酸添加により分化誘導させ、レチノイン酸添加前を未分化、添加後を分化後として細胞のグライコミクスを行った。分化誘導方法及び糖鎖発現量の定量的に解析は、実施例２と同様とした。糖鎖発現量の定量的に解析した結果を図4-1及び4-2(図4-1の縦軸拡大)に示した。さらに、この結果をもとに、フコースを1つ有するタイプと、そうでないタイプの糖鎖でサブグループ化を行い、結果を図4-3に示す。さらに、シアル酸を有さないタイプと、そうでないタイプの糖鎖でサブグループ化を行い、結果を図4-4に示す。これらの結果は、この方法により細胞分化を定量的にモニタリングできることを示す。
尚、フコースを1つ有するタイプの糖鎖、シアル酸を有さないタイプの糖鎖、さらには、ハイマンノース型の糖鎖は、それぞれ以下のとおりである。
フコースを1つ有するタイプの糖鎖群とは、表４中 化6、化11、化13、化17、化19、化32、化36、化37、化39、化44、化47、化50、化51、化52である。
シアル酸を有さないタイプの糖鎖群とは、表４中 化6、化7、化8、化11、化13、化14、化17、化19、化20、化34、化35、化36、化37、化38、化39、化42、化44、化46、化47、化49、化52である。
ハイマンノース型の糖鎖群とは、表４中 化12、化18、化22、化26、化31、化40、化48である。
シアル酸を有さないタイプの糖鎖群とは、表４中 化6、化7、化8、化11、化13、化14、化17、化19、化20、化34、化35、化36、化37、化38、化39、化42、化44、化46、化47、化49、化52である。
ハイマンノース型の糖鎖群とは、表４中 化12、化18、化22、化26、化31、化40、化48である。
本発明は、例えば幹細胞の分化が関連する再生医療や医薬品製造開発の分野に有用である。
Claims (17)
- 分化を誘導した幹細胞または前駆細胞の分化レベルを評価する方法であって、
(A)分化誘導剤の存在下で培養した幹細胞または前駆細胞に含まれるN-結合型糖鎖について定量的プロファイルを経時的に取得すること、
(B)前記定量的プロファイル中から下記(C)の糖鎖カテゴリーの決定方法で決定された糖鎖のカテゴリーの少なくとも１つについて、該カテゴリーに含まれる糖鎖(群)の存在量または存在割合の経時的変化を求めること
を特徴とする、前記分化レベル評価方法。
(C)分化誘導剤の非存在下で培養した幹細胞または前駆細胞に含まれるN-結合型糖鎖について定量的プロファイルを取得すること、
分化誘導剤の存在下で培養した幹細胞または前駆細胞に含まれるN-結合型糖鎖について定量的プロファイルを取得すること、
前記2つの定量的プロファイル中の存在量に変動がある糖鎖群の少なくとも一部を抽出すること、
抽出した糖鎖群に含まれる各糖鎖を糖鎖タイプに基づいて、ハイマンノース型とノンハイマンノース型のカテゴリーに分け、かつノンハイマンノース型をさらに(1)バイセクトの有無、(2)フコースの数（０、１、２以上）、(3)シアル酸の有無、及び(4)分岐度（２、３以上）のカテゴリーに分けること、並びに
前記5つのカテゴリーの中から、幹細胞または前駆細胞の分化レベルを評価するのに適した糖鎖のカテゴリーを少なくとも１つ決定することを含む糖鎖カテゴリーの決定方法。 - 幹細胞または前駆細胞の心筋分化レベルを評価する方法であって、
心筋分化誘導剤の存在下で培養した幹細胞または前駆細胞に含まれるN-結合型糖鎖について定量的プロファイルを経時的に取得すること、
前記定量的プロファイル中のフコースを1つ有するタイプの糖鎖群の存在量または存在割合、フコースを2つ有するタイプの糖鎖群の存在量または存在割合及びハイマンノース型の糖鎖群の存在量または存在割合から成る群から選ばれる少なくとも1つの経時的変化を求めること、
を含む心筋分化レベルを評価する方法。 - 前記フコースを1つ有するタイプの糖鎖群の存在量または存在割合が前記培養によって増大した細胞は、心筋分化レベルが高まったものである請求項2に記載の方法。
- 前記フコースを2つ有するタイプの糖鎖群の存在量または存在割合が前記培養によって減少した細胞は、心筋分化レベルが高まったものである請求項2に記載の方法。
- 前記ハイマンノース型の糖鎖群の存在量または存在割合が前記培養によって減少した細胞は、心筋分化レベルが高まったものである請求項2に記載の方法。
- マウス由来の幹細胞または前駆細胞の神経細胞への分化レベルを評価する方法であって、
神経細胞への分化誘導剤の存在下で培養した幹細胞または前駆細胞に含まれるN-結合型糖鎖について定量的プロファイルを経時的に取得すること、
前記定量的プロファイル中のバイセクト構造を有するタイプの糖鎖群の存在量または存在割合、バイセクト構造を有さないタイプの糖鎖群の存在量または存在割合及びハイマンノース型の糖鎖群の存在量または存在割合から成る群から選ばれる少なくとも1つの経時的変化を求めること、
を含む神経細胞への分化レベルを評価する方法。 - 前記バイセクト構造を有するタイプの糖鎖群の存在量または存在割合が前記培養によって増大した細胞は、神経細胞への分化レベルが高まったものである請求項6に記載の方法。
- 前記バイセクト構造を有さないタイプの糖鎖群の存在量または存在割合が前記培養によって減少した細胞は、神経細胞への分化レベルが高まったものである請求項6に記載の方法。
- 前記ハイマンノース型の糖鎖群の存在量または存在割合が前記培養によって減少した細胞は、神経細胞への分化レベルが高まったものである請求項6に記載の方法。
- ヒト由来の幹細胞または前駆細胞の神経細胞への分化レベルを評価する方法であって、
神経細胞への分化誘導剤の存在下で培養した幹細胞または前駆細胞に含まれるN-結合型糖鎖について定量的プロファイルを経時的に取得すること、
前記定量的プロファイル中のフコースを１つ有するタイプの糖鎖群の存在量または存在割合、シアル酸を有さないタイプの糖鎖群の存在量または存在割合及びハイマンノース型の糖鎖群の存在量または存在割合から成る群から選ばれる少なくとも1つの経時的変化を求めること、
を含む神経細胞への分化レベルを評価する方法。 - 前記フコースを１つ有するタイプの糖鎖群の存在量または存在割合が前記培養によって増大した細胞は、神経細胞への分化レベルが高まったものである請求項10に記載の方法。
- 前記シアル酸を有さないタイプの糖鎖群の存在量または存在割合が前記培養によって増加した細胞は、神経細胞への分化レベルが高まったものである請求項10に記載の方法。
- 前記ハイマンノース型の糖鎖群の存在量または存在割合が前記培養によって減少した細胞は、神経細胞への分化レベルが高まったものである請求項10に記載の方法。
- 前記N-結合型糖鎖は、グライコブロッティング法により分離及び精製されたものである請求項1〜13のいずれかに記載の方法。
- 前記定量的プロファイルは、MALDI-TOF/MSまたはLC-ESI/SSI-TOF/MSにより得られたものである請求項1〜14のいずれかに記載の方法。
- 幹細胞が、胚性幹細胞、組織幹細胞、生体幹細胞、または人工多能性幹細胞(iPS細胞)である請求項1〜15のいずれかに記載の方法。
- 前駆細胞は、幹細胞を分化誘導した細胞であり、かつ多能性を有する細胞である請求項1〜16のいずれかに記載の方法。
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