JP5351701B2 - 分子組成測定方法及び装置 - Google Patents

Description

本発明は、分子組成測定方法及び装置、更に詳細には少なくとも２種類のタンパク質分子を含む液にレーザー光束を照射し、該タンパク質分子からの散乱光を受光して、その散乱光信号からタンパク質分子の組成を測定する分子組成測定方法及び装置に関する。

眼球の角膜と水晶体の間にある前房には、前房水が流れている。正常眼では前房柵の働きにより、前房水中のアルブミン等のタンパク質は非常に低濃度であり、また、血球は存在しない。

しかし、白内障やぶどう膜炎による眼内レンズの挿入手術後などにおいて、血液房水柵の機能が低下したりすると、前房水中に白血球や赤血球が流出したり、アルブミン分子が異常に増加したり、あるいはグロブリン等、アルブミンよりも大きいタンパク質分子が流出したりすることが知られている。

そして、この血球の数密度やタンパク質分子の濃度を定量的に測定することは、手術後の経過の診断を行なう上において重要である。

このタンパク質分子の濃度を定量的に測定する方法として、眼球の前房水中に浮遊するタンパク質分子にレーザー光を照射し、前記タンパク質分子から散乱される散乱光強度を測定することによって、前房水中タンパク濃度を求める方法が、たとえば、下記特許文献１に提案されている。

この特許文献１に記載された従来技術は、単波長レーザーを用いたレーザーフレアーセル測定技術と呼ばれる計測技術で人眼前房内の前房水に含まれるタンパク質や種々の生体分子の組成に関する情報を、非接触・非侵襲で得ている。

特開平４−３５２９３３号公報

前房水に含まれるタンパク質を測定するのは前眼部の炎症の度合いを測定するためであるが、従来の方法では、前房水中のタンパク質が健常状態でも存在するアルブミンなのか、あるいは疾病状態になると滲出するグロブリンなのか、あるいはアルブミン／グロブリン比（以下「Ａ／Ｇ比」という）の測定まではできず、いうなれば炎症程度ぐらいしか定量的に測定できなかった。疾病状態や、血液房水柵の機能不全状態ではグロブリン分子の流出が増加するため、Ａ／Ｇ比が小さくなるからである。

しかしＡ／Ｇ比が測定できるようになれば、炎症の「質」を定量化測定することができ、炎症具合から適切な治療方法を選択することが可能となる。また散乱光のゆらぎ成分を解析することで生体サイズを検出することが可能となり、それまでアルブミンなのかプレアルブミンなのかが判明しなかった成分について識別が可能となる。

本発明は、このような点に鑑みてなされたもので、試料あるいは人眼前房水内のタンパク質分子の組成あるいは濃度を信頼性よく非接触・非侵襲で測定することが可能な分子組成測定方法及び装置を提供することを課題とする。

本発明は、
少なくとも２種類のタンパク質分子を含む液にレーザー光束を照射し、該タンパク質分子からの散乱光を受光して、その散乱光信号からタンパク質分子の組成を測定する分子組成測定方法であって、
前記タンパク質分子に所定波長のレーザー光束を照射し、
前記タンパク質分子に前記波長と異なるレーザー光束を照射し、
前記それぞれ異なる波長のレーザー光束で照射されたタンパク質分子の散乱光信号の自己相関関数に基づきタンパク質分子の組成を測定することを特徴とする。

また、本発明は、
少なくとも２種類のタンパク質分子を含む液にレーザー光束を照射し、該タンパク質分子からの散乱光を受光して、その散乱光信号からタンパク質分子の組成を測定する分子組成測定装置であって、
波長の異なるレーザー光束を発光するレーザー光源と、
前記レーザー光源からの所定波長のレーザー光束で照射されたタンパク質分子からの散乱光信号の自己相関関数と、前記レーザー光束の波長と異なるレーザー光束で照射されたタンパク質分子からの散乱光信号の自己相関関数とを求める相関器と、
前記それぞれ異なる波長のレーザー光束で求められた自己相関関数に基づきタンパク質分子の組成を演算する演算器と、
を備えたことを特徴とする。

本発明では、異なる波長のレーザー光束でタンパク質分子を照射し、各タンパク質分子の散乱光信号の自己相関関数からタンパク質分子の組成を測定しているので、タンパク質の同定精度が向上する。また人眼前房内のタンパク質分子であるアルブミンとグロブリンの比を非接触・非侵襲で測定することができ、眼科診断に大きく寄与することができる。

試料内のタンパク質分子の自己相関関数を求める構成を示した構成図である。 試料セルの正面図である。 図１の構成で求められる自己相関関数を示したグラフ図である。 アルブミン、グロブリン、及びその混合系の自己相関関数を示したグラフ図である。 試料セル内のタンパク質分子の組成を測定する装置の構成を示した構成図である。 人眼前房水内のタンパク質分子の組成を測定する装置の構成を示した構成図である。 アルブミン、グロブリンの吸光度の波長依存性を示すグラフ図である。

以下、図面に示す実施例に基づいて本発明を詳細に説明する。

図１には、本発明の実施例に係る分子組成測定装置の全体構成が図示されている。図１において、符号１で示すものは、光源、例えば半導体レーザー光源であり、この半導体レーザー光源１から出射されたレーザー光束は、レンズ２により円柱状のガラス製試料セル（キュベットとも呼ばれる）３内に集光される。光源は半導体レーザーに限らず、Ｈｅ−Ｎｅレーザー、半導体レーザー励起の固体レーザーや近赤外光レーザーなどのレーザー光源を用いてもよい。なお近赤外レーザーを用いる場合には可視光のレーザーを同一光路に重畳するエイミングビームとして用いると良い。

試料セル３は、図２に図示されており、試料セル３には、タンパク質分子４ａなどの粒子を含んだ試料４並びにマグネチックスターラーバー（磁性攪拌子）５が収納され、キャップ６により封入される。マグネチックスターラーバー５は外部に配置されたモーター（不図示）により継続的に攪拌され、試料４は均一な溶液になっている。

半導体レーザー光源１からのレーザー光束は、図１に示したように試料セル３の内壁面近傍を通過するように配置され、その壁面に垂直に、レンズ７と、光電子増倍管あるいはＡＰＤ（アバランシェ・フォトダイオード）フォトン・カウンティング・モジュールによって構成される検出器８からなる受光装置が配置される。

レーザー光束で照射された試料４内のタンパク質分子４ａからの側方散乱光は、レンズ７を介して検出器８に入射され、散乱光信号８ａが時系列的な信号として出力される。散乱光信号８ａは、自己相関解析を行う相関器９に送出され、散乱光の自己相関関数が演算される。

相関器９から得られる典型的な自己相関関数が図３に図示されている。遅延時間τが０のときの自己相関係数の値を１としたとき、自己相関係数が１／ｅに落ちるときの遅延時間の値τ_１／ｅを緩和係数といい、散乱物質によって決定される定数となる。一般に、小さい分子は速く動くため、緩和係数は小さくなる（自己相関関数はグラフの左に寄る）。逆に、大きな分子の動きは遅いので、緩和係数は大きくなる（グラフは右寄りになる）。

図４は、試料４にアルブミン、あるいはグロブリン、あるいはアルブミンとグロブリンが所定の比率で含まれている場合の相関器９から得られる自己相関関数を示している。アルブミンの分子径は小さく、約８ｎｍ、グロブリンはそれより大きく、約１０〜１００ｎｍと広い範囲に分布することが知られており、図４に示すような測定結果となる。しかし、アルブミンとグロブリンが所定の割合で混合されている混合系を測定した場合には、その重ね合わせになり、図４で一番上に示した自己相関関数が測定される。

半導体レーザー光源１の波長がλ_１のとき、この混合系の自己相関係数Ｇ_１（τ）の平方根は、下記数１のように表される。

ここで、Ａはコヒーレンス度、Ｔは測定時間、Ｎは検出器８で検出されるフォトン数、Ｓ_１はアルブミンの散乱効率、Ｃ_１はアルブミン濃度、Γ_１はアルブミンの緩和係数、Ｓ_２はグロブリンの散乱効率、Ｃ_２はグロブリン濃度、Γ_２はグロブリンの緩和係数である。

この混合系の自己相関関数から、アルブミンとグロブリンの濃度、あるいはその比を求めるために、散乱効率、緩和係数が波長依存性を持つことを利用する。例えば、光源の波長が大きくなると、自己相関係数の緩和係数は小さくなる。また、散乱効率も図７に示したような波長依存性を示す。なお、図７において、縦軸は吸光度（Ａ．Ｕ．任意単位）で、散乱効率と吸光度の合計値が１となっている。図７で一点鎖線、点線、実線はそれぞれ基準液、アルブミン、グロブリンの吸光度を示している。

そこで、図５に示したように、光源に波長可変レーザー光源１０を用いて、混合系の自己相関関数を測定する。ここでの光源は他に波長掃引レーザーや、白色光に帯域可変フィルターや回折格子を介したものであってもよい。なお、図５において、光源に波長可変レーザー光源１０が用いられること、相関器９の後に、アルブミンとグロブリンの濃度などを演算する演算器１１が接続されることを除いて、図１の構成と同じなので、同一部分の説明は省略する。

波長可変レーザー光源１０から発光するレーザー光束の波長をλ_１（例えばλ_１＝７００ｎｍ）とすると、相関器９で自己相関係数Ｇ_１（τ）が求められるので、数１で示す自己相関係数Ｇ_１（τ）の平方根を演算器１１で演算し、その値を演算器１１内のメモリ（不図示）に格納しておく。

続いて、波長可変レーザー光源１０から発光するレーザー光束の波長をλ_１からからλ_２（例えばλ_２＝９６０ｎｍ）に変化させると、コヒーレンス度Ａ、フォトン数Ｎ、アルブミンとグロブリンの散乱効率Ｓ_１、Ｓ_２、アルブミンとグロブリンの緩和係数Γ_１、Γ_２がそれぞれＡ’、Ｎ’、Ｓ_１’、Ｓ_２’、Γ_１’、Γ_２’に変化し、相関器９で求められる自己相関係数Ｇ_２（τ）の平方根が下記数２に従って演算器１１で演算される。そして、この演算された値が演算器１１のメモリに格納される。

数１と数２を簡略化すると、それそれ数３、数４のようになるので、それぞれの値を同様にメモリに格納する。

ここで、αは波長がλ_１のときの上記Ａ、Ｔ、Ｎ、Ｓ_１、Γ_１、τで決まる定数、βは波長がλ_１のときの上記Ａ、Ｔ、Ｎ、Ｓ_２、Γ_２、τで決まる定数、α’は波長がλ_２のときの上記Ａ’、Ｔ、Ｎ’、Ｓ_１’、Γ_１’、τで決まる定数、β’は波長がλ_２のときの上記Ａ、Ｔ、Ｎ’、Ｓ_２’、Γ_２’、τで決まる定数である。

続いて、演算器１１のメモリに格納されている数３、数４の式から下記数５に示したように、アルブミンとグロブリンの濃度Ｃ_１、Ｃ_２を求める。

このようにして、試料内のタンパク質分子に照射されるレーザー光束の波長を変化させることにより試料内に浮遊するアルブミンとグロブリンの各濃度を求めることができる。また、各濃度Ｃ_１、Ｃ_２からＣ_１／Ｃ_２、つまりＡ／Ｇ比を求めることができる。

上述した実施例１では、試料セル３内の試料４に含まれるアルブミンとグロブリンのタンパク質分子４ａの組成（濃度）あるいはその比を求めたが、図６に示す実施例では、人眼（被検眼）２０の前房２１内の前房水に浮遊するアルブミンとグロブリンのタンパク質分子４ａの組成（濃度）あるいはその比が求められる。

図５の実施例と比較して、試料セル３を人眼２０の前房２１に置き換えたところが相違するだけである。波長可変体レーザー光源１０からのレーザー光束は、その波長がλ_１に設定され、前房２１近傍を通過する。波長λ_１のレーザー光束で照射された前房２１内の前房水に浮遊するタンパク質分子４ａからの側方散乱光は、レンズ７を介して検出器８に入射され、散乱光信号８ａが時系列的な信号として出力される。散乱光信号８ａは、自己相関解析を行う相関器９に送出され、数１に示した自己相関係数の平方根が演算器１１により演算され、メモリに格納される。

続いて、波長可変レーザー光源１０から発光するレーザー光束の波長がλ_２に変化され、そのとき相関器９で求められる自己相関係数Ｇ_２（τ）の平方根が数２に従って演算され、その値が演算器１１のメモリに格納される。続いて、数３〜数５に従って、前房２１内のアルブミンとグロブリンの濃度Ｃ_１、Ｃ_２、あるいはその比が演算される。

なお、レーザー光束の波長を変化させるために、図５、図６の実施例では、波長可変レーザー光源１０を用いているが、波長の異なる２つのレーザー光源を設け、これらのレーザー光源を切り換えることにより、レーザー光束の波長を変化させるようにしてもよい。

また、上記実施例１、２では、演算器１１を相関器９と別に設けているが、演算器１１で行われる演算を相関器９により演算するようにしてもよい。

また、上述した実施例１、２では、アルブミンとグロブリンのタンパク質分子の組成（濃度）あるいはその比を求めたが、少なくとも自己相関関数を求めるときの散乱効率及び／又は緩和係数に波長依存性のある他のタンパク質分子、あるいは他の生体分子、微粒子であってもよい。

１ 半導体レーザー光源
３ 試料セル
４ 試料
４ａ タンパク質分子
８ 検出器
９ 相関器
１０ 波長可変レーザー光源
１１ 演算器
２０ 人眼
２１ 前房

Claims (10)

1. 少なくとも２種類のタンパク質分子を含む液にレーザー光束を照射し、該タンパク質分子からの散乱光を受光して、その散乱光信号からタンパク質分子の組成を測定する分子組成測定方法であって、
   前記タンパク質分子に所定波長のレーザー光束を照射し、
   前記タンパク質分子に前記波長と異なるレーザー光束を照射し、
   前記それぞれ異なる波長のレーザー光束で照射されたタンパク質分子の散乱光信号の自己相関関数に基づきタンパク質分子の組成を測定することを特徴とする分子組成測定方法。
2. 前記タンパク質分子が人眼前房内の前房水に浮遊するタンパク質分子であることを特徴とする請求項１に記載の分子組成測定方法。
3. 前記タンパク質分子が試料セル内の溶液に浮遊するタンパク質分子であることを特徴とする請求項１に記載の分子組成測定方法。
4. ２種類のタンパク質分子の濃度、あるいはその比が測定されることを特徴とする請求項１から３のいずれか１項に記載の分子組成測定方法。
5. 前記タンパク質分子がアルブミンとグロブリンであることを特徴とする請求項１から４のいずれか１項に記載の分子組成測定方法。
6. 少なくとも２種類のタンパク質分子を含む液にレーザー光束を照射し、該タンパク質分子からの散乱光を受光して、その散乱光信号からタンパク質分子の組成を測定する分子組成測定装置であって、
   波長の異なるレーザー光束を発光するレーザー光源と、
   前記レーザー光源からの所定波長のレーザー光束で照射されたタンパク質分子からの散乱光信号の自己相関関数と、前記レーザー光束の波長と異なるレーザー光束で照射されたタンパク質分子からの散乱光信号の自己相関関数とを求める相関器と、
   前記それぞれ異なる波長のレーザー光束で求められた自己相関関数に基づきタンパク質分子の組成を演算する演算器と、
   を備えたことを特徴とする分子組成測定装置。
7. 前記タンパク質分子が人眼前房内の前房水に浮遊するタンパク質分子であることを特徴とする請求項６に記載の分子組成測定装置。
8. 前記タンパク質分子が試料セル内の溶液に浮遊するタンパク質分子であることを特徴とする請求項６に記載の分子組成測定装置。
9. ２種類のタンパク質分子の濃度、あるいはその比が測定されることを特徴とする請求項６から８のいずれか１項に記載の分子組成測定装置。
10. 前記タンパク質分子がアルブミンとグロブリンであることを特徴とする請求項６から９のいずれか１項に記載の分子組成測定装置。

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