JP5313913B2 - タバコ特有のニトロサミン類に選択性を有する分子インプリントポリマーおよびその使用方法 - Google Patents

Description

一般的に本発明は、分子インプリントポリマーおよび当該ポリマーのニコチン代謝体の生物的分析および分離に使用することに関する。より具体的には、本発明は、タバコ特有のニトロサミン類に特異性を有する分子インプリントポリマーに関し、タバコ、タバコ代替え品およびそれらの派生物を処理してその中に含まれる目的の化合物の量を減少させるために当該ポリマーを使用することを含む。

医学、食事、環境および化学の分野において、関連する物質の複雑な混合物から特定の物質を選択的に分離する必要性が高まっている。その目的は、１つ以上の特定の化合物の定量的抽出、それら化合物の濃度の測定、または多成分混合物からの目標化合物の選択的除去などがある。

より厳しさを増した健康管理によって、広範囲に亘って日常的に使用されている特定の物質から有害な生成物および代謝産物を厳密かつ選択的に定量することができる方法の要求が高まっている。特に懸念されているのは、タバコ由来製品の使用に関連する化合物であり、これらの化合物は、未処理のタバコ葉に元来存在するまたは喫煙中に発生するものである。ニトロサミン類などのニトロソ基含有化合物は、この点に関して特に顕著なものと見なされている。

喫煙による危険を減少させるために、神経刺激性の物質、ニコチンのみを含む特定の医薬品が製造されており、その化学的作用は、喫煙材の依存性の原因であるとされている。

禁煙セラピーのためにニコチン処方の中で、ニコチンチューイングガムは、最も広く使用されている。製造中に必要とされる品質管理は、ニコチン量の監視および一次ニコチン酸化物、例えばコチニン、ミオスミン、ニコチン−シス−Ｎ−オキシド、ニコチン−トランス−Ｎ−オキシドおよびベータ−ニコチリンなどの監視である。場合によっては、ノルニコチン、アナタビンおよびアナバシンの定量化も望まれる。このような監視および定量化の方法および材料の改善が当業界で必要とされている。このような紙巻きタバコ代替え製品の使用は、体内組織中にニコチンが存在している間、自然な代謝工程によって体内でニトロサミンニコチン代謝体を生成させる。これらの代謝体のレベルは、ほとんどの分析方法が定量的に行い得る濃度以下の状態にある。従って製品製造中に使用する方法および材料に加えて、低レベルの生体内のニコチン代謝体を監視する方法の改善も必要とされている。

より新しい製品に関連した必要性と共に、従来のタバコ製品もタバコまたはタバコ煙からの成分を定量化する、減少させるまたは取り除くための方法および材料がを必要としている。そのような成分としては、タバコ特有ニトロサミン類（ＴＳＮＡｓ）およびそれらのアルカノイド前駆体：４−（メチルニトロソアミノ）−１−（３−ピリジル）−１−ブタノン（ＮＫＫ）、４−（メチルニトロソアミノ）−１−（３−ピリジル）−１−ブタナール（ＮＮＡ）、Ｎ−ニトロソノルニコチン（ＮＮＮ）、Ｎ−ニトロソアナバシン（ＮＡＢ）、Ｎ−ニトロソアナタビン（ＮＡＴ）、４−（メチルニトロソアミノ）−１−（３−ピリジル）−１−ブタノール（ＮＮＡＬ）、４−（メチルニトロソアミノ）−４−（３−ピリジル）−１−ブタノール（イソ−ＮＮＡＬ）および４−（メチルニトロソアミノ）−４−（３−ピリジル）ブタン酸（イソ−ＮＮＡＣ）などが挙げられる。

人間の生体液中に存在するこれらの化合物の量を適切に定量するために、アルカノイド類、特にタバコのニトロシル化された分解生成物および代謝体を分析するための方法が開発されている。この分析に使用される既存のクロマトグラフィーによる分離および抽出方法は、母集団をスクリーニングする際に生じる非常に多くの数のサンプルを扱うために必要とされる頑丈さ、感度および速度に欠ける。既存の方法では、通常、１ミリリットル当たり数ピコグラム存在する低濃度のニトロサミン類は、多段階抽出によって調製される広範囲のサンプルを必要とし、場合によっては分析前に検体の化学的誘導体化（例えば、質量分析前の重水素化を必要とする。この複雑な工程の理由の１つとして、既存の分離材料は、問題の代謝産物に対して例えば抗体または生体受容体ほど選択的ではなく、むしろ分離作用において代謝体の電荷または疎水性のような物理化学的特性に依存していることが挙げられる。これらの物理化学的特性は、サンプル中の多くの他の関係ない分子と共有されている場合がある。従って、ＴＳＮＡ類の分析用に素早くかつ簡単に行える方法は、まだ対処されておらず、医学的分析において必要とされている。

ここ数年、分子インプリントによって調製された材料（分子インプリントポリマーまたはＭＩＰ）による小さな分子の選択的な認識に関する多くの報告がある。ＭＩＰは、目標とする化合物と選択的に結合するように調製された反応部位を有するポリマーである。非共有的に調製された分子インプリントポリマーは、治療薬、糖、ヌクレオチド塩基およびペスチサイドならびにステロイドおよびペプチドホルモンを含む様々な小さな分子の不斉認識に使用されている。いくつかのインプリント材が示す目標検体に対する高度な親和性および選択性は、対応する免疫アフィニティー（ＩＡ）フェーズと同等であることを正当化した。しかしながら、後者のフェーズとは対照的にＭＩＰ材は、調製が簡単で、ほとんどの媒体で安定しており、長期間に亘って再利用可能である。従って、ＭＩＰ材のクロマトグラフィーによる分離（連続式またはバッチ式）または化学的検知、もしくは特異的な検定に利用することが、現在、調査されている。

また別の用途として、生体サンプルまたは複合マトリックス中に低濃度で存在する検体の固相抽出（ＳＰＥ）がある。ＳＰＥによって、既存の方法では達成し得ないレベルの検体の選択的な濃縮および浄化が可能になる。分子インプリント固相抽出（ＭＩＰＳＥ）は、生体分析、食品分析および環境分析に使用されている。これらの例において、検体の選択的な濃縮および浄化が行われ、後続のクロマトグラッフィック（例えばＨＰＬＣ）または質量分析定量を高精度に行え、それらの検出限界（ＬＯＤ）を下げることができる。

目標分子または目標分子群に対する良好な親和性と組み合わされた高度な選択性によって、ＭＩＰは食品品質を向上させるためのツールとして食品業界からかなりの注目を集めている。ここでは、食品マトリックスから不必要な成分を選択的に除去するためにＭＩＰを使用することが要求される。これらの成分は、低濃度で存在する場合が多いので、ＭＩＰの飽和容量は、限定要因にはならない。

参照によって本明細書中に引用されるＷＯ０５／１１２６７０によれば、ＭＩＰ材を尿などの複合マトリックスから最も一般的なニトロシル化されたニコチン誘導体を選択的に吸着することができるようにして、定量的に回収し、化学的濃度の見積もりに誤差を少なくするのが好ましい。ＷＯ０５／１１２６７０の例は、メタクリル酸（ＭＡＡ）、トリフルオロメタクリル酸（ＴＦＭＡＡ）、４−ビニル安息香酸および４−ビニルベンゼンスルホン酸などの酸性または高酸性テンプレートモノマーを用いて調製されるＭＩＰに限定されている。定量化に加えて、タバコ、タバコ代替え品またはこれらの混合物を含む消費材の有害性を目標化合物の量を減少させることによって低減する試みもよく知られている。このような有害性の低減は、材料自体または抽出物などの派生物中で行うことができる。またこの低減は、これら材料の熱分解生成物、即ち燃焼によって生じる主流煙または副流煙または材料をその燃焼温度未満に加熱することによって発生するエアロゾル中で行うことも可能である。この種の低減によく知られている方法の１つとして、これら材料の熱分解生成物を不必要な成分を吸着するフィルターと接触させることが挙げられる。これとは別の方法としては、例えば米国特許第５，６０１，０９７号に開示されているような材料を溶媒を使用して抽出するものがある。この特許によれば、界面活性剤を含む溶液でタバコを処理し、ポリペプチドを抽出し、溶液から界面活性剤とポリペプチドを除去し、溶液をタバコと再度結合させてタバコ材のプロテイン含有量を減少させている。またＷＯ０１／６５９５４号は、タバコを超臨界二酸化炭素などの超臨界抽出液と接触させてニトロサミン類を選択的に減少または除去する方法を開示している。

これらの方法は、タバコ自体またはタバコ代替え品、即ち喫煙、噛むまたは吸引するに拘わらずタバコと同様に消費することができる天然のタバコと類似の特性を有する天然または合成材料の両方に等しく適用できる。

Ｌｉｕ， Ｙ．等による“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｌｙ ｉｍｐｒｉｎｔｅｄ Ｓｏｌｉｄ−Ｐｈａｓｅ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｓｏｒｂｅｎｔ ｆｏｒ Ｒｅｍｏｖａｌ ｏｆ Ｎｉｃｏｔｉｎｅ ｆｏｒｍ Ｔｏｂａｃｃｏ Ｓｍｏｋｅ， Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｌｅｔｔｅｒｓ， Ｖｏｌ． ３６， Ｎｏ．８（２００３）”の１６３１−１６４５頁に報告されているようなＭＩＰを用いてタバコ煙からニコチンを除去する試みがなれされている。この論文に記載されているＭＩＰは、ニコチンと結合するように設計されており、これより有毒なニコチン代謝体であるニトロサミンと結合するようには設計されていない。実際のところデータを作成する科学的方法がキーとなる制御−チェックエレメントに欠けるので、このＭＩＰがニコチンに対して選択性を有するのか不明である。ＷＯ０５／１１２６７０号に記載されているようにＭＩＰのＴＳＮＡ類に対する選択性は、タバコ生成物を処理するのに使用でき、これによりタバコ生成物から１つ以上のニトロソ基含有化合物の量を減少させる。このようなＭＩＰは、タバコ生成物の消費に一般的に関連する体内のＴＳＮＡ類の分析および定量化ならびに非タバコ製品の調製および評価にも使用できることが判っている。従って、進歩はしているもののニコチンおよびニコチン代謝体の分野において、新規なＭＩＰおよびこれを使用した方法が当業界では必要とされている。

本発明は、特にニトロソ基含有化合物に選択性を有する新規なＭＩＰを提供することによって当業界の要求を満たすものである。

本発明のＭＩＰは、フリーラジカル重合開始剤を含む重合媒体中で、ニトロサミンの構造的類似体の存在下で、１つ以上の中性の官能性モノマーと疎水性架橋剤とを共重合させ、その後テンプレートを除去することによって得ることができる。

また本発明は、化学センサーの分析サンプルの前処理用にクロマトグラフィーの分析および予備抽出用にまたはニコチン含有物質または装置からＴＳＮＡ類を抽出するための固相フィルターとして使用することを含む。

１つの態様によれば、少なくとも１つのタバコ特有のニトロサミン（ＴＳＮＡ）に対して選択的な分子インプリントポリマーが提供され、このポリマーは、ＴＳＮＡまたはその構造類似体と、中性の官能性モノマーと疎水性の架橋剤とを含む材料を用いて調製されている。ＴＳＮＡの構造類似体は、ＴＳＮＡのエナミン類似体、ＴＳＮＡのスルホンアミド類似体またはＴＳＮＡのアミド類似体、例えばホルムアミド類似体などが使用できる。中性官能モノマーは、２−ヒドロキシメチルメタクリレート（ＨＥＭＡ）、アクリルアミド、メタクリルアミド、グリセロールモノアクリレートおよびグリセロールモノメタクリレートからなる群から選択することが可能である。疎水性の架橋剤は、エチレングリコールジメタクリレート（ＥＤＭＡ）、トリメチロールプロパントリメタクリレート（ＴＲＩＭ）およびジビニルベンゼン（ＤＶＢ）からなる群から選択することができる。本発明のこの態様では、ポリマーは、ＮＮＫ、ＮＮＡ、ＮＮＮ、ＮＡＢ、ＮＡＴ、ＮＮＡＬ、イソ−ＮＮＡＬまたはイソ−ＮＮＡＣに対して選択性を有する。

本発明の別の態様では、喫煙品が提供され、この喫煙品は、喫煙材と上述の態様による分子インプリントポリマーとを含む。

本発明の別の態様では、煙用フィルターは、上述の分子インプリントポリマーを含んでもよい。

本発明の別の態様によれば、サンプル中のニトロサミンを少なくとも検出、定量化および分離の内の１つを行えるようにキットが上述の分子インプリントポリマーとこれを使用するためのインストラクションを含んでもよい。

本発明の別の態様によれば、ＴＳＮＡ類に対して選択性を有する分子インプリントポリマーを調製する方法が提供され、この方法は、ニトロサミンの構造的類似体の存在下で、フリーラジカル重合開始剤を含む重合媒体中で、１つ以上の中性の官能モノマーと疎水性架橋剤とを共重合させてＴＳＮＡの構造類似体に結合する分子インプリントポリマーを作製する工程と、分子インプリントポリマーからＴＳＮＡの構造類似体を除去する工程とを含む。

本発明のさらなる態様によれば、タバコ生成物中の少なくとも１つのＴＳＮＡの量を減少させる方法が提供され、この方法はタバコ生成物を本発明の分子インプリントポリマーで処理することを含む。タバコ生成物は、タバコ、タバコ代替え品またはこれらの混合物を含む材料を例えば材料の燃焼温度未満の温度にまで加熱して熱分解することによって、材料を燃焼させることによってまたはタバコ、タバコ代替え品またはこれらの混合物を含む材料を溶媒と接触させて製してもよい。

本発明のさらなる態様によれば、タバコ材の製造方法が提供され、この方法は、タバコ、タバコ代替え品またはこれらの混合物を含む材料を溶媒で処理して抽出物を製する工程と、この抽出物を本発明の分子インプリントポリマーと接触させて抽出物中の分子インプリントポリマーの量を減少させる工程と、処理された抽出物と抽出されたタバコ材を組み合わせる工程とを含む。

本明細書において、「タバコ生成物」は、タバコ（タバコ葉または茎を含む）またはタバコ代替え品またはタバコとタバコ代替え品とのブレンドを含む材料およびこのような材料の派生物、例えばこの材料の抽出物、この材料を熱分解することによって得られる煙およびこの材料を燃焼温度未満の温度に加熱して得られるエアロゾルを意味する。

タバコ生成物がタバコまたはタバコ代替え品を含む材料の熱分解によって得られる派生物である場合、この分解は、従来の紙巻きタバコで行われる材料の分解、または喫煙者によって吸引されるエアロゾルを製するためにいくつかの既に知られている代替えタバコ製品で使用される工程に従って材料をその燃焼温度未満の温度に加熱することによって行われる。

これとは別にタバコ生成物は、タバコまたはタバコ代替え品を含む材料を溶媒と接触させることによって得られる派生物であってもよい。特に本発明は、喫煙用の材料を製造する方法を提供し、この方法は、喫煙可能な材料を溶媒で抽出する工程と、少なくとも１つのニトロソ基含有化合物に対して選択性を有するＭＩＰで抽出物を処理して、抽出物中のニトロソ基含有化合物の量を減少させる工程と、処理された抽出物と喫煙可能な材料とを組み合わせる工程とを含む。

この工程において、この喫煙可能な材料は例えば、微粉、葉柄、スクラップ、切断された葉身、刻まれた葉柄またはこれらのあらゆる組み合わせなどのあらゆる形態のものであってもよい。溶媒は、メタノール、エタノールまたは超臨界二酸化炭素液などの超臨界液体抽出媒体などの水性または非水性のものであってもよい。抽出は、タバコから窒素含有化合物を抽出するのに好ましいあらゆる条件下で行うことができる。

また本発明は、タバコまたはタバコ代替え品とその熱分解生成物から少なくとも１つのニトロソ基含有化合物の除去に選択性を有するＭＩＰとを含む喫煙品を含む。

本発明の喫煙品は、例えば紙巻きタバコ、シガーまたはシガリロなどのあらゆる従来の形態のものであってもよい。特に喫煙品は、フィルターを付きまたはフィルター付きでない任意にラッパーで巻かれた喫煙材ロッドを含む。ラッパーは、紙、タバコ葉、再生タバコまたはタバコ代替え品からなってもよい。これとは別に例えば喫煙品が副流煙の低減または主流煙中の熱分解物の量を低減することを意図するものである場合、ラッパーは、セラミック材などの非燃焼性無機材で構成してもよい。フィルターは、例えば繊維性セルロースアセテート、ポリプロピレンまたはポリエチレン、または紙などのあらゆる好適な材料であればよい。

喫煙材は、タバコであることが好ましいが、非タバコ喫煙材などのタバコ代替え品であってもよい。非タバコ代替え品としては、乾燥および硬化された果実材などの植物系材料およびアルギン酸塩およびグリセロールなどのエアロゾル発生物質から得られる合成喫煙材であってもよい。また喫煙材は、タバコおよび非タバコ喫煙材のブレンドを含んでもよい。喫煙材がタバコを含む場合、タバコは、空気、直火、火力、日光で硬化された葉身または葉柄であってもよく、あらゆる好適な方法を用いて処理されたものであってもよい。例えば、タバコは、裁断、刻み、膨張または再生タバコであってもよい。また喫煙材は、土壌改良剤、着色剤、湿潤剤（グリセロールおよびプロピレングリコール）、不活性充填材（チョークなど）および風味剤（糖、甘草およびココア）などの従来使用されている添加剤を含んでもよい。

また本発明は、吸煙以外の吸収、噛むまたは鼻からの摂取による経口または経鼻消費を意図したタバコにも適用可能である。このような製品としては、嗅ぎタバコまたは噛みタバコなどがある。

本発明のＭＩＰは、喫煙材に組み込んでもよい。従って本発明は、喫煙材の熱分解生成物から少なくとも１つのタバコ特有のニトロサミンの除去に選択的なＭＩＰを含有する喫煙材を含む。これとは別に喫煙品がラッパーに包まれた喫煙材ロッドを含む場合、ＭＩＰをラッパーに組み込んでもよい。従って本発明は、喫煙材の熱分解生成物から目標とする化合物の除去に選択的な分子インプリントポリマーを含む喫煙品用ラッパー材を含む。ラッパーは、紙などのセルロース系材料または再生タバコなどのタバコ系材料であってもよい。

本発明の好ましい喫煙品は、タバコロッドと、喫煙材の熱分解生成物から少なくとも１つのタバコ特有のニトロサミンを選択的に除去する分子インプリントポリマーを含むフィルターとを含む紙巻きタバコである。

また本発明は、喫煙材の熱分解生成物から少なくとも１つのタバコ特有のニトロサミンを選択的に除去する分子インプリントポリマーを含む煙用フィルターを含む。この煙用フィルターは、喫煙品とは別個に作製してもよく、例えば紙巻きタバコまたはシガー用のホルダーとして作製してもよく、またはフィルター付き紙巻きタバコとして喫煙品に組み込んでもよい。

紙巻きタバコ用の煙フィルターは、いかなる従来の形状のものであってもよい。例えば、セルロースアセテートなどの繊維状フィルター材のセクションを含む「ダルメシアン」型のフィルターであってもよく、ＭＩＰが粒状である場合、このセクション全体に配される。これとは別にフィルターは、「キャビティー」型フィルターであってもよく、このフィルターは、繊維性フィルター材の２つの隣接するセクションの間にＭＩＰが位置する複数のセクションを含む。またこの煙フィルターは、イオン交換樹脂、ゼオライト、シリカ、アルミナまたはアンバーライトなどの他の吸着剤を含んでもよい。

使用の際、煙はフィルター内を通過し、ＭＩＰは煙から目標化合物を選択的に吸着、保持し、ろ過された煙が喫煙者に送達される。

本発明の煙フィルターおよび喫煙品は、使用時にＭＩＰが煙に晒されるのを防ぐまたは減少させる保護手段を含んでもよい。これは多くの異なる方法で行うことができる。例えば、煙フィルターが煙の蒸気相または粒状相から物質を吸着するためのフィルターエレメントを含んでもよい。このようなフィルターエレメントは、活性炭などの一般的な吸着剤を含んでもよく、活性炭は、糸、粒子、粉、布または紙などのあらゆる従来の形態のものであってもよい。またフィルターエレメントは、イオン交換樹脂、ゼオライト、シリカ、アルミナまたはアンバーライトなどの選択性を有する吸着剤であってもよい。ＭＩＰを保護する手段は、異なる組成の２つ以上のこのようなフィルターエレメントを含んでもよく、例えば第１のフィルターエレメントは、セルロースアセテートからなり、第２のフィルターエレメントは、活性炭からなってもよい。煙フィルターおよび喫煙品に複数のフィルターエレメントを設けることは、よく知られており、あらゆる従来の構成のフィルターおよびそれに関連する形成方法を使用することができる。

インプリントポリマーの合成工程の概要を示す。 タバコ特有のニトロサミンを示す。 ニトロサミン類の等配電子（ｉｓｏｓｔｅｒｉｃ）類似体を示す。 アミドおよびスルホンアミド系目標類似体を示す。 ＮＮＡＬの抽出用のＭＩＰを調製するためにテンプレートとして使用されるエナミン目標類似体（ＭＰＡＰＢ）を示す。 ２−ヒドロキエチルメタクリレートの化学構造を示す。 エチレングリコールジメタクリレートの化学構造を示す。 テンプレート１がホルムアミドであり、テンプレート２がエナミンであり、テンプレート３がスルホンアミドである場合のＮ−ニトロソピペリジンおよびニコチンの抽出結果を示す。 水性溶液から抽出されたＴＳＮＡとニコチンの割合を示す。 水洗浄の際に放出されたＴＳＮＡの割合を示す。 水性溶液から抽出されたＴＳＮＡとニコチンの割合を示す。 水洗浄の際に放出されたＴＳＮＡの割合を示す。 ５つのサンプルを個別に充填した後に保持されなかったニコチンの割合を示す。 ５つのサンプルを個別に充填した後に保持されなかったＮＮＮの割合を示す。 ５つのサンプルを個別に充填した後に保持されなかったＮＮＫの割合を示す。 ５つのサンプルを個別に充填した後に保持されなかったＮＡＴの割合を示す。 ５つのサンプルを個別に充填した後に保持されなかったＮＡＢの割合を示す。 本発明による煙フィルターを有する喫煙品の側面図であり、一部長手方向の断面を示し、また一部を切り欠いて示している。 本発明による別の煙フィルターを有する喫煙品の図１７と類似の図。

図中、類似の特徴には同じ参照番号を付してある。

分子インプリントは、通常、次の工程からなる、（１）目標とされる分子またはその構造類似体であるテンプレート化合物と、選択された１つ以上の官能性モノマーとを溶液中で相互作用させて、テンプレートモノマーコンプレックスを形成する、（２）テンプレートモノマーコンプレックスを架橋モノマーと重合させて、テンプレート化合物を組み込んだ高分子マトリックスを得る、（３）テンプレート化合物を高分子マトリックスから抽出して、目標とする分子の選択的結合に使用することができるＭＩＰを形成する。工程（３）の前にＭＩＰが固体ポリマー（またはモノリス）として調製される場合、これは粉砕され、篩いに掛けられ所望の大きさの粒状材とする。懸濁または乳化重合法によって調製される場合、粒径は重合工程中に所望の範囲内に調整することができるので、粉砕および篩い分けは、必要ない。上述の方法のいずれかで調製された粒状材は、クロマトグラフィーまたは固相分離カラム内に詰め込んで、類似の構造または官能性を有する分子を含む混合物の他の成分からテンプレートをクロマトグラフィーによって分離するために使用される。

テンプレート化合物の除去によって露出した分子インプリントポリマーの反応部位は、目標とする分子の新しい分子との反応に適した立体化学構造である。その結果、分子インプリントポリマーは目標とする分子への選択的結合に使用することができる。

「非共有」ルートが分子インプリント拘束部位を発生させるために広く使用されている。これはテンプレートモノマーコンプレックスを形成するためにテンプレート化合物と官能性モノマーの非共有自己組織化を利用して、次いで架橋モノマーの存在下でフリーラジカル重合を行い、最終的にテンプレート化合物を抽出する。テンプレート分子と好適な１つ以上のモノマーを重合前に共有結合させる共有インプリントは、公知の方法で行うこともできる。上記の方法のいずれかによって形成されたＭＩＰの結合性能は、テンプレート分子の再結合によって調べることができる。

重合は、孔形成溶媒、ポロゲンの存在下で行われる。官能性モノマーとテンプレート化合物間の静電的相互作用を安定化させるために、ポロゲンは、低から中程度の極性の非プロトン性溶媒から多くの場合選択される。ほとんどの場合、テンプレート化合物は、重合媒体に中程度から高度の溶解性を示し、これら化合物またはその構造類似体は、従って、この標準的な工程に直接利用することができる。

目標とする分子自体をテンプレートとして使用することが可能であるが、次のような理由から目標分子の構造的類似体が一般的には好ましい、（ａ）目標分子は、重合条件下で不安定である、または重合を阻害する（ｂ）目標分子はその合成の複雑さまたはコスト的にまたはその両方の点で十分な量を入手しいにくい、（ｃ）テンプレートが予備重合混合物に不溶性または溶けにくい、（ｄ）ＭＩＰが使用中ＭＩＰから流出するポリマーマトリックスの進入しにくい領域に保持された低レベルの目標分子によって汚染されたままになる、および／または（ｅ）目標検体が著しい健康上のリスクを呈し、テンプレートとして使用すべきではない。ニトロソ基含有化合物、特に下記に述べるＴＳＮＡ類として知られている化合物の場合、その機能的類似化合物をテンプレートとして使用するのがより便利である場合がよくある。例えば、スルホンアミド、エナミンまたはアミド、例えばホルムアミド、ＴＳＮＡ類の誘導体は、テンプレート化合物になり得る、図２参照。

ＭＩＰが目標化合物の機能的類似体を用いて得られる場合、その機能的類似体は、等配電子性でなければならず、好ましくは目標化合物と等電性であり、またはその機能的類似化合物は、強い相互作用が起きやすい目標化合物の下部構造を含んでもよい。

ここで言う分子の「構造的類似体」は、元の分子とは同一ではないが、分子の形状、電子配分またはその他の特性の点で元の分子の一部または全てと部分的にまたは全体的に類似していることを意味する。

一般式Ｏ＝Ｎ−Ｎ（Ｒ_１）（Ｒ_２）で表されるニトロソ基含有化合物、特にニトロサミン類は、タバコおよびタバコ煙の多くの成分の中で、喫煙者に有害であると示唆されているものである。本発明が注目しているのは、タバコ中に自然に発生する一群のニトロサミン類である、図２参照。

ニトロサミン類を目標とするための可能な等配電子類似物を図３に示す。図に示した分子は、親化合物であるアミンの全ての誘導体であり、第２級アミンおよび対応するアルデヒドまたは酸塩化物から単独の工程で合成される。エナミンの分子モデル（図４Ｂ）は、良好な立体相補性を有することが示されている。

ＷＯ０５／１１２６７０に記載されているＭＩＰは、分析溶液、分析体、分析流体および分析タバコ材から多くのニコチン代謝体を分析および抽出するために使用すると、有望な結果が得られることを示している。しかしながら、ＴＳＮＡ類は、特定の狭い分野に限られているので、様々な材料からこれらの化合物を回収するための新しい方法が、現在模索されている。この点に関し、新しい材料および方法を用いたＭＩＰの形成が評価されている。

新しいＭＩＰの設計は、好適なテンプレートの選択から始まった。上記したようにテンプレートは、ポリマーに選択性を付与し、理想的には化学的に安定し、入手が容易であり、取り扱いが容易であり、かつ選択的結合性を付与するものでなければならない。本発明の１つの目標は、人体がニトロサミン類に晒されるのを減少させることであるので、ニトロサミン類は、可能なテンプレートではない。その代わり、ホルムアミド類、エナミン類およびスルホンアミド類（図２参照）は、それらの類似の幾何学的特徴および同じ場所に部分的に負の電荷を保持していることを考えると、ニトロソ基を置換するのに使用することができるようである。

モノマー、架橋剤および重合条件（例えば、溶媒またはポロゲン、重合開始剤、および温度）は、最終的なＭＩＰの特性に影響を与える。評価したモノマーは、酸性ＭＡＡおよび中性モノマー２−ヒドロキシエチルメタクリレート（ＨＥＭＡ）である、図５参照。最終的にポリマーの大半を構成する架橋剤も、ポリマーが親水性になるか、疎水性になるかに影響を与える。従って、親水性架橋剤ＰＥＴＲＡおよび疎水性ＥＤＭＡを評価した、図６参照。重合のために熱および光化学反応開始性を評価した。最初の実験では、エナミンまたはスルホンアミドがインプリントされ、ＵＶ重合で調製された中性の疎水性ＭＩＰは、驚異的な結果を示した。次に酸と親水性ＭＩＰの比較を含む分析を行った。結果を以下に要約する。

本発明をいくつかの実施例を参照し、より具体的に説明するが、これは説明のためのものであり、本発明を限定するものではない。本発明は、テンプレート分子、有機または水性系に存在するＴＳＮＡ類に結合するように設計されたポリマー材および最終的にはこのポリマーの使用、例えば分析サンプルの予備処理のためのクロマトグラフィーおよび化学センサーでの分析または予備分離に使用することに言及する。特に明記しない限り、材料は市販されているもの、または従来の技法により調製することができるものである。

実施例１：評価のためのＭＩＰの調製

３つのテンプレート（ホルムアミド、エナミン、スルホンアミド）、２つのモノマー（酸性および中性）および２つの架橋剤（親水性または疎水性）の全ての可能な組み合わせを表す１２種類のＭＩＰを調製した。水にＮ−ニトロソピペリジンと（−）−ニコチンを１：１で混合した混合物を用いて、これらのＭＩＰを評価した。インプリントされていない参照ポリマーを生成し、同様の条件で評価した。結果の概要を図７に示す。エナミンおよびピリジンカルビノールテンプレートの調製例および本発明の目的に使用することができる方法のさらなる説明は、ＷＯ０５／１１２６７０に記載されている。

図７に証明されているように、酸性モノマーを使用したＭＩＰは、多量のニコチンを捕捉する。ニコチンレベルに影響を与えないまま、ＴＳＮＡ類を選別して除去する用途の場合、このようなモノマーは、あまり好ましくない。さらに疎水性架橋剤を含むＭＩＰは、親水性ＭＩＰより良好なニトロサミン類捕捉性能を有することが判る。

実施例２：分析的比較のためのＭＩＰの調製

図７に示したように中性の疎水性ＭＩＰが驚異的な性能を示したことから、エナミンまたはスルホンアミドテンプレートがインプリントされ、紫外線で重合された中性の疎水性ＭＩＰを選択し、さらに分析した。比較のために最も性能のよい疎水性ＭＩＰもサンプルに含めた。７種類のＭＩＰを表１に示すパラメーターを用いて調整した。

実施例３：選択されたＭＩＰのＴＳＮＡ／ニコチン混合物による評価

ＳＰＥカラムを準備した。各カラムは、２５グラムのＭＩＰ１−７をそれぞれ含む。また各カラムに０．３０μｇ／ｍｌの総ＴＳＮＡと０．２μｇ／ｍｌのニコチンを含む水性溶液を１ｍｌ加えた。ＨＰＬＣを使用して、各カラムで抽出されなかったＴＳＮＡの量を測定し、抽出された材料を計算した、図８参照。１ｍｌの水を各カラム内を通過させ、放出されたＴＳＮＡがあれば、その量を測定した、図９参照。図８および図９は、それぞれ２つの実験の平均を示す。

疎水性の中性ＭＩＰの強い性能に基づき、ＭＩＰ１およびＭＩＰ３−７をｐＨが６．３のリン酸緩衝液（イオン強度が０．０９）に０．３０μｇ／ｍｌの総ＴＳＮＡと４μｇ／ｍｌのニコチンを含む試験溶液１ｍｌを用いて、再度評価した。結果を図１０および１１に示し、これらは両方とも２つの実験の平均を示す。これから判るように、ＭＩＰ１、３および４は、１００％のＴＳＮＡを保持し、ほとんどのニコチンが邪魔されずに通過しており、最も良好な性能を示した。

ＭＩＰ１、３および４の性能をｐＨ５．３および７．３でも評価した。ｐＨが増加するにつれて、保持されたニコチンの量は、１０％から３０％に増加し、これはニコチンが影響されるべきではない場合、最適な性能は、わずかに酸性のｐＨのものを使用することによって得られる。酸性モノマーＭＡＡおよび疎水性架橋剤ＥＤＭＡを使用して形成された酸性ＭＩＰもｐＨ６．３で同じ条件で評価し、このＭＩＰは約９０％のニコチンを保持した。

ＭＩＰの再生をＭｅＯＨ洗浄液中で０．５％のＴＦＡを使用して行った。他の酸／アルコール混合物を同じように使用してもよい。

実施例４：特定のＴＳＮＡ類およびニコチンによる選択されたＭＩＰの評価

上記の実験でＭＩＰ１、３および４の驚異的な性能を発見した後、さらなる評価を行った。２５ｍｇの粉砕されたＭＩＰを含むＳＰＥカラムを準備し、１ｍｌの試験溶液を５回カラムに充填した。試験溶液は、ｐＨ６．３のリン酸緩衝液（イオン強度が０．０９）にＮＮＮ、ＮＮＫ、ＮＡＴをそれぞれ約８０ｎｇ／ｍｌ、ＮＡＢを４０ｎｇ／ｍｌおよびニコチンを４μｇ／ｍｌ含むものであった。各サンプルをカラムに充填した後、保持されなかったニコチンおよび各ＴＳＮＡの量をＨＰＬＣを使用して測定した。対照の非インプリントポリマーも評価した。結果を図１２−１６に示す。図から判るように約１０％のニコチンが１回目の充填段階でＭＩＰに捕捉されている。この段階でＭＩＰはニコチンで飽和し、カラムにさらにサンプルを加えたところ、ニコチンはそれ以上ほとんど保持されていない。ＮＮＮは、最も弱くＭＩＰに結合し、２回目の充填でようやく捕捉され始めている。ＭＩＰ１、３および４は、それぞれＮＮＫ、ＮＡＢおよびＮＡＴの保持力に良好な結果を示している。従って、中性官能性モノマー、エナミンまたはスルホンアミドテンプレートおよび疎水性架橋剤の組み合わせは、混合サンプルからのＴＳＮＡに対して驚異的に高い保持力を有し、一方ニコチンはわずかな量しか保持しない。

これらのＭＩＰは、ニコチンに影響を与えずにＴＳＮＡ類をサンプルから除去する用途、例えばＴＳＮＡ類を除去するためのタバコまたはタバコ煙の処理などの用途に特に有用である。さらにこれらのＭＩＰは、物のサンプルまたは患者からのサンプル中のＴＳＮＡの量を測定するための分析キャパシティー（ａｎａｌｙｔｉｃａｌ ｃａｐａｃｉｔｙ）に利用することができる。このような場合、ニコチンが所望の成分である場合、ＭＩＰによって保持されたニコチンの量を定量化することもでき、かつ、他の方法、例えばニコチンに特異性を有するＭＩＰを使用してサンプル中のニコチンの残りの量を定量化することもできる。さらなるニコチンレベルの評価工程を本発明のＴＳＮＡに特異性を有するＭＩＰの使用前または使用後に行ってもよい。

実施例５：タバコ抽出物の処理における本発明のＭＩＰの使用

上述のパラメーターに従って作製されたポリマーをＳＰＥカラム内に組み入れることができ、カラムを必要に応じて調製することができる。ポリマーに使用する中性の官能性モノマーは、例えばＨＥＭＡ、アクリルアミド、メタクリルアミド、Ｎ−メタクリルアミド、グリセロールモノアクリレート、グリセロールモノメタクリレートまたは２−（４−ビニルフェニル）−１，３−プロパンジオールが使用可能である。疎水性架橋剤としては、例えばＥＤＭＡ、ＴＲＩＭ、ＤＶＢ、ｍ−ジイソプロペニルベンゼン、テトラメチレングリコールジメタクリレート、ペンタエリスリトールテトラアクリレート、Ｎ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド、Ｎ，Ｎ’−エチレンビスアクリルアミド、Ｎ，Ｎ’−ブチレンビスアクリルアミド、Ｎ，Ｎ’−ヘキサメチレンビスアクリルアミドなどが使用可能である。他の利用可能な材料も知られており、例えば２００５年にニューヨーク所在のＭａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ社より刊行されたＹａｎ， Ｍ、Ｒａｍｓｔｒoｍ， Ｏ等による“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｌｙ Ｉｍｐｒｉｎｔｅｄ Ｍａｔｅｒｉａｌ：Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ”を参照されたい。

裁断または刻みタバコ葉は、６０℃で１５−２５分間、水で抽出することができる。タバコは、ろ過によって溶液から分離させ、乾燥させる。溶液をＳＰＥカラム内を通過させ、ＴＳＮＡを抽出物から吸着する。その後、カラムの内容物を抜き、溶液を膜蒸発によって濃縮し、その濃縮物を抽出されたタバコと再度組み合わせ、空気中で乾燥させる。ＭＩＰの性能は、０．５％のＴＦＡを含む２ｘ１ｍｌのメタノールを使用してＭＩＰに結合した化合物を溶出することによって評価することができ、ＨＰＬＣ−ＵＶを使用して抽出分析することが可能である。

実施例６：タバコ抽出物の処理における本発明のＭＩＰの使用

連続的な抽出工程を使用して、ＵＳブレンドタイプの刻みタバコ葉を第１の抽出チャンバーに充填し、このチャンバーには超臨界二酸化炭素が供給される。タバコと接触した後、二酸化炭素は本発明によるＭＩＰを含む第２の抽出チャンバー内に供給される。ポリマーと接触させた後、二酸化炭素を第１抽出チャンバーに戻し、再度タバコと接触させる。この循環工程をタバコのＴＳＮＡ含有量が所望のレベルになるまで続けられ、その際二酸化炭素は系から排出され、タバコは第１チャンバーから取り除かれる。第２チャンバーのＭＩＰは、再使用のために再生される。

実施例７：サンプル分析のための本発明のＭＩＰの使用

ＳＰＥカラムを本発明のＭＩＰ２５ｍｇを加えることによって準備する。テストサンプル、例えばＴＳＮＡ類を含んでいると思われる人間の尿５ｍｌをカラムに加える。サンプルをカラム内を通過させて、その後カラムを真空状態にして、全ての液体を取り除き、確実にＭＩＰ材を乾燥させる。ＭＩＰに対して非特異性を有するすべての邪魔な化合物を取り除くために、例えば１ｍｌの蒸留水で洗浄を行う。乾燥後、ＴＳＮＡ類を例えば１ｍｌＤＣＭを使用してＭＩＰから回収し、ＨＰＬＣを使用して定量化することができる。

実施例８：喫煙品における本発明のＭＩＰの使用

図１７および１８にチッピング紙４によって煙用フィルターに装着されたラッパー２に巻かれたタバコのロッド１を有する紙巻きタバコ形状の喫煙品を示す。明確にするためにチッピング紙４をラッパー２から離して示しているが、実際にはこれらは互いに接触している。

図１７において、煙フィルター３は、３つの円筒状フィルターエレメント３ａ、３ｂ、３ｃを含む。フィルターの吸い口端にある第１のフィルターエレメント３ａは、長さが７ｍｍであり、セルロースアセテートトウで構成され、これはその長さに亘って水量ゲージで２５ｍｍの圧力降下を有する７重量％のトリアセチン可塑剤で含浸されている。中央に位置する第２のフィルターエレメント３ｂは、１５０ｍｇの活性炭粒子を含む長さ５ｍｍのキャビティーである。ロッド１に隣接する第３のフィルターエレメント３ｃは、長さが１５ｍｍであり、その長さに亘って水量ゲージで９０ｍｍの圧力降下を有し、８０ｍｇのセルロースアセテートトウを含む。このトウは、４重量％のトリアセチンで含浸され、ダルメシアン式にその容積全体に均一に配分された本明細書で説明したＴＳＮＡ類に特異性を有するＭＩＰを８０ｍｇ有する。

図１８に示す紙巻きタバコは、煙フィルター３が４つの同軸に配置された円筒状のフィルターエレメント３ａ、３ｂ、３ｃおよび３ｄを有する以外、図１７の紙巻きタバコと類似している。紙巻きタバコの吸い口端に位置する第１のフィルターエレメント３ａは、長さが５ｍｍであり、７重量％のトリアセチン可塑剤で含浸されたセルロースアセテートトウで構成されている。第１のフィルターエレメント３ａに隣接して位置する第２のフィルター３ｂは、本明細書で説明したように調製されたＴＳＮＡ類に特異なＭＩＰ２００ｍｇを含むキャビティーである。第２フィルターエレメント３ｂに隣接する第３のフィルターエレメント３ｃは、長さが１０ｍｍで、７重量％のトリアセチンで含浸されたセルロースアセテートトウを含む。第３フィルターエレメント３ｃの間に位置する第４のフィルターエレメント３ｄは、長さが７ｍｍであり、８０ｍｇの粒状活性炭を含む。リング状に配置された換気孔５がチッピング紙の半径方向の面Ａ−Ａに形成されており、この換気孔は、煙が紙巻きタバコを介して吸引される際に第４フィルターエレメント３ｄとの接合部の約３ｍｍ下流の第３フィルターエレメント３ｃ内へ空気を送るものである。

上記の開示事項は、あくまで本発明を例示するためのものであり、本発明を限定するものではない。本発明の精神および本質を包含するここに開示した態様の変形例は、当業者にとって自明のものであるので、本発明は、添付の特許請求の範囲およぶその同等物の範囲内のすべてのものを包含するものであると解釈すべきである。

Claims (27)

1. 少なくとも１つのタバコ特有のニトロサミン（ＴＳＮＡｓ）に対して選択的な分子インプリントポリマーであって、該ポリマーは、
   ＴＳＮＡまたはその構造的類似体と、
   中性の官能性モノマーと、
   疎水性架橋剤とを含む材料を使用して調製されたものである、分子インプリントポリマー。
2. ＴＳＮＡの前記構造的類似体がＴＳＮＡのエナミン類似体であることを特徴とする請求項１記載のポリマー。
3. ＴＳＮＡの前記構造的類似体がホルムアミドなどのＴＳＮＡのアミド類似体であることを特徴とする請求項１記載のポリマー。
4. ＴＳＮＡの前記構造的類似体がＴＳＮＡのスルホンアミド類似体であることを特徴とする請求項１記載のポリマー。
5. 前記中性の官能性モノマーが２−ヒドロキシメチルメタクリレート（ＨＥＭＡ）、アクリルアミド、メタクリルアミド、グリセロールモノアクリレートおよびグリセロールモノメタクリレートからなる群から選択されることを特徴とする請求項１記載のポリマー。
6. 前記疎水性架橋剤がエチレングリコールジメタクリレート（ＥＤＭＡ）、トリメチロールプロパントリメタクリレート（ＴＲＩＭ）およびジビニルベンゼン（ＤＶＢ）からなる群から選択されることを特徴とする請求項１記載のポリマー。
7. ＮＮＫに対して選択性を有することを特徴とする請求項１記載のポリマー。
8. ＮＮＡに対して選択性を有することを特徴とする請求項１記載のポリマー。
9. ＮＮＮに対して選択性を有することを特徴とする請求項１記載のポリマー。
10. ＮＡＢに対して選択性を有することを特徴とする請求項１記載のポリマー。
11. ＮＡＴに対して選択性を有することを特徴とする請求項１記載のポリマー。
12. ＮＮＡＬに対して選択性を有することを特徴とする請求項１記載のポリマー。
13. イソ−ＮＮＡＬに対して選択性を有することを特徴とする請求項１記載のポリマー。
14. イソ−ＮＮＡＣに対して選択性を有することを特徴とする請求項１記載のポリマー。
15. 喫煙材と、
    請求項１乃至１４いずれか１項記載のポリマーと
    を含む喫煙品
16. 請求項１乃至１４いずれか１項記載のポリマーを含む煙用フィルター。
17. 請求項１乃至１４いずれか１項記載のポリマーと、
    サンプル中のニトロサミン類の検出、定量化および分離の内の少なくとも１つを行うために前記ポリマーを使用するためのインストラクションと、
    を含むキット。
18. いくつかのＴＳＮＡ類に対して選択性を有する分子インプリントポリマーの製造方法であって、
    少なくとも１つのＴＳＮＡ構造類似体の存在下で少なくとも１つの中性の官能性モノマーと少なくとも１つの疎水性架橋剤とを少なくとも１つのフリーラジカル重合開始剤を含む重合媒体中で共重合してＴＳＮＡ構造類似体に結合した分子インプリントポリマーを製する工程と、
    前記分子インプリントポリマーからＴＳＮＡ構造類似体を除去する工程と、
    を含む製造方法。
19. 前記官能性モノマーがＨＥＭＡ、アクリルアミド、メタクリルアミド、グリセロールモノアクリレートおよびグリセロールモノメタクリレートからなる群から選択されることを特徴とする請求項１８記載の方法。
20. 前記架橋剤がＥＤＭＡ、ＴＲＩＭおよびＤＶＢからなる群から選択されることを特徴とする請求項１８記載の方法。
21. 請求項１８乃至２０いずれか１項記載の方法によって製せられる分子インプリントポリマー。
22. タバコ生成物中の少なくとも１つのＴＳＮＡの量を減少させる方法であって、請求項１乃至１４いずれか１項記載のポリマーで前記タバコ製品を処理することを含む方法。
23. 前記タバコ生成物がタバコ、タバコ代替え品またはこれらの混合物を含む材料を熱分解することによって得られることを特徴とする請求項２２記載の方法。
24. 前記タバコ生成物が材料をその燃焼温度未満の温度に加熱することによって得られることを特徴とする請求項２２記載の方法。
25. 前記タバコ生成物が材料を燃焼することによって得られることを特徴とする請求項２２記載の方法。
26. タバコ生成物がタバコ、タバコ代替え品またはこれらの混合物を含む材料を溶媒と接触させることによって得られることを特徴とする請求項２２記載の方法。
27. タバコ、タバコ代替え品またはこれらの混合物を含む材料を溶媒で処理して、抽出物を得る工程と、
    この抽出物を請求項１乃至１４いずれか１項記載のポリマーと接触させて、抽出物中のポリマーの量を減少させる工程と、
    処理された抽出物と抽出されたタバコ材を組み合わせる工程と、
    を含むタバコ材の製造方法。

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