JP5228169B2 - Tuber formation control vector for controlling tuber formation of plant, plant production method and plant with controlled tuber formation - Google Patents
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- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
Description
本発明は、植物の塊茎形成を制御するための塊茎形成制御ベクター、塊茎形成が制御された植物の製造方法、および、塊茎形成が制御された植物に関する。 The present invention relates to a tuber formation control vector for controlling tuber formation of a plant, a method for producing a plant in which tuber formation is controlled, and a plant in which tuber formation is controlled.
ジャガイモは、バレイショ（Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ ｃｖ．ＭａｙＱｕｅｅｎ）の肥大した塊茎であり、例えば、食物資源として広く栽培されている。このように植物の塊茎を食物等の資源として利用する場合には、様々な要因に影響を受けることなく、植物が、塊茎を効率良く形成することが望まれる。他方、植物の塊茎以外の部位が資源として利用されることもある。このような場合、塊茎形成に植物の栄養源が使用されるのを防ぐため、反対に、塊茎を形成し難いことが望まれる。このため、植物の塊茎形成を目的に応じて制御できれば、効率良く目的とする植物資源を作出することが可能になると考えられる。 Potato is an enlarged tuber of potato (Solanum tuberosum cv. MayQueen), and is widely cultivated as a food resource, for example. Thus, when utilizing the tuber of a plant as resources, such as food, it is desired for a plant to form a tuber efficiently, without being influenced by various factors. On the other hand, parts other than plant tubers may be used as resources. In such a case, in order to prevent the use of plant nutrients for tuber formation, it is desirable that, on the contrary, it is difficult to form tubers. For this reason, if the tuber formation of a plant can be controlled according to the objective, it will be possible to produce the target plant resource efficiently.
自然界において、植物の塊茎形成は、日長に左右されており、例えば、バレイショの場合、短日条件では、塊茎形成が促進され、反対に、長日条件では、塊茎形成が阻害されることが報告されている（非特許文献１）。したがって、日長条件の調節や、栽培地域の選択により、塊茎形成の促進または塊茎形成の抑制を図ることは可能と考えられる。しかしながら、植物の栽培において、実際に、日長条件を制御したり、栽培地域を選択することは、手間がかかり、また、栽培地域も限定されることから、結果的に、効率の低下を招き、実用的ではない。 In nature, the tuber formation of plants depends on the day length. For example, in the case of potato, tuber formation is promoted under short day conditions, and on the contrary, tuber formation is inhibited under long day conditions. It has been reported (Non-Patent Document 1). Therefore, it is considered possible to promote tuber formation or suppress tuber formation by adjusting the day length condition or selecting the cultivation area. However, in the cultivation of plants, actually controlling the day length condition and selecting the cultivation area is troublesome and the cultivation area is limited, resulting in a decrease in efficiency. Not practical.
そこで、塊茎形成が促進された植物または塊茎形成が抑制された植物を生産する方法の確立が望まれている。
そこで、本発明は、植物への導入により、植物の塊茎形成を制御（促進または抑制）できる新たな塊茎形成制御ベクター、塊茎形成が制御された植物の製造方法ならびに塊茎形成が制御された植物の提供を目的とする。 Therefore, the present invention provides a new tuber formation control vector capable of controlling (promoting or suppressing) tuber formation of a plant by introduction into the plant, a method for producing a plant with controlled tuber formation, and a plant with controlled tuber formation. For the purpose of provision.
前記目的を達成するために、本発明のベクターは、植物の塊茎形成を制御するための塊茎形成制御ベクターであって、ＬＫＰ２遺伝子、または、ＣＯＮＳＴＡＮＳ遺伝子とＥＡＲモチーフのＤＮＡ配列とを含むキメラ遺伝子が挿入されたことを特徴とする。 In order to achieve the above object, a vector of the present invention is a tuber formation control vector for controlling tuber formation of a plant, wherein a chimeric gene comprising a LKP2 gene or a CONSTANS gene and a DNA sequence of an EAR motif is used. It is characterized by being inserted.
本発明の製造方法は、塊茎形成が制御された植物の製造方法であって、植物に、本発明の塊茎形成制御ベクターを導入することを特徴とする。また、本発明の植物は、本発明の製造方法により得られる、塊茎形成が制御された植物である。 The production method of the present invention is a method for producing a plant in which tuber formation is controlled, and is characterized by introducing the tuber formation control vector of the present invention into a plant. Moreover, the plant of this invention is a plant by which tuber formation was controlled obtained by the manufacturing method of this invention.
本発明者らは、鋭意研究の結果、植物体において人為的にＬＫＰ２遺伝子を発現させることによって、塊茎形成が促進され、また、植物体において人為的にＣＯＮＳＴＡＮＳ遺伝子とＥＡＲモチーフのＤＮＡ配列とを含むキメラ遺伝子を発現させることによって、塊茎形成を抑制できることを見出し、本発明に到った。 As a result of intensive studies, the present inventors have promoted tuber formation by artificially expressing the LKP2 gene in the plant, and artificially contain the CONSTANS gene and the DNA sequence of the EAR motif in the plant. The inventors found that tuber formation can be suppressed by expressing a chimeric gene, and have arrived at the present invention.
ＬＫＰ２遺伝子は、ＬＯＶ ｋｅｌｃｈ ｐｒｏｔｅｉｎ２（以下、「ＬＫＰ２」という）の遺伝子である。ＬＫＰ２は、（１）青色光受容部でありタンパク質−タンパク質間相互作用に関わるＬＯＶドメインと、（２）ユビキチンプロテアソーム系を介したタンパク質分解に関与するＳＣＦ複合体の構成因子Ｆ−ｂｏｘ ｍｏｔｉｆ、および、（３）ユビキチン化の基質タンパク質の認識領域と考えられているｋｅｌｃｈ ｒｅｐｅａｔ、という３つのドメインからなるタンパク質である。そして、ＬＫＰ２遺伝子ならびにＬＫＰ２については、以下のことが報告されている（非特許文献２、非特許文献３）。まず、ＬＫＰ２遺伝子をシロイヌナズナで過剰発現させると、開花遅延が生じ、概日リズム周期が消失することが報告されている（非特許文献２、非特許文献３）。また、ＬＫＰ２遺伝子は、ＳＣＦ複合体の構成因子ＡＳＫと相互作用することから、標的タンパク質の分解を通して概日時計の制御を行う可能性があることが報告されている（非特許文献３）。しかしながら、このようなＬＫＰ２遺伝子ならびにＬＫＰ２の機能が、植物の塊茎形成に関係していることは何ら報告されておらず、そのような示唆もされていない。このような技術常識の中、本発明者らは、鋭意研究の結果、メカニズムは不明であるが、植物中で人為的にＬＫＰ２遺伝子を発現させることで、塊茎形成を促進させ、例えば、植物体１個当たりの塊茎形成個数の増加を実現した。
The LKP2 gene is a gene of LOV kelch protein 2 (hereinafter referred to as “LKP2”). LKP2 is (1) a blue light receptor and a LOV domain involved in protein-protein interaction, (2) a component factor F-box motif of the SCF complex involved in proteolysis via the ubiquitin proteasome system, and (3) A protein consisting of three domains, kelch repeat, which is considered as a recognition region of a substrate protein for ubiquitination. The following has been reported for the LKP2 gene and LKP2 (
ＣＯＮＳＴＡＮＳ遺伝子は、ＣＯＮＳＴＡＮＳ（以下、「ＣＯ」という）の遺伝子（以下、「ＣＯ遺伝子」という）である。ＣＯは、転写制御因子であり、例えば、シロイヌナズナにおいて、転写活性化因子として長日の日照条件に特異的に反応して開花を促進することが報告されている（非特許文献４）。また、ＥＡＲモチーフとは、ＥＲＦ−ａｓｓｏｓｉａｔｅｄ ａｍｐｈｉｐｈｉｌｉｃ ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ ｍｏｔｉｆであり、転写活性化因子の機能を抑制するという機能を有するポリペプチドであることが報告されている。そして、ＣＯのＣ末端側に１２アミノ酸からなるＥＡＲモチーフを連結させるキメラ遺伝子を、長日植物シロイヌナズナで発現させると、長日条件下であっても、ＥＡＲモチーフによりＣＯＮＳＴＡＮＳの機能が抑制され、花芽形成および開花が遅延することが報告されている（非特許文献５）。しかしながら、このようなＣＯの機能抑制が、植物の塊茎形成に関係していることは何ら報告されておらず、そのような示唆もされていない。このような技術常識の中、本発明者らは、鋭意研究の結果、メカニズムは不明であるが、植物中で人為的にＣＯ遺伝子とＥＡＲモチーフのＤＮＡ配列とを含むキメラ遺伝子を発現させることで、塊茎形成を抑制し、例えば、植物体１個当たりの塊茎形成個数の減少を実現した。 The CONSTANS gene is a gene of CONSTANS (hereinafter referred to as “CO”) (hereinafter referred to as “CO gene”). CO is a transcriptional regulatory factor, and for example, it has been reported that in Arabidopsis thaliana, as a transcriptional activator, it reacts specifically with long-day sunshine conditions to promote flowering (Non-patent Document 4). Further, the EAR motif is an ERF-associated amylophile repression motif, and has been reported to be a polypeptide having a function of suppressing the function of a transcriptional activator. When a chimeric gene that links an EAR motif consisting of 12 amino acids to the C-terminal side of CO is expressed in long-day plant Arabidopsis, the EAR motif suppresses the function of CONSTANS even under long-day conditions. It has been reported that formation and flowering are delayed (Non-patent Document 5). However, it has not been reported at all that the suppression of the function of CO is related to tuber formation in plants, nor has it been suggested. Under such technical common sense, the present inventors have intensively studied, but the mechanism is unknown, but by artificially expressing a chimeric gene containing a CO gene and a DNA sequence of the EAR motif in a plant, The tuber formation was suppressed, and for example, a reduction in the number of tubers formed per plant was realized.
したがって、本発明によれば、ＬＫＰ２遺伝子を含むベクターまたは前記キメラ遺伝子を含むベクターを使用することにより、塊茎形成が促進された植物と塊茎形成が抑制された植物のそれぞれを、目的に応じて作出することができる。これによって得られる本発明の植物は、例えば、使用した本発明のベクターの種類に応じて、塊茎形成が制御されるため、より効率良く目的とする植物資源を作出することができる。このため、本発明は、例えば、農業の分野等において極めて有用な技術といえる。 Therefore, according to the present invention, by using a vector containing the LKP2 gene or a vector containing the chimeric gene, a plant in which tuber formation is promoted and a plant in which tuber formation is suppressed are produced according to the purpose. can do. Since the tuber formation of the plant of the present invention obtained thereby is controlled according to, for example, the type of the vector of the present invention used, the target plant resource can be produced more efficiently. For this reason, this invention can be said to be a very useful technique in the field | area of agriculture etc., for example.
本発明の塊茎形成制御ベクターは、前述のように、ＬＫＰ２遺伝子、または、ＣＯ遺伝子とＥＡＲモチーフのＤＮＡ配列とを含むキメラ遺伝子が挿入されたことを特徴とする。以下、本発明において、ＬＫＰ２遺伝子を含む塊茎形成制御ベクターを「塊茎形成促進ベクター」といい、前記キメラ遺伝子を含む塊茎形成制御ベクターを「塊茎形成抑制ベクター」という。なお、本発明において、「機能的に配置」、「機能的に結合」とは、それが意図する機能を発揮しうる状態で配置または結合していることを意味する。また、本発明において、遺伝子の発現とは、例えば、遺伝子の転写および翻訳（タンパク質の合成）を含む。 As described above, the tuber formation control vector of the present invention is characterized in that a chimeric gene containing the LKP2 gene or the CO gene and the DNA sequence of the EAR motif is inserted. Hereinafter, in the present invention, a tuber formation control vector containing the LKP2 gene is referred to as a “tuber tube formation promoting vector”, and a tuber formation control vector containing the chimeric gene is referred to as a “tuber tube formation suppression vector”. In the present invention, “functionally arranged” and “functionally coupled” mean that they are arranged or coupled in a state where they can perform their intended functions. In the present invention, gene expression includes, for example, gene transcription and translation (protein synthesis).
＜塊茎形成促進ベクター＞
本発明において、ＬＫＰ２遺伝子は、例えば、ゲノムＤＮＡの配列でもよいし、ｃＤＮＡ配列であってもよい。ＬＫＰ２遺伝子としては、例えば、以下の（Ａ）または（Ｂ）のＤＮＡがあげられる。
（Ａ）配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡ
（Ｂ）前記（Ａ）において、１もしくは数個の塩基が欠失、置換または付加された塩基配列からなり、且つ、前記ＬＫＰ２と同様の機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
<Bottle formation promotion vector>
In the present invention, the LKP2 gene may be, for example, a genomic DNA sequence or a cDNA sequence. Examples of the LKP2 gene include the following DNA (A) or (B).
(A) DNA comprising the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1
(B) DNA encoding a protein having a base sequence in which one or several bases are deleted, substituted or added in (A) and having the same function as LKP2
前記（Ａ）のＤＮＡは、ＬＫＰ２遺伝子のＣＤＳ（ＬＫＰ２のアミノ酸配列をコードする、終止コドンを含む配列）である。前記（Ｂ）において、前記塩基数は制限されないが、例えば、５０塩基に対して、１〜６個が好ましく、より好ましくは１〜５個、さらに好ましくは１〜４個、特に好ましくは１〜３個である。また、前記（Ｂ）のＤＮＡは、ＬＫＰ２と同様の機能を喪失しない範囲であれば、例えば、前記（Ａ）のＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡであってもよいし、前記いずれかのＤＮＡとの相同性が９０％以上のＤＮＡでもよい。ハイブリダイズのストリンジェントな条件とは、例えば、当該技術分野における標準の条件があげられるが、例えば、温度条件は、配列番号１で示された塩基配列のＴｍ値の±５℃、好ましくは±２℃、より好ましくは±１℃である。条件の具体例として、５×ＳＳＣ溶液、１０×Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、１００μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡおよび１％ＳＤＳ中、６５℃でのハイブリダイゼーション、０．２×ＳＳＣおよび１％ＳＤＳ中、６５℃、１０分の洗浄（２回）があげられる。また、相同性は、例えば、９０％以上であり、好ましくは９５％以上、より好ましくは９７．５％以上である。 The DNA of (A) is a CDS of the LKP2 gene (a sequence including a stop codon encoding the amino acid sequence of LKP2). In (B), the number of bases is not limited, but for example, 1 to 6 is preferable, more preferably 1 to 5, further preferably 1 to 4, and particularly preferably 1 to 50 bases. There are three. Further, the DNA of (B) may be, for example, a DNA that hybridizes with the DNA of (A) under stringent conditions as long as it does not lose the same function as LKP2. DNA having 90% or more homology with such DNA may be used. The stringent conditions for hybridization include, for example, standard conditions in the technical field. For example, the temperature condition is ± 5 ° C. of the Tm value of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1, preferably ± 2 ° C., more preferably ± 1 ° C. Specific examples of conditions include hybridization at 65 ° C. in 5 × SSC solution, 10 × Denhardt solution, 100 μg / ml salmon sperm DNA and 1% SDS, 65 ° C., 10 in 0.2 × SSC and 1% SDS. Minute washing (twice). The homology is, for example, 90% or more, preferably 95% or more, more preferably 97.5% or more.
また、ＬＫＰ２遺伝子は、例えば、配列番号２に示すＬＫＰ２のアミノ酸配列をコードする他の塩基配列からなるＤＮＡであってもよい。 Further, the LKP2 gene may be, for example, a DNA comprising another base sequence encoding the amino acid sequence of LKP2 shown in SEQ ID NO: 2.
なお、シロイヌナズナのＬＫＰ２遺伝子の塩基配列ならびにＬＫＰ２のアミノ酸配列は、例えば、ＮＣＢＩアクセッションＮｏ．ＡＢ０３８７９７にコードされている。本発明においてＬＫＰ２遺伝子は、ＬＫＰ２と同様の機能を有するファミリータンパク質（例えば、ＺＴＬ）をコードする遺伝子であってもよい。 The base sequence of the LKP2 gene of Arabidopsis thaliana and the amino acid sequence of LKP2 are, for example, NCBI Accession No. It is coded in AB038797. In the present invention, the LKP2 gene may be a gene encoding a family protein (for example, ZTL) having the same function as LKP2.
本発明の塊茎形成促進ベクターは、植物に導入された際に、ＬＫＰ２遺伝子を発現するものであればよく、ＬＫＰ２遺伝子以外の構造は制限されない。本発明の塊茎形成促進ベクターとしては、例えば、さらに発現プロモーターを有し、前記発現プロモーターの制御下にＬＫＰ２遺伝子が挿入されていることが好ましい。この場合、塊茎形成促進ベクターは、目的の植物体に導入した際に、例えば、植物体の染色体に組み込まれてもよいし、植物体の染色体には組み込まれず、植物体において独立したエピソームとして存在してもよい。前者の場合、ＬＫＰ２遺伝子は、発現プロモーターの制御下に位置する状態で、植物体のゲノムに組み込まれることが好ましい。また、塊茎形成促進ベクターは、植物体に導入され、組換えによって植物体の染色体に組み込まれることにより、ＬＫＰ２遺伝子が発現プロモーターの制御下に配置するような構造であってもよい。この場合、前記発現プロモーターは、例えば、植物体の染色体が本来備えるプロモーターであってもよいし、予め、染色体に組み込んだ外来の発現ベクターであってもよい。 The tuber formation promotion vector of this invention should just express LKP2 gene, when it introduce | transduces into a plant, Structures other than LKP2 gene are not restrict | limited. The tuber formation promoting vector of the present invention preferably has, for example, an expression promoter, and the LKP2 gene is inserted under the control of the expression promoter. In this case, when the tuber formation promoting vector is introduced into the target plant, for example, it may be incorporated into the chromosome of the plant, or it is not incorporated into the chromosome of the plant but exists as an independent episome in the plant. May be. In the former case, it is preferable that the LKP2 gene is integrated into the genome of the plant in a state of being located under the control of the expression promoter. Further, the tuber formation promoting vector may have a structure in which the LKP2 gene is placed under the control of the expression promoter by being introduced into a plant body and integrated into the chromosome of the plant body by recombination. In this case, the expression promoter may be, for example, a promoter originally provided in a plant chromosome, or may be an exogenous expression vector previously incorporated into the chromosome.
前記発現プロモーターとしては、制限されないが、カリフラワーモザイクウィルス（ＣａＭＶ）の３５Ｓプロモーター（Ｐ３５Ｓ）、マンノピン合成酵素遺伝子プロモーター、アクチン遺伝子プロモーター等があげられる。本発明の塊茎形成促進ベクターにおいて、ＬＫＰ２遺伝子の位置は、例えば、発現プロモーターの制御下であればよく、通常、プロモーターの下流側（３’側）に機能的に配置される。 Examples of the expression promoter include, but are not limited to, cauliflower mosaic virus (CaMV) 35S promoter (P35S), mannopine synthase gene promoter, and actin gene promoter. In the tuber formation promoting vector of the present invention, the position of the LKP2 gene may be under the control of an expression promoter, for example, and is usually functionally arranged downstream (3 ′ side) of the promoter.
本発明の塊茎形成促進ベクターは、種々のベクターにＬＫＰ２遺伝子が挿入されていればよく、前記ベクターの種類は、制限されず、例えば、後述するようなベクターの導入方法に応じて適宜決定できる。前記ベクターとしては、例えば、プラスミドベクター等があげられる。 The tuber formation promotion vector of the present invention is not limited as long as the LKP2 gene is inserted into various vectors, and the type of the vector is not limited, and can be determined as appropriate according to, for example, the vector introduction method described below. Examples of the vector include a plasmid vector.
後述するようなアグロバクテリウムを介した形質転換（アグロバクテリウム法）を行う場合は、例えば、バイナリーベクターが好ましく、これにＬＫＰ２遺伝子を挿入すれば、本発明の塊茎形成促進ベクターとして使用できる。前記バイナリーベクターの種類は特に制限されないが、Ｔｉプラスミドベクターや、Ｔ−ＤＮＡの右側境界配列（ＲＢ）と左側境界配列（ＬＢ）とを有するベクター等があげられる。このようなバイナリーベクターは、前記Ｔ−ＤＮＡのＲＢとＬＢとの間に目的のＬＫＰ２遺伝子を挿入すれば、植物に導入した際に、ＲＢからＬＢの領域を植物の染色体に組み込むことができる。この場合、前述のようにＲＢとＬＢとの間には、さらに発現プロモーターが挿入され、この発現プロモーターの制御下にＬＫＰ２遺伝子が機能的に配置されていることが好ましい。ＬＫＰ２遺伝子を挿入するバイナリーベクターとしては、例えば、ｐＢＥ２１１３，ｐＢＩＮ１９等が使用できる。また、例えば、プロトプラスト法（エレクトロポレーション法）やパーティクルガン法を行う場合には、従来これらの方法に使用されている各種プラスミドを使用することもできる。 In the case of performing transformation via Agrobacterium (Agrobacterium method) as described later, for example, a binary vector is preferable, and if the LKP2 gene is inserted therein, it can be used as the tuber formation promoting vector of the present invention. The type of the binary vector is not particularly limited, and examples thereof include a Ti plasmid vector and a vector having a T-DNA right border sequence (RB) and a left border sequence (LB). In such a binary vector, when the target LKP2 gene is inserted between the RB and LB of the T-DNA, the RB to LB region can be incorporated into the plant chromosome when introduced into the plant. In this case, as described above, it is preferable that an expression promoter is further inserted between RB and LB, and the LKP2 gene is functionally arranged under the control of this expression promoter. As a binary vector for inserting the LKP2 gene, for example, pBE2113, pBIN19 and the like can be used. For example, when performing the protoplast method (electroporation method) or the particle gun method, various plasmids conventionally used in these methods can also be used.
本発明の塊茎形成促進ベクターは、さらに、植物への導入の有無を確認できることから、選択マーカーをコードする配列（選択マーカー配列）を有することが好ましい。選択マーカー配列としては、特に制限されず、公知の薬剤耐性マーカー、蛍光タンパク質マーカー等のマーカーをコードする配列があげられる。前記薬剤耐性マーカーとしては、特に制限されず、例えば、カナマイシン耐性マーカー、ネオマイシン耐性マーカー、ゼオシン耐性マーカー、ピューロマイシン耐性マーカー、ハイグロマイシン耐性マーカー等があげられる。前記蛍光タンパク質マーカーとしては、例えば、ＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ）、ＥＧＦＰ（変異型ＧＦＰ：Ｅｎｈａｎｃｅｄ ＧＦＰ）等があげられる。これらの選択マーカー配列は、その配列にしたがってＰＣＲ等により合成してもよいし、前記選択マーカー配列を有する市販のベクターから調製することもできる。 Since the tuber formation promotion vector of this invention can confirm further the presence or absence of introduction | transduction to a plant, it is preferable to have a sequence (selection marker sequence) which codes a selection marker. The selection marker sequence is not particularly limited, and examples thereof include sequences encoding markers such as known drug resistance markers and fluorescent protein markers. The drug resistance marker is not particularly limited, and examples thereof include a kanamycin resistance marker, a neomycin resistance marker, a zeocin resistance marker, a puromycin resistance marker, and a hygromycin resistance marker. Examples of the fluorescent protein marker include GFP (Green Fluorescent Protein) and EGFP (mutant GFP). These selection marker sequences may be synthesized by PCR or the like according to the sequence, or may be prepared from a commercially available vector having the selection marker sequence.
＜塊茎形成抑制ベクター＞
本発明において、前記キメラ遺伝子は、転写活性化因子であるＣＯをコードする塩基配列（ＣＯ遺伝子）と、転写抑制活性を有するＥＡＲモチーフ（以下、「Ｒｅｐ」ともいう）をコードするＤＮＡ配列（以下、「Ｒｅｐ配列」ともいう）とが機能的に結合したキメラ遺伝子である。前記キメラ遺伝子は、以下、「ＣＯ−Ｒｅｐ遺伝子」ともいう。前記ＣＯ遺伝子とＲｅｐ配列との位置関係は、制限されず、ＣＯとＲｅｐ（ＥＡＲモチーフ）との融合タンパク質が産生され、ＥＡＲモチーフの機能により、ＣＯの転写活性能が抑制できればよい。具体例としては、前記ＣＯ遺伝子の３’末端側にＲｅｐ配列が機能的に配置されていることが好ましい。この場合、発現したＣＯのＣ末端側にリプレッサーが連結される。
<Tube formation inhibition vector>
In the present invention, the chimeric gene comprises a nucleotide sequence (CO gene) encoding CO, which is a transcriptional activator, and a DNA sequence (hereinafter, also referred to as “Rep”) having an transcriptional repressing activity. , Also referred to as “Rep sequence”). Hereinafter, the chimeric gene is also referred to as “CO-Rep gene”. The positional relationship between the CO gene and the Rep sequence is not limited as long as a fusion protein of CO and Rep (EAR motif) is produced and the transcriptional activity of CO can be suppressed by the function of the EAR motif. As a specific example, it is preferable that a Rep sequence is functionally arranged on the 3 ′ end side of the CO gene. In this case, a repressor is linked to the C-terminal side of the expressed CO.
本発明において、ＣＯ遺伝子は、例えば、ゲノムＤＮＡの配列でもよいし、ｃＤＮＡ配列であってもよく、また、合成した塩基配列であってもよい。 In the present invention, the CO gene may be, for example, a genomic DNA sequence, a cDNA sequence, or a synthesized base sequence.
本発明において、ＣＯ遺伝子としては、例えば、以下の（Ｃ）または（Ｄ）のＤＮＡがあげられる。
（Ｃ）配列番号３に記載の塩基配列からなるＤＮＡ
（Ｄ）前記（Ｃ）において、１もしくは数個の塩基が欠失、置換または付加された塩基配列からなり、且つ、前記ＣＯと同様の機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
In the present invention, examples of the CO gene include the following DNA (C) or (D).
(C) DNA comprising the base sequence set forth in SEQ ID NO: 3
(D) DNA encoding a protein having a base sequence in which one or several bases are deleted, substituted or added in (C) and having the same function as CO
前記（Ｃ）のＤＮＡは、ＣＯ遺伝子のＣＤＳ（ＣＯのアミノ酸配列をコードする、終止コドンを含む配列）である。前記（Ｄ）において、前記塩基数は制限されないが、例えば、５０塩基に対して、１〜６個が好ましく、より好ましくは１〜５個、さらに好ましくは１〜４個、特に好ましくは１〜３個である。また、前記（Ｄ）のＤＮＡは、ＣＯと同様の機能を喪失しない範囲であれば、例えば、前記（Ｃ）のＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡであってもよいし、前記いずれかのＤＮＡとの相同性が９０％以上のＤＮＡでもよい。ハイブリダイズのストリンジェントな条件とは、例えば、当該技術分野における標準の条件があげられるが、例えば、温度条件は、配列番号３で示された塩基配列のＴｍ値の±５℃、好ましくは±２℃、より好ましくは±１℃である。条件の具体例として、５×ＳＳＣ溶液、１０×Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、１００μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡおよび１％ＳＤＳ中、６５℃でのハイブリダイゼーション、０．２×ＳＳＣおよび１％ＳＤＳ中、６５℃、１０分の洗浄（２回）があげられる。また、相同性は、例えば、９０％以上であり、好ましくは９５％以上、より好ましくは９７．５％以上である。ＣＯ−Ｒｅｐ遺伝子は、例えば、配列番号３における終止コドン（ＴＧＡ）をＧＣＡ等に置換してもよい。 The DNA (C) is a CDS of a CO gene (a sequence including a stop codon encoding the amino acid sequence of CO). In (D), the number of bases is not limited, but for example, 1 to 6 is preferable, more preferably 1 to 5, further preferably 1 to 4, particularly preferably 1 to 50 bases. There are three. The DNA of (D) may be, for example, DNA that hybridizes with the DNA of (C) under stringent conditions, as long as it does not lose the same function as CO. DNA having 90% or more homology with such DNA may be used. The stringent conditions for hybridization include, for example, standard conditions in the technical field. For example, the temperature condition is ± 5 ° C. of the Tm value of the base sequence represented by SEQ ID NO: 3, preferably ± 2 ° C., more preferably ± 1 ° C. Specific examples of conditions include hybridization at 65 ° C. in 5 × SSC solution, 10 × Denhardt solution, 100 μg / ml salmon sperm DNA and 1% SDS, 65 ° C., 10 in 0.2 × SSC and 1% SDS. Minute washing (twice). The homology is, for example, 90% or more, preferably 95% or more, more preferably 97.5% or more. In the CO-Rep gene, for example, the stop codon (TGA) in SEQ ID NO: 3 may be replaced with GCA or the like.
また、ＣＯ遺伝子は、例えば、配列番号４に示すＣＯのアミノ酸配列をコードする他の塩基配列からなるＤＮＡであってもよい。なお、シロイヌナズナのＣＯ遺伝子ならびにＣＯの配列は、例えば、ＮＣＢＩアクセッションＮｏ．ＮＭ１２１５８９にコードされている。本発明においてＣＯ遺伝子は、例えば、シロイヌナズナのＣＯ遺伝子には制限されず、他の植物種由来のＣＯ遺伝子でもよい。 In addition, the CO gene may be, for example, DNA composed of another base sequence encoding the amino acid sequence of CO shown in SEQ ID NO: 4. Note that the Arabidopsis thaliana CO gene and the CO sequence are, for example, NCBI Accession No. It is coded in NM121589. In the present invention, the CO gene is not limited to, for example, the Arabidopsis thaliana CO gene, and may be a CO gene derived from another plant species.
本発明において、Ｒｅｐ配列は、例えば、以下の（Ｅ）または（Ｆ）のＤＮＡがあげられる。
（Ｅ）配列番号５に記載の塩基配列からなるＤＮＡ
（Ｆ）前記（Ｅ）において、１もしくは数個の塩基が欠失、置換または付加された塩基配列からなり、且つ、前記ＥＡＲモチーフと同様の機能を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ
In the present invention, examples of the Rep sequence include the following DNA (E) or (F).
(E) DNA comprising the base sequence set forth in SEQ ID NO: 5
(F) DNA encoding a polypeptide comprising a base sequence in which one or several bases are deleted, substituted or added in (E) and having the same function as the EAR motif
前記（Ｅ）のＤＮＡは、ＥＡＲモチーフのアミノ酸配列をコードする配列である。前記（Ｆ）において、前記塩基数は制限されないが、例えば、５０塩基に対して、１〜６個が好ましく、より好ましくは１〜５個、さらに好ましくは１〜４個、特に好ましくは１〜３個である。また、前記（Ｆ）のＤＮＡは、ＥＡＲモチーフと同様の機能を喪失しない範囲であれば、例えば、前記（Ｅ）のＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡであってもよいし、前記いずれかのＤＮＡとの相同性が９０％以上のＤＮＡでもよい。ハイブリダイズのストリンジェントな条件とは、例えば、当該技術分野における標準の条件があげられるが、例えば、温度条件は、配列番号５で示された塩基配列のＴｍ値の±５℃、好ましくは±２℃、より好ましくは±１℃である。条件の具体例として、５×ＳＳＣ溶液、１０×Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、１００μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡおよび１％ＳＤＳ中、６５℃でのハイブリダイゼーション、０．２×ＳＳＣおよび１％ＳＤＳ中、６５℃、１０分の洗浄（２回）があげられる。また、相同性は、例えば、９０％以上であり、好ましくは９５％以上、より好ましくは９７．５％以上である。 The DNA of (E) is a sequence encoding the amino acid sequence of the EAR motif. In (F), the number of bases is not limited, but for example, 1 to 6 is preferable, more preferably 1 to 5, more preferably 1 to 4, and particularly preferably 1 to 50 bases. There are three. In addition, the DNA of (F) may be, for example, DNA that hybridizes with the DNA of (E) under stringent conditions, as long as it does not lose the same function as the EAR motif. DNA with 90% or more homology with any DNA may be used. The stringent conditions for hybridization include, for example, standard conditions in the technical field. For example, the temperature condition is ± 5 ° C. of the Tm value of the base sequence represented by SEQ ID NO: 5, preferably ± 2 ° C., more preferably ± 1 ° C. Specific examples of conditions include hybridization at 65 ° C. in 5 × SSC solution, 10 × Denhardt solution, 100 μg / ml salmon sperm DNA and 1% SDS, 65 ° C., 10 in 0.2 × SSC and 1% SDS. Minute washing (twice). The homology is, for example, 90% or more, preferably 95% or more, more preferably 97.5% or more.
また、Ｒｅｐ配列は、例えば、配列番号６に示すＥＡＲモチーフのアミノ酸配列（ＬＤＬＤＬＥＬＲＬＧＦＡ）をコードする他の塩基配列からなるＤＮＡであってもよい。 In addition, the Rep sequence may be, for example, a DNA composed of another base sequence encoding the amino acid sequence of the EAR motif shown in SEQ ID NO: 6 (LDLDLELLRLGFA).
ＣＯ遺伝子とＲｅｐ配列とからなるキメラ遺伝子の一例を配列番号７に示す。この配列において、９−１１８０番目の領域が終止コドンをＧＣＡに置換したＣＯ遺伝子であり、１１３７−１１７２番目の領域がＲｅｐ配列である。その他の部分（例えば、３’末端）は、ベクターへの連結が容易になることから、制限酵素部位（配列番号７においてはＮｏｔＩサイト）等を有している。なお、この配列は一例であって、本発明を制限するものではない。 An example of a chimeric gene comprising a CO gene and a Rep sequence is shown in SEQ ID NO: 7. In this sequence, the 9-1180th region is a CO gene in which the stop codon is replaced with GCA, and the 1137-1172th region is a Rep sequence. The other part (for example, 3 'end) has a restriction enzyme site (NotI site in SEQ ID NO: 7) and the like because it can be easily linked to a vector. Note that this arrangement is an example and does not limit the present invention.
本発明の塊茎形成促進ベクターは、植物に導入された際に、前記キメラ遺伝子を発現するものであればよく、前記キメラ遺伝子以外の構造は制限されない。本発明の塊茎形成抑制ベクターとしては、例えば、さらに発現プロモーターを有し、前記発現プロモーターの制御下に前記キメラ遺伝子が挿入されていることが好ましい。この場合、塊茎形成抑制ベクターは、目的の植物体に導入した際に、例えば、植物体の染色体に組み込まれてもよいし、植物体の染色体には組み込まれず、植物体において独立したエピソームとして存在してもよい。前者の場合、前記キメラ遺伝子は、発現プロモーターの制御下に位置する状態で、植物体のゲノムに組み込まれることが好ましい。また、塊茎形成抑制ベクターは、植物体に導入され、組換えによって植物体の染色体に組み込まれることにより、前記キメラ遺伝子が発現プロモーターの制御下に配置するような構造であってもよい。この場合、前記発現プロモーターは、例えば、植物体の染色体が本来備えるプロモーターであってもよいし、予め、染色体に組み込んだ外来の発現ベクターであってもよい。前記発現プロモーターとしては、前述のようなものがあげられる。前記キメラ遺伝子の位置は、例えば、発現プロモーターの制御下であればよく、通常、プロモーターの下流側（３’側）に機能的に配置される。 The tuber formation promotion vector of the present invention may be any vector that expresses the chimeric gene when introduced into a plant, and the structure other than the chimeric gene is not limited. The tuber formation suppression vector of the present invention preferably has, for example, an expression promoter, and the chimeric gene is inserted under the control of the expression promoter. In this case, when introduced into the target plant body, the tuber formation suppression vector may be integrated into the plant chromosome, or may not be integrated into the plant chromosome and exists as an independent episome in the plant body. May be. In the former case, the chimeric gene is preferably integrated into the genome of the plant in a state where it is under the control of an expression promoter. In addition, the tuber formation suppression vector may have a structure in which the chimeric gene is placed under the control of an expression promoter by being introduced into a plant and integrated into the chromosome of the plant by recombination. In this case, the expression promoter may be, for example, a promoter originally provided in a plant chromosome, or may be an exogenous expression vector previously incorporated into the chromosome. Examples of the expression promoter include those described above. The position of the chimeric gene may be, for example, under the control of an expression promoter, and is usually functionally arranged on the downstream side (3 ′ side) of the promoter.
本発明の塊茎形成抑制ベクターは、種々のベクターに前記キメラ遺伝子が挿入されていればよく、前記ベクターの種類は、制限されず、前述のようなものがあげられる。また、前述と同様に、アグロバクテリウム法を行う場合は、例えば、バイナリーベクターが好ましく、これに前記キメラ遺伝子を挿入すれば、本発明の塊茎形成抑制ベクターとして使用できる。前記バイナリーベクターは、前述と同様のものが使用でき、前記キメラ遺伝子の挿入も、前記ＬＫＰ２遺伝子と同様である。 The tuber formation suppression vector of the present invention is not limited as long as the chimeric gene is inserted into various vectors, and the type of the vector is not limited, and examples thereof include those described above. Similarly to the above, when the Agrobacterium method is performed, for example, a binary vector is preferable, and if the chimeric gene is inserted into this, it can be used as the tuber formation-suppressing vector of the present invention. The same binary vector as described above can be used, and the insertion of the chimeric gene is the same as that of the LKP2 gene.
本発明の塊茎形成抑制ベクターは、選択マーカー配列を有することが好ましく、前記選択マーカー配列としては、前述と同様のものがあげられる。 The tuber formation suppression vector of the present invention preferably has a selection marker sequence, and examples of the selection marker sequence include those described above.
＜塊茎形成が制御された植物の製造方法＞
本発明の製造方法は、塊茎形成が抑制された植物の製造方法であって、植物に、本発明の塊茎形成制御ベクターを導入することを特徴とする。本発明の製造方法によれば、本発明の塊茎形成促進ベクターを導入することにより、塊茎形成が促進され、例えば、植物体１個あたりの塊茎個数が増加した植物を得ることができる。他方、本発明の塊茎形成抑制ベクターを導入すれば、塊茎形成が抑制され、例えば、植物体１個あたりの塊茎個数が減少した植物を得ることができる。
<Plant production method with controlled tuber formation>
The production method of the present invention is a method for producing a plant in which tuber formation is suppressed, and is characterized by introducing the tuber formation control vector of the present invention into a plant. According to the production method of the present invention, by introducing the tuber formation promoting vector of the present invention, tuber formation is promoted, for example, a plant having an increased number of tubers per plant body can be obtained. On the other hand, if the tuber formation suppression vector of this invention is introduce | transduced, tuber formation is suppressed, for example, the plant in which the number of tubers per plant body decreased can be obtained.
本発明の製造方法においては、本発明の塊茎形成制御ベクターを目的の植物に導入すればよく、例えば、ベクターの導入方法や条件等は制限されない。 In the production method of the present invention, the tuber formation control vector of the present invention may be introduced into the target plant, and for example, the method and conditions for introducing the vector are not limited.
本発明の製造方法において、対象となる植物は、制限されない。具体例としては、ナス科の植物があげられ、前記ナス科の植物としては、例えば、バレイショがあげられる。 In the production method of the present invention, the target plant is not limited. Specific examples include solanaceous plants, and examples of the solanaceous plants include potato.
本発明の塊茎形成制御ベクターの導入方法は、制限されず、植物の種類やベクターの種類等に応じて適宜決定でき、例えば、アグロバクテリウム法、プロトプラスト法（エレクトロポレーション法）、パーティクルガン法等があげられる。これらの導入方法は、従来公知の方法に従って行うことができる。 The introduction method of the tuber formation control vector of the present invention is not limited and can be appropriately determined according to the kind of plant, the kind of vector, etc., for example, Agrobacterium method, protoplast method (electroporation method), particle gun method Etc. These introduction methods can be performed according to a conventionally known method.
アグロバクテリウム法を採用する場合、例えば、以下のようにして本発明の植物を生産できる。本発明の塊茎形成制御ベクターを、Ｖｉｒ領域を有するプラスミドを持つアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）に導入する。そして、目的の植物体に前記アグロバクテリウムを感染させ、培地で培養を行う。この際、前述のように塊茎形成制御ベクターが選択マーカー配列を有していれば、例えば、薬剤等を含有する培地で培養することによって、本発明の塊茎形成制御ベクターが導入された形質転換体を容易に選択できる。このようにして得られた形質転換体は、ＬＫＰ２遺伝子を導入した場合には、ＬＫＰ２遺伝子の発現によって、塊茎形成が促進され、例えば、植物体１個あたりの塊茎個数が増加し、前記キメラ遺伝子を導入した場合には、前記キメラ遺伝子の発現によって、塊茎形成が抑制され、例えば、植物体１個あたりの塊茎個数が減少する。 When employing the Agrobacterium method, for example, the plant of the present invention can be produced as follows. The tuber formation control vector of the present invention is introduced into Agrobacterium (Agrobacterium tumefaciens) having a plasmid having a Vir region. Then, the target plant is infected with the Agrobacterium and cultured in a medium. At this time, if the tuber formation control vector has a selection marker sequence as described above, the transformant into which the tuber formation control vector of the present invention has been introduced, for example, by culturing in a medium containing a drug or the like. Can be selected easily. When the LKP2 gene is introduced into the transformant thus obtained, tuber formation is promoted by the expression of the LKP2 gene. For example, the number of tubers per plant increases, and the chimeric gene Is introduced, the tuber formation is suppressed by the expression of the chimeric gene, for example, the number of tubers per plant body decreases.
アグロバクテリウム法によりバレイショに本発明の塊茎形成制御ベクターを導入する際には、例えば、以下のようにして行うことができる。まず、バレイショのマイクロチューバー（小指の先ぐらいの大きさの塊茎）を準備する。これを、本発明の塊茎形成制御ベクターを導入したアグロバクテリウムとともに培養し、前記アグロバクテリウムを感染させる。そして、さらに培養することによりカルスを形成させ、例えば、薬剤等を含有する培地で培養し、前記カルスから再分化したシュートを選択すればよい。また、塊茎以外にも、例えば、葉の切片を用いる葉片培養においてアグロバクテリウムを感染させてもよい。 When the tuber formation control vector of the present invention is introduced into a potato by the Agrobacterium method, for example, it can be carried out as follows. First, prepare a potato microtuber (a tuber about the size of the tip of a little finger). This is cultured with Agrobacterium into which the tuber formation control vector of the present invention has been introduced to infect the Agrobacterium. Further, callus may be formed by further culturing, for example, cultured in a medium containing a drug or the like, and a shoot regenerated from the callus may be selected. In addition to tubers, for example, Agrobacterium may be infected in leaf piece culture using leaf sections.
このようにして得られる本発明の植物（形質転換体）は、導入された各遺伝子の発現によって、塊茎形成が促進または抑制される。なお、本発明において植物とは、例えば、植物体全体でも、葉、種子等の植物体の一部でもよく、また、プロトプラスト、カルス等の植物細胞であってもよい。 In the plant (transformant) of the present invention thus obtained, tuber formation is promoted or suppressed by the expression of each introduced gene. In the present invention, the plant may be, for example, the whole plant, a part of a plant such as a leaf or seed, or a plant cell such as protoplast or callus.
［実施例］
つぎに、本発明の実施例について、比較例と併せて説明する。ただし、本発明は下記の実施例により制限されない。
[Example]
Next, examples of the present invention will be described together with comparative examples. However, the present invention is not limited by the following examples.
バレイショ（Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ ｃｖ．ＭａｙＱｕｅｅｎ）に、ＬＫＰ２遺伝子を有する塊茎形成促進ベクター（ｐＢＥ２１１３/ＬＫＰ２）を導入し、塊茎形成の状態を確認した。 A tuber formation promoting vector (pBE2113 / LKP2) having the LKP2 gene was introduced into potato (Solanum tuberosum cv. MayQueen) to confirm the state of tuber formation.
＜塊茎形成促進ベクターｐＢＥ２１１３／ＬＫＰ２の構築＞
シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ（Ｌ．）Ｈｅｙｎｈ．ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｃｏｌｕｍｂｉａ、以下同様）のｃＤＮＡから、下記プライマーセット１を用いたＰＣＲによって、ＬＫＰ２コード領域（ＣＤＳ）を増幅させた。なお、下記プライマーセット１は、フォワードプライマー（配列番号８）が５’側にＢａｍＨＩサイトを、リバースプライマー（配列番号９）が５’側にＢａｍＨＩサイトを備える。この増幅物の概略を図１に示す。同図における数値は、増幅物における塩基の番号を示す。
（プライマーセット１）
フォワードプライマー ５’−GGATCCGTATGCAAAATCAAATGGAGTGGG−３’
リバースプライマー ５’−GGATCCGATCAAGTACTTGCAGTGGTAGAA−３’
<Construction of tuber formation promoting vector pBE2113 / LKP2>
The LKP2 coding region (CDS) was amplified by PCR using the following primer set 1 from cDNA of Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. Accession Columbia (hereinafter the same). In the primer set 1 below, the forward primer (SEQ ID NO: 8) has a BamHI site on the 5 ′ side, and the reverse primer (SEQ ID NO: 9) has a BamHI site on the 5 ′ side. An outline of the amplified product is shown in FIG. The numerical value in the figure shows the base number in the amplified product.
(Primer set 1)
Forward primer 5'-GGATCCGTATGCAAAATCAAATGGAGTGGG-3 '
Reverse primer 5'-GGATCCGATCAAGTACTTGCAGTGGTAGAA-3 '
このＰＣＲ増幅物とバイナリーベクターｐＢＥ２１１３ＮｏｔのＢａｍＨＩサイトに挿入した。このようにして得られた組換え発現ベクターを、ｐＢＥ２１１３／ＬＫＰ２、または、３５Ｓ：ＬＫＰ２という。ｐＢＥ２１１３Ｎｏｔの構成の一部の概略を図１に示す。同図に示すように、ｐＢＥ２１１３Ｎｏｔは、カリフラワーモザイクウィルス（ＣａＭＶ）３５Ｓプロモーターを備える発現ベクターである。同図において、「Ｅ１２」は、ＣａＭＶの３５Ｓプロモーター上流領域Ｅ１２配列（−４１９〜−９０ｂｐの２回繰り返し配列）であり、「Ｐ３５Ｓ」は、ＣａＭＶの３５Ｓプロモーターであり、「Ω」は、タバコモザイクウィルス（ＴＭＶ）の５’非翻訳領域エンハンサーΩ領域であり、「ＮＯＳ−Ｔ」は、ノパリン合成酵素遺伝子ｎｏｓ３’非翻訳領域終止シグナル（転写ターミネーター及びｍＲＮＡポリアデニル化シグナル）であり、「ＲＢ」は、アグロバクテリウムＴ−ＤＮＡの右側境界配列（Ｒｉｇｈｔ Ｂｏｒｄｅｒ：２５ｂｐ）であり、「ＬＢ」は、前記Ｔ−ＤＮＡの左側境界配列（Ｌｅｆｔ Ｂｏｒｄｅｒ：２５ｂｐ）である。ｐＢＥ２１１３／ＬＫＰ２は、前述のようにＬＫＰ２遺伝子の増幅物をｐＢＥ２１１３ＮｏｔのＢａｍＨＩサイトに挿入しているため、ＬＫＰ２遺伝子の増幅物が、Ｔ−ＤＮＡのＲＢとＬＢとに挟まれた構造となる。
This PCR amplification product and the binary vector pBE2113Not were inserted into the BamHI site. The recombinant expression vector thus obtained is referred to as pBE2113 / LKP2 or 35S: LKP2. An outline of a part of the configuration of pBE2113Not is shown in FIG. As shown in the figure, pBE2113Not is an expression vector comprising a cauliflower mosaic virus (CaMV) 35S promoter. In the same figure, “E12” is the
この発現ベクターは、ＲＢとＬＢとの間にプロモーターＰ３５ＳとＬＫＰ２遺伝子とが挿入され、前記ＬＫＰ２遺伝子は前記プロモーターの制御下に配置されている。したがって、従来公知の方法に従って、これらの発現ベクターを導入したアグロバクテリウムを植物体に感染させれば、ＲＢからその下流に位置するＬＢまでの領域が、組換えにより植物体のゲノム中に組み込まれる。そして、組み込まれた発現プロモーターＰ３５Ｓの制御下にあるＬＫＰ２遺伝子が過剰に発現することとなる。 In this expression vector, a promoter P35S and an LKP2 gene are inserted between RB and LB, and the LKP2 gene is placed under the control of the promoter. Therefore, when Agrobacterium introduced with these expression vectors is infected into a plant according to a conventionally known method, the region from RB to LB located downstream thereof is integrated into the genome of the plant by recombination. It is. Then, the LKP2 gene under the control of the incorporated expression promoter P35S will be overexpressed.
＜形質転換体の作製＞
作製したｐＢＥ２１１３／ＬＫＰ２を、アグロバクテリウム法によりバレイショに導入した。特に示さない限り、アグロバクテリウム法は、インプランタインフィルトレーション法（Ishige, T, Ohshima, M, Ohashi, Y "Transformation of Japanese potato cultivars with the β-glucoronidase gene fused with the promoter of the pathogenesis-related 1a protein gene of tobacco." Plant Science 73, 167-174 (1991).）ならびに「日本生化学会編基礎生化学実験法第３巻タンパク質ＩＩ機能・動態解析法」（東京化学同人、２００１年、ｐｐ．１１６−１２５）に従って行った。形質転換体の作製工程の概略を図２に示す。
<Production of transformant>
The produced pBE2113 / LKP2 was introduced into the potato by the Agrobacterium method. Unless otherwise indicated, the Agrobacterium method is an inplanter infiltration method (Ishige, T, Ohshima, M, Ohashi, Y "Transformation of Japanese potato cultivars with the β-glucoronidase gene fused with the promoter of the pathogenesis-related
バレイショの小さな塊茎（マイクロチューバー）に、ｐＢＥ２１１３／ＬＫＰ２を導入したアグロバクテリウムを感染させた。３〜４週間再分化培地で培養し、そして、再分化したカルスを、カナマイシン（１００ｍｇ／Ｌ）とＣｅｆｏｔａｘｉｍｅ（３００ｍｇ／Ｌ）とを含む再分化培地で育成し、遺伝子（ｐＢＥ２１１３／ＬＫＰ２のＲＢからＬＢの領域）が導入された形質転換体を仮選択した。 A small potato tuber (microtuber) was infected with Agrobacterium into which pBE2113 / LKP2 was introduced. The cells were cultured in a redifferentiation medium for 3 to 4 weeks, and the redifferentiated callus was grown in a redifferentiation medium containing kanamycin (100 mg / L) and Cefotaxime (300 mg / L). Transformants into which the LB region) was introduced were provisionally selected.
さらに、前記仮選択を行った形質転換体について、ＲＮＡゲルブロットハイブリダイゼーションを行い、ＬＫＰ２遺伝子が発現している株を選択した。まず、前記形質転換体から、ＲＮｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用いて、ｍＲＮＡを抽出した。抽出したｍＲＮＡを、１．８５％ホルムアルデヒドを含有する１％アガロースゲルに供し、電気泳動を行った。電気泳動したＲＮＡをナイロンメンブランにブロッティングし、ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ−１１−ｄＵＴＰ（ＤＩＧ−ｄＵＴＰ）で標識化したＲＮＡプローブと反応させてハイブリッドを形成させた。そして、試薬（商品名ＣＤＰ ｓｔａｒ ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ ｋｉｔ；ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を用いて化学蛍光シグナルを発生させ、これを検出装置（商品名ｌｉｇｈｔ ｃａｐｔｕｒｅ ｓｙｓｔｅｍ；ＡＴＴＯ社製）で検出した。この結果を、図３に示す。同図は、薬剤選択した形質転換体のＲＮＡゲルブロッティングハイブリダイゼーションの結果を示す図である。同図において、上欄が、ＬＫＰ２ｍＲＮＡの結果であり、下欄は、泳動したＲＮＡ量を確認するためのコントロールの結果である。そして、同図の結果から、３５、３６、４０、４２、４４、４５、４７、４８の計８株の形質転換体を、遺伝子（ｐＢＥ２１１３／ＬＫＰ２のＲＢからＬＢの領域）が導入された植物体として選択した。 Furthermore, RNA gel blot hybridization was performed on the transformant subjected to the preliminary selection, and a strain expressing the LKP2 gene was selected. First, mRNA was extracted from the transformant using RNeasy Plant Mini Kit (manufactured by Qiagen). The extracted mRNA was applied to a 1% agarose gel containing 1.85% formaldehyde and subjected to electrophoresis. The electrophoresed RNA was blotted on a nylon membrane, and reacted with an RNA probe labeled with digoxigenin-11-dUTP (DIG-dUTP) to form a hybrid. Then, a chemical fluorescence signal was generated using a reagent (trade name CDP star visualization kit; manufactured by GE Healthcare), and this was detected with a detection device (trade name: light capture system; manufactured by ATTO). The result is shown in FIG. The figure shows the results of RNA gel blotting hybridization of transformants selected for drugs. In the figure, the upper column is the result of LKP2 mRNA, and the lower column is the result of the control for confirming the amount of migrated RNA. Based on the results shown in the figure, a total of 8 transformants of 35, 36, 40, 42, 44, 45, 47, and 48 were transformed into a plant into which the gene (RB to LB region of pBE2113 / LKP2) was introduced. Selected as body.
各形質転換体（８株）のシュートを切り取り、２％ショ糖含有改変ＭＳ寒天培地（日本生化学編基礎生化学実験法第３巻タンパク質）に植え、長日条件（１６時間明期／８時間暗記）で培養した。成長したバレイショを、１５％ショ糖を含むＭＳ寒天培地に移植し、暗所下で２ヶ月培養した。各形質転換体について、１株から得られた塊茎の形成個数を確認した。また、コントロールとして、ＬＫＰ２遺伝子を挿入していないバイナリーベクターｐＢＥ２１１３を用いて、同様にしてバレイショの形質転換を行い、得られた形質転換体についても同様に塊茎の形成個数の確認を行った。これらの結果を、図４に示す。同図は、ｐＢＥ２１１３／ＬＫＰ２（３５Ｓ：ＬＫＰ２）を導入した形質転換体と、コントロールベクターｐＢＥ２１１３を導入した形質転換体における塊茎の形成個数の平均を示すグラフである（ｎ＝８）。同図において、バーは、標準誤差を示し、＊は、ｔ検定によるＰ値が０．０５以下であることを示す。
Cut out the shoots of each transformant (8 strains), planted in 2% sucrose-containing modified MS agar medium (Japan Biochemistry, Basic Biochemistry Experimental Method,
このようにＬＫＰ２遺伝子を過剰発現させた形質転換体は、形成される塊茎の個数がコントロール（１００％）よりも約２倍程度多い結果となった。この結果から、ＬＫＰ２遺伝子の発現により、塊茎の形成を促進できることがわかる。 Thus, the transformant overexpressing the LKP2 gene resulted in about twice as many tubers formed as compared to the control (100%). This result shows that tuber formation can be promoted by the expression of the LKP2 gene.
バレイショ（Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ ｃｖ．ＭａｙＱｕｅｅｎ）に、ＣＯ-Ｒｅｐ遺伝子（前記キメラ遺伝子）を有する塊茎形成抑制ベクター（ｐＢＥ２１１３/ＣＯ-Ｒｅｐ）を導入し、塊茎形成の状態を確認した。なお、特に示さない限りは、前記実施例１と同様にして操作を行った。 The tuber formation suppression vector (pBE2113 / CO-Rep) which has a CO-Rep gene (the said chimera gene) was introduce | transduced into the potato (Solanum tuberosum cv. MayQueen), and the state of tuber formation was confirmed. Unless otherwise indicated, the operation was performed in the same manner as in Example 1.
＜塊茎形成抑制ベクターｐＢＥ２１１３/ＣＯ-Ｒｅｐの構築＞
特に示さない限りは、文献（Takase, T et al., "Overexpression of the chimericgene of the floral regulator CONSTANS and the EAR motif repressor causes late flowering in Arabidopsis." Plant Cell Rep. Epub ahead of print (2007)）に従った。まず、５’末端にＢａｍＨＩサイト、３’末端にＢｇｌIIサイトを備えるＥＡＲモチーフの二本鎖ＤＮＡを合成した。この二本鎖の順鎖の配列を下記配列番号１０に示す。この二本鎖をＢａｍＨＩとＢｇｌIIで処理し、ｐＢＥ２１１３ＮｏｔのＢａｍＨＩサイトに挿入した。この組換えベクターを、ｐＢＥ２１１３／Ｒｅｐという。
５’−GGATCCCTTGATCTTGATCTTGAACTTAGACTTGGATTTGCTTAGATCT−３’（配列番号１０）
<Construction of tuber formation suppression vector pBE2113 / CO-Rep>
Unless otherwise indicated, literature (Takase, T et al., "Overexpression of the chimeric gene of the floral regulator CONSTANS and the EAR motif repressor causes late flowering in Arabidopsis." Plant Cell Rep. Epub ahead of print (2007)). I followed. First, double-stranded DNA of an EAR motif having a BamHI site at the 5 ′ end and a BglII site at the 3 ′ end was synthesized. The sequence of this double-stranded normal chain is shown in SEQ ID NO: 10 below. This double strand was treated with BamHI and BglII and inserted into the BamHI site of pBE2113Not. This recombinant vector is referred to as pBE2113 / Rep.
5′-GGATCCCTTGATCTTGATCTTGAACTTAGACTTGGATTTGCTTAGATCT-3 ′ (SEQ ID NO: 10)
つぎに、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ（Ｌ．）Ｈｅｙｎｈ．ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｃｏｌｕｍｂｉａ、以下同様）のｃＤＮＡから、下記プライマーセット２を用いたＰＣＲによって、ＣＯコード領域（ＣＤＳ）を増幅させた。なお、下記プライマーセット２において、フォワードプライマー（配列番号１１）およびリバースプライマー（配列番号１２）は、共に、５’側にＢａｍＨＩサイトを備え、リバースプライマーは、終止コドンＴＧＡをＧＣＡに置き換える配列とした。この増幅物の概略を図１に示す。同図における数値は、増幅物の長さを示す。
（プライマーセット２）
フォワードプライマー ５’−AGGATCCGTATGTTGAAACAAGAGAGTAAC−３’
リバースプライマー ５’−TGGATCCTGCGAATGAAGGAACAATCCCA−３’
Next, the CO coding region (CDS) was amplified from the cDNA of Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. Accession Columbia (hereinafter the same) by PCR using the following primer set 2. In the primer set 2 below, both the forward primer (SEQ ID NO: 11) and reverse primer (SEQ ID NO: 12) have a BamHI site on the 5 ′ side, and the reverse primer has a sequence that replaces the stop codon TGA with GCA. . An outline of the amplified product is shown in FIG. The numerical value in the figure shows the length of the amplified product.
(Primer set 2)
Forward primer 5'-AGGATCCGTATGTTGAAACAAGAGAGTAAC-3 '
Reverse primer 5'-TGGATCCTGCGAATGAAGGAACAATCCCA-3 '
この増幅物をｐＣＲ４−ＴＯＰＯ（商品名、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）にサブクローニングし、ＢａｍＨＩで処理した後、この断片を前述のｐＢＥ２１１３／ＲｅｐのＢａｍＨＩサイトにライゲーションした。このようにして得られた組換え発現ベクターを、ｐＢＥ２１１３／ＣＯ−Ｒｅｐ、または、３５Ｓ：ＣＯ−Ｒｅｐという。ｐＢＥ２１１３／ＣＯ−Ｒｅｐは、前述のように、Ｃｏ−Ｒｅｐ遺伝子の増幅物をｐＢＥ２１１３ＮｏｔのＢａｍＨＩサイトに挿入しているため、Ｃｏ−Ｒｅｐ遺伝子の増幅物が、Ｔ−ＤＮＡのＲＢとＬＢとに挟まれた構造となる。 This amplified product was subcloned into pCR4-TOPO (trade name, manufactured by Invitrogen) and treated with BamHI, and then this fragment was ligated to the BamHI site of the aforementioned pBE2113 / Rep. The recombinant expression vector thus obtained is referred to as pBE2113 / CO-Rep or 35S: CO-Rep. As described above, since pBE2113 / CO-Rep inserts the amplified product of Co-Rep gene into the BamHI site of pBE2113Not, the amplified product of Co-Rep gene is sandwiched between RB and LB of T-DNA. Structure.
この発現ベクターは、ＲＢとＬＢとの間にプロモーターＰ３５ＳとＣＯ−Ｒｅｐ遺伝子とが挿入され、前遺伝子は前記プロモーターの制御下に配置されている。したがって、従来公知の方法に従って、これらの発現ベクターを導入したアグロバクテリウムを植物体に感染させれば、ＲＢからその下流に位置するＬＢまでの領域が、組換えにより植物体のゲノム中に組み込まれる。そして、組み込まれた発現プロモーターＰ３５Ｓの制御下にあるＣＯ−Ｒｅｐ遺伝子（キメラ遺伝子）が過剰に発現することとなる。 In this expression vector, a promoter P35S and a CO-Rep gene are inserted between RB and LB, and the previous gene is placed under the control of the promoter. Therefore, when Agrobacterium introduced with these expression vectors is infected into a plant according to a conventionally known method, the region from RB to LB located downstream thereof is integrated into the genome of the plant by recombination. It is. Then, the CO-Rep gene (chimeric gene) under the control of the incorporated expression promoter P35S is overexpressed.
＜形質転換体の作製＞
作製したｐＢＥ２１１３／ＣＯ−Ｒｅｐを、前記実施例１と同様にしてアグロバクテリウム法によりバレイショに導入した。そして、同様にして、薬剤による仮選択を行い、続いて、ＲＮＡゲルブロットハイブリダイゼーションにより、ＣＯ−Ｒｅｐ遺伝子が発現している株を選択した。ＲＮＡゲルブロットハイブリダイゼーションの結果を、図５に示す。同図は、薬剤選択した形質転換体のＲＮＡゲルブロッティングハイブリダイゼーションの結果を示す図である。同図において、上欄が、ＣＯ−ＲｅｐｍＲＮＡの結果であり、下欄は、泳動したＲＮＡ量を確認するためのコントロールの結果である。そして、同図の結果から、計２２株（７，８，１０，１１，１５，１６，１７，１８，２６，２８，３１，３５，３７，５４，５６，５７，５８，５９，６３，７１，７３，７４）の形質転換体を、遺伝子（ｐＢＥ２１１３／ＣＯ−ＲｅｐのＲＢからＬＢの領域）が導入された植物体として選択した。
<Production of transformant>
The produced pBE2113 / CO-Rep was introduced into the potato by the Agrobacterium method in the same manner as in Example 1. Similarly, provisional selection with a drug was performed, and subsequently, a strain expressing the CO-Rep gene was selected by RNA gel blot hybridization. The results of RNA gel blot hybridization are shown in FIG. The figure shows the results of RNA gel blotting hybridization of transformants selected for drugs. In the figure, the upper column is the result of CO-Rep mRNA, and the lower column is the result of the control for confirming the amount of migrated RNA. And from the result of the figure, a total of 22 strains (7, 8, 10, 11, 15, 16, 17, 18, 26, 28, 31, 35, 37, 54, 56, 57, 58, 59, 63, 71, 73, 74) was selected as a plant into which a gene (RB to LB region of pBE2113 / CO-Rep) was introduced.
各形質転換体（２２株）からシュートを切り取り、前記実施例１と同様に、培養を行い、各形質転換体について１株から得られた塊茎の形成個数を確認した。これらの結果を、図６に示す。同図は、ｐＢＥ２１１３／ＣＯ−Ｒｅｐ（３５Ｓ：Ｃｏ−Ｒｅｐ）を導入した形質転換体（ｎ＝２２）と、コントロールベクターｐＢＥ２１１３を導入した形質転換体（ｎ＝７０）における塊茎の形成個数の平均を示すグラフである。同図において、バーは、標準誤差を示し、＊は、ｔ検定によるＰ値が０．０５以下であることを示す。 Shoots were cut from each transformant (22 strains) and cultured in the same manner as in Example 1 to confirm the number of tubers formed from one strain for each transformant. These results are shown in FIG. The figure shows the average number of tubers formed in a transformant introduced with pBE2113 / CO-Rep (35S: Co-Rep) (n = 22) and a transformant introduced with control vector pBE2113 (n = 70). It is a graph which shows. In the figure, the bar indicates standard error, and * indicates that the P value by t test is 0.05 or less.
このようにＣｏ−Ｒｅｐ遺伝子を過剰発現させた形質転換体は、形成される塊茎の個数がコントロール（１００％）よりも約２５％程度少ない結果となった。この結果から、Ｃｏ−Ｒｅｐ遺伝子の発現により、塊茎の形成を抑制できることがわかる。 Thus, the transformant overexpressing the Co-Rep gene resulted in about 25% fewer tubers than the control (100%). From this result, it can be seen that tuber formation can be suppressed by the expression of the Co-Rep gene.
本発明によれば、例えば、目的に応じて、ＬＫＰ２遺伝子を含む塊茎形成促進ベクターまたは前記キメラ遺伝子（ＣＯ−Ｒｅｐ遺伝子）を含む塊茎形成抑制ベクターを植物に導入することにより、塊茎形成が促進または抑制された植物を作出できる。このようにして得られる植物は、例えば、植物体１個あたりの塊茎個数が増加し、または、植物体１個当たりの塊茎個数を減少することができる。したがって、本発明は、目的に応じて、植物の塊茎形成を制御でき、効率良く目的の植物資源を作出できることから、例えば、農業の分野において、極めて有用な技術といえる。 According to the present invention, for example, depending on the purpose, tuber formation promotion vector containing LKP2 gene or tuber formation suppression vector containing the chimeric gene (CO-Rep gene) is introduced into a plant to promote tuber formation or Can produce suppressed plants. In the plant thus obtained, for example, the number of tubers per plant body can be increased, or the number of tubers per plant body can be decreased. Accordingly, the present invention can be said to be an extremely useful technique in the field of agriculture, for example, because tuber formation of plants can be controlled according to the purpose and target plant resources can be efficiently produced.
Claims (7)
バレイショに、ＣＯＮＳＴＡＮＳ遺伝子とＥＡＲモチーフのＤＮＡ配列とを含むキメラ遺伝子が挿入された塊茎形成制御ベクターを導入することを特徴とする製造方法。 A method for producing a potato with suppressed tuber formation,
In potato production method characterized by introducing a chimeric gene inserted tuber formation control vector containing a DNA sequence of the CONSTANS gene and EAR motif.
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