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JP5364381B2 - アンミン白金錯体を高濃度で内包するリポソームおよびその製造方法 - Google Patents

アンミン白金錯体を高濃度で内包するリポソームおよびその製造方法 Download PDF

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Description

本発明は、アンミン白金錯体（例えば、シスプラチン）を内包するリポソームおよびその製造方法に関する。詳細には、難水溶性のアンミン白金錯体を内包するリポソームおよびその製造方法に関する。
リポソームは、中空球状の脂質二分子膜構造を有する。従って、その脂質二重膜の内側に水溶性薬物を封入することができる。この理由により、リポソームは、医薬品、農薬、化粧品等の分野で広く研究され、利用されてきた。特に、外膜表面にリガンドを結合したリポソームについては、がん・腫瘍などの標的部位に選択的に薬物や遺伝子などを送達するためのＤＤＳ材料として多くの研究がなされてきた。
しかし、がん・腫瘍の処置に用いる薬剤の多くは難水溶性であり、リポソームに封入できる薬物量は非常に少なかった。たとえば、シスプラチンの場合、水系以外には溶解せず、水系でも常温で約２ｍｇ／ｍｌの飽和濃度しかないため、がん・腫瘍の処置に有効な量の薬剤を患者に投与するためには、投与されるリポソームの量は必然的に多くなるという不都合が存在する。
特許文献１は、シスプラチン、カルボプラチン等の制ガン剤、アスピリン、アセトアミノフェン、インドメタシン等の解熱剤、酢酸コルチゾン等のホルモンなどを含有するリポソーム製剤を記載している。しかし、特許文献１に記載されるリポソーム製剤は、その製造工程に加熱工程を要する。一般に、リポソームは加熱により不安定になることが知られている。従って、特許文献１に記載される方法により製造されたリポソームは不安定である。特許文献１では、リポソームに内包されたシスプラチンの量は、８．９μｇ／ｍｇ 脂質が限度である。従って、特許文献１に記載される方法により製造されたリポソームはわずかな量しかシスプラチンを内包することができなかった。
非特許文献１には、シスプラチンを内包させたリポソームが記載されている。しかし、このリポソームは、１４．０μｇ／ｍｇ脂質ほどしかリポソームを内包することはできなかった。
シスプラチンは、金属錯体の反応性を利用した制がん剤である。白金金属錯体であるシスプラチンは、無電荷の状態でがん細胞膜を透過して細胞内へ移行する。血中の塩化物イオン濃度は、１０３ｍｍｏｌ／ｌであるが、細胞内では４ｍｍｏｌ／ｌに低下することから、シスプラチンの塩化物イオンは水分子に置換され、細胞内では図１Ａに示すような平衡状態にある。
この状態のシスプラチンは細胞内のＤＮＡと図１Ｂに示すような様式で結合し、ＤＮＡの複製を阻害することにより抗がん作用を発揮する。しかし、シスプラチンは腎毒性や難聴などの強い副作用があるので、これらの副作用を軽減させながらも抗がん作用を維持するために種々のシスプラチン誘導体および剤型、ならびに投与方法の開発が試みられてきた。
しかし、水溶性が低いシスプラチンのような薬剤は高濃度でリポソームに内包することができないので、充分な量の薬剤を標的部位に送達させることは未だ成功していない。
従って、難水溶性薬物を大量にリポソームに内包させる技術を開発し、提供することに対して需要がある。
特開平５−２５５０７０号公報 Ｍａｒｙ Ｓ．Ｎｅｗｍａｎ，Ｇａｉｌ Ｔ．Ｃｏｌｂｅｒｎ，Ｐｅｔｅｒ Ｋ．Ｗｏｒｋｉｎｇら、「Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ，ｔｉｓｓｕｅ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ，ａｎｄ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｎｅｓｓ ｏｆ ｃｉｓｐｌａｔｉｎ ｅｎｃａｐｓｕｋｌａｔｅｄ ｉｎ ｌｏｎｇ−ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ， ｐｅｇｙｌａｔｅｄ ｌｉｐｏｓｏｍｅ（ＳＰＩ−０７７） ｉｎ ｔｕｍｏｒ−ｂｅａｒｉｎｇ ｍｉｃｅ」、Ｃａｎｃｅｒ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ（１９９９）４３：１−７頁
本発明は、難水溶性のアンミン白金錯体を大量にリポソームに内包させ、少量の投与で経口投与可能な難水溶性アンミン白金錯体内包リポソームを提供することを課題とする。
上記の課題を解決するために、本発明者等は鋭意研究の結果、アンミン白金錯体の硝酸塩等の水溶性の塩と、リポソーム形成用の脂質懸濁液とを混合してリポソームを製造した後に、塩化物イオン等の難水溶性の錯体を形成させるイオンの存在下に配置することによって、予想外にも、その難水溶性の錯体が、リポソーム内において形成されたことを見出したことによって、本発明を完成させ、上記課題を解決するに至ったものである。
上記目的を達成するために、本発明は、例えば、以下の手段を提供する。
（項目１）
アンミン白金錯体を内包するリポソームを製造する方法であって、該方法は、以下の工程：
Ａ）水溶性アンミン白金錯体、白金錯体原料またはその組合せを提供する工程；
Ｂ）リポソーム、リポソーム原料またはその組合せを提供する工程：および
Ｃ）該水溶性アンミン白金錯体、白金錯体原料またはその組合せと、該リポソーム、該リポソーム原料またはその組合せとを含む混合物を調製し、リポソーム形成維持条件に供する工程であって、ただし、該リポソームが存在する時点で該白金錯体の形成する塩が水溶性の状態である、工程
を包含する、方法。
（項目２）
さらに、Ｄ）前記Ｃ）工程により得られた混合物を、前記白金錯体の形成する塩が難水溶性であるイオンを含む溶液の存在下に供する工程を包含する、上記項目に記載の方法。
（項目３）
前記水溶性アンミン白金錯体が、２つのアンミン基を有する、上記項目に記載の方法。
（項目４）
前記水溶性アンミン白金錯体が、ｃｉｓ−ジアンミンジニトラト白金（ＩＩ）である、上記項目に記載の方法。
（項目５）
Ａ）前記水溶性アンミン白金錯体を、第一緩衝液に溶解し、白金錯体溶液を調製する工程；
Ｂ）前記リポソーム原料を提供する工程であって、
Ｂ−ｉ）リポソーム形成能を有する脂質を、メタノール・クロロホルム溶液に懸濁して攪拌し、該攪拌した溶液を蒸発させ、沈殿物を真空乾燥させることにより脂質膜を得る工程；および
Ｂ−ｉｉ）該脂質膜を、第二緩衝液に懸濁し、脂質懸濁液を形成する工程、を包含する、工程；ならびに
Ｃ）該白金錯体溶液と、該脂質懸濁液とを混合し、前記リポソーム形成維持条件に供する工程
を包含し、ここで、該第一緩衝液および第二緩衝液は、該白金錯体が形成する塩が難水溶性であるイオンを含まない、上記項目に記載の方法。
（項目６）
前Ｂ−ｉｉ）工程に引き続き、前記脂質懸濁液を超音波処理することを含む、上記項目に記載の方法。
（項目７）
前記Ｃ）工程において、前記リポソーム形成維持条件が、前記白金錯体溶液と前記脂質懸濁液との混合物を限外濾過に供することおよび該混合物を一晩静置することからなる群より選択されることを含む、上記項目に記載の方法。
（項目８）
Ａ）前記水溶性アンミン白金錯体を、第一緩衝液に溶解し、白金錯体溶液を調製する工程；
Ｂ）前記リポソームを提供する工程；および
Ｃ）該白金錯体溶液と、該リポソームとを混合し、前記リポソーム形成維持条件に供する工程
を包含し、ここで、該第一緩衝液は、該白金錯体が形成する塩が難水溶性であるイオンを含まない、上記項目に記載の方法。
（項目９）
前記Ｂ）工程において、前記リポソームは、前記水溶性アンミン白金錯体が、リポソーム膜を通過して該リポソーム内に移行し、留まるために充分な組成を有する、上記項目に記載の方法。
（項目１０）
前記リポソーム形成維持条件が、前記リポソームを破壊することなく維持すると同時に、前記水溶性アンミン白金錯体がリポソーム膜を通過して該リポソーム内に移行し、留まるために充分な条件である、上記項目に記載の方法。
（項目１１）
前記リポソームを構成する脂質または前記リポソーム原料が、ジパルミトイルホスファチジルコリン、コレステロール、ガングリオシド、ジセチルホスフェート、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、コール酸ナトリウム、ジセチルフォスファチジルエタノールアミン−ポリグリセリン８Ｇ、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルグリセロールおよびそれらの組合せからなる群より選択される、上記項目に記載の方法。
（項目１２）
前記Ｃ）工程において、前記混合物が、ｐＨ６〜１０の範囲内に調節される、上記項目に記載の方法。
（項目１３）
前記白金錯体の形成する塩が水溶性の状態である条件が、塩化物イオン（Ｃｌ−）、臭化物イオン（Ｂｒ−）、ヨウ化物イオン（Ｉ−）、チオシアン酸イオン（ＳＣＮ−）およびシアン化物イオン（ＣＮ−）からなる群より選択される該白金錯体の形成する塩が難水溶性であるイオンを含まない溶液の存在下におくことである、上記項目に記載の方法。
（項目１４）
前記塩化物イオン（Ｃｌ−）が、０〜４ｍＭの範囲で含まれる、上記項目にに記載の方法。
（項目１５）
前記工程Ｃ）において、前記混合物が、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）−３−アミノプロパンスルホン酸緩衝剤、炭酸緩衝剤、リン酸緩衝剤、２−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］エタンスルホン酸緩衝剤、トリス（ヒドロキシ）アミノメタン緩衝剤、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸緩衝剤、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）１−２−アミノエタンスルホン酸緩衝剤、Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２エタンスルホン酸緩衝剤、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−ヒドロキシ−３−アミノプロパンスルホン酸緩衝剤、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−ヒドロキシプロパンスルホン酸）緩衝剤、Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−ヒドロキシプロパン−３−プロパンスルホン酸緩衝剤、トリス（ヒドロキシメチルメチルグリシン）緩衝剤、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン緩衝剤、２−（シクロヘキシルアミノ）エタンスルホン酸緩衝剤、３−Ｎ−シクロヘキシルアミノ−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸緩衝剤、３−シクロヘキシルアミノプロパンスルホン酸緩衝剤およびそれらの組合せからなる群より選択される緩衝剤を含む、上記項目に記載の方法。
（項目１６）
前記Ｃ）工程において、前記水溶性アンミン白金錯体、白金錯体原料またはその組合せと、前記リポソーム、リポソーム原料またはその組合せとが、１：９〜９：１の範囲内の比で混合される、上記項目に記載の方法。
（項目１７）
前記Ｄ）工程において、前記白金錯体の形成する塩が難水溶性であるイオンが、塩化物イオン（Ｃｌ−）、臭化物イオン（Ｂｒ−）、ヨウ化物イオン（Ｉ−）、チオシアン酸イオン（ＳＣＮ−）およびシアン化物イオン（ＣＮ−）からなる群より選択される、上記項目にに記載の方法。
（項目１８）
前記白金錯体の形成する塩が難水溶性であるイオンが、塩化物イオン（Ｃｌ−）である、上記項目に記載の方法。
（項目１９）
前記塩化物イオン（Ｃｌ−）が、ＮａＣｌ、ＨＣｌまたはＣａＣｌ２より提供される、上記項目に記載の方法。
（項目２０）
前記Ｄ）工程において、前記白金錯体の形成する塩が難水溶性であるイオンが、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）−３−アミノプロパンスルホン酸緩衝液、炭酸緩衝液、リン酸緩衝液、２−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］エタンスルホン酸緩衝液、トリス（ヒドロキシ）アミノメタン緩衝液、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸緩衝液、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）１−２−アミノエタンスルホン酸緩衝液、Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２エタンスルホン酸緩衝液、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−ヒドロキシ−３−アミノプロパンスルホン酸緩衝液、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−ヒドロキシプロパンスルホン酸）緩衝液、Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−ヒドロキシプロパン−３−プロパンスルホン酸緩衝液、トリス（ヒドロキシメチルメチルグリシン）緩衝液、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン緩衝液、２−（シクロヘキシルアミノ）エタンスルホン酸緩衝液、３−Ｎ−シクロヘキシルアミノ−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸緩衝液および３−シクロヘキシルアミノプロパンスルホン酸緩衝液からなる群より選択される緩衝液により提供される、上記項目に記載の方法。
（項目２１）
前記塩化物イオン（Ｃｌ−）が、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）−３−アミノプロパンスルホン酸緩衝液（ｐＨ８．４）、炭酸緩衝液（ｐＨ８．５）、リン酸緩衝液（ｐＨ８．０）および２−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］エタンスルホン酸緩衝液（ｐＨ７．２）からなる群より選択される緩衝液により提供される、上記項目に記載の方法。
（項目２２）
前記Ｄ）工程が、
ｉ）形成されたリポソームを親水性化処理する工程；
ｉｉ）該リポソームへ標的指向性物質を結合させる工程；
ｉｉｉ）該修飾標的指向性物質が結合したリポソームを親水性化する工程ならびに
ｉｖ）該親水性化したリポソームを含む溶液をフィルター濾過をする工程
を包含する、上記項目に記載の方法。
（項目２３）
前記標的指向性物質が、抗体、糖鎖、レクチン、相補的核酸、レセプター、リガンド、アプタマーおよび抗原からなる群より選択される、上記項目に記載の方法。
（項目２４）
前記アンミン白金錯体が、難水溶性である、上記項目に記載の方法。
（項目２５）
ｃｉｓ−ジアミンジクロロ白金（ＩＩ）を内包するリポソームを製造する方法であって、該方法は、以下の工程：
（Ａ１）ｃｉｓ−ジアンミンジニトラト白金（ＩＩ）を、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）−３−アミノプロパンスルホン酸緩衝液に溶解し、ｃｉｓ−ジアンミンジニトラト白金（ＩＩ）を含む溶液を調製する工程であって、該Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）−３−アミノプロパンスルホン酸緩衝液は、塩化物イオン（Ｃｌ−）を含まないか、または塩化物イオン（Ｃｌ−）を０〜４ｍＭの範囲で含む、工程；
（Ａ２）該ｃｉｓ−ジアンミンジニトラト白金（ＩＩ）を含む溶液のｐＨをｐＨ６〜１０に調節する工程；
（Ｂ１）ジパルミトイルホスファチジルコリン、コレステロール、ガングリオシド、ジセチルホスフェート、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミンおよびコール酸ナトリウムを混合させて脂質を調製する工程；
（Ｂ２）該脂質を、メタノール・クロロホルム溶液に懸濁して攪拌し、該攪拌した溶液を蒸発させ、沈殿物を真空乾燥させることにより脂質膜を得る工程；
（Ｂ３）該脂質膜を、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）−３−アミノプロパンスルホン酸緩衝液（ｐＨ６〜１０）に懸濁させて脂質懸濁液を作製する工程であって、該Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）−３−アミノプロパンスルホン酸緩衝液は、塩化物イオン（Ｃｌ−）を含まないか、または塩化物イオン（Ｃｌ−）を０〜４ｍＭの範囲で含む、工程；
（Ｂ４）該脂質懸濁液を３０℃〜４０℃で攪拌させ、窒素置換し、超音波処理する工程；および
（Ｃ１）ｐＨが調節された該ｃｉｓ−ジアンミンジニトラト白金（ＩＩ）溶液と、超音波処理した脂質懸濁液とを、１：９〜９：１の範囲内の比で混合して、分画分子量５００〜３００，０００で限外濾過に供する工程
を包含する、上記項目に記載の方法。
（項目２６）
ｃｉｓ−ジアミンジクロロ白金（ＩＩ）を内包するリポソームを製造する方法であって、該方法は、以下の工程：
（Ａ１）ｃｉｓ−ジアンミンジニトラト白金（ＩＩ）を、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）−３−アミノプロパンスルホン酸緩衝液に溶解し、ｃｉｓ−ジアンミンジニトラト白金（ＩＩ）を含む溶液を調製する工程であって、該Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）−３−アミノプロパンスルホン酸緩衝液は、塩化物イオン（Ｃｌ−）を含まないか、または塩化物イオン（Ｃｌ−）を０〜４ｍＭの範囲で含む、工程；
（Ａ２）該ｃｉｓ−ジアンミンジニトラト白金（ＩＩ）を含む溶液のｐＨをｐＨ８．４に調節する工程；
（Ｂ１）リポソームを提供する工程；および
（Ｃ１）ｐＨが調節された該ｃｉｓ−ジアンミンジニトラト白金（ＩＩ）溶液と、該リポソームとを、１：９〜９：１の範囲内の比で混合して、分画分子量５００〜３００，０００で限外濾過に供する工程
を包含する、上記項目に記載の方法。
（項目２７）
水溶性アンミン白金錯体、白金錯体原料またはその組合せと、リポソーム、リポソーム原料またはその組合せとを混合して、リポソーム形成維持条件に供することによって得ることができる、アンモニアを有するアンミン白金錯体を内包するリポソーム。
（項目２８）
前記水溶性アンミン白金錯体と、前記リポソームとを混合して、リポソーム形成維持条件に供することによって得ることができる、上記項目に記載のリポソーム。
（項目２９）
前記水溶性アンミン白金錯体と、前記リポソーム原料とを混合して、リポソーム形成維持条件に供することによって得ることができる、上記項目に記載のリポソーム。
（項目３０）
アンモニアを有するアンミン白金錯体が、１ｍｇ脂質あたり０．３μｇ以上で含まれる、アンミン白金錯体を内包するリポソーム。
（項目３１）
前記アンモニアを有するアンミン白金錯体が、１ｍｇ脂質あたり９μｇ以上で含まれる、上記項目に記載のリポソーム。
（項目３２）
前記アンモニアを有するアンミン白金錯体が、１ｍｇ脂質あたり１７μｇ以上で含まれる、上記項目に記載のリポソーム。
（項目３３）
アンモニアを有するアンミン白金錯体が、１ｍｇリン脂質あたり１００μｇ以上で含まれる、アンミン白金錯体を内包するリポソーム。
（項目３４）
アンモニアを有するアンミン白金錯体が、リポソーム１ｍｌあたり３９μｇ／ｍｌ以上で含まれる、アンミン白金錯体を内包するリポソーム。
（項目３５）
アンモニアを有するアンミン白金錯体が、リポソーム１個あたり３×１０−１０μｇ以上で含まれる、アンミン白金錯体を内包するリポソーム。
（項目３６）
前記アンミン白金錯体が、２つのアンモニアを有する、上記項目に記載のリポソーム。
（項目３７）
前記アンミン白金錯体が、ｃｉｓ−ジアミンジクロロ白金（ＩＩ）の水溶性形態である、上記項目に記載のリポソーム。
（項目３８）
前記アンミン白金錯体が、ｃｉｓ−ジアミンジクロロ白金（ＩＩ）である、上記項目に記載のリポソーム。
（項目３９）
前記アンミン白金錯体を内包するリポソームが、ジパルミトイルホスファチジルコリン、コレステロール、ガングリオシド、ジセチルホスフェート、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、コール酸ナトリウム、ジセチルフォスファチジルエタノールアミン−ポリグリセリン８Ｇ、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルグリセロールおよびそれらの組合せからなる群より選択される脂質を含む、上記項目に記載のリポソーム。
（項目４０）
前記アンミン白金錯体を内包するリポソームが、標的指向性物質をさらに含む、上記項目に記載のリポソーム。
（項目４１）
前記標的指向性物質が、抗体、糖鎖、レクチン、相補的核酸、レセプター、リガンド、アプタマーおよび抗原からなる群より選択される、上記項目に記載のリポソーム。
（項目４２）
がんまたは腫瘍を処置するための組成物であって、該組成物は、アンモニアを有するアンミン白金錯体を内包するリポソームを含み、該リポソームは、水溶性アンミン白金錯体、白金錯体原料またはその組合せと、リポソーム、リポソーム原料またはその組合せとを混合して、リポソーム形成維持条件に供することによって得ることができる、組成物。
（項目４３）
がんまたは腫瘍を処置するための組成物であって、該組成物は、アンモニアを有するアンミン白金錯体を内包するリポソームを含み、該リポソームは、該アンミン白金錯体が、１ｍｇ脂質あたり０．３μｇ以上で含まれる、組成物。
（項目４４）
前記アンミン白金錯体が、２つのアンモニアを有する、上記項目に記載の組成物。
（項目４５）
前記アンミン白金錯体が、ｃｉｓ−ジアミンジクロロ白金（ＩＩ）の水溶性形態である、上記項目に記載の組成物。
（項目４６）
前記アンミン白金錯体が、ｃｉｓ−ジアミンジクロロ白金（ＩＩ）である、上記項目に記載の組成物。
（項目４７）
前記アンミン白金錯体を内包するリポソームが、ジパルミトイルホスファチジルコリン、コレステロール、ガングリオシド、ジセチルホスフェート、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、コール酸ナトリウム、ジセチルフォスファチジルエタノールアミン−ポリグリセリン８Ｇ、パルミトイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルグリセロールおよびそれらの組合せからなる群より選択される脂質を含む、上記項目に記載の組成物。
（項目４８）
前記アンミン白金錯体を内包するリポソームが、標的指向性物質をさらに含む、上記項目に記載の組成物。
（項目４９）
前記標的指向性物質が、抗体、糖鎖、レクチン、相補的核酸、レセプター、リガンド、アプタマーおよび抗原からなる群より選択される、上記項目に記載の組成物。
（項目５０）
がんまたは腫瘍を処置するための方法であって、該方法は、がんまたは腫瘍を処置する必要のある哺乳動物に、該がんまたは腫瘍を処置するのに有効な量の、アンモニアを有するアンミン白金錯体を内包するリポソームを投与する工程を包含し、ここで、該リポソームは、水溶性アンミン白金錯体、白金錯体原料またはその組合せと、リポソーム、リポソーム原料またはその組合せとを混合して、リポソーム形成維持条件に供することによって得ることができる、方法。
（項目５１）
がんまたは腫瘍を処置するための方法であって、該方法は、がんまたは腫瘍を処置する必要のある哺乳動物に、該がんまたは腫瘍を処置するのに有効な量の、アンモニアを有するアンミン白金錯体を内包するリポソームを投与する工程を包含し、ここで、該リポソームは、該アンミン白金錯体が、１ｍｇ脂質あたり０．３μｇ以上で含まれる、方法。
（項目５２）
前記アンモニアを有するアンミン白金錯体を内包するリポソームが、静脈内投与、皮下投与、経口投与，局所投与、または腹腔内投与により投与される、上記項目に記載の方法。
（項目５３）
前記アンモニアを有するアンミン白金錯体を内包するリポソームが、少なくとも白金錯体１．５μｇ／ｇ体重の用量で投与される、上記項目に記載の方法。
（項目５４）
前記がんまたは腫瘍が、睾丸腫瘍、膀胱癌、腎盂腫瘍、尿管腫瘍、前立腺癌、卵巣癌、頭頸部癌、非小細胞肺癌、食道癌、子宮癌、神経芽細胞種および胃癌からなる群より選択される、上記項目に記載の方法。
（項目５５）
前記アンミン白金錯体を内包するリポソームが、標的指向性物質をさらに含む、上記項目に記載の方法。
（項目５６）
前記標的指向性物質が、抗体、糖鎖、レクチン、相補的核酸、レセプター、リガンド、アプタマーおよび抗原からなる群より選択される、上記項目に記載の方法。
（項目５７）
医薬として使用するための、アンモニアを有するアンミン白金錯体を内包するリポソームであって、該リポソームは、水溶性アンミン白金錯体、白金錯体原料またはその組合せと、リポソーム、リポソーム原料またはその組合せとを混合して、リポソーム形成維持条件に供することによって得ることができる、リポソーム。
（項目５８）
医薬として使用するための、アンモニアを有するアンミン白金錯体を内包するリポソームであって、該アンミン白金錯体が、１ｍｇ脂質あたり０．３μｇ以上で含まれる、リポソーム。
また、本発明は、１つの特定の実施形態では、以下のようにも記載することができる。
以下項目Ａとは、Ａ１〜Ａｎの任意の項目であって、ｎは、当該番号より１つ少ない数をいう。
（項目Ａ１）
アンミン白金錯体を内包するリポソームを製造する方法であって、該方法は、以下の工程：
Ａ）アンミン基を有する水溶性の白金錯体を含む溶液を提供する工程；
Ｂ）該水溶性の白金錯体を含む溶液とリポソーム形成能を有する脂質懸濁液とを混合して混合溶液を作製する工程；
Ｃ）該混合溶液をリポソームが形成する条件に供する工程；および
Ｄ）該混合溶液を、形成する塩が難水溶性であるイオンを含む溶液の存在下に供する工程、
を包含する、方法。
（項目Ａ２）
前記水溶性のアンミン白金錯体が、２つのアンミン基を有する、上記項目Ａに記載の方法。
（項目Ａ３）
前記水溶性の白金錯体が、ｃｉｓ−ジアンミンジニトラト白金（ＩＩ）である、上記項目Ａに記載の方法。
（項目Ａ４）
前記Ａ）工程において、前記水溶性の白金錯体を含む溶液が、ｐＨ６〜１０の範囲内に調節される、上記項目Ａに記載の方法。
（項目Ａ５）
前記Ａ）工程において、前記水溶性の白金錯体を含む溶液が、形成する塩が難水溶性であるイオンを含まない、上記項目Ａに記載の方法。
（項目Ａ６）
前記形成する塩が難水溶性であるイオンが、塩化物イオン（Ｃｌ−）、臭化物イオン（Ｂｒ−）、ヨウ化物イオン（Ｉ−）、チオシアン酸イオン（ＳＣＮ−）およびシアン化物イオン（ＣＮ−）からなる群より選択される、上記項目Ａに記載の方法。
（項目Ａ７）
前記形成する塩が難水溶性であるイオンが、塩化物イオン（Ｃｌ−）である、上記項目Ａに記載の方法。
（項目Ａ８）
前記塩化物イオン（Ｃｌ−）が、０〜４ｍＭの範囲で含まれる、上記項目Ａに記載の方法。
（項目Ａ９）
前記Ａ）工程において、前記水溶性の白金錯体を含む溶液が、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）−３−アミノプロパンスルホン酸緩衝剤（ｐＨ８．４）、炭酸緩衝剤（ｐＨ８．５）、リン酸緩衝剤（ｐＨ８．０）、２−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）緩衝剤（ｐＨ７．２）、トリス（ヒドロキシ）アミノメタン緩衝剤、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸緩衝剤、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）１−２−アミノエタンスルホン酸緩衝剤、Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２エタンスルホン酸緩衝剤、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−ヒドロキシ−３−アミノプロパンスルホン酸緩衝剤、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−ヒドロキシプロパンスルホン酸）緩衝剤、Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−ヒドロキシプロパン−３−プロパンスルホン酸緩衝剤、トリス（ヒドロキシメチルメチルグリシン）緩衝剤、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン緩衝剤、２−（シクロヘキシルアミノ）エタンスルホン酸緩衝剤、３−Ｎ−シクロヘキシルアミノ−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸緩衝剤および３−シクロヘキシルアミノプロパンスルホン酸緩衝剤からなる群より選択される緩衝剤を含む、上記項目Ａに記載の方法。
（項目Ａ１０）
前記水溶性の白金錯体を含む溶液が、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）−３−アミノプロパンスルホン酸緩衝剤を含む、上記項目Ａに記載の方法。
（項目Ａ１１）
前記水溶性の白金錯体を含む溶液が、ｐＨ８．４に調節されている、上記項目Ａに記載の方法。
（項目Ａ１２）
前記Ｂ）工程において、前記水溶性の白金錯体を含む溶液と脂質懸濁液とが、１：９〜９：１の範囲内の比で混合される、上記項目Ａに記載の方法。
（項目Ａ１３）
前記Ｂ）工程における前記脂質懸濁液が、
ｉ）脂質を、メタノール・クロロホルム溶液に懸濁して攪拌し、該攪拌した溶液を蒸発させ、沈殿物を真空乾燥させることにより脂質膜を得る工程；および
ｉｉ）該脂質膜を、懸濁緩衝液に懸濁させる工程
によって作製される、上記項目Ａに記載の方法。
（項目Ａ１４）
前記脂質懸濁液が、前記脂質として、ジパルミトイルホスファチジルコリン、コレステロール、ガングリオシド、ジセチルホスフェート、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミンおよびコール酸ナトリウムを、３５：４０：１５：５：５：１６７のモル比で含む、上記項目Ａに記載の方法。
（項目Ａ１５）
前記水溶性の白金錯体を含む溶液と前記脂質懸濁液とが、７：３の比で混合される、上記項目Ａに記載の方法。
（項目Ａ１６）
前記メタノール・クロロホルム溶液が、メタノールとクロロホルムとを１：１の比で含む、上記項目Ａに記載の方法。
（項目Ａ１７）
前記懸濁緩衝液が、形成する塩が難水溶性であるイオンを含まない、上記項目Ａに記載の方法。
（項目Ａ１８）
前記形成する塩が難水溶性であるイオンが、塩化物イオン（Ｃｌ−）、臭化物イオン（Ｂｒ−）、ヨウ化物イオン（Ｉ−）、チオシアン酸イオン（ＳＣＮ−）およびシアン化物イオン（ＣＮ−）からなる群より選択される、上記項目Ａに記載の方法。
（項目Ａ１９）
前記形成する塩が難水溶性であるイオンが、塩化物イオン（Ｃｌ−）である、上記項目Ａに記載の方法。
（項目Ａ２０）
前記塩化物イオン（Ｃｌ−）が、０〜４ｍＭの範囲で含まれる、上記項目Ａに記載の方法。（項目Ａ２１）
前記懸濁緩衝液が、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）−３−アミノプロパンスルホン酸緩衝剤（ｐＨ８．４）、炭酸緩衝剤（ｐＨ８．５）、リン酸緩衝剤（ｐＨ８．０）、２−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）緩衝剤（ｐＨ７．２）、トリス（ヒドロキシ）アミノメタン緩衝剤、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸緩衝剤、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）１−２−アミノエタンスルホン酸緩衝剤、Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２エタンスルホン酸緩衝剤、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−ヒドロキシ−３−アミノプロパンスルホン酸緩衝剤、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−ヒドロキシプロパンスルホン酸）緩衝剤、Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−ヒドロキシプロパン−３−プロパンスルホン酸緩衝剤、トリス（ヒドロキシメチルメチルグリシン）緩衝剤、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン緩衝剤、２−（シクロヘキシルアミノ）エタンスルホン酸緩衝剤、３−Ｎ−シクロヘキシルアミノ−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸緩衝剤および３−シクロヘキシルアミノプロパンスルホン酸緩衝剤からなる群より選択される緩衝剤を含む、上記項目Ａに記載の方法。
（項目Ａ２２）
前記懸濁緩衝液が、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）−３−アミノプロパンスルホン酸緩衝剤（ｐＨ８．４）である、上記項目Ａに記載の方法。
（項目Ａ２３）
前記Ｂ）工程に引き続き、前記脂質懸濁液を超音波処理する工程をさらに包含する、上記項目Ａに記載の方法。
（項目Ａ２４）
前記超音波処理する工程が、前記脂質容液を３０℃〜４０℃で攪拌させ、窒素置換し、超音波処理する工程である、上記項目Ａに記載の方法。
（項目Ａ２５）
前記Ｃ）工程において、前記混合溶液を、リポソームが形成するのに十分な時間、前記リポソームが形成する条件下に供する、上記項目Ａに記載の方法。
（項目Ａ２６）
前記Ｃ）工程において、前記混合溶液をリポソームが形成する条件が、該混合溶液を限外濾過に供することおよび該混合溶液を一晩静置することからなる群より選択される、上記項目Ａに記載の方法。
（項目Ａ２７）
前記混合溶液をリポソームが形成する条件が、前記混合溶液を分画分子量１０，０００で限外濾過に供することである、上記項目Ａに記載の方法。
（項目Ａ２８）
前記Ｄ）工程が、前記Ｃ）工程において、リポソームの形成を確認した後に行われる、上記項目Ａに記載の方法。
（項目Ａ２９）
前記Ｄ）工程において、前記形成する塩が難水溶性であるイオンが、塩化物イオン（Ｃｌ−）、臭化物イオン（Ｂｒ−）、ヨウ化物イオン（Ｉ−）、チオシアン酸イオン（ＳＣＮ−）およびシアン化物イオン（ＣＮ−）からなる群より選択される、上記項目Ａに記載の方法。
（項目Ａ３０）
前記形成する塩が難水溶性であるイオンが、塩化物イオン（Ｃｌ−）である、上記項目Ａに記載の方法。
（項目Ａ３１）
前記Ｄ）工程において、前記塩化物イオン（Ｃｌ−）が、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）−３−アミノプロパンスルホン酸緩衝液（ｐＨ８．４）、炭酸緩衝液（ｐＨ８．５）、リン酸緩衝液（ｐＨ８．０）、２−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）緩衝液（ｐＨ７．２）、トリス（ヒドロキシ）アミノメタン緩衝液、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸緩衝液、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）１−２−アミノエタンスルホン酸緩衝液、Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２エタンスルホン酸緩衝液、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−ヒドロキシ−３−アミノプロパンスルホン酸緩衝液、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−ヒドロキシプロパンスルホン酸）緩衝液、Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−ヒドロキシプロパン−３−プロパンスルホン酸緩衝液、トリス（ヒドロキシメチルメチルグリシン）緩衝液、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン緩衝液、２−（シクロヘキシルアミノ）エタンスルホン酸緩衝液、３−Ｎ−シクロヘキシルアミノ−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸緩衝液および３−シクロヘキシルアミノプロパンスルホン酸緩衝液からなる群より選択される少なくとも１つの緩衝液により提供される、上記項目Ａに記載の方法。
（項目Ａ３２）
前記塩化物イオン（Ｃｌ−）が、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）−３−アミノプロパンスルホン酸緩衝液（ｐＨ８．４）、炭酸緩衝液（ｐＨ８．５）、ＰＢＳ（ｐＨ８．０）およびＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．２）からなる群より選択される少なくとも１つの緩衝液により提供される、上記項目Ａに記載の方法。
（項目Ａ３３）
前記塩化物イオン（Ｃｌ−）が、ＮａＣｌ、ＨＣｌまたはＣａＣｌ２より提供される、上記項目Ａに記載の方法。
（項目Ａ３４）
前記塩化物イオン（Ｃｌ−）が、ＮａＣｌにより提供される、上記項目Ａに記載の方法。
（項目Ａ３５）
前記Ｄ）工程が、
ｉ）形成されたリポソームを親水性化処理する工程；
ｉｉ）該リポソームへ標的指向性物質を結合させる工程；
ｉｉｉ）該修飾標的指向性物質が結合したリポソームを親水性化する工程ならびに
ｉｖ）該親水性化したリポソームを含む溶液をフィルター濾過をする工程
を包含する、上記項目Ａに記載の方法。
（項目Ａ３６）
前記標的指向性物質が、抗体、糖鎖、レクチン、相補的核酸、レセプター、リガンド、アプタマーおよび抗原からなる群より選択される、上記項目Ａに記載の方法。
（項目Ａ３７）
前記アンミン白金錯体が、難水溶性である、上記項目Ａに記載の方法。
（項目Ａ３８）
アンミン白金錯体を内包するリポソームを製造する方法であって、該方法は、以下の工程：
Ａ−１）２つのアンミン基を有する水溶性の白金錯体を含む溶液を調製する工程；
Ａ−２）該水溶性の白金錯体を含む溶液のｐＨをｐＨ６〜１０の範囲内に調節する工程；
Ｂ−１）ｐＨが調節された該ｃｉｓ−ジアンミンジニトラト白金（ＩＩ）溶液と、超音波処理した脂質懸濁液とを、１：９〜９：１の範囲内の比で混合して混合溶液を作製する工程；および
Ｃ−１）該混合溶液を限外濾過に供する工程；および
Ｄ−１）限外濾過後に、該混合溶液を塩化物イオン（Ｃｌ−）の存在下に供する工程、を包含し、
ここで、該アンミン白金錯体は難水溶性である、方法。
（項目Ａ３９）
ｃｉｓ−ジアミンジクロロ白金（ＩＩ）を内包するリポソームを製造する方法であって、該方法は、以下の工程：
（Ａ１）ｃｉｓ−ジアンミンジニトラト白金（ＩＩ）を、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）−３−アミノプロパンスルホン酸緩衝液に溶解し、ｃｉｓ−ジアンミンジニトラト白金（ＩＩ）を含む溶液を調製する工程であって、該Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）−３−アミノプロパンスルホン酸緩衝液は、塩化物イオン（Ｃｌ−）を含まないか、または塩化物イオン（Ｃｌ−）を０〜４ｍＭの範囲で含む、工程；
（Ａ２）該ｃｉｓ−ジアンミンジニトラト白金（ＩＩ）を含む溶液のｐＨをｐＨ８．４に調節する工程；
（Ｂ１）ジパルミトイルホスファチジルコリン、コレステロール、ガングリオシド、ジセチルホスフェート、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミンおよびコール酸ナトリウムを、３５：４０：１５：５：５：１６７のモル比で混合させて脂質を調製する工程；
（Ｂ２）該脂質を、メタノール・クロロホルム（１：１）溶液に懸濁して攪拌し、該攪拌した溶液を蒸発させ、沈殿物を真空乾燥させることにより脂質膜を得る工程；および
（Ｂ３）該脂質膜を、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）−３−アミノプロパンスルホン酸緩衝液（ｐＨ８．４）に懸濁させて脂質懸濁液を作製する工程であって、該Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）−３−アミノプロパンスルホン酸緩衝液は、塩化物イオン（Ｃｌ−）を含まないか、または塩化物イオン（Ｃｌ−）を０〜４ｍＭの範囲で含む、工程、
（Ｂ４）該脂質懸濁液を３０℃〜４０℃で攪拌させ、窒素置換し、超音波処理する工程；
（Ｂ５）ｐＨが調節された該ｃｉｓ−ジアンミンジニトラト白金（ＩＩ）溶液と、超音波処理した脂質懸濁液とを、７：３の範囲内の比で混合して混合溶液を作製する工程；
（Ｃ１）該混合溶液を分画分子量１０，０００で限外濾過に供する工程；および
（Ｄ１）限外濾過後に、該混合溶液を、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）−３−アミノプロパンスルホン酸緩衝液（ｐＨ８．４）、炭酸緩衝液（ｐＨ８．５）、ＰＢＳ（ｐＨ８．０）およびＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．２）からなる群より選択される少なくとも１つの緩衝液に曝す工程、
を包含する、方法。
（項目Ａ４０）
アンモニアを有するアンミン白金錯体が、１ｍｇ脂質あたり２０μｇ以上で含まれる、アンミン白金錯体を内包するリポソーム。
（項目Ａ４１）
前記アンミン白金錯体が、２つのアンモニアを有する、上記項目Ａに記載のリポソーム。
（項目Ａ４２）
前記アンミン白金錯体が、ｃｉｓ−ジアミンジクロロ白金（ＩＩ）である、上記項目Ａに記載のリポソーム。
（項目Ａ４３）
前記アンミン白金錯体を内包するリポソームが、ジパルミトイルホスファチジルコリン、コレステロール、ガングリオシド、ジセチルホスフェート、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミンおよびコール酸ナトリウムを含む、上記項目Ａに記載のリポソーム。
（項目Ａ４４）
前記アンミン白金錯体を内包するリポソームが、ジパルミトイルホスファチジルコリン、コレステロール、ガングリオシド、ジセチルホスフェート、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミンおよびコール酸ナトリウムを、３５：４０：１５：５：５：１６７のモル比で含む、上記項目Ａに記載のリポソーム。
（項目Ａ４５）
前記アンミン白金錯体を内包するリポソームが、標的指向性物質をさらに含む、上記項目Ａに記載のリポソーム。
（項目Ａ４６）前記標的指向性物質が、抗体、糖鎖、レクチン、相補的核酸、レセプター、リガンド、アプタマーおよび抗原からなる群より選択される、上記項目Ａに記載のリポソーム。
なお、上記記載における、Ａ，Ｂ工程などの記載は、必ずしも同じ工程をさしているのではなく、発明により適宜異なって理解されるべきことに留意すべきである。
従って、本発明のこれらおよび他の利点は、添付の図面を参照して、以下の詳細な説明を読めば、明白である。
これまで、リポソームに内包できないか、内包効率の低かった難水溶性アンミン白金錯体（例えば、シスプラチン）をリポソームに効率よく内包することが可能とし、従来達成できなかった濃度・量の難水溶性アンミン白金錯体（例えば、シスプラチン）をリポソーム中に内包させることができた。これにより、従来技術よりはるかに低用量の難水溶性アンミン白金錯体含有リポソーム製剤を投与して従来と同程度の薬効（例えば、抗がん作用）を奏することが可能となった。
以下に、本発明の好ましい実施形態を示すが、当業者は本発明の説明および当該分野における周知慣用技術からその実施形態などを適宜実施することができ、本発明が奏する作用および効果を容易に理解することが認識されるべきである。
以下、各発明について、実施形態を詳しく説明する。
以下、本発明を説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の冠詞（例えば、英語の場合は「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」など）は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。矛盾する場合、本明細書（定義を含めて）が優先する。
（用語の定義）
以下に本明細書において特に使用される用語の定義を列挙する。
本明細書において「アンミン白金錯体」とは、アンモニアを有する白金錯体をいう。アンミン白金錯体としては、例えば、ｃｉｓ−ジアンミンジクロロ白金（ＩＩ）＜シスプラチンとして知られる。＞、ｃｉｓ−ジアンミンジニトラト白金（ＩＩ）、ｃｉｓ−ジアンミン−１，１−シクロブタン−ジカルボキシラト白金（ＩＩ）＜カルボプラチンとして知られる。＞、ｃｉｓ−ジアンミン（グリコラト）白金（ＩＩ）＜ネダプラチンとして知られる。＞、（１Ｒ，２Ｒ−ジアンミンシクロへキサン）オキサラト白金（ＩＩ）＜オキザリプラチンとして知られる。＞、ｃｉｓ−ジアンミンジブロモ白金（ＩＩ）＜抗がん活性を有する。＞、μ−ヒドロキソ白金（ＩＩ）＜抗がん活性を有する。＞などが挙げられるが、これらに限定されない。このうち、難水溶性のアンミン白金錯体としては、例えば、ｃｉｓ−ジアンミンジクロロ白金（ＩＩ）、ｃｉｓ−ジアンミン−１，１−シクロブタン−ジカルボキシラト白金（ＩＩ）、ｃｉｓ−ジアンミンジブロモ白金（ＩＩ）等を挙げることができる。
本明細書において「ｃｉｓ−ジアンミンジクロロ白金（ＩＩ）（ＣＤＤＰ）」とは、シスプラチンともいう。これは、以下の構造を有する：
シスプラチンは、種々のがん、腫瘍の処置に対して効果を有する。がん、腫瘍の例としては、例えば、精巣腫瘍、膀胱がん、腎盂・尿管腫瘍、前立腺がん、卵巣がん、頭頸部がん、非小細胞肺がん、食道がん、子宮頸がん、神経芽細胞種、胃がん、小細胞肺がん、骨肉種、胚細胞腫瘍などが挙げられるが、これらに限定されない。ここで、がんは、腫瘍や白血病等のあらゆる新生物による疾患を含む。
本明細書において「ｃｉｓ−ジアミンジクロロ白金（ＩＩ）の水溶性形態」とは、水溶性の状態にあるシスプラチンをいう。例えば、ｃｉｓ−ジアミンジクロロ白金（ＩＩ）の水溶性形態としては、ｃｉｓ−ジアンミンジニトラト白金（ＩＩ）（ＣＤＤＰ−３）などが挙げあれる。
本明細書において、「ｃｉｓ−ジアンミンジニトラト白金（ＩＩ）（ＣＤＤＰ−３）」は、シスプラチン硝酸体ともいう。これは、以下の構造を有する：
本明細書において、「ｃｉｓ−ジアンミン−１，１−シクロブタン−ジカルボキシラト白金（ＩＩ）」は、カルボプラチンともいう。これは、以下の構造を有する：
カルボプラチンは、種々のがん、腫瘍の処置に対して効果を有する。がん、腫瘍の例としては、例えば、精巣腫瘍、膀胱がん、腎盂・尿管腫瘍、前立腺がん、卵巣がん、頭頸部がん、非小細胞肺がん、食道がん、子宮頸がん、神経芽細胞種、胃がん、小細胞肺がん、骨肉種、胚細胞腫瘍などが挙げられるが、これらに限定されない。ここで、がんは、腫瘍や白血病等のあらゆる新生物による疾患を含む。
本明細書において、「ｃｉｓ−ジアンミン（グリコラト）白金（ＩＩ）」は、ネダプラチンともいう。これは、以下の構造を有する：
ネダプラチンは、種々のがん、腫瘍の処置に対して効果を有する。がん、腫瘍の例としては、例えば、精巣腫瘍、膀胱がん、腎盂・尿管腫瘍、前立腺がん、卵巣がん、頭頸部がん、非小細胞肺がん、食道がん、子宮頸がん、神経芽細胞種、胃がん、小細胞肺がん、骨肉種、胚細胞腫瘍などが挙げられるが、これらに限定されない。ここで、がんは、腫瘍や白血病等のあらゆる新生物による疾患を含む。
本明細書において、「１Ｒ，２Ｒ−ジアンミンシクロへキサン）オキサラト白金（ＩＩ）」は、オキザリプラチンともいう。これは、：
オキザリプラチンは、種々のがん、腫瘍の処置に対して効果を有する。がん、腫瘍の例としては、例えば、精巣腫瘍、膀胱がん、腎盂・尿管腫瘍、前立腺がん、卵巣がん、頭頸部がん、非小細胞肺がん、食道がん、子宮頸がん、神経芽細胞種、胃がん、小細胞肺がん、骨肉種、胚細胞腫瘍などが挙げられるが、これらに限定されない。ここで、がんは、腫瘍や白血病等のあらゆる新生物による疾患を含む。
本明細書において、「ｃｉｓ−ジアンミンジブロモ白金（ＩＩ）」は、以下の構造を有する：
ｃｉｓ−ジアンミンジブロモ白金（ＩＩ）は、抗がん活性を有する。
本明細書において、「μ−ヒドロキソ白金（ＩＩ）二核錯体」は、例えば、以下の構造の化合物が挙げられる：
μ−ヒドロキソ白金（ＩＩ）二核錯体は、抗がん活性を有する。
これらの白金錯体において、Ｐｔとアンミン配位子の結合は強い。従って、上記白金錯体は水溶液中では、ＰｔとＯの結合部分が解離した状態で存在する。
本発明では、リポソームがリポソームとして存在する時点で水溶性の形態の白金錯体が接触して存在することが重要であると考えられる。したがって、シスプラチン以外の白金錯体であっても、いったん水溶性の形態にして、その後難水溶性の塩を形成することさえできれば本発明の効果が達成されることが理解される。当該分野において、上記白金錯体または他の白金錯体についてこのような水溶性および難水溶性の塩を形成するイオン種は知られているか、または適宜選択することができることから、シスプラチン以外の白金錯体であっても本発明を実施することができることが理解される。そして、水溶性の選択の基準としては、０．５ｇ／１００ｇ水〜１０ｇ／１００ｇ水（例えば、０．５ｇ／１００ｇ水、１．０ｇ／１００ｇ水、１．５ｇ／１００ｇ水、２．０ｇ／１００ｇ水、２．５ｇ／１００ｇ水、３．０ｇ／１００ｇ水、３．５ｇ／１００ｇ水、４．０ｇ／１００ｇ水、４．５ｇ／１００ｇ水、５．０ｇ／１００ｇ水、５．５ｇ／１００ｇ水、６．０ｇ／１００ｇ水、６．５ｇ／１００ｇ水、７．０ｇ／１００ｇ水、７．５ｇ／１００ｇ水、８．０ｇ／１００ｇ水、８．５ｇ／１００ｇ水、９．０ｇ／１００ｇ水、９．５ｇ／１００ｇ水、１０ｇ／１００ｇ水以上（以上、上限）であり、１０ｇ／１００ｇ水、９．５ｇ／１００ｇ水、９．０ｇ／１００ｇ水、８．５ｇ／１００ｇ水、８．０ｇ／１００ｇ水、７．５ｇ／１００ｇ水、７．０ｇ／１００ｇ水、６．５ｇ／１００ｇ水、６．０ｇ／１００ｇ水、５．５ｇ／１００ｇ水、５．０ｇ／１００ｇ水、４．５ｇ／１００ｇ水、４．０ｇ／１００ｇ水、３．５ｇ／１００ｇ水、３．０ｇ／１００ｇ水、２．５ｇ／１００ｇ水、２．０ｇ／１００ｇ水、１．５ｇ／１００ｇ水、１．０ｇ／１００ｇ水以下（以上、下限）の任意の範囲の可能な組合せ）（水溶性のものの溶解度）、および難水溶性の選択の基準としては、０．０ｇ／１００ｇ水〜０．５ｇ／１００ｇ水（例えば、０．０ｇ／１００ｇ水、０．０５ｇ／１００ｇ水、０．１ｇ／１００ｇ水、０．１５ｇ／１００ｇ水、０．２ｇ／１００ｇ水、０．２５ｇ／１００ｇ水、０．３ｇ／１００ｇ水、０．３５ｇ／１００ｇ水、０．４ｇ／１００ｇ水、０．４５ｇ／１００ｇ水、０．５以上（以上、上限）であり、０．５ｇ／１００ｇ水、０．４５ｇ／１００ｇ水、０．４ｇ／１００ｇ水、０．３５ｇ／１００ｇ水、０．２５ｇ／１００ｇ水、０．２ｇ／１００ｇ水、０．１５ｇ／１００ｇ水、０．１ｇ／１００ｇ水、０．０５ｇ／１００ｇ水以下（以上、下限）の任意の範囲の可能な組合せ）（難水溶性のものの溶解度）として溶解度で表すことができる。
本明細書において「白金錯体原料」とは、緩衝液と混ぜると水溶性アンミン白金錯体を形成し得る原料をいう。したがって、混合することで、水溶性アンミン白金錯体を形成することができる限り、どのような材料を用いてもよく、原料は、複数種類あってもよい。本明細書において使用され得る白金錯体原料としては、例えば、ｃｉｓ−〔Ｐｔ（ＮＨ３）２Ｉ２〕、ｃｉｓ−〔Ｐｔ（ＮＨ３）２Ｃｌ２〕、ｃｉｓ−〔Ｐｔ（ＮＨ３）２Ｂｒ２〕、Ｋ２ＰｔＣｌ４が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、ｃｉｓ−〔Ｐｔ（ＮＨ３）２Ｉ２〕、ｃｉｓ−〔Ｐｔ（ＮＨ３）２Ｃｌ２〕、ｃｉｓ−〔Ｐｔ（ＮＨ３）２Ｂｒ２〕、Ｋ２ＰｔＣｌ４は、硝酸銀（ＡｇＮＯ３）を２等量（１．９８等量）添加するだけで硝酸体になる。
例えば、シスプラチンの場合であれば、シスプラチンの水に対する溶解性は、２ｍｇ／ｍｌ（室温）である。シスプラチン硝酸体は、２０ｍｇ／ｍｌである。つまり、シスプラチンの溶解度（室温）以上の白金錯体で使用することできる。当該分野において、上記シスプラチンまたは他の白金錯体についてこのような水溶性および難水溶性の塩を形成するイオン種は知られているか、または適宜選択することができることから、シスプラチン以外の白金錯体であっても、シスプラチンと同様に、その溶解性を考慮することによって適宜、選択することができる。このときに、加える硝酸銀の当量数を適宜調節することによって同様に実施することができる。また、臭化物イオンの濃度、ヨウ化物イオンの濃度は、いずれも塩化物イオンと同等で問題なく実施することができる。臭化物イオン、ヨウ化物イオンのほうが塩化物イオンよりも結合性が強いため、同条件でおこなっても、同様に難水溶性物質が形成されると考えられるため。また、それぞれのイオンのリポソーム膜透過性に差異はないと考えられることから、これらの要素を考慮して実施することができる。
本明細書において「アンミン基」とは、アンモニア分子が別の基と結合したときに付される名称である。
本明細書において「リポソーム」とは、通常、膜状に集合した脂質層および内部の水層から構成される閉鎖小胞を意味する。代表的に使用されるリン脂質のほか、コレステロール、糖脂質などを組み込ませることも可能である。リポソームは内部に水を含んだ閉鎖小胞であるため、水溶性の薬剤などを小胞内に保持させることも可能である。したがって、このようなリポソームによって、細胞膜を通過しえない薬物や遺伝子などを細胞内に送達するのに使われる。また、生体適合性も良いのでＤＤＳ用のナノ粒子性キャリアー材料としての期待が大きい。本発明において、リポソームは、修飾基を付するために、エステル結合を付与する官能基を有する構成単位（例えば、糖脂質、ガングリオシド、ホスファチジルグリセロールなど）またはペプチド結合を付与する官能基を有する構成単位（例えば、ホスファチジルエタノールアミン）を有し得る。
本発明において使用されるリポソームは、水溶性アンミン白金錯体を通過させることができさえすれば、どのような製法により作製されたものであってもよい。本発明において、リポソームは、複数の製造方法により調製されたリポソーム（例えば、改良コール酸塩法のもの、凍結乾燥法のもの）を混ぜ合わせて使用することもできる。なぜなら、水溶性アンミン白金錯体をリポソーム膜を介してリポソーム中に移行させ、維持できればよいからである。このようなリポソームは、その用途に応じて、構成脂質成分を組合せたリポソームへの水溶性白金錯体の内包量、内包効率、内包後の漏出およびリポソームの安定性などを検討することにより当業者が適宜、決定することができる。そして、その判断基準は以下のとおりである。
内包量は、リポソーム中の白金量を原子吸光高度法（ＦＡＡＳ）により測定し、その用途に応じた白金量であればよい。
内包効率は、初期白金錯体量に対するリポソームに内包された白金量を割合として算出することができる。用途にもよるが、たとえば、０．５％以上の白金錯体が内包されていればよい。
内包後の漏出は、リポソーム中の白金量を原子吸光光度法（ＦＡＡＳ）によって経時的に定量し、内包直後の白金量と比較することにより評価することできる。
リポソームの安定性は、粒子径分布を経時的に測定することによって、確認することができる。
リポソーム膜は固すぎると物質を透過させず、柔らかすぎるとリポソーム自体が不安定になる。リポソーム膜の堅さは、リポソーム構成成分の種類、混合比などにより決定される。リポソーム膜の堅さおよび流動性は、リポソームのバリアー能に影響する。
水溶性物質がリポソーム内水相に留まるのは、脂質２重膜が水溶性物質に対する障壁として働いているためである。膜の流動性および透過性は、ゲル相と液晶相とで全く異なる。液晶相では一般に相転移温度の低い脂質が多く含まれるほど、また、温度が高いほど流動性は増加する。リポソームの内水相に封入した物質は、膜の相転移および流動性に依存して漏出性が変動する。
飽和脂質で構成されるリポソームは、ゲル相では高いバリア能（透過しにくいが漏れにくい）を示す。飽和脂質で構成されるリポソームは、相転移温度以上にてバリア能を消失するが、液晶相の飽和脂質にコレステロールまたは少量の不飽和脂肪酸を添加するとバリア能が回復する。
不飽和脂肪酸で構成されるリポソームは、液晶相でバリア能を有するが、温度の上昇に従って、流動性および低分子の膜透過性が上昇する。不飽和脂肪酸膜においてもコレステロールの添加は、膜のバリア能を高める。つまり、コレステロール含量が多くなると透過性は下がるが、内水相の物質は安定にとどめることができる。
コレステロールが膜成分に含まれている場合、相転移の状態および膜の流動性は大きく変化する。コレステロールは不飽和脂質膜では、脂質分子間の相互作用を高め、流動性および膜透過性の減少を引き起こす。一方、飽和脂質に加えると相転移が消失し、ゲル相の温度でも流動性を有する膜となる。
これらの効果は、コレステロールが脂質分子と複合体を形成するために生ずると考えられている。コレステロールが存在すると、相転移における劇的な流動性変化が消失するので、結果として、相転移温度以上では流動性の減少が生じ、一方、相転移温度以下では、流動性の増加が認められる。
本発明において使用されるリポソームは、コレステロールが含まれる場合、封入させる物質が膜を通過し、リポソーム中に留まるリポソーム膜を硬さを達成するのに充分な比率（例えば、コレステロールがリン脂質に対して、例えば、約３０〜５０モル％、約３０モル％以上、約３５モル％以上、約４０モル％以上、約４５モル％以上であり、約５０モル％以下、約４５モル％以下、約４０モル％以下、約３５モル％以下であってもよく、約５０モル％以上または約３０モル％であってもよく、それらの任意の範囲の可能な組み合わせ）で含まれ得る。
リポソームの調製は、当該分野において公知の任意の手法により製造することができる。例えば、超音波処理法、エタノール注入法、フレンチプレス法、エーテル注入法、コール酸法、凍結乾燥法、逆相蒸発法により調製されたものであり得る（例えば、「リポソーム応用の新展開〜人工細胞の開発に向けて〜 監修 秋吉一成/辻井薫 ＮＴＳ ｐ３３〜４５（２００５）」、「リポソーム 野島庄七 ｐ２１−４０ 南江堂（１９８８）」を参照のこと。）が挙げられ得る。
例えば、その中でもコール酸透析法による方法が挙げられる。コール酸透析法では、ａ）脂質と界面活性剤の混合ミセルの調製、およびｂ）混合ミセルの透析により製造を実施する。次に本発明の糖鎖リポソームにおいて好ましい実施形態では、リンカーとしてタンパク質を使用することが好ましく、タンパク質に糖鎖が結合した糖タンパク質のリポソームへのカップリングは、以下の２段階反応によって行うことができる。ａ）リポソーム膜上のガングリオシド部分の過ヨウ素酸酸化、およびｂ）還元的アミノ化反応による酸化リポソームへの糖タンパク質のカップリングである。このような手法によって望ましい糖鎖を含む糖タンパク質をリポソームに結合することができ、所望の糖鎖を有する多種多様な糖タンパク質・リポソームコンジュゲートを得ることができる。リポソームの純度や安定性を見るために粒子径サイズ分布を調べることが非常に重要である。その方法として、ゲル濾過クロマト法（ＧＰＣ）および走査型電顕（ＳＥＭ）や動的光散乱法（ＤＬＳ）などを使うことができる。一例として、ジパルミトイルホスファチジルコリン、コレステロール、ガングリオシド、ジセチルホスフェート、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミンおよびコール酸ナトリウムを、３５：４０：１５：５：５：１６７のタイプのリポソームを製造することができる。
リポソームは、凍結乾燥法によっても作製することができる。凍結乾燥法は、例えば、Ｈ．Ｋｉｋｕｃｈｉ，Ｎ．Ｓｕｚｕｋｉ ｅｔ ａｌ，Ｂｉｏｐｈａｒｍ．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｐｏｓ．，１７，５８９−６０５（１９９９）等により報告されている。例えば、以下の方法により調製することができる。リポソーム溶液を−４０〜−５０℃で凍結させ、凍結乾燥させる。凍結乾燥粉末に内包物質溶液を添加して再水和する。限外濾過法または透析法で、内包されなかった物質を除去する。必要に応じて、最初のリポソーム溶液に糖などを添加する。また、目的に応じて、フレンチプレス法、メンブランフィルター法により粒子サイズを調整する。
本明細書において使用される場合、用語「リポソーム原料」とは、緩衝液に混ぜるとリポソームを形成することができる脂質をいう。これらとしては、たとえば、実施例において使用されているミセル懸濁液が挙げられるが、水溶性アンミン白金錯体と接触するときにリポソームを形成することができ、水溶性アンミン白金錯体を通過させることができるような脂質であれば、これら以外のものであってもよい。本製造方法において使用されるリポソーム原料は、製造されるリポソームの用途に応じて、構成脂質成分を組合せたリポソームへの水溶性白金錯体の内包量、内包効率、内包後の漏れおよびリポソームの安定性を検討することにより当業者が適宜、決定することができる。
本明細書において使用される場合、用語「脂質」とは、長鎖の脂肪族炭化水素またはその誘導体をいう。「脂質」は、例えば、脂肪酸、アルコール、アミン、アミノアルコール、アルデヒドなどからなる化合物の総称である。本発明において使用されるリポソーム形成能を有する脂質またはリポソームを構成する脂質としては、例えば、ホスファチジルコリン類、ホスファチジルエタノールアミン類、ホスファチジン酸類、長鎖アルキルリン酸塩類、糖脂質類（ガングリオシド類など）、ホスファチジルグリセロール類、スフィンゴミエリン類、コレステロール類等。
ホスファチジルコリン類としては、ジミリストイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリン等が挙げられる。
ホスファチジルエタノールアミン類としては、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン等が挙げられる。
ホスファチジン酸類としては、ジミリストイルホスファチジン酸、ジパルミトイルホスファチジン酸、ジステアロイルホスファチジン酸が挙げられる。長鎖アルキルリン酸塩類としてはジセチルホスフェート等が挙げられる。
糖脂質類としては、ガラクトシルセラミド、グルコシルセラミド、ラクトシルセラミド、ホスフナチド、グロボシド、ガングリオシド類等が挙げられる。ガングリオシド類としては、ガングリオシドＧＭ１（Ｇａｌβ１，３ＧａｌＮＡｃβ１，４（ＮｅｕＡα２，３）Ｇａｌβ１，４Ｇｌｃβ１，１’Ｃｅｒ）、ガングリオシドＧＤｌａ、ガングリオシドＧＴｌｂ等が挙げられる。
ホスファチジルグリセロール類としては、ジミリストイルホスファチジルグリセロール、ジパルミトイルホスファチジルグリセロ−ル、ジステアロイルホスファチジルグリセロール等が好ましい。
このうち、ホスファチジン酸類、長鎖アルキルリン酸塩類、糖脂質類、およびコレステロール類はリポソームの安定性を上昇させる効果を有するので、構成脂質として添加するのが望ましい。例えば、本発明において使用されるリポソームを構成する脂質として、ホスファチジルコリン類（モル比０〜７０％）、ホスファチジルエタノールアミン類（モル比０〜３０％）、ホスファチジン酸類、および長鎖アルキルリン酸塩からなる群から選択される１種以上の脂質（モル比０〜３０％）、糖脂質類、ホスファチジルグリセロール類およびスフィンゴミエリン類からなる群から選択される１種以上の脂質（モル比０〜４０％）、ならびにコレステロール類（モル比０〜７０％）を含むものが挙げられる。ガングリオシド、糖脂質またはホスファチジルグリセロールを含むことが好ましい。アルブミンのようなリンカーの結合が容易になるからである。
本発明において使用されるリポソームを構成する脂質またはリポソーム原料としては、例えば、ジパルミトイルホスファチジルコリン、コレステロール、ガングリオシド、ジセチルホスフェート、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、コール酸ナトリウム、ジセチルフォスファチジルエタノールアミン−ポリグリセリン８Ｇ、ジミリストイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジルコリン、ジミリストイルホスファチジルセリン、ジパルミトイルホスファチジルセリン、ジステアロイルホスファチジルセリン、ジオレオイルホスファチジルセリン、ジミリストイルホスファチジルイノシトール、ジパルミトイルホスファチジルイノシトール、ジステアロイルホスファチジルイノシトール、ジオレオイルホスファチジルイノシトール、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン、ジミリストイルホスファチジン酸、ジパルミトイルホスファチジン酸、ジステアロイルホスファチジン酸、ジオレオイルホスファチジン酸、ガラクトシルセラミド、グルコシルセラミド、ラクトシルセラミド、ホスフナチド、グロボチド、ＧＭ１（Ｇａｌβ１，３ＧａｌＮＡｃβ１，４（ＮｅｕＡα２，３）Ｇａｌβ１，４Ｇｌｃβ１，１’Ｃｅｒ）、ガングリオシドＧＤ１ａ、ガングリオシドＧＤ１ｂ、ジミリストイルホスファチジルグリセロール、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール、ジステアロイルホスファチジルグリセロール、ジオレオイルホスファチジルグリセロール等が挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、ジパルミトイルホスファチジルコリン、コレステロール、ガングリオシド、ジセチルホスフェート、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、コール酸ナトリウム、ジセチルフォスファチジルエタノールアミン−ポリグリセリン８Ｇ、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルグリセロールであり得る。
本発明のアンミン白金錯体を内包するリポソームは、以下の方法によって製造され得る。具体的には、この方法は、Ａ）水溶性アンミン白金錯体、白金錯体原料またはその組合せを提供する工程；Ｂ）リポソーム、リポソーム原料またはその組合せを提供する工程：およびＣ）該水溶性アンミン白金錯体、白金錯体原料またはその組合せと、該リポソーム、該リポソーム原料またはその組合せとを含む混合物を調製し、リポソーム形成維持条件に供する工程であって、ただし、該リポソームが存在する時点で該白金錯体の形成する塩が水溶性の状態である条件に供する工程を包含する。本発明の製造方法は、Ｄ）前記Ｃ）工程により得られた混合物を、前記白金錯体の形成する塩が難水溶性であるイオンを含む溶液の存在下に供する工程をさらに含み得る。
好ましくは、前記Ｄ）工程は、ｉ）形成されたリポソームを親水性化処理する工程；ｉｉ）該リポソームへ標的指向性物質を結合させる工程；ｉｉｉ）該修飾標的指向性物質が結合したリポソームを親水性化する工程ならびにｉｖ）該親水性化したリポソームを含む溶液をフィルター濾過をする工程を包含し得る。
本発明において水溶性アンミン白金錯体は、好ましくは、２つのアンミン基を有し、より好ましくは、ｃｉｓ−ジアンミンジニトラト白金（ＩＩ）であり得る。
好ましい製造方法としては、以下の工程：Ａ）前記水溶性アンミン白金錯体を、第一緩衝液に溶解し、白金錯体溶液を調製する工程；Ｂ）前記リポソーム原料を提供する工程；Ｃ）該白金錯体溶液と、該脂質懸濁液とを混合し、前記リポソーム形成維持条件に供する工程を包含し得る。この方法では、該第一緩衝液および第二緩衝液は、該白金錯体が形成する塩が難水溶性であるイオンを含まないものが使用され得る。
１つの実施形態において、本製造方法の前記Ｂ）工程は、Ｂ−ｉ）リポソーム形成能を有する脂質を、メタノール・クロロホルム溶液に懸濁して攪拌し、該攪拌した溶液を蒸発させ、沈殿物を真空乾燥させることにより脂質膜を得る工程；およびＢ−ｉｉ）該脂質膜を、第二緩衝液に懸濁し、脂質懸濁液を形成する工程を包含し得る。
より好ましい実施形態において、本発明の製造方法は、Ａ）工程として、（Ａ１）ｃｉｓ−ジアンミンジニトラト白金（ＩＩ）を、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）−３−アミノプロパンスルホン酸緩衝液に溶解し、ｃｉｓ−ジアンミンジニトラト白金（ＩＩ）を含む溶液を調製する工程であって、該Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）−３−アミノプロパンスルホン酸緩衝液は、塩化物イオン（Ｃｌ−）を含まないか、または塩化物イオン（Ｃｌ−）を０〜４ｍＭの範囲で含む、工程；（Ａ２）該ｃｉｓ−ジアンミンジニトラト白金（ＩＩ）を含む溶液のｐＨをｐＨ６〜１０（好ましくは、ｐＨ８．４）に調節する工程を包含し得る。
さらに、Ｂ）工程として、（Ｂ１）ジパルミトイルホスファチジルコリン、コレステロール、ガングリオシド、ジセチルホスフェート、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミンおよびコール酸ナトリウムを（好ましくは、例えば、３５：４０：１５：５：５：１６７のモル比）混合させて脂質を調製する工程；（Ｂ２）該脂質を、メタノール・クロロホルム（好ましくは、１：１）溶液に懸濁して攪拌し、該攪拌した溶液を蒸発させ、沈殿物を真空乾燥させることにより脂質膜を得る工程；および（Ｂ３）該脂質膜を、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）−３−アミノプロパンスルホン酸緩衝液（ｐＨ８．４）に懸濁させて脂質懸濁液を作製する工程であって、該Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）−３−アミノプロパンスルホン酸緩衝液は、塩化物イオン（Ｃｌ−）を含まないか、または塩化物イオン（Ｃｌ−）を０〜４ｍＭの範囲で含む、工程；および（Ｂ４）該脂質懸濁液を３０℃〜４０℃で攪拌させ、窒素置換し、超音波処理する工程を包含し得る。
さらに、Ｃ）工程として、（Ｃ１）ｐＨが調節された該ｃｉｓ−ジアンミンジニトラト白金（ＩＩ）溶液と、超音波処理した脂質懸濁液とを、１：９〜９：１（好ましくは、７：３）の範囲内の比で混合して、分画分子量５００〜３００，０００（好ましくは、１０，０００）で限外濾過に供する工程を包含し得る。
別の好ましい製造方法としては、Ａ）前記水溶性アンミン白金錯体を、第一緩衝液に溶解し、白金錯体溶液を調製する工程；Ｂ）前記リポソームを提供する工程；およびＣ）該白金錯体溶液と、該リポソームとを混合し、前記リポソーム形成維持条件に供する工程を包含する方法が挙げられる。この方法では、該第一緩衝液は、該白金錯体が形成する塩が難水溶性であるイオンを含まないものが使用され得る。前記リポソームは、例えば、水溶性アンミン白金錯体が、リポソーム膜を通過して該リポソーム内に移行し、留まるために充分な組成を有し得る。前記リポソーム形成維持条件は、例えば、リポソームを破壊することなく維持すると同時に、前記水溶性アンミン白金錯体がリポソーム膜を通過して該リポソーム内に移行し、留まるために充分な条件であり得る。
別のより好ましい実施形態において、本発明の製造方法のＡ）工程は、（Ａ１）ｃｉｓ−ジアンミンジニトラト白金（ＩＩ）を、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）−３−アミノプロパンスルホン酸緩衝液に溶解し、ｃｉｓ−ジアンミンジニトラト白金（ＩＩ）を含む溶液を調製する工程であって、該Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）−３−アミノプロパンスルホン酸緩衝液は、塩化物イオン（Ｃｌ−）を含まないか、または塩化物イオン（Ｃｌ−）を０〜４ｍＭの範囲で含む、工程；（Ａ２）該ｃｉｓ−ジアンミンジニトラト白金（ＩＩ）を含む溶液のｐＨをｐＨ６〜１０（好ましくは、ｐＨ８．４）に調節する工程を包含し得る。
本発明の製造方法のＢ）工程は、（Ｂ１）リポソームを提供する工程；（Ｃ１）ｐＨが調節された該ｃｉｓ−ジアンミンジニトラト白金（ＩＩ）溶液と、該リポソームとを、１：９〜９：１の範囲内の比で混合して、分画分子量５００〜３００，０００（好ましくは、１０，０００）で限外濾過に供する工程を包含し得る。
１つの実施形態において、本発明のアンミン白金錯体を内包するリポソームは、以下の方法によって製造され得る。具体的には、この方法は、Ａ）２つのアンミン基を有する水溶性の白金錯体を含む溶液を提供する工程；Ｂ）該水溶性の白金錯体を含む溶液とリポソーム形成能を有する脂質懸濁液とを混合して混合溶液を作製する工程；Ｃ）該混合溶液をリポソームが形成する条件に供する工程；およびＤ）該混合溶液を、形成する塩が難水溶性であるイオンを含む溶液の存在下に供する工程、を包含する。好ましくは、本発明の水溶性の白金錯体は、ｃｉｓ−ジアンミンジニトラト白金（ＩＩ）であり得る。
より好ましい製造方法としては、以下の工程：Ａ−１）２つのアンミン基を有する水溶性の白金錯体を含む溶液を調製する工程；Ａ−２）該水溶性の白金錯体を含む溶液のｐＨをｐＨ６〜１０の範囲内に調節する工程；Ｂ−１）ｐＨが調節された該ｃｉｓ−ジアンミンジニトラト白金（ＩＩ）溶液と、超音波処理した脂質懸濁液とを、１：９〜９：１の範囲内の比で混合して混合溶液を作製する工程；およびＣ−１）該混合溶液を限外濾過に供する工程；およびＤ−１）限外濾過後に、該混合溶液を塩化物イオン（Ｃｌ−）の存在下に供する工程、を包含する方法が挙げられる。
本発明のｃｉｓ−ジアミンジクロロ白金（ＩＩ）を内包するリポソームは、以下の方法によって製造され得る。具体的には、この方法は、（Ａ１）ｃｉｓ−ジアンミンジニトラト白金（ＩＩ）を、塩化物イオン（Ｃｌ−）を実質的に含まないＮ−トリス（ヒドロキシメチル）−３−アミノプロパンスルホン酸緩衝液に溶解し、ｃｉｓ−ジアンミンジニトラト白金（ＩＩ）を含む溶液を調製する工程；（Ａ２）該ｃｉｓ−ジアンミンジニトラト白金（ＩＩ）を含む溶液のｐＨをｐＨ８．４に調節する工程；（Ｂ１）ジパルミトイルホスファチジルコリン、コレステロール、ガングリオシド、ジセチルホスフェート、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミンおよびコール酸ナトリウムを、３５：４０：１５：５：５：１６７のモル比で混合させて脂質を調製する工程；（Ｂ２）該脂質を、メタノール・クロロホルム（１：１）溶液に懸濁して攪拌し、該攪拌した溶液を蒸発させ、沈殿物を真空乾燥させることにより脂質膜を得る工程；および（Ｂ３）該脂質膜を、塩化物イオン（Ｃｌ−）を実質的に含まないＮ−トリス（ヒドロキシメチル）−３−アミノプロパンスルホン酸緩衝液（ｐＨ８．４）に懸濁させて脂質懸濁液を作製する工程、（Ｂ４）該脂質懸濁液を３０℃〜４０℃で攪拌させ、窒素置換し、超音波処理する工程；（Ｂ５）ｐＨが調節された該ｃｉｓ−ジアンミンジニトラト白金（ＩＩ）溶液と、超音波処理した脂質懸濁液とを、７：３の範囲内の比で混合して混合溶液を作製する工程；（Ｃ１）該混合溶液を分画分子量１０，０００で限外濾過に供する工程；および（Ｄ１）限外濾過後に、該混合溶液を、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）−３−アミノプロパンスルホン酸緩衝液（ｐＨ８．４）、炭酸緩衝液（ｐＨ８．５）、ＰＢＳ（ｐＨ８．０）およびＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．２）からなる群より選択される少なくとも１つの緩衝液に曝す工程、包含する。
本明細書において使用される場合、用語「混合物」とは、水溶性アンミン白金錯体、白金錯体原料またはその組合せ（本明細書において、水溶性アンミン白金錯体等とも称される。）と、リポソーム、該リポソーム原料またはその組合せ（本明細書において、リポソーム等とも称される。）とを混合して含むものをいう。
本明細書において使用される場合、用語「混合溶液」とは、水溶性の白金錯体を含む溶液とリポソーム形成能を有する脂質懸濁液とを混合して作製した溶液をいう。
リポソーム、リポソーム原料またはその組合せ、白金錯体、白金錯体原料またはその組合せ、必要であれば緩衝液は、任意の順序で混合することができる。例えば、これらの順序は、１）リポソーム原料と白金錯体とを混合して緩衝液を添加する順序、２）リポソーム原料と緩衝液とを混合した後に、白金錯体を添加する順序、３）白金錯体を緩衝液に溶解した後にリポソーム原料を添加する順序であり得るが、これらに限定されない。なぜなら、リポソームが形成・維持される条件を保持する限り、どのような順序で混合されても、リポソームが存在する時点で水溶性アンミン白金錯体がリポソームに接触することができるかぎり、本発明は達成することができるからである。水溶液中で強酸性を示す白金錯体を用いる場合には、混合液は、ｐＨ６〜１０の範囲が好ましい。
すなわち、本発明では、リポソーム「形成・維持」条件を保持する限り問題がない、と理解される。
理論に束縛されることを望まないが、水溶液中で強酸性の白金錯体（シスプラチン硝酸体含む）は、脂質成分とシスプラチン硝酸体の混合物を水溶液で再溶解する場合、アルカリ性の緩衝液で再懸濁する必要があり、酸性化では、脂質が分解することから、これらの条件を考慮することができる。アルカリ性の必要なレベルとしては、たとえば、80mgシスプラチン硝酸体を4mlのTAPS(pH8.4)に溶解するとき、1NNaOHが約350μl加える事を利用することができる。
本発明の製造方法では、この混合物を、リポソーム形成維持条件に供する工程であって、ただし、該リポソームが存在する時点で該白金錯体の形成する塩が水溶性の状態に供することにより、本発明のアンミン白金錯体を内包するリポソームが作製され得る。この混合物は、ｐＨ６〜１０の範囲内にありさえすればよい。なぜなら、中性付近のｐＨであれば、リポソームを形成することおよび／またはリポソームを維持することが可能であるからである。
本明細書において使用される場合、用語「リポソーム形成維持条件」とは、リポソームが形成するか、および／またはリポソームが維持されるための条件をいう。
本明細書において使用される場合、用語「リポソームが形成する」条件とは、この混合物（例えば、混合溶液）中でリポソームが形成するための条件をいう。リポソームが形成する条件は、例えば、該混合物を限外濾過に供すること、該混合物を一晩静置すること等であり得る。さらに好ましくは、リポソームが形成する条件は、この混合物を分画分子量５００〜３００，０００（好ましくは、１０，０００）で限外濾過に供することであり得る。
本明細書において使用される場合、用語「リポソームが維持される」条件とは、この混合物（例えば、混合溶液）中でリポソームが維持されるための条件をいう。リポソームが維持される条件は、例えば、理論に束縛されることを望まないが、リポソームは、ｐＨ６．０以下になると壊れ維持されない。界面活性剤を添加すると壊れれる為、維持されない。超音波など物理化学的な力により壊れる為、維持されない。高温６０℃以上になると壊れるので維持されない。外液中にＣｌ−，Ｂｒ−，Ｉ−，ＳＣＮ−，ＣＮ−または核酸塩基（グアニン、シトシン）が含まれると、水溶性白金錯体の状態で存在しないか、または不活性化する。（グアニン塩基のＮ７位の窒素と結合すると不活化することから、これらを考慮することができる。
本明細書において使用される場合、用語「白金錯体の形成する塩が水溶性の状態である条件」とは、その混合物中で白金錯体の形成する塩が水溶性の状態となる条件をいう。例えば、このような条件としては、混合液を、白金錯体が形成する塩が難水溶性であるイオンを含まない溶液の条件下におくことをいう。
本明細書において使用される場合、用語「形成する塩が難水溶性であるイオンを含まない」とは、その溶液中で白金錯体が難水溶性塩を形成し得るイオンを実質的に含まないことをいう。形成する塩が難水溶性であるイオンは、例えば、塩化物イオン（Ｃｌ−）、臭化物イオン（Ｂｒ−）、ヨウ化物イオン（Ｉ−）、チオシアン酸イオン（ＳＣＮ−）、シアン化物イオン（ＣＮ−）等であり得る。この溶液は、形成する塩が難水溶性であるイオンを含まないか、含んだとしても白金錯体が難水溶性塩を形成するほど含んでいなければよい。
本明細書において使用される場合、難水溶性塩を形成し得るイオンを「実質的に含まない」とは、難水溶性塩を形成しない程度の濃度で該イオンを含み得ることをいう。例えば、難水溶性塩を形成し得るイオンが塩化物イオン（ＣＬ−）であれば、その濃度は、体内で存在する濃度以下の濃度（約０〜４ｍＭ程度)であるといえる。難水溶性塩を形成し得
る濃度は、以下のような工程を包含する方法により、実験的に決定され得る：
１）アンミン白金錯体を含む水溶液（６ｍＭ）を調製する工程；
２）種々の濃度で難水溶性塩を形成し得るイオンを含む溶液（終濃度０〜２００ｍＭ）を調製する工程；
３）２）工程の難水溶性塩を形成し得るイオンを含む溶液を、１）工程のアンミン白金錯体を含む水溶液に、該イオンが難水溶性塩を形成するまで添加する工程；および
４）該イオンを含む溶液を添加した量から、難水溶性塩を形成し得る濃度を算出する工程。
難水溶性塩を形成しない濃度は、他の塩についても同様に定義される。
本明細書において使用される場合、用語「水溶性」とは、水に溶ける性質をいう。本発明のアンミン白金錯体内包リポソームの製造方法によりリポソームに内包されるアンミン白金錯体は、好ましくは、難水溶性である。本明細書において使用される場合、用語「難水溶性」とは、水に溶けないか、ほとんど溶けない性質をいう。
本明細書において「第一緩衝液」とは、水溶性アンミン白金錯体、その白金錯体の材料またはその組合せを溶解するための緩衝液をいう。
本発明の製造方法において、第一緩衝液は、その緩衝液中で白金錯体が難水溶性塩を形成し得るイオンを含まないものが使用され得る。この第一緩衝液は、形成する塩が難水溶性であるイオンを含まないか、含んだとしても白金錯体が難水溶性塩を形成するほど含んでいなければよい。形成する塩が難水溶性であるイオンとは、例えば、塩化物イオン（Ｃｌ−）、臭化物イオン（Ｂｒ−）、ヨウ化物イオン（Ｉ−）、チオシアン酸イオン（ＳＣＮ−）、シアン化物イオン（ＣＮ−）等であり得る。この第一緩衝液は、例えば、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）−３−アミノプロパンスルホン酸緩衝剤（ｐＨ８．４）、炭酸緩衝剤（ｐＨ８．５）、リン酸緩衝剤（ｐＨ８．０）、２−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）緩衝剤（ｐＨ７．２）、トリス（ヒドロキシ）アミノメタン緩衝剤、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸緩衝剤、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）１−２−アミノエタンスルホン酸緩衝剤、Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２エタンスルホン酸緩衝剤、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−ヒドロキシ−３−アミノプロパンスルホン酸緩衝剤、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−ヒドロキシプロパンスルホン酸）緩衝剤、Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−ヒドロキシプロパン−３−プロパンスルホン酸緩衝剤、トリス（ヒドロキシメチルメチルグリシン）緩衝剤、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン緩衝剤、２−（シクロヘキシルアミノ）エタンスルホン酸緩衝剤、３−Ｎ−シクロヘキシルアミノ−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸緩衝剤、３−シクロヘキシルアミノプロパンスルホン酸緩衝剤等を含む緩衝液が使用され得る。好ましくは、第一緩衝液は、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）−３−アミノプロパンスルホン酸緩衝剤（好ましくは、ｐＨ８．４）を含む緩衝液であり得る。
本明細書において「白金錯体溶液」とは、水溶性アンミン白金錯体を第一緩衝液に溶解して調製した、水溶性の白金錯体を含む溶液をいう。白金錯体溶液は、例えば、シスプラチン硝酸体であれば、１５ｍＭ〜３００ｍＭ 溶解度の範囲を基にシスプラチン硝酸体（分子量３５３）を基準として範囲を設定することができる。このような水溶性の白金錯体を含む溶液は、当該分野において公知であり、そして慣用的な実験および当該分野の技術常識しか必要としない。従って、このような溶液の調製は、当業者の技術範囲内である。
本明細書において使用される場合、用語「水溶性の白金錯体を含む溶液」とは、水溶性の状態で白金錯体を含む溶液であればよい。この水溶性の白金錯体を含む溶液は、ｐＨ６〜１０（好ましくは、８．４）の範囲内に調節され得る。この水溶性の白金錯体を含む溶液は、形成する塩が難水溶性であるイオンを含まない溶液であり得る。
本発明において使用される水溶性の白金錯体を含む溶液は、例えば、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）−３−アミノプロパンスルホン酸緩衝剤（ｐＨ８．４）、炭酸緩衝剤（ｐＨ８．５）、リン酸緩衝剤（ｐＨ８．０）、２−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）緩衝剤（ｐＨ７．２）、トリス（ヒドロキシ）アミノメタン緩衝剤、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸緩衝剤、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）１−２−アミノエタンスルホン酸緩衝剤、Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２エタンスルホン酸緩衝剤、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−ヒドロキシ−３−アミノプロパンスルホン酸緩衝剤、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−ヒドロキシプロパンスルホン酸）緩衝剤、Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−ヒドロキシプロパン−３−プロパンスルホン酸緩衝剤、トリス（ヒドロキシメチルメチルグリシン）緩衝剤、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン緩衝剤、２−（シクロヘキシルアミノ）エタンスルホン酸緩衝剤、３−Ｎ−シクロヘキシルアミノ−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸緩衝剤、３−シクロヘキシルアミノプロパンスルホン酸緩衝剤等を含み得る。好ましくは、水溶性の白金錯体を含む溶液は、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）−３−アミノプロパンスルホン酸緩衝剤（ｐＨ８．４）を含み得る。「白金錯体溶液」または「水溶性の白金錯体を含む溶液」は、上記以外の緩衝剤を含んでいてもよい。なぜなら、リポソームが存在する時点で、アンミン白金錯体を水溶性の状態に保つことができればよいからである。このような緩衝剤は、ｐＨ６〜１０に緩衝能を有し、白金錯体と結合性を有する陰イオンを含んでいなければ、リポソームを維持し、水溶性白金錯体を維持することができる。
本明細書において使用される場合、用語「脂質懸濁液」とは、リポソーム形成能を有する脂質の懸濁液であり、リポソームを形成する条件に供したときにリポソームを形成する脂質が懸濁した任意の液をいう。膜状態で懸濁している場合は、「脂質膜懸濁液」ともいう。また、脂質が溶媒に溶解している場合には、「脂質溶液」ともいう。広義には、脂質溶液は、脂質懸濁状態のものも包含しうる。
そのような「リポソーム形成能を有する脂質の懸濁液」の組成は、以下の説明のように、当業者は、その組成を適宜決めることができ、その範囲が明確に決定することができる。その説明は以下のとおりである：本発明において使用され得る脂質懸濁液は、リポソームの作製に一般的に用いられる脂質により作製され得る。リポソームの作製に一般的に用いられる脂質としては、例えば、ホスファチジルコリン、コレステロール等が挙げられる。リポソームの作製において代替的に使用され得る脂質としては、ホスファチジルエタノールアミン、ガングリオシド、コール酸ナトリウム、ジセチルホスフェート、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ジホスファチジルグリセロール、カルジオリピン、スルホキシリボシルジグリセリド、ジガラクトシルジグリセリド、ガラクトシルジグリセリド等が挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、本発明において使用され得る脂質懸濁液は、以下の範囲の組成であり得る：
ホスファチジルコリン：０〜５０ｍＭ
ホスファチジルエタノールアミン：０〜３．３ｍＭ
コレステロール：０〜２６．１ｍＭ
ガングリオシド：０〜９．３ｍＭ
コール酸ナトリウム：０〜１０８．９ｍＭ
ジセチルホスフェート：０〜３．２９ｍＭ。
このリポソーム形成能を有する脂質の懸濁液は、Ｂ−ｉ）ポソーム原料である脂質を、メタノール・クロロホルム溶液（好ましくは、１：１）に懸濁して攪拌し、該攪拌した溶液を蒸発させ、沈殿物を真空乾燥させることにより脂質膜を得る工程；Ｂ−ｉｉ）該脂質膜を、第二緩衝液（懸濁緩衝液）に懸濁する工程によって作製され得る。この脂質懸濁液は超音波処理されていてもよい。この脂質懸濁液は、脂質として、ジパルミトイルホスファチジルコリン、コレステロール、ガングリオシド、ジセチルホスフェート、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミンおよびコール酸ナトリウムを（好ましくは、３５：４０：１５：５：５：１６７のモル比）で含み得る。本方法において、水溶性アンミン白金錯体を含む溶液と脂質懸濁液とは、１：９〜９：１の範囲内（好ましくは、７：３）の比で混合され得る。
本明細書において「第二緩衝液」とは、脂質懸濁液を溶解するための緩衝液をいう。この第二緩衝液は、本明細書において「懸濁緩衝液」ともいう。
本発明の製造方法において、第二緩衝液は、その緩衝液中で白金錯体が難水溶性塩を形成し得るイオンを含まないものが使用され得る。この懸濁緩衝液は、形成する塩が難水溶性であるイオンを含まないか、含んだとしても白金錯体が難水溶性塩を形成するほど含んでいなければよい。形成する塩が難水溶性であるイオンとは、例えば、塩化物イオン（Ｃｌ−）、臭化物イオン（Ｂｒ−）、ヨウ化物イオン（Ｉ−）、チオシアン酸イオン（ＳＣＮ−）、シアン化物イオン（ＣＮ−）等であり得る。この第二緩衝液は、例えば、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）−３−アミノプロパンスルホン酸緩衝剤（ｐＨ８．４）、炭酸緩衝剤（ｐＨ８．５）、リン酸緩衝剤（ｐＨ８．０）、２−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）緩衝剤（ｐＨ７．２）、トリス（ヒドロキシ）アミノメタン緩衝剤、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸緩衝剤、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）１−２−アミノエタンスルホン酸緩衝剤、Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２エタンスルホン酸緩衝剤、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−ヒドロキシ−３−アミノプロパンスルホン酸緩衝剤、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−ヒドロキシプロパンスルホン酸）緩衝剤、Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−ヒドロキシプロパン−３−プロパンスルホン酸緩衝剤、トリス（ヒドロキシメチルメチルグリシン）緩衝剤、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン緩衝剤、２−（シクロヘキシルアミノ）エタンスルホン酸緩衝剤、３−Ｎ−シクロヘキシルアミノ−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸緩衝剤、３−シクロヘキシルアミノプロパンスルホン酸緩衝剤等を含む緩衝液が使用され得る。好ましくは、第一緩衝液は、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）−３−アミノプロパンスルホン酸緩衝剤（好ましくは、ｐＨ８．４）を含む緩衝液であり得る。
「第二緩衝液」または「懸濁緩衝液」は、上記以外の緩衝剤を含んでいてもよい。なぜなら、リポソームが存在する時点で、アンミン白金錯体を水溶性の状態に保つことができればよいからである。このような緩衝剤は、ｐＨ６〜１０に緩衝能を有し、白金錯体と結合性を有する陰イオンを含んでいなければ、リポソームを維持し、水溶性白金錯体を維持することができる。
本明細書において、第一緩衝液と第二緩衝液とは、同じ組成であってもよいし、別の組成であってもよい。なぜなら、これらの緩衝液は、リポソームが存在する時点で白金錯体を水溶性の状態に保つことができるような緩衝液でありさえすれば、どのようなものであってもよいからである。
本明細書において使用される場合、用語「白金錯体の形成する塩が難水溶性であるイオンを含む溶液の存在下」とは、白金錯体の形成する塩が難水溶性であるイオンが提供され得る環境下におくことをいう。
好ましい実施形態において、「白金錯体の形成する塩が難水溶性であるイオンを含む溶液の存在下」は、塩化物イオン（Ｃｌ−）の存在下であり得る。
本製造方法において、白金錯体の形成する塩が難水溶性であるイオン（例えば、塩化物イオン（Ｃｌ−））は、例えば、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）−３−アミノプロパンスルホン酸緩衝液（ｐＨ８．４）、炭酸緩衝液（ｐＨ８．５）、ＰＢＳ（ｐＨ８．０）またはＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．２）、トリス（ヒドロキシ）アミノメタン緩衝液、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸緩衝液、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）１−２−アミノエタンスルホン酸緩衝液、Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２エタンスルホン酸緩衝液、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−ヒドロキシ−３−アミノプロパンスルホン酸緩衝液、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−ヒドロキシプロパンスルホン酸）緩衝液、Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−ヒドロキシプロパン−３−プロパンスルホン酸緩衝液、トリス（ヒドロキシメチルメチルグリシン）緩衝液、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン緩衝液、２−（シクロヘキシルアミノ）エタンスルホン酸緩衝液、３−Ｎ−シクロヘキシルアミノ−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸緩衝液、３−シクロヘキシルアミノプロパンスルホン酸緩衝液等により提供され得るが、これらに限定されない。なぜなら、ｐＨ６〜１０に緩衝能を有し、白金錯体と結合性を有する陰イオンを含んでいなければ、リポソームを維持し、水溶性白金錯体を維持することができるからである。一般的な緩衝液の調製および特徴づけは、当該分野において公知であり、そして慣用的な実験および当該分野の技術常識しか必要としない。従って、目的とするアンミン白金錯体の難水溶性塩と、上記ｐＨ、緩衝液が含み得るイオン等を考慮して、当業者は、白金錯体が難水溶性の塩を形成するイオンを含む緩衝液を適宜、選択することができる。
本方法において、塩化物イオン（Ｃｌ−）は、ＮａＣｌ、ＨＣｌ、ＣａＣｌ２により提供され得るが、これらに限定されない。好ましくは、塩化物イオン（Ｃｌ−）は、ＮａＣｌにより提供され得る。
好ましい実施形態において、本発明におけるリポソームは、ガングリオシド、糖脂質またはホスファチジルグリセロールを含ませてそれにペプチドなどのリンカーを結合させ、標的指向性物質（例えば、抗体、糖鎖、レクチン、相補的核酸、レセプター、リガンド、アプタマー、抗体など）を結合させることが可能である。
本明細書において使用される場合、用語「標的指向性物質」とは、病態（特に、腫瘍）を特異的に認識するものをいう。本発明において使用される「標的指向性物質」としては、抗体、糖鎖、レクチン、相補的核酸、レセプター、リガンド、アプタマー、抗体等が挙げられ得るが、これらに限定されるものではない。なぜなら、標的指向性物質は、リポソームを破壊することなく、リポソームに標的指向性を付与するようなものであれば、よいからである。当業者は、標的にあわせて、リポソームに結合させる標的指向性物質を適宜、決定することができる。適切な架橋剤を用いることによって、あらゆる物質をリポソーム膜表面に修飾することができる。
本明細書において使用される場合、用語「抗体」とは、免疫原である抗原によって惹起された特異的なアミノ酸配列を有する免疫グロブリン分子をいう。抗体は、Ｂ細胞により生産され、血液、体液中に存在する。抗体は、抗原と特異的に反応するという特徴を有する。抗体は、抗原の呈示による刺激の結果としてではなく自然に存在する場合もあり得る。基本的には、抗体の分子構造は各２本の軽鎖と重鎖とから形成されるが、二量体、三量体、五量体としても存在し得る。これらとしては、例えば、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＧ等が挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書において「糖鎖」とは、単位糖（単糖および／またはその誘導体）が１つ以上連なってできた化合物をいう。単位糖が２つ以上連なる場合は、各々の単位糖同士の間は、グリコシド結合による脱水縮合によって結合する。このような糖鎖としては、例えば、生体中に含有される多糖類（グルコース、ガラクトース、マンノース、フコース、キシロース、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン、シアル酸ならびにそれらの複合体および誘導体）の他、分解された多糖、糖タンパク質、プロテオグリカン、グリコサミノグリカン、糖脂質などの複合生体分子から分解または誘導された糖鎖など広範囲なものが挙げられるがそれらに限定されない。したがって、本明細書では、糖鎖は、「多糖（ポリサッカリド）」、「糖質」、「炭水化物」と互換可能に使用され得る。また、特に言及しない場合、本明細書において「糖鎖」は、糖鎖および糖鎖含有物質の両方を包含することがある。代表的には、約２０種類の単糖（グルコース、ガラクトース、マンノース、フコース、キシロース、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン、シアル酸ならびにそれらの複合体および誘導体など）が鎖状につながった物質で、生体の細胞内外のタンパク質や脂質に付いている。単糖の配列によって機能が異なり、通常は複雑に枝分かれしていて、人体には数百種類以上の多様な構造の糖鎖があると予想されており、さらに、人体において有用な構造は数万種類以上あると考えられている。細胞間での分子・細胞認識機能などタンパク質や脂質が生体内で果たす高次機能に関係していると見られているが、そのメカニズムは未解明の部分が多い。核酸、タンパク質に次ぐ第３の生命鎖として現在のライフサイエンスで注目されている。とりわけ、細胞認識におけるリガンド（情報分子）としての糖鎖の機能が期待され、その高機能材料開発への応用が研究されている。
本明細書において「糖」または「単糖」とは、少なくとも１つの水酸基および少なくとも１つのアルデヒド基またはケトン基を含む、ポリヒドロキシアルデヒドまたはポリヒドロキシケトンをいい、糖鎖の基本単位を構成する。本明細書において使用される場合、糖はまた、炭水化物ともいい、両者は互換的に用いられる。本明細書において使用される場合、特に言及するときは、糖鎖は、１つ以上糖が連なった鎖または配列をいい、糖または単糖というときは、糖鎖を構成する１つの単位をいう。ここで、ｎ＝２、３、４、５、６、７、８、９および１０であるものを、それぞれジオース、トリオース、テトロース、ペントース、ヘキソース、ヘプトース、オクトース、ノノースおよびデコースという。一般に鎖式多価アルコールのアルデヒドまたはケトンに相当するもので、前者をアルドース，後者をケトースという。本発明では、いずれの形式のものでも使用され得る。
本発明において糖を記載するために使用する命名法および略称は、通常の命名法に従う。例えば、β−Ｄ−ガラクトース
は、Ｇａｌ；
Ｎ−アセチル−α−Ｄ−ガラクトサミン
は、ＧａｌＮＡｃ；
α−Ｄ−マンノース
は、Ｍａｎ；
β−Ｄ−グルコース
は、Ｇｌｃ；
Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミン
は、ＧｌｃＮＡｃ；
α−Ｌ−フコース
は、Ｆｕｃ；
α−Ｎ−アセチルノイラミン酸
は、Ｎｅｕ５Ａｃ；
セラミド
は、Ｃｅｒ；
Ｌ−セリン
ＣＨ２（ＯＨ）ＣＨ（ＣＯＯＨ）ＮＨ２
は、Ｓｅｒにより表す。なお、Ｃｅｒは通常脂質に分類されるが、本明細書では、糖鎖を構成する糖の一種の定義にも入ることから特に言及しない限り、糖として扱う。また、Ｓｅｒは通常アミノ酸に分類されるが、本明細書では、糖鎖を構成する糖の一種の定義にも入ることから特に言及しない限り、糖として扱う。環状の２つのアノマーは、αおよびβにより表す。表示上の理由により、ａまたはｂと表すことがある。従って、本明細書において、αとａ、βとｂは、アノマー表記については交換可能に使用される。
本明細書において、ガラクトースとは、任意の異性体を指すが、代表的にはβ−Ｄ−ガラクトースであり、特に言及しないときには、β−Ｄ−ガラクトースを指すものとして使用される。
本明細書において、アセチルガラクトサミンとは、任意の異性体を指すが、代表的にはＮ−アセチル−α−Ｄ−ガラクトサミンであり、特に言及しないときには、Ｎ−アセチル−α−Ｄ−ガラクトサミンを指すものとして使用される。
本明細書において、マンノースとは、任意の異性体を指すが、代表的にはα−Ｄ−マンノースであり、特に言及しないときには、α−Ｄ−マンノースを指すものとして使用される。
本明細書において、グルコースとは、任意の異性体を指すが、代表的にはβ−Ｄ−グルコースであり、特に言及しないときには、β−Ｄ−グルコースを指すものとして使用される。
本明細書において、アセチルグルコサミンとは、任意の異性体を指すが、代表的にはＮ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミンであり、特に言及しないときには、Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミンを指すものとして使用される。
本明細書において、フコースとは、任意の異性体を指すが、代表的にはα−Ｌ−フコースであり、特に言及しないときには、α−Ｌ−フコースを指すものとして使用される。
本明細書において、アセチルノイラミン酸とは、任意の異性体を指すが、代表的にはα−Ｎ−アセチルノイラミン酸であり、特に言及しないときにはα−Ｎ−アセチルノイラミン酸を指すものとして使用される。
本明細書において、セリンとは、任意の異性体を指すが、代表的にはＬ−セリンであり、特に言及しないときにはＬ−セリンを指すものとして使用される。
本明細書において、糖の表示記号、呼称、略称（Ｇｌｃなど）などは、単糖を表すときと、糖鎖中で使用されるときとは、異なることに留意する。糖鎖中、単位糖は、結合先の別の単位糖との間に脱水縮合があるので、相方から水素または水酸基を除いた形で存在することになる。従って、これらの糖の略号は、単糖を表すときに使用されるときは、すべての水酸基が存在するが、糖鎖中で使用されるときは、水酸基が結合先の糖の水酸基とが脱水縮合されて酸素のみが残存した状態を示していることが理解される。
糖が、アルブミンと共有結合されるときには、糖の還元末端がアミノ化され、そのアミン基を介してアルブミンなどの他の成分に結合することができるが、その場合は還元末端の水酸基がアミン基に置換されたものを指すことに留意する。
単糖は一般に、グリコシド結合により結合されて二糖および多糖を形成する。環の平面に関する結合の向きは、αおよびβにより示す。２つの炭素の間の結合を形成する特定の炭素原子も記載する。
本明細書において糖鎖は、
により表される。従って、例えば、ガラクトースのＣ−１とグルコースのＣ−４との間のβグリコシド結合は、Ｇａｌβ１，４Ｇｌｃにより表される。従って、例えば、シアリルルイスＸ（ＳＬＸ）は、Ｎｅｕ５Ａｃα２，３Ｇａｌβ１，４（Ｆｕｃα１，３）ＧｌｃＮＡｃと表される。Ｎ-アセチルラクトサミン（Ｇ４ＧＮ）は、Ｇａｌβ１，４ＧｌｃＮＡｃと表される。α1-6マンノビオース（Ａ６）は、Ｍａｎα１，６Ｍａｎと表される。
糖鎖の分岐は、括弧により表し、結合する単位糖のすぐ左に配置して表記する。例えば、
と表され、括弧の中は、
と表記される。従って、例えば、ガラクトースのＣ−１とグルコースのＣ−４との間がβグリコシド結合し、さらにこのグルコースのＣ−３がフコースのＣ−１とαグリコシド結合している場合、Ｇａｌβ１，４（Ｆｕｃα１，３）Ｇｌｃと表される。単糖は、（潜在）カルボニル原子団になるだけ小さい番号を付けることを基本にして表される。有機化学命名法の一般基準では（潜在）カルボニル原子団より優位な原子団が分子中に導入されたときでも、通常上記の番号付けで表される。
本明細書において使用される糖鎖としては、例えば、シアリルルイスＸ、Ｎ−アセチルラクトサミン、α１−６マンノビオースならびにそれらの２つ以上の組み合わせからなる群より選択される糖鎖が挙げられるが、これらに限定されない。２つ以上の組み合わせが使用可能な理由としては、理論に束縛されないが、上記糖鎖の各々が目的の送達部位の組織または細胞に局在するレクチンに対して特異性を有しており、混在してもその特異性を発揮すると考えられるからである。
本明細書において使用される場合、用語「レクチン」とは、細胞膜複合糖質（糖タンパク質および糖脂質）の糖鎖と結合能を有する物質をいい、細胞凝集，分裂誘発，機能活性化，細胞障害などの効果をおよぼす能力を有する。糖鎖を細胞が発信する情報分子とすれば、レクチンは受信分子であるといえる。一定の性質を有する細胞または組織は、それに相応したレクチンのパターンを有する。レクチンは、感染、生体防御、免疫、受精、標的細胞へのターゲティング、細胞分化、細胞間接着、新生糖タンパク質の品質管理および細胞内選別輸送などを実現する。レクチンは、多用な糖鎖結合性を有し、速やかな結合および解離という固有の物理化学的性質を有することにより厳格に制御されている。糖鎖認識蛋白質とも呼ばれる。植物レクチンについての研究は古く、既に約３００種類が知られている。最近、動物レクチンについても活発に研究が行われており、新規レクチンの発見が続いている。動物細胞膜上に在る主要なレクチンファミリーのレクチン群（約１００種類）に基づく多彩な糖鎖認識機能が研究されている。とりわけ、多様な構造をもつ糖鎖リガンドの構造情報を受け取るレセプター（情報受容蛋白質、または、標的分子）としての機能が注目されている。
本明細書において使用される場合、用語「相補的核酸」とは、当該分野において用いられる最も広義の意味として定義され、核酸の塩基対合律により、互いに塩基対を形成し得る核酸をいう。これらとしては、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ等が挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書において使用される場合、用語「レセプター」とは、「受容体」とも称され、細胞に存在して外部からの刺激を認識し、伝達するための構造を有するものをいう。これらとしては、例えば、細胞表面受容体、細胞内受容体等が挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書において使用される場合、用語「リガンド」とは、物質にとって、それ自体が非常に強固に吸着される分子をいう。これらとしては、例えば、タンパク質、核酸、化学物質等が挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書において使用される場合、用語「アプタマー」とは、種々の物質（タンパク質、化学物質など）の構造を認識し、結合し得る比較的分子量の小さい核酸をいう。これらとしては、例えば、ＲＮＡアプタマー、ＤＮＡアプタマー等が挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書において使用される場合、用語「抗原」とは、抗体の産生を促す働きを有する物質をいう。例えば、高分子の糖、タンパク質、それらの複合体、ウイルス、細胞などが挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書中で使用される場合、「親水性化」は、リポソーム表面に親水性化合物を結合させることをいう。親水性化に用いる化合物としては、低分子の親水性化合物、好ましくは少なくとも１つのＯＨ基を有する低分子の親水性化合物、さらに好ましくは、少なくとも２つのＯＨ基を有する低分子の親水性化合物が挙げられる。また、さらに少なくとも１つのアミノ基を有する低分子の親水性化合物、すなわち分子中に少なくとも１つのＯＨ基と少なくとも１つのアミノ基を有する親水性化合物が挙げられる。このような親水性化合物として、例えば、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンなどを含むトリス（ヒドロキシアルキル）アミノアルカン等のアミノアルコール類等が挙げられ、さらに具体的には、トリス（ヒドロキシメチノレ）アミノエタン、トリス（ヒドロキシエチル）アミノエタン、トリス（ヒドロキシプロピル）アミノエタン、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、トリス（ヒドロキシエチル）アミノメタン、トリス（ヒドロキシプロピル）アミノメタン、トリス（ヒドロキシメチル）アミノプロパン、トリス（ヒドロキシエチル）アミノプロパン、トリス（ヒドロキシプロピル）アミノプロパン等が挙げられる。
本明細書において「アルキル」とは、メタン、エタン、プロパンのような脂肪族炭化水素（本明細書において「アルカン」という）から水素原子が一つ失われて生ずる１価の基をいい、一般にＣｎＨ２ｎ＋１−で表される（ここで、ｎは正の整数である）。アルキルは、直鎖または分枝鎖であり得る。本明細書において「置換されたアルキル」とは、以下に規定する置換基によってアルキルのＨが置換されたアルキルをいう。これらの具体例は、Ｃ１〜Ｃ２アルキル、Ｃ１〜Ｃ３アルキル、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、Ｃ１〜Ｃ５アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ７アルキル、Ｃ１〜Ｃ８アルキル、Ｃ１〜Ｃ９アルキル、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、Ｃ１〜Ｃ１１アルキルまたはＣ１〜Ｃ１２アルキル、Ｃ１〜Ｃ２置換されたアルキル、Ｃ１〜Ｃ３置換されたアルキル、Ｃ１〜Ｃ４置換されたアルキル、Ｃ１〜Ｃ５置換されたアルキル、Ｃ１〜Ｃ６置換されたアルキル、Ｃ１〜Ｃ７置換されたアルキル、Ｃ１〜Ｃ８置換されたアルキル、Ｃ１〜Ｃ９置換されたアルキル、Ｃ１〜Ｃ１０置換されたアルキル、Ｃ１〜Ｃ１１置換されたアルキルまたはＣ１〜Ｃ１２置換されたアルキルであり得る。アルカンについては、これらの具体例は、Ｃ１〜Ｃ２アルカン、Ｃ１〜Ｃ３アルカン、Ｃ１〜Ｃ４アルカン、Ｃ１〜Ｃ５アルカン、Ｃ１〜Ｃ６アルカン、Ｃ１〜Ｃ７アルカン、Ｃ１〜Ｃ８アルカン、Ｃ１〜Ｃ９アルカン、Ｃ１〜Ｃ１０アルカン、Ｃ１〜Ｃ１１アルカンまたはＣ１〜Ｃ１２アルカン、Ｃ１〜Ｃ２置換されたアルカン、Ｃ１〜Ｃ３置換されたアルカン、Ｃ１〜Ｃ４置換されたアルカン、Ｃ１〜Ｃ５置換されたアルカン、Ｃ１〜Ｃ６置換されたアルカン、Ｃ１〜Ｃ７置換されたアルカン、Ｃ１〜Ｃ８置換されたアルカン、Ｃ１〜Ｃ９置換されたアルカン、Ｃ１〜Ｃ１０置換されたアルカン、Ｃ１〜Ｃ１１置換されたアルカンまたはＣ１〜Ｃ１２置換されたアルカンであり得る。ここで、例えばＣ１〜Ｃ１０アルキルとは、炭素原子を１〜１０個有する直鎖または分枝状のアルキルを意味し、メチル（ＣＨ３−）、エチル（Ｃ２Ｈ５−）、ｎ−プロピル（ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２−）、イソプロピル（（ＣＨ３）２ＣＨ−）、ｎ−ブチル（ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−）、ｎ−ペンチル（ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−）、ｎ−ヘキシル（ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−）、ｎ−ヘプチル（ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−）、ｎ−オクチル（ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−）、ｎ−ノニル（ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−）、ｎ−デシル（ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−）、−Ｃ（ＣＨ３）２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２、−ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２などが例示される。また、例えば、Ｃ１〜Ｃ１０置換されたアルキルとは、Ｃ１〜Ｃ１０アルキルであって、そのうち１または複数の水素原子が置換基により置換されているものをいう。Ｒとしては、Ｃ１〜Ｃ６アルキルが好ましく、特にＣ１〜Ｃ６アルキルが好ましい。
本発明の物質または上で定義した官能基が置換基Ｒによって置換されている場合、そのような置換基Ｒは、単数または複数存在し、それぞれ独立して、水素、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、シクロアルケニル、アルキニル、アルコキシ、炭素環基、ヘテロ環基、ハロゲン、ヒドロキシ、チオ−ル、シアノ、ニトロ、アミノ、カルボキシ、アシル、チオカルボキシ、アミド、置換されたアミド、置換されたカルボニル、置換されたチオカルボニル、置換されたスルホニルおよび置換されたスルフィニルからなる群より選択される。
（アンミン白金錯体内包リポソームを製造する技術の用途）
本発明のアンミン白金錯体内包リポソームを製造する技術は、病態（特に、腫瘍・がん）を処置するためのリポソーム製剤を製造するために利用され得る。
本発明のアンミン白金錯体をリポソームに内包させる技術を用いてリポソームに内包される製剤としては、精巣腫瘍、膀胱がん、腎盂・尿管腫瘍、前立腺がん、卵巣がん、頭頸部がん、非小細胞肺がん、食道がん、子宮頸がん、神経芽細胞種、胃がん、小細胞肺がん、骨肉種、胚細胞腫瘍等を処置するための薬剤が挙げられるが、これらに限定されない。この薬剤としては、例えば、ｃｉｓ−ジアンミンジクロロ白金（ＩＩ）、ｃｉｓ−ジアンミン−１，１−シクロブタン−ジカルボキシラト白金（ＩＩ）、ｃｉｓ−ジアンミン（グリコラト）白金（ＩＩ）、（１Ｒ，２Ｒ−ジアンミンシクロへキサン）オキサラト白金（ＩＩ）、ｃｉｓ−ジアンミンジブロモ白金（ＩＩ）等が挙げられるが、これらに限定されない。
（アンミン白金錯体内包リポソームの用途）
本発明のアンミン白金錯体内包リポソームは、病態（特に、腫瘍・がん）を処置するために利用され得る。
本発明のアンミン白金錯体内包リポソームを用いて処置され得る病態としては、例えば、精巣腫瘍、膀胱がん、腎盂・尿管腫瘍、前立腺がん、卵巣がん、頭頸部がん、非小細胞肺がん、食道がん、子宮頸がん、神経芽細胞種、胃がん、小細胞肺がん、骨肉種、胚細胞腫瘍等を処置するための薬剤が挙げられるが、これらに限定されない。
（好ましい実施形態の説明）
以下に本発明の好ましい実施形態を説明する。以下に提供される実施形態は、本発明のよりよい理解のために提供されるものであり、本発明の範囲は以下の記載に限定されるべきでない。従って、当業者は、本明細書中の記載を参酌して、本発明の範囲内で適宜改変を行うことができることは明らかである。
（アンミン白金錯体内包リポソームの製造方法）
１つの局面において、本発明は、アンミン白金錯体を内包するリポソームを製造する方法を提供する。該方法は、以下の工程：Ａ）水溶性アンミン白金錯体、白金錯体原料またはその組合せを提供する工程；Ｂ）リポソーム、リポソーム原料またはその組合せを提供する工程：およびＣ）該水溶性アンミン白金錯体、白金錯体原料またはその組合せと、該リポソーム、該リポソーム原料またはその組合せとを含む混合物を調製し、リポソーム形成維持条件に供する工程であって、ただし、該リポソームが存在する時点で該白金錯体の形成する塩が水溶性の状態である工程を包含する。この方法は、さらに、Ｄ）前記Ｃ）工程により得られた混合物を、前記白金錯体の形成する塩が難水溶性であるイオンを含む溶液の存在下に供する工程を包含し得る。
１つの実施形態において、本発明において使用され得る水溶性アンミン白金錯体は、２つのアンミン基を有し得る。好ましくは、ｃｉｓ−ジアンミンジニトラト白金（ＩＩ）であり得る。
他の実施形態において、本発明の製造方法は、Ａ）前記水溶性アンミン白金錯体を、第一緩衝液に溶解し、白金錯体溶液を調製する工程；Ｂ）前記リポソーム原料を提供する工程；Ｃ）該白金錯体溶液と、該脂質懸濁液とを混合し、前記リポソーム形成維持条件に供する工程を包含し得る。この方法では、該第一緩衝液および第二緩衝液は、該白金錯体が形成する塩が難水溶性であるイオンを含まないものが使用され得る。
１つの実施形態において、本製造方法の前記Ｂ）工程は、Ｂ−ｉ）リポソーム形成能を有する脂質を、メタノール・クロロホルム溶液に懸濁して攪拌し、該攪拌した溶液を蒸発させ、沈殿物を真空乾燥させることにより脂質膜を得る工程；およびＢ−ｉｉ）該脂質膜を、第二緩衝液に懸濁し、脂質懸濁液を形成する工程を包含し得る。
別の実施形態において、本製造方法では、第一緩衝液と第二緩衝液とは、同じ組成のものであっても、別の組成のものであってもよい。なぜなら、これらの緩衝液は、リポソームが存在する時点で白金錯体を水溶性の状態に保つことができるような緩衝液でありさえすれば、どのようなものであってもよいからである。
別の実施形態において、本発明の製造方法では、前Ｂ−ｉｉ）工程に引き続き、前記脂質懸濁液を超音波処理することを含み得る。
別の実施形態において、本発明の製造方法では、前記Ｃ）工程において、前記リポソーム形成維持条件は、前記白金錯体溶液と前記脂質懸濁液との混合物を限外濾過に供すること、該溶液を一晩静置することを含み得る。前記白金錯体溶液と前記脂質懸濁液との混合物を限外濾過に供することおよび該混合物を一晩静置することは連続して実施されてもよい。
別の実施形態において、本発明の製造方法において使用され得る第一緩衝液は、その緩衝液中で白金錯体が難水溶性塩を形成し得るイオンを含まないものであり得る。この第一緩衝液は、形成する塩が難水溶性であるイオンを含まないか、含んだとしても白金錯体が難水溶性塩を形成するほど含んでいなければよい。形成する塩が難水溶性であるイオンとは、例えば、塩化物イオン（Ｃｌ−）、臭化物イオン（Ｂｒ−）、ヨウ化物イオン（Ｉ−）、チオシアン酸イオン（ＳＣＮ−）、シアン化物イオン（ＣＮ−）等であり得る。この第一緩衝液は、例えば、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）−３−アミノプロパンスルホン酸緩衝剤（ｐＨ８．４）、炭酸緩衝剤（ｐＨ８．５）、リン酸緩衝剤（ｐＨ８．０）、２−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）緩衝剤（ｐＨ７．２）、トリス（ヒドロキシ）アミノメタン緩衝剤、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸緩衝剤、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）１−２−アミノエタンスルホン酸緩衝剤、Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２エタンスルホン酸緩衝剤、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−ヒドロキシ−３−アミノプロパンスルホン酸緩衝剤、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−ヒドロキシプロパンスルホン酸）緩衝剤、Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−ヒドロキシプロパン−３−プロパンスルホン酸緩衝剤、トリス（ヒドロキシメチルメチルグリシン）緩衝剤、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン緩衝剤、２−（シクロヘキシルアミノ）エタンスルホン酸緩衝剤、３−Ｎ−シクロヘキシルアミノ−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸緩衝剤、３−シクロヘキシルアミノプロパンスルホン酸緩衝剤等を含む緩衝液が使用され得るが、これらに限定されない。好ましくは、第一緩衝液は、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）−３−アミノプロパンスルホン酸緩衝剤（好ましくは、ｐＨ８．４）を含む緩衝液である。本発明において第一緩衝液は、上記以外の緩衝液も使用することができる。なぜなら、形成する塩が難水溶性であるイオンを含まないか、含んだとしても白金錯体が難水溶性塩を形成するほど含んでいない緩衝液であれば、白金錯体が難水溶性の塩を形成することがないからである。
好ましい実施形態において、第一緩衝液は、ｐＨ６〜１０（好ましくは、８．４）の範囲内に調節され得る。
別の実施形態において、本発明の製造方法において使用され得る第二緩衝液は、その緩衝液中で白金錯体が難水溶性塩を形成し得るイオンを含まないものであり得る。この第二緩衝液は、形成する塩が難水溶性であるイオンを含まないか、含んだとしても白金錯体が難水溶性塩を形成するほど含んでいなければよい。
本明細書において、白金錯体の「形成する塩が難水溶性であるイオン」とは、例えば、塩化物イオン（Ｃｌ−）、臭化物イオン（Ｂｒ−）、ヨウ化物イオン（Ｉ−）、チオシアン酸イオン（ＳＣＮ−）、シアン化物イオン（ＣＮ−）等であり得る。この第一緩衝液は、例えば、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）−３−アミノプロパンスルホン酸緩衝剤（ｐＨ８．４）、炭酸緩衝剤（ｐＨ８．５）、リン酸緩衝剤（ｐＨ８．０）、２−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）緩衝剤（ｐＨ７．２）、トリス（ヒドロキシ）アミノメタン緩衝剤、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸緩衝剤、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）１−２−アミノエタンスルホン酸緩衝剤、Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２エタンスルホン酸緩衝剤、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−ヒドロキシ−３−アミノプロパンスルホン酸緩衝剤、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−ヒドロキシプロパンスルホン酸）緩衝剤、Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−ヒドロキシプロパン−３−プロパンスルホン酸緩衝剤、トリス（ヒドロキシメチルメチルグリシン）緩衝剤、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン緩衝剤、２−（シクロヘキシルアミノ）エタンスルホン酸緩衝剤、３−Ｎ−シクロヘキシルアミノ−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸緩衝剤、３−シクロヘキシルアミノプロパンスルホン酸緩衝剤等を含む緩衝液が使用され得るが、これらに限定されない。好ましくは、第二緩衝液は、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）−３−アミノプロパンスルホン酸緩衝剤（好ましくは、ｐＨ８．４）を含む緩衝液である。本発明において第二緩衝液は、上記以外の緩衝液も使用することができる。なぜなら、緩衝液が、形成する塩が難水溶性であるイオンを含まないか、含んだとしても白金錯体が難水溶性塩を形成するほど含んでいなければ、白金錯体が難水溶性の塩を形成することがないからである。
たとえば、以下を溶解度の例示としてあげることができる。
１．水溶性白金錯体（２分子の水分子が配位した状態）に対し２等量の塩化物イオン（Ｃｌ−）および臭化物イオン（Ｂｒ−）およびヨウ化物イオン（Ｉ−）、チオシアン酸イオン（ＳＣＮ−）が存在すると水溶性白金錯体の２分子の配位水がこれらのイオンに置換して、難溶性の塩を形成する。１等量のイオンを含む場合、１分子の水分子がこれらのイオンによって置換される。イオンを含まない場合は、２分子の水分子が配位した構造をとる。
２．塩化物イオン（Ｃｌ−）の場合、細胞内の塩化物イオン濃度が０〜４ｍＭで水分子が置換した構造となり、ＤＮＡと結合するといわれており、このことから塩化物イオンの範囲についてはｍＭ表記させて頂きました。臭化物イオン（Ｂｒ−）およびヨウ化物イオン（Ｉ−）、チオシアン酸イオン（ＳＣＮ−）のうち、Ｂｒ−、Ｉ−の配位した錯体には、活性の強さに差があるが、活性があるといわれている。従って、細胞内の環境下では、水分子の配位した構造をとると考えられる。
難水溶性物質は、Ｃｌ−，Ｂｒ−，Ｉ−で抗癌活性があることが知られている。白金原子への結合性は、Ｃｌ−＜Ｂｒ−＜Ｉ−の順になるといわれている。Ｃｌ−よりもＢｒ−，Ｉ−は、白金と結合しやすく、難溶性物質を形成しやすいと考えられる。従って、Ｃｌ−と同条件で難水溶性物質とすることができると考えられる。これらの条件を考慮して本発明を実施することができる。
また、本発明において、難水溶性であれば、いったん本発明のリポソームが形成されると形成後、白金錯体がリポソームの外に出にくくなり、送達効率が上がることが企図される。
好ましい実施形態において、第二緩衝液は、ｐＨ６〜１０（好ましくは、８．４）の範囲内に調節され得る。
別の好ましい実施形態において、本発明の製造方法は、以下の工程：Ａ）前記水溶性アンミン白金錯体を、第一緩衝液に溶解し、白金錯体溶液を調製する工程；Ｂ）前記リポソームを提供する工程；およびＣ）該白金錯体溶液と、該リポソームとを混合し、前記リポソーム形成維持条件に供する工程を包含し得る。この製造方法では、該第一緩衝液は、該白金錯体が形成する塩が難水溶性であるイオンを含んでいない。
好ましい実施形態において、本発明の製造方法では、前記リポソームは、水溶性アンミン白金錯体が、リポソーム膜を通過して該リポソーム内に移行し、留まるために充分な組成を有し得る。
別の好ましい実施形態において、前記リポソーム形成維持条件は、リポソームを破壊することなく維持すると同時に、前記水溶性アンミン白金錯体がリポソーム膜を通過して該リポソーム内に移行し、留まるために充分な条件であり得る。
１つの実施形態において、本発明の製造方法において使用されるリポソームを構成する脂質または前記リポソーム原料は、ジパルミトイルホスファチジルコリン、コレステロール、ガングリオシド、ジセチルホスフェート、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、コール酸ナトリウム、ジセチルフォスファチジルエタノールアミン−ポリグリセリン８Ｇ、ジミリストイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジルコリン、ジミリストイルホスファチジルセリン、ジパルミトイルホスファチジルセリン、ジステアロイルホスファチジルセリン、ジオレオイルホスファチジルセリン、ジミリストイルホスファチジルイノシトール、ジパルミトイルホスファチジルイノシトール、ジステアロイルホスファチジルイノシトール、ジオレオイルホスファチジルイノシトール、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン、ジミリストイルホスファチジン酸、ジパルミトイルホスファチジン酸、ジステアロイルホスファチジン酸、ジオレオイルホスファチジン酸、ガラクトシルセラミド、グルコシルセラミド、ラクトシルセラミド、ホスフナチド、グロボチド、ＧＭ１（Ｇａｌβ１，３ＧａｌＮＡｃβ１，４（ＮｅｕＡα２，３）Ｇａｌβ１，４Ｇｌｃβ１，１’Ｃｅｒ）、ガングリオシドＧＤ１ａ、ガングリオシドＧＤ１ｂ、ジミリストイルホスファチジルグリセロール、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール、ジステアロイルホスファチジルグリセロール、ジオレオイルホスファチジルグリセロール等が挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、ジパルミトイルホスファチジルコリン、コレステロール、ガングリオシド、ジセチルホスフェート、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、コール酸ナトリウム、ジセチルフォスファチジルエタノールアミン−ポリグリセリン８Ｇ、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルグリセロールであり得る。
本製造方法において使用されるリポソームは、好ましくは、前記脂質懸濁液は、前記脂質として、ジパルミトイルホスファチジルコリン、コレステロール、ガングリオシド、ジセチルホスフェート、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミンおよびコール酸ナトリウムを、３５：４０：１５：５：５：１６７のモル比で含み得る。
本製造方法において使用されるリポソームは、水溶性アンミン白金錯体がそのリポソーム膜を通過してリポソーム中に入ることができるようなものであれば、どのようなものであってもよい。リポソームは、市販されているものを使用してもよく、例えば、日油などから市販されている。一般的なリポソームの調製および特徴付けは当該分野において公知であり、そして慣用的な実験および当該分野の技術常識しか必要としない。例えば、超音波処理法、エタノール注入法、フレンチプレス法、エーテル注入法、コール酸法、凍結乾燥法、逆相蒸発法により調製されたものであり得る（例えば、「リポソーム応用の新展開〜人工細胞の開発に向けて〜 監修 秋吉一成/辻井薫 ＮＴＳ ｐ３３〜４５（２００５）」、「リポソーム 野島庄七 ｐ２１−４０ 南江堂（１９８８）」を参照のこと。）が挙げられ得る。
１つの実施形態において、本製造方法において、リポソームは、複数の製造方法により調製されたリポソーム（例えば、改良コール酸塩法のもの、凍結乾燥法のもの）を混ぜ合わせて使用することもできる。
本発明において使用される前記リポソームを構成する脂質または前記リポソーム原料は、上記以外のものであってもよい。なぜなら、水溶性アンミン白金錯体が、その提供されたリポソームまたは形成されたリポソームの膜を通過してリポソーム内に移行し、その中に留まりさえすればよいからである。
別の実施形態において、本発明の製造方法では、前記Ｃ）工程において、前記混合物は、ｐＨ６〜１０（好ましくは、ｐＨ８．４）の範囲内に調節され得る。
別の実施形態において、本発明の製造方法では、前記白金錯体の形成する塩が水溶性の状態である条件は、該白金錯体の形成する塩が難水溶性であるイオンを実質的に含まない溶液の存在下におくことである。形成する塩が難水溶性であるイオンは、例えば、塩化物イオン（Ｃｌ−）、臭化物イオン（Ｂｒ−）、ヨウ化物イオン（Ｉ−）、チオシアン酸イオン（ＳＣＮ−）、シアン化物イオン（ＣＮ−）等（好ましくは、塩化物イオン（Ｃｌ−））であり得る。この溶液は、形成する塩が難水溶性であるイオンを含まないか、含んだとしても白金錯体が難水溶性塩を形成するほど含んでいなければよい。この白金錯体の形成する塩が難水溶性であるイオンは、例えば、塩化物イオン（Ｃｌ−）であれば、０〜４ｍＭの範囲で含まれ得る。なぜなら、塩化物イオン（Ｃｌ−）の場合、この０〜４ｍＭという濃度は、体内で存在する濃度以下の濃度であるので、難水溶性の塩として析出することはないと考えられるからである。
１つの実施形態において、本発明の製造方法では、前記Ｃ）工程において、前記水溶性アンミン白金錯体、白金錯体原料またはその組合せと、前記リポソーム、リポソーム原料またはその組合せとは、１：９〜９：１の範囲内の比で混合され得る。
リポソーム、リポソーム原料またはその組合せ、白金錯体、白金錯体原料またはその組合せ、必要であれば緩衝液は、任意の順序で混合することができる。例えば、これらの順序は、１）リポソーム原料と白金錯体とを混合して緩衝液を添加する順序、２）リポソーム原料と緩衝液とを混合した後に、白金錯体を添加する順序、３）白金錯体を緩衝液に溶解した後にリポソーム原料を添加する順序であり得るが、これらに限定されない。なぜなら、リポソームが形成・維持される条件を保持する限り、どのような順序で混合されても、リポソームが存在する時点で水溶性アンミン白金錯体がリポソームに接触することができるかぎり、本発明は達成することができるからである。水溶液中で強酸性を示す白金錯体を用いる場合には、混合液は、ｐＨ６〜１０の範囲が好ましい。
１つの実施形態において、前記白金錯体懸濁液と脂質懸濁液とは、１：９〜９：１の範囲内の比で混合され得る。
好ましい実施形態において、前記白金錯体懸濁液と脂質懸濁液とは、７：３の比で混合され得る。
別の実施形態において、前記白金錯体溶液とリポソームとは、１：９〜９：１の範囲内（好ましくは、７：３）の比で混合され得る。
１つの実施形態において、本発明の製造方法では、前記Ｃ）工程において、前記混合物は、形成する塩が難水溶性であるイオンを実質的に含まない。前記形成する塩が難水溶性であるイオンは、例えば、塩化物イオン（Ｃｌ−）、臭化物イオン（Ｂｒ−）、ヨウ化物イオン（Ｉ−）、チオシアン酸イオン（ＳＣＮ−）、シアン化物イオン（ＣＮ−）等であり得る。好ましくは、前記形成する塩が難水溶性であるイオンは、塩化物イオン（Ｃｌ−）であり得る。１つの実施形態において、前記混合物は、塩化物イオン（Ｃｌ−）を、０〜４ｍＭの範囲で含み得る。前記混合物は、形成する塩が難水溶性であるイオンを含まないか、含んだとしても白金錯体が難水溶性塩を形成するほど含んでいなければよい。
１つの実施形態において、前記混合物は、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）−３−アミノプロパンスルホン酸緩衝剤（ｐＨ８．４）、炭酸緩衝剤（ｐＨ８．５）、リン酸緩衝剤（ｐＨ８．０）、２−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）緩衝剤（ｐＨ７．２）、トリス（ヒドロキシ）アミノメタン緩衝剤、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸緩衝剤、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）１−２−アミノエタンスルホン酸緩衝剤、Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２エタンスルホン酸緩衝剤、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−ヒドロキシ−３−アミノプロパンスルホン酸緩衝剤、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−ヒドロキシプロパンスルホン酸）緩衝剤、Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−ヒドロキシプロパン−３−プロパンスルホン酸緩衝剤、トリス（ヒドロキシメチルメチルグリシン）緩衝剤、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン緩衝剤、２−（シクロヘキシルアミノ）エタンスルホン酸緩衝剤、３−Ｎ−シクロヘキシルアミノ−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸緩衝剤、３−シクロヘキシルアミノプロパンスルホン酸緩衝剤等（好ましくは、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）−３−アミノプロパンスルホン酸緩衝剤（ｐＨ８．４））を含み得る。
別の実施形態において、本発明の製造方法では、前記Ｄ）工程において、前記白金錯体の形成する塩が難水溶性であるイオンは、塩化物イオン（Ｃｌ−）、臭化物イオン（Ｂｒ−）、ヨウ化物イオン（Ｉ−）、チオシアン酸イオン（ＳＣＮ−）、シアン化物イオン（ＣＮ−）であり得る。好ましい実施形態において、この白金錯体の形成する塩が難水溶性であるイオンは、塩化物イオン（Ｃｌ−）である。
１つの実施形態において、前記塩化物イオン（Ｃｌ−）は、ＮａＣｌ、ＨＣｌ、ＣａＣｌ２より提供され得る。
別の実施形態において、本発明の製造方法では、前記Ｄ）工程において、前記白金錯体の形成する塩が難水溶性であるイオン（例えば、塩化物イオン（Ｃｌ−））は、例えば、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）−３−アミノプロパンスルホン酸緩衝液、炭酸緩衝液、リン酸緩衝液、２−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］エタンスルホン酸緩衝液、トリス（ヒドロキシ）アミノメタン緩衝液、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸緩衝液、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）１−２−アミノエタンスルホン酸緩衝液、Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２エタンスルホン酸緩衝液、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−ヒドロキシ−３−アミノプロパンスルホン酸緩衝液、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−ヒドロキシプロパンスルホン酸）緩衝液、Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−ヒドロキシプロパン−３−プロパンスルホン酸緩衝液、トリス（ヒドロキシメチルメチルグリシン）緩衝液、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン緩衝液、２−（シクロヘキシルアミノ）エタンスルホン酸緩衝液、３−Ｎ−シクロヘキシルアミノ−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸緩衝液、３−シクロヘキシルアミノプロパンスルホン酸緩衝液などにより提供され得るが、これらに限定されない。好ましくは、この塩化物イオン（Ｃｌ−）は、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）−３−アミノプロパンスルホン酸緩衝液（ｐＨ８．４）、炭酸緩衝液（ｐＨ８．５）、リン酸緩衝液（ｐＨ８．０）、２−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］エタンスルホン酸緩衝液（ｐＨ７．２）などにより提供され得るが、これらに限定されない。本発明の製造方法の前記Ｄ）工程において使用され得る、白金錯体の形成する塩が難水溶性であるイオンは、上記以外の緩衝液によっても提供され得る。なぜなら、白金錯体の形成する塩が難水溶性であるイオンを提供するものであれば、白金錯体を難水溶性の塩にすることができるからである。
別の実施形態において、本製造方法の前記Ｄ）工程は、ｉ）形成されたリポソームを親水性化処理する工程；ｉｉ）該リポソームへ標的指向性物質を結合させる工程；ｉｉｉ）該修飾標的指向性物質が結合したリポソームを親水性化する工程ならびにｉｖ）該親水性化したリポソームを含む溶液をフィルター濾過をする工程を包含し得る。
１つの実施形態において、本製造方法において使用され得る標的指向性物質は、例えば、抗体、糖鎖、レクチン、相補的核酸、レセプター、リガンド、アプタマー、抗原であり得る。好ましくは、標的指向性物質は、抗体、糖鎖であり得るが、これらに限定されない。なぜなら、標的指向性物質は、リポソームを破壊することなく、リポソームに標的指向性を付与するようなものであれば、よいからである。当業者は、標的にあわせて、リポソームに結合させる標的指向性物質を適宜、決定することができる。
１つの実施形態において、本発明において使用され得る前記アンミン白金錯体は、難水溶性であり得る。
好ましい実施形態において、本発明の製造方法は、以下：（Ａ１）ｃｉｓ−ジアンミンジニトラト白金（ＩＩ）を、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）−３−アミノプロパンスルホン酸緩衝液に溶解し、ｃｉｓ−ジアンミンジニトラト白金（ＩＩ）を含む溶液を調製する工程であって、該Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）−３−アミノプロパンスルホン酸緩衝液は、塩化物イオン（Ｃｌ−）を含まないか、または塩化物イオン（Ｃｌ−）を０〜４ｍＭの範囲で含む、工程；および（Ａ２）該ｃｉｓ−ジアンミンジニトラト白金（ＩＩ）を含む溶液のｐＨをｐＨ６〜１０（好ましくは、ｐＨ８．４）に調節する工程；（Ｂ１）ジパルミトイルホスファチジルコリン、コレステロール、ガングリオシド、ジセチルホスフェート、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミンおよびコール酸ナトリウム（好ましくは、３５：４０：１５：５：５：１６７のモル比）で混合させて脂質を調製する工程；（Ｂ２）該脂質を、メタノール・クロロホルム（好ましくは、１：１）溶液に懸濁して攪拌し、該攪拌した溶液を蒸発させ、沈殿物を真空乾燥させることにより脂質膜を得る工程；および（Ｂ３）該脂質膜を、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）−３−アミノプロパンスルホン酸緩衝液（ｐＨ６〜１０、好ましくは、ｐＨ８．４）に懸濁させて脂質懸濁液を作製する工程であって、該Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）−３−アミノプロパンスルホン酸緩衝液は、塩化物イオン（Ｃｌ−）を含まないか、または塩化物イオン（Ｃｌ−）を０〜４ｍＭの範囲で含む、工程；（Ｂ４）該脂質懸濁液を３０℃〜４０℃で攪拌させ、窒素置換し、超音波処理する工程；および（Ｃ１）ｐＨが調節された該ｃｉｓ−ジアンミンジニトラト白金（ＩＩ）溶液と、超音波処理した脂質懸濁液とを、１：９〜９：１（好ましくは、７：３）の範囲内の比で混合して、分画分子量５００〜３００，０００（好ましくは、１０，０００）で限外濾過に供する工程を包含し得る。
別の好ましい実施形態において、本発明の製造方法は、以下：（Ａ１）ｃｉｓ−ジアンミンジニトラト白金（ＩＩ）を、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）−３−アミノプロパンスルホン酸緩衝液に溶解し、ｃｉｓ−ジアンミンジニトラト白金（ＩＩ）を含む溶液を調製する工程であって、該Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）−３−アミノプロパンスルホン酸緩衝液は、塩化物イオン（Ｃｌ−）を含まないか、または塩化物イオン（Ｃｌ−）を０〜４ｍＭの範囲で含む、工程；および（Ａ２）該ｃｉｓ−ジアンミンジニトラト白金（ＩＩ）を含む溶液のｐＨをｐＨ６〜１０（好ましくは、ｐＨ８．４）に調節する工程：Ｂ）工程として、（Ｂ１）リポソームを提供する工程：および（Ｃ１）ｐＨが調節された該ｃｉｓ−ジアンミンジニトラト白金（ＩＩ）溶液と、該リポソームとを、１：９〜９：１の範囲内の比で混合して、分画分子量５００〜３００，０００（好ましくは、１０，０００）で限外濾過に供する工程を包含し得る。
別の実施形態において、本発明のアンミン白金錯体を内包するリポソームを製造する方法は、以下の工程：Ａ）２つのアンミン基を有する水溶性の白金錯体を含む溶液を提供する工程；Ｂ）該水溶性の白金錯体を含む溶液とリポソーム形成能を有する脂質懸濁液とを混合して混合溶液を作製する工程；Ｃ）該混合溶液をリポソームが形成する条件に供する工程；およびＤ）該混合溶液を、形成する塩が難水溶性であるイオンを含む溶液の存在下に供する工程、を包含する。
１つの実施形態では、Ａ）工程において、前記水溶性の白金錯体を含む溶液は、ｐＨ６〜１０（好ましくは、８．４）の範囲内に調節され得る。
１つの実施形態では、前記Ｂ）工程における前記脂質懸濁液は、ｉ）脂質を、メタノール・クロロホルム溶液に懸濁して攪拌し、該攪拌した溶液を蒸発させ、沈殿物を真空乾燥させることにより脂質膜を得る工程；およびｉｉ）該脂質膜を、懸濁緩衝液に懸濁させる工程によって作製され得る。
１つの実施形態において、前記メタノール・クロロホルム溶液は、メタノールとクロロホルムとを１：１の比で含み得る。
１つの実施形態において、本方法は、前記Ｂ）工程に引き続き、前記脂質懸濁液を超音波処理する工程をさらに包含し得る。好ましくは、前記超音波処理する工程は、前記脂質容液を３０℃〜４０℃で攪拌させ、窒素置換し、超音波処理する工程であり得る。
１つの実施形態では、前記Ｃ）工程において、前記混合溶液を、リポソームが形成するのに十分な時間、前記リポソームが形成する条件下に供し得る。好ましくは、前記混合溶液をリポソームが形成する条件は、例えば、該混合溶液を限外濾過に供すること、該混合溶液を一晩静置すること等であり得る。さらに好ましくは、前記混合溶液をリポソームが形成する条件は、前記混合溶液を分画分子量１０，０００で限外濾過に供することであり得る。
１つの実施形態では、前記Ｄ）工程は、前記Ｃ）工程において、リポソームの形成を確認した後に行われ得る。
別の実施形態において、本発明のアンミン白金錯体を内包するリポソームを製造する方法は、以下の工程：Ａ−１）２つのアンミン基を有する水溶性の白金錯体を含む溶液を調製する工程；Ａ−２）該水溶性の白金錯体を含む溶液のｐＨをｐＨ６〜１０の範囲内に調節する工程；Ｂ−１）ｐＨが調節された該ｃｉｓ−ジアンミンジニトラト白金（ＩＩ）溶液と、超音波処理した脂質懸濁液とを、１：９〜９：１の範囲内の比で混合して混合溶液を作製する工程；およびＣ−１）該混合溶液を限外濾過に供する工程；およびＤ−１）限外濾過後に、該混合溶液を塩化物イオン（Ｃｌ−）の存在下に供する工程、を包含し、ここで、該アンミン白金錯体は難水溶性である。
別の実施形態において、本発明のアンミン白金錯体を内包するリポソームを製造する方法は、以下の工程：（Ａ１）ｃｉｓ−ジアンミンジニトラト白金（ＩＩ）を、塩化物イオン（Ｃｌ−）を実質的に含まないＮ−トリス（ヒドロキシメチル）−３−アミノプロパンスルホン酸緩衝液に溶解し、ｃｉｓ−ジアンミンジニトラト白金（ＩＩ）を含む溶液を調製する工程；（Ａ２）該ｃｉｓ−ジアンミンジニトラト白金（ＩＩ）を含む溶液のｐＨをｐＨ８．４に調節する工程；（Ｂ１）ジパルミトイルホスファチジルコリン、コレステロール、ガングリオシド、ジセチルホスフェート、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミンおよびコール酸ナトリウムを、３５：４０：１５：５：５：１６７のモル比で混合させて脂質を調製する工程；（Ｂ２）該脂質を、メタノール・クロロホルム（１：１）溶液に懸濁して攪拌し、該攪拌した溶液を蒸発させ、沈殿物を真空乾燥させることにより脂質膜を得る工程；および（Ｂ３）該脂質膜を、塩化物イオン（Ｃｌ−）を実質的に含まないＮ−トリス（ヒドロキシメチル）−３−アミノプロパンスルホン酸緩衝液（ｐＨ８．４）に懸濁させて脂質懸濁液を作製する工程、（Ｂ４）該脂質懸濁液を３０℃〜４０℃で攪拌させ、窒素置換し、超音波処理する工程；（Ｂ５）ｐＨが調節された該ｃｉｓ−ジアンミンジニトラト白金（ＩＩ）溶液と、超音波処理した脂質懸濁液とを、７：３の範囲内の比で混合して混合溶液を作製する工程；（Ｃ１）該混合溶液を分画分子量１０，０００で限外濾過に供する工程；および（Ｄ１）限外濾過後に、該混合溶液を、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）−３−アミノプロパンスルホン酸緩衝液（ｐＨ８．４）、炭酸緩衝液（ｐＨ８．５）、ＰＢＳ（ｐＨ８．０）およびＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．２）からなる群より選択される少なくとも１つの緩衝液に曝す工程、包含する。
（アンミン白金錯体を内包するリポソーム）
１つの局面において、本発明は、アンミン白金錯体を内包するリポソームを提供する。このアンミン白金錯体を内包するリポソームは、水溶性アンミン白金錯体原料と、リポソーム原料とを混合して、リポソーム形成維持条件に供することによって得ることができる。
１つの実施形態において、本発明のアンミン白金錯体を内包するリポソームは、２つのアンモニアを有し得る。
別の実施形態において、本発明のアンミン白金錯体を内包するリポソームは、ｃｉｓ−ジアミンジクロロ白金（ＩＩ）の水溶性形態であり得る。
別の実施形態において、本発明のアンミン白金錯体を内包するリポソームは、ｃｉｓ−ジアミンジクロロ白金（ＩＩ）であり得る。
別の実施形態において、本発明のアンミン白金錯体を内包するリポソームは、脂質として、ジパルミトイルホスファチジルコリン、コレステロール、ガングリオシド、ジセチルホスフェート、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、コール酸ナトリウム、ジセチルフォスファチジルエタノールアミン−ポリグリセリン８Ｇ、ジミリストイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジルコリン、ジミリストイルホスファチジルセリン、ジパルミトイルホスファチジルセリン、ジステアロイルホスファチジルセリン、ジオレオイルホスファチジルセリン、ジミリストイルホスファチジルイノシトール、ジパルミトイルホスファチジルイノシトール、ジステアロイルホスファチジルイノシトール、ジオレオイルホスファチジルイノシトール、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン、ジミリストイルホスファチジン酸、ジパルミトイルホスファチジン酸、ジステアロイルホスファチジン酸、ジオレオイルホスファチジン酸、ガラクトシルセラミド、グルコシルセラミド、ラクトシルセラミド、ホスフナチド、グロボチド、ＧＭ１（Ｇａｌβ１，３ＧａｌＮＡｃβ１，４（ＮｅｕＡα２，３）Ｇａｌβ１，４Ｇｌｃβ１，１’Ｃｅｒ）、ガングリオシドＧＤ１ａ、ガングリオシドＧＤ１ｂ、ジミリストイルホスファチジルグリセロール、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール、ジステアロイルホスファチジルグリセロール、ジオレオイルホスファチジルグリセロール等を含み得るが、これらに限定されない。好ましくは、ジパルミトイルホスファチジルコリン、コレステロール、ガングリオシド、ジセチルホスフェート、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、コール酸ナトリウム、ジセチルフォスファチジルエタノールアミン−ポリグリセリン８Ｇ、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルグリセロールであり得る。なぜなら、上記以外の脂質から構成されたリポソームであっても、リポソーム中にｃｉｓ−ジアンミンジクロロ白金（ＩＩ）および／またはその水溶性形態を含ませることができ、かつ、それらをリポソーム中に留めておくことができるような脂質により構成されていればよいからである。
本発明において、リポソームは、複数の製造方法により調製されたリポソーム（例えば、改良コール酸塩法のもの、凍結乾燥法のもの）を混ぜ合わせて使用することもできる。
１つの実施形態において、本発明のアンミン白金錯体を内包するリポソームは、標的指向性物質をさらに含み得る。前記標的指向性物質としては、例えば、抗体、糖鎖、レクチン、相補的核酸、レセプター、リガンド、アプタマーおよび抗原（好ましくは、抗体、糖鎖）が挙げられるが、これらに限定されない。なぜなら、適切な架橋剤を用いることによって、あらゆる物質をリポソーム膜表面に修飾することができるからである。
別の局面において、本発明は、アンモニアを有するアンミン白金錯体が、１ｍｇ脂質あたり０．３μｇで含まれ得る、アンミン白金錯体を内包するリポソームを提供する。例えば、アンモニアを有するアンミン白金錯体は、０．３μｇより多く、（例えば、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、２．０、３．０、４．０、５．０、６．０、７．０、８．０、９．０、１０．０、１１．０、１２．０、１３．０、１４．０、１５．０．１６．０、１７．０、１８．０、１９．０、２０．０あるいは、好ましくは、９μｇ、１７μｇ以上で含まれ得る、アンミン白金錯体を内包するリポソームを提供する。
別の局面において、本発明は、アンモニアを有するアンミン白金錯体が、例えば、１ｍｇリン脂質あたり１０μｇ以上、２０μｇ以上、３０μｇ以上、４０μｇ以上、５０μｇ以上、６０μｇ以上、７０μｇ以上、８０μｇ以上、９０μｇ以上、１００μｇ以上、１５０μｇ以上、２００μｇ以上、３００μｇ以上で含まれ得る、アンミン白金錯体を内包するリポソームを提供する。
別の局面において、本発明は、アンモニアを有するアンミン白金錯体が、例えば、リポソーム１ｍｌあたり３９μｇ／ｍｌ、４０μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ、６０μｇ／ｍｌ、７０μｇ／ｍｌ、８０μｇ／ｍｌ以上、９０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌで含まれ得る、アンミン白金錯体を内包するリポソームを提供する。
別の局面において、本発明は、アンモニアを有するアンミン白金錯体が、例えば、リポソーム１個あたり１×１０−１０μｇ以上、２×１０−１０μｇ以上、３×１０−１０μｇ以上、４×１０−１０μｇ以上、５×１０−１０μｇ以上、１０−９μｇ以上で含まれ得る、アンミン白金錯体を内包するリポソームを提供する。
１つの実施形態において、本発明のアンミン白金錯体を内包するリポソームは、２つのアンモニアを有し得る。
別の実施形態において、本発明のアンミン白金錯体を内包するリポソームは、ｃｉｓ−ジアミンジクロロ白金（ＩＩ）の水溶性形態であり得る。
別の実施形態において、本発明のアンミン白金錯体を内包するリポソームは、ｃｉｓ−ジアミンジクロロ白金（ＩＩ）であり得る。
別の実施形態において、本発明のアンミン白金錯体を内包するリポソームは、脂質として、ジパルミトイルホスファチジルコリン、コレステロール、ガングリオシド、ジセチルホスフェート、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、コール酸ナトリウム、ジミリストイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジルコリン、ジミリストイルホスファチジルセリン、ジパルミトイルホスファチジルセリン、ジステアロイルホスファチジルセリン、ジオレオイルホスファチジルセリン、ジミリストイルホスファチジルイノシトール、ジパルミトイルホスファチジルイノシトール、ジステアロイルホスファチジルイノシトール、ジオレオイルホスファチジルイノシトール、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン、ジミリストイルホスファチジン酸、ジパルミトイルホスファチジン酸、ジステアロイルホスファチジン酸、ジオレオイルホスファチジン酸、ガラクトシルセラミド、グルコシルセラミド、ラクトシルセラミド、ホスフナチド、グロボチド、ＧＭ１（Ｇａｌβ１，３ＧａｌＮＡｃβ１，４（ＮｅｕＡα２，３）Ｇａｌβ１，４Ｇｌｃβ１，１’Ｃｅｒ）、ガングリオシドＧＤ１ａ、ガングリオシドＧＤ１ｂ、ジミリストイルホスファチジルグリセロール、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール、ジステアロイルホスファチジルグリセロール、ジオレオイルホスファチジルグリセロール等を含み得るが、これらに限定されない。なぜなら、上記以外の脂質から構成されたリポソームであっても、リポソーム中にｃｉｓ−ジアンミンジクロロ白金（ＩＩ）および／またはその水溶性形態を含ませることができ、かつ、それらをリポソーム中に留めておくことができるような脂質により構成されていればよいからである。好ましくは、前記アンミン白金錯体を内包するリポソームは、ジパルミトイルホスファチジルコリン、コレステロール、ガングリオシド、ジセチルホスフェート、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミンおよびコール酸ナトリウムを、３５：４０：１５：５：５：１６７のモル比で含み得る。
１つの実施形態において、本発明のアンミン白金錯体を内包するリポソームは、標的指向性物質をさらに含み得る。前記標的指向性物質としては、例えば、抗体、糖鎖、レクチン、相補的核酸、レセプター、リガンド、アプタマーおよび抗原（好ましくは、抗体、糖鎖）が挙げられるが、これらに限定されない。なぜなら、適切な架橋剤を用いることによって、あらゆる物質をリポソーム膜表面に修飾することができるからである。
ここで、本発明のアンミン白金錯体を内包するリポソームは、上述の（製造方法）に記載される任意の形態が使用され得る。
（組成物）
１つの局面において、本発明は、がんまたは腫瘍を処置するための組成物を提供する。該組成物は、アンモニアを有するアンミン白金錯体を内包するリポソームを含み、該リポソームは、水溶性アンミン白金錯体原料と、リポソーム原料とを混合して、リポソーム形成維持条件に供することによって得ることができる。
別の局面において、本発明は、がんまたは腫瘍を処置するための組成物を提供する。この組成物は、アンモニアを有するアンミン白金錯体を内包するリポソームを含み、該リポソームは、該アンミン白金錯体が、例えば、１ｍｇ脂質あたり０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、２．０、３．０、４．０、５．０、６．０、７．０、８．０、９．０、１０．０、１１．０、１２．０、１３．０、１４．０、１５．０．１６．０、１７．０、１８．０、１９．０、２０．０あるいは、好ましくは、９μｇ、１７μｇ以上で含まれ得る以上で含まれ得る。
別の局面において、本発明は、アンモニアを有するアンミン白金錯体が、例えば、１ｍｇリン脂質あたり１０μｇ以上、２０μｇ以上、３０μｇ以上、４０μｇ以上、５０μｇ以上、６０μｇ以上、７０μｇ以上、８０μｇ以上、９０μｇ以上、１００μｇ以上、１５０μｇ以上、２００μｇ以上、３００μｇ以上で含まれ得る、アンミン白金錯体を内包するリポソームの組成物を提供する。
別の局面において、本発明は、アンモニアを有するアンミン白金錯体が、例えば、リポソーム１ｍｌあたり３９μｇ／ｍｌ、４０μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ、６０μｇ／ｍｌ、７０μｇ／ｍｌ、８０μｇ／ｍｌ以上、９０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌで含まれ得る、アンミン白金錯体を内包するリポソームの組成物を提供する。
別の局面において、本発明は、アンモニアを有するアンミン白金錯体が、例えば、リポソーム１個あたり１×１０−１０μｇ以上、２×１０−１０μｇ以上、３×１０−１０μｇ以上、４×１０−１０μｇ以上、５×１０−１０μｇ以上、１０−９μｇ以上で含まれ得る、アンミン白金錯体を内包するリポソームの組成物を提供する。
１つの実施形態において、本発明の組成物において使用され得るリポソームでは、アンミン白金錯体は、２つのアンモニアを有し得る。
別の実施形態において、本発明の組成物において使用され得るリポソームでは、前記アンミン白金錯体は、ｃｉｓ−ジアミンジクロロ白金（ＩＩ）の水溶性形態であり得る。
別の実施形態において、本発明の組成物において使用され得るリポソームでは、前記アンミン白金錯体は、ｃｉｓ−ジアミンジクロロ白金（ＩＩ）であり得る。
別の実施形態において、本発明の組成物において使用され得るアンミン白金錯体を内包するリポソームは、脂質として、ジパルミトイルホスファチジルコリン、コレステロール、ガングリオシド、ジセチルホスフェート、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、コール酸ナトリウムコール酸ナトリウム、ジセチルフォスファチジルエタノールアミン−ポリグリセリン８Ｇ、ジミリストイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジルコリン、ジミリストイルホスファチジルセリン、ジパルミトイルホスファチジルセリン、ジステアロイルホスファチジルセリン、ジオレオイルホスファチジルセリン、ジミリストイルホスファチジルイノシトール、ジパルミトイルホスファチジルイノシトール、ジステアロイルホスファチジルイノシトール、ジオレオイルホスファチジルイノシトール、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン、ジミリストイルホスファチジン酸、ジパルミトイルホスファチジン酸、ジステアロイルホスファチジン酸、ジオレオイルホスファチジン酸、ガラクトシルセラミド、グルコシルセラミド、ラクトシルセラミド、ホスフナチド、グロボチド、ＧＭ１（Ｇａｌβ１，３ＧａｌＮＡｃβ１，４（ＮｅｕＡα２，３）Ｇａｌβ１，４Ｇｌｃβ１，１’Ｃｅｒ）、ガングリオシドＧＤ１ａ、ガングリオシドＧＤ１ｂ、ジミリストイルホスファチジルグリセロール、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール、ジステアロイルホスファチジルグリセロール、ジオレオイルホスファチジルグリセロール等を含み得るが、これらに限定されない。好ましくは、ジパルミトイルホスファチジルコリン、コレステロール、ガングリオシド、ジセチルホスフェート、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、コール酸ナトリウム、ジセチルフォスファチジルエタノールアミン−ポリグリセリン８Ｇ、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルグリセロールであり得る。なぜなら、上記以外の脂質から構成されたリポソームであっても、リポソーム中にｃｉｓ−ジアンミンジクロロ白金（ＩＩ）および／またはその水溶性形態を含ませることができ、かつ、それらをリポソーム中に留めておくことができるような脂質により構成されていればよいからである。
１つの実施形態において、本発明の組成物において使用され得るリポソームは、標的指向性物質をさらに含み得る。前記標的指向性物質としては、例えば、抗体、糖鎖、レクチン、相補的核酸、レセプター、リガンド、アプタマーおよび抗原（好ましくは、抗体、糖鎖）が挙げられるが、これらに限定されない。なぜなら、標的指向性物質は、リポソームを破壊することなく、リポソームに標的指向性を付与するようなものであれば、よいからである。適切な架橋剤を用いることによって、あらゆる物質をリポソーム膜表面に修飾することができる。当業者は、標的にあわせて、リポソームに結合させる標的指向性物質を適宜、決定することができる。
ここで、本発明の組成物において使用され得るアンミン白金錯体を内包するリポソームは、上述の（製造方法）および（アンミン白金錯体を内包するリポソーム）に記載される任意の形態が使用され得る。
本発明の組成物は、必要に応じて、適切な処方材料または薬学的に受容可能なキャリアを含み得る。適切な処方材料または薬学的に受容可能なキャリアとしては、抗酸化剤、保存剤、着色料、蛍光色素、風味料、希釈剤、乳化剤、懸濁化剤、溶媒、フィラー、増量剤、緩衝剤、送達ビヒクルおよび／または薬学的アジュバントが挙げられるがそれらに限定されない。代表的には、本発明の組成物は、アンミン白金錯体、および必要に応じて他の有効成分を、少なくとも１つの生理的に受容可能なキャリア、賦形剤または希釈剤とともに含む組成物の形態で投与される。例えば、適切なビヒクルは、ミセル、注射溶液、生理的溶液、または人工脳脊髄液であり得、これらには、非経口送達のための組成物に一般的に使用される他の物質を補充することが可能である。
本明細書で使用される受容可能なキャリア、賦形剤または安定化剤は、好ましくは、レシピエントに対して非毒性であり、そして好ましくは、使用される投薬量および濃度において不活性であり、好ましくは、例えば、リン酸塩、クエン酸塩、または他の有機酸；アスコルビン酸、α−トコフェロール；低分子量ポリペプチド；タンパク質（例えば、血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリン）；親水性ポリマー（例えば、ポリビニルピロリドン）；アミノ酸（例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンまたはリジン）；モノサッカリド、ジサッカリドおよび他の炭水化物（グルコース、マンノース、またはデキストリン）；キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）；糖アルコール（例えば、マンニトールまたはソルビトール）；塩形成対イオン（例えば、ナトリウム）；ならびに／あるいは非イオン性表面活性化剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ、プルロニック（ｐｌｕｒｏｎｉｃ）またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ））などが挙げられる。
例示の適切なキャリアとしては、中性緩衝化生理食塩水、または血清アルブミンと混合された生理食塩水が挙げられる。好ましくは、その生成物は、適切な賦形剤（例えば、スクロース）を用いて凍結乾燥剤として処方される。他の標準的なキャリア、希釈剤および賦形剤は所望に応じて含まれ得る。他の例示的な組成物は、ｐＨ約７．０−８．５のＴｒｉｓ緩衝剤またはｐＨ約４．０−５．５の酢酸緩衝剤を含み、これらは、さらに、ソルビトールまたはその適切な代替物を含み得る。
以下に本発明の組成物の一般的な調製法を示す。なお、動物薬組成物、医薬部外品、水産薬組成物、食品組成物および化粧品組成物等についても公知の調製法により製造することができることに注意されたい。
本発明の組成物などは、薬学的に受容可能なキャリアと必要に応じて配合し、例えば、注射剤、懸濁剤、溶液剤、スプレー剤等の液状製剤として非経口的に投与することができる。薬学的に受容可能なキャリアの例としては、賦形剤、潤滑剤、結合剤、崩壊剤、崩壊阻害剤、吸収促進剤、吸収剤、湿潤剤、溶剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、緩衝剤、無痛化剤等が挙げられる。また、必要に応じて、防腐剤、抗酸化剤、着色剤、甘味剤等の製剤添加物を用いることができる。また、本発明の組成物には、シアリルルイスＸ、脂質など以外の物質を配合することも可能である。非経口の投与経路としては、静脈内、筋肉内、皮下投与、皮内投与、粘膜投与、直腸内投与、膣内投与、局所投与、皮膚投与など等が挙げられるがそれらに限定されない。全身投与されるとき、本発明において使用される医薬は、発熱物質を含まない、薬学的に受容可能な水溶液の形態であり得る。そのような薬学的に受容可能な組成物の調製について、ｐＨ、等張性、安定性などを考慮することは、当業者の技術範囲内である。
液状製剤における溶剤の好適な例としては、注射溶液、アルコール、プロピレングリコール、マクロゴール、ゴマ油およびトウモロコシ油等が挙げられる。
液状製剤における溶解補助剤の好適な例としては、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、Ｄ−マンニトール、安息香酸ベンジル、エタノール、トリスアミノメタン、コレステロール、トリエタノールアミン、炭酸ナトリウムおよびクエン酸ナトリウム等が挙げられるがそれらに限定されない。
液状製剤における懸濁化剤の好適な例としては、例えば、ステアリルトリエタノールアミン、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリルアミノプロピオン酸、レシチン、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、モノステアリン酸グリセリン等の界面活性剤、例えば、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース等の親水性高分子等が挙げられる。
液状製剤における等張化剤の好適な例としては、塩化ナトリウム、グリセリン、Ｄ−マンニトール等が挙げられるがそれらに限定されない。
液状製剤における緩衝剤の好適な例としては、リン酸塩、酢酸塩、炭酸塩およびクエン酸塩等が挙げられるがそれらに限定されない。
液状製剤における無痛化剤の好適な例としては、ベンジルアルコール、塩化ベンザルコニウムおよび塩酸プロカイン等が挙げられるがそれらに限定されない。
液状製剤における防腐剤の好適な例としては、パラオキシ安息香酸エステル類、クロロブタノール、ベンジルアルコール、２−フェニルエチルアルコール、デヒドロ酢酸、ソルビン酸等が挙げられるがそれらに限定されない。
液状製剤における抗酸化剤の好適な例としては、亜硫酸塩、アスコルビン酸、α−トコフェロールおよびシステイン等が挙げられるがそれらに限定されない。
注射剤として調製する際には、液剤および懸濁剤は殺菌され、かつ血液または他の目的のための注射部位における溶媒と等張であることが好ましい。通常、これらは、細菌保留フィルター等を用いるろ過、殺菌剤の配合または照射などによって無菌化する。さらにこれらの処理後、凍結乾燥等の方法により固形物とし、使用直前に無菌水または無菌の注射用希釈剤（塩酸リドカイン水溶液、生理食塩水、ブドウ糖水溶液、エタノールまたはこれらの混合溶液等）を添加してもよい。
さらに、本発明の組成物は、着色料、保存剤、香料、矯味矯臭剤、甘味料等、ならびに他の薬剤を含んでいてもよい。
本発明において使用される物質、組成物等の量は、使用目的、対象疾患（種類、重篤度など）、被験体の年齢、体重、性別、既往歴、細胞の形態または種類などを考慮して、当業者が容易に決定することができる。本発明の方法を被験体に対して施す頻度もまた、使用目的、対象疾患（種類、重篤度など）、被験体の年齢、体重、性別、既往歴、および治療経過などを考慮して、当業者が容易に決定することができる。頻度としては、例えば、毎日−数ヶ月に１回（例えば、１週間に１回−１ヶ月に１回）の投与が挙げられる。１週間−１ヶ月に１回の投与を、経過を見ながら施すことが好ましい。投与する量は、処置されるべき部位が必要とする量を見積もることによって確定することができる。
（処置方法）
１つの局面において、本発明は、がんまたは腫瘍を処置するための方法を提供する。この方法は、がんまたは腫瘍を処置する必要のある哺乳動物に、該がんまたは腫瘍を処置するのに有効な量の、アンモニアを有するアンミン白金錯体を内包するリポソームを投与する工程を包含し、ここで、該リポソームは、水溶性アンミン白金錯体原料と、リポソーム原料とを混合して、リポソーム形成維持条件に供することによって得ることができる。
別の局面において、本発明は、がんまたは腫瘍を処置するための方法を提供する。この方法は、がんまたは腫瘍を処置する必要のある哺乳動物に、該がんまたは腫瘍を処置するのに有効な量の、アンモニアを有するアンミン白金錯体を内包するリポソームを投与する工程を包含し、ここで、該リポソームは、該アンミン白金錯体が、例えば、１ｍｇ脂質あたり０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、２．０、３．０、４．０、５．０、６．０、７．０、８．０、９．０、１０．０、１１．０、１２．０、１３．０、１４．０、１５．０．１６．０、１７．０、１８．０、１９．０、２０．０あるいは、好ましくは、９μｇ、１７μｇ以上で含まれ得る。
別の局面において、本発明の方法で用いられるものは、アンモニアを有するアンミン白金錯体が、例えば、１ｍｇリン脂質あたり１０μｇ以上、２０μｇ以上、３０μｇ以上、４０μｇ以上、５０μｇ以上、６０μｇ以上、７０μｇ以上、８０μｇ以上、９０μｇ以上、１００μｇ以上、１５０μｇ以上、２００μｇ以上、３００μｇ以上で含まれ得る。
別の局面において、本発明の方法で用いられるものは、アンモニアを有するアンミン白金錯体が、例えば、リポソーム１ｍｌあたり３９μｇ／ｍｌ、４０μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ、６０μｇ／ｍｌ、７０μｇ／ｍｌ、８０μｇ／ｍｌ以上、９０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌで含まれ得る。
別の局面において、本発明の方法で用いられるものは、アンモニアを有するアンミン白金錯体が、例えば、リポソーム１個あたり１×１０−１０μｇ以上、２×１０−１０μｇ以上、３×１０−１０μｇ以上、４×１０−１０μｇ以上、５×１０−１０μｇ以上、１０−９μｇ以上で含まれ得る。
１つの実施形態において、本発明の処置方法では、前記アンモニアを有するアンミン白金錯体を内包するリポソームは、例えば、静脈内投与、皮下投与、経口投与，局所投与、腹腔内投与など（好ましくは、静脈内投与）により投与され得る。
他の実施形態において、本発明の処置方法では、前記アンモニアを有するアンミン白金錯体を内包するリポソームは、アンミン白金錯体量として、１０〜９０ｍｇ/ｍ２の範囲（例えば、１０ｍｇ/ｍ２、１５ｍｇ/ｍ２、２０ｍｇ/ｍ２、２５ｍｇ/ｍ２、３０ｍｇ/ｍ２、３５ｍｇ/ｍ２、４０ｍｇ/ｍ２、４５ｍｇ/ｍ２、５０ｍｇ/ｍ２、５５ｍｇ/ｍ２、６０ｍｇ/ｍ２、６５ｍｇ/ｍ２、７０ｍｇ/ｍ２、７５ｍｇ/ｍ２、８０ｍｇ/ｍ２、８５ｍｇ/ｍ２、９０ｍｇ/ｍ２以上であり、９０ｍｇ/ｍ２、８５ｍｇ/ｍ２、８０ｍｇ/ｍ２、７５ｍｇ/ｍ２、７０ｍｇ/ｍ２、６５ｍｇ/ｍ２、６０ｍｇ/ｍ２、５５ｍｇ/ｍ２、５０ｍｇ/ｍ２、４５ｍｇ/ｍ２、４０ｍｇ/ｍ２、３５ｍｇ/ｍ２、３０ｍｇ/ｍ２、２５ｍｇ/ｍ２、２０ｍｇ/ｍ２、１５ｍｇ/ｍ２、１０ｍｇ/ｍ２以下の任意の範囲の可能な組み合わせ）、好ましくは、２０〜５０ｍｇ/ｍ２の用量で投与され得る。例えば、１日１回１５〜２０ｍｇ/ｍ２、１日１回５０〜７０ｍｇ/ｍ２、１日１回２５〜３５ｍｇ/ｍ２、１日１回１０〜２０ｍｇ/ｍ２、１日１回７０〜９０ｍｇ/ｍ２、１日１回２０ｍｇ/ｍ２の用量で投与され得るが、これらに限定されない。
別の実施形態において、本発明の処置方法により処置され得る前記がんまたは腫瘍は、例えば、睾丸腫瘍、膀胱癌、腎盂腫瘍、尿管腫瘍、前立腺癌、卵巣癌、頭頸部癌、非小細胞肺癌、食道癌、子宮癌、神経芽細胞種、胃癌、好ましくは、前立腺癌、子宮癌であり得るが、これらに限定されない。なぜなら、がん・腫瘍の種類・状態によりリポソームに内包させる白金錯体の種類、量、リポソームの投与量、投与形態などを調整することにより、本発明の処置方法をがん・腫瘍に適用することができるからである。
ここで、本発明の処置方法において使用されるアンミン白金錯体を内包するリポソームは、上述の（製造方法）および（アンミン白金錯体を内包するリポソーム）に記載される任意の形態が使用され得る。
本明細書において「被験体」とは、本発明の処置が適用される生物をいい、「患者」ともいわれる。患者または被験体は、例えば、鳥類、哺乳動物などであってもよい。好ましくは、そのような動物は、哺乳動物（例えば、単孔類、有袋類、貧歯類、皮翼類、翼手類、食肉類、食虫類、長鼻類、奇蹄類、偶蹄類、管歯類、有鱗類、海牛類、クジラ目、霊長類、齧歯類、ウサギ目など）であり得る。例示的な被験体としては、例えば、ヒト、ウシ、ブタ、ウマ、ニワトリ、ネコ、イヌなどの動物が挙げられるがそれらに限定されない。さらに好ましくは、ヒトであり得る。
本明細書において「処置するのに有効な量」とは、当業者に十分に認識される用語であり、意図される薬理学的結果（例えば、予防、治療、再発防止など）を生じるために有効な薬剤の量をいう。従って、処置有効量は、処置されるべき疾患の徴候を軽減するのに十分な量である。所定の適用のための有効量（例えば、処置有効量）を確認する１つの有用なアッセイは、標的疾患の回復の程度を測定することである。実際に投与される量は、処置が適用されるべき個体に依存し、好ましくは、所望の効果が顕著な副作用をともなうことなく達成されるように最適化された量である。有効用量の決定は十分に当業者の能力内にある。
治療有効量、予防有効量などおよび毒性は、細胞培養または実験動物における標準的な薬学的手順（例えば、ＥＤ５０、集団の５０％において治療的に有効な用量；およびＬＤ５０、集団の５０％に対して致死的である用量）によって決定され得る。治療効果と毒性効果との間の用量比は治療係数であり、それは比率ＥＤ５０／ＬＤ５０として表され得る。大きな治療係数を呈する薬物送達媒体が好ましい。細胞培養アッセイおよび動物実験から得られたデータが、ヒトでの使用のための量の範囲を公式化するのに使用される。このような化合物の用量は、好ましくは、毒性をほとんどまたは全くともなわないＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内にある。この用量は、使用される投与形態、患者の感受性、および投与経路に依存してこの範囲内で変化する。一例として、投与量は、年齢その他の患者の条件、疾患の種類、使用する細胞の種類等により適宜選択される。
（医薬用途）
１つの局面において、本発明は、医薬として使用するための、アンモニアを有するアンミン白金錯体を内包するリポソームを提供する。このリポソームは、水溶性アンミン白金錯体原料と、リポソーム原料とを混合して、リポソーム形成維持条件に供することによって得ることができる。
他の局面において、本発明は、医薬として使用するための、アンモニアを有するアンミン白金錯体を内包するリポソームを提供する。このリポソームは、アンミン白金錯体を、本明細書の他の場所において記載される任意の実施形態の濃度・レベルで含む。
ここで、本発明の医薬として使用するためのリポソームは、上述の（製造方法）および（アンミン白金錯体を内包するリポソーム）に記載される任意の形態が使用され得る。
以上のように、本発明の好ましい実施形態を用いて本発明を例示してきたが、本発明は、この実施形態に限定して解釈されるべきものではない。本発明は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。当業者は、本発明の具体的な好ましい実施形態の記載から、本明細書の記載および技術常識に基づいて等価な範囲を実施することができることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願および文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。
以下、実施例により、本発明の構成をより詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。以下において使用した試薬類は、特に言及した場合を除いて、市販されているものを使用した。
（実施例１：ｃｉｓ−ジアンミンジクロロ白金（ＩＩ）を内包したリポソームの調製）
（ｃｉｓ−ジアミンジニトラト白金（ＩＩ）（シスプラチン−硝酸体）の合成）
４塩化白金カリウム（Ｋ２ＰｔＣｌ４）４．１５ｇ（１０．０ｍｍｏｌ）とヨウ化カリウム６．６４ｇ（４０ｍｍｏｌ）を、酸素を充分に除去した蒸留水５０ｍｌに完全に溶解した後、窒素雰囲気下で２８％アンモニア水溶液１．３５ｍｌ（２２ｍｍｏｌ）を添加し、撹拌することにより沈澱を得た。この沈澱物を水とエタノールで各々２回洗浄した後、常温で真空（〜２０ｍｍＨｇ）乾燥することにより、アンミン−白金中間体ｃｉｓ−〔Ｐｔ（ＮＨ３）２Ｉ２〕４．４９ｇを得た。このアンミン−白金中間体ｃｉｓ−〔Ｐｔ（ＮＨ３）２Ｉ２〕２．４１ｇ（５．０ｍｍｏｌ）を蒸留水３０ｍｌに懸濁させた後、硝酸銀１．６８ｇ（９．９ｍｍｏｌ）を添加して、遮光下、２４時間攪拌した。生成したヨウ化銀を濾別し、濾液をエバポレーターで濃縮し白色結晶を得た。この白色結晶を、冷蒸留水と冷エタノールで２回洗浄し、乾燥させ、シスプラチン−硝酸体として無色のｃｉｓ−〔Ｐｔ（ＮＨ３）２（ＮＯ３）２〕を１．０１ｇ得た。
（ｃｉｓ−ジアミンジニトラト白金（ＩＩ）を内包したリポソームの調製）
ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、コレステロール、ガングリオシド、ジセチルホスフェート（ＤＣＰ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）をモル比で、３５：４０：５：１５：５の割合で合計脂質量４５．６ｍｇになるように混合し、コール酸ナトリウム４６．９ｍｇを添加し、メタノール・クロロホルム溶液（１：１）溶液３ｍｌに溶解させた。３７℃、１時間撹拌し、メタノールクロロホルムをロータリーエバポレーターで蒸発させて、真空乾燥させた。得られた脂質膜をＮａＣｌ未添加のＮ−トリス（ヒドロキシメチル）−３−アミノプロパンスルホン酸緩衝液（ｐＨ８．４）３ｍｌに懸濁させ、３７℃、１時間撹拌した。次いで、この溶液を窒素置換し、超音波処理して、透明なミセル懸濁液を得た。次に、ｃｉｓ−ジアミンジニトラト白金（ＩＩ）を５４．１ｍｇを秤量して、ＮａＣｌ未添加のＮ−トリス（ヒドロキシメチル）−３−アミノプロパンスルホン酸緩衝液（ｐＨ８．４）７ｍｌに溶解させ、ミセル懸濁液と混合し、ＰＭ１０（Ａｍｉｃｏｎ Ｃｏ．，ＵＳＡ）とＮａＣｌ未添加のＮ−トリス（ヒドロキシメチル）−３−アミノプロパンスルホン酸緩衝液（ｐＨ８．４）を用いた限外濾過（分画分子量：１０，０００）にかけ均一リポソーム１０ｍｌ（３５．５ｍｇ 脂質量）を調製した。
（リポソーム中にｃｉｓ−ジアミンジニトラト白金（ＩＩ）が内包されたことの確認）
本実施例で調製されたリポソームに、ｃｉｓ−ジアミンジニトラト白金（ＩＩ）が内包されていることをフレームレス原子吸光光度法（ＦＡＡＳ）により確認した。
フレームレス原子吸光光度法（ＦＡＡＳ）には、ＡＡ−６７００ Ａｔｏｍｉｃ ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ Ｆｌａｍｅ ｅｍｉｓｓｉｏｎ ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ（島津）を用いた。波長２６５．９ｎｍ、スリット幅０．５、ランプ電流１４ｍＡの条件下にて、１２０℃で３０秒間、２５０℃で１０秒間、７００℃で２０秒間、７００℃で５秒間、２６００℃で３秒間にわたって順次処理した。白金標準液（１ｍｇ Ｐｔ／ｍｌ、１０００ｐｐｍ）を精製水で希釈して、１２．５ｎｇ／ｍｌ、２５ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、２００ｎｇ／ｍｌの溶液を調製し、検量線を作成した。リポソーム溶液を精製水で１００００倍して、被検試料とした。
（結果）
本実施例において調製されたリポソーム中には、ｃｉｓ−ジアミンジニトラト白金（ＩＩ）が３２３．３３μｇ／１ｍｌ（９１．０８μｇ／ｍｇ脂質）内包されていた。得られたリポソームの脂質量は３５．５ｍｇであった。このｃｉｓ−ジアミンジニトラト白金（ＩＩ）のリポソームへの内包率は、５．９％であった。ｃｉｓ−ジアミンジニトラト白金（ＩＩ）内包リポソームを含む溶液は、無色であった。
（ｃｉｓ−ジアミンジニトラト白金（ＩＩ）のｃｉｓ−ジアミンジクロロ白金（ＩＩ）への転換）
ｃｉｓ−ジアミンジニトラト白金（ＩＩ）が内包されたことが確認されたリポソームを、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）−３−アミノプロパンスルホン酸緩衝液（ｐＨ８．４）、炭酸緩衝液（ｐＨ８．５）、ＰＢＳ（ｐＨ８．０）、またはＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．２）に、２５℃にて、９６時間にわたり供する。これらの緩衝液は、いずれも最終濃度１５０ｍＭのＮａＣｌが含まれている。
その結果、無色の溶液は淡黄色に変化することが確認される。これは、ｃｉｓ−ジアミンジニトラト白金（ＩＩ）が、ｃｉｓ−ジアミンジクロロ白金（ＩＩ）に転換したことを示す。さらに、この変化は、吸光光度法、ＩＲ法、１９５Ｐｔ−ＮＭＲ法により検出することができる。
（吸光光度法）
（１）最終濃度１５０ｍＭのＮａＣｌが含まれるバッファーに９６時間供したｃｉｓ−ジアミンジニトラト白金（ＩＩ）内包リポソームのＮａＣｌをバッファー交換により除き、１０倍濃縮する。（２）１００℃で、３０分間の加熱後（リポソームの破壊）、クロロホルムにより溶媒抽出を行う。（３）水層を回収する。（４）回収した水層について波長２００〜４００ｎｍの吸収スペクトルを測定する。（５）ｃｉｓ−ジアミンジニトラト白金（ＩＩ）を内包した直後（１５０ｍＭ ＮａＣｌに供する前）のリポソームについても（２）〜（４）の操作を行う。（６）バッファーに９６時間供したｃｉｓ−ジアミンジニトラト白金（ＩＩ）リポソームと、ｃｉｓ−ジアミンジニトラト白金（ＩＩ）の内包直後のリポソームについて、吸収スペクトルを比較することにより、ｃｉｓ−ジアミンジニトラト白金（ＩＩ）からｃｉｓ−ジアミンジクロロ白金（ＩＩ）ヘの転換を確認することができる。
（ＩＲ法）
吸光光度法と同様に溶媒抽出を行う。水層を回収後、ロータリーエバボレーターを用いて水を蒸発させる。Ｎｕｊｏｌ法により、ＩＲスペクトルを測定し、最終濃度１５０ｍＭのＮａＣｌが含まれるバッファーに９６時間供したｃｉｓ−ジアミンジニトラト白金（ＩＩ）内包リポソームと、ｃｉｓ−ジアミンジニトラト白金（ＩＩ）を内包した直後（１５０ｍＭＮａＣｌに供する前）のリポソームのスペクトルを比較する。
ｃｉｓ−ジアミンジニトラト白金（ＩＩ）の状態である場合、Ｐｔ−Ｏ−Ｈの変角振動のスペクトルが、９５０〜１１００ｃｍ−１の領域に現れる。ｃｉｓ−ジアミンジクロロ白金（ＩＩ）の状態である場合、Ｐｔ−Ｃｌ結合しかないので、９５０〜１１００ｃｍ−１の領域にはバンドは認められない。従って、ｃｉｓ−ジアミンジニトラト白金（ＩＩ）からｃｉｓ−ジアミンジクロロ白金（ＩＩ）ヘの転換を確認することができる。
白金錯体に関するＩＲ法の詳細については、例えば、Ｒ．Ｆｒａｇｇｉａｎｉ，Ｂ．Ｌｉｐｐｅｒｔ，Ｃ．Ｊ．Ｌｏｃｋ ａｎｄ Ｂ．Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，９９，７７７（１９７７）、Ｆ．Ｄ．Ｒｏｃｈｏｎ，Ａ．Ｍｏｒｎｅａｕ
ａｎｄ Ｒ．Ｍｅｌａｓｏｎ，Ｉｎｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，２７，１０（１９８８）に記載されている。
（リポソーム内に内包された硝酸体のシスプラチンへの変換）
（１９５ＰｔＮＭＲスペクトルによる解析）
リポソーム内に内包された硝酸体のシスプラチンへの変換は、１９５ＰｔＮＭＲスペクトルにより解析する。１９５ＰｔＮＭＲスペクトルの感度は、天然の１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルの感度より２０倍大きい。また、１９５Ｐｔの天然存在比は、３３．８％であり、天然に存在する白金の１Ｈに対する相対感度は、３．４×１０−３と比較的高い。さらにその化学シフトは１５００ｐｐｍという極めて広い周波数領域に観測されるので、構造や結合性を調べる上で、極めて有用である。
（サンプル調製）
以下のように、シスプラチン、硝酸体（ｃｉｓ−ジアンミンジニトラト白金（ＩＩ））および硝酸体（ｃｉｓ−ジアンミンジニトラト白金（ＩＩ））内包リポソームのサンプルを調製する。
シスプラチン：シスプラチン（Ｍ．Ｗ：３００）２ｍｇをＤ２Ｏ１ｍｌに溶解させてサンプルとする。（６．６ｍＭ）
硝酸体（ｃｉｓ−ジアンミンジニトラト白金（ＩＩ））：硝酸体（Ｍ．Ｗ．３６５）５ｍｇをＤ２Ｏ１ｍｌに溶解させてサンプルとする。（１３．７ｍＭ）
硝酸体（ｃｉｓ−ジアンミンジニトラト白金（ＩＩ））内包リポソーム（ＮａＣｌ＋）：Ｐｔ濃度が４．７５ｍＭとなるように濃縮して使用する。
（測定方法）
Ｎａ２ＰｔＣｌ６（Ｓｏｄｉｕｍ ｈｅｘａｃｈｌｏｒｏｐｌａｔｉｎａｔｅ（ＩＶ）をＤ２Ｏに溶解させて外部標準液を作成する。ＮＭＲ装置は、ＩＮＯＶＡ−６００（Ｖａｒｉａｎ社）を使用する。直径５ｍｍの測定管にサンプルをいれて、測定を行う。
この測定方法では、対照として測定したシスプラチンは、−２１６０ｐｐｍ、硝酸体（ｃｉｓ−ジアンミンジニトラト白金（ＩＩ））は、−１６２０ｐｐｍに各々ケミカルシフトが観測されることになる。したがって、目的とするリポソームに内包された硝酸体（ｃｉｓ−ジアンミンジニトラト白金（ＩＩ））のケミカルシフトは、外液中にＮａＣｌが含まれる場合、シスプラチンと同じ−２１６０ｐｐｍに観測される。これらのケミカルシフト等を測定することにより、内包された硝酸体（ｃｉｓ−ジアンミンジニトラト白金（ＩＩ））は、緩衝液中の塩化ナトリウム由来のＣｌ−イオンにより置換され、シスプラチンに変換されているかどうかを確認することができる。
（比較例１．塩化ナトリウムイオンの影響）
ＤＰＰＣ、コレステロール、ガングリオシド、ＤＣＰ、ＤＰＰＥをモル比で、３５：４０：５：１５：５の割合で合計脂質量４５．６ｍｇになるように混合し、コール酸ナトリウム４６．９ｍｇを添加し、メタノール・クロロホルム溶液（１：１）溶液３ｍｌに溶解させた。３７℃、１時間撹拌し、メタノールクロロホルムをロータリーエバポレーターで蒸発させて、真空乾燥させた。得られた脂質膜をＮａＣｌを添加したＮ−トリス（ヒドロキシメチル）−３−アミノプロパンスルホン酸緩衝液（ｐＨ８．４）３ｍｌに懸濁させ、３７℃、１時間撹拌した。次いで、この溶液を窒素置換し、超音波処理して、透明なミセル懸濁液を得た。次に、ｃｉｓ−ジアミンジニトラト白金（ＩＩ）を５４．１ｍｇを秤量して、ＮａＣｌを添加したＮ−トリス（ヒドロキシメチル）−３−アミノプロパンスルホン酸緩衝液（ｐＨ８．４）７ｍｌに溶解させ、ミセル懸濁液と混合し、ＰＭ１０（Ａｍｉｃｏｎ Ｃｏ．，ＵＳＡ）とＮａＣｌを添加したＮ−トリス（ヒドロキシメチル）−３−アミノプロパンスルホン酸緩衝液（ｐＨ８．４）を用いた限外濾過（分画分子量：１０，０００）にかけ均一リポソーム１０ｍｌを調製した。
ＮａＣｌを添加したＮ−トリス（ヒドロキシメチル）−３−アミノプロパンスルホン酸緩衝液（ｐＨ８．４）を用いた場合、ｃｉｓ−ジアミンジニトラト白金（ＩＩ）はリポソームに内包されなかった。Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−３−アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳ）緩衝液に溶解後、数十分で析出が生じた。これらは、吸光度法により確認した。測定には、ＵＶ２５００ＰＣ（島津）吸光光度計を使用した。
ｃｉｓ−ジアミンジニトラト白金（ＩＩ）５ｍｇ／ｍｌを１５０ｍＭ 塩化ナトリウムを含むＴＡＰＳ緩衝液（ｐＨ８．４）に溶解し、２５℃で静置し、経時的（０時間、５分後、１０分後、１５分後、３０分後および４５分後）にＵＶスペクトルを測定した。コントロールとして、ｃｉｓ−ジアミンジクロロ白金（ＩＩ）１ｍｇを塩化ナトリウム含有ＴＡＰＳ緩衝液１ｍｌに溶解し、そのＵＶスペクトルを測定した。図４Ａおよび図４Ｂに示されるように、４５分後のＵＶスペクトルの吸収特性は、シスプラチンと同一の特性であった。４５分後以上、放置しても、ＵＶスペクトルに変化は認められなかった。従って、ｃｉｓ−ジアミンジニトラト白金（ＩＩ）の水溶液を、１５０ｍＭ ＮａＣｌを含むＴＡＰＳに溶解し、２５℃で４５分間静置すると、ｃｉｓ−ジアミンジニトラト白金（ＩＩ）がｃｉｓ−ジアミンジクロロ白金（ＩＩ）に変化することがわかった。これは、ＮａＣｌの存在により、ｃｉｓ−ジアミンジニトラト白金（ＩＩ）が水に難溶性のｃｉｓ−ジアミンジクロロ白金（ＩＩ）となり析出してきてしまうことに原因があると考えられる。
（実施例２．リポソームの定量分析）
（Ｉ．脂質定量）
リポソームの構成脂質量を、コレステロール量を定量することにより算出した。脂質の定量にはデタミナーＴＣ５５５キット（カタログ番号ＵＣＣ／ＥＡＮ１２８）（ＫＹＯＷＡ Ｃｏ．ＬＴＤ）を用いた。標準物質として、キットに添付されている５０ｍｇ／ｍｌ
コレステロールを使用した。
スタンダード溶液として、標準物質（５０ｍｇ／ｍｌ：コレステロール）をＰＢＳ緩衝液で希釈し、０、０．１、０．２５、０．５、０．７５、１、５、１０μｇ／２０μｌ溶液を調製した。Ｃｉｓ−ジアミンジニトラト白金（ＩＩ）内包リポソームをＰＢＳ緩衝液で５倍希釈し、検体溶液を調製した。スタンダード溶液、検体溶液をそれぞれ試験管に２０μｌ分注した。各試験管に、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（１０％溶液）を１７μｌ添加して撹拌し、その後、３７℃、４０分間、静置した。デタミナーＴＣ５５５キットの酵素試薬を３００μｌ添加して撹拌し、その後、３７℃、２０分間、静置した。吸光度５４０ｎｍを測定し、スタンダード溶液により検量線を作成して、リポソームのコレステロール量を測定し、脂質量を求めた。
コレステロール量から脂質量を求める換算式
脂質量（μｇ／５０μｌ）＝コレステロール量（μｇ／５０μｌ）×４．５１（換算係数）
得られたリポソームの脂質量は３．５５ｍｇ／ｍｌであった。
（ＩＩ．粒子径分布および粒子径）
リポソーム粒子を精製水で５０倍に希釈して、ゼータサイザーナノ（Ｎａｎ−ＺＳ：ＭＡＬＶＥＲＮ Ｃｏ．ＬＴＤ）を用いて測定した。
リポソーム粒子の平均粒子径は、１５９ｎｍであった（図２Ａ）。
（実施例３．糖鎖を結合させたｃｉｓ−ジアミンジニトラト白金（ＩＩ）内包リポソームの調製）
実施例１の「ｃｉｓ−ジアミンジニトラト白金（ＩＩ）内包リポソームの調製」と同様の方法により、ｃｉｓ−ジアミンジニトラト白金（ＩＩ）内包リポソームを調製した。本実施例において調製されたリポソーム中には、ｃｉｓ−ジアミンジニトラト白金（ＩＩ）が３２３．３３μｇ／１ｍｌ（９１．０８μｇ／ｍｇ脂質）内包されていた。得られたリポソームの脂質量は３５．５ｍｇであった。このｃｉｓ−ジアミンジニトラト白金（ＩＩ）のリポソームへの内包率は、５．９％であった。ｃｉｓ−ジアミンジニトラト白金（ＩＩ）内包リポソームを含む溶液は、無色であった。
（リポソーム脂質膜面上の親水性化処理）
ｃｉｓ−ジアミンジニトラト白金（ＩＩ）内包リポソームの溶液１０ｍｌをＸＭ３００膜（Ａｍｉｃｏｎ Ｃｏ．，ＵＳＡ）と炭酸緩衝液（ｐＨ ８．５）を用いた限外濾過（分画分子量：３００，０００）にかけ溶液のｐＨを８．５にした。次に、架橋試薬ビス（スルホスクシンイミジル）スベレート（ＢＳ３；Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｏ．，ＵＳＡ）１０ｍｇを加え、室温で２時間攪拌した。その後、さらに冷蔵下で一晩攪拌してリポソーム膜上の脂質ジパルミトイルフォスファチジルエタノールアミンとＢＳ３との化学結合反応を完結した。そして、このリポソーム液をＸＭ３００膜と炭酸緩衝液（ｐＨ ８．５）で限外濾過（分画分子量：３００，０００）にかけた。次に、炭酸緩衝液（ｐＨ ８．５）１ｍｌに溶かしたトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン４０ｍｇをリポソーム液１０ｍｌに加えた。次いで、この溶液を、室温で２時間攪拌後、冷蔵下で一晩攪拌し、分画分子量３００，０００で限外濾過し、遊離のトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンを除去し、該炭酸緩衝液をＮ−トリス（ヒドロキシメチル）−３−アミノプロパンスルホン酸緩衝液（ｐＨ８．４）に交換し、リポソーム膜上の脂質に結合したＢＳ３とトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンとの化学結合反応を完結した。これにより、リポソーム膜の脂質ジパルミトイルフォスファチジルエタノールアミン上にトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンの水酸基が配位して水和親水性化された。
（リポソーム膜面上へのヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）の結合）
リポソーム膜面上へのヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）の結合は、既報の手法（Ｙａｍａｚａｋｉ，Ｎ．，Ｋｏｄａｍａ，Ｍ．ａｎｄ Ｇａｂｉｕｓ，Ｈ．−Ｊ．（１９９４）ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ．２４２，５６−６５）により、カップリング反応法を用いて行った。すなわち、この反応は２段階化学反応で行い、はじめに、本実施例で得られた１０ｍｌのリポソーム膜面上に存在するガングリオシドを１ｍｌのＮ−トリス（ヒドロキシメチル）−３−アミノプロパンスルホン酸緩衝液（ｐＨ ８．４）に溶かしたメタ過ヨウ素酸ナトリウム４３ｍｇを加え、冷蔵下で一晩攪拌して過ヨウ素酸酸化した。ＸＭ３００膜とＰＢＳ緩衝液（ｐＨ ８．０）で限外濾過（分画分子量：３００，０００）することにより、遊離の過ヨウ素酸ナトリウムを除去し、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）−３−アミノプロパンスルホン酸緩衝液をＰＢＳ緩衝液（ｐＨ８．０）に交換して、酸化されたリポソーム１０ｍｌを得た。このリポソーム液に、２０ｍｇのヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）／ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ ８．０）を加えて室温で２時間反応させ、次に２Ｍ ＮａＢＨ３ＣＮ／ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ ８．０）１００μｌを加えて室温で２時間、さらに冷蔵下で一晩攪拌してリポソーム上のガングリオシドとＨＳＡとのカップリング反応でＨＳＡを結合した。次いで、限外濾過（分画分子量：３００，０００）し、遊離のシアノホウ素酸ナトリウムおよびヒト血清アルブミンを除去し、この溶液の緩衝液を炭酸緩衝液（ｐＨ８．５）に交換して、ＨＳＡ結合リポソーム液１０ｍｌを得た。
（糖鎖の調製）
糖鎖として、シアリルルイスＸを使用した。
各糖鎖の質量を計測し、以下において使用するための前処理をした。
（リポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）上への糖鎖の結合）
本実施例において調製した各糖鎖２ｍｇを精製水に溶解し、０．２５ｇのＮＨ４ＨＣＯ３を溶かした０．５ｍｌ水溶液に加え、３７℃で３日間攪拌した後、０．４５μｍのフィルターで濾過して糖鎖の還元末端のアミノ化反応を完結して、各糖鎖のグリコシルアミン化合物４ｍｇ／ｍｌ（アミノ化糖鎖溶液）を得た。次に、本実施例で得たリポソーム液の一部分１０ｍｌに架橋試薬３，３’−ジチオビス（スルホスクシンイミジルプロピオネート）（ＤＴＳＳＰ；Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｏ．，ＵＳＡ）１０ｍｇを加えて室温で２時間、続いて冷蔵下で一晩攪拌し、ＸＭ３００膜と炭酸緩衝液（ｐＨ ８．５）で限外濾過（分画分子量：３００，０００）して、遊離のＤＴＳＳＰを除去し、ＤＴＳＳＰがリポソーム上のＨＳＡに結合したリポソーム１０ｍｌを得た。次に、このリポソーム液に上記のグリコシルアミン化合物（アミノ化糖鎖溶液）１２．５、３７．５、１２５、２５０、５００、１２５０、２５００μｌを加えて、室温で２時間反応させ、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン／炭酸緩衝液（ｐＨ ８．５）を添加し、その後、冷蔵下で一晩攪拌し、リポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン上のＤＴＳＳＰにグリコシル化アミン化合物の結合を行った。ＸＭ３００膜とＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ ７．２）で限外濾過（分画分子量：３００，０００）して、遊離の糖鎖およびトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンを除去した。その結果、糖鎖とヒト血清アルブミンとリポソームとが結合したリポソーム各１０ｍｌが得られた。
（リポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）上の親水性化処理）
本実施例で調製された糖鎖が結合したリポソームについて、それぞれ別々に以下の手順によりリポソーム上のＨＳＡタンパク質表面の親水性化処理を行った。このリポソーム１０ｍｌに、別々に、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン２６．４ｍｇを加えて、室温で２時間、その後冷蔵下で一晩攪拌した後、ＸＭ３００膜とＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ ７．２）で限外濾過（分画分子量：３００，０００）し、未反応物を除去した。０．４５μｍのフィルターで濾過して、最終産物である親水性化処理された糖鎖が結合したリポソーム複合体各１０ｍｌ（総脂質量１５．２ｍｇ、総蛋白量１１００μｇ、平均粒子径１７１ｎｍ）を得た。
（ｃｉｓ−ジアミンジクロロ白金（ＩＩ）がリポソームに内包されていることの確認）
本実施例により調製された糖鎖の結合したリポソームを含む溶液は、無色から淡黄色に変化した。これは、リポソームに内包されたｃｉｓ−ジアミンジニトラト白金（ＩＩ）が、ｃｉｓ−ジアミンジクロロ白金（ＩＩ）に転換したことを示す。さらに、この変化は、吸光光度法、ＩＲ法、１９５Ｐｔ−ＮＭＲ法により検出することができる。
（リポソーム内に内包された硝酸体のシスプラチンへの変換）
（１９５ＰｔＮＭＲスペクトルによる解析）
リポソーム内に内包された硝酸体のシスプラチンへの変換は、１９５ＰｔＮＭＲスペクトルにより解析した。
（サンプル調製）
以下のように、シスプラチン、硝酸体（ｃｉｓ−ジアンミンジニトラト白金（ＩＩ））および硝酸体（ｃｉｓ−ジアンミンジニトラト白金（ＩＩ））内包リポソームのサンプルを調製した。
シスプラチン：シスプラチン（Ｍ．Ｗ：３００）２ｍｇをＤ２Ｏ１ｍｌに溶解させてサンプルとした。（６．６ｍＭ）
硝酸体（ｃｉｓ−ジアンミンジニトラト白金（ＩＩ））：硝酸体（Ｍ．Ｗ．３６５）５ｍｇをＤ２Ｏ１ｍｌに溶解させてサンプルとした。（１３．７ｍＭ）
硝酸体（ｃｉｓ−ジアンミンジニトラト白金（ＩＩ））内包リポソーム（ＮａＣｌ＋）：Ｐｔ濃度が４．７５ｍＭとなるように濃縮して使用した。
（測定方法）
Ｎａ２ＰｔＣｌ６（Ｓｏｄｉｕｍ ｈｅｘａｃｈｌｏｒｏｐｌａｔｉｎａｔｅ（ＩＶ）をＤ２Ｏに溶解させて外部標準液を作成した。ＮＭＲ装置は、ＩＮＯＶＡ−６００（Ｖａｒｉａｎ社）を使用した。直径５ｍｍの測定管にサンプル６００μｌをいれて、測定を行った。
（結果）
対照として測定したシスプラチンは、−２１６０ｐｐｍ、硝酸体（ｃｉｓ−ジアンミンジニトラト白金（ＩＩ））は、−１６２０ｐｐｍに各々ケミカルシフトが観測された（図５ａおよび図５ｂ）。目的とするリポソームに内包された硝酸体（ｃｉｓ−ジアンミンジニトラト白金（ＩＩ））のケミカルシフトは、外液中にＮａＣｌが含まれる場合、シスプラチンと同じ−２１６０ｐｐｍに観測された（図５ｃ）。このことから、内包された硝酸体（ｃｉｓ−ジアンミンジニトラト白金（ＩＩ））は、緩衝液中の塩化ナトリウム由来のＣｌ−イオンにより置換され、ほとんどが、シスプラチンに変換されていることが確認された。また、リポソームに内包させたｃｉｓ−ジアンミンジニトラト白金（ＩＩ）をｃｉｓ−ジアミンジクロロ白金（ＩＩ）に変化させない場合は、ｃｉｓ−ジアンミンジニトラト白金（ＩＩ）のケミカルシフト値である−１６２０ｐｐｍのピークも、ｃｉｓ−ジアミンジクロロ白金（ＩＩ）のケミカルシフト値である−２１６０ｐｐｍも認められなかった（図５ｄ）。
本実施例において調製されたリポソーム中には、ｃｉｓ−ジアミンジクロロ白金（ＩＩ）が２５３．９８μｇ／１ｍｌ（７８．３８μｇ／ｍｇ脂質）内包されていた。得られたリポソームの脂質量は３２．４ｍｇであった。このｃｉｓ−ジアミンジクロロ白金（ＩＩ）のリポソームへの内包率は、４．５９％であった。
特許文献１の方法により製造されたリポソームに内包されるシスプラチンの量は、８．９μｇ／ｍｇ 脂質であり、得られたリポソームの脂質量は２００ｍｇである。従って、本方法により製造されたリポソーム１個あたりが内包するシスプラチンの量は、特許文献１のリポソームよりも約９倍量も多い。また、本実施例の方法では、５４．１ｍｇのｃｉｓ−ジアミンジニトラト白金（ＩＩ）（シスプラチンに換算すると４６．０ｍｇ）をリポソームに内包させているのに対し、特許文献１では、約２倍量の１００ｍｇのシスプラチンをリポソームに内包させている。従って、単位脂質量当たりの内包効率は、内包されたシスプラチン量と内包に使用したシスプラチン量から換算すると、本発明の方法により製造されたリポソームが約１８倍程度も優れているといえる。さらに、本発明の方法には加熱工程は含まれず、作製されたリポソームは安定であるといえる。
また、非特許文献１に記載されるリポソームには、１４．０μｇ／ｍｇ 脂質のシスプラチンが内包されている。従って、本方法により製造されたリポソーム１個あたりが内包するシスプラチンの量は、非特許文献１のリポソームよりも約５．６倍量も多い。
従って、本方法により調製されるシスプラチン内包リポソームは、従来の方法により作製されたリポソームよりも非常に多くのシスプラチンを内包することができることが確認された。
（実施例４．リポソームの定量分析）
本実施例では、実施例３で調製した糖鎖の結合したＣｉｓ−ジアミンジニトラト白金（ＩＩ）内包リポソームの定量分析を行った。
（Ｉ．タンパク質定量）
リポソームに内包されたＨＳＡ量とリポソーム表面にカップリングしたＨＳＡの総タンパク質量をＢＣＡ法により測定した。
タンパク質量の測定は、Ｍｉｃｒｏ ＢＣＡＴＭ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｒｅａｇｅｎｔキット（カタログ番号２３２３５ＢＮ）（ＰＩＥＲＣＥ Ｃｏ．ＬＴＤ）を用いた。標準物質として、キットに添付された２ｍｇ／ｍｌアルブミン（ＢＳＡ）を使用した。
スタンダード溶液として、標準物質（２ｍｇ／ｍｌ：アルブミン）をＰＢＳ緩衝液で希釈し、０、０．２５、０．５、１、２、３、４、５μｇ／５０μｌ溶液を調製した。Ｃｉｓ−ジアミンジニトラト白金（ＩＩ）内包リポソームをＰＢＳ緩衝液で２０倍希釈し、検体溶液を調製した。スタンダード溶液、検体溶液をそれぞれ試験管に５０μｌ分注した。各試験管に３％ラウリル硫酸ナトリウム溶液（ＳＤＳ溶液）を１００μｌ添加した。キットに添付された試薬Ａ、Ｂ、Ｃを、試薬Ａ：試薬Ｂ：試薬Ｃ＝４８：２：５０となるように混合し、各試験管に１５０μｌ添加した。この試験管を、６０℃で１時間、静置した。室温に戻ってから、吸光度５４０ｎｍを測定し、スタンダード溶液により検量線を作成して、リポソームのタンパク質量を測定した。リポソームのタンパク質量は、１１０μｇ／ｍｌであった。
（ＩＩ．脂質定量）
リポソームの構成脂質量を、コレステロール量を定量することにより算出した。脂質の定量にはデタミナーＴＣ５５５キット（カタログ番号ＵＣＣ／ＥＡＮ１２８）（ＫＹＯＷＡ Ｃｏ．ＬＴＤ）を用いた。標準物質として、キットに添付されている５０ｍｇ／ｍｌ
コレステロールを使用した。
スタンダード溶液として、標準物質（５０ｍｇ／ｍｌ：コレステロール）をＰＢＳ緩衝液で希釈し、０、０．１、０．２５、０．５、０．７５、１、５、１０μｇ／２０μｌ溶液を調製した。実施例３で調製した糖鎖の結合したＣｉｓ−ジアミンジニトラト白金（ＩＩ）内包リポソームをＰＢＳ緩衝液で５倍希釈し、検体溶液を調製した。スタンダード溶液、検体溶液をそれぞれ試験管に２０μｌ分注した。各試験管に、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（１０％溶液）を１７μｌ添加して撹拌し、その後、３７℃、４０分間、静置した。デタミナーＴＣ５５５キットの酵素試薬を３００μｌ添加して撹拌し、その後、３７℃、２０分間、静置した。吸光度５４０ｎｍを測定し、スタンダード溶液により検量線を作成して、リポソームのコレステロール量を測定し、脂質量を求めた。
コレステロール量から脂質量を求める換算式
脂質量（μｇ／５０μｌ）＝コレステロール量（μｇ／５０μｌ）×４．５１（換算係数）
得られたリポソームの脂質量は３．２４ｍｇ／ｍｌであった。
（ＩＩＩ．粒子径分布および粒子径）
リポソーム粒子を精製水で５０倍に希釈して、ゼータサイザーナノ（Ｎａｎ−ＺＳ：ＭＡＬＶＥＲＮ Ｃｏ．ＬＴＤ）を用いて測定した。
リポソーム粒子の平均粒子径は、１７１ｎｍであった（図２Ｂ）。
（実施例５：抗体を結合させたｃｉｓ−ジアミンジクロロ白金（ＩＩ）内包リポソームの調製）
実施例１の「ｃｉｓ−ジアミンジニトラト白金（ＩＩ）内包リポソームの調製」と同様の方法により、ｃｉｓ−ジアミンジニトラト白金（ＩＩ）内包リポソームを調製した。このｃｉｓ−ジアミンジニトラト白金（ＩＩ）内包リポソームを含む溶液は無色である。
（リポソーム脂質膜面上の親水性化処理）
実施例１と同様の方法により、リポソーム脂質膜面を親水性化処理する。
（標的指向性物質の調製）
標的指向性物質として、腫瘍に特異的な抗体（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ（ＭＮ，ＵＳＡ）社製のＥ−セレクチン抗体（ＡＦ５７５）を用いた。以下において使用するための前処理をした。ＡＴＣＣより抗ヒトＥ−ｓｅｌｅｃｔｉｎマウスモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞（Ｎｕｍｂｅｒ：ＣＲＬ−２５１５ ＣＬ３）を購入して精製した。細胞をＲＰＭＩ １６４０（ＧＩＢＣＯ ｃｏｄｅ．１１８７５）／１０％ＦＢＳ／ペニシリン１００ｕｎｉｔ／ｍｌ・ストレプトマイシン１００μｇ／ｍｌ（Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ ｓｏｌｕｔｉｏｎ，ｓｔａｂｉｋｌｉｚｅｄ ＳＩＧＭＡ Ａ５９５５）（ウシ胎児血清 ＳＩＧＭＡ Ｆ０９２６ 中、３７℃、５％ＣＯ２環境下で培養した。マウスＢａｌｂ／ｃ（日本ＳＬＣ 雌性、６週齢）にプリスタン（５００μｌ／ｍｏｕｓｅ）を２回（５日間間隔）投与したのち、５×１０６のハイブリドーマ細胞をＰＢＳに浮遊させ、１ｍｌずつ腹腔内に注射した。注射後、１４日目に開腹し、腹水を採取した。腹水に硫酸アンモニウム（０．４飽和）を添加して、１０，０００ｒｐｍ×３０分（４℃）で遠心し、沈殿を生理食塩水で溶解し、透析（３日間、４℃）を行った。１０，０００ｒｐｍ×３０分（４℃）で遠心し、上清に２容量の０．０６Ｍ 酢酸緩衝液（ｐＨ４．８）を添加し、ｎ−Ｃａｐｒｙｌｉｃ ａｃｉｄを終濃度で、６．８％となるように添加し、室温で３０分間撹拌した。１０，０００ｒｐｍ×３０分（０〜４℃）で遠心し、透析（３日間、４℃）を行った。１０，０００ｒｐｍ×３０分（０〜４℃）で遠心し、上清を回収した。
（リポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）上への抗体の結合）
本実施例で得たリポソーム液の一部分１０ｍｌに架橋試薬３，３’−ジチオビス（スルホスクシンイミジルプロピオネート）（ＤＴＳＳＰ；Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｏ．，ＵＳＡ）１０ｍｇを加えて室温で２時間、続いて冷蔵下で一晩攪拌し、ＸＭ３００膜と炭酸緩衝液（ｐＨ ８．５）で限外濾過（分画分子量：３００，０００）して、遊離のＤＴＳＳＰを除去し、ＤＴＳＳＰがリポソーム上のＨＳＡに結合したリポソーム１０ｍｌを得た。次に、このリポソーム液に本実施例で調製した４．６ｍｇ／ｍｌのＥ−セレクチン抗体（ＡＦ５７５）３．２６ｍｌ（１５ｍｇ抗体）を１０ｍｌのリポソーム液に添加して、２５℃で２時間反応させ、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン／炭酸緩衝液（ｐＨ ８．５）を添加し、その後、冷蔵下で一晩攪拌し、リポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン上のＤＴＳＳＰにＥ−セレクチン抗体（ＡＦ５７５）の結合を行った。ＸＭ３００膜とＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ ７．２）で限外濾過（分画分子量：３００，０００）して、遊離のＥ−セレクチン抗体（ＡＦ５７５）およびトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンを除去した。その結果、Ｅ−セレクチン抗体（ＡＦ５７５）とヒト血清アルブミンとリポソームとが結合したリポソーム各１０ｍｌが得られた。
（リポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）上の親水性化処理）
本実施例で調製されたＥ−セレクチン抗体（ＡＦ５７５）が結合したリポソームについて、実施例３と同様の方法により親水性化処理を行った。
（ｃｉｓ−ジアミンジクロロ白金（ＩＩ）がリポソームに内包されていることの確認）
本実施例により調製されたＥ−セレクチン抗体（ＡＦ５７５）の結合したリポソームを含む溶液は、無色から淡黄色に変化した。これは、リポソームに内包されたｃｉｓ−ジアミンジニトラト白金（ＩＩ）が、ｃｉｓ−ジアミンジクロロ白金（ＩＩ）に転換したことを示す。さらに、この変化は、実施例１と同様の方法を用いて、吸光光度法、ＩＲ法、１９５Ｐｔ−ＮＭＲ法により検出することができる。
（リポソームの定量分析）
本実施例で調製したＥ−セレクチン抗体（ＡＦ５７５）の結合したＣｉｓ−ジアミンジニトラト白金（ＩＩ）内包リポソームの定量分析（タンパク質定量、脂質定量、粒子径分布および粒子径）を、実施例１と同様の方法により行った（図６）。
（実施例６Ａ：がん・腫瘍の処置についての有効性の検討）
本実施例は、実施例１（糖鎖なしリポソーム）、実施例３（糖鎖修飾リポソーム）および実施例５（抗体修飾リポソーム）により調製したｃｉｓ−ジアミンジクロロ白金（ＩＩ）内包リポソームが、がん・腫瘍の処置に有効であることを確認することを目的とする。
（ｃｉｓ−ジアミンジクロロ白金（ＩＩ）内包リポソームの抗癌活性評価）
（１．担癌部位への集積性：癌部位の集積ｃｉｓ−ジアミンジクロロ白金（ＩＩ）量の評価）
実施例３（シアリルルイスＸ修飾リポソーム）により調製したｃｉｓ−ジアミンジクロロ白金（ＩＩ）内包リポソームをもちいた。
６週齢のマウス（Ｂａｌｂ／ｃ、雌性）（各群１匹）の右大腿部の皮下に、１×１０６細胞のエールリッヒ腹水癌細胞（ＥＡＴ細胞）（ＡＴＣＣ Ｎｕｍｂｅｒ ： ＣＣＬ−７７ＴＭ Ｅ （Ｅｈｒｌｉｃｈ−Ｌｅｔｔｅｒ ａｓｃｉｔｅｓ））を移植して１０日後に実験に用いた。ｃｉｓ−ジアミンジクロロ白金（ＩＩ）を内包させたシアリルルイスＸ修飾リポソーム、およびコントロールとしてｃｉｓ−ジアミンジクロロ白金（ＩＩ）のみを、それぞれ１．７ｍｇ／ｋｇ体重（２２６μｇ／ｍｌ）でマウスに１５０μｌ、尾静脈投与した。投与後４８、９６時間後に腫瘍を摘出した。
摘出した腫瘍組織（０．２〜１．０ｇ）のうち、０．１ｇに対して濃硝酸 １ｍＬを添加し、５分間撹拌した。１時間静置したのち、６０℃の水浴中で１時間加熱し、室温に戻した。この硝酸で処理した溶液１００μｌに蒸留水３００μｌ添加した。フレームレス原子吸光光度法（ＦＡＡＳ：ＡＡ−６７００ Ａｔｏｍｉｃ ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ ｆｌａｍｅ ｅｍｉｓｓｉｏｎ ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ ＳＩＭＡＺＵ）で白金量を測定し、腫瘍１グラムあたりの白金量を比較した。（波長２６５．９ｎｍ、スリット幅 ０．５、ランプ電流１４ｍＡ、１２０℃ ３０秒、２５０℃ １０秒、７００℃ ５秒、２６００℃ ３秒：検量線は、１ｍｇ／ｍｌ 白金標準液（ＮＡＫＡＲＡＩ）を蒸留水で希釈して、１２．５ｎｇ／ｍｌ、２５ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、２００ｎｇ／ｍｌの溶液を作製した。）。結果を以下の表に示す。
白金濃度：組織１ｇあたりに存在した白金量（ｎｇ）
投与後時間：各リポソームを投与し、組織に存在する白金濃度を測定した時間
シスプラチン単独：ｃｉｓ−ジアミンジクロロ白金（ＩＩ）のみ
ＳＬＸ修飾：ｃｉｓ−ジアミンジクロロ白金（ＩＩ）を内包した、シアリルルイスＸで修飾したリポソーム
（考察）
リポソーム投与の４８時間後において、シアリルルイスＸ修飾リポソームを投与したマウスでは、ｃｉｓ−ジアミンジクロロ白金（ＩＩ）のみを投与したマウスに比べて、リポソームが癌部位に顕著に集積していることが観察された。また、投与９６時間後において、ｃｉｓ−ジアミンジクロロ白金（ＩＩ）のみを投与すると、癌部位への集積は顕著に減少した。シアリルルイスＸ修飾リポソームでは、ｃｉｓ−ジアミンジクロロ白金（ＩＩ）のみを投与したときよりも２．５倍以上もｃｉｓ−ジアミンジクロロ白金（ＩＩ）が腫瘍部位に残存していることが確認された（表１）。
（２．細胞増殖を抑制する活性の確認）
本実施例は、実施例１（糖鎖なしリポソーム）、実施例３（糖鎖修飾リポソーム）および実施例５（抗体修飾リポソーム）により調製したｃｉｓ−ジアミンジクロロ白金（ＩＩ）内包リポソームを用いた。
エールリッヒ腹水癌細胞（ＥＡＴ細胞）（ＡＴＣＣ Ｎｕｍｂｅｒ ： ＣＣＬ−７７ＴＭ Ｅ （Ｅｈｒｌｉｃｈ−Ｌｅｔｔｅｒ ａｓｃｉｔｅｓ））を１×１０３細胞／１００μｌ／ウェル（Ｆａｌｃｏｎ３０７２）で播種し、２４時間培養後に試料を添加した。試料は、ｃｉｓ−ジアミンジクロロ白金（ＩＩ）内包未修飾リポソーム、ｃｉｓ−ジアミンジクロロ白金（ＩＩ）内包シアリルルイスＸリポソーム、ｃｉｓ−ジアミンジクロロ白金（ＩＩ）内包抗Ｅ−セレクチン抗体修飾リポソームを、ＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル液体培地低グルコース ＳＩＧＭＡ Ｄ６０４６）／１０％ＦＢＳ（ウシ胎児血清 ＳＩＧＭＡ Ｆ０９２６）／ペニシリン１００ｕｎｉｔ／ｍｌ・ストレプトマイシン１００μｇ／ｍｌ（Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ ｓｏｌｕｔｉｏｎ， ｓｔａｂｉｋｌｉｚｅｄ ＳＩＧＭＡ Ａ５９５５））で希釈してｃｉｓ−ジアミンジクロロ白金（ＩＩ）量として１０μｇ／ｍｌに調製した。コントロールとして、ｃｉｓ−ジアミンジクロロ白金（ＩＩ）のみをＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳで溶解し、１０μｇ／ｍｌに調製したもの（シスプラチン単独）を用いた。次いで、この試料を、終濃度が、８．３μＭ、１６．６μＭとなるように培養細胞へ添加し、３７℃，５％ＣＯ２インキュベーター内で４８時間培養した。添加から４８時間後の細胞数を、ホルマザン量を指標とするＭＴＴアッセイを行い評価した。
さらに、試料を含まない対象として、ＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳのみを添加したものついても、ＭＴＴアッセイを行った。
細胞数測定用ＷＳＴ−８（キシダ化学）を各ウェルに２０μｌ添加して、２時間後に吸光度４５０ｎｍを測定した。吸光度の測定には、ＧＥヘルスケア Ｕｌｔｒｏｓｐｅｃ−６３００を用いた。１試料あたり４区；ｎ＝３で実験を行った。結果を以下に示す。
（表２．各試料による細胞増殖の抑制）
試料：添加した試料の終濃度（μＭ）
試料なし：試料（ｃｉｓ−ジアミンジクロロ白金（ＩＩ））を添加しなかった群の吸光度（４５０ｎｍ）の平均
シスプラチン単独：ｃｉｓ−ジアミンジクロロ白金（ＩＩ）のみ
未修飾：ｃｉｓ−ジアミンジクロロ白金（ＩＩ）を内包した、未修飾のリポソーム
ＳＬＸ修飾：ｃｉｓ−ジアミンジクロロ白金（ＩＩ）を内包した、シアリルルイスＸで修飾したリポソーム
抗体修飾：ｃｉｓ−ジアミンジクロロ白金（ＩＩ）を内包した、抗Ｅ−セレクチン抗体で修飾したリポソーム
平均：各試料を投与した後の吸光度（４５０ｎｍ）の平均
ＳＤ：標準偏差
（考察）
試料を添加しなかった群では、吸光度（４５０ｎｍ）は０．４８０であった（表２、試料なし）。
未修飾リポソーム、ＳＬＸ修飾リポソームおよび抗体修飾リポソームを投与した群は、試料終濃度が８．３μＭのときも、１６．６μＭのときも、ｃｉｓ−ジアミンジクロロ白金（ＩＩ）単独のものとほぼ同様に効果があることが示された。この結果から、ｃｉｓ−ジアミンジクロロ白金（ＩＩ）をリポソームに封入しても、抗がん作用は消失しないことが示された。シスプラチンが細胞内でリポソームから放出され、核酸と相互作用していることが確認できた。
本実施例により、未修飾リポソーム、ＳＬＸ修飾リポソームおよび抗体修飾リポソームの全てにおいて、リポソームに内包されたｃｉｓ−ジアミンジクロロ白金（ＩＩ）は、細胞に対して増殖抑制活性を示すことが確認された。
（３．腫瘍の増殖抑制効果の確認）
６週齢マウス（Ｂａｌｂ／ｃ 雌性）（各群３匹）の右大腿部の皮下に、１×１０６細胞のエールリッヒ腹水癌細胞（ＥＡＴ細胞）（ＡＴＣＣ Ｎｕｍｂｅｒ ： ＣＣＬ−７７ＴＭ Ｅ （Ｅｈｒｌｉｃｈ−Ｌｅｔｔｅｒ ａｓｃｉｔｅｓ））を移植した。移植の５日後、１２日後、１９日後に、ｃｉｓ−ジアミンジクロロ白金（ＩＩ）内包シアリルルイスＸ修飾リポソーム、および抗Ｅ−セレクチン抗体修飾リポソームを、それぞれ、１．５ｍｇ／ｋｇ（２００μｇ／ｍｌ）でマウスの尾静脈に投与した。コントロールとして、生理食塩水、ｃｉｓ−ジアミンジクロロ白金（ＩＩ）を生理食塩水に２００μｇ／ｍｌとなるように溶解させた。この溶解した溶液を、同様に投与した。
腫瘍の大きさは、腫瘍を移植した１２日後、１９日後、２９日後に、デジタルノギス（Ｍｉｔｕｔｏｙｏ ＣＤ−Ｓ１５Ｃ）を用いて、長径（Ａｍｍ）および担径（Ｂｍｍ）を測定することで確認した。（Ａ×Ｂ２）×０．４の計算式により腫瘍体積（ｍｍ３）を計算した。
この動物実験では、内包用のリポソームには、がんに指向させることが知られている糖鎖（ＳＬＸ）および抗体を結合させたものを用いて、従来のシスプラチンに対する抗がん作用の改善を観察した。以下に結果を示す。
腫瘍体積（ｍｍ３）
日数：腫瘍移植後、腫瘍の大きさを測定した時期
生理食塩水：生理食塩水のみ
シスプラチン単独：ｃｉｓ−ジアミンジクロロ白金（ＩＩ）のみ
ＳＬＸ修飾：ｃｉｓ−ジアミンジクロロ白金（ＩＩ）を内包した、シアリルルイスＸで修飾したリポソーム
抗体修飾：ｃｉｓ−ジアミンジクロロ白金（ＩＩ）を内包した、抗Ｅ−セレクチン抗体で修飾したリポソーム
平均：各試料を投与した後の腫瘍体積（ｍｍ３）の平均
ＳＤ：標準偏差
（結果および考察）
この結果から、ｃｉｓ−ジアミンジクロロ白金（ＩＩ）を内包した、シアリルルイスＸ修飾リポソームまたは抗Ｅ−セレクチン抗体修飾リポソームを投与した場合、腫瘍細胞の移植後２９日目において、腫瘍の大きさは、ｃｉｓ−ジアミンジクロロ白金（ＩＩ）単独および未修飾のリポソームを投与したものよりも顕著に小さかった。
これは、ｃｉｓ−ジアミンジクロロ白金（ＩＩ）を内包したリポソームは、シアリルルイスＸまたは抗Ｅ−セレクチン抗体で修飾したことで、リポソームの腫瘍組織への集積性が高まったことにより、腫瘍にｃｉｓ−ジアミンジクロロ白金（ＩＩ）の効果が集中した結果と考えられる。
本実施例では、シアリルルイスＸおよび抗Ｅ−セレクチン抗体の修飾による効果が確認された。この結果より、ｃｉｓ−ジアミンジクロロ白金（ＩＩ）を内包させ、シアリルルイスＸまたは抗Ｅ−セレクチン抗体で修飾したリポソームは、ｃｉｓ−ジアミンジクロロ白金（ＩＩ）を単独で投与するよりも、顕著に少ない量で腫瘍の成長を抑制することが確認できた。このことから、シアリルルイスＸまたは抗Ｅ−セレクチン抗体で修飾したリポソームが腫瘍の治療に有効であることが示された。
また、従来の内包方法よりも脂質あたりまたはリン脂質あたりのシスプラチン内包量が顕著に増大させることができ、その結果、顕著な治療効果が奏されることも確認された。
これは、たとえば、従来の抗がん剤内包リポソーム（Ｃａｎｃｅｒ Ｃｈｅｍｏｔｔｈｅｒ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ （１９９９） ４３：１−７ Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ，ｔｉｓｓｕｅ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ，ａｎｄ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｎｅｓｓ ｏｆ ｃｉｓｐｌａｔｉｎ ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｄ ｉｎ ｌｏｎｇ−ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ，ｐｅｇｙｌａｔｅｄ ｌｉｐｏｓｏｍｅ（ＳＰＩ）ｉｎ ｔｕｍｏｒ−ｂｅａｒｉｎ ｍｉｃｅ）において達成されたものよりも顕著であることが理解される。この文献に記載されたＳＰＩ０７７リポソームは、アメリカで臨床利用されているリポソームである。この文献のＦｉｇ１Ａには、ＳＰＩ０７７リポソームのデータが記載されているが、その投与量は、本実施例のリポソームよりはるかに多い。したがって、本発明は、全体の投与量を減らしつつ、同程度以上の効果を達成するといえる。癌種によっては、プローブ標識していないリポソーム（ＳＰＩ０７７）で、本論文程度の抗癌活性が認められるため、糖鎖および抗体を認識プローブとして用いたリポソームは、このシスプラチン投与量で、更に効果が見込めると考えられる。
（実施例６Ｂ：他のがん・腫瘍の処置についての有効性の検討）
実施例１（未修飾リポソーム）、実施例３（糖鎖修飾リポソーム）および実施例５（抗体修飾リポソーム）により調製されたｃｉｓ−ジアミンジクロロ白金（ＩＩ）内包リポソームが、精巣腫瘍、膀胱がん、腎盂・尿管腫瘍、前立腺がん、卵巣がん、頭頸部がん、非小細胞肺がん、食道がん、子宮頸がん、神経芽細胞種、胃がん、小細胞肺がん、骨肉種、胚細胞腫瘍の処置に有効であることを確認する。
雌性Ｂａｌｂ／ｃマウスの大腿部皮下に、精巣腫瘍、膀胱がん、腎盂・尿管腫瘍、前立腺がん、卵巣がん、頭頸部がん、非小細胞肺がん、食道がん、子宮頸がん、神経芽細胞種、胃がん、小細胞肺がん、骨肉種、胚細胞腫瘍の細胞（約２×１０７個）を移植し、がん組織が０．３〜０．６ｇに発育したものを担がんマウスとして本実験に用いる。
各々の担がんマウスに、各ｃｉｓ−ジアミンジクロロ白金（ＩＩ）内包リポソーム（２００μｌ）を、経口投与または尾静脈投与のいずれかで、それぞれ投与する。
ｃｉｓ−ジアミンジクロロ白金（ＩＩ）内包リポソームを投与した全ての担がんマウスにおいて、がん・腫瘍の体積は減少するか、腫瘍・がんは消滅することが確認される。
したがって、本方法により作製されたｃｉｓ−ジアミンジクロロ白金（ＩＩ）内包リポソームは、がん・腫瘍の処置に有効であることがわかる。
(実施例７：他の水溶性アンミン白金錯体での実験）
（シスプラチン−硫酸体を内包したリポソームの調製）
（シスプラチン−硫酸体の調製）
４塩化白金カリウム（Ｋ２ＰｔＣｌ４）４．１５ｇ（１０．０ｍｍｏｌ）とヨウ化カリウム６．６４ｇ（４０ｍｍｏｌ）を、酸素を充分に除去した蒸留水５０ｍｌに完全に溶解した後、窒素雰囲気下で２８％アンモニア水溶液１．３５ｍｌ（２２ｍｍｏｌ）を添加し、撹拌することにより沈澱を得る。この沈澱物を水とエタノールで各々２回洗浄した後、常温で真空（〜２０ｍｍＨｇ）乾燥することによりアンミン−白金中間体ｃｉｓ−〔Ｐｔ（ＮＨ３）２Ｉ２〕を得る。このアンミン−白金中間体ｃｉｓ−〔Ｐｔ（ＮＨ３）２Ｉ２〕１．４５ｇ（３．０ｍｍｏｌ）を蒸留水３００ｍｌに懸濁させた後、硫酸銀０．９３３ｇ（３．０ｍｍｏｌ）を添加して、攪拌しながら４時間反応させ、生成したヨウ化銀を濾別し、シスプラチン−硫酸体として、無色のｃｉｓ−〔Ｐｔ（ＮＨ３）２ＳＯ４〕を得る。
（シスプラチン−硫酸体の内包されたリポソームの調製）
ＤＰＰＣ、コレステロール、ガングリオシド、ＤＣＰ、ＤＰＰＥをモル比で、３５：４０：５：１５：５の割合で合計脂質量４５．６ｍｇになるように混合し、コール酸ナトリウム４６．９ｍｇを添加し、メタノール・クロロホルム溶液（１：１）溶液３ｍｌに溶解させる。３７℃、１時間撹拌し、メタノールクロロホルムをロータリーエバポレーターで蒸発させて、真空乾燥させる。得られた脂質膜をＮａＣｌ未添加のＮ−トリス（ヒドロキシメチル）−３−アミノメタン（ＴＡＰＳ）緩衝液（ｐＨ８．４）３ｍｌに懸濁させ、３７℃、１時間撹拌する。次いで、この溶液を窒素置換し、超音波処理して、透明なミセル懸濁液を得る。次に、シスプラチン−硫酸体を５０ｍｇを秤量して、ＮａＣｌ未添加のＴＡＰＳ緩衝液（ｐＨ８．４）７ｍｌに溶解させ、ミセル懸濁液と混合し、ＰＭ１０（Ａｍｉｃｏｎ Ｃｏ．，ＵＳＡ）とＮａＣｌ未添加のＴＡＰＳ緩衝液（ｐＨ８．４）を用いた限外濾過（分画分子量：１０，０００）にかけ均一リポソーム１０ｍｌを調製する。
（リポソーム中にシスプラチン−硫酸体が内包されたことの確認）
本実施例で調製されたリポソームに、シスプラチン−硫酸体が内包されていることを、実施例１と同様の方法を用いて、フレームレス原子吸光光度法（ＦＡＡＳ）により確認する。
その結果、リポソーム中に、シスプラチン−硫酸体が内包されていることが確認される。
（シスプラチン−硫酸体のｃｉｓ−ジアミンジクロロ白金（ＩＩ）への転換）
（１．緩衝液によるシスプラチン−硫酸体のｃｉｓ−ジアミンジクロロ白金（ＩＩ）への転換）
シスプラチン−硫酸体が内包されたことが確認されたリポソームを、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）−３−アミノプロパンスルホン酸緩衝液（ｐＨ８．４）、炭酸緩衝液（ｐＨ８．５）、ＰＢＳ（ｐＨ８．０）、またはＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．２）に、２５℃にて、９６時間供する。これらの緩衝液は、いずれも最終濃度１５０ｍＭのＮａＣｌが含まれている。
その結果、無色の溶液は淡黄色に変化することが確認される。これは、シスプラチン−硫酸体が、ｃｉｓ−ジアミンジクロロ白金（ＩＩ）に転換したことを示す。さらに、この変化は、実施例１と同様の方法を用いて、吸光光度法、ＩＲ法、１９５Ｐｔ−ＮＭＲ法により検出することができる。
（２．糖鎖を結合させたシスプラチン−硫酸体を内包したリポソームの調製）
実施例２と同様の方法を使用して、シスプラチン−硫酸体が内包されたことが確認されたリポソームから、糖鎖を結合させたｃｉｓ−ジアミンジクロロ白金（ＩＩ）を内包したリポソームを調製する。得られたリポソームにおいて、シスプラチン−硫酸体がｃｉｓ−ジアミンジクロロ白金（ＩＩ）へ転換したことは、実施例１と同様の方法を用いて、吸光光度法、ＩＲ法、１９５Ｐｔ−ＮＭＲ法により検出することができる。
（３．抗体を結合させたｃｉｓ−ジアミンジクロロ白金（ＩＩ）を内包したリポソームの調製）
実施例６と同様の方法を使用して、シスプラチン−硫酸体が内包されたことが確認されたリポソームの各溶液から、抗体を結合させたｃｉｓ−ジアミンジクロロ白金（ＩＩ）を内包したリポソームを調製する。得られたリポソームにおいて、シスプラチン−硫酸体がｃｉｓ−ジアミンジクロロ白金（ＩＩ）へ転換したことは、実施例１と同様の方法を用いて、吸光光度法、ＩＲ法、１９５Ｐｔ−ＮＭＲ法により検出することができる。
（リポソームの定量分析）
上記（シスプラチン−硫酸体のｃｉｓ−ジアミンジクロロ白金（ＩＩ）への転換）節で調製したリポソームの各々について、定量分析（タンパク質定量、脂質定量、粒子径分布および粒子径）を、実施例１と同様の方法により行う。
（がん・腫瘍の処置についての有効性の検討）
実施例５と同様の方法により、上記（シスプラチン−硫酸体のｃｉｓ−ジアミンジクロロ白金（ＩＩ）への転換）節で調製したリポソームの各々が、腫瘍・がんの処置に有効であるかどうかを確認する。
その結果、これらの難水溶性薬剤を内包したリポソームを投与した全ての担がんマウスにおいて、がん・腫瘍の体積は減少するか、腫瘍・がんは消滅することが確認される。
したがって、本方法により作製されたｃｉｓ−ジアミンジクロロ白金（ＩＩ）を内包したリポソームは、がん・腫瘍の処置に有効であることがわかる。
(実施例８：他の白金錯体での実験）
実施例１と同様の方法を用いて、ｃｉｓ−ジアンミンジクロロ白金（ＩＩ）の代わりに、ｃｉｓ−ジアンミン−１，１−シクロブタン−ジカルボキシラト白金（ＩＩ）、ｃｉｓ−ジアンミン（グリコラト）白金（ＩＩ）、（１Ｒ，２Ｒ−ジアンミンシクロへキサン）オキサラト白金（ＩＩ）、ｃｉｓ−ジアンミンジブロモ白金（ＩＩ）を内包させたリポソームを調製する。
（リポソーム中に薬剤が内包されたことの確認）
実施例１と同様の方法を使用して、フレームレス原子吸光光度法（ＦＡＡＳ）により、これら薬剤が水溶性形態としてリポソーム中に内包されたことを確認する。
（水溶性薬剤から難水溶性薬剤への転換）
（１．緩衝液による水溶性薬剤から難水溶性薬剤への転換）
実施例１と同様の方法を使用して、水溶性薬物が内包されたことが確認されたリポソームの各溶液を、各々が形成する塩が難水溶性であるイオンを含む溶液に供する。その結果、水溶性薬剤が、難水溶性薬剤に転換したことを示す。さらに、この変化は、実施例１と同様の方法を用いて、吸光光度法、ＩＲ法、１９５Ｐｔ−ＮＭＲ法により検出することができる。
（２．糖鎖を結合させた難水溶性薬剤を内包したリポソームの調製）
実施例３と同様の方法を使用して、水溶性薬物が内包されたことが確認されたリポソームの各溶液から、糖鎖を結合させた難水溶性薬剤を内包したリポソームを調製する。このリポソームについて、内包された水溶性薬剤が難水溶性薬剤へ転換したことは、実施例１と同様の方法を用いて、吸光光度法、ＩＲ法、１９５Ｐｔ−ＮＭＲ法により検出することができる。
（３．抗体を結合させた難水溶性薬剤を内包したリポソームの調製）
実施例６と同様の方法を使用して、水溶性薬物が内包されたことが確認されたリポソームの各溶液から、抗体を結合させた難水溶性薬剤を内包したリポソームを調製する。このリポソームについて、内包された水溶性薬剤が難水溶性薬剤へ転換したことは、実施例１と同様の方法を用いて、吸光光度法、ＩＲ法、１９５Ｐｔ−ＮＭＲ法により検出することができる。
（リポソームの定量分析）
上記（水溶性薬剤から難水溶性薬剤への転換）節で調製したリポソームの各々について、定量分析（タンパク質定量、脂質定量、粒子径分布および粒子径）を、実施例１と同様の方法により行う。
（がん・腫瘍の処置についての有効性の検討）
実施例５と同様の方法により、上記（水溶性薬剤から難水溶性薬剤への転換）節で調製したリポソームの各々が、腫瘍・がんの処置に有効であるかどうかを確認する。
その結果、これらの難水溶性薬剤を内包したリポソームを投与した全ての担がんマウスにおいて、がん・腫瘍の体積は減少するか、腫瘍・がんは消滅することが確認される。
したがって、本方法により作製された難水溶性薬剤を内包したリポソームは、がん・腫瘍の処置に有効であることがわかる。
（実施例９．凍結乾燥空リポソームへのｃｉｓ−ジアンミンジニトラト白金（ＩＩ）の内包）
本実施例では、本発明の内包技術がどのようなリポソームにも応用できることを確認するために、改良コール酸塩法（Ｎ．Ｙａｍａｚａｋｉ，Ｍ．ｋｏｄａｍａ，Ｈ−Ｊ．Ｇａｂｉｕｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，２４２，５６−６５（１９９４）；Ｎ．Ｙａｍａｚａｋｉ，Ｊ．Ｍｅｍｂｒ．Ｓｃｉ．，４１，２４９−２６７（１９８９）；およびＭ．Ｈｉｒａｉ，Ｈ．Ｍｉｎｅｍａｔｓｕ，Ｎ Ｋｏｎｄｏ，Ｋ Ｏｉｅ，Ｋ．Ｉｇａｒａｓｈｉ，Ｎ．Ｙａｍａｚａｋｉ，ＢＢＲＣ．，３５３，５５３−５５８（２００７））とは異なる凍結乾燥空リポソーム法（Ｈ．Ｋｉｋｕｃｈｉ，Ｎ．Ｓｕｚｕｋｉ ｅｔ ａｌ，Ｂｉｏｐｈａｒｍ．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｐｏｓ．，１７，５８９−６０５（１９９９））により作製されたリポソームを用いて、ｃｉｓ−ジアンミンジニトラト白金（ＩＩ）を内包させた。
（ｃｉｓ−ジアンミンジニトラト白金（ＩＩ）（ＣＤＤＰ−３）の合成）
実施例１と同様の方法を用いた。ｃｉｓ−ジアンミンジニトラト白金（ＩＩ）は、Ｄａｈａｒａの方法（Ｓ．Ｇ．Ｄｈａｒａ，Ｉｎｄｉａｎ Ｊ．Ｃｈｅｍ．，７，３３５（１９７０））により合成した。
塩化白金酸カリウム４．１５ｇ（１０ｍｍｏｌ）を蒸留水に溶解後、遮光、氷冷下で窒素を吹き込みながらヨウ化カリウム６．６４ｇ（４０ｍｍｏｌ）を加え５分間撹拌した。この反応溶液に２８％アンモニア水溶液１．３５ｍＬ（２２ｍｍｏｌ）を滴下し、３時間撹拌した。生成した黄色結晶を濾取し、蒸留水、エタノールで順次洗浄した後、４０℃で１０時間減圧乾燥した。ここで、アンミン−白金中間体ｃｉｓ−〔Ｐｔ（ＮＨ３）２Ｉ２〕（ｃｉｓ−ｄｉａｍｍｉｎｅｄｉｉｏｄｅｐｌａｔｉｎｕｍ（ＩＩ）（ＣＤＤＰ−２））を４．４９ｇ得た。ｃｉｓ−〔Ｐｔ（ＮＨ３）２Ｉ２〕２．４１ｇ（５ｍｍｏｌ）を蒸留水に懸濁させた後、硝酸銀１．６８ｇ（９．９ｍｍｏｌ）を加え、遮光下２４時間撹拌した。生成したヨウ化銀を濾別し、濾液をエバポレーターで濃縮して白色結晶を得た。この白色結晶を冷蒸留水、エタノールで順次洗浄した後、４０℃で１０時間減圧乾燥し、ｃｉｓ−ジアンミンジニトラト白金（ＩＩ）を１．０１ｇ得た。
（２種類のリポソームの調製およびｃｉｓ−ジアミンジクロロ白金（ＩＩ）の内包）
（１．改良型コール酸塩法（リポソームＩ））
リポソームＩは、実施例１の改良型コール酸塩法と同様の方法を用いて調製した。ＤＰＰＣ、コレステロール、ガングリオシド、ＤＣＰ、ＤＰＰＥをモル比で３５：４０：５：１５：５の割合で合計脂質量４５．６ｍｇになるように混合し、コール酸ナトリウム４６．９ｍｇを添加して、メタノール・クロロホルム（１：１）溶液３ｍＬに溶解させた。３７℃、１時間撹拌後、メタノールとクロロホルムをロータリーエバポレーターで蒸発させ、真空乾燥後に塩化ナトリウム不含のＴＡＰＳ（Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）−３−アミノプロパンスルホン酸）緩衝液（ｐＨ８．４）３ｍＬに懸濁した。３７℃で１時間撹拌した後、超音波処理をして透明なミセル懸濁液を得た。
次に、ｃｉｓ−ジアンミンジニトラト白金（ＩＩ）（１０８．２ｍｇ）を塩化ナトリウム不含ＴＡＰＳ緩衝液（ｐＨ８．４）７ｍｌに完全に溶解させ、１Ｍの水酸化ナトリウムでｐＨ８．４に調製し、ミセル懸濁液と混合した。ＰＭ１０（ＡＭＩＣＯＮ）と塩化ナトリウム不含ＴＡＰＳ緩衝液（ｐＨ８．４）を用いた限外濾過（分画分子量：１０，０００）によりリポソーム１０ｍＬを調製した。リポソーム外液をＰＭ１０（Ａｍｉｃｏｎ）を用いた限外濾過により１５０ｍＭの塩化ナトリウム含有ＴＡＰＳ緩衝液（ｐＨ８．４）に置換し、リポソームに内包されたｃｉｓ−ジアンミンジニトラト白金（ＩＩ）をｃｉｓ−ジアミンジクロロ白金（ＩＩ）に変換させた。
（２．凍結乾燥法（リポソームＩＩ）
凍結乾燥空リポソームは、ＣＯＡＳＴＯＭＥ ＥＬシリーズ（ＥＬ−０１−ＰＡ、日油）を使用した。このＣＯＡＳＴＯＭＥ ＥＬ−０１−ＰＡ（負電荷リポソーム）の組成は、ジセチルフォスファチジルエタノールアミン−ポリグリセリン８Ｇ：ジパルミトイルホスファチジルコリン：コレステロール：ジパルミトイルホスファチジルグリセロール＝４．２：１１．４：１５．２：１１．４（μＭｏｌ／バイアル）である。ｃｉｓ−ジアンミンジニトラト白金（ＩＩ）（４０ｍｇ）を塩化ナトリウム不含のＴＡＰＳ緩衝液（ｐＨ８．４）２ｍＬに溶解させ、１Ｍ水酸化ナトリウムでｐＨ８．４に調製して凍結乾燥リポソームのバイヤル内に２ｍＬ滴下した。バイヤルを５回転倒混和し、ＰＭ１０（ＡＭＩＣＯＮ）と塩化ナトリウム不含のＴＡＰＳ緩衝液（ｐＨ８．４）を用いた限外濾過（分画分子量：１０，０００）によりリポソーム２ｍＬを調製した。塩化ナトリウムを１５０ｍＭとなるようにリポソーム溶液に添加し４℃、９６時間撹拌して内包されたｃｉｓ−ジアンミンジニトラト白金（ＩＩ）をｃｉｓ−ジアミンジクロロ白金（ＩＩ）に変換した。
（比較例２．ｃｉｓ−ジアンミンジニトラト白金（ＩＩ）を用いることなく、ｃｉｓ−ジアミンジクロロ白金（ＩＩ）を直接内包させたリポソーム）
比較例として、ｃｉｓ−ジアンミンジニトラト白金（ＩＩ）をリポソームに内包させｃｉｓ−ジアミンジクロロ白金（ＩＩ）に変換するのではなく、ｃｉｓ−ジアミンジクロロ白金（ＩＩ）を直接内包させたリポソームを調製した。
（１．改良型コール酸塩法）
ｃｉｓ−ジアミンジクロロ白金（ＩＩ）を直接内包させたリポソームを、ｃｉｓ−ジアミンジクロロ白金（ＩＩ）（ＳＩＧＭＡ）２８ｍｇを１５０ｍＭ塩化ナトリウム含有ＴＡＰＳ緩衝液（ｐＨ８．４）７ｍｌに完全に溶解させ、１Ｍ水酸化ナトリウムでｐＨ８．４に調製し、ミセル懸濁液と混合して作製した。ｃｉｓ−ジアンミンジニトラト白金（ＩＩ）のかわりにｃｉｓ−ジアミンジクロロ白金（ＩＩ）を用いることおよび緩衝液に塩化ナトリウムが含まれること以外、本実施例のｃｉｓ−ジアンミンジニトラト白金（ＩＩ）の内包と同様の方法を用いた。
（２．凍結乾燥法）
凍結乾燥空リポソームは、ＣＯＡＳＴＯＭＥ ＥＬシリーズ（ＥＬ−０１−ＰＡ、日本油脂）を使用した。ｃｉｓ−ジアミンジクロロ白金（ＩＩ）を直接内包させたリポソームを、以下のようにして作製した。ＣＯＡＳＴＯＭＥ ＥＬ−０１−ＰＡ を室温に戻した。シスプラチン４ｍｇを１５０ｍＭ塩化ナトリウム含有ＴＡＰＳ緩衝液（ｐＨ８．４）２ｍｌに完全に溶解させ、ＣＯＡＳＴＯＭＥ ＥＬ−０１−ＰＡに添加し、３回転倒混和した。遊離のシスプラチンを除くために、分画分子量１０，０００の膜を用いて限外濾過を行った。
（３．糖鎖で修飾したｃｉｓ−ジアミンジクロロ白金（ＩＩ）内包リポソームＩの製造）
本実施例の改良コール酸法において調製したｃｉｓ−ジアミンジクロロ白金（ＩＩ）内包リポソームＩのうちの一部分を用いて、実施例３と同様の方法により、糖鎖で修飾したリポソームＩを作製した。
（リポソーム脂質膜面上の親水性化処理）
ｃｉｓ−ジアミンジニトラト白金（ＩＩ）内包したリポソームＩの溶液１０ｍｌをＸＭ３００膜（Ａｍｉｃｏｎ Ｃｏ．，ＵＳＡ）と炭酸緩衝液（ｐＨ ８．５）を用いた限外濾過（分画分子量：３００，０００）にかけ溶液のｐＨを８．５にした。次に、架橋試薬ビス（スルホスクシンイミジル）スベレート（ＢＳ３；Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｏ．，ＵＳＡ）１０ｍｇを加え、室温で２時間攪拌した。その後、さらに冷蔵下で一晩攪拌してリポソーム膜上の脂質ジパルミトイルフォスファチジルエタノールアミンとＢＳ３との化学結合反応を完結した。そして、このリポソーム液をＸＭ３００膜と炭酸緩衝液（ｐＨ ８．５）で限外濾過（分画分子量：３００，０００）にかけた。次に、炭酸緩衝液（ｐＨ ８．５）１ｍｌに溶かしたトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン４０ｍｇをリポソーム液１０ｍｌに加えた。次いで、この溶液を、室温で２時間攪拌後、冷蔵下で一晩攪拌し、分画分子量３００，０００で限外濾過し、遊離のトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンを除去し、該炭酸緩衝液をＮ−トリス（ヒドロキシメチル）−３−アミノプロパンスルホン酸緩衝液（ｐＨ８．４）に交換し、リポソーム膜上の脂質に結合したＢＳ３とトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンとの化学結合反応を完結した。これにより、リポソーム膜の脂質ジパルミトイルフォスファチジルエタノールアミン上にトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンの水酸基が配位して水和親水性化された。
（リポソーム膜面上へのヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）の結合）
本実施例で得られた１０ｍｌのリポソームＩの膜面上に存在するガングリオシドを１ｍｌのＮ−トリス（ヒドロキシメチル）−３−アミノプロパンスルホン酸緩衝液（ｐＨ ８．４）に溶かしたメタ過ヨウ素酸ナトリウム４３ｍｇを加え、冷蔵下で一晩攪拌して過ヨウ素酸酸化した。ＸＭ３００膜とＰＢＳ緩衝液（ｐＨ ８．０）で限外濾過（分画分子量：３００，０００）することにより、遊離の過ヨウ素酸ナトリウムを除去し、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）−３−アミノプロパンスルホン酸緩衝液をＰＢＳ緩衝液（ｐＨ８．０）に交換して、酸化されたリポソーム１０ｍｌを得た。このリポソーム液に、２０ｍｇのヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）／ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ ８．０）を加えて室温で２時間反応させ、次に２Ｍ ＮａＢＨ３ＣＮ／ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ ８．０）１００μｌを加えて室温で２時間、さらに冷蔵下で一晩攪拌してリポソーム上のガングリオシドとＨＳＡとのカップリング反応でＨＳＡを結合した。次いで、限外濾過（分画分子量：３００，０００）し、遊離のシアノホウ素酸ナトリウムおよびヒト血清アルブミンを除去し、この溶液の緩衝液を炭酸緩衝液（ｐＨ８．５）に交換して、ＨＳＡ結合リポソーム液１０ｍｌを得た。
（糖鎖の調製）
糖鎖として、シアリルルイスＸを使用した。
各糖鎖の質量を計測し、以下において使用するための前処理をした。
（リポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）上への糖鎖の結合）
糖鎖２ｍｇを精製水に溶解し、０．２５ｇのＮＨ４ＨＣＯ３を溶かした０．５ｍｌ水溶液に加え、３７℃で３日間攪拌した後、０．４５μｍのフィルターで濾過して糖鎖の還元末端のアミノ化反応を完結して、各糖鎖のグリコシルアミン化合物４ｍｇ／ｍｌ（アミノ化糖鎖溶液）を得た。次に、本実施例で得たリポソームＩの溶液の一部分（１０ｍｌ）に架橋試薬３，３’−ジチオビス（スルホスクシンイミジルプロピオネート）（ＤＴＳＳＰ；Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｏ．，ＵＳＡ）１０ｍｇを加えて室温で２時間、続いて冷蔵下で一晩攪拌し、ＸＭ３００膜と炭酸緩衝液（ｐＨ ８．５）で限外濾過（分画分子量：３００，０００）して、遊離のＤＴＳＳＰを除去し、ＤＴＳＳＰがリポソーム上のＨＳＡに結合したリポソーム１０ｍｌを得た。次に、このリポソーム液に上記のグリコシルアミン化合物（アミノ化糖鎖溶液）３７．５μｌを加えて、室温で２時間反応させ、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン／炭酸緩衝液（ｐＨ ８．５）を添加し、その後、冷蔵下で一晩攪拌し、リポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン上のＤＴＳＳＰにグリコシル化アミン化合物の結合を行った。ＸＭ３００膜とＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ ７．２）で限外濾過（分画分子量：３００，０００）して、遊離の糖鎖およびトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンを除去した。その結果、糖鎖とヒト血清アルブミンとリポソームとが結合したリポソーム各１０ｍｌが得られた。
（リポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）上の親水性化処理）
本実施例で調製された糖鎖が結合したリポソームＩについて、リポソーム上のＨＳＡタンパク質表面の親水性化処理を行った。このリポソーム１０ｍｌに、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン２６．４ｍｇを加えて、室温で２時間、その後冷蔵下で一晩攪拌した後、ＸＭ３００膜とＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ ７．２）で限外濾過（分画分子量：３００，０００）し、未反応物を除去した。０．４５μｍのフィルターで濾過して、最終産物である親水性化処理された糖鎖が結合したリポソーム複合体各１０ｍｌを得た。
（粒子径およびゼータ電位の測定）
本実施例および比較例において調製した各リポソーム溶液（糖鎖なし）を純水で５０倍に希釈して、動的散乱法により、ゼータサイザーナノＮａｎ−ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ）を用いて測定した。
ｃｉｓ−ジアンミンジニトラト白金（ＩＩ）を内包させた後、ｃｉｓ−ジアミンジクロロ白金（ＩＩ）に変換したｃｉｓ−ジアミンジクロロ白金（ＩＩ）内包リポソームＩの粒子径分布は、均一な粒度分布を示し、平均粒子径は１５９ｎｍであった（表４）。ｃｉｓ−ジアンミンジニトラト白金（ＩＩ）を内包させた後、ｃｉｓ−ジアミンジクロロ白金（ＩＩ）に変換したｃｉｓ−ジアミンジクロロ白金（ＩＩ）内包リポソームＩＩの粒子径分布は、均一な粒度分布を示し、平均粒子径は１４７ｎｍであった（表４）。
リポソームＩおよびＩＩの粒子径や形状の確認を行った結果、表４に示すように、ｃｉｓ−ジアミンジクロロ白金（ＩＩ）内包リポソームの粒子径は、いずれのリポソームにおいても約１５０ｎｍであった。腫瘍組織や炎症組織にリポソームを集積させるためには、リポソームの粒子径を調節することが重要となる。がん部位の新生血管や炎症部位の血管には、１００〜２００ｎｍの間隙が存在することが明らかにされていることから、リポソームＩおよびリポソームＩＩの粒子の大きさは、血管内から組織へ移行して集積することができる程度であると考えられる（Ａ．Ａ．Ｇａｂｉｚｏｎ，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，５２，８９１−８９６（１９９２）；Ｓ．Ｋ．Ｈｕａｎｇ，Ｆ．Ｊ．Ｍａｒｔｉｎ，Ｇ．Ｊａｙ ｅｔ ａｌ，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．，１４３，１０−１４（１９９３）；Ｓ．Ｋ．Ｈｕａｎｇ，Ｅ．Ｍａｙｈｅｗ，Ｓ．Ｇｉｌａｎｉ ｅｔ ａｌ，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，５２，６７７４−６７８１（１９９２）；およびＮ．Ｚ．Ｗｕ，Ｄ．Ｄａ，Ｔ．Ｌ．Ｒｕｄｏｌｌ ｅｔ ａｌ，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，５３，３７６５−３７７０（１９９３））。
（電子顕微鏡による観察）
本実施例において調製した、ｃｉｓ−ジアミンジクロロ白金（ＩＩ）を内包したリポソームＩ（糖鎖なし）を１％ 酢酸ウランによりネガティブ染色した（Ｊ．Ｄ．Ａｌｍｅｉｄａ，Ｃ．Ｍ．Ｂｒａｎｄ，Ｄ．Ｃ．Ｅｄｗａｒｄｓ ａｎｄ Ｔ．Ｄ．Ｈｅａｔｈ，Ｌａｎｃｅｔ ２（７９４１）．，８９９−９０１（１９７５）。具体的には、銅メッシュにリポソーム溶液を１滴滴下し、ＰＢＳ緩衝液でよく洗浄し、１％酢酸ウランに数秒間浸した。余分な水分を吸い取り乾燥させた。その後、透過型電子顕微鏡Ｈ−７１００Ｓ（ＨＩＴＡＣＨＩ）により、粒子の形状と大きさを８００００倍で観察した。
その結果、ｃｉｓ−ジアミンジクロロ白金（ＩＩ）を内包したリポソームＩは、均一な球状のリポソームであることがわかった（図７）。また、電子顕微鏡で観察されたリポソームＩの粒子径は、動的散乱法による平均粒子径と一致する結果を得た。
（脂質量の定量）
実施例２と同様の方法を用いた。０．５％ＴｉｔｏｎＸ−１００存在下でデタミナーＴＣ５５５キット（ＫＹＯＷＡ）を用いて、総コレステロール量を測定し、各脂質のモル比から総脂質量を算出した
その結果、リポソーム量の目安となる脂質量は、リポソームＩで３．５ｍｇ／ｍＬ、リポソームＩＩで７．６ｍｇ／ｍＬであった（表４）。
（ｃｉｓ−ジアンミンジニトラト白金（ＩＩ）の定量）
リポソームに内包されたｃｉｓ−ジアンミンジニトラト白金（ＩＩ）は、フレームレス原子吸光光度法（ＦＡＡＳ）によりＡＡ−６７００ Ａｔｏｍｉｃ ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ ｆｌａｍｅ ｅｍｉｓｓｉｏｎ ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ（ＳＨＩＭＡＺＵ））を用いて定量した。波長２６５．９ｎｍ、スリット幅０．５、ランプ電流１４ｍＡの条件下、１２０℃で３０秒間、２５０℃で１０秒間、７００℃で２０秒間、７００℃で５秒間、２６００℃で３秒間、順次処理を行った。１ｍｇ／ｍＬ白金標準液（ＮＡＫＡＲＡＩ）を精製水で希釈して１２．５ｎｇ／ｍｌ、２５ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、２００ｎｇ／ｍｌの溶液を調製し、検量線を作成した。リポソーム溶液は精製水で１０，０００倍希釈して被検試料とした。
フレームレス原子吸光光度法（ＦＡＡＳ）で白金量を測定することによって、リポソームに内包されたｃｉｓ−ジアミンジクロロ白金（ＩＩ）の量を算出した結果、改良コール酸塩法では、ｃｉｓ−ジアンミンジニトラト白金（ＩＩ）を内包させｃｉｓ−ジアミンジクロロ白金（ＩＩ）に変換したリポソームＩ溶液中のｃｉｓ−ジアミンジクロロ白金（ＩＩ）濃度は、９１．０８μｇ／脂質ｍｇ（３２３．３μｇ／ｍＬ）であった（表４左欄）。一方、ｃｉｓ−ジアミンジクロロ白金（ＩＩ）をリポソームに直接内包した場合、０．３０６μｇ／脂質ｍｇ（１．０７μｇ／ｍＬ）であった（表４左欄）。
凍結乾燥法においては、ｃｉｓ−ジアンミンジニトラト白金（ＩＩ）を内包させｃｉｓ−ジアミンジクロロ白金（ＩＩ）に変換したリポソームＩＩ溶液中のｃｉｓ−ジアミンジクロロ白金（ＩＩ）濃度は、１１７．５μｇ／脂質ｍｇ（８９３μｇ／ｍＬ）であった（表４右欄）。一方、ｃｉｓ−ジアミンジクロロ白金（ＩＩ）をリポソームに直接内包した場合、１７．７μｇ／脂質ｍｇ（１３４．６μｇ／ｍＬ）であった（表４右欄）。
ｃｉｓ−ジアンミンジニトラト白金（ＩＩ）を内包させた後ｃｉｓ−ジアミンジクロロ白金（ＩＩ）に変換したときの脂質１ｍｇあたりの内包量は、リポソームＩでは、ｃｉｓ−ジアミンジクロロ白金（ＩＩ）をリポソームに直接内包させたときの約３００倍量であり、リポソームＩＩでは、６．６倍量であった。この結果、特に、リポソーム形成と同時に物質を内包させる改良コール酸塩法により作製したリポソームＩの場合、より内包量の差が大きいことが確認された。
ｃｉｓ−ジアンミンジニトラト白金（ＩＩ）は、ｃｉｓ−ジアミンジクロロ白金（ＩＩ）よりも水溶性が約１０倍高い。したがって、ｃｉｓ−ジアンミンジニトラト白金（ＩＩ）をリポソームに内包させた後ｃｉｓ−ジアミンジクロロ白金（ＩＩ）に変換する方法により、脂質１ｍｇあたり約３００倍量のｃｉｓ−ジアミンジクロロ白金（ＩＩ）がリポソームに内包されたことは、予測よりもはるかに高濃度でｃｉｓ−ジアミンジクロロ白金（ＩＩ）が内包されたといえる。また、リポソームＩＩにおいては、その差が約６〜７倍の内包量の差であったことから、この内包技術は、特に、改良コール酸塩法で作製したリポソームＩでより効果的であるといえる。
一般的に、リポソーム形成と同時に物質を内包させる改良コール酸塩法を用いて作製したリポソームＩの場合、ｃｉｓ−ジアミンジクロロ白金（ＩＩ）のような無電荷の低分子化合物の内包量は非常に低い。このため、ｃｉｓ−ジアミンジクロロ白金（ＩＩ）をリポソームに直接内包させる方法では、リポソームＩは０．３０６μｇ／脂質ｍｇのｃｉｓ−ジアミンジクロロ白金（ＩＩ）しか内包することができなかった。しかし、本発明の内包技術を用いた場合には、９１．１μｇ／脂質ｍｇのｃｉｓ−ジアミンジクロロ白金（ＩＩ）を内包させることができた。改良コール酸塩法により作製したリポソームＩのほうが、凍結乾燥空リポソーム法を用いて作製したリポソームＩＩよりもｃｉｓ−ジアミンジクロロ白金（ＩＩ）内包量の差が大きく現れたことの原因は、改良コール酸塩法では無電荷の低分子化合物を内包させることがほとんどできないことにあると考えられる。
また、本実施例のリポソームＩおよびリポソームＩＩは、血中タンパク質との結合を防ぐために、リポソーム表面の電荷は負となるように負電荷を帯びた脂質成分により構成されているが正電荷のものでも適用可能であり、当業者は適宜設計変更することができる。ｃｉｓ−ジアンミンジニトラト白金（ＩＩ）は、水溶液中でプラスの電荷を有することから、負電荷を有する脂質成分を用いたリポソームへの内包にとって有利な分子形態である可能性がある。ＥＰＲ効果（Ｙ．Ｍａｔｓｕｍｕｒａ ａｎｄ Ｈ．Ｍａｅｄａ，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，４６，６３８７−６３９２（１９８６））により炎症やがん部位をターゲティングするリポソームのほとんどが、血中滞留性を向上させるために表面電荷が負となるように設計されているので、汎用されている多くのリポソームにおいても同じように、本発明の内包技術を用いることにより難水溶性の薬物のリポソームへの内包量を増加させることができると考えられる。
（ｃｉｓ−ジアンミンジニトラト白金（ＩＩ）からｃｉｓ−ジアミンジクロロ白金（ＩＩ）への変換の確認）
ｃｉｓ−ジアンミンジニトラト白金（ＩＩ）の硝酸イオンが、１５０ｍＭ塩化ナトリウムの塩化物イオンによって置換することを、吸収スペクトル法を用いて確認した（比較例１および図４Ａおよび図４Ｂ）。
図４Ａおよび図４Ｂに示す通り、ｃｉｓ−ジアンミンジニトラト白金（ＩＩ）の吸収スペクトル（図４Ａ）は、塩化物イオンを添加した直後から経時的に変化し、図４Ｂに示すｃｉｓ−ジアミンジクロロ白金（ＩＩ）の吸収スペクトルと一致した。このことから、ｃｉｓ−ジアンミンジニトラト白金（ＩＩ）は、１５０ｍＭ 塩化ナトリウム存在下で９９％以上がｃｉｓ−ジアミンジクロロ白金（ＩＩ）に変換したことが確認できた。
次に、リポソームＩおよびリポソームＩＩに内包されたｃｉｓ−ジアンミンジニトラト白金（ＩＩ）が１５０ｍＭ塩化ナトリウム溶液中でｃｉｓ−ジアミンジクロロ白金（ＩＩ）に変換することを、１９５Ｐｔ−ＮＭＲ法により確認した。
（１９５Ｐｔ−ＮＭＲ法）
実施例３と同様の方法を使用した。ｃｉｓ−ジアンミンジニトラト白金（ＩＩ）を内包させたリポソームとして、本実施例において調製したリポソームＩＩを用いた。これらのリポソームに内包させたｃｉｓ−ジアンミンジニトラト白金（ＩＩ）からｃｉｓ−ジアミンジクロロ白金（ＩＩ）への変換を、２５℃で直径５ｍｍの測定管にサンプルに入れＩＮＯＶＡ−６００（Ｖａｒｉａｎ社）を用いた１９５Ｐｔ−ＮＭＲ法により解析した。
（サンプル調製）
Ｓｏｄｉｕｍ ｈｅｘａｃｈｌｏｒｏｐｌａｔｉｎａｔｅ（ＩＶ）を重水に５０ｍＭとなるように溶解して外部標準液とした。ｃｉｓ−ジアミンジクロロ白金（ＩＩ）、ｃｉｓ−ジアンミンジニトラト白金（ＩＩ）をそれぞれ重水に終濃度６．６ｍＭ、１３．７ｍＭとなるように溶解させてサンプルとした。リポソームＩＩに内包したｃｉｓ−ジアンミンジニトラト白金（ＩＩ）をｃｉｓ−ジアミンジクロロ白金（ＩＩ）に変換した場合および変換しなかった場合のリポソームサンプルを凍結乾燥し、次いで重水に懸濁させて、いずれも白金濃度が４．７５ｍＭとなるように調製した。
図８ａおよびｂに示すように、ｃｉｓ−ジアミンジクロロ白金（ＩＩ）を重水に溶解させた時のケミカルシフト値は、−２１６０ｐｐｍであり、また、ｃｉｓ−ジアンミンジニトラト白金（ＩＩ）を重水に溶解させたときのケミカルシフト値は、−１６２０ｐｐｍであった。このケミカルシフト値は文献値と一致していた（Ｂ．Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ．，６０ ８５９（１９７８））。図８ｃに示すように、ｃｉｓ−ジアンミンジニトラト白金（ＩＩ）を内包させたリポソームＩＩの外液を１５０ｍＭ塩化ナトリウム含有ＴＡＰＳ（ｐＨ８．４）緩衝液とし、２５℃で９６時間放置後のケミカルシフト値は−２１６０ｐｐｍであり、図８ａに示されるｃｉｓ−ジアミンジクロロ白金（ＩＩ）のケミカルシフト値と一致した。このことから、リポソームＩＩに内包されたｃｉｓ−ジアンミンジニトラト白金（ＩＩ）がｃｉｓ−ジアミンジクロロ白金（ＩＩ）に変換していることが確認された。また、ｃｉｓ−ジアンミンジニトラト白金（ＩＩ）をｃｉｓ−ジアミンジクロロ白金（ＩＩ）に変化させない場合は、ｃｉｓ−ジアンミンジニトラト白金（ＩＩ）のケミカルシフト値である−１６２０ｐｐｍのピークも、ｃｉｓ−ジアミンジクロロ白金（ＩＩ）のケミカルシフト値である−２１６０ｐｐｍも認められなかった（図８ｄ）。
リポソームＩについても、図５ａ〜ｄおよび実施例３に示す通り、同様の結果が得られ、リポソームに内包されたｃｉｓ−ジアンミンジニトラト白金（ＩＩ）がｃｉｓ−ジアミンジクロロ白金（ＩＩ）に変換していることが確認された。
リポソームＩ（改良コール酸塩法）においてもリポソームＩＩ（凍結乾燥法）においても、１９５Ｐｔ−ＮＭＲ法による解析では、ｃｉｓ−ジアンミンジニトラト白金（ＩＩ）の−１６２０ｐｐｍのケミカルシフトは認められず、ｃｉｓ−ジアミンジクロロ白金（ＩＩ）のケミカルシフト位置である−２１６０ｐｐｍに確認された（図５ｃおよび図８ｃ）。このことから、いずれのリポソームでも、リポソーム内のｃｉｓ−ジアンミンジニトラト白金（ＩＩ）は、ｃｉｓ−ジアミンジクロロ白金（ＩＩ）に構造が変化していることが確認された。
また、リポソームに内包させたｃｉｓ−ジアンミンジニトラト白金（ＩＩ）をｃｉｓ−ジアミンジクロロ白金（ＩＩ）に変換させなかった場合、図５ｄおよび図８ｄに示すように、ｃｉｓ−ジアンミンジニトラト白金（ＩＩ）の−１６２０ｐｐｍのケミカルシフトもｃｉｓ−ジアミンジクロロ白金（ＩＩ）のケミカルシフトも認められなかった。これは、内包されたｃｉｓ−ジアンミンジニトラト白金（ＩＩ）が、図３に示すように水分子の配位により、リポソームの膜成分と緩やかな相互作用をすることによって非常に多数の分子種となったために、ケミカルシフトとしては検出されなかったものと考えられる。
以上のように、本発明の好ましい実施形態を用いて本発明を例示してきたが、本発明は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願および文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。
本発明は、リポソームに内包できないか、内包効率の低かった難水溶性アンミン白金錯体をリポソームに効率よく内包できるという有用性を有する。従って、経口投与できなかった難水溶性アンミン白金錯体をリポソーム製剤として利用するという有用性を提供する。
図１Ａは、シスプラチンの細胞内での挙動を示す模式図である。シスプラチンは血漿中では、Ｃｉ−イオン濃度が１０３ｍｍｏｌｅであるため、シスプラチンの状態で存在するが、細胞内においては、Ｃｌ−イオン濃度は、４ｍｍｏｌｅとなるため、シスプラチンのＣｌ−イオンは解離して、水分子が配位した構造との平衡状態をとる。 図１Ｂは、シスプラチンがＤＮＡと結合する様式を示す模式図である。左上は、グアニン塩基と単結合した状態である。右上は、シスプラチンがＤＮＡの二本鎖間で結合した状態である。左下は、シスプラチンがＤＮＡと単結合し、タンパク質とも単結合した状態である。右下は、グアニン塩基と単結合し、一方でタンパク質と結合した状態である。 図１Ｃは、ｃｉｓ−ジアミンジニトラト白金（ＩＩ）（ＣＤＤＰ−３）およびｃｉｓ−ジアミンジクロロ白金（ＩＩ）（ＣＤＤＰ）の構造を示す図である。 図１Ｄは、ガングリオ系ガングリオシドの生合成経路を示す図である。 図２Ａは、実施例１において調製されたｃｉｓ−ジアミンジクロロ白金（ＩＩ）内包リポソームの粒子径の測定結果の図である。 図２Ｂは、実施例３において調製された、糖鎖を結合させたｃｉｓ−ジアミンジクロロ白金（ＩＩ）内包リポソームの粒子径の測定結果の図である。 図３は、シスプラチン内包リポソームの作製を模式化した図である。 図４Ａは、シスジアミンジニトラト白金（ＩＩ）５ｍｇ／ｍｌを１５０ｍＭ 塩化ナトリウムを含むＴＡＰＳ緩衝液（ｐＨ８．４）に溶解し、２５℃で静置（０時間、５分後、１０分後、１５分後、３０分後および４５分後）したときのＵＶスペクトルを示す。１：０時間、２：５分後、３：１０分後、４：１５分後、５：３０分後、６：４５分後。 図４Ｂは、コントロールとして、ｃｉｓ−ジアミンジクロロ白金（ＩＩ）１ｍｇをＴＡＰＳ緩衝液１ｍｌに溶解したときのＵＶスペクトルを示す。 図５は、シスプラチンの１９５ＰｔＮＭＲスペクトルを示す。シスプラチンは、−２１６０ｐｐｍ、にケミカルシフトが観測された。図５ｂは、硝酸体（ｃｉｓ−ジアンミンジニトラト白金（ＩＩ））の１９５ＰｔＮＭＲスペクトルを示す。この硝酸体（ｃｉｓ−ジアンミンジニトラト白金（ＩＩ））は、−１６２０ｐｐｍにケミカルシフトが観測された。図５ｃは、硝酸体（ｃｉｓ−ジアンミンジニトラト白金（ＩＩ））内包リポソーム（ＮａＣｌ＋）の１９５ＰｔＮＭＲスペクトルを示す。このリポソームに内包された硝酸体（ｃｉｓ−ジアンミンジニトラト白金（ＩＩ））のケミカルシフトは、外液中にＮａＣｌが含まれる場合、シスプラチンと同じ−２１６０ｐｐｍに観測された。図５ｄは、リポソームに内包させたｃｉｓ−ジアンミンジニトラト白金（ＩＩ）をｃｉｓ−ジアミンジクロロ白金（ＩＩ）に変化させないかった場合（４．７５ｍＭ，重水）の１９５Ｐｔ−ＮＭＲスペクトルを示す。 図６は、実施例５において調製された抗体を結合させたｃｉｓ−ジアミンジクロロ白金（ＩＩ）内包リポソームの粒子径の測定結果の図である。 図７は、ｃｉｓ−ジアミンジクロロ白金（ＩＩ）内包リポソームＩを透過型電子顕微鏡により観察した写真である。ｃｉｓ−ジアンミンジニトラト白金（ＩＩ）をリポソームＩに内包後、１５０ｍＭ塩化ナトリウムを含有するＴＡＰＳ緩衝液に交換した後のリポソームＩを、Ｈ−７１００Ｓ（ＨＩＴＡＣＨＩ）により観察した。バーは１００ｎｍを示す。 図８は、シスプラチンの１９５ＰｔＮＭＲスペクトルを示す。測定にはＩＮＯＶＡ−６００（Ｖａｒｉａｎ社）を使用した。図８ａは、ｃｉｓ−ジアミンジクロロ白金（ＩＩ）（６．６ｍＭ，重水）の１９５ＰｔＮＭＲスペクトルを示す。図８ｂは、ｃｉｓ−ジアンミンジニトラト白金（ＩＩ）（１３．７ｍＭ，重水）１９５ＰｔＮＭＲスペクトルを示す。図８ｃは、ｃｉｓ−ジアンミンジニトラト白金（ＩＩ）をリポソームに内包後、外液を１５０ｍＭ塩化ナトリウムを含有する緩衝液に交換し、ｃｉｓ−ジアンミンジニトラト白金（ＩＩ）をｃｉｓ−ジアミンジクロロ白金（ＩＩ）に変換させた場合（４．７５ｍＭ，重水）の１９５ＰｔＮＭＲスペクトルを示す。図８ｄは、リポソームに内包させたｃｉｓ−ジアンミンジニトラト白金（ＩＩ）をｃｉｓ−ジアミンジクロロ白金（ＩＩ）に変化させないかった場合（４．７５ｍＭ，重水）の１９５Ｐｔ−ＮＭＲスペクトルを示す。

Claims (20)

  1. アンミン白金錯体を内包するリポソームを製造する方法であって、該方法は、以下の工程：
    Ａ）ｃｉｓ−ジアンミンジニトラト白金（ＩＩ）を含む白金錯体溶液を調製する工程；
    Ｂ）リポソーム、リポソーム原料またはその組合せを提供する工程：および
    Ｃ）該ｃｉｓ−ジアンミンジニトラト白金（ＩＩ）と、該リポソーム、該リポソーム原料またはその組合せとを含む混合物を調製し、リポソーム形成維持条件に供する工程
    を包含し、ここで、該白金錯体溶液は、塩化物イオン（Ｃｌ−）、臭化物イオン（Ｂｒ−）、ヨウ化物イオン（Ｉ−）、チオシアン酸イオン（ＳＣＮ−）およびシアン化物イオン（ＣＮ−）を含まないか、または難水溶性塩を形成しない濃度で含む、方法。
  2. さらに、Ｄ）前記Ｃ）工程により得られた混合物を、塩化物イオン（Ｃｌ−）、臭化物イオン（Ｂｒ−）、ヨウ化物イオン（Ｉ−）、チオシアン酸イオン（ＳＣＮ−）およびシアン化物イオン（ＣＮ−）からなる群より選択されるイオンを含む溶液の存在下に供する工程を包含する、請求項１に記載の方法。
  3. Ａ）前記ｃｉｓ−ジアンミンジニトラト白金（ＩＩ）を、前記第一緩衝液に溶解し、前記白金錯体溶液を調製する工程；
    Ｂ）前記リポソーム原料を提供する工程であって、
    Ｂ−ｉ）リポソーム形成能を有する脂質を、メタノール・クロロホルム溶液に懸濁して攪拌し、該攪拌した溶液を蒸発させ、沈殿物を真空乾燥させることにより脂質膜を得る工程；および
    Ｂ−ｉｉ）該脂質膜を、第二緩衝液に懸濁し、脂質懸濁液を形成する工程、を包含する、工程；ならびに
    Ｃ）該白金錯体溶液と、該脂質懸濁液とを混合し、前記リポソーム形成維持条件に供する工程
    を包含し、ここで、該第一緩衝液および第二緩衝液は、塩化物イオン（Ｃｌ−）、臭化物イオン（Ｂｒ−）、ヨウ化物イオン（Ｉ−）、チオシアン酸イオン（ＳＣＮ−）およびシアン化物イオン（ＣＮ−）を含まないか、または難水溶性塩を形成しない濃度で含む、請求項１に記載の方法。
  4. 前Ｂ−ｉｉ）工程に引き続き、前記脂質懸濁液を超音波処理することを含む、請求項３に記載の方法。
  5. 前記Ｃ）工程において、前記リポソーム形成維持条件が、前記白金錯体溶液と前記脂質懸濁液との混合物を限外濾過に供することおよび該混合物を一晩静置することからなる群より選択されることを含む、請求項３に記載の方法。
  6. 前記Ｂ）工程において、前記リポソームは、前記水溶性アンミン白金錯体が、リポソーム膜を通過して該リポソーム内に移行し、留まるために充分な組成を有する、請求項１に記載の方法。
  7. 前記リポソーム形成維持条件が、前記リポソームを破壊することなく維持すると同時に、前記ｃｉｓ−ジアンミンジニトラト白金（ＩＩ）がリポソーム膜を通過して該リポソーム内に移行し、留まるために充分な条件である、請求項１に記載の方法。
  8. 前記リポソームを構成する脂質または前記リポソーム原料が、ジパルミトイルホスファチジルコリン、コレステロール、ガングリオシド、ジセチルホスフェート、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、コール酸ナトリウム、ジセチルフォスファチジルエタノールアミン−ポリグリセリン８Ｇ、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルグリセロールおよびそれらの組合せからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
  9. 前記Ｃ）工程において、前記混合物が、ｐＨ６〜１０の範囲内に調節される、請求項１に記載の方法。
  10. 前記イオンが、塩化物イオン（Ｃｌ−）である、請求項２に記載の方法。
  11. 前記塩化物イオン（Ｃｌ−）が、ＮａＣｌ、ＨＣｌまたはＣａＣｌ２より提供される、請求項１０に記載の方法。
  12. 前記ｃｉｓ−ジアンミンジニトラト白金（ＩＩ）が６ｍMで含まれ、前記塩化物イオン（
    Ｃｌ−）が、０〜４ｍＭの範囲で含まれる、請求項１に記載の方法。
  13. 前記工程Ｃ）において、前記混合物が、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）−３−アミノプロパンスルホン酸緩衝剤、炭酸緩衝剤、リン酸緩衝剤、２−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］エタンスルホン酸緩衝剤、トリス（ヒドロキシ）アミノメタン緩衝剤、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸緩衝剤、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）１−２−アミノエタンスルホン酸緩衝剤、Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２エタンスルホン酸緩衝剤、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−ヒドロキシ−３−アミノプロパンスルホン酸緩衝剤、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−ヒドロキシプロパンスルホン酸）緩衝剤、Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−ヒドロキシプロパン−３−プロパンスルホン酸緩衝剤、トリス（ヒドロキシメチルメチルグリシン）緩衝剤、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン緩衝剤、２−（シクロヘキシルアミノ）エタンスルホン酸緩衝剤、３−Ｎ−シクロヘキシルアミノ−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸緩衝剤、３−シクロヘキシルアミノプロパンスルホン酸緩衝剤およびそれらの組合せからなる群より選択される緩衝剤を含む、請求項１に記載の方法。
  14. 前記Ｃ）工程において、前記ｃｉｓ−ジアンミンジニトラト白金（ＩＩ）と、前記リポソーム、リポソーム原料またはその組合せとが、１：９〜９：１の範囲内の比で混合される
    、請求項１に記載の方法。
  15. 前記Ｄ）工程において、前記イオンが、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）−３−アミノプロパンスルホン酸緩衝液、炭酸緩衝液、リン酸緩衝液、２−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］エタンスルホン酸緩衝液、トリス（ヒドロキシ）アミノメタン緩衝液、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸緩衝液、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）１−２−アミノエタンスルホン酸緩衝液、Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２エタンスルホン酸緩衝液、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−ヒドロキシ−３−アミノプロパンスルホン酸緩衝液、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−ヒドロキシプロパンスルホン酸）緩衝液、Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−ヒドロキシプロパン−３−プロパンスルホン酸緩衝液、トリス（ヒドロキシメチルメチルグリシン）緩衝液、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン緩衝液、２−（シクロヘキシルアミノ）エタンスルホン酸緩衝液、３−Ｎ−シクロヘキシルアミノ−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸緩衝液および３−シクロヘキシルアミノプロパンスルホン酸緩衝液からなる群より選択される緩衝液により提供される、請求項２に記載の方法。
  16. 前記塩化物イオン（Ｃｌ−）が、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）−３−アミノプロパンスルホン酸緩衝液（ｐＨ８．４）、炭酸緩衝液（ｐＨ８．５）、リン酸緩衝液（ｐＨ８．０）および２−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］エタンスルホン酸緩衝液（ｐＨ７．２）からなる群より選択される緩衝液により提供される、請求項１０に記載の方法。
  17. 前記Ｄ）工程が、
    ｉ）形成されたリポソームを親水性化処理する工程；
    ｉｉ）該リポソームへ標的指向性物質を結合させる工程；
    ｉｉｉ）該修飾標的指向性物質が結合したリポソームを親水性化する工程ならびに
    ｉｖ）該親水性化したリポソームを含む溶液をフィルター濾過をする工程
    を包含する、請求項２に記載の方法。
  18. 前記標的指向性物質が、抗体、糖鎖、レクチン、相補的核酸、レセプター、リガンド、アプタマーおよび抗原からなる群より選択される、請求項１７に記載の方法。
  19. ｃｉｓ−ジアミンジクロロ白金（ＩＩ）を内包するリポソームを製造する方法であって、該方法は、以下の工程：
    （Ａ１）ｃｉｓ−ジアンミンジニトラト白金（ＩＩ）を、６ｍＭでＮ−トリス（ヒドロキシメチル）−３−アミノプロパンスルホン酸緩衝液に溶解し、ｃｉｓ−ジアンミンジニトラト白金（ＩＩ）を含む溶液を調製する工程であって、該Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）−３−アミノプロパンスルホン酸緩衝液は、塩化物イオン（Ｃｌ−）を含まないか、または塩化物イオン（Ｃｌ−）を０〜４ｍＭの範囲で含む、工程；
    （Ａ２）該ｃｉｓ−ジアンミンジニトラト白金（ＩＩ）を含む溶液のｐＨをｐＨ６〜１０に調節する工程；
    （Ｂ１）ジパルミトイルホスファチジルコリン、コレステロール、ガングリオシド、ジセチルホスフェート、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミンおよびコール酸ナトリウムを混合させて脂質を調製する工程；
    （Ｂ２）該脂質を、メタノール・クロロホルム溶液に懸濁して攪拌し、該攪拌した溶液を蒸発させ、沈殿物を真空乾燥させることにより脂質膜を得る工程；
    （Ｂ３）該脂質膜を、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）−３−アミノプロパンスルホン酸緩衝液（ｐＨ６〜１０）に懸濁させて脂質懸濁液を作製する工程であって、該Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）−３−アミノプロパンスルホン酸緩衝液は、塩化物イオン（Ｃｌ−）を含まないか、または塩化物イオン（Ｃｌ−）を０〜４ｍＭの範囲で含む、工程；
    （Ｂ４）該脂質懸濁液を３０℃〜４０℃で攪拌させ、窒素置換し、超音波処理する工程；および
    （Ｃ１）ｐＨが調節された該ｃｉｓ−ジアンミンジニトラト白金（ＩＩ）溶液と、超音波処理した脂質懸濁液とを、１：９〜９：１の範囲内の比で混合して、分画分子量５００〜３００，０００で限外濾過に供する工程
    を包含する、請求項１に記載の方法。
  20. ｃｉｓ−ジアミンジクロロ白金（ＩＩ）を内包するリポソームを製造する方法であって、該方法は、以下の工程：
    （Ａ１）ｃｉｓ−ジアンミンジニトラト白金（ＩＩ）を、６ｍＭでＮ−トリス（ヒドロキシメチル）−３−アミノプロパンスルホン酸緩衝液に溶解し、ｃｉｓ−ジアンミンジニトラト白金（ＩＩ）を含む溶液を調製する工程であって、該Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）−３−アミノプロパンスルホン酸緩衝液は、塩化物イオン（Ｃｌ−）を含まないか、または塩化物イオン（Ｃｌ−）を０〜４ｍＭの範囲で含む、工程；
    （Ａ２）該ｃｉｓ−ジアンミンジニトラト白金（ＩＩ）を含む溶液のｐＨをｐＨ８．４に調節する工程；
    （Ｂ１）リポソームを提供する工程；および
    （Ｃ１）ｐＨが調節された該ｃｉｓ−ジアンミンジニトラト白金（ＩＩ）溶液と、該リポソームとを、１：９〜９：１の範囲内の比で混合して、分画分子量５００〜３００，０００で限外濾過に供する工程
    を包含する、方法。
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