JP5662363B2 - 難発現性タンパク質の分泌のためのタンパク質融合因子（ｔｆｐ）を明らかにする方法、タンパク質融合因子（ｔｆｐ）ライブラリーを製造する方法、及び難発現性タンパク質の組み換え的生産方法 - Google Patents

Description

本発明は、従来の組み換え生産方法で生産することが難しい難発現性タンパク質を発現または分泌生産することが可能な適合型タンパク質融合因子（ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｆｕｓｉｏｎ ｐａｒｔｎｅｒ：ＴＦＰ）を多様な遺伝資源から超高速で選別する技術に関する。

最近、ヒトゲノムプロジェクトで確保された遺伝体塩基配列の情報と遺伝体単位で確認される多様なタンパク質の機能を分析し、人体医薬学的に重要なタンパク質製品を生産するためには、組み換え微生物を用いる高効率タンパク質生産システムの開発が必要である。ヒトなどの高等生物由来の組み換えタンパク質を生産するために発現システムを選定するとき、多様な要因、例えば宿主細胞の成長特性、タンパク質の発現程度、細胞内外発現可能性、翻訳後修飾（ｐｏｓｔ−ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）可能性、発現されたタンパク質の生物学的活性及び発現タンパク質の用途などが考慮されるべきである。代表的な微生物遺伝子発現システムとして大腸菌及び酵母システムが主に用いられているが、大腸菌は、多くの発現システムが開発されており、外来タンパク質の発現率が非常に高いという利点があるが、高等生物由来のタンパク質を組み換え生産しようとするときに翻訳後修飾過程が不可能であり、細胞の培養培地へのタンパク質の完全な分泌が難しく、ジスルフィド結合（ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ ｂｏｎｄ）の多いタンパク質の折り畳みが不可能であり、封入体（ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ ｂｏｄｙ）などの不溶性タンパク質の形で発現するなどの欠点が指摘されている（Ｍａｋｒｉｄｅｓ， Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｒｅｖ．， １９９６， ６０， ５１２）。また、ヒトタンパク質のうち、疾病と連関されて医薬学的に価値の高い大部分のタンパク質が糖タンパク質または膜タンパク質であるから、完全な活性を持つためにはグリコシル化（ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）を必ず要求し或いはジスルフィド結合による完全な３次元構造を要求する場合、これらのタンパク質は、大腸菌では生産が不可能であり、酵母などの真核微生物発現システムを必ず必要とする。

真核微生物である酵母サッカロマイセス・セレヴィシェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）は、ヒトに対して安全性が立証されたＧＲＡＳ（Ｇｅｎｅｒａｌｌｙ Ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ Ａｓ Ｓａｆｅ）微生物であって、遺伝子操作が容易であり、様々な発現システムが開発されているうえ、大量培養が容易である。それだけでなく、ヒトタンパク質などの高等細胞由来タンパク質を組み換え生産するとき、タンパク質を細胞外に分泌することが可能な分泌機能と、グリコシル化などのタンパク質の翻訳後修飾機能を行うことができるという利点を提供する。タンパク質の分泌シグナルと目標タンパク質を人為的に融合（ｆｕｓｉｏｎ）することにより細胞外分泌が可能であるが、タンパク質の分泌過程によってタンパク質の折り畳み、ジスルフィド結合の形成及びグリコシル化過程が行われ、よって、生物学的に完全な活性を有する組み換えタンパク質を生産することができるという利点を提供する。これは、また、生物学的活性を有する組み換えタンパク質を培地から直接得ることができるから、経済的に効率が低い細胞の粉砕またはリフォールディング段階を必要としないため、非常に経済的である（Ｅｃｋａｒｔ ａｎｄ Ｂｕｓｓｉｎｅａｕ， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．， １９９６， ７， ５２５）。

ところが、上述した多くの利点にも拘わらず、酵母サッカロマイセス・セレヴィシェを用いたヒトタンパク質分泌システムに関する現技術の問題点として指摘されているのは、ヒトタンパク質の種類によっては全く生産されないか、或いは数グラム／リットルまで生産されるなど、分泌率が数千倍以上の差異を示して分泌生産性を予測することが難しいことである。外来タンパク質が数グラム／リットルの水準まで分泌生産可能であると判断するとき、分泌生産性の側面から十分な経済性があると判断されるが、タンパク質の種類によっては分泌効率が低いという問題と、特に高付加価値の人体医薬用タンパク質を生産しようとするときに発現及び分泌が難しいという問題がよく発生する。かかる問題を解決するために、タンパク質の分泌に関与する分泌因子についての研究が盛んに行われている。小胞体で新しく合成されたタンパク質の折り畳みを助ける分泌因子ＢｉＰ（ＫＡＲ２）の過発現方法（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ｐｒｏｇ．， １９９６， ２７１， １００１７）とシステム結合の形成を助けるＰＤＩ（ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ ｉｓｏｍｅｒａｓｅ）の過発現方法（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， １９９４， １２， ３８１； Ｓｃｈｕｌｔｚ ｅｔ ａｌ．， Ａｎｎ． Ｎ． Ｙ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， １９９４， ７２１， １４８； Ｈａｙａｎｏ ｅｔ ａｌ．， ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．， １９９５， ３７７， ５０５）などのシャペロン（ｃｈａｐｅｒｏｎｅ）についての研究、及び分泌を誘導する融合因子の製造と元々よく分泌されるタンパク質との融合によって分泌を増進させる研究が盛んに行われている（Ｇｏｕｋａ ｅｔ ａｌ．， Ａｐｐｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．， １９９７， ４７， １）。このような方法は、現在まで外来タンパク質の分泌を増進させた非常に成功的な方法と認識されているが、このような融合技術の分子メカニズムについての研究は未だ微々である。実験的に、このような融合技術は、タンパク質の移動を容易にし、折り畳みを助けるなど、タンパク質の翻訳段階または翻訳後段階における限界点を改善するものと知られている。

Ｋｊｅｌｄｓｅｎ等（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ． Ｐｕｒｉｆ．， １９９７， ９， ３３１）は、インシュリンまたはインシュリン前駆体（ＩＰ）を酵母で効率よく分泌生産するために、理論的根拠によって製作された合成リーダー（ｌｅａｄｅｒ）をインシュリンに融合してインシュリンの分泌率を改善したが、このような合成リーダーにはグリコシル化部位とＢｉＰ認識部位を添加して小胞体に留まる時間を長くすることにより、タンパク質が正常的に折り畳まれるように誘導した。また、合成リーダーに追加的なグリコシル化部位を導入することにより、黒色アスペルギルスおよびサッカロマイセス・セレヴィシェにおけるインシュリンの分泌率が相当増加したと報告した（Ｋｊｅｌｄｓｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ． Ｐｕｒｉｆ．， １９９８， １４， ３０９）。これと同様の結果が、アスペルギルスアワモリ（Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， １９８９， ８， ４３５）及び疎水性キュチナーゼ（ｃｕｔｉｎａｓｅ）を酵母で発現した場合にも報告された（Ｓａｇｔ ｅｔ ａｌ．， Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ２０００， ６６， ４９４０）。これは、グリコシル化部位の導入により組み換えタンパク質の小胞体内における溶解性が増加し、タンパク質の折り畳みが誘導されることにより、結果として分泌が増加することに起因した。

元々良く分泌されるタンパク質を融合因子として用いる研究によれば、黒色アスペルギスルのグルコアミラーゼと融合して発現し、牛由来のプロキモシン（Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， １９８９， ８， ４３５）、豚膵臓由来のホスホリパーゼＡ２（Ｒｏｂｅｒｔｓ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ， １９９２， １２２， １５５）、ヒトインターロイキン−６（Ｃｏｎｔｒｅｒａｓ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １９９１， ９， ３７８； Ｂｒｏｅｋｈｕｉｊｓｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．， １９９３， ３１， １３５）、鶏由来のリゾチーム（Ｊｅｅｎｅｓ ｅｔ ａｌ．， ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ， １９９３， １０７， ２６７）、及びヒトラクトフェリン（Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， １９９５， １３， ４９８）を効率よく分泌させた。分泌増加率は、タンパク質によって差異を見せて５倍〜１０００倍であった。酵母においても、ヒトインターロイキン−１βのアミノ末端２４個のアミノ酸を融合因子として用いてヒト成長因子及びコロニー刺激因子の分泌を増加させた（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｐｒｏｇ．， １９９９， １５， ８８４）。ヒトインターロイキン−１βは、特別な分泌シグナルなしに分泌されるものと知られており（Ｍｕｅｓｃｈ ｅｔ ａｌ．， Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｓｃｉ．， １９９０， １５， ８６）、酵母においても非常に効果的に組み換え分泌生産されるものと報告された（Ｂａｌｄａｒｉ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．， １９８７， １， ４３３）。タンパク質が正常的に折り畳まれるためにはタンパク質の元々保有した融合因子が必ず必要とされる場合も報告されたが（Ｔａｋａｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．， Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．， ２００１， ５５， ４５４）、リゾプスオリゼ由来のリパーゼ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｏｒｙｚａｅ ｌｉｐａｓｅ、ＲＯＬ）を酵母サッカロマイセス・セレヴィシェで発現するために、サッカロマイセス由来の交配因子アルファ（ｍａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ ａｌｐｈａ）のプレ−プロ−リーダー（ｐｒｅ−ｐｒｏ−ｌｅａｄｅｒ）配列をＲＯＬの成熟タンパク質に該当する遺伝子と結合して発現した場合には、全くＲＯＬが分泌されなかったが、ＲＯＬ自体のｐｒｏ配列を結合した場合には、適切に分泌された。これは、ＲＯＬ自体のｐｒｏ配列が自己タンパク質の折り畳みに絶対的に必要であることを示した。

上述した研究結果から分かるように、組み換えタンパク質の分泌を誘導するために様々な分泌因子が開発された。ところが、開発された分泌因子が特定タンパク質の分泌増進には効果があるが、全てのタンパク質に一律的に適用できないという問題があった。Ｄｏｒｎｅｒ等は、ＣＨＯ細胞でＢｉＰを過発現した結果、むしろタンパク質分泌率が減少し（Ｄｏｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， ＥＭＢＯ Ｊ．， １９９２， １１， １５６３）、反面、ＢｉＰの発現を減少させたときにはタンパク質分泌が増加した（Ｄｏｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．， １９８８， ８， ４０６３）と報告した。酵母においても、ＫＡＲ２（ＢｉＰ）の過発現が植物タウマチン（ｐｌａｎｔ ｔｈａｕｍａｔｉｎ）の場合には、分泌が向上しなかった（Ｈａｒｍｓｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ａｐｐｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．， １９９６， ４６， ３６５）。バキュロウィルスでＢｉＰを過発現したとき、細胞抽出物で可溶性抗体の量が増加したが、抗体の分泌効率は増加しなかった（Ｈｓｕ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ． Ｐｕｒｉｆ．， １９９４， ５， ５９５）。別の分泌因子であるフォルダーゼ（ＰＤＩ）を過発現する場合にも、黒色アスパルギルスでフォルダーゼを過発現したが、グルコアミラーゼの分泌が増加しなかった（Ｗａｎｇ ａｎｄ Ｗａｒｄ， Ｃｕｒｒ． Ｇｅｎｅｔ． ２０００， ３７， ５７）。また、タンパク質融合因子を用いた分泌誘導の場合にも、特定のタンパク質に対してのみ分泌効率が増進されるという問題が報告されている。

上述したように、分泌因子の効果に関する多くの研究があったが、タンパク質の種類によっては分泌に及ぼす影響が異なったため、開発された分泌因子が全てのタンパク質に適用できないという問題がある。したがって、目的する各タンパク質分泌増進の最大化のためには、目的のタンパク質に特異的に適用できる最適の分泌因子を選別する技術が必要である。このため、本発明者らは、組み換えタンパク質の種類によって最適の分泌融合因子を遺伝体単位で超高速で選別する技術を開発し、本発明を完成した。

そこで、本発明の目的は、酵母における発現率が低くて経済的量産が不可能なタンパク質を対象としてタンパク質の生産を強力に誘導することができる適切なタンパク質融合因子（ＴＦＰ）を、酵母を含んだ様々な遺伝子源から超高速で選別することが可能な方法、及びこれを用いて難発現性タンパク質の分泌生産を促進することが可能なタンパク質融合因子を提供することにある。

一様態において、本発明は、難発現性の目的タンパク質遺伝子（Ｘ）を自動選別用レポーター遺伝子（Ｒ）に結合してＸ−Ｒの難発現性融合タンパク質を製造し、Ｘ−Ｒの融合物に別の遺伝子の融合によってＸ−Ｒ難発現性融合タンパク質の分泌を細胞外に誘導するタンパク質融合因子（ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｆｕｓｉｏｎ ｐａｒｔｎｅｒ、ＴＦＰ）を遺伝子ライブラリーから選別する方法に関する。

本発明の前記および他の目的、特徴および他の利点は添付図面を参照する以降の詳細な説明からより明らかに理解可能である。

インベルターゼ遺伝子の欠失過程及び選別標識のポップアウト過程を示す図である。 インベルターゼ活性を測定するためのザイモグラムである。（レイン１、２、３：野性型サッカロマイセス・セレヴィシェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）Ｙ２８０５、レイン４、５、６：インベルターゼ欠失変異株（Ｓ．セレヴィシェＹ２８０５Δｉｎｖ２）） 炭素源による菌体の成長を示す写真である。（ＩＮＶ２：野性型Ｓ．セレヴィシェＹ２８０５、Δｉｎｖ２：インベルターゼ欠失変異株（Ｓ．セレヴィシェＹ２８０５Δｉｎｖ２）） インベルターゼ遺伝子の欠失を確認するためのサザンブロット結果である。（レイン１、２：Ｓ．セレヴィシェＹ２８０５ｕｒａ３ ＩＮＶ２、レイン３、４：Ｓ．セレヴィシェＹ２８０５Δｉｎｖ２Ｕ（ＵＲＡ３Δｉｎｖ２）、レイン５、６：Ｓ．セレヴィシェＹ２８０５Δｉｎｖ２（ｕｒａ３Δｉｎｖ２）） グルコース及びスクロース培地における菌体成長を確認した写真である。 プラスミドｐＹＨＴＳ−Ｆ０、Ｆ１及びＦ２の製造過程及び酵母遺伝子ライブラリーの製造過程を図式した図である。 ４種のタンパク質融合因子を含む菌体の培養上澄液をＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスタンブロットした結果である。（レイン１：サイズマーカー（ｓｉｚｅ ｍａｒｋｅｒ）、レイン２：インターロイキン−２、レイン３：ｐＹＩＬ−ＴＦＰ１を含有した菌体を培養した培養上澄液、レイン４：ｐＹＩＬ−ＴＦＰ２を含有した菌体を培養した培養上澄液、レイン５：ｐＹＩＬ−ＴＦＰ３を含有した菌体を培養した培養上澄液、レイン６：ｐＹＩＬ−ＴＦＰ４を含有した菌体を培養した培養上澄液） 糖鎖分析のためにＥｎｄｏ−Ｈ処理前後のＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果である。（レイン１、−：ｐＹＩＬ−ＴＦＰ１を含有した菌体を培養した培養上澄液、Ｅｎｄｏ−Ｈ非処理、レイン１、＋：ｐＹＩＬ−ＴＦＰ１を含有した菌体を培養した培養上澄液、Ｅｎｄｏ−Ｈ処理、レイン２、−：ｐＹＩＬ−ＴＦＰ３を含有した菌体を培養した培養上澄液、Ｅｎｄｏ−Ｈ非処理、レイン２、＋：ｐＹＩＬ−ＴＦＰ３を含有した菌体を培養した培養上澄液、Ｅｎｄｏ−Ｈ処理、レイン３、−：ｐＹＩＬ−ＴＦＰ４を含有した菌体を培養した培養上澄液、Ｅｎｄｏ−Ｈ非処理、レイン３、＋：ｐＹＩＬ−ＴＦＰ４を含有した菌体を培養した培養上澄液、Ｅｎｄｏ−Ｈ処理） Ｋｅｘ２ｐプロセッシングサイト有無による菌体培養上澄液のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析結果である。（レインＭ：サイズマーカー、レイン１：ｐＹＩＬ−ＴＦＰ１を含有した菌体の培養上澄液、レイン２：ｐＹＩＬ−ＫＲＴＦＰ１を含有した菌体の培養上澄液、レイン３：ｐＹＩＬ−ＴＦＰ３を含有した菌体の培養上澄液、レイン４：ｐＹＩＬ−ＫＲＴＦＰ３を含有した菌体の培養上澄液、レイン５：ｐＹＩＬ−ＴＦＰ４を含有した菌体の培養上澄液、レイン６：ｐＹＩＬ−ＫＲＴＦＰ４を含有した菌体の培養上澄液） ＴＦＰ１の特性分析のための遺伝子欠失の後に製造されたプラスミドを示す模式図である。 ＴＦＰ１由来のタンパク質融合因子（ＴＦＰ１−１、２、３および４）によるインターロイキン−２分泌能を確認したＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果である。（レインＭ：サイズマーカー、レインＳ：インターロイキン−２、レイン１−１：ｐＹＩＬ−ＫＲＴ１−１（「ｐＹＩＬ−ＫＲＴＦＰ１−１」と命名する）を含有した菌体を培養した培養上澄液、レイン１−２：ｐＹＩＬ−ＫＲＴ１−２（「ｐＹＩＬ−ＫＲＴＦＰ１−２と命名する」を含有した菌体を培養した培養上澄液、レイン１−３：ｐＹＩＬ−ＫＲＴ１−３（「ｐＹＩＬ−ＫＲＴＦＰ１−３」と命名する）を含有した菌体を培養した培養上澄液、レイン１：ｐＹＩＬ−ＫＲＴＦＰ１を含有した菌体を培養した培養上澄液、レイン１−４：ｐＹＩＬ−ＫＲＴ１−４（「ｐＹＩＬ−ＫＲＴＦＰ１−４」と命名する）を含有した菌体を培養した培養上澄液） ｐＹＩＬ−ＫＲＴ１−４を含有した組み換え菌株の流加発酵培養プロフィル、及び培地に分泌されたタンパク質を発酵時間別にＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析した結果である。 タンパク質融合因子ＴＦＰ１、２、３及び４を用いた難分泌タンパク質ヒトコロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）の分泌を確認したＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスタンブロット結果である。（レインＭ：サイズマーカー、レイン１：ｐＹＧＣＳＦ−ＫＲＴＦＰ１を含有した菌体を培養した培養上澄液、レイン２：ｐＹＧＣＳＦ−ＫＲＴＦＰ２を含有した菌体を培養した培養上澄液、レイン３：ｐＹＧＣＳＦ−ＫＲＴＦＰ３を含有した菌体を培養した培養上澄液、レイン４：ｐＹＧＣＳＦ−ＫＲＴＦＰ４を含有した菌体を培養した培養上澄液） ｐＹＧＣＳＦ−ＴＦＰ３を含有した組み換え菌株の流加発酵培養プロフィル、及び培地に分泌されたタンパク質を発酵時間別にＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析した結果である。 タンパク質融合因子ＴＦＰ３が由来した遺伝子全体を確保し、Ｇ−ＣＳＦとの融合地点を変更してＧ−ＣＳＦの分泌率を向上させた結果である。（（Ａ）レインＴ３：ｐＹＧＣＳＦ−ＫＲＴＦＰ３を含有した菌体を培養した培養上澄液、レインＴ３−１：ｐＹＧＣＳＦ−ＫＲＴＦＰ３−１を含有した菌体を培養した培養上澄液、レインＴ３−２：ｐＹＧＣＳＦ−ＫＲＴＦＰ３−２を含有した菌体を培養した培養上澄液、レインＴ３−３：ｐＹＧＣＳＦ−ＫＲＴＦＰ３−３を含有した菌体を培養した培養上澄液、レインＴ３−４：ｐＹＧＣＳＦ−ＫＲＴＦＰ３−４を含有した菌体を培養した培養上澄液、（Ｂ）レインＴ３：ｐＹＧＣＳＦ−ＫＲＴＦＰ３を含有した菌体を培養した培養上澄液、レインＴ３−１：ｐＹＧＣＳＦ−ＫＲＴＦＰ３−１を含有した菌体を培養した培養上澄液、レインＴ３−１−１：ｐＹＧＣＳＦ−ＫＲＴＦＰ３−１−１を含有した菌体を培養した培養上澄液、レインＴ３−１−２：ｐＹＧＣＳＦ−ＫＲＴＦＰ３−１−２を含有した菌体を培養した培養上澄液、レインＴ３−２：ｐＹＧＣＳＦ−ＫＲＴＦＰ３−２を含有した菌体を培養した培養上澄液） タンパク質融合因子ＴＦＰ３を用いて産業酵素ＣａｌＢ１４を分泌生産した発酵培地のＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果である。（レインＭ：サイズマーカー、 レイン１、２：ｐＹＧＡ−ＣａｌＢ１４を含有した菌体を２０℃で低温培養した培養上澄液、レイン１２−５８：ｐＹＧＴ３−ＣａｌＢ１４を含有した菌体を培養した培養上澄液） タンパク質融合因子ＴＦＰ１を含有したＧ−ＣＳＦ発現ベクターｐＧＡＰ−ＴＦＰ１−ＧＣＳＦ及びｐＧＡＰ−ＭＦａｌｐｈａ−ＧＣＳＦをそれぞれ含有した酵母ピキアパストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）を回分培養し、時間別に取った試料内に存在するタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析した結果である。（レインＳｃ：ｐＹＧＣＳＦ−ＫＲＴＦＰ１を含有した酵母Ｓ．セレヴィシェ培養上澄液１０μＬ、レイン６−２４：ｐＧＡＰ−ＴＦＰ１−ＧＣＳＦ及びｐＧＡＰ−ＭＦａｌｐｈａ−ＧＣＳＦを含有したＰ．パストリスを培養した培養上澄液２００μＬ濃縮液） ｐＹＩＬ−ＫＲＴＦＰ１のマップを示す。 ｐＹＩＬ−ＫＲＴＦＰ２のマップを示す。 ｐＹＩＬ−ＫＲＴＦＰ３のマップを示す。 ｐＹＩＬ−ＫＲＴＦＰ４のマップを示す。 ｐＹＩＬ−ＫＲＴ１−３（「ｐＹＩＬ−ＫＲＴＦＰ１−３と命名する」）のマップを示す。 ｐＹＩＬ−ＫＲＴ１−４（「ｐＹＩＬ−ＫＲＴＦＰ１−４と命名する」）のマップを示す。 ｐＹＧＴ３−１−１−ＧＣＳＦのマップを示す。 ｐＹＧＴ３−１−２−ＧＣＳＦのマップを示す。

一つの具体的な様態において、本発明は、
（１）難発現性目的タンパク質の遺伝子（Ｘ）とフレーム単位（ｉｎ−ｆｒａｍｅ）で連結された自動選別用レポーター遺伝子（Ｒ）の融合遺伝子（Ｘ−Ｒ）を含む自動選別ベクターを製造する段階と、
（２）難発現性融合タンパク質（Ｘ−Ｒ）の分泌を誘導するタンパク質融合因子を含んだ遺伝子ライブラリーを自動選別ベクターと連結してタンパク質融合因子ライブラリーを製造する段階と、
（３）タンパク質融合因子ライブラリーでレポーター遺伝子の活性がない細胞を形質転換させてレポータータンパク質の活性を検出する段階と、
（４）レポータータンパク質の活性を示す形質転換細胞から遺伝子を分離してタンパク質融合因子の特性を分析する段階とを含んで、難発現性タンパク質生産用適合型タンパク質融合因子を選別する方法に関する。

本発明において、「タンパク質融合因子（ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｆｕｓｉｏｎ ｐａｒｔｎｅｒ、ＴＦＰ）」とは、難発現性タンパク質をコードする遺伝子と融合されて難発現性タンパク質の分泌生産を誘導する遺伝子を意味する。また、「タンパク質融合因子タンパク質」は、前述したようにタンパク質融合因子遺伝子によってコードされるアミノ酸配列のタンパク質を意味する。

本発明において、「難発現性タンパク質（ｎｏｎ−ｐｒｏｄｕｃｉｂｌｅ ｐｒｏｔｅｉｎ）」とは、ヒトまたは多様な生命体由来のタンパク質を組み換え生産しようとするとき、タンパク質自体の特性によって大腸菌や酵母などの宿主細胞における組み換え発現生産が難しいタンパク質を意味する。特に、本発明の目的上、酵母などの宿主細胞における組み換え発現生産が難しいタンパク質を意味する。本発明の選別方法及びこれから得たタンパク質融合因子は、大腸菌などの原核細胞と酵母などの真核細胞における組み換え的生産が不可能なタンパク質だけでなく、大腸菌などの他の宿主における組み換え生産が可能であっても、酵母などの真核細胞では生産性が低いため経済性のない多数のタンパク質を組み換え的に生産するのに用いられる。本発明において、「発現」とは、特定のタンパク質をコードする遺伝子の転写及び翻訳産物が分泌されて最終目的物として得られることを含む意味である。

本発明の自動選別用レポーター遺伝子は、必ずしもこれに限定されるものではないが、インベルターゼ、スクラーゼ、セルラーゼ、キシラナーゼ、マルターゼ、アミラーゼ、グルコアミラーゼ、ガラクトシダーゼなどから構成された、細胞外部への分泌が可能なタンパク質をコードする遺伝子群から選択される。

前述した選別方法において、難発現性融合タンパク質の分泌を誘導するためのタンパク質融合因子を含む遺伝子ライブラリーは、多様な起源、例えば酵母またはヒトを含んだ多様な動植物及び微生物由来から得ることができ、酵母起源の遺伝子ライブラリーが好ましい。前記遺伝子ライブラリー用酵母は、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、デバリオミセス（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ）、ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、クリュイベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）、シゾサッカロミセスポンベエキス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、クモノスカビ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）などを含む。これらの遺伝子ライブラリーは、ゲノム性（染色体性）ＤＮＡまたはｃＤＮＡの形態でありうる。

一つの具体的な例示として、組み換え生産が難しい難発現性タンパク質（Ｘ）とインベルターゼ（Ｉ）を融合して酵母で発現する場合、融合された難分泌タンパク質（Ｘ）によって正常的に分泌されたインベルターゼの分泌が抑制され、スクロースを単一炭素源として現有する培地で難発現の程度に応じて酵母が成長せず、または成長が非常に遅延する。しかし、Ｘ−Ｉの発現及び分泌を誘導することが可能な効率的なタンパク質融合因子を導入する場合、細胞はスクロース培地で速く成長するが、このような特徴を利用して、難発現タンパク質とインベルターゼが誘導されたタンパク質（Ｘ−Ｉ）に多様な起源から確保されるタンパク質融合因子ライブラリーをさらに融合して、ＴＦＰ−Ｘ−ＩまたはＸ−Ｉ−ＴＦＰの形態に製造した後、酵母に導入、発現してスクロース培地で速く成長する細胞を選別すると、多様な起源のライブラリーから、難発現性タンパク質に最も適したＴＦＰを超高速で選別することができる。

したがって、より好ましい様態において、本発明は、
（１）酵母インベルターゼを用いた自動選別システムの開発のためのレポーター遺伝子として使用するために、酵母自体が有するインベルターゼ遺伝子ＩＮＶ２（Ｉ）を欠失させた酵母変異株を製造する段階と、
（２）酵母ＧＡＬ１０プロモータによって発現が調節され、インベルターゼ（Ｉ）遺伝子と難発現性遺伝子（Ｘ）がフレーム単位で融合された遺伝子（Ｘ−Ｉ）を含有する自動選別ベクターとしての酵母ＨＴＳ（ｈｉｇｈ ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）ベクター（ｐＹＨＴＳ−Ｆ０、ｐＹＨＴＳ−Ｆ１及びｐＹＨＴＳ−Ｆ２）を製造する段階と、
（３）インベルターゼと難発現性タンパク質の融合遺伝子（Ｘ−Ｉ）を分泌させることが可能な酵母遺伝子からのタンパク質融合因子ライブラリーをｐＹＨＴＳベクターに製造する段階と、
（４）製造されたライブラリーを段階（１）で製造された酵母に形質転換し、スクロースを単一炭素源として含んでいる培地で自動選別する段階と、
（５）スクロース培地で成長した酵母を培養し、培地に分泌されたタンパク質を確認する段階と、
（６）酵母から遺伝子を分離してタンパク質融合因子特性を分析する段階とを含む、難発現性タンパク質生産用適合型ＴＦＰを超高速で選別する方法に関する。

本発明者らは、酵母インベルターゼ欠如変異株を製造し、インベルターゼ遺伝子が欠失された酵母菌株でインベルターゼと融合されたタンパク質の発現によってインベルターゼを自動選別システムのマーカーとして使用することができることを確認した後、難発現性タンパク質であるヒトインターロイキン−２を用いたタンパク質融合因子自動選別ベクターであるｐＹＨＴＳ−Ｆ０、Ｆ１及びＦ２を製造し、ここに酵母起源の切断された染色体ＤＮＡを連結してタンパク質融合因子ライブラリーを製造し、これから難分泌性タンパク質ヒトインターロイキン−２に適したタンパク質融合因子タンパク質ＴＦＰ１、ＴＦＰ２、ＴＦＰ３及びＴＦＰ４を確認した。

本発明において、「インベルターゼを用いた自動選別システム」とは、酵母がスクロースを単位炭素源として用いるためには酵母ＩＮＶ２遺伝子によってコードされるタンパク質であるインベルターゼという酵素を必要とするが、酵母の染色体上に存在するＩＮＶ２遺伝子を欠失させ、ベクターにＩＮＶ２遺伝子を導入してＩＮＶ２遺伝子の発現如何に応じてスクロース培地で成長する菌株を選別するシステムを意味する。

インベルターゼは、レポータータンパク質として用いられてきた。例えば、米国特許第６，２２８，５９０号及びＥＰ第０９０７７２７Ｂ１では、インベルターゼ自体の分泌シグナルを除去して分泌されないようにした後、その分泌を誘導する融合因子を選別する方法について開示している。本発明は、これとは対照的に、インベルターゼを難発現性タンパク質と融合して難発現性融合タンパク質を形成し、これを難発現性融合タンパク質の発現を誘導することが可能なタンパク質融合因子の選別に利用する。その結果、インベルターゼが発現される形質転換体の数が著しく減少する弁別力を有し、難発現性タンパク質に特異的に適用されるタンパク質融合因子を高速で確保することができる。

本発明で確保されたタンパク質融合因子ＴＦＰ１、ＴＦＰ２、ＴＦＰ３、ＴＦＰ４及びその誘導体の適用範囲は、多様な商業的用途として量産されるタンパク質を含む。このようなタンパク質は、これらに限定されるものではないが、サイトカイン（例えば、インターロイキン）、血清タンパク質（例えば、因子ＶＩＩ、ＶＩＩＩ及びＩＸを含んだ血液因子）、免疫グロブリン、サイトカインレセプター、ラクトフェリン、インターフェロン（例えば、α−、β−及びγ−インターフェロン）、コロニー刺激因子（例えば、ＧＭ−ＣＳＦ，Ｇ−ＣＳＦ）、ホスホリパーゼ−活性化タンパク質（ＰＬＡＰ）、インシュリン、腫瘍怪死因子（ＴＮＦ）、成長因子（例えば、ＴＧＦαまたはＴＦＰβなどの組織成長因子及び内皮成長因子、表皮成長因子：ＥＧＦ、血素板由来増殖因子：ＰＤＧＦ、線維芽細胞増幅因子：ＦＧＦ）、ホルモン（例えば、卵胞刺激ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、抗利尿ホルモン、色素性ホルモン及び副甲状腺ホルモン、黄体ホルモン分泌ホルモン及びその類似体）、カルシトニン（ｃａｌｃｉｔｏｎｉｎ）、カルシトニン遺伝子関連ペプチド（Ｃａｌｃｉｔｏｎｉｎ Ｇｅｎｅ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｐｅｐｔｉｄｅ、ＣＧＰＲ）、エンケファリン（ｅｎｋｅｐｈａｌｉｎ）、ソマトメジン、エリスロポエチン、視床下部放出因子、プロラクチン、絨毛性ゴナドトロピン、組織プラスミノゲン活性因子、成長ホルモン放出ペプチド（ｇｒｏｗｔｈ ｈｏｒｍｏｎｅ ｒｅｌｅａｓｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅ、ＧＨＰＲ）、胸腺体液性因子（ｔｈｙｍｉｃ ｈｕｍｏｒａｌ ｆａｃｔｏｒ、ＴＨＦ）、抗癌及び抗生ペプチドなどを含む。また、このようなタンパク質は、例えば炭水化物−特異的酵素、タンパク質分解酵素、リパーゼ、酸化還元酵素、トランスフェラーゼ、加水分解酵素、リアーゼ、異性化酵素、リガーゼなどの酵素を含むことができる。具体的な酵素は、これらに限定されないが、アスパラギナーゼ、アルギナーゼ、アルギニンデアミナーゼ、アデノシンデアミナーゼ、過酸化物ジスムターゼ、エンドトキシナーゼ、カタラーゼ、キモトリプシン、ウリカーゼ、アデノシンジホスファダーゼ、チロシナーゼ及びビリルビンオキシダーゼを挙げることができる。炭水化物−特異的酵素の例としては、グルコースオキシダーゼ、ガラクトシダーゼ、グルコセレブロシダーゼ、グルクロニダーゼなどがある。

難発現性タンパク質遺伝子は、人体医学的または産業的重要性があり、組み換え生産の必要性があるヒトを含んだ様々な動植物及び微生物由来の遺伝子から分離または化学合成されるものであって、前述したタンパク質をコードする遺伝子である。

本発明の自動選別ベクターは、プロモータ遺伝子、翻訳開始及び終結コドンが除去された目的タンパク質をコードする遺伝子、およびこれにフレーム単位で融合されたレポーター遺伝子を含み、プロモータ遺伝子は、ＧＡＰＤＨ、ＰＧＫ、ＡＤＨ、ＰＨＯ５、ＧＡＬ１及びＧＡＬ１０よりなる群から選択される遺伝子であることが好ましい。

本発明の自動選別方法において形質転換に使用した宿主細胞は、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）やデバリオミセス（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ）、ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、クリュイベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）、シゾサッカロミセス （Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）及びサッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属などの酵母類、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）やペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、クモノスカビ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）及びトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属などの菌類、またはエシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）及びバシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属などの細菌類を使用することができるが、必ずしもこれに限定されるものではない。

本発明の難発現性タンパク質生産用適合型ＴＦＰの超高速選別方法は、発現不可能であり或いは発現率が非常に低い難発現性タンパク質用に使用することが好ましいが、ある程度発現されるが発現率を高めることが可能なＴＦＰを選別するためにも利用できる。本発明の具体例で実施しているように、インベルターゼをレポーターとして使用する場合、スクロース培地で成長が速い順序通りに区別してより効率的なＴＦＰを選別することができる。

別の様態において、本発明は、難発現性タンパク質インターロイキン−２の分泌生産促進のための適合型融合因子超高速選別ベクターｐＹＨＴＳ−Ｆ０、Ｆ１及びＦ２に関するものであり、このような選別ベクターは、難発現タンパク質ヒトインターロイキン−２とインベルターゼとが融合された遺伝子を含有しており、インターロイキン−２遺伝子のアミノ末端に３つの相異なるリーディングフレームで製造された制限酵素ＢａｍＨＩ切断部位を含有している。

本発明の具体的な実施では、ヒトインターロイキン−２を酵母で分泌生産促進する適合型融合因子を超高速で選別するために、選別ベクター３種（ｐＹＨＴＳ−Ｆ０、Ｆ１及びＦ２）に酵母染色体ＤＮＡを無作為に切断し、挿入した後、インベルターゼが欠如された菌株に形質転換し、スクロース培地で成長する菌体を選別することにより、難発現性インターロイキン−２及びインベルターゼの融合タンパク質を培地に分泌することが可能な適合型融合因子を選別した。

ヒトインターロイキン−２は、疎水性の強いタンパク質であって、酵母における発現が難しい理由は、強力なプロモータによって組み換え大量発現されたタンパク質が小胞体内で速く活性型に折り畳まれず、互いに凝集して小胞体機能を麻痺させる問題のためであると推定されている。よって、インターロイキン−２に融合されたインベルターゼも分泌できないため、細胞がスクロース培地で成長することができない。このような融合タンパク質を効率よく分泌させることが可能なタンパク質融合因子は、インターロイキン−２遺伝子の前部に酵母遺伝子ライブラリーを挿入し、酵母に形質転換した後、スクロース培地で成長する形質転換体を選択することにより確保される。

具体的な実施において、本発明者らは、難発現タンパク質であるインターロイキン−２の分泌を誘導する融合因子を確保するために、スクロース培地で成長する形質転換体から遺伝子を分離し、大腸菌に再形質転換して相異なる４種のプラスミド（ｐＹＨＴＳ−ＴＦＰ１、ＴＦＰ２、ＴＦＰ３及びＴＦＰ４）を回収した。それぞれのプラスミドに挿入された４種の相異なるタンパク質融合因子遺伝子ＴＦＰ１（配列番号２）、ＴＦＰ２（配列番号４）、ＴＦＰ３（配列番号６）及びＴＦＰ４（配列番号８）を確保した。これらの遺伝子によってコードされるアミノ酸配列がそれぞれ配列番号１、３、５及び７に示されている。

前記得られたベクターｐＹＨＴＳ−ＴＦＰ１、ＴＦＰ２、ＴＦＰ３及びＴＦＰ４からインベルターゼを除去し、インターロイキン−２遺伝子に翻訳終結コドンを挿入したｐＹＩＬ−ＴＦＰ１、ＴＦＰ２、ＴＦＰ３及びＴＦＰ４を製作した。このようなベクターは、タンパク質融合因子と融合された形のインターロイキン−２を分泌するため、タンパク質融合因子を自動除去し得るように、タンパク分解酵素Ｋｅｘ２ｐ認識部位を挿入したベクターｐＹＩＬ−ＫＲＴＦＰ１、ＫＲＴＦＰ２、ＫＲＴＦＰ３及びＫＲＴＦＰ４を製作した。ひいては、ヒトコロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）をタンパク質融合因子ＴＦＰ１ないし４と融合したベクターｐＹＧＣＳＦ−ＴＦＰ１ないし４を製作し、ＴＦＰがヒトインターロイキン−２以外のタンパク質の分泌生産にも効果的であることを立証した。

一方、産業用リパーゼ酵素として脚光を浴びているカンジダ・アンタークチカ由来のリパーゼＢ（ＣａｌＢ）を分子進化させて非活性が約６倍以上増加した変異株ＣａｌＢ１４を組み換え酵母を用いて大量分泌生産するために、既存の発現分泌システム（ＡＭＹ、アミラーゼ分泌シグナル）を利用する場合、酵母の培養適温である３０℃ではタンパク質が正常的に分泌されず、２２℃で低温培養する場合、分泌生産されるという特徴がある。したがって、大規模発酵培養の際に細胞培養が遅く、特に夏期にファーメンターの温度調節のための高費用問題が発生するので、培養適温で分泌生産が可能な分泌システムが求められる。本発明では、このような問題を、ＣａｌＢとＴＦＰ３とが融合したベクターｐＹＧＴ３−ＣａｌＢ４を製作して解決した。

よって、別の様態において、本発明は、配列番号１で表されるタンパク質融合因子ＴＦＰ１タンパク質またはその類似体に関する。また、本発明は、配列番号１で表されるタンパク質融合因子ＴＦＰ１タンパク質またはその類似体をコードする遺伝子に関する。本発明は、配列番号１で表されるアミノ酸配列またはその相同性（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ）、好ましくは７５％、より好ましくは８５％、さらに好ましくは９０％、最も好ましくは９５％以上の相同性を持つアミノ酸配列を有するタンパク質融合因子ＴＦＰ１タンパク質を本発明の範囲に含む。また、本発明は、配列番号１で表されるタンパク質融合因子ＴＦＰ１タンパク質をコードするＤＮＡまたはその相同性、好ましくは７５％、より好ましくは８５％、さらに好ましくは９０％、最も好ましくは９５％以上の相同性を持つＤＮＡ配列を有する遺伝子を本発明の範囲に含む。好ましくは、前記遺伝子は、配列番号２の遺伝子である。また、本発明は、前記遺伝子を含む組み換えベクターに関するものである。好ましくは、組み換えベクターに含まれる遺伝子は配列番号２の遺伝子である。組み換えベクターｐＹＩＬ−ＴＦＰ１、ｐＹＩＬ−ＫＲＴＦＰ１、ｐＹＧＣＳＦ−ＴＦＰ１、ｐＹＧＣＳＦ−ＫＲＴＦＰ１、ｐＧＡＰ−ＴＦＰ１−ＧＣＳＦなどを例示することができる。また、本発明は、前述した組み換えベクターで形質転換された細胞に関するものである。ｐＹＩＬ−ＫＲＴＦＰ１で形質転換された大腸菌がＫＣＴＣ（Ｋｏｒｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ）に２００３年１１月１１日付で寄託番号ＫＣＴＣ １０５４４ＢＰで寄託された。

別の様態において、本発明は、配列番号３で表されるタンパク質融合因子ＴＦＰ２タンパク質またはその類似体に関するものである。また、本発明は、配列番号３で表されるタンパク質融合因子ＴＦＰ２タンパク質またはその類似体をコードする遺伝子に関するものである。本発明は、配列番号３で表されるアミノ酸配列またはその相同性、好ましくは７５％、より好ましくは８５％、さらに好ましくは９０％、最も好ましくは９５％以上の相同性を持つアミノ酸配列を有するタンパク質融合因子ＴＦＰ２タンパク質を本発明の範囲に含む。また、本発明は、配列番号３で表されるタンパク質融合因子ＴＦＰ２タンパク質をコードするＤＮＡ配列またはその相同性、好ましくは７５％、より好ましくは８５％、さらに好ましくは９０％、最も好ましくは９５％以上の相同性を持つＤＮＡ配列を有する遺伝子を本発明の範囲に含む。好ましくは、前記遺伝子は配列番号４の遺伝子である。また、本発明は、前記遺伝子を含む組み換えベクターに関するものである。好ましくは、組み換えベクターに含まれる遺伝子は配列番号４の遺伝子である。組み換えベクターｐＹＩＬ−ＴＦＰ２、ｐＹＩＬ−ＫＲＴＦＰ２、ｐＹＧＣＳＦ−ＴＦＰ２、ｐＹＧＣＳＦ−ＫＲＴＦＰ２などを例示することができる。また、本発明は、前述した組み換えベクターで形質転換された細胞に関するものである。ｐＹＩＬ−ＫＲＴＦＰ２で形質転換された大腸菌がＫＣＴＣ（Ｋｏｒｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ）に２００３年１１月１１日付で寄託番号ＫＣＴＣ １０５４５ＢＰで寄託された。

別の様態において、本発明は、配列番号５で表されるタンパク質融合因子ＴＦＰ３タンパク質またはその類似体に関するものである。また、本発明は、配列番号５で表されるタンパク質融合因子ＴＦＰ３タンパク質またはその類似体をコードする遺伝子に関するものである。本発明は、配列番号５で表されるアミノ酸配列またはその相同性、好ましくは７５％、より好ましくは８５％、さらに好ましくは９０％、最も好ましくは９５％以上の相同性を持つアミノ酸配列を有するタンパク質融合因子ＴＦＰ３タンパク質を本発明の範囲に含む。また、本発明は、配列番号５で表されるタンパク質融合因子ＴＦＰ３タンパク質をコードするＤＮＡ配列またはその相同性、好ましくは７５％、より好ましくは８５％、さらに好ましくは９０％、最も好ましくは９５％以上の相同性を持つＤＮＡ配列を有する遺伝子を本発明の範囲に含む。好ましくは、前記遺伝子は配列番号６の遺伝子である。また、本発明は、前記遺伝子を含む組み換えベクターに関するものである。好ましくは、組み換えベクターに含まれる遺伝子は配列番号６の遺伝子である。組み換えベクターｐＹＩＬ−ＴＦＰ３、ｐＹＩＬ−ＫＲＴＦＰ３、ｐＹＧＣＳＦ−ＴＦＰ３、ｐＹＧＣＳＦ−ＫＲＴＦＰ３、ｐＹＧＴ３−ＣａｌＢ１４などを例示することができる。また、本発明は、前述した組み換えベクターで形質転換された細胞に関するものである。ｐＹＩＬ−ＫＲＴＦＰ３で形質転換された大腸菌がＫＣＴＣ（Ｋｏｒｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ）に２００３年１１月１１日付で寄託番号ＫＣＴＣ １０５４６ＢＰで寄託された。

別の様態において、本発明は、配列番号７で表されるタンパク質融合因子ＴＦＰ４タンパク質またはその類似体片に関するものである。また、本発明は、配列番号７で表されるタンパク質融合因子ＴＦＰ４タンパク質またはその類似体に関するものである。本発明は、配列番号７で表されるアミノ酸配列またはその相同性、好ましくは７５％、より好ましくは８５％、さらに好ましくは９０％、最も好ましくは９５％以上の相同性を持つアミノ酸配列を有するタンパク質融合因子ＴＦＰ４タンパク質を本発明の範囲に含む。また、本発明は、配列番号７で表されるタンパク質融合因子ＴＦＰ４タンパク質をコードするＤＮＡ配列またはその相同性、好ましくは７５％、より好ましくは８５％、さらに好ましくは９０％、最も好ましくは９５％以上の相同性を持つＤＮＡ配列を有する遺伝子を本発明の範囲に含む。好ましくは、前記遺伝子は配列番号８の遺伝子である。また、本発明は、前記遺伝子を含む組み換えベクターに関するものである。好ましくは、組み換えベクターに含まれる遺伝子は配列番号８の遺伝子である。組み換えベクターｐＹＩＬ−ＴＦＰ４、ｐＹＩＬ−ＫＲＴＦＰ４、ｐＹＧＣＳＦ−ＴＦＰ４、ｐＹＧＣＳＦ−ＫＲＴＦＰ４などを例示することができる。また、本発明は、前述した組み換えベクターで形質転換された細胞に関するものである。ｐＹＩＬ−ＫＲＴＦＰ４で形質転換された大腸菌がＫＣＴＣ（Ｋｏｒｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ）に２００３年１１月１１日付で寄託番号ＫＣＴＣ １０５４７ＢＰで寄託された。

本発明において、タンパク質融合因子タンパク質または遺伝子に対して使用された用語「類似体」とは、タンパク質融合因子遺伝子を難発現性タンパク質の遺伝子と融合する場合、難発現性タンパク質の分泌生産を誘導してタンパク質融合因子の活性を示す作用的等価物を意味し、タンパク質融合因子タンパク質の場合、例えば同一の性質を有するアミノ酸同士の置換（例えば、疎水性アミノ酸から他の疎水性アミノ酸への置換、親水性アミノ酸から他の親水性アミノ酸への置換、塩基性アミノ酸から他の塩基性アミノ酸への置換、酸性アミノ酸から他の酸性アミノ酸への置換）、アミノ酸の欠失、挿入またはこれらの組み合わせを含むことができる。

本発明のタンパク質融合因子タンパク質の置換類似体と関連して、分子の活性を全体的に変更させないタンパク質及びペプチドにおけるアミノ酸置換は、当該分野に公知になっており（Ｈ． Ｎｅｕｒａｔｈ， Ｒ． Ｌ． Ｈｉｌｌ， Ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， ＮｅｗＹｏｒｋ， １９７９）、最も一般に発生する置換としては、アミノ酸残基Ａｌａ／Ｓｅｒ、Ｖａｌ／Ｉｌｅ、Ａｓｐ／Ｇｌｕ、Ｔｈｒ／Ｓｅｒ、Ａｌａ／Ｇｌｙ、Ａｌａ／Ｔｈｒ、Ｓｅｒ／Ａｓｎ、Ａｌａ／Ｖａｌ、Ｓｅｒ／Ｇｌｙ、Ｔｈｙ／Ｐｈｅ、Ａｌａ／Ｐｒｏ、Ｌｙｓ／Ａｒｇ、Ａｓｐ／Ａｓｎ、Ｌｅｕ／Ｉｌｅ、Ｌｅｕ／Ｖａｌ、Ａｌａ／Ｇｌｕ、Ａｓｐ／Ｇｌｙ間の置換を例示することができる。

また、本発明のタンパク質融合因子タンパク質の欠失類似体と関連して、ゲノム性ライブラリー（染色体ライブラリー）またはｃＤＮＡライブラリーによって明らかになったタンパク質融合因子遺伝子の全体配列のうち一部配列を除去しても、難発現性タンパク質の分泌に影響を及ぼさず、ひいては分泌を促進させることができ、本発明者らは、タンパク質融合因子ＴＦＰ１、ＴＦＰ２、ＴＦＰ３及びＴＦＰ４の欠失類似体断片が難発現性タンパク質の分泌に及ぼす影響を調査した。ＴＦＰ１の場合、セリン、アラニンリッチ配列、Ｎ−グルコシル化部位またはこれらの両者ともが除去された遺伝子を含むベクターの場合、難発現性タンパク質を分泌できなかったが、５’−ＵＴＲ（５’−ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｅｄ ｒｅｇｉｏｎ）を除去する場合（ｐＹＩＬ−ＫＲＴ１−４）、難発現性タンパク質の発現率が３倍以上増加し、追加の３’末端の追加配列を除去した場合（ｐＹＩＬ−ＫＲＴ１−３）にも難発現性タンパク質の分泌を誘導した。したがって、本発明のタンパク質融合因子タンパク質は、難発現性タンパク質の分泌に否定的影響を及ぼさない限り、５’−ＵＴＲ領域、３’−末端領域の欠失体を本発明の範囲に含む。

具体的な様態において、本発明は、配列番号９で表されるタンパク質融合因子ＴＦＰ１−３タンパク質またはその類似体を提供する。また、本発明は、タンパク質融合因子ＴＦＰ１−３タンパク質またはその類似体をコードする遺伝子を提供する。本発明は、配列番号９で表されるアミノ酸配列またはその相同性、好ましくは７５％、より好ましくは８５％、さらに好ましくは９０％、最も好ましくは９５％以上の相同性を持つアミノ酸配列を有するタンパク質融合因子ＴＦＰ１−３タンパク質を本発明の範囲に含む。また、本発明は、配列番号９で表されるタンパク質融合因子ＴＦＰ１−３タンパク質をコードするＤＮＡ配列またはその相同性、好ましくは７５％、より好ましくは８５％、さらに好ましくは９０％、最も好ましくは９５％以上の相同性を持つＤＮＡ配列を有する遺伝子を本発明の範囲に含む。また、本発明は、前記遺伝子を含む組み換えベクターを提供する。好ましくは、組み換えベクターに含まれる遺伝子は配列番号９で表されるタンパク質融合因子ＴＦＰ１−３をコードする遺伝子である。組み換えベクターｐＹＩＬ−ＫＲＴ１−３（「ｐＹＩＬ−ＫＲＴ１−３」と命名する）を例示することができる。また、本発明は、前記組み換えベクターで形質転換された細胞を提供する。ｐＹＩＬ−ＫＲＴ１−３で形質転換された大腸菌がＫＣＴＣ（Ｋｏｒｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ）に２００３年１１月１１日付で寄託番号ＫＣＴＣ １０５４８ＢＰで寄託された。

別の具体的な様態において、本発明は、配列番号１０で表される遺伝子によってコードされるタンパク質融合因子ＴＦＰ１−４タンパク質またはその類似体を提供する。また、本発明は、タンパク質融合因子ＴＦＰ１−４をコードする配列番号１０で表される遺伝子またはその類似体を提供する。本発明は、配列番号１０で表される遺伝子によってコードされるアミノ酸配列またはその相同性、好ましくは７５％、より好ましくは８５％、さらに好ましくは９０％、最も好ましくは９５％以上の相同性を持つアミノ酸配列を有するタンパク質融合因子ＴＦＰ１−４タンパク質を本発明の範囲に含む。また、本発明は、配列番号１０で表されるＤＮＡ配列またはその相同性、好ましくは７５％、より好ましくは８５％、さらに好ましくは９０％、最も好ましくは９５％以上の相同性を持つＤＮＡ配列を有する遺伝子を本発明の範囲に含む。また、本発明は、配列番号１０で表されるタンパク質融合因子ＴＦＰ１−４をコードする遺伝子またはその類似体を含む組み換えベクターを提供する。また、本発明は、配列番号１０で表されるタンパク質融合因子ＴＦＰ１−４をコードするＤＮＡ配列またはその相同性、好ましくは７５％、より好ましくは８５％、さらに好ましくは９０％、最も好ましくは９５％以上の相同性を持つＤＮＡ配列を有する遺伝子を含む組み換えベクターを提供する。組み換えベクターｐＹＩＬ−ＫＲＴ１−４（「ｐＹＩＬ−ＫＲＴ１−４」と命名する）を例示することができる。また、本発明は、前記組み換えベクターで形質転換された細胞を提供する。ｐＹＩＬ−ＫＲＴ１−４で形質転換された大腸菌がＫＣＴＣ（Ｋｏｒｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ）に２００３年１１月１１日付で寄託番号ＫＣＴＣ １０５４９ＢＰで寄託された。

また、本発明のタンパク質融合因子タンパク質の挿入類似体と関連して、ゲノム性ライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリーによって明らかになったタンパク質融合因子遺伝子の全体配列または活性を示す部分配列に一部配列を追加しても、難発現性タンパク質の分泌に影響を及ぼさず、ひいては分泌を促進させることができ、本発明者らは、タンパク質融合因子の挿入類似体が難発現性タンパク質の分泌に及ぼす影響を調査した。ＴＦＰ３（１０４ａａ）の場合、ＴＦＰ３−３（１８９ａａ）及びＴＦＰ３−４（２２２ａａ）挿入類似体は、分泌効率が減少したが、ＴＦＰ３に比べて２６個のアミノ酸を追加したＴＦＰ３−１の場合、追加的なＮ−グルコシル化部位が含まれてＧ−ＣＳＦ分泌率がＴＦＰ３に比べて約３倍程度増加した。ひいては、ＴＦＰ３−１にさらに４個のアミノ酸が追加されたＴＦＰ３−１−１（１３４個のアミノ酸を含む）及び１３個のアミノ酸が追加されたＴＦＰ３−１−２（１４３個のアミノ酸を含む）は、Ｇ−ＣＳＦの分泌量の減少なしに分泌過程中にＫｅｘ２ｐによってプロセスされていない融合タンパク質の量も大幅減少した。したがって、本発明のタンパク質融合因子タンパク質は、難発現性タンパク質の分泌に否定的影響を及ぼさない限り、Ｎ−グルコシル化領域、融合部位を切断するための切断酵素Ｋｅｘ２ｐの接近を可能にする領域が追加された挿入類似体を本発明の範囲に含む。

具体的な様態において、本発明は、配列番号４０で表されるタンパク質融合因子ＴＦＰ３−１−１タンパク質またはその類似体を提供する。また、本発明は、配列番号４０で表されるタンパク質融合因子ＴＦＰ３−１−１タンパク質またはその類似体をコードする遺伝子を提供する。本発明は、配列番号４０で表されるアミノ酸配列またはその相同性、好ましくは７５％、より好ましくは８５％、さらに好ましくは９０％、最も好ましくは９５％以上の相同性を持つアミノ酸配列を有するタンパク質融合因子ＴＦＰ３−１−１タンパク質を本発明の範囲に含む。また、本発明は、配列番号４０で表されるタンパク質融合因子ＴＦＰ３−１−１タンパク質をコードするＤＮＡ配列またはその相同性、好ましくは７５％、より好ましくは８５％、さらに好ましくは９０％、最も好ましくは９５％以上の相同性を持つＤＮＡ配列を有する遺伝子を本発明の範囲に含む。好ましくは、前記遺伝子は配列番号４１の遺伝子である。また、本発明は、前記遺伝子を含む組み換えペクターを提供する。好ましくは、組み換えベクターに含まれる遺伝子は、配列番号４１の遺伝子である。組み換えベクターｐＹＧＴ３−１−１−ＧＣＳＦを例示することができる。また、本発明は、前記組み換えベクターで形質転換された細胞を提供する。ｐＹＧＴ３−１−１−ＧＣＳＦで形質転換された大腸菌がＫＣＴＣ（Ｋｏｒｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ）に２００４年１２月２１日付で寄託番号ＫＣＴＣ １０７５３ＢＰで寄託された。

別の具体的な様態において、本発明は、配列番号４２で表されるタンパク質融合因子ＴＦＰ３−１−２タンパク質またはその類似体を提供する。また、本発明は、配列番号４２で表されるタンパク質融合因子ＴＦＰ３−１−２タンパク質またはその類似体をコードする遺伝子を提供する。本発明は、配列番号４０で表されるアミノ酸配列またはその相同性、好ましくは７５％、より好ましくは８５％、さらに好ましくは９０％、最も好ましくは９５％以上の相同性を持つアミノ酸配列を有するタンパク質融合因子ＴＦＰ３−１−２タンパク質を本発明の範囲に含む。また、本発明は、配列番号４２で表されるタンパク質融合因子ＴＦＰ３−１−２タンパク質をコードするＤＮＡ配列またはその相同性、好ましくは７５％、より好ましくは８５％、さらに好ましくは９０％、最も好ましくは９５％以上の相同性を持つＤＮＡ配列を有する遺伝子を本発明の範囲に含む。好ましくは、前記遺伝子は配列番号４３の遺伝子である。また、本発明は、前記遺伝子を含む組み換えベクターを提供する。好ましくは、組み換えベクターに含まれる遺伝子は、配列番号４３の遺伝子である。組み換えベクターｐＹＧＴ３−１−２−ＧＣＳＦを例示することができる。また、本発明は、前記組み換えベクターで形質転換された細胞を提供する。ｐＹＧＴ３−１−２−ＧＣＳＦで形質転換された大腸菌がＫＣＴＣ（Ｋｏｒｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ）に２００４年１２月２１日付で寄託番号ＫＣＴＣ １０７５４ＢＰで寄託された。

本発明において、タンパク質融合因子タンパク質または遺伝子に対して使用された用語「相同性」とは、野性型アミノ酸配列及び野性型核酸配列との類似程度を示すためのもので、タンパク質の場合、本発明のＴＦＰタンパク質のアミノ酸配列と、好ましくは７５％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上同一でありうるアミノ酸配列を含む。一般に、タンパク質相同物は、目的のタンパク質と同一な活性部位を含む。遺伝子の場合、本発明のＴＦＰタンパク質をコードするＤＮＡ配列と、好ましくは７５％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上同一でありうるＤＮＡ配列を含む。このような相同性の比較は、肉眼、または購入し易い比較プログラムを用いて行うことができる。市販のコンピュータプログラムは２つ以上の配列間の相同性を百分率（％）で計算することができ、相同性（％）は隣接した配列に対して計算できる。

難発現性タンパク質の分泌生産のために、本発明によって明らかになったタンパク質融合因子は、難発現性タンパク質の遺伝子と融合して使用され、難発現性タンパク質の分泌生産のためにベクターに挿入される。本発明において、「ベクター」は、適当な宿主細胞においてタンパク質の発現を調節することが可能な調節配列（ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）に作動可能に連結されたＤＮＡ配列及びその他の遺伝子操作を容易にし、或いはタンパク質の発現を最適化するために導入される配列を含有するＤＮＡ作製物を意味する。そのような調節配列には、転写を調節するためのプロモータ（ｐｒｏｍｏｔｅｒ）、転写を調節するために選択的に付加されたオペレーター（ｏｐｅｒａｔｏｒ）、適切なｍＲＮＡリボソーム結合部位及び転写／翻訳の終了を調節する配列が含まれる。外来遺伝子を挿入するためのベクターとしては、プラスミド、ウィルス、コスミッドなど様々な形のベクターを使用することができる。ベクターはクローニングベクター及び発現ベクターを含み、クローニングベクターは外来ＤＮＡが挿入されて複製できるプラスミドであって、形質転換の際に宿主細胞へ外来のＤＮＡを伝達させる。発現ベクターは、通常、外来ＤＮＡの断片が挿入されたキャリアであって、一般に二本鎖のＤＮＡの断片を意味する。ここで、外来ＤＮＡは、宿主細胞で天然的に発見されないＤＮＡである異種ＤＮＡを意味する。発現ベクターは、一応宿主細胞内にあると、宿主染色体ＤＮＡと関係なく複製することができ、挿入された外来ＤＮＡが生成できる。当業界に広く知られているように、トランスフェクションされた遺伝子の発現水準を宿主細胞において高めるためには、当該遺伝子が、選択された発現宿主内で機能を発揮する転写及び翻訳発現調節配列に作動可能に連結されなければならない。

タンパク質融合因子を含む組み換えベクターへの形質転換と関連して本願明細書に使用された用語「形質転換」とは、ＤＮＡを宿主に導入してＤＮＡが染色体外要素として或いは染色体統合完成によって複製可能になることを意味する。本発明に係る形質転換に使用できる宿主細胞は、原核または真核細胞のいずれも含むことができる。ＤＮＡの導入効率が高く、導入されたＤＮＡの発現効率が高い宿主が通常用いられる。細菌、例えば大腸菌、シュードモナス、バチルス、ストレプトマイセス、真菌、酵母などの周知の真核及び原核宿主、ＳＦ９（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）などの昆虫細胞、ＣＨＯ、ＣＯＳ１、ＣＯＳ７、ＢＳＣ１、ＢＳＣ４０、ＢＭＴ１０などの動物細胞などが使用できる宿主細胞の例である。本発明によって難発現性タンパク質を量産するための宿主細胞は、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）やデバリオミセス（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ）、ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、クリュイベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）、シゾサッカロミセスポンベエキス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）及びサッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属などの酵母類が好ましく使用できる。

別の様態において、本発明は、前記タンパク質融合因子がＴＦＰタンパク質を用いて難発現性タンパク質を組み換え方法で生産する方法に関するものである。

このような難発現性タンパク質の組み換え的生産方法は、前記タンパク質融合因子ＴＦＰタンパク質をコードする遺伝子と融合された難発現性タンパク質コード遺伝子が挿入された発現ベクターを製作する段階と、組み換え発現ベクターで形質転換された形質転換体を培養する段階とを含む。具体的に、本発明は、配列番号１、３、５、７、９、４０または４２で表されるアミノ酸配列またはその相同性、好ましくは７５％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の相同性を持つアミノ酸配列を有するタンパク質、または配列番号１０で表される遺伝子によってコードされるアミノ酸配列またはその相同性、好ましくは７５％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の相同性を持つアミノ酸配列を有するタンパク質を用いて、難発現性タンパク質を組み換え方法で生産する方法に関するものである。好ましくは、配列番号１で表されるタンパク質は配列番号２で表される遺伝子によってコードされ、配列番号３で表されるタンパク質は配列番号４で表される遺伝子によってコードされ、配列番号５で表されるタンパク質は配列番号６で表される遺伝子によってコードされ、配列番号７で表されるタンパク質は配列番号８で表される遺伝子によってコードされ、配列番号４０で表されるタンパク質は配列番号４１で表される遺伝子によってコードされ、配列番号４２で表されるタンパク質は配列番号４３で表される遺伝子によってコードされる。

以下、本発明を実施例によって詳細に説明する。下記の実施例は、本発明を例示するものに過ぎず、本発明の内容を限定するものではない。

＜実施例１＞酵母インベルターゼ欠如変異株の製造
難発現性タンパク質に対するタンパク質融合因子を超高速で選別するために、酵母インベルターゼをレポーターとして用いて、スクロース培地における細胞成長の評価を利用した自動選別システムを製造した。

ベクターに含まれたインベルターゼ遺伝子を形質転換後の選別レポーター遺伝子として使用するために、インベルターゼ活性が欠如された酵母が必要であり、このために染色体のＩＮＶ２遺伝子を欠失させた。遺伝子欠失誘導用カセットを製造するために、プラスミドｐＲＢ５８（Ｃａｒｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ， １９８２， ２０， １４５）を制限酵素ＥｃｏＲＩとＸｈｏＩで処理してＩＮＶ２コード遺伝子を回収し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＫＳ＋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製、米国）のＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩ部位に導入してｐＢＩΔＢＸを製造した。図１に示すように、ｐＢＩΔＢＸに含まれたＩＮＶ２遺伝子のＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｂａＩ部位に１９０ｂｐの繰り返し配列（Ｔｃ１９０）を両末端に含むＵＲＡ３遺伝子を挿入してｐＢＩＵを製造した。ｐＢＩＵを制限酵素ＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩで処理した後、サッカロマイセス・セレヴィシェＹ２８０５Δｇａｌ１（Ｍａｔ ａ ｕｒａ３ ＩＮＶ２ ｐｅｐ４：：ＨＩＳ３ ｇａｌ１ ｃａｎ１）菌株（ＳＫ Ｒｈｅｅ， Ｋｏｒｅａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）に形質転換してウラシルのない選択培地で形質転換体Ｙ２８０５Δｇａｌ１Δｉｎｖ２Ｕ（Ｍａｔ ａ ｉｎｖ２：：ＵＲＡ３ ｐｅｐ４：：ＨＩＳ３ ｇａｌ１ ｃａｎ１）を選別した。

選別された形質転換体のインベルターゼ活性が消滅されたか否かを確認するために、単一コロニーを、グルコースとスクロースを単位炭素源として供給したそれぞれの培地で培養した結果、グルコースでは正常的に成長し、スクロースでも対照区に比べて成長が非常に遅かったが成長することができた。ところが、培養途中で培地に分泌されるインベルターゼの量を調査するために、ＩＮＶ２＋菌株とΔｉｎｖ２菌株を培養し、培養上澄液に存在するタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した後、ゲルをスクロース溶液で３０分間反応し、その後ＴＴＣ（２，３，５−ｔｒｉｐｈｅｎｙｌ−ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ）で発色したザイモグラム分析を行った結果（図２）、Δｉｎｖ２菌株の場合、大部分のインベルターゼ活性が消失されたことが分かった。ところが、スクロース培地で非常に遅いが成長する問題があるが、これはミトコンドリアの機能によるグルコース新生（ｇｌｕｃｏｎｅｏｇｅｎｅｓｉｓ）によって細胞が部分的に成長するものと推定された。したがって、このような問題を除去するために、ミトコンドリア電子伝達系作用抑制物質であるアンチマイシンＡを添加した後、インベルターゼの発現がない菌株の成長を確認した結果、菌株の成長を完全に抑制することができた（図３）。

選別されたＹ２８０５Δｇａｌ１Δｉｎｖ２Ｕ（Ｍａｔ ａ ｉｎｖ２：：ＵＲＡ３ ｐｅｐ４：：ＨＩＳ３ ｇａｌ１ ｃａｎ１）菌株にヒトｃＤＮＡライブラリーを含有するＵＲＡ３ベクターを再形質転換するためには、ＩＮＶ２遺伝子欠失用として使用したＵＲＡ３遺伝子を除去する必要があるが、このために、培養細胞を５−フッ化オロチン酸（５−ＦＯＡ）培地で培養してＵＲＡ３遺伝子がポップアウト（ｐｏｐ−ｏｕｔ）された菌株Ｙ２８０５Δｇａｌ１Δｉｎｖ２（Ｍａｔ ａ ｕｒａ３ ｉｎｖ２：：Ｔｃ１９０ ｐｅｐ４：：ＨＩＳ３ ｇａｌ１ ｃａｎ１）を選別した（図１）。染色体上のＩＮＶ２遺伝子が予想したように欠失され、ＵＲＡ３遺伝子がさらにポップアウトされたか否かをサザンブロット（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ）法によって確認した（図４）。Ｙ２８０５菌株の染色体をＥｃｏＲＩで処理し、ＩＮＶ２遺伝子をプローブとして使用する場合、約４．３ｋｂの切片が確認されるが、ＵＲＡ３遺伝子が挿入された後（Ｙ２８０５Δｇａｌ１Δｉｎｖ２Ｕ）、約５．０ｋｂに増加されてからＵＲＡ３遺伝子がポップアウトされると（Ｙ２８０５Δｇａｌ１Δｉｎｖ２）、約３．７ｂｋｂに減少する。図４の結果から分かるように、ＩＮＶ２遺伝子が予想したように正確に欠失され、ＵＲＡ３遺伝子がポップアウトされたことを確認した。

＜実施例２＞インベルターゼとの融合による自動選別システムの確認
インベルターゼ遺伝子が欠失された菌株でインベルターゼと融合されたタンパク質の発現によってスクロース培地における自動選別を確認するために、酵母でよく発現されるヒトタンパク質である血清アルブミン（ＨＳＡ）と難発現タンパク質であるヒトインターロイキン−２（ＩＬ−２）を利用した。

アルブミンとインベルターゼが融合されたベクターｐＧＨＳＡ−ＩＮＶ２を作るための過程として、まずヒト血清アルブミン遺伝子の両末端にＳｆｉＩ認識配列を挿入するために、ＳｆｉＩ認識配列を有する重合酵素連鎖反応用センスプライマーＪＨ９７（Ｓｆｉ−ＨＳＡ−ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ）（配列番号１１）とアンチセンスプライマーＪＨ１１９（Ｓｆｉ−ＨＳＡ−ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ）（配列番号１２）を使用し、ｐＹＨＳＡ５（Ｋａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．， １９９８， ８， ４２）を鋳型とし、Ｐｆｕ重合酵素（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製、米国）を用いて重合酵素連鎖反応（９４℃で５分間１回；９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、７２℃で２分間反応を２５回；７２℃で７分間１回）してアルブミン遺伝子約１．８ｋｂの切片を得た。また、プライマーＪＨ９９（Ｓｆｉ−ＩＮＶ−ｆｏｒｗａｒｄ）（配列番号１３）及びＪＨ１００（ＳａｌＩ−ＩＮＶ−ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ）（配列番号１４）を用いてｐＲＢ５８を鋳型としてインベルターゼ遺伝子を同一の方法で重合酵素連鎖反応して回収した後、制限酵素ＳｆｉＩ／ＳａｌＩで処理し、ＰｓｔＩ／ＳｆｉＩで処理されたアルブミン遺伝子と共にＰｓｔＩ／ＳａｌＩで処理されたｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製、米国）に挿入した。ｐＹＨＳＡ５を制限酵素ＳａｃＩ／ＰｓｔＩで処理してＧＡＬプロモータ及びアルブミン遺伝子の一部を含む切片と、以前に製造されたアルブミン遺伝子の一部及びインベルターゼ遺伝子を含有するＰｓｔＩ／ＳａｌＩ切片とを、さらにＳａｃＩ／ＳａｌＩで処理されたＹＥＧα−ＨＩＲ５２５ベクター（Ｃｈｏｉ ｅｔ ａｌ．， Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．， １９９４， ４２， ５８７）に同時に挿入してｐＧＨＳＡ−ＩＮＶ２を製造した。

インターロイキン−２とインベルターゼの融合発現ベクターを製造するために、プライマーＪＨ１０６（Ｓｆｉ−ＩＬ２−ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ）（配列番号１５）及びＪＨ１０７（Ｓｆｉ−ＩＬ２−ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ）（配列番号１６）を用いてｐＴ７−ｈＩＬ−２（ＪＫ Ｊｕｎｇ， Ｋｏｒｅａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を鋳型として重合酵素連鎖反応し、回収されたインターロイキン遺伝子をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製、米国）のＥｃｏＲＶ部位に挿入してｐＢＫＳ−ＩＬ２を製造した。ｐＢＫＳ−ＩＬ２をＳｆｉＩで処理した切片と、ｐＧＨＳＡ−ＩＶＮ２をＳａｃＩ−ＳｆｉＩで処理して得たＧＡＬプロモータ及びＩＮＶ分泌シグナルを含有する切片とを、ＳａｃＩ／ＳｆｉＩで処理されたｐＧＨＳＡ−ＩＮＶ２に同時に挿入してｐＧＩＬ２−ＩＮＶ２を製造した。

アルブミンとインベルターゼの融合タンパク質を発現するベクターｐＧＨＳＡ−ＩＮＶ２、インターロイキン−２とインベルターゼの融合タンパク質を発現するＰＧＩＬ２−ＩＮＶ２、及びインベルターゼのみを発現するｐＲＢ５８を、インベルターゼ遺伝子が欠失されてスクロース培地で成長することができない菌株（Ｙ２８０５Δｉｎｖ２）にそれぞれ形質転換し、グルコースを炭素源として添加した培地（ＵＤ）とスクロースを炭素源として添加した培地（ＹＰＳＡ）に塗抹して細胞の成長有無を観察した（図５）。インベルターゼを正常的に発現するベクターｐＲＢ５８の場合には、２つの炭素源で全て正常的に成長し、また、インベルターゼが酵母でよく発現されるタンパク質であるアルブミンと融合された場合（ｐＧＨＳＡ−ＩＮＶ２）にも、やはり２つの炭素源を全て良く利用して成長した。ところが、酵母で発現され難いタンパク質であるインターロイキン−２の場合（ｐＧＩＬ２−ＩＮＶ２）には、グルコース培地では正常的に成長するが、スクロース培地では全く成長しなかった。これは、予想したように、インターロイキン−２の細胞内における発現が不可能であって、これに融合されたインベルターゼも発現できないためであると判断された。したがって、インベルターゼ遺伝子が欠失されてスクロース培地で成長することができない菌株（Ｙ２８０５Δｉｎｖ２）に形質転換したインベルターゼ遺伝子の発現如何を用いて自動選別が可能であることが分かった。

＜実施例３＞難発現タンパク質ヒトインターロイキン−２を用いたタンパク質融合因子選別ベクターの製造
インターロイキン−２とインベルターゼとが融合されたベクターｐＧＩＬ２−ＩＮＶ２を用いて融合タンパク質の分泌を誘導することが可能な適正のタンパク質融合因子を確保するために、３つのリーディングフレームを有するライブラリー製造ベクターｐＹＨＴＳ−Ｆ０、Ｆ１及びＦ２を製造した（図６）。

３つのリーディングフレームとＢａｍＨＩ認識配列を有する重合酵素連鎖反応用センスプライマーＪＨ１２０（ＢａｍＨＩ−ＩＬ２−１−ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ）（配列番号１７）、ＪＨ１２１（ＢａｍＨＩ−ＩＬ２−２−ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ）（配列番号１８）およびＪＨ１２２（ＢａｍＨＩ−ＩＬ２−３−ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ）（配列番号１９）とアンチセンスプライマーＪＨ１２３（ＩＮＶ−１−ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ）（配列番号２０）を使用しｐＧＩＬ２−ＩＮＶ２を鋳型として用いて、Ｐｆｕ重合酵素（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製、米国）を用いた重合酵素連鎖反応（９４℃で３分間１回；９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、７２℃で１分間反応を２５回；７２℃で７分間１回）してインターロイキン−２と一部のインベルターゼ遺伝子を含む約１．２ｋｂの切片をそれぞれ得た。さらにＪＨ１２４（ＩＮＶ−ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ）（配列番号２１）とＪＨ９５（ＩＮＶ−２−ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ）（配列番号２２）をプライマーとして使用しＰＧＩＬ２−ＩＮＶ２を鋳型として用いて同一の条件で重合酵素連鎖反応して、一部のインベルターゼ遺伝子を含む約０．９ｋｂの切片をそれぞれ得た。それぞれの遺伝子をアガロースゲルから回収した後、３つのリーディングフレームを有する１．２ｋｂ切片３種類と０．９ｋｂ切片をそれぞれ混合してセンスプライマーＪＨ１２０（配列番号１７）、ＪＨ１２１（配列番号１８）及びＪＨ１２２（配列番号１９）とアンチセンスプライマーＪＨ９５（配列番号２２）を用いて２次重合酵素連鎖反応を行い、アガロースゲル電気泳動によってそれぞれ２．１ｋｂ切片３種類を回収した。回収された３種の２．１ｋｂ切片を制限酵素ＢａｍＨＩとＳａｌＩで処理し、ＢａｍＨＩとＳａｌＩで処理されたｐＧＩＬ２−ＩＮＶ２にそれぞれ結合してｐＹＨＴＳ−Ｆ０、Ｆ１及びＦ２を製造した。

＜実施例４＞酵母遺伝体からの適合型タンパク質融合因子ライブラリーの製造
タンパク質融合因子ライブラリーを製造するために、酵母サッカロマイセス・セレヴィシェＹ２８０５（ＳＫ Ｒｈｅｅ， Ｋｏｒｅａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）及びハンゼヌラポリモルファＤＬ−１（ＡＴＣＣ２６０１２）由来の染色体ＤＮＡを用いた。それぞれの染色体を制限酵素Ｓａｕ３ＡＩで部分切断した後、アガロースゲルから０．５〜１．０ｋｂサイズのＤＮＡを回収し、その後ＢａｍＨＩで切断し、子牛腸由来のホスファターゼで処理したｐＹＨＴＳ−Ｆ０、Ｆ１及びＦ２混合ベクターに連結した（図６）。連結されたＤＮＡを大腸菌ＤＨ５αに形質転換し、アンピシリン含有ＬＢ培地（１％バクトトリプトン、０．５％酵素抽出物、１％ＮａＣｌ）に塗抹した後、３７℃で一日中培養した。それぞれの染色体から製造されたライブラリーＤＮＡを用いて約５×１０４細胞の形質転換体ライブラリーを確保した。全ての形質転換体を滅菌蒸留水を用いて回収し、回収された菌体からライブラリーＤＮＡをプラスミド抽出キット（Ｂｉｏｎｅｅｒ社製、韓国）を用いて分離した。

＜実施例５＞難分泌性タンパク質ヒトインターロイキン−２に適した適合型タンパク質融合因子の自動選別
前述した方法で製造されたライブラリーＤＮＡを酵母サッカロマイセス・セレヴィシェＹ２８０５Δｇａｌ１Δｉｎｖ２（Ｍａｔ ａ ｕｒａ３ ｉｎｖ２：：Ｔｃ１９０ ｐｅｐ４：：ＨＩＳ３ ｇａｌ１ ｃａｎ１）に酢酸リチウム方法（Ｈｉｌｌｓ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １９９１， １９， ５７９１）で形質転換した後、ウラシルが欠乏されたＵＤ最小培地（０．６７％アミノ酸が欠乏された酵母窒素基質、適正濃度の各種アミノ酸混合体、２％グルコース）、及びスクロースとアンチマイシンＡを含む複合培地ＹＰＧＳＡ（１％酵母抽出物、２％ペプトン、２％スクロース、０．３％ガラクトース、１μｇ／ｍＬアンチマイシンＡ）にそれぞれ塗抹して３０℃で５日間培養した。培養後、各培地で形成された菌体の数は、表１（タンパク質融合因子導入前後の形質転換体数の比較）に表示したとおりである。ライブラリーの製作のために使用したベクター（ｐＹＨＴＳ−Ｆ０、Ｆ１及びＦ２）のみを形質転換した場合には、グルコース培地では約１×１０４程度の菌体が形成されたが、炭素源としてスクロースを使用した培地では予想したように全く成長しなかった。ところが、酵母遺伝体ライブラリーを挿入した場合には、約１１個の形質転換体が成長して、挿入されたタンパク質融合因子の助けによりインベルターゼが分泌されたことを予想することができた。

＜実施例６＞タンパク質融合因子の分析
スクロース培地で成長した各菌体をＹＰＤ（１％酵母抽出物、２％ペプトン、２％グルコース）培地で２４時間培養した後、回収された細胞を破砕し、その後導入されたプラスミドを分離し、大腸菌に再形質転換した。形質転換された大腸菌からプラスミドを分離した後、制限酵素処理して挿入された遺伝子の有無を確認し、塩基配列分析によって４種の相異なる配列を有する遺伝子が挿入されてタンパク質融合因子の役割をすることが分かった（表２：スクロース培地で成長した菌体から分離されたプラスミドに挿入された新規のタンパク質融合因子）。

６−１．タンパク質融合因子１（ＴＦＰ１）
本発明者らは、インターロイキン−２とインベルターゼとの融合タンパク質を効率よく細胞外に分泌させることが可能なタンパク質融合因子１（ＴＦＰ１）（配列番号２）を選別した。ＴＦＰ１遺伝子は、酵母サッカロマイセス・セレヴィシェ遺伝子Ｙａｒ０６６ｗの部分配列と同一である。Ｙａｒ０６６ｗ遺伝子は、α１，４−グルカングルコシダーゼ（ＳＴＡ１）遺伝子と類似であり、これによりコードされるタンパク質はグリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）−アンカー（ｇｌｙｃｏｓｙｌ−ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ （ＧＰＩ） ａｎｃｈｏｒ）を含有したタンパク質である。Ｙａｒ０６６ｗ遺伝子は、未だ機能が知られていない遺伝子であり、酵母サッカロマイセス・セレヴィシェの機能が知られていない遺伝子であるＹｏｌ１５５ｃ、Ｙｉｌ１６９ｃとそれぞれ７０．３％、７２．７％の配列類似性を示す。Ｙａｒ０６６ｗ遺伝子によってコードされるアミノ酸配列のうち、インターロイキンと融合されたアミノ酸の数は、全体２０３個中の１０５個であり、タンパク質分泌のためのシグナルとして２３個のアミノ酸の分泌シグナルを含有しており、Ｎ−グルコシル化部位とセリン、アラニンリッチ（ｓｅｒｉｎｅ−ｒｉｃｈ）配列を含有している。

６−２．タンパク質融合因子２（ＴＦＰ２）
本発明者らは、インターロイキン−２とインベルターゼとの融合タンパク質を効率よく細胞外に分泌させることが可能なタンパク質融合因子２（ＴＦＰ２）（配列番号４）を選別した。ＴＦＰ２遺伝子は、酵母サッカロマイセス・セレヴィシェ遺伝子Ｙａｒ０２６ｃの部分配列と同一である。Ｙａｒ０２６ｃ遺伝子は、未だ機能が知られていない遺伝子である。Ｙａｒ０２６ｃ遺伝子によってコードされるアミノ酸配列のうち、インターロイキン−２と融合されたアミノ酸の数は、全体１６９個中の１１７個であり、タンパク質分泌のためシグナルとして１９個のアミノ酸の分泌シグナルを含有しており、３個のＮ−グルコシル化部位を含有している。

６−３．タンパク質融合因子３（ＴＦＰ３）
本発明者らは、インターロイキン−２とインベルターゼとの融合タンパク質を効率よく細胞外に分泌させることが可能なタンパク質融合因子３（ＴＦＰ３）（配列番号６）を選別した。ＴＦＰ３遺伝子は、酵母サッカロマイセス・セレヴィシェ遺伝子Ｙｊｌ１５８ｃ（ＰＩＲ４／ＣＩＳ３）の部分配列と同一である。Ｙｊｌ１５８ｃ遺伝子によってコードされるタンパク質は、細胞壁に共有結合されたＯ−マンノシル化されたタンパク質である。Ｙｊｌ１５８ｃ遺伝子は、細胞分裂に関与するＣｉｋ１欠如変異株に対するマルチコピーサプレッサ（ｍｕｌｔｉｃｏｐｙ ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ）として知られている遺伝子である。Ｙｊｌ１５８ｃ遺伝子によってコードされるアミノ酸配列のうち、インターロイキン−２と融合されたアミノ酸の数は、全体２２７個中の１０４個であり、タンパク質分泌のためのシグナルとして２３個のアミノ酸のプレ（ｐｒｅ）分泌シグナルと４１個のプロ（ｐｒｏ）分泌シグナルを含有しており、Ｌｙｓ−ＡｒｇからなるＫｅｘ２ｐ切断配列を含有しており、ＰＩＲ繰り返し配列を持っている。

６−４．タンパク質融合因子４（ＴＦＰ４）
本発明者らは、インターロイキン−２とインベルターゼとの融合タンパク質を効率よく細胞外に分泌させることが可能なタンパク質融合因子４（ＴＦＰ４）（配列番号８）を選別した。ＴＦＰ４は、酵母ハンゼヌラポリモルファ由来の遺伝子であり、機能は知られていないが、インターロイキン−２と融合されたアミノ酸の数は５０個であり、この中の１８個のアミノ酸からなるタンパク質分泌シグナルを含んでいる。

＜実施例７＞培地に分泌された融合タンパク質の分析
スクロース培地で成長した菌体が分泌するタンパク質を分析するために、前述した４つのタンパク質融合因子を含有する菌体をＹＰＤＧ培地（１％酵母抽出物、２％ペプトン、２％グルコース、０．３％ガラクトース）で４０時間培養した後、細胞を除去し、残った培養上澄液に溶解されている全体タンパク質をアセトン（最終濃度４０％）に沈澱させた後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行ったが、インベルターゼが融合された状態では、インベルターゼ部分の過多なグルコシル化により単一タンパク質バンドを確認し難いという問題があったため、各ベクター（ｐＹＨＴＳ−ＴＦＰ１、２、３及び４）からインベルターゼを除去し、インターロイキン−２遺伝子に翻訳終結コドンを挿入した。このために、プライマーＪＨ１３２（ＳａｃＩ−ＧＡＬ−ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ）（配列番号２３）及びＪＨ１３７（ＩＬ２−Ｔｅｒｍ−ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ）（配列番号２４）を用いてそれぞれのベクターからＧＡＬプロモータ、各ＴＦＰ及び翻訳終結コドンを含有したインターロイキン−２遺伝子を含む切片を得るために、各ベクター（ｐＹＨＴＳ−ＴＦＰ１、２、３及び４）を重合酵素連鎖反応した後、回収された遺伝子切片をＳａｃＩ／ＳａｌＩで処理し、ＳａｃＩ／ＳａｌＩで処理されたＹＥＧα−ＨＩＲ５２５ベクターに挿入してｐＹＩＬ−ＴＦＰ１、２、３及び４を製造した。製造された４種のＩＬ−２発現ベクターを酵母に形質転換した後、単一コロニーを確保し、前述したような方法で培養し、培養上澄液に分泌されたタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥして分析した（図７）。図７の結果から分かるように、ｐＹＩＬ−ＴＦＰ２を除いたそれぞれのベクターを含有した菌体の培養上澄液から、タンパク質のサイズが相異なる強いバンドが観察された。これらは、ＩＬ−２抗体を用いたウェスタンブロット法（図７）でバンドと確認され、それぞれの分泌誘導融合タンパク質とＩＬ−２とが融合された状態であることを確認することができた。ところが、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で現れた実際サイズは、それぞれのタンパク質融合因子及びＩＬ−２遺伝子のサイズから類推されるタンパク質のサイズとは相当な差異を示した。これはグルコシル化による差異であると推定されるので、Ｎ−グルコシル化によってタンパク質に付加された糖を除去するために、各タンパク質にＥｎｄｏ−Ｈ酵素を処理した後、さらにＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析した（図８）。タンパク質配列上、ＴＦＰ１には１つのＮ−グルコシル化誘発配列（２８〜３０番目のアミノ酸）があり、ＴＦＰ３はＯ−グルコシル化誘導配列を含有しており、ＴＦＰ４にはグルコシル化誘導配列がなかった。予想したように、ｐＹＩＬ−ＴＦＰ１の場合には、Ｅｎｄｏ−Ｈ処理の後、分子量が相当減少することが分かった。したがって、ｐＹＩＬ−ＴＦＰ１の場合には、発現されたタンパク質がＮ−グルコシル化されていることを確認することができたが、ｐＹＩＬ−ＴＦＰ３の場合にはＯ−グルコシル化によるグルコシル化なので、Ｅｎｄｏ−Ｈ処理を施しても分子量の変化がなく、ｐＹＩＬ−ＴＦＰ４の場合にも、何の変化がなかった。

＜実施例８＞細胞内におけるＫｅｘ２ｐ切断によるオーセンティック（ａｕｔｈｅｎｔｉｃ）なタンパク質の生産
本発明者らは、実施例７で使用したベクターが各タンパク質融合因子とＩＬ−２とが融合された状態で培地に分泌されるので、ヒトインターロイキン−２と同一な状態のオーセンティックなタンパク質を生産するために、細胞内でタンパク質融合因子を自動的に除去することができるよう、融合因子とＩＬ−２との間に、酵母が自体的に生産する蛋白分解酵素Ｋｅｘ２ｐが認識し得る切断部位（Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ）をそれぞれ挿入した。ｐＹＩＬ−ＴＦＰ１にＫｅｘ２ｐ切断配列を組み込むために、ｐＹＩＬ−ＴＦＰ１を鋳型とし、プライマーＪＨ１３２（配列番号２３）及びＨＹ２２（ＴＦＰ１−ＬＤＫＲ−ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ）（配列番号２５）、ＨＹ２３（ＴＦＰ１−ＬＤＫＲ−ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ）（配列番号２６）及びＪＨ１３７（配列番号２４）を用いてそれぞれ重合酵素連鎖反応し、電気泳動の後、ゲルから回収されたＧＡＬプロモータ及びＴＦＰ１を含有する切片とインターロイキン−２遺伝子を含有する切片とを鋳型とし、ＪＨ１３２（配列番号２３）及びＪＨ１３７（配列番号２４）を用いて２次重合酵素連鎖反応した。得られたＧＡＬプロモータ−ＴＦＰ１−ＩＬ２切片を制限酵素ＳａｃＩ／ＳａｌＩで処理し、ＳａｃＩ／ＳａｌＩで処理されたＹＥＧα−ＨＩＲ５２５ベクターに挿入してｐＹＩＬ−ＫＲＴＦＰ１を製造した。また、ｐＹＩＬ−ＴＦＰ２にＫｅｘ２ｐ切断配列を組み込むために、ｐＹＩＬ−ＴＦＰ２を鋳型とし、前述の方法と同様の方法でプライマーＪＨ１３２（配列番号２３）及びＨＹ２０（ＴＦＰ２−ＬＤＫＲ−ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ）（配列番号２７）、ＨＹ２１（ＴＦＰ２−ＬＤＫＲ−ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ）（配列番号２８）及びＪＨ１３７（配列番号２４）を用いてそれぞれ重合酵素連鎖反応し、回収された２つの遺伝子切片を鋳型とし、ＪＨ１３２（配列番号２３）及びＪＨ１３７（配列番号２４）を用いて２次重合酵素連鎖反応した後、得られた切片を制限酵素ＳａｃＩ／ＳａｌＩで処理し、ＳａｃＩ／ＳａｌＩで処理されたＹＥＧα−ＨＩＲ５２５ベクターに挿入してｐＹＩＬ−ＫＲＴＦＰ２を製造した。また、ｐＹＩＬ−ＴＦＰ３にＫｅｘ２ｐ切断配列を組み込むために、ｐＹＩＬ−ＴＦＰ３を鋳型とし、前述の方法と同様の方法でプライマーＪＨ１３２（配列番号２３）及びＨＹ１７（ＴＦＰ３−ＬＤＫＲ−ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ）（配列番号３８）、ＨＹ１８（ＴＦＰ３−ＬＤＫＲ−Ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ）（配列番号３９）及びＪＨ１３７（配列番号２４）を用いてそれぞれ重合酵素連鎖反応し、回収された２つの遺伝子切片を鋳型とし、ＪＨ１３２（配列番号２３）及びＪＨ１３７（配列番号２４）を用いて２次重合酵素連鎖反応した後、得られた切片を制限酵素ＳａｃＩ／ＳａｌＩで処理し、ＳａｃＩ／ＳａｌＩで処理されたＹＥＧα−ＨＩＲ５２５ベクターに挿入してｐＹＩＬ−ＫＲＴＦＰ３を製造した。また、ｐＹＩＬ−ＴＦＰ４にＫｅｘ２ｐ切断配列を組み込むために、ｐＹＩＬ−ＴＦＰ４を鋳型とし、前述の方法と同様の方法でプライマーＪＨ１３２（配列番号２３）及びＨＹ２４（ＴＦＰ４−ＬＤＫＲ−ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ）（配列番号２９）、ＨＹ２５（ＴＦＰ４−ＬＤＫＲ−Ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ）（配列番号３０）及びＪＨ１３７（配列番号２４）を用いてそれぞれ重合酵素連鎖反応し、回収された２つの遺伝子切片を鋳型とし、ＪＨ１３２（配列番号２３）及びＪＨ１３７（配列番号２４）を用いて２次重合酵素連鎖反応した後、得られた切片を制限酵素ＳａｃＩ／ＳａｌＩで処理し、ＳａｃＩ／ＳａｌＩで処理されたＹＥＧα−ＨＩＲ５２５ベクターに挿入してｐＹＩＬ−ＫＲＴＦＰ４を製造した。

製造された４つのベクターのうち、ｐＹＩＬ−ＫＲＴＦＰ１、ｐＹＩＬ−ＫＲＴＦＰ３及びｐＹＩＬ−ＫＲＴＦＰ４をそれぞれ酵母２８０５Δｇａｌ１Δｉｎｖ２菌株に導入して単一コロニーを選別してＹＰＤＧ培地（１％酵母抽出物、２％ペプトン、２％グルコース、０．３％ガラクトース）で４０時間培養した後、細胞を除去し、残った培養上澄液をＳＤＳ−ＰＡＧＥした結果、図９に示すように、ヒトインターロイキン−２と同じサイズのタンパク質が分泌生産されることを確認した。ヒトインターロイキン−２を分泌生産する３つのタンパク質融合因子のうちＴＦＰ１が最も効率よくオーセンティックなインターロイキン−２を分泌生産することができることを確認した。

前記ベクターｐＹＩＬ−ＫＲＴＦＰ１、ｐＹＩＬ−ＫＲＴＦＰ２、ｐＹＩＬ−ＫＲＴＦＰ３及びｐＹＩＬ−ＫＲＴＦＰ４は、国際寄託機関である韓国大田市儒城區魚隠洞５２番地所在のＫＣＴＣ（Ｋｏｒｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ）に２００３年１１月１１日付でそれぞれ受託番号ＫＣＴＣ １０５４４ＢＰ、１０５４５ＢＰ、１０５４６ＢＰ及び１０５４６ＢＰで寄託した。

＜実施例９＞タンパク質融合因子１（ＴＦＰ１）の特性分析
ＩＬ−２を最も効率よく分泌生産するタンパク質融合因子としてＴＦＰ１を選別し、ＴＦＰ１配列に存在する分泌シグナル（ａ）、Ｎ−グルコシル化部位（ｂ）、及びセリン、アラニンリッチ配列（ｃ）、追加配列（ｄ）及び５’−ＵＴＲ（５’−非翻訳配列）配列（ｅ）の中のどの配列が、難分泌タンパク質であるインターロイキン−２の分泌に絶対的な影響を与えるかを確認するために、図１０に示すように、ＴＦＰ１の各特徴配列を一つずつ除去した欠如遺伝子を製造した。まず、ＴＦＰ１から配列上別に特徴がない追加配列ｄを除去するために、ｐＹＩＬ−ＫＲＴＦＰ１を鋳型とし、プライマーＪＨ１４３（ＸｂａＩ−ＴＦＰ１−ｄ−ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ）（配列番号３１）及びＪＨ１３２（配列番号２３）を用いて重合酵素連鎖反応した。得られたＤＮＡ切片は、ＧＡＬプロモータとＴＦＰ１から配列ｄが除去された切片ＴＦＰ１−１を含んでいる。ＴＦＰ１から追加配列（ｄ）及びセリン、アラニンリッチ配列（ｃ）を除去するために、ｐＹＩＬ−ＫＲＴＦＰ１を鋳型とし、プライマーＪＨ１４２（ＸｂａＩ−ＴＦＰ１−ｃ−ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ）（配列番号３２）及びＪＨ１３２（配列番号２３）を用いて重合酵素連鎖反応し、得られた切片はＧＡＬプロモータと配列ｃ及びｄが除去された切片ＴＦＰ１−２を含んでいる。また、ＴＦＰ１からｄ、ｃ及びＮ−グルコシル化部位（ｂ）を除去するために、ｐＹＩＬ−ＫＲＴＦＰ１を鋳型とし、プライマーＪＨ１４１（ＸｂａＩ−ＴＦＰ１−ｂ−ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ）（配列番号３３）及びＪＨ１３２（配列番号２３）を用いて重合酵素連鎖反応し、得られた切片にはＧＡＬプロモータ及び配列ｃ、ｄ及びｂが除去された切片をＴＦＰ１−３を含んでいる。Ｋｅｘ２ｐ切断部位を含むＩＬ−２遺伝子を製造するために、ｐＹＩＬ−ＫＲＴＦＰ１を鋳型とし、プライマーＪＨ１４０（ＳｐｅＩ−ＸｂａＩ−ＬＤＫＲ−ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ）（配列番号３４）及びＪＨ１３７（配列番号２４）を用いて重合酵素連鎖反応した。回収されたＩＬ−２切片を制限酵素ＳｐｅＩ及びＳａｌＩで処理した切片と、以前に得られた３つの切片（ＴＦＰ１−１、２及び３）をそれぞれ制限酵素ＳａｃＩ及びＸｂａＩで処理し、ＳａｃＩ及びＳａｌＩで処理されたＹＥＧα−ＨＩＲ５２５にそれぞれ挿入して、図１０に示すように、ｐＹＩＬ−ＫＲＴ１−１、ｐＹＩＬ−ＫＲＴ１−２、及びｐＹＩＬ−ＫＲＴ１−３を製造した。ＴＦＰ１の５’−ＵＴＲを除去するために、ｐＹＩＬ−ＫＲＴＦＰ１を鋳型とし、プライマーＨＹ３８（ＴＦＰ１−ＵＴＲ−ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ）（配列番号３５）及びＪＨ１３７（配列番号２４）を用いて重合酵素連鎖反応し、回収された遺伝子をＢａｍＨＩ／ＳａｌＩで処理した後、ＳａｃＩ／ＢａｍＨＩで処理されたＧＡＬ１０プロモータと共に、ＳａｃＩ／ＳａｃＩで処理されたＹＥＧα−ＨＩＲ５２５に挿入してｐＹＩＬ−ＫＲＴ１−４を製造した（図１０）。

製造された４種のプラスミドｐＹＩＬ−ＫＲＴ１−１、ｐＹＩＬ−ＫＲＴ１−２、ｐＹＩＬ−ＫＲＴ１−３及びｐＹＩＬ−ＫＲＴ１−４を酵母に形質転換し、単一コロニーを培養して培養上澄液をＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析した結果、図１１に示すように、分泌シグナル、Ｎ−グルコシル化及びセリン、アラニンリッチ配列を全て含んでいるｐＹＩＬ−ＫＲＴ１−３の場合にのみＩＬ−２バンドが確認され、セリン、アラニンリッチ配列が除去されたｐＹＩＬ−ＫＲＴ１−２及びセリン、アラニンリッチ配列及びＮ−グルコシル化配列が除去されたｐＹＩＬ−ＴＦＰ１−１の場合には全くバンドが確認されなかった。したがって、ＩＬ−２分泌を効果的に誘導するためには、ＴＦＰ１に存在する３つの特徴的な配列（分泌シグナル、Ｎ−グルコシル化及びセリン／アラニンリッチ配列）が全て必要であることが分かった。また、ＴＦＰ１の５’−ＵＴＲを除去した場合、発現率が約３倍以上増加することを確認した。

前記ベクターｐＹＩＬ−ＫＲＴ１−３及びｐＹＩＬ−ＫＲＴ１−４は、国際寄託機関である韓国大田市儒城區魚隠洞５２番地所在のＫＣＴＣに２００３年１１月１１日付でそれぞれ受託番号ＫＣＴＣ １０５４８ＢＰ及び１０５４９ＢＰで寄託した。

＜実施例１０＞タンパク質融合因子ＴＦＰ１−４を用いたヒトインターロイキン２の発酵生産
前記ベクターｐＹＩＬ−ＫＲＴ１−４を形質転換した組み換え酵母菌株を５Ｌのジャーファーメンター（ｊａｒ ｆｅｒｍｅｎｔｏｒ）で流加発酵培養によってインターロイキン−２の分泌生産性を調査した。ファーメンターに接種するためのシード培養は、フラスコでシード培地（酵母窒素ベース（アミノ酸不在）６．７％、カザミノ酸０．５％及びブドウ糖２％）を用いて培養し、初期発酵培地としては、発酵培養培地（酵母抽出物４％、ペプトン１％、ブドウ糖２％）を用いて約１５ＯＤ６００まで培養した後、流加培地（酵母抽出物１５％、ブドウ糖３０％、ガラクトース３０％）を細胞の成長速度に応じて異なる供給量で供給して培養した。約６４時間培養の後、細胞は約２００ＯＤ６００まで成長し、各時間別に培地試料５μＬを取って分泌タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析した（図１２）。結果的に約５００ｍｇ／Ｌのインターロイキン−２が培地に分泌生産されたことを標準試料の量と比較して確認した。酵母発酵によって分泌生産されたインターロイキン−２は、アミノ酸末端の分析によってＡｌａ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒから構成されたことを確認し、ヒトから分泌されるインターロイキン−２と同一であることを確認した。

＜実施例１１＞タンパク質融合因子ＴＦＰ１ないし４を用いたヒトコロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）の分泌能の比較
難分泌タンパク質であるヒトインターロイキン−２を用いて確保された４種のタンパク質融合因子（ＴＦＰ１、２、３及び４）が別の難分泌ヒトタンパク質の分泌にも効果があるか否かを確認するために、難分泌タンパク質であるヒトコロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）を４種のＴＦＰに融合して酵母における発現及び分泌を確認した。ヒトコロニー刺激因子遺伝子は、ヒトｃＤＮＡライブラリーからプライマーＪＨ１４４（ＧＣＳＦ−ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ）（配列番号３６）及びＪＨ１４５（ＧＣＳＦ−ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ）（配列番号３７）を用いて重合酵素連鎖反応によって確保し、確保された遺伝子を制限酵素ＸｂａＩ／ＳａｌＩで処理し、ｐＹＩＬ−ＫＲＴＦＰ１、２、３及び４のＸｂａＩ／ＳａｌＩ部位に挿入してｐＹＧＣＳＦ−ＴＦＰ１、２、３及び４を製造した。

ヒトコロニー刺激因子を発現するために製造されたベクターｐＹＧＣＳＦ−ＴＦＰ１、２、３及び４を酵母に形質転換し、単一コロニーを分離して培養した後、培養上澄液をＳＤＳ−ＰＡＧＥし、Ｇ−ＣＳＦ抗体を用いたウェスタンブロット結果は、図１３に示したとおりである。それぞれのＴＦＰによってＧ−ＣＳＦが分泌生産され、ＴＦＰ１及びＴＦＰ３によって効率よくＧ−ＣＳＦが分泌生産されることが分かった。特にＴＦＰ３の場合、最も効率よくＧ−ＣＳＦを分泌生産することが可能であることを、Ｇ−ＣＳＦに対する抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ社製、米国）を用いたウェスタンブロットによって確認することができた。したがって、タンパク質の種類によって互いに異なるＴＦＰが最大の分泌効率を示すということが立証されるため、本発明で得た４種のＴＦＰは、ＩＬ−２またはＧ−ＣＳＦ以外の多様な難分泌性タンパク質の分泌を促進することが可能なタンパク質融合因子として非常に有用であろうと判断された。

＜実施例１２＞タンパク質融合因子ＴＦＰ３を用いたヒトコロニー成長因子（Ｇ−ＣＳＦ）の発酵生産
実施例１１で記述されたベクターｐＹＧＣＳＦ−ＴＦＰ３で形質転換された組み換え酵母菌株を５Ｌのジャーファーメンターで流加発酵培養によってヒトコロニー成長因子の分泌生産性を調査した。ファーメンターに接種するためのシード培養は、フラスコでシード培地（酵母窒素ベース（アミノ酸不在）６．７％、カザミノ酸０．５％、及びブドウ糖２％）を用いて培養し、初期発酵培地としては、発酵培養培地（酵母抽出物４％、ペプトン１％、ブドウ糖２％）を用いて約１５ＯＤ６００まで培養した後、流加培地（酵母抽出物１５％、ブドウ糖３０％、ガラクトース３０％）を細胞の成長速度に応じて異なる供給量で供給して培養した。約６４時間培養の後、細胞は約２００ＯＤ６００まで成長し、各時間別に培地試料５μＬを取って分泌タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析した（図１４）。結果的に約３００ｍｇ／Ｌのヒトコロニー成長因子が培地に分泌生産されたことを標準試料の量と比較して確認した。酵母発酵によって分泌生産されたヒトコロニー成長因子は、アミノ酸末端の分析によってＴｈｒ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏから構成されたことを確認して、ヒトから分泌されるコロニー成長因子と同一であることを確認した。

＜実施例１３＞タンパク質融合因子ＴＦＰ３誘導体を用いたヒトコロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）の分泌効率分析
前記実施例１１でＧ−ＣＳＦの最適分泌のためにＴＦＰ３が最も優れることを確認することにより、酵母サッカロマイセス・セレヴィシェ遺伝体からＰＣＲを用いて、ＴＦＰ３が由来した遺伝子Ｙｊｌ１５８ｃ（ＣＩＳ３）全体を確保し、図１５に示すように、ＴＦＰ３の長さを漸次変化させたＴＦＰ３の誘導体を６種（ＴＦＰ３−１、２、３、４及びＴＦＰ３−１−１（配列番号４０）、ＴＦＰ３−１−２（配列番号４２））製造した。最初得られたＴＦＰ３は、Ｙｊｌ１５８ｃ（ＣＩＳ３）から得られる２２７個のアミノ酸中の１０４個を含有しているが、これを漸次長く作った各ＴＦＰ３−１（１３０個のアミノ酸を含む）、ＴＦＰ３−２（１５７個のアミノ酸を含む）、ＴＦＰ３−３（１８９個のアミノ酸を含む）及びＴＦＰ３−４（２２２個のアミノ酸を含む）を製造し、それぞれをＧ−ＣＳＦ遺伝子に連結し、融合部位にＫｅｘ２ｐ認識部位を挿入した。図１５の（Ａ）結果から分かるように、ＴＦＰ３に比べて２６個のアミノ酸を追加したＴＦＰ３−１の場合、追加的なＮ−グルコシル化部位が含まれてＧ−ＣＳＦ分泌率がＴＦＰ３に比べて約３倍程度増加した。ところが、ＴＦＰ３の長さをさらに長くした場合には別に効果がなく、むしろＴＦＰ３−３及びＴＦＰ３−４の場合には分泌効率が低くなる結果を示した。

また、図１５の（Ａ）に示すように、発現及び分泌効率が増進されるにつれて、Ｋｅｘ２ｐによって完全に切断されていないＴＦＰ３−１−ＧＣＳＦの融合タンパク質が培地に分泌されることが観察された。これは、２つの遺伝子の融合部位に存在する多数のＯ−グルコシル化部位に付加された糖により酵素接近が難しいためであると判断され、ＴＦＰ３にさらに４個のアミノ酸が追加されたＴＦＰ３−１−１（１３４個のアミノ酸を含む）及び１３個のアミノ酸が追加されたＴＦＰ−１−２（１４３個のアミノ酸を含む）を製造してＧ−ＣＳＦ分泌能及び融合タンパク質減少有無を調査したところ、図１５の（Ｂ）に示すように、ＴＦＰ３−１−１及びＴＦＰ３−１−２においてＧ−ＣＳＦの分泌量の減少なしに融合タンパク質の量が大幅減少した。したがって、確保されたＴＦＰと目的タンパク質の融合部位の精巧な操作によって目的タンパク質の分泌率をさらに向上させることができることを確認した。

本発明において、タンパク質融合因子ＴＦＰ３−１−１を含有するＧ−ＣＳＦ発現ベクターｐＹＧＴ３−１−１−ＧＣＳＦ及びＴＦＰ３−１−２を含有するＧ−ＣＳＦ発現ベクターｐＹＧＴ３−１−２−ＧＣＳＦは、国際寄託機関である 韓国大田市儒城區魚隠洞５２番地所在のＫＣＴＣに２００４年１２月２１日付でそれぞれ受託番号ＫＣＴＣ １０７５３ＢＰ及びＫＣＴＣ １０７５４ＢＰで寄託した。

＜実施例１４＞タンパク質融合因子ＴＦＰ３を用いた産業酵素リパーゼの分泌生産
タンパク質分泌融合因子ＴＦＰ３を含有したＧ−ＣＳＦ発現ベクターｐＹＧＣＳＦ−ＫＲＴＦＰ３のＸｂａＩ−ＳａｌＩ部位に、ｐＹＧＡ−ＣＡｌＢ１４（ＥＳ Ｃｈｏｉ， Ｋｏｒｅａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）をＸｂａＩ−ＳａｌＩで処理して得たＣａｌＢ遺伝子を挿入し、ｐＹＧＴ３−ＣａｌＢ１４を製造した。各発現ベクターを用いて培養温度によるＣａｌＢ１４の分泌率を比較した。ＴＦＰ３を用いたＣａｌＢ１４分泌生産の場合、培養適温である３０℃でも既存の発現システムに比べて２倍以上の高い分泌率を示した（表３：各発現ベクターを含有した菌株の培養温度によるＣａｌＢ活性）。

ｐＴＧＴ３−ＣａｌＢ１４を含有した組み換え酵母を５Ｌのジャーファーメンターで流加培養及び適温培養（３０℃）してＣａｌＢ１４の分泌程度を分析した。使用培地としては、発酵培養培地（酵母抽出物４％、ペプトン１％、ブドウ糖２％）を使用して約１５ＯＤ６００まで培養した後、流加培地（酵母抽出物１５％、ブドウ糖３０％、ガラクトース３０％）を細胞の成長速度に応じて異なる供給量で供給して培養した。組み換え菌株は、３０℃で非常に速く成長することができ、培養温度のシフトなしにも高効率でＣａｌＢ１４を培地に分泌生産することができた。タンパク質の活性及び濃度の分析結果、約１．５〜２．０ｇ／ＬのＣａｌＢ１４が培地に分泌され、ＣａｌＢ１４の経済的な量産が可能であった（図１６）。

＜実施例１５＞タンパク質融合因子ＴＦＰ１の活性をピキアパストリスで確認
本発明で開発されたＴＦＰが異なる酵母Ｐ．パストリスでも作動するかを確認するために、Ｐ．パストリスベクターｐＰＩＣ９（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、米国）をＢａｌＩＩ−ＥｃｏＲＩで処理してＡＯＸプロモータを除去し、ここにＰ．パストリス染色体からプライマー［Ｂｇ１ＩＩ−ＧＡＰ−ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ（配列番号４４）及びＧＡＰ−ＥｃｏＲＩ−ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ（配列番号４５）］を用いて確保されたＧＡＰ（ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ ３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）由来のプロモータを挿入してｐＰＩＣ９−ＧＡＰを製作した。このベクターをＥｃｏＲＩ−ＮｏｔＩで処理し、ここにＥｃｏＲＩ−ＮｏｔＩで処理されたＭＦａｌｐｈａ（ｍａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ ａｌｐｈａ）−ＧＣＳＦ及びＴＦＰ１−ＧＣＳＦ遺伝子をそれぞれ挿入して、ｐＧＡＰ−ＭＦ−ＧＣＳＦ及びｐＧＡＰ−ＴＦＰ１−ＧＣＳＦを製作した。それぞれのベクターをＳａｌＩで処理した後、Ｐ．パストリスＧＳ１１５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、米国）に形質転換した。確保された形質転換体をフラスコ培養し、培地に分泌されたＧ−ＣＳＦをＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって最終菌株を選別した。それぞれのベクターが導入された選別菌株をファーメンターで発酵培地（酵母抽出物４％、バクトペプトン１％、グリセロール４％）を用いて回分培養し、時間別に試料を取って、培地に分泌されたＧ−ＣＳＦをＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって確認した（図１７）。図１７に示すように、ＴＦＰ１の場合、ＭＦａｌｐｈａより高い分泌率を示して酵母Ｓ．セレヴィシェ由来のＴＦＰがＰ．パストリスでも非常に効果的に利用できることを確認した。

本発明は以下の態様であり得る。
［１］細胞から分泌されない難発現性タンパク質の分泌のためのタンパク質融合因子（ＴＦＰ）を選別する方法であって、
ａ）レポータータンパク質をコードする第２のポリヌクレオチドがインフレームで連結された上記難発現性タンパク質をコードする第１のポリヌクレオチドを含む自動選別ベクターを製造する段階と、
ｂ）上記自動選別ベクターに第３のポリヌクレオチドを連結して、ライブラリーを製造する段階と、
ｃ）上記ライブラリーで上記レポータータンパク質の活性がない上記細胞を形質転換する段階と、
ｄ）上記細胞を培養する段階と、
ｅ）一個以上の上記細胞から分泌されたレポータータンパク質の活性を検出することでタンパク質融合因子（ＴＦＰ）を選別する段階とを含み、
上記レポータータンパク質が、インベルターゼ、スクラーゼ、セルラーゼ、キシラナーゼ、マルターゼ、アミラーゼ、グルコアミラーゼ、及びガラクトシダーゼから成る群から選択される、方法。
［２］さらに、選別されたタンパク質融合因子（ＴＦＰ）を分離する段階を含む１に記載の方法。
［３］上記難発現性タンパク質が、サイトカイン、血清タンパク質、免疫グロブリン、サイトカインレセプター、ラクトフェリン、インターフェロン、コロニー刺激因子、幹細胞刺激因子、ホスホリパーゼ活性化タンパク質、インスリン、腫瘍怪死因子、成長因子、ホルモン、酵素、抗癌ペプチド、及び抗菌ペプチドから成る群から選択される、１に記載の方法。
［４］上記難発現性タンパク質がヒトインターロイキン−２、ヒトコロニー刺激因子、又はＣａｌＢ１４である１に記載の方法。
［５］上記第３のポリヌクレオチドが、ゲノム性ＤＮＡに由来する１に記載の方法。
［６］上記第３のポリヌクレオチドが、ｃＤＮＡに由来する１に記載の方法。
［７］上記第３のポリヌクレオチドが、動物、植物、又は微生物のＤＮＡに由来する１に記載の方法。
［８］上記第３のポリヌクレオチドが、酵母ＤＮＡに由来する７に記載の方法。
［９］上記第３のポリヌクレオチドが、カンジダ(Candida)、デバリオミセス(Debaryomyces)、ハンゼヌラ(Hansenula)、クリュイベロミセス(Kluyveromyces)、ピキア(Pichia)、シゾサッカロミセス(Schizosaccharomyces)、ヤロウィア(Yarrowia)、サッカロマイセス(Saccharomyces)、アスペルギルス(Aspergillus)、ペニシリウム(Penicillium)、クモノスカビ(Rhizopus)、又はトリコデルマ(Trichoderma)のＤＮＡに由来する７に記載の方法。
［１０］上記細胞が真核細胞、又は細菌細胞である１に記載の方法。
［１１］上記細胞が、エシェリキア(Escherichia)、シュードモナス(Pseudomonas)、バシラス(Bacillus)、ストレプトマイセス(Streptomyces)、スポドプテラ・フルギペルダ(Spodoptera frugiperda)、ＣＨＯ、ＣＯＳ１、ＣＯＳ７、ＢＳＣ１、ＢＳＣ４０、ＢＭＴ１０、カンジダ(Candida)、デバリオミセス(Debaryomyces)、ハンゼヌラ(Hansenula)、クリュイベロミセス(Kluyveromyces)、ピキア(Pichia)、シゾサッカロミセス(Schizosaccharomyces)、ヤロウィア(Yarrowia)、サッカロマイセス(Saccharomyces)、アスペルギルス(Aspergillus)、ペニシリウム(Penicillium)、クモノスカビ(Rhizopus)、又はトリコデルマ(Trichoderma)の細胞である１０に記載の方法。
［１２］上記レポータータンパク質が細胞外部に分泌されるタンパク質である１に記載の方法。
［１３］上記レポータータンパク質がインベルターゼであり、上記細胞が単一炭素源としてスクロースを含む培地で培養される１に記載の方法。
［１４］上記自動選別ベクターに、さらにプロモータ遺伝子が含まれる１に記載の方法。
［１５］上記プロモータ遺伝子がＧＡＰＤＨ、ＰＧＫ、ＡＤＨ、ＰＨＯ５、ＧＡＬ１及びＧＡＬ１０より成る群から選択される遺伝子に由来する１４に記載の方法。
［１６］上記自動選別ベクターに、さらに切断認識部位が含まれる１に記載の方法。
［１７］上記切断認識部位がＫｅｘ２ｐによって認識される１６に記載の方法。
［１８］上記自動選別ベクターは、プロモータ遺伝子と、翻訳開始及び終結コドンが除去された難発現性タンパク質をコードする第１のポリヌクレオチドと、上記難発現性タンパク質をコードする第１のポリヌクレオチドにインフレームで連結されたレポータータンパク質をコードする第２のポリヌクレオチドとを含む１に記載の方法。
［１９］酵母の細胞から分泌されない難発現性タンパク質の分泌のためのタンパク質融合因子（ＴＦＰ）を選抜する方法であって、
ａ）インベルターゼをコードする第２のポリヌクレオチドがインフレームで連結された上記難発現性タンパク質をコードする第１のポリヌクレオチドを含む自動選別ベクターを製造する段階と、
ｂ）上記自動選別ベクターに第３のポリヌクレオチドを連結して、ライブラリーを製造する段階と、
ｃ）上記ライブラリーで内在性インベルターゼ遺伝子が欠失している酵母変異株を形質転換する段階と、
ｄ）上記形質転換された酵母を単一炭素源としてスクロースを含む培地で培養する段階と、
ｅ）一個以上の上記形質転換された酵母から分泌されたインベルターゼの活性を検出することで上記タンパク質融合因子（ＴＦＰ）を選別する段階とを含む方法。
［２０］タンパク質融合因子（ＴＦＰ）ライブラリーを製造する方法であって、
ａ）インベルターゼをコードする第２のポリヌクレオチドがインフレームで連結されたインターロイキン−２をコードする第１のポリヌクレオチドを含む自動選別ベクターを製造する段階と、
ｂ）上記自動選別ベクターに切断した酵母遺伝体断片を連結して、ライブラリーを製造する段階と、
ｃ）上記ライブラリーで上記インベルターゼの活性がない細胞を形質転換する段階と、
ｄ）上記細胞を培養する段階と、
ｅ）インベルターゼの活性を分泌する細胞を選別する段階と、
ｆ）インベルターゼの活性を分泌する上記細胞を回収する段階とを含み、これによって、タンパク質融合因子（ＴＦＰ）ライブラリーを製造する方法。
［２１］さらに回収された各細胞から上記タンパク質融合因子（ＴＦＰ）をコードするポリヌクレオチドを分離する段階を含む２０に記載の方法。
［２２］上記切断した酵母遺伝体断片が、カンジダ(Candida)、デバリオミセス(Debaryomyces)、ハンゼヌラ(Hansenula)、クリュイベロミセス(Kluyveromyces)、ピキア(Pichia)、シゾサッカロミセス(Schizosaccharomyces)、ヤロウィア(Yarrowia)、サッカロマイセス(Saccharomyces)、アスペルギルス(Aspergillus)、ペニシリウム(Penicillium)、クモノスカビ(Rhizopus)、又はトリコデルマ(Trichoderma)のＤＮＡに由来する２０に記載の方法。
［２３］上記インベルターゼが細胞外部に分泌されるタンパク質である２０に記載の方法。
［２４］上記細胞が単一炭素源としてスクロースを含む培地で培養される２０に記載の方法。
［２５］上記自動選別ベクターに、さらにプロモータ遺伝子が含まれる２０に記載の方法。
［２６］上記プロモータ遺伝子がＧＡＰＤＨ、ＰＧＫ、ＡＤＨ、ＰＨＯ５、ＧＡＬ１及びＧＡＬ１０より成る群から選択されるポリヌクレオチドに由来する２５に記載の方法。
［２７］上記自動選別ベクターに、さらに切断認識部位が含まれる２０に記載の方法。
［２８］上記切断認識部位がＫｅｘ２ｐによって認識される２７に記載の方法。
［２９］上記自動選別ベクターは、プロモータ遺伝子と、翻訳開始及び終結コドンが除去されたインターロイキン−２をコードする第１のポリヌクレオチドと、上記第１のポリヌクレオチドにインフレームで連結されたインベルターゼをコードする第２のポリヌクレオチドとを含む２０に記載の方法。
［３０］難発現性タンパク質とタンパク質融合因子（ＴＦＰ）タンパク質とを含む融合タンパク質であって、
該難発現性タンパク質が、細胞から分泌されないものであり、
該タンパク質融合因子（ＴＦＰ）タンパク質が、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号４０又は配列番号４２で表されるアミノ酸配列の一つを含み、該難発現性タンパク質の該細胞からの分泌を誘導するものである、融合タンパク質。
［３１］３０に記載の融合タンパク質をコードする遺伝子。
［３２］上記遺伝子が配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号４１、又は配列番号４３で表されるヌクレオチド配列の一つを有する、タンパク質融合因子（ＴＦＰ）タンパク質のためのポリヌクレオチドを含む、３１に記載の遺伝子。
［３３］３１に記載の遺伝子を含むベクター。
［３４］上記ベクターが、ｐＹＩＬ−ＫＲＴＥＰ１(KCTC 10544BP)、ｐＹＩＬ−ＫＲＴＥＰ２(KCTC 10545BP)、ｐＹＩＬ−ＫＲＴＥＰ３(KCTC 10546BP)、ｐＹＩＬ−ＫＲＴＥＰ４(KCTC 10547BP)、ｐＹＩＬ−ＫＲＴ１−３(KCTC 10548BP)、ｐＹＩＬ−ＫＲＴ１−４(KCTC 10549BP)、ｐＹＧＴ３−１−１−ＧＣＳＦ(KCTC 10753BP)、及びｐＹＧＴ３−１−２−ＧＣＳＦ(KCTC 10754BP)から成る群から選択される３３に記載のベクター。
［３５］３３に記載のベクターで形質転換された細胞。
［３６］上記細胞が、エシェリキア(Escherichia)、シュードモナス(Pseudomonas)、バシラス(Bacillus)、ストレプトマイセス(Streptomyces)、スポドプテラ・フルギペルダ(Spodoptera frugiperda)、ＣＨＯ、ＣＯＳ１、ＣＯＳ７、ＢＳＣ１、ＢＳＣ４０、ＢＭＴ１０、カンジダ(Candida)、デバリオミセス(Debaryomyces)、ハンゼヌラ(Hansenula)、クリュイベロミセス(Kluyveromyces)、ピキア(Pichia)、シゾサッカロミセス(Schizosaccharomyces)、ヤロウィア(Yarrowia)、サッカロマイセス(Saccharomyces)、アスペルギルス(Aspergillus)、ペニシリウム(Penicillium)、クモノスカビ(Rhizopus)、又はトリコデルマ(Trichoderma)から成る群から選択される３５に記載の細胞。
［３７］難発現性タンパク質の組み換え的生産方法であって、
ａ）１に記載の方法によって選別されたタンパク質融合因子（ＴＦＰ）タンパク質をコードする第２のポリヌクレオチドと連結された、上記難発現性タンパク質をコードする第１のポリヌクレオチドを含む発現ベクターを製作する段階と、
ｂ）上記発現ベクターで細胞を形質転換する段階と、
ｃ）上記細胞を培養する段階とを含み、上記難発現性タンパク質が生産される組み換え的生産方法。
［３８］上記タンパク質融合因子（ＴＦＰ）タンパク質が、
配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号４０又は配列番号４２で表されるアミノ酸配列の一つを含み、難発現性タンパク質の分泌を誘導するタンパク質である、３７に記載の組み換え的生産方法。
［３９］上記タンパク質融合因子（ＴＦＰ）タンパク質が、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号４１、又は配列番号４３で表されるヌクレオチド配列の一つを含む遺伝子によってコードされている３７に記載の組み換え的生産方法。

〔産業上の利用可能性〕
本発明は、現在まで組み換え生産が不可能であり或いは発現率が低かった多様なタンパク質を適合型ＴＦＰ超高速選別及び利用によって経済的に量産可能にするのに寄与する。

〔受託証〕

Claims (9)

1. 難発現性タンパク質とタンパク質融合因子（ＴＦＰ）タンパク質とを含む融合タンパク質であって、
   該難発現性タンパク質が、細胞から分泌されないものであり、
   該タンパク質融合因子（ＴＦＰ）タンパク質が、配列番号５、配列番号４０又は配列番号４２で表されるアミノ酸配列の一つからなり、該難発現性タンパク質の該細胞からの分泌を誘導するものである、融合タンパク質。
2. 請求項１に記載の融合タンパク質をコードする遺伝子。
3. 上記遺伝子が配列番号６、配列番号４１、又は配列番号４３で表されるヌクレオチド配列の一つからなる、タンパク質融合因子（ＴＦＰ）タンパク質のためのポリヌクレオチドを含む、請求項２に記載の遺伝子。
4. 請求項２に記載の遺伝子を含むベクター。
5. 上記ベクターが、ｐＹＩＬ−ＫＲＴＥＰ３(KCTC 10546BP)、ｐＹＧＴ３−１−１−ＧＣＳＦ(KCTC 10753BP)、及びｐＹＧＴ３−１−２−ＧＣＳＦ(KCTC 10754BP)から成る群から選択される請求項４に記載のベクター。
6. 請求項４に記載のベクターで形質転換された細胞。
7. 上記細胞が、エシェリキア(Escherichia)、シュードモナス(Pseudomonas)、バシラス(Bacillus)、ストレプトマイセス(Streptomyces)、スポドプテラ・フルギペルダ(Spodoptera frugiperda)、ＣＨＯ、ＣＯＳ１、ＣＯＳ７、ＢＳＣ１、ＢＳＣ４０、ＢＭＴ１０、カンジダ(Candida)、デバリオミセス(Debaryomyces)、ハンゼヌラ(Hansenula)、クリュイベロミセス(Kluyveromyces)、ピキア(Pichia)、シゾサッカロミセス(Schizosaccharomyces)、ヤロウィア(Yarrowia)、サッカロマイセス(Saccharomyces)、アスペルギルス(Aspergillus)、ペニシリウム(Penicillium)、クモノスカビ(Rhizopus)、及びトリコデルマ(Trichoderma)から成る群から選択される請求項６に記載の細胞。
8. 難発現性タンパク質の組み換え的生産方法であって、
   ａ）(ii) 配列番号５、配列番号４０又は配列番号４２で表されるアミノ酸配列の一つからなるタンパク質融合因子（ＴＦＰ）タンパク質をコードするポリヌクレオチドと連結された、(i) 上記難発現性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを製作する段階と、
   ｂ）上記発現ベクターで酵母サッカロマイセス・セレヴィシェの細胞を形質転換する段階と、
   ｃ）上記細胞を培養する段階とを含み、上記難発現性タンパク質が生産される組み換え的生産方法。
9. 上記タンパク質融合因子（ＴＦＰ）タンパク質が、配列番号６、配列番号４１、又は配列番号４３で表されるヌクレオチド配列の一つからなる遺伝子によってコードされている請求項８に記載の組み換え的生産方法。

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