JP5644544B2 - 発光強度測定装置 - Google Patents

Description

本発明は、バイオチップの発光強度を測定するための発光強度測定装置に関する。

生命科学等の分野において、「区画された領域」から発生する発光を検出する測定が行われる。区画された領域とは、例えば、一つの基板上に多数のウェルがアレイ状に配列されたバイオチップにおける各ウェルのように、試料が他の試料と隔てられて収容される領域である。

バイオチップでは、ＤＮＡ、タンパク質、糖鎖などのバイオ分子や、これらを有する細胞等が各ウェルに予め固定されている。このようなバイオチップに標的分子を含む試料を供給すると、バイオチップ上のバイオ分子（以下、固定分子）に対して特異的な標的分子のみが固定分子と結合する。

標的分子と結合する発光体により固定分子と標的分子が結合したウェルにおいて発光を生じさせ、その発光強度を測定することにより、試料に含まれる標的分子の構造や量を決定することが可能である。発光強度の測定は、バイオチップに対向して配置されたＣＣＤ（Charge Coupled Device Image Sensor）やＣＭＯＳ（Complementary Metal Oxide Semiconductor）等の受光素子により行われる。ここで、ここで、バイオチップにおける発光は微小発光である場合が多く、わずかな光を正確に計測することが求められる。

微小発光を正確に検出するために、受光素子において発生するノイズを低減することが考えられる。例えば、特許文献１に記載の「バイオチップ検査装置」は、バイオチップを撮像した画像から光学読取装置に由来するノイズを補正するものとされている。

特開２０１０−２１７０８７号公報（段落[００４３]）

受光素子において発生するノイズを除去するために、予め大きなノイズを発生する受光素子を選別し、発光の検出の際にその受光素子の出力を除外することが一般的である。しかしながら、特に、ＣＭＯＳイメージセンサにおいては、受光素子のノイズ強度の分布は連続的であり、特定の閾値をもって画素の使用、不使用を振り分けることは困難である。

以上のような事情に鑑み、本発明の目的は、発光強度測定の際に受光素子において発生するノイズの影響を低減することが可能な発光強度測定装置を提供することにある。

上記目的を達成するため、本発明の一形態に係る発光強度測定装置は、受光部と、決定部と、乗算部と、加算部とを具備する。
上記受光部は、複数の受光素子が配列され、試料が収容される複数の区画が形成されたバイオチップに対向して配置される。
上記決定部は、予め取得された各上記受光素子の雑音特性に基づいて、各上記受光素子の重み付け比率を決定する。
上記乗算部は、各上記受光素子の出力に上記重み付け比率を乗じて、各上記受光素子の重み付け出力を算出する。
上記加算部は、各上記区画に対向する各上記受光素子の上記重み付け出力を加算する。

この構成によれば、決定部によって雑音特性の大きい受光素子には小さい重み付け比率が設定され、雑音特性の小さい受光素子には大きい重み付け比率が設定され、乗算部によってそれぞれ各受光素子の出力に乗算される。したがって、受光素子の雑音特性による測定結果への影響を低減することが可能である。

上記決定部は、各上記受光素子の雑音強度の二乗の逆数に比例する値を上記重み付け比率としてもよい。

この構成によれば、決定部は、予め取得された各上記受光素子の雑音特性に基づいた重み付け比率を決定することが可能となる。

上記決定部は、さらに、同一の上記各区画に対向する複数の上記受光素子で構成される受光素子群において、上記受光素子の受光強度分布に基づいて上記重み付け比率を算出してもよい。

受光素子群において、各区画との位置関係により受光強度に分布が生じる場合がある。例えば、区画のひとつにおいて発光が生じた際、当該区画の直下に位置する受光素子は、直下に位置しない受光素子より受光強度が大きくなる。したがって、決定部が受光素子の受光強度分布に基づいて重み付け比率を算出することにより、受光強度の小さい受光素子に起因する雑音の増幅を防止することが可能となる。

上記決定部は、上記受光強度分布に比例する値を上記重み付け比率としてもよい。

この構成によれば、決定部は受光素子の受光強度分布に基づいて重み付け比率を算出することが可能となる。

上記決定部は、各上記受光素子群が同一の受光強度に対して同一の出力となるように上記重み付け比率を規格化してもよい。

この構成によれば、複数の受光素子群の受光強度、即ち各区画の発光強度を互いに比較することが可能となる。

上記受光素子は、相補型金属酸化膜半導体イメージセンサであってもよい。

相補型金属酸化膜半導体（ＣＭＯＳ）イメージセンサは、その構造上、各受光素子の雑音特性が連続的に分布しやすいものであり、特定の閾値をもって受光素子の使用不使用を判断する従来の方式は不適当である一方、本発明の適用が有効である。

以上のように本発明によれば、発光強度測定の際に受光素子において発生するノイズの影響を低減することが可能な発光強度測定装置を提供することが可能となる。

本発明の実施形態に係る発光強度測定装置を示す模式図である。 同発光強度測定装置の一部を拡大した図である。 同発光強度測定装置を用いて測定するＥＬＩＳＡ法の概要を示す図である。 同発光強度測定装置のバイオチップに励起光が照射されている状態を示す模式図である。

以下、図面を参照しながら、本発明の実施形態を説明する。

[発光強度測定装置の構成]
図１は、本発明の一実施形態に係る発光強度測定装置１の概略を示す模式図である。図２は、発光強度測定装置１の一部を拡大した図である。これらの図に示すように、発光強度測定装置１は、バイオチップ２、励起光カットフィルタ３、受光部４及び信号処理装置５を有する。図２において励起光カットフィルタ３は省略されている。バイオチップ２と受光部４は励起光カットフィルタ３を介して対向しており、受光部４は信号処理装置５に接続されている。なお、本実施形態では、発光強度測定装置１は抗原の蛍光発光を検出するための装置として構成されているが、発光を検出するものであれば他の構成とすることも可能である。

バイオチップ２は配列された複数のウェル２１を有する。ウェル２１は互いに区画して形成された凹部とすることができ、各ウェル２１には他のウェル２１と独立して試料を収容することが可能とされている。バイオチップ２はＤＮＡ（Deoxyribonucleic acid）チップ、プロテインチップ、糖鎖チップ、細胞チップ等の種類があるが、どの種類であってもよい。バイオチップ２は例えば一辺が数ｃｍ程度、ウェル２１の直径が数十μｍ程度のものとすることができる。

励起光カットフィルタ３は、バイオチップ２に照射される励起光が受光部４に到達しないように遮蔽し、励起光とその照射によって生じる蛍光を分離するためのものである。励起光カットフィルタ３は任意のものを用いることができる。

受光部４は、配列された複数の受光素子４１を有する。受光素子４１は、ＣＣＤ（Charge Coupled Device）やＣＭＯＳ（Complementary Metal Oxide Semiconductor）等の光電変換素子である。受光部４は、受光素子４１が２次元的に配列されたイメージセンサであってもよく、受光素子４１が１次元的に配列されたラインセンサであってもよい。特に、ウェル２１と受光素子４１の位置合わせを行うことが容易であり、ウェル２１の形状と受光素子４１の形状の適合性に優れるイメージセンサが好適である。受光部４は、各受光素子４１の出力を信号処理装置５に出力する。出力方式はＣＣＤやＣＭＯＳ等の素子構造によって異なるが、各受光素子４１の出力は互いに個別に出力される。

受光部４はバイオチップ２に対向して配置される。具体的には、図２に示すように、バイオチップ２の各ウェル２１に複数の受光素子４１が対向するように配置される。この各ウェル２１に対向する受光素子４１の群をクラスター４２とする。即ち、受光部４はウェル２１と同数のクラスター４２を有する。

クラスター４２内には、種々の雑音（ノイズ）特性を有する受光素子４１が存在する。雑音は例えば受光素子４１がＣＭＯＳである場合、暗電流ノイズ、スイッチングノイズ等である。さらに例えば暗電流ノイズは、時間に比例し予想可能な系統的ノイズ成分と、暗電流に比例した分散を持つ予想不能な統計的ノイズ成分に分けられる。このうち特に、発光強度測定において問題となるのは校正することができない統計的ノイズであり、以下雑音は統計的ノイズであるものとする。図２に、各受光素子４１のノイズ強度を濃淡で例示する。このように各クラスター４２にはノイズ強度が異なる受光素子４１が含まれている。

信号処理装置５は、受光部４の各受光素子４１の出力に基づいて後述する信号処理を行う。図１に示すように、信号処理装置５は、決定部５１、乗算部５２、及び加算部５３を有する。これらの各構成は、信号処理回路によって実現されてもよく、演算処理装置のプログラムによって実現されるものであってもよい。乗算部５２は受光部４に接続され、決定部５１は乗算部５２に接続されている。加算部５３は乗算部５２に接続され、加算部５３の出力が信号処理装置５から出力される。

決定部５１は、各受光素子４１の「重み付け比率」を決定する。決定部５１の重み付け比率の決定方法の詳細については後述するが、決定部５１は、各受光素子４１の受光素子４１の固有ノイズに由来する「統計的ノイズ強度」とクラスター４２内における想定光強度に由来する「信号感度」から重み付け比率を決定する。また、決定部５１は必要に応じて、クラスター４２間で受光強度が比較できるように、重み付け比率を規格化する。決定部５１は重み付け比率を乗算部５２に出力する。

乗算部５２は、各受光素子４１の出力に、決定部５１から出力された重み付け比率を乗じる。以下、重み付け比率が乗じられた各受光素子４１の出力を「重み付け出力」とする。これにより、各受光素子４１の出力は上記統計的ノイズ強度及び信号感度に応じて増減される。乗算部５２は重み付け出力を加算部５３に出力する。

加算部５３は、乗算部５２から出力された各受光素子４１の重み付け出力をクラスター４２毎に加算する。これにより、クラスター４２単位での受光強度が算出される。加算部５３は、クラスター４２単位での受光強度を信号処理装置５から出力する。

[発光強度測定装置を用いた発光強度測定方法]
発光強度測定装置１を用いた発光強度測定方法について説明する。まず、ユーザによってバイオチップ２が準備される。バイオチップを用いる発光強度測定方法は多くの種類があるが、本実施形態はそのいずれにも適用することが可能である。ここでは、そのひとつであるＥＬＩＳＡ（Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay）法（サンドイッチ法）について概略的に説明する。

図３はＥＬＩＳＡ法の概要を示す模式図である。同図は、バイオチップ２のひとつのウェル２１を模式的に示すものである。図３（ａ）に示すように、ウェル２１に定量対象のタンパク質（以下、目的タンパク質）に結合可能な抗体Ａを固定する。このとき、例えば他のウェル２１には、異なる構造の目的タンパク質に結合可能な抗体を固定させておくことができる。

次に、図３（ｂ）に示すように、ウェル２１に目的タンパク質を含む試料を供給し、抗体Ａに目的タンパク質Ｂを結合させる。続いて、図３（ｃ）に示すように、ウェル２１に目的タンパク質と結合可能な一次抗体Ｃを供給し、目的タンパク質Ｂに一次抗体Ｃを結合させる。その後に結合しなかった目的タンパク質Ｂと一次抗体Ｃを洗い流す。

図３（ｄ）に示すように、ウェル２１に一次抗体Ｃと結合可能な二次抗体Ｄを供給し、一次抗体Ｃに二次抗体Ｄを結合させる。なお、二次抗体は蛍光分子によって標識されている。図３（ｅ）に示すようにウェル２１に励起光を照射すると、蛍光分子が蛍光を生じる。即ち、特定のウェル２１についてその蛍光発光の強度が分かると、当該ウェル２１に対応する目的タンパク質Ｂの定量分析が可能となる。

ここで、ＥＬＩＳＡ法における蛍光発光は、その発光体が分子レベルであり、発光強度が微少である。したがって、受光素子の露光時間を長くする等の工夫が行われるが、その際に受光素子のノイズが問題となる。特にこのような分析では発光強度が分析値に直結するため、ノイズの影響を排除した正確な発光強度測定が必要となる。このような事情はＥＬＩＳＡ法以外の発光強度測定方法においても同様である。

[発光強度測定装置の動作]
発光強度測定装置１の動作について説明する。発光強度測定装置１のバイオチップ２は上述のように蛍光分子による標識がなされているものとする。図４は、バイオチップ２のひとつのウェル２１に励起光が照射されている状態を示す模式図である。同図に示すように、ウェル２１に励起光Ｌ１が照射されると、蛍光Ｌ２が生じる。蛍光Ｌ２は励起光カットフィルタ３（図４では省略）を透過して、当該ウェル２１に対向するクラスター４２に入射する。ここで、図４に示すように当該クラスター４２の受光素子４１において、ウェル２１との位置関係により受光強度分布Ｓが形成される。

各受光素子４１が入射する蛍光を光電変換し、乗算部５２に出力する。各受光素子４１の出力はその出力順序によって、いずれの受光素子４１の出力かが特定される。

決定部５１が重み付け比率を決定する。決定部５１は、発光強度測定の事前に各受光素子４１について測定された暗電流を保持している。発光強度測定が開始されると、決定部５１はその測定時間における暗電流を求め、その平方根を算出する。さらに、これにスイッチングノイズ等の他の統計的ノイズを二乗和平方根として加えたものを各受光素子４１の雑音強度Ｎ_ｉｊとする。なお、Ｎ_ｉｊは配列された受光素子４１のうちｉ行ｊ列の受光素子４１の雑音強度を意味する（以下、下付き文字について同様）。

また、決定部５１は、予め測定あるいは計算により求められたクラスター４２内の受光強度分布Ｓを保持している。決定部５１はこれを想定受光強度とし、さらに同一光強度に対する受光素子４１間の感度差がある場合には、当該感度差を想定受光強度に乗じて信号感度Ｓ _ｉｊ とする。

決定部５１は上記統計的ノイズ強度Ｎ_ｉｊ及び上記信号感度Ｓ_ｉｊから重み付け比率Ｒ_ｉｊを算出する。以下、重み付け比率Ｒ_ｉｊの導出方法について説明する。

各受光素子４１の雑音は相互に無相関であるとすると、クラスター４２を構成する受光素子４１の重み付け後のＳＮ(signal/noise)比は以下の（数１）に示す式で与えられる。

このＳＮ比を最小化する重み付け比率Ｒ_ｉｊを以下の（数２）に示す式で求める。

このとき重み付け比率Ｒ_ｉｊは以下の（数３）に示す式で与えられる。

一般に（数３）に示す式の解は解析的には求まらないため、以下の（数４）に示す式のように近似する。

この近似は、どの特定の受光素子４１を問題にしても、それ以外の受光素子４１についはＲ_ｋｌＮ_ｋｌや（Ｒ_ｋｌＳ_ｋｌ）の総和が一定になることを前提としており、受光素子４１の数が十分に多い場合には妥当な近似である。この近似のもとでは（数４）に示す式の重み付け比率Ｒ_ｉｊは以下の（数５）に示す式のようになり、重み付け比率Ｒ_ｉｊはこれに比例させるのが最適となる。

ここで信号感度Ｓ_ｉｊは各受光素子４１の光に対する感受性であると同時に特定の受光素子４１においての想定光強度（観察される発光現象が特定の受光素子４１において検出される確率）をも含む。また、雑音強度Ｎ_ｉｊは、検出される光強度に依存しない雑音となる。さらにクラスター４２間の信号感度Ｓ_ｉｊが同一となるように規格化し、最終的な重み付け比率Ｒ_ｉｊは以下の（数６）に示す式に比例する形で与えられる。なお、クラスター４２間での受光強度の比較をしない場合には、規格化は必ずしも必要ではない。

以上のようにして重み付け比率Ｒ_ｉｊが決定される。決定部５１によって雑音特性の大きい受光素子４１には小さい重み付け比率Ｒ_ｉｊが設定され、雑音特性の小さい受光素子４１には大きい重み付け比率Ｒ_ｉｊが設定される。したがって、受光素子４１の雑音特性による測定結果への影響を低減することが可能である。

また、決定部５１が、ウェル２１との位置関係により形成される受光素子４１の受光強度分布Ｓによる信号感度Ｓ_ｉｊに基づいて重み付け比率Ｒ_ｉｊを算出することにより、受光強度の小さい受光素子４１に起因する雑音の増幅を防止することが可能となる。

決定部５１は、以上のようにして算出した重み付け比率Ｒ_ｉｊを乗算部５２に出力する。乗算部５２は、各受光素子４１の出力に対してそれぞれ対応する重み付け比率Ｒ_ｉｊを乗算して、重み付け出力を生成する。

加算部５３は、各受光素子４１の重み付け出力を加算する。これにより、各クラスター４２の受光強度が算出される。各クラスターの受光強度は信号処理装置５から出力され、ユーザあるいは情報処理装置によって、目的物質の定量等が行われる。

上述のように、発光強度測定装置１は、受光素子４１の固有ノイズに由来する統計的ノイズ強度に基づいて、重み付け比率を決定する。このため、ノイズの大きい受光素子４１からの出力は減衰され、ノイズの小さい受光素子４１からの出力は増幅される。したがって、発光強度測定装置１は測定結果における受光素子４１の固有ノイズによる影響を低減することが可能である。また、これにより、受光部４のサイズを低減することが可能となる。

具体的には、本実施形態に係る発光強度測定装置１では、受光素子４１がＣＭＯＳイメージセンサである場合にはノイズを１５％改善することが可能であり、これにより受光部４の面積を２５％（ノイズ改善の２乗分の１）縮小することが可能である。一般的にＣＭＯＳイメージセンサは価格が面積に比例するため、発光強度測定に要する費用を削減することが可能である。

本発明はこの実施形態にのみ限定されるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲内において変更することが可能である。

本実施形態では、バイオチップにおいて生じる発光の強度を測定するための発光強度測定装置について説明したが、本発明は他の測定装置についても適用することが可能である。具体的には、ｐｈセンサ、抗原抗体反応に基づく電位変化を検出するセンサ等の同一の因果関係に支配される現象を複数のセンサによって検出する系に適用することができる。

１…発光強度測定装置
４…受光部
５…信号処理装置
５１…決定部
５２…乗算部
５３…加算部

Claims (5)

1. 試料が収容される複数の区画が形成されたバイオチップに対向して配置される、複数の受光素子が配列された受光部と、
   予め取得された各前記受光素子の雑音特性に基づいて、各前記受光素子の重み付け比率を決定する決定部であって、各前記受光素子の雑音強度の二乗の逆数に比例する値を前記重み付け比率とする決定部と、
   各前記受光素子の出力に前記重み付け比率を乗じて、各前記受光素子の重み付け出力を算出する乗算部と、
   各前記区画に対向する各前記受光素子の前記重み付け出力を加算する加算部と
   を具備する発光強度測定装置。
2. 請求項１に記載の発光強度測定装置であって、
   前記決定部は、さらに、同一の前記各区画に対向する複数の前記受光素子で構成される受光素子群において、前記受光素子の受光強度分布に基づいて前記重み付け比率を算出する
   発光強度測定装置。
3. 請求項２に記載の発光強度測定装置であって、
   前記決定部は、前記受光強度分布に比例する値を前記重み付け比率とする
   発光強度測定装置。
4. 請求項３に記載の発光強度測定装置であって、
   前記決定部は、各前記受光素子群が同一の受光強度に対して同一の出力となるように前記重み付け比率を規格化する
   発光強度測定装置。
5. 請求項４に記載の発光強度測定装置であって、
   前記受光素子は、相補型金属酸化膜半導体イメージセンサである
   発光強度測定装置。

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