JP5354621B2 - マイクロビーズの配列方法及びその配列装置 - Google Patents

Description

本発明は、マイクロビーズの配列（捕捉・解放）方法及びその配列（捕捉・解放）装置に関するものである。

アルギン酸高分子は生体適合性が良く、食材や細胞のカプセル化など用途の多い材料である。これを利用して、ドラッグデリバリーや、再生医工学の材料に使う例は多い。
ところで、ヒドロゲル中にセルをカプセル化することはセルに保護を与えるものであり、バイオリアクターや組織工学と関連する（下記非特許文献１参照）。アルギン酸はその生体適合性、入手の容易さ、比較的低いコストから、最も良く用いられ、研究されるヒドロゲルである。アルギン酸中にセルをカプセル化し、アレイを形成することができれば、セルを保護膜中に包み込みながら、多くのセルを同時に視覚化し分析することができるようになるので、診断研究、薬理学的研究やセロミクスの研究に多く応用されるだろう。

微小な単一直径（単分散）カプセルの生成は、良く研究されるものの一つである（下記非特許文献２参照）。セルをマイクロビーズ中にカプセル化すれば、カプセルへ栄養を与え不要物を排出する交換が拡散によって短時間にできるようになり、カプセル化されたセルの生存可能性を向上させることができる（下記非特許文献３参照）。さらに、マイクロビーズを単分散化することによって、個々のマイクロビーズ中のカプセル化されたセルの数を、より正確に制御することができるようになる。

マイクロデバイス中でアルギン酸ナトリウムと塩化カルシウム液滴を用いて、セルをカプセル化するために微小な不均一直径（多分散）のアルギン酸マイクロビーズを形成することは、Ｓｕｇｉｕｒａら（下記非特許文献４参照）によって報告されている。

ＷＯ ０２／０６８１０４ Ａ１

Ｍ．Ｍ．Ｓｔｅｖｅｎｓ ｅｔ ａｌ．，"Ａ Ｒａｐｉｄ−Ｃｕｒｉｎｇ Ａｌｇｉｎａｔｅ Ｇｅｌ Ｓｙｓｔｅｍ：Ｕｔｉｌｉｔｙ ｉｎ Ｐｅｒｉｏｓｔｅｕｍ−ｄｅｒｉｖｅｄ Ｃａｒｔｉｌａｇｅ Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ"，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，２５，ｐｐ．８８７−８９４，２００４． Ｇ．Ｏｒｉｖｅ ｅｔ ａｌ．，"Ｃｅｌｌ Ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ：Ｐｒｏｍｉｓｅ ａｎｄ Ｐｒｏｇｒｅｓｓ" Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，９，ｐｐ．１０４−１０７，２００３． Ｗ．Ｍ．Ｋｕ（ｕはウムラウト付き）ｈｔｒｅｉｂｅｒ，Ｒ．Ｐ．Ｌａｎｚａ，ａｎｄ Ｗ．Ｌ．Ｃｈｉｃｋ，Ｃｅｌｌ ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｂｉｒｋｈａ（ａはウムラウト付き）ｕｓｅｒ Ｂｏｓｔｏｎ，１９９９． Ｓ．Ｓｕｇｉｕｒａ，Ｔ．Ｏｄａ，Ｙ．Ｉｚｕｍｉｄａ，Ｙ．Ａｏｙａｇｉ，Ｍ．Ｓａｔａｋｅ，Ａ．Ｏｃｈｉａｉ，Ｎ．Ｏｈｋｏｈｃｈｉ，Ｍ．Ｎａｋａｊｉｍａ，"Ｓｉｚｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ Ｃａｌｃｉｕｍ Ａｌｇｉｎａｔｅ Ｂｅａｄｓ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ Ｌｉｖｉｎｇ Ｃｅｌｌｓ ｕｓｉｎｇ Ｍｉｃｒｏ−Ｎｏｚｚｌｅ Ａｒｒａｙ"，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，２６，ｐｐ．３３２７−３３３１，２００５． Ｄ．Ｐｏｎｃｅｌｅｔ，"Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｌｇｉｎａｔｅ Ｂｅａｄｓ ｂｙ Ｅｍｕｌｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ／Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｇｅｌａｔｉｏｎ"，２００１，Ａｎｎａｌｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，９４４，ｐｐ．７４−８２． Ａ Ｔｉｘｉｅｒ−Ｍｉｔａ，Ｙ．Ｍｉｔａ，Ｋ．Ｃｏｚｉｃ，Ｆ．Ｍ．，Ｂ．ＬｅＰｉｏｕｆｌｅ，ａｎｄ Ｈ．Ｆｕｊｉｔａ，"Ｔｏ ｐｌａｃｅ ｃｅｌｌｓ ａｎ ａｒｒａｙ ｕｓｉｎｇ ａｓｐｉｒａｔｉｏｎ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，"Ｍｉｃｒｏ Ｔｏｔａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｎａｒａ，Ｊａｐａｎ，２００２． Ｂ．Ｌｅ．Ｐｉｏｕｆｌｅ，Ｐ．Ｓｕｒｂｌｅｄ，Ｈ．Ｎａｇａｉ，Ｙ．Ｍｕｒａｋａｍｉ，Ｈ．Ｓ．Ｃｈｕｎ，Ｅ．Ｔａｍｉｙａ，ａｎｄ Ｈ．Ｆｕｊｉｔａ，"Ｌｉｖｉｎｇ ｃｅｌｌｓ ｃａｐｔｕｒｅｄ ｏｎ ａ ｂｉｏｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍ ｄｅｖｏｔｅｄ ｔｏ ＤＮＡ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ，"Ｍａｔｅｒｉａｌｓ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｃ，ｖｏｌ．１２，ｐｐ．７７−８１，２０００． Ｂ．Ｍ．Ｔａｆｆ ａｎｄ Ｊ．Ｖｏｌｄｍａｎ，"Ａ Ｓｃａｌａｂｌｅ Ｒｏｗ／Ｃｏｌｕｍｎ− Ａｄｄｒｅｓｓａｂｌｅ Ｄｉｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃ Ｃｅｌｌ−Ｔｒａｐｐｉｎｇ Ａｒｒａｙ"，Ｍｉｃｒｏ Ｔｏｔａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＵＳＡ，ｐｐ．８６５−８６７，２００５． Ｆ．Ｍ．Ｗｈｉｔｅ， Ｆｌｕｉｄ Ｍｅｃｈａｎｉｃｓ，３ｒｄ ｅｄ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ：ＭｃＧｒａｗ Ｈｉｌｌ，１９９４ Ｓｔｅｆａｎ Ｆｉｅｄｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，"Ｄｉｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃ Ｓｏｒｔｉｎｇ ｏｆ Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ ａｎｄ Ｃｅｌｌｓ ｉｎ ａ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍ"，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．１９９８，７０，ｐｐ．１９０９−１９１５

しかしながら、マイクロビーズの均一性とサイズ分布を向上するために、以下の２つの問題を解決する必要がある。すなわち、（１）ゲル化のために微小アルギン酸ナトリウム液滴に外部から多価陽イオンが添加されるときの変形の問題と、（２）ゲル化前のアルギン酸ナトリウム液滴の不要な融合の問題、である。
そこで、本発明では、これまでに提案された内部ゲル化法（上記非特許文献５参照）とＴ字交差路液滴生成法（上記特許文献１参照）をも参照し研究を重ねながら、アルギン酸マイクロビーズ（ＭＡＢ）を生成するようにした。

さらに、セルアセイのためＭＡＢ中にセルをカプセル化することも試みる。吸引法（上記非特許文献６参照）のようなフルイディック法や、金表面へのケミカルパターニングのような生化学的手法（上記非特許文献７参照）や、誘電泳動トラップ（捕捉）（上記非特許文献８参照）に基づくセルアレイがこれまでに報告されている。しかしながら、これらのセルアレイの多くは、複雑な作成手順と制御を必要としている。

そこで、本発明者らは、「１トラップあたり１ビーズ」の固定化を達成するために、パッシブマイクロフルイディックトラップデバイス（マイクロチャンネルからなるマイクロビーズ捕捉装置）を提案する。単一直径アルギン酸マイクロビーズ（ＭＡＢ）を生成する技術だけでなく、穏やかで扱い易い、マイクロビーズベースのセルアセイシステムの開発に向けて研究を行っている。

本発明は、上記状況に鑑みて、マイクロビーズの配列方法及びその配列装置を提供することを目的とする。

本発明は、上記目的を達成するために、
〔１〕マイクロビーズの配列方法において、マイクロビーズが流されるとともに、狭窄領域を有する直線状チャンネルとこの直線状チャンネルと順次交差する方形波形状のチャンネルとを配置し、前記マイクロビーズが捕捉されていない空の狭窄領域がある場合は、この空の狭窄領域でマイクロビーズを捕捉し、前記マイクロビーズが捕捉されている狭窄領域がある場合は、マイクロビーズが捕捉された前記狭窄領域をバイパスして方形波形状のチャンネル沿いに前記マイクロビーズを下流に移動させることを特徴とする。

〔２〕マイクロビーズの配列方法において、上記〔１〕に記載のマイクロビーズの配列方法によって配列された前記マイクロビーズが位置する狭窄領域の終端部を加熱することにより、前記マイクロビーズを前記狭窄領域から解放することを特徴とする。
〔３〕マイクロビーズの配列方法において、上記〔１〕に記載のマイクロビーズの配列方法によって配列されたマイクロビーズが位置する狭窄領域の終端部に誘電泳動力を作用させ、前記マイクロビーズを前記狭窄領域から解放することを特徴とする。

〔４〕マイクロビーズの配列装置において、マイクロビーズが流されるとともに、狭窄領域を有する直線状チャンネルと、この直線状チャンネルと順次交差する方形波形状のチャンネルと、前記マイクロビーズが捕捉されていない空の狭窄領域がある場合は、この空の狭窄領域でマイクロビーズを捕捉し、前記マイクロビーズが捕捉されている狭窄領域がある場合は、マイクロビーズが捕捉された前記狭窄領域をバイパスして方形波形状のチャンネル沿いに前記マイクロビーズを下流に移動させるマイクロビーズ移動手段を具備することを特徴とする。

〔５〕上記〔４〕記載のマイクロビーズの配列装置において、前記マイクロビーズが位置する狭窄領域の終端部を加熱手段により加熱することで泡を生成させ、前記マイクロビーズを前記狭窄領域から解放することを特徴とする。
〔６〕上記〔５〕記載のマイクロビーズの配列装置において、前記加熱手段はターゲットへレーザー光を照射するレーザーであることを特徴とする。

〔７〕上記〔４〕記載のマイクロビーズの配列装置において、前記マイクロビーズが位置する狭窄領域の終端部に誘電泳動手段を設けて、前記マイクロビーズを前記狭窄領域から解放することを特徴とする。
〔８〕上記〔４〕〜〔７〕の何れか一項記載のマイクロビーズの配列装置において、前記狭窄領域を水平方向に複数個配置し、前記マイクロビーズをチップ上にアレイ化して配置することを特徴とする。

本発明によれば、マイクロビーズをチップ上にアレイ化させることも可能である。

本発明の参考例を示すＭＡＢ製造装置の模式図である。 本発明の参考例を示すＭＡＢの図面代用写真である。 本発明の参考例における完全ゲル化の前後におけるＭＡＢの直径分布を示す図である。 本発明の参考例を示すＭＡＢ中にカプセル化されたＨｅｐ Ｇ２セルを示す図である。 本発明の実施例を示すマイクロビーズ（μ液滴）の捕捉装置（マイクロアレイ）の模式図である。 本発明の実験例を示すマイクロビーズ（μ液滴）の捕捉アレイで捕捉されるＭＡＢの図面代用写真である。 本発明にかかる長方形のマイクロチャンネルの断面図である。 本発明にかかるマイクロ液滴トラップの詳細な説明図である。 本発明の実施例を示す体積流量比Ｑ₁ ／Ｑ₂ が３．６６で設計されたマイクロ液滴の捕捉装置中に捕捉されたビーズを示す図である。 本発明の実施例を示す捕捉されたビーズの解放（リリース）装置（その１）を示す図である。 本発明の実施例を示す捕捉されたビーズの解放装置（その２）の動作を示す図である。 本発明の実施例を示す捕捉されたビーズの解放装置（その２）とその動作を示す図である。

本発明のマイクロビーズの配列方法において、マイクロビーズが流されるとともに、狭窄領域を有する直線状チャンネルとこの直線状チャンネルと順次交差する方形波形状のチャンネルとを配置し、前記マイクロビーズが捕捉されていない空の狭窄領域がある場合は、この空の狭窄領域でマイクロビーズを捕捉し、前記マイクロビーズが捕捉されている狭窄領域がある場合は、マイクロビーズが捕捉された前記狭窄領域をバイパスして方形波形状のチャンネル沿いに前記マイクロビーズを下流に移動させる。

以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
図１は本発明の参考例を示すＭＡＢ製造装置の模式図である。
この図において、１は連続相である油２を流す第１のマイクロチャンネル（例えば幅は直径１５０μｍ、高さは５５μｍ）、３は分散相であるＣａＣＯ₃ 粉末を含むアルギン酸ナトリウム溶液４を流す第２のマイクロチャンネル（例えば幅は直径５０μｍ、高さは５５μｍ）、５はその第１のマイクロチャンネル１と第２のマイクロチャンネル３が交差するＴ字交差路、６はそのＴ字交差路５で形成されるＣａＣＯ₃ 粉末を含むアルギン酸ナトリウムからなる液滴、７はレシチン（ｌｅｃｉｔｈｉｎ：燐脂質の一種）及び酢酸を含む油８が流れる第３のマイクロチャンネル、９は第１のマイクロチャンネル１と第３のマイクロチャンネル７が合流する二路合流チャンバー、１０は二路合流チャンバー９にて形成されるマイクロビーズ（μ液滴）、１１はその二路合流チャンバー９に連通する混合及び反応チャンネル、１２はゲル化が進んだマイクロビーズ（μ液滴）である。

ここで、不溶性炭酸カルシウム粒子を含んだアルギン酸ナトリウム溶液４をＴ字交差路５で油２の流れに流すと、液滴６が生成される。次いで、レシチンと酢酸を含む油８が第３のマイクロチャンネル７から下流に加えられる。次いで、曲がりくねったチャンネルからなる混合及び反応チャンネル１１で、酸性油、つまりレシチンと酢酸を含む油８とメインストリームを流れる油２との混合が促進される。ＣａＣＯ₃ 粉末を含むアルギン酸ナトリウムからなる液滴６は、ペーハー（ｐＨ）値が減少し、Ｃａ²⁺（カルシウムイオン）が組み合わされるとゲル化が起こり、下流にアルギン酸カルシウムゲルが形成される。つまり、ｐＨ値の減少により、不溶性カルシウム錯体からＣａ²⁺が放出されて、ゲル化が起こる。続いて、ＭＡＢはマイクロチューブで捕捉され、さらにゲル化を進めるため遠心力により水性塩化カルシウム水溶液中に分離される。

この単一直径アルギン酸マイクロビーズの製造装置を用いると、セルをアルギン酸ナトリウム溶液に加えるだけで、セルをＭＡＢにカプセル化することができる。しかしながら、この場合、溶液は浸透圧に合わせて、水の代わりに生理食塩水を用いて調節される必要がある。
なお、上記参考例では、分散相として不溶性ＣａＣＯ₃ 粉末を含んだアルギン酸ナトリウム溶液について述べたが、ｐＨ７以上の水溶液に溶けない物質であればよい。例えばバリウム化合物粉末などであってもよい。

また、交差路は、Ｔ字交差路に限らず、フローフォーカシング（ｆｌｏｗ ｆｏｃｕｓｉｎｇ）によってもよい。
さらに、界面活性剤としては、レシチンに限られるものではなく、両親媒性分子であれば、他のものであってもよい。
図２は本発明の参考例を示すＭＡＢの図面代用写真であり、図２（ａ）は完全にゲル化される前の油を、図２（ｂ）は完全にゲル化された後の水中における状態を示す図、図３は本発明の参考例における完全にゲル化する前後におけるＭＡＢの直径分布を示す図である。

変動係数（Ｃ．Ｖ．）は直径の標準偏差と平均径の比として定義される。平均径と変動係数（Ｃ．Ｖ．）は、完全ゲル化前はそれぞれ１１６．９３μｍと１．９％であり、完全ゲル化後はそれぞれ８１．９１μｍと２．７％であった。生成されたＭＡＢの８．９％は球形ではなく、計測に含まれなかった。Ｔ字交差路を用いた液滴形成によって、単一直径のアルギン酸ナトリウム液滴を生成することが可能となった。界面活性剤（レシチン）を加えることによって、形成された液滴間の不要な癒着を防ぎ、マイクロビーズが徐々にゲル化していく間もマイクロビーズの単一直径を維持することができた。この手法で、ゲルは遠心分離による水相への分離前に硬化した。その結果、マイクロビーズ（ＭＡＢ）は球形であり、サイズ分布も小さかった。Ｃａ²⁺濃度とｐＨのような微調整パラメータによって、不良は低減または除去される。

形成されたマイクロビーズの直径はチャンネルの深さ（５５μｍ）よりも大きかった。これは、ゲル化が緩やかなプロセスであり、アルギン酸ナトリウム液滴が装置内では完全に硬化しないためである。これら液滴は装置を出て、完全にゲル化する前にマイクロチューブ中で球形をとる。
図３から明らかなように、その直径はゲル化中に２９．９％だけ減少している。

図４は本発明の参考例を示すＭＡＢ中にカプセル化されたＨｅｐ Ｇ２セル（ヒト肝癌由来細胞）を示す図である。
この図には、ＭＡＢ１６中でカプセル化に成功したＨｅｐ Ｇ２セル１５が示されている。このように、内部ゲル化法とＴ字交差路液滴生成法を組み合わせることで、単一直径ＭＡＢ１６を生成し、Ｈｅｐ Ｇ２セル１５をＭＡＢ１６中にカプセル化することに成功した。ＭＡＢ中でカプセル化されたセルの数は、アルギン酸ナトリウムにおけるセルの密度を調整することにより制御することができる。

図５は本発明の実施例を示すマイクロビーズ（μ液滴）捕捉装置（マイクロアレイ）の模式図である。
この図において、２１はマイクロビーズ（μ液滴）、２２は直線状チャンネル、２３は方形波形状のチャンネル、２４は直線状チャンネル２２に形成される狭窄領域、である。なお、図５において、太い矢印はメインストリームを、小さい矢印はサブストリームを示している。

そこで、マイクロビーズ（μ液滴）の捕捉装置は、直線状チャンネル２２と交差するように形成された方形波形状のチャンネル２３からなり、マイクロビーズ（μ液滴）２１の捕捉は、直線状チャンネル２２に沿った狭窄領域２４で行われる。マイクロビーズ（μ液滴）２１が捕捉されておらず狭窄領域２４が空の場合、直線状チャンネル２２から狭窄領域２４への流れに対する抵抗は、方形波形状のチャンネル２３沿いの流れに対する抵抗よりも低い、つまり、メインストリーム（太い矢印）は直線状チャンネル２２から狭窄領域２４に沿って流れ、マイクロビーズ（μ液滴）２１は直線状チャンネル２２から狭窄領域２４へ移動しやすくなる。したがって、流れの中のマイクロビーズ（μ液滴）２１は、メインストリーム（太い矢印）によって狭窄領域２４で捕捉される（トラップモード）。一旦、マイクロビーズ（μ液滴）２１が捕捉され、狭窄領域２４が埋まると、直線状チャンネル２２から狭窄領域２４への流れに対する抵抗は大幅に上昇し、メインストリームは方形波形状のチャンネル２３沿いへと方向が変更される。従って、次のマイクロビーズ（μ液滴）は、埋められた狭窄領域２４をバイパスして方形波形状のチャンネル２３沿いに運ばれる（バイパスモード）。直線状チャンネル２２と狭窄領域２４の幅はそれぞれ１５０μｍと３５μｍである。チャンネルの高さはそれぞれ８５μｍである。

このように、マイクロビーズ（μ液滴）２１は流される順番に直線状チャンネル２２に形成された狭窄領域２４を塞いでいくため、結果として、マイクロビーズ（μ液滴）２１をアレイ化して配置することができる。
次に、上記した装置の作製について説明する。
ラピッドプロトタイピングが可能であること、作製の容易さ、そして最も重要な、生体適合性を有するといった利点があるため、ＭＡＢ製造装置とマイクロアレイ装置の両方の作製には、エラストマーＰＤＭＳ（Ｄｏｗ Ｃｏｒｎｉｎｇ社製シリコーンエラストマー Ｓｙｌｇａｒｄ）を用いたソフトリソグラフィーが選択される。まず、シリコンウエハ上に通常のリソグラフィ技術を用いてＳＵ−８金型を形成する。次いでＰＤＭＳ膜をＳＵ−８のマスター金型から成形する。注入口及び排出口用のアクセスホールがＰＤＭＳ板に開けられる。ＰＤＭＳをペトリ皿で硬化させることで別のＰＤＭＳ板を生成する。最後に、２つのＰＤＭＳ板の表面を酸素プラズマで処理し、恒久的に接着する。

次にこの装置で用いられる材料について説明する。
この装置では、アルギン酸ナトリウム及びトウモロコシ油、大豆から抽出したレシチン（和光純薬工業株式会社製）を用いた。さらに、塩化カルシウム（ＣａＣｌ₂ ）、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、及びＴｗｅｅｎ２０（関東化学株式会社製）を用いた。また、酢酸（ナカライテスク株式会社製）を用いた。炭酸カルシウム（ＣａＣｏ₃ ）粉末はＹＨＮＡＮＯ ｃｏ．，Ｌｔｄ．から提供を受けた。全ての化学薬品及び試薬は入手したままの状態で、更なる精製は行わずに使用した。全ての実験に用いた超純水は１８ＭΩ・ｃｍの比抵抗を有するミリポアシステムから得た。

次に、ＭＡＢの生成手順について説明する。
全ての相の流速の制御にはシリンジポンプ（図示なし）を用いた。連続相はトウモロコシ油（メインストリーム）、及びレシチン（２ｗｔ％）と酢酸（０．６７μｌ／ｍｌ）を含んだトウモロコシ油を用いた。ＣａＣＯ₃ 粒子を含んだアルギン酸ナトリウム（２ｗｔ％）溶液を分散相として用いた。メインストリームのトウモロコシ油と、酢酸により酸性化されたトウモロコシ油、及びＣａＣＯ₃ 入りアルギン酸懸濁液の流速はそれぞれ０．２５ｍｌ／ｈ、０．２５ｍｌ／ｈ、及び０．０１８ｍｌ／ｈであった。

作製されたマイクロビーズはマイクロチューブ中で捕捉した。マイクロチューブは遠心分離にかけられ、上澄みは除去された。マイクロビーズはそっとピペット操作して、ＣａＣｌ₂ （２ｗｔ％）溶液（１ｗｔ％ Ｔｗｅｅｎ２０）で洗浄された。次いで、混合物は再度遠心分離された。この洗浄処理はあと２回繰り返された。ＭＡＢの写真はＶＨ−Ｚ４５０ 高倍率ズームレンズ（４５０Ｘ）とＫｅｙｅｎｃｅ ＶＨＸ−１００ デジタルマイクロスコープシステムで撮影された。直径はＫｅｙｅｎｃｅ イメージソフトウェアで計測された。

次に、セルをカプセル化するＭＡＢの生成について説明する。
ＭＡＢの手順と同様だが、セルの生存可能性を維持するために、全ての溶液は浸透圧に合わせて調節されなければならなかった。アルギン酸ナトリウム（２ｗｔ％）溶液は、水の代わりにＮａＣｌ（０．９ｗｔ％）溶液を用いて調製された。洗浄には、ＣａＣｌ₂ （１５５ｍＭ）溶液（１ｗｔ％ Ｔｗｅｅｎ２０）が用いられた。最終洗浄には培地を使用した。

次に、マイクロアレイへのマイクロビーズの捕捉について説明する。
上記手順で調製されたＭＡＢはシリンジポンプを用いてマイクロアレイに導入された。実験は逆さにしたＮｉｋｏｎ顕微鏡（Ｎｉｃｏｎ ｅｃｌｉｐｓｅ，ＴＥ３００）上に搭載したＣＣＤカメラ（Ｈａｍａｍａｔｓｕ Ｃ５４０５−０５）を用いて視覚化した。
図６は本発明の実験例を示すマイクロビーズ（μ液滴）の捕捉アレイで捕捉されるＭＡＢの図面代用写真である。

ここで、マイクロビーズ（μ液滴）捕捉アレイは直列に１００液滴の捕捉を行うことができる。
図６（ａ）はマイクロビーズ（μ液滴）捕捉アレイにマイクロビーズ（μ液滴）が捕捉された状態を、図６（ｂ）はバイパスモードのスーパーインポーズ画像を、図６（ｃ）は捕捉モードのスーパーインポーズ画像をそれぞれ示している。

この図から明らかなように、マイクロビーズ（μ液滴）は既に他のマイクロビーズ（μ液滴）がある狭窄領域には捕捉されなかった。この捕捉の効率はほぼ１００％なので、少数のマイクロビーズ（μ液滴）を捕捉しアレイ化するのに好適である。図６（ａ）の四角で囲まれた領域はそれぞれバイパスモードと捕捉モードを示している。この装置は、マイクロビーズ（μ液滴）を固定することができ、この捕捉を連続してつなげることでマイクロアレイが形成された。

このように、連続したマイクロフルイディックトラップを用いることで、マイクロビーズが固定され、アレイ化された。単一直径ＭＡＢを生成することができることで、セロミクス研究と治療目的の両方でアルギン酸の利用を促進することができる。ここで提案されたパッシブマイクロフルイディックトラップは、操作が簡単かつロバストであり、高効率である。セルをカプセル化した、トラップされたマイクロビーズを壊すことなく、上流に薬品／医薬品を簡単に導入することができ、セルアセイのために有用なツールとなる。さらに、セルをアルギン酸中にカプセル化することで、非接着細胞だけでなく、より難しい接着細胞も扱うことができるようになる。

本発明によれば、薬剤等を均一直径のマイクロビーズに導入することによって、内部に混入している薬剤の量を調整できる。また、インシュリンなどの有益な物質を放出したり、分解したりする細胞をカプセル化し、体内に導入すれば、体内に入れた場合の免疫反応を防ぎつつ活用させることができる。
以下、マイクロチャンネル中の圧力低下について説明する。

Ｄａｒｃｙ−Ｗｅｉｓｂａｃｈの式を用いてマイクロチャンネル中の圧力低下あるいは圧力差を割り出し、Ｈａｇｅｎ−Ｐｏｉｓｅｕｉｌｌｅ流れの問題のための連続方程式及び運動量方程式を解くことで、以下の式（１）が得られた。
Δｐ＝（ｆＬ／Ｄ）・（ρＶ² ／２） …（１）
ここで、Δｐは圧力差、ｆはＤａｒｃｙ摩擦係数、Ｌはチャンネル長、Ｄは流体直径、ρは流体密度、Ｖは流体の平均速度である。

マイクロチャンネルの流体直径Ｄは、
Ｄ＝４Ａ／Ｐ …（２）
ここで、Ａはマイクロチャンネルの断面積、Ｐはマイクロチャンネルの潤辺である。
図７に示される幅を有する長方形チャンネル（Ｗは幅、Ｈは高さ）の断面積及び潤辺は次のように示される。

Ａ＝ＷＨ …（３）
Ｐ＝２（Ｗ＋Ｈ） …（４）
Ｄａｒｃｙ摩擦係数ｆはＲｅｙｎｏｌｄｓ数Ｒｅ、及びアスペクト比αに関連する。アスペクト比αは、高さ／幅あるいは幅／高さのどちらかで定義され、０≦α≦１となる。Ｄａｒｃｙ摩擦係数ｆ及びＲｅｙｎｏｌｄｓ数Ｒｅの積は、アスペクト比に依存する定数であるか、また、
ｆ・Ｒｅ＝Ｃ（α） …（５）
であり、ここでＣ（α）はαの関数である定数Ｃであり、Ｒｅは
Ｒｅ＝ρＶＤ／μ …（６）
でも表され、μは流体粘性である。

次に、様々なアスペクト比の長方形チャンネルの層流摩擦係数について説明する。
表１はＷｈｉｔｅ（上記非特許文献９参照）によって与えられた解である。

式（５）及び（６）を式（１）に代入すると、下記式（７）が得られる。
Δｐ＝〔Ｃ（α）／２）〕・（μＬＶ／Ｄ² ） …（７）
流体の平均速度Ｖは
Ｖ＝Ｑ／Ａ …（８）
で表され、ここでＱは体積流量である。

式（２）と式（８）を式（７）に代入すると、下記式（９）が得られる。
Δｐ＝〔Ｃ（α）／３２）〕・（μＬＱＰ² ／Ａ³ ） …（９）
図８は本発明にかかるマイクロ液滴トラップの詳細な説明図である。
上記したが、マイクロ液滴の捕捉は直線状チャンネルに形成された方形波チャンネル（ループチャンネル）で行われる。マイクロ液滴のトラップは直線状チャンネルに沿った狭窄領域でなされ、トラップが空であると、直線状チャンネルに沿った流体抵抗はループチャンネルに沿った流体抵抗よりも低くなる。流れにおけるビーズはメインストリームによって運ばれ捕捉される（捕捉モード）。捕捉されると流体抵抗は直線状チャンネルに沿って急激に増加し、そして、そのメインストリームはループチャンネルに向きが変えられ、続いてビーズは埋められたトラップをバイパスすることによりループチャンネルに沿って運ばれる。

ここで、図８（ｂ）にその捕捉の簡略化された回路図を示す。図８（ｂ）における２つの交差路Ａ，Ｂは図８（ａ）の中でＸによってマークされた交差路に対応する。交差路Ａの流体は、流路１又は流路２を介して交差路Ｂへ流れる。曲がり、幅の拡張等による小さなロスを無視すると、流路１及び流路２の圧力差は式（９）で計算される。どちらの流路も圧力低下は同じなので、両方の式を等しいとして、以下の式（１０）が得られる。

Ｑ₁ ／Ｑ₂ ＝〔Ｃ₂ （α₂ ）／Ｃ₁ （α₁ ）〕・（Ｌ₂ ／Ｌ₁ ）・
（Ｐ₂ ／Ｐ₁ ）² ・（Ｐ₂ ／Ｐ₁ ）² ・（Ａ₁ ／Ａ₂ ）³ …（１０）
ここで、添字の１及び２はそれぞれ流路１及び流路２を示す。流路１については、分析を簡略化するために、長さＬ₁ の幅を狭くしたチャンネルの長さとすることに注意されたい。大半の圧力低下は幅を狭くしたチャンネル沿いに起こるので、これは有効である。

面積と周囲の関係は以下の通りであり、
Ａ₁ ＝Ｗ₁ Ｈ …（１１）
Ａ₂ ＝Ｗ₂ Ｈ …（１２）
Ｐ₁ ＝２（Ｗ₁ ＋Ｈ） …（１３）
Ｐ₂ ＝２（Ｗ₂ ＋Ｈ） …（１４）
高さＨが両方の流路において同じであることに留意されたい。

上記の関係を式（１０）に代入すると、以下の式（１５）が得られる。
Ｑ₁ ／Ｑ₂ ＝〔Ｃ₂ （α₂ ）／Ｃ₁ （α₁ ）〕・（Ｌ₂ ／Ｌ₁ ）・
〔（Ｗ₂ ＋Ｈ）／（Ｗ₁ ＋Ｈ）〕² ・（Ｗ₁ ／Ｗ₂ ）³ …（１５）
捕捉が動作するためには、流路１沿いの体積流量は流路２沿いの体積流量よりも大きくなくてはならない。すなわち、
Ｑ₁ ／Ｑ₂ ≧１
または
〔Ｃ₂ （α₂ ）／Ｃ₁ （α₁ ）〕・（Ｌ₂ ／Ｌ₁ ）・
〔（Ｗ₂ ＋Ｈ）／（Ｗ₁ ＋Ｈ）〕² ・（Ｗ₁ ／Ｗ₂ ）³ ≧１ …（１６）
である。

上記式が流速の項を含まないことに留意されたい。換言すれば、正しく設計された捕捉は層流中で全ての速度で行われる。
図９は本発明の実施例を示す体積流量比Ｑ₁ ／Ｑ₂ が３．６６で設計されたマイクロ液滴の捕捉装置中に捕捉されたビーズを示す図である。
このマイクロ液滴の装置３１においては、体積流量比Ｑ₁ ／Ｑ₂ は１よりも大きく、結果的に、メインストリームは直線状チャンネル３２沿いであり、ビーズ（１５μｍ）３４を直線状チャンネル３２の狭窄領域３３に捕捉し、アレイ状に配置することができた。

なお、体積流量比Ｑ₁ ／Ｑ₂ が０．７６で設計されたマイクロ液滴の捕捉装置中に捕捉しようと試みたが、体積流量比Ｑ₁ ／Ｑ₂ が１より小さく、結果的に、メインストリームはループチャンネル（方形波チャンネル）沿いであり、捕捉することはできなかった。
図１０は本発明の実施例を示す捕捉されたビーズの解放（リリース）装置（その１）を示す図であり、図１０（ａ）はそのビーズの捕捉した状態を示す図、図１０（ｂ）はその捕捉されたビーズを解放する状態を示す図である。

図１０（ａ）に示すように、直線状チャンネル４１の狭窄領域４２の終端部にアルミニウム４３がパターニングされており、その狭窄領域４２にビーズ４４が捕捉されている。そこで、図１０（ｂ）に示すように、その狭窄領域４２の終端部のアルミニウム４３にレーザー（例えば、出力１．５Ｗ）４５を照射する。すると、その狭窄領域４２の終端部に泡４６が生成されて、狭窄領域４２に捕捉されていたビーズ４４を狭窄領域４２から解放することができる。

なお、上記実施例では、パターニングされたアルミニウム４３にレーザー４５を照射するようにしたが、狭窄領域の終端部をターゲットとしてそのターゲットとなる基板をレーザーで照射することにより泡４６を発生させることができればよい。
このように、レーザーを用いた狭窄領域の終端部の加熱により泡を発生させることによって、一度捕捉したビーズを解放する。つまり、一旦捕捉したビーズの並べ換えを自在に行うことができる。

また、マイクロシステムにおいてビーズ及びセルを分類するために誘電泳動を用いるようにしたもの（上記非特許文献１０参照）が提案されている。
図１１は本発明の実施例を示す捕捉されたビーズの解放装置（その２）の動作を示す図、図１２はそのビーズの解放装置とその動作を示す図であり、図１２（ａ）はビーズ（セル）が捕捉された状態を、図１２（ｂ）は試薬の吹き込み状態を、図１２（ｃ）はビーズ（セル）が選択された状態を、図１２（ｄ）は電極への電位の印加状態を、図１２（ｅ）はビーズ（セル）が解放された状態を示す図である。

図１１に示すように、第１電極５１は直角三角形状をなし、斜辺５２，水平辺５３及び垂直辺５４を有している。一方、第２電極５５も直角三角形状をなし、斜辺５６，水平辺５７及び垂直辺５８を有している。これらの第１電極５１の斜辺５２と第２電極５５の垂直辺５８とは対向している。
そこで、図１１（ａ）に示すように、第１電極５１に＋電位が、第２電極５５に−電位が印加されると、第１電極５１の斜辺５２と水平辺５３が交わった下部先端部５９は尖っており、一方、第２電極５５の垂直辺５８は平坦となっているので、第１電極５１と第２電極５５との間には不平等電界が生成される。つまり、下部先端部５９には傾斜度の大きい電界が生成され、第２電極５５の垂直辺５８には傾斜度の小さい電界が生成される。このように第１電極５１と第２電極５５との間には不平等電界が生成されるので、図１１（ｂ）に示すように、下部先端部５９の近傍にビーズ（セル）６０が配置される場合には、矢印のように誘電泳動力６１Ａが働くことになり、ビーズ（セル）６０は傾斜度の大きい電界が生じている下部先端部５９から傾斜度の小さい電界が生じている第２電極５５の垂直辺５８へと吸引されることになる。

このような誘電泳動力を生じさせる手段を、上記したビーズ（セル）の捕捉装置において、捕捉状態から解放するために用いることができる。
以下、具体的に説明する。
まず、図１２（ａ）に示すように、マイクロビーズの捕捉アレイ装置でビーズ（セル）６５を捕捉する。その捕捉アレイ装置には、上記した第１電極と第２電極からなる電極６４が直線状チャンネル６１の狭窄領域６３に配置されている。

次に、図１２（ｂ）に示すように、試薬６６がビーズ（セル）６５の捕捉アレイ装置へ導入され、ビーズ（セル）６５の試薬６６に対する反応が観察される。
次に、図１２（ｃ）に示すように、解放したい所望のビーズ（セル）６５′がある場合は、そのビーズ（セル）６５′を解放するために電極６４′を選択して電極６４′へ任意の電圧を印加する。

次に、図１２（ｄ）に示すように、電極６４′への電圧の印加により、電極６４′間には不平等電界が生成されるので、ビーズ（セル）６５′は誘電泳動力により直線状チャンネル６１の狭窄領域６３から解放される。
次に、図１２（ｅ）に示すように、解放されたビーズ（セル）６５′はメインストリーム６７に乗り、方形波形状のチャンネル６２を流れていくことになる。

その解放されたビーズ（セル）６５′は、この捕捉アレイ装置から運ばれ、更なる分析のために収集される。誘電泳動力を生じさせるための電位は５−１５Ｖである。
なお、本発明は上記実施例に限定されるものではなく、本発明の趣旨に基づき種々の変形が可能であり、これらを本発明の範囲から排除するものではない。

本発明のマイクロビーズの捕捉方法及びその配列装置は、再生医工学、細胞研究、創薬などに有効利用できる。

１ 第１のマイクロチャンネル
２ 油（連続相）
３ 第２のマイクロチャンネル
４ ＣａＣＯ₃ 粉末を含むアルギン酸ナトリウム溶液（分散相）
５ Ｔ字交差路
６ ＣａＣＯ₃ 粉末を含むアルギン酸ナトリウムからなる液滴
７ 第３のマイクロチャンネル
８ レシチン及び酢酸を含む油
９ 二路合流チャンバー
１０ 二路合流チャンバーにて形成されるマイクロビーズ（μ液滴）
１１ 混合及び反応チャンネル
１２ ゲル化が進んだマイクロビーズ（μ液滴）
１５ Ｈｅｐ Ｇ２セル
１６，２１ マイクロビーズ（μ液滴）
２２，３２，４１，６１ 直線状チャンネル
２３，６２ 方形波形状のチャンネル
２４，３３，４２，６３ 直線状チャンネルに形成される狭窄領域
３１ マイクロ液滴の装置
３４ ビーズ（１５μｍ）
４３ アルミニウム
４４ ビーズ
４５ レーザー
４６ 泡
５１ 第１電極
５２，５６ 斜辺
５３，５７ 水平辺
５４，５８ 垂直辺
５５ 第２電極
５９ 下部先端部
６０，６５ ビーズ（セル）
６１Ａ 誘電泳動力
６４ 第１電極と第２電極からなる電極
６４′ 電圧を印加したい電極
６５′ 解放したい所望のビーズ（セル）
６６ 試薬
６７ メインストリーム

Claims (8)

1. マイクロビーズが流されるとともに、狭窄領域を有する直線状チャンネルと該直線状チャンネルと順次交差する方形波形状のチャンネルとを配置し、前記マイクロビーズが捕捉されていない空の狭窄領域がある場合は、該空の狭窄領域でマイクロビーズを捕捉し、前記マイクロビーズが捕捉されている狭窄領域がある場合は、マイクロビーズが捕捉された前記狭窄領域をバイパスして方形波形状のチャンネル沿いに前記マイクロビーズを下流に移動させることを特徴とするマイクロビーズの配列方法。
2. 請求項１に記載のマイクロビーズの配列方法によって配列された前記マイクロビーズが位置する狭窄領域の終端部を加熱することにより、前記マイクロビーズを前記狭窄領域から解放することを特徴とするマイクロビーズの配列方法。
3. 請求項１に記載のマイクロビーズの配列方法によって配列されたマイクロビーズが位置する狭窄領域の終端部に誘電泳動力を作用させ、前記マイクロビーズを前記狭窄領域から解放することを特徴とするマイクロビーズの配列方法。
4. （ａ）マイクロビーズが流されるとともに、狭窄領域を有する直線状チャンネルと、
   （ｂ）該直線状チャンネルと順次交差する方形波形状のチャンネルと、
   （ｃ）前記マイクロビーズが捕捉されていない空の狭窄領域がある場合は、該空の狭窄領域でマイクロビーズを捕捉し、前記マイクロビーズが捕捉されている狭窄領域がある場合は、マイクロビーズが捕捉された前記狭窄領域をバイパスして方形波形状のチャンネル沿いに前記マイクロビーズを下流に移動させるマイクロビーズ移動手段を具備することを特徴とするマイクロビーズの配列装置。
5. 請求項４記載のマイクロビーズの配列装置において、前記マイクロビーズが位置する狭窄領域の終端部を加熱手段により加熱することで泡を生成させ、前記マイクロビーズを前記狭窄領域から解放することを特徴とするマイクロビーズの配列装置。
6. 請求項５記載のマイクロビーズの配列装置において、前記加熱手段はターゲットへレーザー光を照射するレーザーであることを特徴とするマイクロビーズの配列装置。
7. 請求項４記載のマイクロビーズの配列装置において、前記マイクロビーズが位置する狭窄領域の終端部に誘電泳動手段を設けて、前記マイクロビーズを前記狭窄領域から解放することを特徴とするマイクロビーズの配列装置。
8. 請求項４〜７の何れか一項記載のマイクロビーズの配列装置において、前記狭窄領域を水平方向に複数個配置し、前記マイクロビーズをチップ上にアレイ化して配置することを特徴とするマイクロビーズの配列装置。