JP5515075B2

JP5515075B2 - 微粒子製剤

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Inventors: 久仁一森部; 裕井上; 恵司山本
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Description

本発明は、ナノレベルの微粒子とした有効成分である薬剤を包含することができる微粒子から成る微粒子製剤、及び微粒子の安定化法等に関する。

本発明の微粒子製剤は、例えば静脈への注射用薬として有用である。

従来の技術として、例えば下記非特許文献１に、抗真菌薬であるアムホテリシンＢ（以下「ＡＭＰＨ−Ｂ」という。）とポリエチレングリコールのリン脂質誘導体とを用いて調製したリポソーム微粒子を血清成分存在下で安定化させようとする試みが記載されている。

Ｋ．Ｍｏｒｉｂｅ，Ｅ．Ｔａｎａｋａ，Ｋ．ＭａｒｕｙａｍａａｎｄＭ．Ｉｗａｔｓｕｒｕ，ＥｎｈａｎｃｅｄｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎｏｆａｍｐｈｏｔｅｒｉｃｉｎＢｉｎｔｏｌｉｐｏｓｏｍｅｓｂｙｃｏｍｐｌｅｘｆｏｒｍａｔｉｏｎｗｉｔｈｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ．，Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．，１５，１７３７−１７４２（１９９８）．

ＡＭＰＨ−Ｂとポリエチレングリコールのリン脂質誘導体からなるミセル形微粒子も微粒子製剤として応用が可能であるが、水中での安定性が悪く、すぐ凝集してしまうという欠点が存在する。

そこで、本発明は、上記課題に鑑み、薬剤をより安定にミセル型微粒子として存在させることのできる微粒子製剤、及び、微粒子又は微粒子製剤の安定化法等を提供することを目的とする。

本発明者らは、上記課題について鋭意検討を行ったところ、リン脂質誘導体等の界面活性剤と薬剤にアスコルビン酸誘導体を加えることで安定な微粒子を得ることができることを発見し、本発明を完成させるに至った。

即ち、上記課題を解決する一手段として、本発明はアスコルビン酸誘導体、界面活性剤、及び、薬剤を含む微粒子製剤を提供する。

更に、本発明は、界面活性剤からなる微粒子又は該微粒子に薬剤を含む微粒子製剤に、更にアスコルビン酸誘導体を含有させることから成る、該微粒子又は該微粒子製剤の安定化法に係る。

本発明によると、薬剤をより安定に微粒子として存在させることのできる微粒子製剤を提供することができる。本微粒子製剤は、薬剤が溶媒中において微粒子として安定に存在し、薬剤として極めて優れた効能を発揮することができる。また本微粒子製剤は、表面にポリエチレングルコールをはじめとする水溶性の高分子が存在するミセル型のナノ微粒子となっていると考えられるため、血中でも長時間安定に存在することが期待できる。薬剤は微粒子の内部に存在するため、薬剤による副作用の軽減といった効果も期待される。

試料１乃至３に対するＵＰＡ測定の結果を示す図である。試料１乃至４に対する微粒子の安定性についての確認実験の結果を示す図である。試料４に対するＵＰＡ測定の結果を示す図である。試料２、４に対する微粒子の生体成分中の安定性についての確認実験の結果を示す図である。リン脂質誘導体としてジステアロイルフォスファチジルエタノールアミンポリエチレングリコール2000（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ2000）に対してＬ−アスコルビン酸２，６−ジパルミテート（ＡＳＣ−ＤＰ）を各種モル比で混合して微粒子を作成し、それに対するＵＰＡ測定の結果を示す図である。図中、(a) DSPE-PEG単独ミセル, (b) ASC-DP:DSPE-PEG(0.5:1),(c) ASC-DP:DSPE-PEG(2:1),(d) ASC-DP:DSPE-PEG(2.1:1)。アムホテリシンＢを封入した本発明の微粒子製剤の粒子の様子を原子間力顕微鏡（AFM）測定した結果を示す。サイズ：約60-80nm、高さ：約5nmの粒子が確認された。

以下、本発明の実施形態について、詳細に説明するが、本発明は多くの異なる形態による実施が可能であり、以下に説明する実施形態、実施例に限定されるものではないことは
いうまでもない。

本発明に係る微粒子製剤は、アスコルビン酸誘導体、界面活性剤、及び、薬剤を含むことを特徴の一つとする。本発明に係る微粒子製剤は、これらを含有することにより使用の際、溶媒中で安定なミセル状のナノ微粒子として存在することができる。この結果、血中でも長時間安定に存在することが期待でき、薬剤は微粒子の内部に存在するため、薬剤による副作用の軽減といった効果が期待できる。

ここで「アスコルビン酸誘導体」とは、アスコルビン酸を出発物質とし、アスコルビン酸の分子構造の一部を変換して得られる化合物をいう。なお、本発明に係るアスコルビン酸誘導体については、限定されるわけではないが、例えば下記式（１）で示されるものであることが好ましい。

（上記式中、Ｒ_１及びＲ_２は炭素数８以上２０以下の側鎖を有していてもよいアシル鎖である。またＲ_１とＲ_２は同じであっても異なっていてもよい。）

上記式（１）で示されるアスコルビン酸誘導体の具体例として、下記式（３）で示されるＬ−アスコルビン酸２，６−ジパルミテート（ＡＳＣ−ＤＰ）、Ｌ−アスコルビン酸２，６−ジブチレート（ＡＳＣ−ＤＢ）、Ｌ−アスコルビン酸６−モノパルミテート（ＡＳＣ−Ｐ）、及び、Ｌ−アスコルビン酸６−モノステアレート（ＡＳＣ−Ｓ）を挙げることが出来る。この中でも、微粒子製剤の安定化という点では、ＡＳＣ−ＤＰが特に好ましい。

本発明に係る微粒子又は微粒子製剤中のアスコルビン酸誘導体の含有量としては、限定されるわけではないが、界面活性剤１ｍｏｌに対して、好ましくは３ｍｏｌ以下、より好ましくは１ｍｏｌ以上２ｍｏｌ以下の範囲内である。

またここで「界面活性剤」とは、当業者に公知の任意の物質をいう。その例として、界面活性剤の代表例として、本明細書中の実施例に記載された各種のリン脂質誘導体及びコレステロール誘導体等を挙げることが出来る。

ここで、「リン脂質誘導体」とは、上記のとおり、ジアシルグリセロールリン酸を出発物質とし、リン酸基と結合する極性基の分子構造の一部を変換して得られる化合物をいう。又、「コレステロール誘導体」とは、コレステロールの極性基の分子構造の一部を、例えば、ポリエチレングリコール等の基に変換して得られる化合物をいう。リン脂質誘導体の例としては、限定されるわけではないが、下記式（２）で示される化合物であることが好ましい。

（上記式中、Ｒ_１及びＲ_２は炭素数８以上２０以下の側鎖を有していてもよいアルキル鎖である。またＲ_１とＲ_２は同じであっても異なっていてもよい。Ｒ_３はポリエチレングルコール、ポリプロピレングルコール又はポリグリセリン鎖であり、リン酸基に直接又はスペーサーを介して結合している。又、上記式中のスペーサーとしては、当業者に公知の任意の基、例えば、−ＣＨ_２ＣＨ_２ＮＨＣＯ−及び−ＣＨ_２ＣＨ_２ＮＨＣＯ−ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＯ−といった構造を有する基であり得る。又、上記誘導体に含まれるポリエチレングリコールの分子量は任意であるが、１０００〜５０００の範囲が好ましい。）

更に、上記リン脂質誘導体の具体例として、以下に式（４）で示されるジステアロイルフォスファチジルエタノールアミンポリエチレングリコール（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ）、及び、上記コレステロール誘導体の具体例として、CHOL-PEG1000及びCHOL-PEG2000等に代表されるコレステロール‐ＰＥＧ（ＣＨＯＬ−ＰＥＧ）を挙げることが出来る。

また本発明に係る薬剤とは、限定されるわけではないが、抗真菌薬、糖尿病薬、抗癌薬、抗てんかん薬、催眠剤、利尿剤、解熱鎮痛薬、抗リウマチ薬、又はビタミン類等の少なくともいずれか一種を含有することが好ましい。

抗真菌薬の場合、限定されるわけではないが、例えばアムホテリシンＢ（以下「ＡＭＰＨ−Ｂ」という。）、ナイスタチン、ピマリシン等を挙げることができる。なおアムホテリシンＢは、その両親媒性により感受性細胞の形質膜に障害を及ぼすことにより抗菌活性を発揮する、より具体的には、細胞膜に豊富に含まれるステロール、特にエルゴステロールとの特異的相互作用を行なうことによって膜透過性を変化させることから深在性真菌の治療に好適である。

また限定されるわけではないが糖尿病薬の場合は、例えばグリベンクラミド、グリクラシド挙げることができる。

また限定されるわけではないが抗癌薬の場合は、例えばスピカマイシン挙げることができる。

また限定されるわけではないが抗てんかん薬の場合は、例えばフェニトイン挙げることができる。

また限定されるわけではないが催眠薬の場合は、例えばニトラゼパム挙げることができる。

また限定されるわけではないが利尿剤の場合は、例えばスピロノラクトン挙げることができる。

また本発明に係る微粒子製剤中の薬剤の含有量としては、限定されるわけではないが、上記用いる界面活性剤１ｍｏｌに対して０．１ｍｏｌ以上０．２ｍｏｌ以下の範囲内で含有してなることが好ましい。

尚、本微粒子製剤に含まれるアスコルビン酸誘導体、界面活性剤、及び、薬剤は、夫々、一種又は数種の混合物であっても良い。

また、本発明に係る微粒子製剤は、上記各成分のほか、製剤として許容される公知成分を適宜加えることができる。限定されるわけではないが、例えば安定化剤、ｐＨ調整剤、二糖類の少なくともいずれかを適宜含有することができる。

本発明に係る微粒子製剤は当業者に公知の任意の方法で製造することが可能である。

例えば、本発明に係る微粒子製剤は、有機溶媒にアスコルビン酸、リン酸脂質誘導体、薬剤を加えて攪拌し、その後溶媒を蒸発させ、水等の溶媒に改めて溶解させ、その後、超音波処理等を施すことで得ることができる。なおこの微粒子製剤は、保存において水等の溶媒を蒸発させ、使用の際、改めて溶媒に溶解、分散させて注射により投与することができる。なお、有機溶媒としては、アスコルビン酸誘導体、界面活性剤、薬剤を加えて攪拌し、ミセルを形成させることができる限りにおいて限定されるわけではないが、例えば、クロロホルム、メタノール、ジエチルエーテル等の有機溶媒を挙げることができる。なお、アスコルビン酸誘導体、界面活性剤、薬剤は別々の有機溶媒で溶解し、その後混合することも好ましい態様である。その結果、本発明に係る微粒子製剤の粒子径は、通常、４０〜３００nm程度の範囲となる。

本発明に係る微粒子製剤の投与経路は特に限定されるわけではないが、使用の際、溶媒に溶解、分散させて注射により投与することが好ましい態様である。この使用の際に使用する溶媒としては、ミセルを形成させることができる限りにおいて限定されるわけではないが、人体への安全性の観点から、水であることが好ましい。なお、本発明に係る微粒子製剤としては、投与対象者の年齢、体重、性別、病状によって適宜調製可能であり、特に限定されることはない。

以上、本発明により、薬剤がより安定的に微粒子として存在する微粒子製剤を提供することができる。

以下、実際に本発明の微粒子製剤を製造し、その効果を確認した。尚、以下の実施例では、アスコルビン酸誘導体としてＬ−アスコルビン酸２，６−ジパルミテート（以下「ＡＳＣ−ＤＰ」という。）を、リン脂質誘導体としてジステアロイルフォスファチジルエタノールアミンポリエチレングリコール（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ（具体的には「DSPE-PEG2000」）を、薬剤としてＡＭＰＨ−Ｂを用いた例で説明する。なお、本実施例で用いるＡＳＣ−ＤＰを下記式（３）に、ＤＳＰＥ−ＰＥＧを下記式（４）に、ＡＭＰＨ‐Ｂを下記式（５）にそれぞれ示す。

（上記式中、ｎは２０〜１２０、好ましくは４０〜５０の整数である。）

まず、クロロホルム（４ｍｌ）に、ＡＳＣ−ＤＰ及びＤＳＰＥ−ＰＥＧを溶解させ、ほぼ透明な溶液を得た。一方、ＡＭＰＨ−Ｂをメタノールに溶解させ、このメタノール溶液を上記のＡＳＣ−ＤＰ及びＤＳＰＥ−ＰＥＧを溶解させたクロロホルム溶液と混合させた。そして、この混合溶液を６０℃で真空に引きつつ蒸発させ、黄色の薄膜を得た。

次に、この蒸発の結果得た上記薄膜を９％のスクロース水溶液に溶解させ、３分間超音波を用いて分散させて各試料溶液を得た（試料番号１乃至３）。なお本実施例では、ＡＳＣ−ＤＰ、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ及びＡＭＰＨ−Ｂの量を変化させることで、微粒子及びその安定性について評価も行なった。ＡＳＣ−ＤＰ、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ、ＡＭＰＨ−Ｂの量及びその比について下記表１に示す。

図１に、上記試料１乃至３に対し、調製直後に行なったマイクロトラック粒度分布測定（ＭＩＣＲＯＴＲＡＣＵｌｔｒａｆｉｎｅＰａｒｔｉｃｌｅＡｎａｌｙｚｅｒ、日機装株式会社製）（以下「ＵＰＡ測定」という。）の結果を示す（図１（ａ）は試料１、（ｂ）は試料２、（ｃ）は試料３における結果をそれぞれ示す）。この結果、上記各試料溶液においては、粒子径が１２０ｎｍ〜２５０ｎｍの範囲にあることが確認でき、十分小さな微粒子となっていることが確認できた。

次に、上記各試料における微粒子の安定性について確認を行った。この確認は、各試料容器を２５℃の暗室に配置して遮光し、その粒子径の経時変化を測定することによって行なった（粒子径の測定については上記ＵＰＡ測定で行なった）。この結果を図２に示す。この結果、試料１乃至３では、大きな粒子径の変動なく７日以上安定的に存在することが確認できた。一方、ＡＳＣ−ＤＰを加えていない試料４の溶液においては、調製直後は粒子径が５ｎｍ程度であったものの、１日後には１２９ｎｍ、７日後には２１５７ｎｍと、急激に大きくなっており、安定性に欠けていた（図２及び図３参照。図３は、試料４に対するＵＰＡ測定の結果を示す図である。図３（ａ）は調製直後、（ｂ）は１日後、（ｃ）は７日後を示す）。また、試料４において、調製後７日後にはＡＭＰＨ−Ｂの結晶も析出してしまっていた。

更に、上記各試料の生体成分中の安定性についても確認を行った。この確認は、試料２又は試料４に血清成分（ＦＢＳ１０％含有ＰＢＳ溶液）を加えて遮光し、３７℃水浴中でインキュベーションし、粒子径の経時変化を測定することによって行なった。この結果を図４に示す。この結果、試料２では１５時間以上安定に存在することが確認でき、生体成分中においても十分に安定して存在することが確認できた。この結果、溶液中に安定的に保持されていることが確認でき、本発明の効果を確認した。なお、試料４においては、測定開始後３０分にも満たない時間で数百μｍから数ｍｍ程度の大きな固まりとなってしまい、やはり安定性に欠けていた。

更に、リン脂質誘導体であるジステアロイルフォスファチジルエタノールアミンポリエチレングリコール2000（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ2000）に対してＬ−アスコルビン酸２，６−ジパルミテート（ＡＳＣ−ＤＰ）を各種モル比で混合して微粒子を作成し、それらの安定性を評価した。

試料の調製は、ＡＳＣ−ＤＰとＤＳＰＥ−ＰＥＧ2000をモル比0.5：1、1：1、2.0：1、2.1：1、2.3：1、2.5：1、3.0：1で秤量後、なすフラスコに入れてクロロホルムに溶解し、ロータリーエバポレーターで溶媒を留去した。得られた薄膜を精製水で水和し、超音波発生処理（Sonics Vibra Cell VC130 、SONICS & MATERIAL ,Inc.）して水中に均一に分散したものについて、ＵＰＡ測定を行った。得られた粒度分布の値をもとに安定性の結果を表２に示す。

DSPE-PEG2000のみのミセルの粒子径は4-10nm程度の値となる。ＡＳＣ−ＤＰとDSPE-PEG2000を各種モル比で用いて調製した微粒子の粒子径はＡＳＣ−ＤＰの添加量の増加とともに増加する。その結果、両者のモル比が１：１〜２：１の範囲では平均粒子径が100nm以下のナノ微粒子として存在することがわかった。これに対して、モル比３：１の場合、平均粒子径は521nmとなり、数μmの粒子の存在が認められた。更に、モル比４：１では明らかに眼で観察できる程度の粒子が存在した。マイクロトラック粒度分布測定の測定可能範囲が最大７μmであることを考えると、４：１は粒子径評価が困難な領域でナノ微粒子といえる粒子は殆ど存在していないと考えられた。従って、モル比が２：１以上になると平均粒子径が400nm以上に急激に増大し数μmの粒子も存在したことからナノ微粒子形成は困難となると考えられた。一方、両者のモル比が０．５：１以下のような、DSPE-PEG に対してASC-DPの添加量がわずかの場合には、ナノ微粒子の粒度分布に加えてDSPE-PEGミセルの分布が現れた。以上の結果を図５に示す。以上の結果から、ＡＳＣ−ＤＰがDSPE-PEG2000を安定化するのに適したモル比は３：１以下、特に１：１〜２：１の範囲が好ましいと推察された。

更に、上記の微粒子を水に分散し24時間後に同様にマイクロトラック粒度分布測定を行った。その結果、上記のモル比1:1の微粒子の粒子径は78nmから71nmに変化し、モル比0.5:1の微粒子の粒子径は44nmから38nmに変化した。分布があることを考えると、これらの粒子径殆ど変化しないかあるいはわずかに減少している、とみなすことができる。

DSPE-PEG2000と各種アスコルビン酸誘導体とを用いて微粒子を製造し、その安定性を評価した。アスコルビン酸誘導体としてＬ−アスコルビン酸２，６−ジパルミテート（ＡＳＣ−ＤＰ）、Ｌ−アスコルビン酸２，６−ジブチレート（ＡＳＣ−ＤＢ）、Ｌ−アスコルビン酸６−モノパルミテート（ＡＳＣ−Ｐ）、Ｌ−アスコルビン酸６−モノステアレート（ＡＳＣ−Ｓ）を、リン脂質誘導体としてジステアロイルフォスファチジルエタノールアミンポリエチレングリコール2000（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ2000）を用いた。

試料の調製は、アスコルビン酸誘導体とＤＳＰＥ−ＰＥＧ2000をモル比1：1で秤量後、なすフラスコに入れてクロロホルムに溶解し、ロータリーエバポレーターで溶媒を留去した。得られた薄膜を精製水で水和し、超音波発生処理（Sonics Vibra Cell VC130 、SONICS & MATERIAL ,Inc.）して水中に均一に分散したものについてＵＰＡ測定を行った。得られた粒度分布の値をもとに安定性の結果を表３に示す。

その結果、ＡＳＣ−ＤＰを用いた場合には、水に分散することで100nm程度の安定なナノ微粒子が形成し、1週間保存したあとでも粒子径はほぼ同じであった。ＡＳＣ−Ｐ、ＡＳＣ−Ｓを用いた場合には、水に分散後ＤＳＰＥ−ＰＥＧ2000に可溶化され溶液はほぼ透明であった。しかし、経時的に徐々に粒子径の増大が観察され1日後には1μm以上の粒子の存在が確認された。ＡＳＣ−ＤＢを用いた場合にも、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ2000への可溶化が観察され1日後でも同じ状態を維持していたが、3日後には1μm以上の粒子の存在が確認された。以上の結果から、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ2000ミセルを安定化させるためには、ＡＳＣ−ＤＰを用いるのがもっとも有用であることがわかった。

アスコルビン酸誘導体（ＡＳＣ−ＤＰ）と各種界面活性剤とを用いて微粒子を製造し、その安定性を評価した。界面活性剤としてジステアロイルフォスファチジルエタノールアミンポリエチレングリコール2000（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ2000）、ジステアロイルフォスファチジルエタノールアミンポリエチレングリコール5000（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ５０００）、ジステアロイルグリセロール2000、コレステロール‐ＰＥＧ1000（ＣＨＯＬ−ＰＥＧ1000）、コレステロール‐ＰＥＧ2000（ＣＨＯＬ−ＰＥＧ2000）、ラウロマクロゴール、臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）、ラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、ジアシルグリセロール5000、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリエチレングリコール6000（ＰＥＧ6000）、デカエチレングリコールモノドデシルエーテル（Ｂｒｉｊ78）を用いた。

試料の調製は、ＡＳＣ−ＤＰと界面活性剤をモル比1：1で秤量後ナスフラスコに入れてクロロホルムに溶解し、ロータリーエバポレーターで溶媒を留去した。得られた薄膜を精製水で水和し、超音波発生処理（Sonics Vibra Cell VC130 、SONICS & MATERIAL ,Inc.）して水中に均一に分散したものについてＵＰＡ測定を行った。得られた粒度分布の値をもとに安定性の結果を表４に示す。

その結果、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ2000を用いた場合には、水に分散することで100nm程度の安定なナノ微粒子が形成し、1週間保存したあとでも粒子径はほぼ同じであった。ＤＳＰＥ−ＰＥＧ５０００を用いた場合にも水に分散後ナノ微粒子が観測され1日後でも同じ状態を維持していた。しかしさらに保存時間を延長すると粒子径の増大が観察され７日後には沈殿物が確認された。ジアシルグリセロール2000を用いた場合には、水に分散後マイクロサイズの微粒子が観察され1日後でも同じ状態を維持していたが、７日後には沈殿物が確認された。ＣＨＯＬ−ＰＥＧ1000、ＣＨＯＬ−ＰＥＧ2000ラウロマクロゴールを用いた場合には、水に分散後ナノ微粒子が観察された。しかし、経時的に徐々に粒子径の増大が観察され1日後には1μm以上の粒子の存在が確認され、一週間の保存により沈殿物が観察された。ＣＴＡＢ、ＳＤＳを用いた場合には、水に分散後マイクロ微粒子が観察された。しかし、経時的に徐々に粒子径の増大が観察され1日後には沈殿物が観察された。ジアシルグリセロール5000、ＰＶＡ、ＰＥＧ6000、Ｂｒｉｊ78を用いた場合には、水に分散後微粒子の存在は観察されず、沈殿が観察された。以上の結果から、ＡＳＣ−ＤＰによるミセル安定化作用はＤＳＰＥ−ＰＥＧ2000ミセルにおいてもっとも有用であることがわかった。

薬剤が封入された本発明の微粒子製剤を製造し、その安定性を評価した。即ち、アスコルビン酸誘導体（ＡＳＣ−ＤＰ）、リン脂質誘導体（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ2000）、及び、薬剤としてアムホテリシンＢ、クラリスロマイシン、フルコナゾール、アセトヘキサミド、ナイスタチン、ニトラゼパム、フェニトイン、ピロキシカム、スピロノラクトン、イブプロフェン、グリメピリド、ビタミンＡパルミテート、α―トコフェロール、α―リポ酸、ビタミンＫ、ビタミンＤ、ＣｏＱ10を用いた。

試料の調製は、三成分試料として、ＡＳＣ−ＤＰ、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ2000、薬剤をモル比1：1：0.1で、二成分試料として、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ2000、封入薬剤をモル比1：0.1でフラスコに入れてクロロホルムに溶解し、ロータリーエバポレーターで溶媒を留去した。得られた薄膜を精製水で水和し、超音波発生処理（Sonics Vibra Cell VC130 、SONICS & MATERIAL ,Inc.）して水中に均一に分散したものについてＵＰＡ測定を行った。得られた粒度分布の値をもとに安定性の結果を表５に示す。

その結果、アムホテリシンＢ、クラリスロマイシン、フルコナゾール、アセトヘキサミドを封入した場合、３成分試料においては水に分散することで100nm程度の安定なナノ微粒子が形成し、1日後でも同じ粒子径を維持していた。アムホテリシンＢを含む微粒子製剤の様子を原子間力顕微鏡（AFM）測定した結果を図６に示す。一方、２成分試料においては、調製直後に凝集が認められた。ナイスタチンを封入した場合、３成分試料においては水に分散することで100nm程度の安定なナノ微粒子が形成し、1日後でも同じ粒子径を維持していた。一方２成分試料においては、調製直後100nm程度のナノ微粒子が形成したものの一日後には1μm以上の粒子の存在が確認された。ニトラゼパム、フェニトインを封入した場合、３成分試料においては、水に分散することで100nm程度の安定なナノ微粒子が形成し、1日後でも同じ粒子径を維持していた。また二成分試料においても、100nm程度のナノ微粒子が形成した。ピロキシカムを封入した場合、三成分試料においては、水に分散することで100nm程度の安定なナノ微粒子が形成した。しかし、経時的に徐々に粒子径の増大が観察され1日後には1μm以上の粒子の存在が確認された。スピロノラクトン、イブプロフェン、グリメピリドを封入した場合には、３成分試料および２成分試料において微粒子の形成は見られなかった。
以上の結果から、ＡＳＣ−ＤＰにより安定化したＤＳＰＥ−ＰＥＧ2000ミセルにはアムホテリシンＢ等の難水溶性薬剤を安定に封入し、それらを含む微粒子製剤を安定化できることがわかった。

アンホテリシンBをDSPE-PEG2000に対しモル比で0.1添加した微粒子を調製し、毒性試験を行った。アンホテリシンBをデオキシコール酸ナトリウムで可溶化した市販製剤のFungizone、アンホテリシンB/DSPE-PEG2000＝0.1/1mol/mol、アンホテリシンB/DSPE-PEG2000/ASC-DP＝0.1/1/1mol/molをマウスに微静脈投与した。投与はマウス体重あたりのアンホテリシンB量として換算し、１ｍｇ、２ｍｇ、４ｍｇ、６ｍｇ、以下２ｍｇずつ増加させ、それぞれ3匹に投与した。投与後マウスが全匹死亡する濃度を最大耐用量（MTD）とした。表６に示された各種微粒子製剤の毒性試験の結果、アンホテリシンB/DSPE-PEG2000/ASC-DP微粒子の毒性は市販の微粒子製剤Fungizoneと比較して明らかに減少したことがわかった。

本発明は、安定した微粒子製剤として、例えば静脈への注射用薬としての応用が可能であり、産業上の利用可能性を有する。

Claims

下記一般式（１）で示されるアスコルビン酸誘導体、下記一般式（２）で示されるリン脂質誘導体を含む界面活性剤、及び、薬剤を含み、粒子径が４０〜３００ｎｍの範囲のミセル型微粒子を形成してなる微粒子製剤。
（上記式中、Ｒ_１及びＲ_２は、側鎖を有していてもよい炭素数８以上２０以下アシル鎖である。またＲ_１とＲ_２は同じであっても異なっていてもよい。）
（上記式中、Ｒ _１及びＲ _２は、側鎖を有していてもよい炭素数が８以上２０以下のアルキル鎖である。またＲ _１とＲ _２は同じであっても異なっていてもよい。Ｒ _３はポリエチレングルコール、ポリプロピレングルコール、又はポリグリセリン鎖のいずれかを含み、リン酸基に直接又はスペーサーを介して結合している。）
前記アスコルビン酸誘導体はＬ−アスコルビン酸２，６−ジパルミテートを含む、請求項１記載の微粒子製剤。
前記リン脂質誘導体は、下記式（３）で示されるリン脂質誘導体を含む、請求項１記載の微粒子製剤。
（上記式中、ｎは２０〜１２０の整数である。）
前記薬剤は、抗真菌薬、糖尿病薬、抗癌薬、抗てんかん薬、催眠剤、利尿剤、解熱鎮痛薬、抗リウマチ薬、又はビタミン類等の少なくともいずれか一種を含む、請求項１記載の微粒子製剤。
前記抗真菌薬がアムホテリシンＢを含む、請求項４記載の微粒子製剤。
前記アスコルビン酸誘導体が、界面活性剤１ｍｏｌに対して、１ｍｏｌ以上２ｍｏｌ以下含まれている、請求項１記載の微粒子製剤。
下記一般式（２）で示されるリン脂質誘導体を含む界面活性剤からなる微粒子又は該微粒子に薬剤を含む微粒子製剤に、更に、下記一般式（１）で示されるアスコルビン酸誘導体を含有させ、粒子径が４０〜３００ｎｍの範囲のミセル型微粒子を形成させる、該微粒子又は該微粒子製剤の安定化法。
（上記式中、Ｒ_１及びＲ_２は、側鎖を有していてもよい炭素数８以上２０以下アシル鎖である。またＲ_１とＲ_２は同じであっても異なっていてもよい。）
（上記式中、Ｒ _１及びＲ _２は、側鎖を有していてもよい炭素数が８以上２０以下のアルキル鎖である。またＲ _１とＲ _２は同じであっても異なっていてもよい。Ｒ _３はポリエチレングルコール、ポリプロピレングルコール、又はポリグリセリン鎖のいずれかを含み、リン酸基に直接又はスペーサーを介して結合している。）
前記界面活性剤が下記式（３）で示されるリン脂質誘導体を含む、請求項７記載の安定化法。
（上記式中、ｎは２０〜１２０の整数である。）
前記アスコルビン酸誘導体を、界面活性剤１ｍｏｌに対して、１ｍｏｌ以上２ｍｏｌ以下含ませる、請求項７記載の安定化法。
前記アスコルビン酸誘導体がＬ−アスコルビン酸２，６−ジパルミテートを含み、且つ、前記界面活性剤が下記式（３）で示されるリン脂質誘導体を含む、請求項７記載の安定化法。
（上記式中、ｎは２０〜１２０の整数である。）