JP5599991B2

JP5599991B2 - 果実の絞り粕を用いたβ−グルカナーゼ及びキシラナーゼの製造方法及び液体培地

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Publication number: JP5599991B2
Application number: JP2009172177A
Authority: JP
Inventors: 和郎福田
Original assignee: Asahi Group Holdings Ltd
Current assignee: Asahi Group Holdings Ltd
Priority date: 2009-07-23
Filing date: 2009-07-23
Publication date: 2014-10-01
Anticipated expiration: 2029-07-23
Also published as: JP2011024458A

Description

本発明は、β−グルカナーゼ及びキシラナーゼを同時に高生産する製造方法及びその酵素を製造するに有用な液体培地に関する。

セルロース資源を有効利用するために、近年、セルロースを効率的に分解する方法が探索されている。自然界ではセルロースは主として微生物によって分解されており、細菌や糸状菌などの様々な微生物がセルロース分解酵素を生産することが知られている。

これらの微生物は菌体外にセルロース分解酵素を分泌し、セルロースはその作用により、主に、セロオリゴ糖、セロビオースを経てグルコースへと分解される。セルロース分解酵素は、一般に、セルラーゼと呼ばれている。

人工的にセルラーゼを製造しようとする場合、セルラーゼを分泌する微生物としては、トリコデルマ属が知られており、広く利用されている。そして、トリコデルマ属に属する微生物を炭素源及び窒素源などの栄養を含む培地を用いて培養し、セルラーゼを分泌させる方法も知られている。

しかしながら、セルラーゼを製造するための従来の方法は、炭素源として使用できる材料に制限があり、高価な結晶セルロースであったり、仮に安価なセルロース資源であっても、加熱処理やアルカリ処理などの前処理を行う必要があり、比較的高いコストを要するものである。

例えば、特許文献１は、古紙を硫酸第１鉄溶液中で蒸煮し、セルラーゼ生産菌を摂種可能なセルラーゼ生産用基質を開示している。また、特許文献２は、微粉砕したバガスを苛性アルカリで蒸煮し、次亜塩素酸塩溶液で処理し、セルラーゼ生産菌であるトリコデルマ・リーセイを摂種可能なセルラーゼ生産用基質の製造方法を開示している。

また、これら従来の方法で得られるセルラーゼは主としてβ−グルカナーゼを含み、キシラナーゼ活性は低く、バガス及び稲わら等のような、キシランが含まれるセルロース資源の分解能力に劣っている。そのため、天然に存在する多様なセルロース資源の有効利用という目的のためには効果が低い。

特許文献３は、トリコデルマ・リーセイに属する変異株を液体培養し、得られたセルラーゼを採取する工程を含むセルラーゼの製造方法を開示している。培地の炭素源としては、セルロースパウダー、セロビオース、濾紙、一般紙類、オガクズ、ふすま、もみがら、バガス、大豆粕、コーヒー粕等化学構造や性質が異なる種々の材料が羅列されている（第００１１段落）。

しかし、これらのうち培養操作に実際に使用されているものはセロビオース（実施例１）及びアビセル（実施例２）のみであり、その他の材料、即ち天然セルロース材料についてはセルラーゼの生成が確認されていない。

特許文献４は、固形構成成分の除去や非揮発成分の濃縮、濃縮物のオートクレーブ処理等の予備処理を行ったライムギの希薄アルコール蒸留廃液を用い、トリコデルマ属に属する微生物を培養してキシラナーゼを製造する方法を開示している。

しかし、本技術で炭素原として用いられるライムギは入手が困難であり、更に複雑な前処理が必要であるために高いコストを要し、また、この方法ではβ−グルカナーゼの生成量が却って低下してしまう。

他方、果実の絞り粕はジュース等の製造工程で大量に発生するが、本来生産廃棄物であり、工業的な用途に乏しい。一部飼料や肥料として再利用されてはいるものの、果実の絞り粕の発生量を全て消費させるには至っていない。従って、多量のものが産業廃棄物として処理されている。しかるにこれらの粕は、非常に腐敗しやすいため、放置しておくと悪臭が発生し、大きな公害源ともなり、その処理法の確立が待望されている。例えば特許文献５は、かかる果実の絞り粕を利用したＬ−アラビノースの製造法が開示されている。

このように、β−グルカナーゼ及びキシラナーゼを同時に高生産するための培地として果実の絞り粕を利用することは、今まで知られていない。

特開２００３−１３７９０１特公平５−３３９８４号公報特開平９−１６３９８０号公報特開平１１−１１３５６８号公報特開２００１−２８６２９４

本発明は上記従来の問題を解決するものであり、その目的とするところは、キシランを含むセルロース資源の分解能力に優れたセルラーゼを低コストで製造することにある。

本発明者らは、β−グルカナーゼ及びキシラナーゼを同時に高生産し、セルロース原料を分解（糖化）する酵素の製造方法及びその酵素を製造することを鋭意検討を重ねた結果、液体培地の原料として（ａ）果実の絞り粕及び（ｂ）アンモニア態窒素又はアミノ態窒素を用い、トリコデルマ属に属する微生物を培養することによるβ−グルカナーゼ及びキシラナーゼを同時に高生産する製造方法及びその酵素を製造するに有用な液体培地を見出した。

本発明は、（ａ）炭素源として果実の絞り粕、及び（ｂ）窒素源としてアンモニア態窒素又はアミノ態窒素を含む液体培地を用いて、トリコデルマ属に属する微生物を培養する工程を包含するβ−グルカナーゼ及びキシラナーゼの製造方法であって、
前記果実の絞り粕の前記液体培地中における濃度が４〜１０％Ｗ/Ｖであり、
前記アンモニア態窒素又はアミノ態窒素の前記液体培地中における濃度が４０〜５８０ｍＭであるβ−グルカナーゼ及びキシラナーゼの製造方法を提供する。

ある一形態においては、前記トリコデルマ属に属する微生物が、トリコデルマ・リーセイである。

ある一形態においては、培養の過程において前記液体培地に対して果実の絞り粕が追加される。

ある一形態においては、前記果実の絞り粕が、リンゴ絞り粕である。

また、本発明は、（ａ）炭素源として果実の絞り粕、及び（ｂ）窒素源としてアンモニア態窒素又はアミノ態窒素を含む液体培地であって、トリコデルマ属に属する微生物を培養するために用いられ、
前記果実の絞り粕の濃度が４〜１０％Ｗ/Ｖであり、
前記アンモニア態窒素又はアミノ態窒素の濃度が４０〜５８０ｍＭである液体培地を提供する。

本発明は、果実の絞り粕を有効利用して産業廃棄物を減少させるため、環境問題の解決に寄与する。果実の絞り粕は原料段階での品質検査および製造工程管理が厳しく行なわれていることから衛生品質に優れる。また、セルロース分解酵素であるβ−グルカナーゼ及びキシラナーゼが同時に高生産されるため、バガスや稲わら等の天然セルロース資源の糖化に極めて有用である。特に、セルロース資源からエタノールを製造するバイオマスエタノール製造に有用である。

リンゴ絞り粕４％の培地における、硫酸アンモニウムの濃度に対する培養上清液の酵素活性の変化を表すグラフである。リンゴ絞り粕４％の培地における、塩化アンモニウムの濃度に対する培養上清液の酵素活性の変化を表すグラフである。リンゴ絞り粕４％の培地における、ロイシンの濃度に対する培養上清液の酵素活性の変化を表すグラフである。リンゴ絞り粕４％の培地における、尿素の濃度に対する培養上清液の酵素活性の変化を表すグラフである。硫酸アンモニウム４８０ｍＭの培地における、リンゴ絞り粕の濃度に対する培養上清液の酵素活性の変化を表すグラフである。結晶セルロース１％の培地における、硫酸アンモニウムの濃度に対する培養上清液の酵素活性の変化を表すグラフである。硫酸アンモニウム１６０ｍＭの培地における、結晶セルロースの濃度に対する培養上清液の酵素活性の変化を表すグラフである。リンゴ絞り粕１％の培地における、硫酸アンモニウムの濃度に対する培養上清液の酵素活性の変化を表すグラフである。リンゴ絞り粕４％の培地における、硫酸アンモニウムの濃度に対する培養上清液の酵素活性の変化を表すグラフである。実施例１で得られたリンゴ絞り粕４％の培地及び参考例２で得られた結晶セルロース１％の培地のそれぞれの上清液を用いて稲わらを糖化した場合に、生成したグルコースの濃度を比較したグラフである。実施例１で得られたリンゴ絞り粕４％の培地及び参考例２で得られた結晶セルロース１％の培地のそれぞれの上清液を用いてビール粕を糖化した場合に、生成したグルコースの濃度を比較したグラフである。

液体培地
本発明の液体培地はセルロース分解酵素を生産する微生物、例えば、トリコデルマ属、アスペルギルス属、アクレモニウム属、スポロトリクム属、ペニシリウム属、タラロマイセス属、フミコラ属、ネオカリマスチクス属、サーモマイセス属又はクロストリディウム属、ストレプトマイセス属に属する微生物が生育する栄養を含んでいる。

かかる液体培地は、以下の培地組成を水１００ｍｌに溶解及び懸濁した液体培地（一般に、マンデル培地と呼ばれる）を基に調整され、一般に、媒体として水、炭素源として果実の絞り粕、及び窒素源としてアンモニア態窒素又はアミノ態窒素を含むものである。好ましい培地組成の一例を以下に示す。

培地組成：
果実の絞り粕：４ｇ、(ＮＨ_４)_２ＳＯ_４：０．１４ｇ、ＫＨ_２ＰＯ_４：１．５ｇ、ＣａＣｌ_２・２Ｈ_２Ｏ：０．０３ｇ、ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ：０．０３ｇ、コーンスティープリカー：２ｍＬ、ツイーン８０：０．１ｍＬ、微量元素液（Ｈ_３ＢＯ_４６ｍｇ、(ＮＨ_４)_６Ｍｏ_７Ｏ_２４・４Ｈ_２Ｏ２６ｍｇ、ＦeＣｌ_３・６Ｈ_２Ｏ１００ｍｇ、ＣuＳＯ_４・５Ｈ_２Ｏ４０ｍｇ、ＭnＣｌ_２・４Ｈ_２Ｏ８ｍｇ、ＺｎＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ２００ｍｇ液）：０．１ｍＬ、水：１００ｍＬを含む（燐酸又は水酸化ナトリウムでｐＨ４．８に調整）

本発明で、果実の絞り粕とは、ジュースなどの製造工程で副生するものであり、果実を絞った後、果汁をろ過して取り除いた残渣である。果実の絞り粕はジュースなどの製造工程で大量に発生し、入手が容易である。そして、果実の絞り粕は食品の製造副産物であるため、原料段階での品質検査および製造工程管理が厳しく行なわれていることから衛生品質に優れ安全である。果実の絞り粕は、好ましくは、リンゴ、ナシ、モモ、サクランボ、イチゴ等のようなバラ科の果実の絞り粕である。中でもリンゴ絞り粕は、所期の酵素が高生産されるために、好ましい。

リンゴの品種は、従来からリンゴ果汁を製造するために用いられるリンゴであればよく、例えば、「ふじ」、「つがる」、「王林」、「ジョナゴール」、「スターキングデリシャス」「陸奥」等が挙げられる。リンゴの実は完熟であっても未完熟であってもよい。

果実の絞り粕の製造方法は、まず、果実を洗浄する。この際、原料不適果があれば、取り除く。洗浄した果実を破砕機に送り、破砕する。破砕した果実はポンプ等で油圧搾汁機に送り、搾汁する。次いで搾汁機から絞り粕を回収する。果実の絞り粕は、要すれば、洗浄、脱水、乾燥などの処理に供される。

果実の絞り粕は液体培地に導入する際に前処理を行ってもよい。好ましい前処理は、例えば、脱リグニン処理である。果実の絞り粕からリグニンが除去されると強固な細胞壁が崩れ、容易にセルロースが利用できるようになり、酵素が生産され易くなるからである。

脱リグニン処理の方法は特に限定されないが、例えば、水酸化ナトリウムのような強アルカリ性物質の存在下で、または硫酸や燐酸のような強酸性物質の存在下で高温に加熱して分解させる方法、微生物により分解させる方法、高温・高圧下で水熱処理により分解させる方法が挙げられる。処理設備や環境への負荷を考慮すると、高温・高圧下で水熱処理により分解させる方法が好ましい。

また、加熱殺菌など液体培地の原料に対して通常行われる前処理を更に行ってもよい。

果実の絞り粕の液体培地中における濃度は２％Ｗ/Ｖ以上であることが好ましい。果実の絞り粕の濃度が２％Ｗ/Ｖ未満であるとセルラーゼ、特にβ−グルカナーゼの生成量があまり増大しない場合がある。より好ましくは、果実の絞り粕の液体培地中における濃度は３％Ｗ/Ｖ以上、更に好ましくは５％Ｗ/Ｖ以上である。

液体培地中の果実の絞り粕の濃度は高ければ高いほどよい。すなわち、その上限は、液体培地を撹拌することができる限度の量である。液体培地が撹拌できないと微生物は液体培地中に均一に混合されず、培養が正常に進行しないからである。液体培地中の果実の絞り粕の濃度の上限は、攪拌装置の性能に応じて２０、１５、１０又は８％Ｗ／Ｖでありうる。一般的には、上記濃度の好ましい範囲は２〜１５％Ｗ／Ｖ、好ましくは４〜１０％Ｗ／Ｖである。

アンモニア態窒素とはアンモニア又はアンモニア由来のアンモニウム塩に含まれている窒素をいう。また、アミノ態窒素とはアミン又はアミン由来のアミノ化合物に含まれている窒素をいう。アンモニア態窒素又はアミノ態窒素を含む化合物は、例えば、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、燐酸二アンモニウム、塩化アンモニウム、アンモニア水、尿素、アミノ酸およびその塩（例えば、ロイシン、グルタミン酸ナトリウム）である。

これらのうち、窒素源として本発明の液体培地に用いるのに特に好ましい化合物は、硫酸アンモニウムである。その理由は、コストが低く入手が容易だからである。

アンモニア態窒素又はアミノ態窒素の液体培地中における濃度は、アンモニウムのモル数として３０〜６６０ｍＭである。好ましくは、４０〜５８０ｍＭである。濃度が３０ｍＭ未満であるとセルラーゼ、特にβ−グルカナーゼの生成量があまり増大しない場合がある。また、この濃度が６６０ｍＭを超えると酵素の生産性が低下する。また、アンモニア態窒素又はアミノ態窒素の液体培地中における濃度は、液体培地中の果実の絞り粕の濃度に応じて、増減させることが好ましく、例えば、果実の絞り粕の濃度が４％Ｗ／Ｖである場合は、コスト等を考慮すると５０ｍＭが好ましい。

β−グルカナーゼ及びキシラナーゼの製造方法
本発明に使用するトリコデルマ属に属する微生物はセルロースの糖化に必要なセルラーゼを生産するものであれば特に限定されない。好ましいトリコデルマ属に属する微生物はトリコデルマ属糸状菌であり、具体的にはトリコデルマ・リーセイ又はトリコデルマ・ビリデである。特に好ましくは、トリコデルマ・リーセイである。

トリコデルマ・リーセイおよびトリコデルマ・ビリデの菌学的性質は、例えば、イー・ジー・シモンズ，アブストラクト・セカンド・インターナショナル・マイコロジカル・コングレス（E.G. Simmons, Abst. 2nd International Mycological Congress）米国フロリダ州タンパ，１９７７年８月，６１８頁）に記載されている。

液体培養には通常の通気撹拌培養装置が用いられ、上記本発明の液体培地を使用して、培養温度２０〜３３℃好ましくは、２８〜３０℃、培養ｐＨ４〜６で、４〜１０日間培養する。培養の最初から上記液体培地を使用する場合は、液体培地に含まれる成分（例えば、炭素源及び窒素源）の濃度は、本発明の培養方法における上記成分の初期濃度に相当する。

培養の過程において液体培地に対して炭素源を追加してもよい。培養の進行と共に培地中の果実の絞り粕は分解されるため、炭素源を補うことによりセルラーゼの生成効率が向上する場合があるからである。追加する炭素源は、天然セルロースを含み、澱粉質等の栄養分を実質的に含まない材料であれば特に限定されない。追加するのに好ましい炭素源は、果実の絞り粕、紙、ビール粕、麦茶抽出粕などである。培養条件が安定化されるため、好ましいものは果実の絞り粕、特に液体培地の炭素源として最初から用いているものと同じ種類の果実の絞り粕である。

炭素源を追加する場合、培養の過程において、アンモニア態窒素又はアミノ態窒素を必要に応じて、適宜追加してもよい。

ついで、要すればこの培養液から遠心分離、濾過などの公知の方法によって菌体を除去して、トリコデルマ属糸状菌培養上清液が得られる。トリコデルマ属糸状菌培養液又は培養上清液には目的とするセルラーゼ、すなわちβ−グルカナーゼ及びキシラナーゼが高濃度で含まれている。

得られる培養液又は培養上清液のβ−グルカナーゼ活性は３０Ｕ／ｍｌ以上、好ましくは５０Ｕ／ｍｌ以上、より好ましくは６０Ｕ／ｍｌ以上、更に好ましくは７０Ｕ／ｍｌ以上である。また、この培養液又は培養上清液のキシラナーゼ活性は２５Ｕ／ｍｌ以上、好ましくは３０Ｕ／ｍｌ以上、より好ましくは４０Ｕ／ｍｌ以上、更に好ましくは５０Ｕ／ｍｌ以上である。培養液又は培養上清液のβ−グルカナーゼ活性、キシラナーゼ活性のいずれかが上記下限より低下すると、天然に存在する多様なセルロース資源の有効利用という目的に対する効果が低くなる。

尚、上記ヘミセルラーゼ活性は、「oat spelts」由来のキシランを基質とした酵素加水分解により生成した還元糖をDNSと反応させ、５４０ｎｍの吸光度の増加で定量することができる。

より具体的には１％キシラン基質溶液（シグマ社製「Xylan, from oat spelts」を２００ｎＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）に溶解）１．９ｍｌに培養液又は培養上清液0.1ｍｌを加えて、４０℃にて正確に１０分間酵素反応を行なわせた後、DNS試薬（０．７５％ジニトロサリチル酸、１．２％水酸化ナトリウム、２２．５％酒石酸ナトリウムカリウム４水和物、０．３％乳糖１水和物を含む）４ｍｌを加えてよく混合し、反応を停止する。反応停止液に含まれる還元糖量を定量するために、反応停止液を沸騰水浴中で１５分間正確に加熱する。続いて、室温まで冷却した後、５４０ｎｍの吸光度を測定することでキシロースに相当する還元糖量として定量する。１単位のヘミセルラーゼ活性は、４０℃、１０分間の反応条件下で、１分間に１μｍｏｌのキシロースに相当する還元糖を生成する酵素量として表す。

本発明でいう「トリコデルマ属に属する微生物を培養する」とは、技術常識のとおり当該微生物を育成する操作をいう。つまり、β−グルカナーゼ及びキシラナーゼの製造を目的として液体培養を行う方法において、少なくとも上記本発明の液体培地の中でトリコデルマ属に属する微生物が育成する過程が存在すれば、その培養方法は本発明の方法に該当する。

培養を行うと、液体培地の栄養はトリコデルマ属に属する微生物が消費するために減少する。それゆえ、培養の終期には培地中の炭素源や窒素源の濃度が所定の濃度未満になって、結果として本発明の液体培地に該当しない培地の中でトリコデルマ属に属する微生物が育成するかもしれない。かかる場合でも、例えば培養を開始した時点で、使用する液体培地が炭素源や窒素源を所定の濃度で含有する本発明の液体培地に該当しているときは、少なくとも培養の初期には本発明の液体培地の中でトリコデルマ属に属する微生物が育成するのであるから、その培養方法は当然本発明の方法に該当する。

尚、このように特に培養の開始時点から炭素源を高含有させる場合は、上述のとおり、液体培地を攪拌混合する際の利便性を考慮して、果実の絞り粕の濃度の上限をある程度制限することが好ましい。

反対に、培養の初期には培地中の炭素源又は窒素源の濃度が所定の濃度より低く、本発明の液体培地に該当しない培地を用いて培養が行われていても、例えば、その後これらが追加されて培地中の炭素源又は窒素源の濃度が所定の濃度以上になった場合は、その後は本発明の液体培地の中でトリコデルマ属に属する微生物が育成するのであるから、その培養方法は本発明の方法に該当する。

セルロース資源の分解又は糖化方法
本発明の方法により得られたβ−グルカナーゼ及びキシラナーゼは、セルロース資源を分解又は糖化するのに有用である。ここでいうセルロース資源は、合成セルロースもしくは天然セルロース資源のどちらでも良い。合成セルロースとは、セルロース粉末として、流通しているものを表す。天然セルロース資源とは、バガス、稲わら、麦わら、ビール粕、木材などが挙げられる。本発明は、β−グルカナーゼおよびキシラナーゼを同時に高生産できるため、特に、バガス、稲わら、麦わら、ビール粕などの天然セルロース資源の糖化に優れている。

セルロース資源の分解又は糖化方法は、公知の方法を使用すればよく、特に制限されるものではないが、一例としては、基質としてセルロース資源を水性媒体中に懸濁させ、上記培養液又は培養上清液を添加し、攪拌又は振とうしながら、加温して糖化反応を行う方法が挙げられる。セルロース分解活性を示す上記培養液又は培養上清液の代わりにその乾燥物、又は乾燥物を水に分散もしくは溶解した液を用いてもよい。

セルロース原料は、予め脱リグニンしておくことが好ましい。懸濁方法、攪拌方法、上記混合液の添加方法、添加順序、それらの濃度等の反応条件は、グルコースがより高収率で得られるよう適宜調整される。

その際の、反応液のｐＨ及び温度は、酵素が失活しない範囲内であればよく、一般的には、常圧で反応を行う場合、温度は３０〜７０℃、ｐＨは３〜７の範囲でよい。また、この圧力、温度、ｐＨについても、上記同様、グルコースがより高収率で得られるよう適宜調整されるものであるが、常圧で、酢酸又はリン酸緩衝液中で、温度５０〜６０℃、ｐＨ４〜６の範囲で行うことが好ましい。反応時間は一般に６〜１４７時間、好ましくは２４〜７２時間である。

セルロースの糖化により、グルコースを含有する水溶液が得られる。得られた水溶液は、必要に応じて、脱色、脱塩、酵素除去等の精製処理を施すことができる。精製方法は、公知の方法であれば特に制限されないが、例えば、活性炭処理、イオン交換樹脂処理、クロマトグラフィー処理、精密ろ過、限外ろ過、逆浸透ろ過等の濾過処理、晶析処理等を使用してもよく、これらを単独で使用しても、２種以上を組み合わせてもよい。

上記の方法で精製されたグルコースを主成分とする水溶液は、そのまま使用することができるが、必要に応じて、乾燥により固化させてもよい。乾燥方法は、公知の方法であれば特に制限されないが、例えば、噴霧乾燥、凍結乾燥、ドラム乾燥、薄膜乾燥、棚段乾燥、気流乾燥、真空乾燥等を使用してもよく、これらを単独で使用しても、２種以上を組み合わせてもよい。

以下、本発明を実施例によってより具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

実施例１
粉砕装置（アモス社製「ハンマーミル」）を用いてリンゴ果実（品種「ふじ」）を粉砕し、引き続きリンゴ搾汁装置（月島−アンドリッツ製「プレスロールフィルター」）を用いて、搾汁した。搾汁機から絞り粕を回収し、水洗し乾燥させた。

得られたリンゴの絞り粕は、０．３Ｎ水酸化ナトリウム水溶液中で１２１℃、１５分のオートクレーブ処理によるリグニンを除去し、充分水洗いした後、乾燥し、粉砕処理を施して大きさを均一にして使用した。

トリコデルマ・リーセイQM9414（NBRC 31329）をポテトデキストロース寒天培地上で２８℃、７日間培養して胞子を充分形成させた。マンデル培地の炭素源である結晶セルロースを脱リグニン処理したリンゴ絞り粕４％（４ｇ／１００ｍＬ）に置き換えて、また窒素源である硫酸アンモニウムのアミノ態窒素のモル濃度がそれぞれ１５ｍＭ、３５ｍＭ、５０ｍＭ、６５ｍＭ、８０ｍＭ、１００ｍＭまた１１５ｍＭになるように添加して燐酸又は水酸化ナトリウムでｐＨ４．８に調整した１００ｍＭの液体培地を５００ｍＬ容バッフル付三角フラスコに用意した。培養したトリコデルマ・リーセイの１白金耳をこの液体培地に摂取して、２８℃、１８０ｒｐｍ、７日間振とう培養した。７日目に培養液を遠心分離し、上清液のβ−グルカナーゼ活性およびキシラナーゼ活性を測定した。

（酵素活性の測定）
前記で得られた培養液について酵素活性を測定した。
β−グルカナーゼ活性は、メガザイム社製のβ‐グルカナーゼ測定キットを用い、色素標識したβ−グルカンを基質とした酵素分解によって生じた染色断片を吸光度測定した。具体的には、アゾ大麦グルカン基質溶液０．１ｍＬに培養液０．１ｍＬを加えて、４０℃にて正確に１０分間酵素反応を行なわせた後、停止液［４％酢酸ナトリウム、０．４％酢酸亜鉛、８０％メチルセルソルブを含む（ｐＨ５）］０．６ｍＬを加えて５分放置し、反応を停止した。続いて遠心分離した後、上澄液を５９０ｎｍの吸光度測定した。１単位のβ−グルカナーゼ活性は、４０℃、１０分間の反応条件下で、１分間に１μｍｏｌのグルコースに相当する還元糖を生成する酵素量として表した。

次に、キシラナーゼ活性は、「oat spelts」由来のキシランを基質とした酵素加水分解により生成した還元糖をＤＮＳと反応させ、５４０ｎｍの吸光度の増加で定量した。より具体的には１％キシラン基質溶液［シグマ社製「Xylan, from oat spelts」を２００ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）に溶解］１．９ｍＬに培養液０．１ｍＬを加えて、４０℃にて正確に１０分間酵素反応を行なわせた後、ＤＮＳ試薬（０．７５％ジニトロサリチル酸、１．２％水酸化ナトリウム、２２．５％酒石酸ナトリウムカリウム４水和物、０．３％乳糖１水和物を含む）４ｍＬを加えてよく混合し、反応を停止した。反応停止液に含まれる還元糖量を定量するために、反応停止液を沸騰水浴中で１５分間正確に加熱した。続いて、室温まで冷却した後、５４０ｎｍの吸光度を測定することでキシロースに相当する還元糖量として定量した。１単位のキシラナーゼ活性は、４０℃、１０分間の反応条件下で、１分間に１μｍｏｌのキシロースに相当する還元糖を生成する酵素量として表した。結果を図１に示す。

実施例２
マンデル培地の炭素源である結晶セルロースを実施例１と同様にして得た脱リグニン処理したリンゴ絞り粕４％（４ｇ／１００ｍＬ）に置き換えて、また窒素源である硫酸アンモニウムを塩化アンモニウムに置き換えてアンモニア態窒素のモル濃度がそれぞれ２０ｍＭ、４０ｍＭ、５０ｍＭ、６０ｍＭ、８０ｍＭ、１００ｍＭ又は１２０ｍＭになるように添加して実施例１と同様に液体培地を用意した。トリコデルマ・リーセイQM9414（NBRC 31329）をポテトデキストロース寒天培地上で２８℃、７日間培養して胞子を充分形成させ、この１白金耳を液体培地に接種して、２８℃、１８０ｒｐｍ、７日間振とう培養した。７日目に培養液を遠心分離し、実施例１と同様にしてβ−グルカナーゼ活性およびキシラナーゼ活性を測定した。結果を図２に示す。

実施例３
マンデル培地の炭素源である結晶セルロースを実施例１と同様にして得た脱リグニン処理したリンゴ絞り粕４％（４ｇ／１００ｍＬ）に置き換えて、また窒素源である硫酸アンモニウムをロイシンに置き換えてアミノ態窒素のモル濃度がそれぞれ８ｍＭ、１５ｍＭ、２３ｍＭ、３１ｍＭ、３８ｍＭ、４６ｍＭ又は５３ｍＭになるように添加して実施例１と同様に液体培地を用意した。トリコデルマ・リーセイQM9414（NBRC 31329）をポテトデキストロース寒天培地上で２８℃、７日間培養して胞子を充分形成させ、この１白金耳を液体培地に接種して、２８℃、１８０ｒｐｍ、７日間振とう培養した。７日目に培養液を遠心分離し、実施例１と同様にしてβ−グルカナーゼ活性およびキシラナーゼ活性を測定した。結果を図３に示す。

実施例４
マンデル培地の炭素源である結晶セルロースを実施例１と同様にして得た脱リグニン処理したリンゴ絞り粕４％（４ｇ／１００ｍＬ）に置き換えて、また窒素源である硫酸アンモニウムを尿素に置き換えてアミノ態窒素のモル濃度がそれぞれ１７ｍＭ、３３ｍＭ、５０ｍＭ、６７ｍＭ、８３ｍＭ又は１００ｍＭになるように添加して実施例１と同様に液体培地を用意した。トリコデルマ・リーセイQM9414（NBRC 31329）をポテトデキストロース寒天培地上で２８℃、７日間培養して胞子を充分形成させ、この１白金耳を液体培地に接種して、２８℃、１８０ｒｐｍ、７日間振とう培養した。７日目に培養液を遠心分離し、実施例１と同様にしてβ−グルカナーゼ活性およびキシラナーゼ活性を測定した。結果を図４に示す。

実施例５
マンデル培地の炭素源である結晶セルロースを実施例１と同様にして得た脱リグニン処理したリンゴ絞り粕に置き換えて濃度が１％、２％、３％、４％、５％、６％又は７％になるように添加して、また窒素源である硫酸アンモニウムのアンモニア態窒素のモル濃度が４８０ｍＭになるように添加して実施例１と同様に液体培地を用意した。トリコデルマ・リーセイQM9414（NBRC 31329）をポテトデキストロース寒天培地上で２８℃、７日間培養して胞子を充分形成させ、この１白金耳を液体培地に接種して、２８℃、１８０ｒｐｍ、７日間振とう培養した。７日目に培養液を遠心分離し、実施例１と同様にしてβ−グルカナーゼ活性およびキシラナーゼ活性を測定した。結果を図５に示す。

参考例１
マンデル培地の炭素源である結晶セルロースの濃度を１％とし、窒素源である硫酸アンモニウムのアンモニア態窒素のモル濃度がそれぞれ１５ｍＭ、３５ｍＭ、５０ｍＭ、６５ｍＭ、８０ｍＭ、１００ｍＭ又は１１５ｍＭになるように添加して実施例１と同様に液体培地を用意した。トリコデルマ・リーセイQM9414（NBRC 31329）をポテトデキストロース寒天培地上で２８℃、７日間培養して胞子を充分形成させ、この１白金耳を液体培地に接種して、２８℃、１８０ｒｐｍ、７日間振とう培養した。７日目に培養液を遠心分離し、実施例１と同様にしてβ−グルカナーゼ活性およびキシラナーゼ活性を測定した。結果を図６に示す。

参考例２
マンデル培地の炭素源である結晶セルロース濃度が１％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％又は４％になるように添加して、また窒素源である硫酸アンモニウムのアンモニア態窒素のモル濃度が１６０ｍＭになるように添加して実施例１と同様に液体培地を用意した。トリコデルマ・リーセイQM9414（NBRC 31329）をポテトデキストロース寒天培地上で２８℃、７日間培養して胞子を充分形成させ、この１白金耳を液体培地に接種して、２８℃、１８０ｒｐｍ、７日間振とう培養した。７日目に培養液を遠心分離し、実施例１と同様にしてβ−グルカナーゼ活性およびキシラナーゼ活性を測定した。結果を図７に示す。

参考例３
マンデル培地の炭素源である結晶セルロースを実施例１と同様にして得た脱リグニン処理したリンゴ絞り粕１％（３ｇ／１００ｍＬ）に置き換えて添加して、また窒素源である硫酸アンモニウムのアンモニア態窒素のモル濃度がそれぞれ１５ｍＭ、３５ｍＭ、５０ｍＭ、６５ｍＭ、８０ｍＭ、１００ｍＭ又は１１５ｍＭになるように添加して実施例１と同様に液体培地を用意した。トリコデルマ・リーセイQM9414（NBRC 31329）をポテトデキストロース寒天培地上で２８℃、７日間培養して胞子を充分形成させ、この１白金耳を液体培地に接種して、２８℃、１８０ｒｐｍ、７日間振とう培養した。７日目に培養液を遠心分離し、実施例１と同様にしてβ−グルカナーゼ活性およびキシラナーゼ活性を測定した。結果を図８に示す。

実施例６
マンデル培地の炭素源である結晶セルロースを実施例１と同様にして得た脱リグニン処理したリンゴ絞り粕４％（３ｇ／１００ｍＬ）に置き換えて、また窒素源である硫酸アンモニウムのアンモニア態窒素のモル濃度がそれぞれ３３０ｍＭ、４２０ｍＭ、５００ｍＭ、５８０ｍＭ、６６０ｍＭ、７２０ｍＭ又は８００ｍＭになるように添加して実施例１と同様に液体培地を用意した。トリコデルマ・リーセイQM9414（NBRC 31329）をポテトデキストロース寒天培地上で２８℃、７日間培養して胞子を充分形成させ、この１白金耳を液体培地に接種して、２８℃、１８０ｒｐｍ、７日間振とう培養した。７日目に培養液を遠心分離し、実施例１と同様にしてβ−グルカナーゼ活性およびキシラナーゼ活性を測定した。結果を図９に示す。

実施例７
実施例１で得られた培養上清液（４％リンゴ絞り粕、アンモニア態窒素が１００ｍＭの硫安）および参考例２で得られた培養上清液（１％結晶セルロース、アンモニア態窒素が１００ｍＭの硫安）を用いて、セルロース原料の糖化試験を行った。糖化に供するセルロース原料は、以下の方法で脱リグニン処理を行った。稲わらおよびビール粕をそれぞれ微粉砕し、０．３ＮのＮａＯＨに懸濁して、１２０℃、１５分間処理し、水で充分に洗浄後、乾燥した。セルロース原料の糖化は、セルロース原料：０．３ｇ、培養上清液：９．５ｍＬ、１Ｍ酢酸バッファー（ｐＨ４．８）：０．２ｍＬからなる液（セルロース原料３％液）を５０℃、ｐＨ４．８、４８時間、振とうさせて糖化し、生成したグルコースをグルコースＣII−テストワコー（和光純薬工業）で測定した。結果を図１０および図１１に示す。

バガスや稲わら等の天然セルロース資源の糖化に極めて有用なβ−グルカナーゼ及びキシラナーゼを同時に高生産でき、セルロース資源からエタノールを製造するバイオマスエタノール製造に利用できる。

Claims

（ａ）炭素源として果実の絞り粕、及び（ｂ）窒素源としてアンモニア態窒素又はアミノ態窒素を含む液体培地を用いて、トリコデルマ属に属する微生物を培養する工程を包含するβ−グルカナーゼ及びキシラナーゼの製造方法であって、
前記果実の絞り粕の前記液体培地中における濃度が４〜１０％Ｗ/Ｖであり、
前記アンモニア態窒素又はアミノ態窒素の前記液体培地中における濃度が４０〜５８０ｍＭであるβ−グルカナーゼ及びキシラナーゼの製造方法。
前記トリコデルマ属に属する微生物が、トリコデルマ・リーセイである請求項１に記載のβ−グルカナーゼ及びキシラナーゼの製造方法。
培養の過程において前記液体培地に対して果実の絞り粕を追加する請求項１又は２に記載のβ−グルカナーゼ及びキシラナーゼの製造方法。
前記果実の絞り粕が、リンゴ絞り粕である請求項１〜３のいずれか一項に記載のβ−グルカナーゼ及びキシラナーゼの製造方法。
（ａ）炭素源として果実の絞り粕、及び（ｂ）窒素源としてアンモニア態窒素又はアミノ態窒素を含む液体培地であって、トリコデルマ属に属する微生物を培養するために用いられ、
前記果実の絞り粕の濃度が４〜１０％Ｗ/Ｖであり、
前記アンモニア態窒素又はアミノ態窒素の濃度が４０〜５８０ｍＭである液体培地。