JP5219025B2 - セスキテルペンシンターゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸 - Google Patents

Description

本発明は、セスキテルペンシンターゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸、セスキテルペンシンターゼ活性を有するポリペプチド、かかるポリペプチドを用いて有用セスキテルペンを製造する方法などに関するものである。

東南アジアを原生とする多年生根ハーブである野生ハナショウガは、苞に含まれる乳状物質が天然のシャンプーとして、あるいはいくつかの市販のシャンプーの成分として用いられてきたので、「シャンプージンジャー」としても広く知られている。加えて、シャンプージンジャーの新鮮な地下茎は、捻挫、消化不良、歯痛などの民間薬として広く用いられてきた。また、その香りは精神的なリフレッシュ作用を有するともいわれる。その幅広い特性のため、シャンプージンジャーは、世界中の多くの熱帯および亜熱帯地域において栽培されている。

地下茎エッセンシャルオイルに豊富に存在するテルペノイドは薬理学的に有用であることから、近年、シャンプージンジャーは大変な注目を浴びている。テルペノイドは、多種多様な構造を有する天然の植物生成物である。テルペノイドの大部分は、植物と病原体との相互作用（非特許文献１）、植物と草食動物との相互作用（非特許文献２）、および植物と植物との相互作用（非特許文献３）において必須の役割を担うと考えられている。テルペノイドは、抗菌剤および抗癌剤としても有効であり、例えば、モノテルペノイド（Ｃ_１０）は抗発癌剤リモネン（非特許文献４）、セスキテルペノイド（Ｃ_１５）は抗マラリア薬アルテミシニン（非特許文献５）、そしてジテルペノイド（Ｃ_２０）は抗癌剤タクソール（非特許文献６）の有効成分として用いられている。

シャンプージンジャーの地下茎オイルは、主成分としてゼルンボン、α−フムレンおよびカンフェンを含むモノテルペン、セスキテルペン、およびジテルペンの複雑な混合物を含有する（非特許文献７）。シャンプージンジャーにおいて専ら見出される固有のセスキテルペンであるゼルムボンは、大腸癌および皮膚癌に対する有望な抗癌剤とされてきた（非特許文献８および９）。フムレン誘導体である５−ヒドロキシゼルンボンは、マウスのマクロファージにおいて、リポ多糖により誘導される酸化窒素生成を阻害することから、抗炎症剤としての可能性が示唆されている（非特許文献１０）。しかしながら、これらの有用性にも関わらず、シャンプージンジャーにおけるテルペノイドの生合成のメカニズムおよび生理的機能については、ほとんど分かっていない。

天然の植物において生成されるテルペノイドは少量であるため、精製により収量は少なく、そして純度は低くなり、かつ植物廃棄物が大量に生じる。さらに、テルペノイドは構造が複雑であるため、その生合成は難しく、高価である（非特許文献１１）。これらの問題を解決するため、植物を用いてテルペノイドを大量に生成する方法の開発が望まれている。

植物におけるテルペノイドの生合成経路は、Ｃ_１０、Ｃ_１５、およびＣ_２０非環状前駆体であるゲラニルジリン酸（ＧＰＰ）、ファルネシルジリン酸（ＦＰＰ）およびゲラニルゲラニルジリン酸（ＧＧＰＰ）のそれぞれモノテルペン、セスキテルペンおよびジテルペンへの変換からなり（非特許文献１２および１３）、これらの変換は、テルペン（テルペノイド）シンターゼ（ＴＰＳ）により触媒される。かかるテルペンシンターゼのうち、ファルネシルジリン酸をα−フムレンおよびβ−カリオフィレンに変換する酵素として、α−フムレンシンターゼが知られているが、α−フムレンを主生成物として得ることのできるα−フムレンシンターゼは同定されていなかった。また、かかるテルペンシンターゼのうち、β−ユーデスモールを主生成物として得ることのできる酵素も同定されていなかった。
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本発明の解決課題は、有用テルペン類を生成する酵素およびそれをコードする核酸を提供し、それらを利用して有用テルペン類を大量に製造することであった。

本発明者は、上記事情に鑑み鋭意研究を重ねた結果、ハナショウガから次のような酵素をコードする核酸を単離することに先行した。すなわち、ファルネシルジリン酸からβ−カリオフィレンをほとんど生成することなくα−フムレンを生成することのできるα−フムレンシンターゼをコードする核酸の単離に成功した。さらに本発明者は、ファルネシルジリン酸から副産物をほとんど生成することなくβ−ユーデスモールを生成することのできるセスキテルペンシンターゼをコードする核酸の単離に成功した。これらのことから本発明者は本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は：
（１）セスキテルペンシンターゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸であって、
（ａ）配列番号：１〜６のいずれかのヌクレオチド配列を有する核酸、
（ｂ）配列番号：１〜６のいずれかのヌクレオチド配列において、１または数個のヌクレオチドが欠失、置換若しくは付加されたヌクレオチド配列を有する核酸、
（ｃ）（ａ）または（ｂ）の核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る核酸、および
（ｄ）配列番号：１〜６のいずれかのヌクレオチド配列と５０％以上の相同性を有するヌクレオチド配列を有する核酸、
からなる群より選択される、核酸；
（２）α−フムレンシンターゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸であって、
（ａ）配列番号：１のヌクレオチド配列を有する核酸、
（ｂ）配列番号：１のヌクレオチド配列において、１または数個のヌクレオチドが欠失、置換若しくは付加されたヌクレオチド配列を有する核酸、
（ｃ）（ａ）または（ｂ）の核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る核酸、および
（ｄ）配列番号：１のヌクレオチド配列と５０％以上の相同性を有するヌクレオチド配列を有する核酸、
からなる群より選択される、（１）記載の核酸；
（３）配列番号：１のヌクレオチド配列からなる（２）記載の核酸；
（４）β−ユーデスモールシンターゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸であって、
（ａ）配列番号：５のヌクレオチド配列を有する核酸、
（ｂ）配列番号：５のヌクレオチド配列において、１または数個のヌクレオチドが欠失、置換若しくは付加されたヌクレオチド配列を有する核酸、
（ｃ）（ａ）または（ｂ）の核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る核酸、および
（ｄ）配列番号：５のヌクレオチド配列と５０％以上の相同性を有するヌクレオチド配列を有する核酸、
からなる群より選択される、（１）記載の核酸；
（５）配列番号：５のヌクレオチド配列からなる（２）記載の核酸；
（６）セスキテルペンシンターゼ活性を有するポリペプチドであって、
（ａ）配列番号：８〜１３のいずれかのアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（ｂ）配列番号：８〜１３のいずれかのアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチド、および
（ｃ）配列番号：８〜１３のいずれかのアミノ酸配列と５０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド、
からなる群より選択される、ポリペプチド；
（７）α−フムレンシンターゼ活性を有するポリペプチドであって、
（ａ）配列番号：８のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（ｂ）配列番号：８のアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチド、および
（ｃ）配列番号：８のアミノ酸配列と５０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド、
からなる群より選択される、（６）記載のポリペプチド；
（８）配列番号：８のアミノ酸配列からなる（７）記載のポリペプチド；
（９）β−ユーデスモールシンターゼ活性を有するポリペプチドであって、
（ａ）配列番号：１２のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（ｂ）配列番号：１２のアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチド、および
（ｃ）配列番号：１２のアミノ酸配列と５０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド、
からなる群より選択される、（６）記載のポリペプチド；
（１０）配列番号：１２のアミノ酸配列からなる（９）記載のポリペプチド；
（１１）（１）〜（５）のいずれかに記載の核酸を含むベクター；
（１２）（１）〜（５）のいずれかに記載の核酸または（１１）記載のベクターを細胞または植物に導入し、細胞または植物を培養または成長させることを特徴とする、セスキテルペンの製造方法；
（１３）（２）または（３）記載の核酸またはそれを含むベクターを細胞または植物に導入し、細胞または植物を培養または成長させることを特徴とする、α−フムレンの製造方法；
（１４）（４）または（５）記載の核酸またはそれを含むベクターを細胞または植物に導入し、細胞または植物を培養または成長させることを特徴とする、β−ユーデスモールの製造方法；
（１５）（６）記載のポリペプチドを基質と反応させることを特徴とする、セスキテルペンの製造方法；
（１６）（７）または（８）記載のポリペプチドを基質と反応させることを特徴とする、α−フムレンの製造方法；
（１７）（９）または（１０）記載のポリペプチドを基質と反応させることを特徴とする、β−ユーデスモールの製造方法
を提供するものである。

本発明により、テルペン類を生産する酵素、それらをコードする核酸、それらを用いるテルペン類の大量生産方法などが提供される。詳細には、セスキテルペン類を生産する酵素、それらをコードする核酸、それらを用いるセスキテルペン類の大量生産方法などが提供される。セスキテルペンには香料や防虫剤として有用なものが多く、例えば、スズランの香りを有するファルネソール、ホップの主成分であるフムレン類、回虫駆除薬であるα−サントニンなどがある。さらに上述のように、シャンプージンジャーにおいて専ら見出される固有のセスキテルペンであるゼルムボンは大腸癌および皮膚癌に対する抗癌剤として有望視されており、フムレン誘導体である５−ヒドロキシゼルンボンは抗炎症剤としての可能性が示唆されている。特に本発明により、抗菌作用などの生理活性を有するα−フムレンを主生成物として生成することのできるポリペプチド、それをコードする核酸、該核酸を含むベクターや細胞、これらを用いてα−フムレンを製造する方法などが提供される。さらに本発明により、抗うつ作用などの生理活性を有するβ−ユーデスモールを主生成物として生成することのできるポリペプチド、それをコードする核酸、該核酸を含むベクターや細胞、これらを用いてβ−ユーデスモールを製造する方法などが提供される。

本発明は、１の態様において、セスキテルペンシンターゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸であって、
（ａ）配列番号：１〜６のいずれかのヌクレオチド配列を有する核酸、
（ｂ）配列番号：１〜６のいずれかのヌクレオチド配列において、１または数個のヌクレオチドが欠失、置換若しくは付加されたヌクレオチド配列を有する核酸、
（ｃ）（ａ）または（ｂ）の核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る核酸、および
（ｄ）配列番号：１〜６のいずれかのヌクレオチド配列と少なくとも５０％以上の相同性を有するヌクレオチド配列を有する核酸、
からなる群より選択される、核酸に関するものである。本明細書において核酸とは、１本鎖または２本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡを意味する。本発明の核酸は、当業者に既知の種々の方法により製造および取得され得る。

セスキテルペンシンターゼ活性とは、基質からセスキテルペン類を生成する反応を触媒する能力または性質をいい、基質は特に限定されない。例えば、セスキテルペンシンターゼ活性とは、ファルネシルジリン酸を基質としてセスキテルペン類を生成する反応を触媒する能力または性質をいう。セスキテルペンシンターゼ活性には、例えば、後で説明するようなα−フムレンシンターゼ活性やβ−ユーデスモールシンターゼ活性が包含される。セスキテルペンシンターゼは、上記活性を有するいずれかのポリペプチド（酵素）を意味する。また、セスキテルペン類も当業者に公知であり、α−フムレンやβ−ユーデスモールなどが包含される。

α−フムレンシンターゼ活性とは、基質、好ましくはファルネシルジリン酸をα−フムレンに変換する反応を触媒する能力または性質をいう。従って、α−フムレンシンターゼ活性を有するポリペプチド（酵素）、すなわちα−フムレンシンターゼは、基質、例えばファルネシルジリン酸をα−フムレンに変換する反応を触媒することができるポリペプチドであればいずれのものであってもよい。α−フムレンシンターゼ活性は、例えば、ファルネシルジリン酸と該ポリペプチドとをインキュベーションして、得られたα−フムレンの存在または量を調べることにより、決定することができる。好ましくは、本発明の核酸は、コードされるポリペプチドが、基質、例えばファルネシルジリン酸からα−フムレンを主生成物（例えば、全生成物の５０％より多い）として変換することができるものである。本発明の核酸を、例えば、植物に導入して、植物において産生されるα−フムレンの量を増大させること、あるいは本発明の核酸をベクター中に組み込んで大腸菌などの細胞に導入してα−フムレンを大量に製造することなどが可能になる。
などが可能になる。

β−ユーデスモールシンターゼ活性とは、基質、好ましくはファルネシルジリン酸をβ−ユーデスモールに変換する反応を触媒する能力または性質をいう。従って、β−ユーデスモールシンターゼ活性を有するポリペプチド（酵素）、すなわちβ−ユーデスモールシンターゼは、基質、例えばファルネシルジリン酸をβ−ユーデスモールに変換する反応を触媒することができるポリペプチドであればいずれのものであってもよい。β−ユーデスモールシンターゼ活性は、例えば、ファルネシルジリン酸と該ポリペプチドとをインキュベーションして、得られたβ−ユーデスモールの存在または量を調べることにより、決定することができる。好ましくは、本発明の核酸は、コードされるポリペプチドが、基質、例えばファルネシルジリン酸からβ−ユーデスモールを主生成物（例えば、全生成物の５０％より多い）として変換することができるものである。本発明の核酸を、例えば、植物に導入して、植物において産生されるβ−ユーデスモールの量を増大させること、あるいは本発明の核酸をベクター中に組み込んで大腸菌などの細胞に導入してβ−ユーデスモールを大量に製造することなどが可能になる。

本発明の核酸は、具体的には、配列番号：１〜６のいずれかのヌクレオチド配列を有する核酸；配列番号：１〜６のいずれかのヌクレオチド配列において、１個以上、好ましくは、１または数個、例えば、２、３、４、５、６、７、８、または９個程度のヌクレオチドが欠失、置換若しくは付加されたヌクレオチド配列を有する核酸；上記核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る核酸；ならびに配列番号：１〜６のいずれかのヌクレオチド配列と少なくとも５０％、好ましくは、６０、７０、７５、８０、８５％以上、さらに好ましくは９０、９３、９６、９９％、または９９．５％以上の相同性を有するヌクレオチド配列を有する核酸などである。いずれのヌクレオチド配列を有する場合であっても、本発明の核酸は、セスキテルペンシンターゼ活性を有するポリペプチドをコードするものである。

上記ストリンジェントな条件としては、例えば、J. Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition", 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Pressに記載されるような条件が挙げられる。例えば、６×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液（Denhardt's solution）、０．５％ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡを含む溶液中６８℃でプローブとハイブリダイズさせた後、洗浄条件を２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中室温から０．１×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ中６８℃まで変化させる条件などが挙げられる。

上記ヌクレオチド配列の相同性は、例えば、Ｇｅｎｄｏｃなどのプログラムを用いて測定することができる。

本発明におけるα−フムレンシンターゼ活性を有する酵素をコードする好ましい核酸は：配列番号：１のヌクレオチド配列を有する核酸；配列番号：１のヌクレオチド配列において、１個以上、好ましくは、１または数個、例えば、２、３、４、５、６、７、８、または９個程度のヌクレオチドが欠失、置換若しくは付加されたヌクレオチド配列を有する核酸；上記核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る核酸；ならびに配列番号：１のヌクレオチド配列と少なくとも５０％、好ましくは、６０、７０、７５、８０、８５％以上、さらに好ましくは９０、９３、９６、９９％、または９９．５％以上の相同性を有するヌクレオチド配列を有する核酸である。

本発明におけるα−フムレンシンターゼ活性を有する酵素をコードする、さらに好ましい核酸は配列番号：１に示すヌクレオチド配列からなる核酸である。

本発明におけるβ−ユーデスモールシンターゼ活性を有する酵素をコードする好ましい核酸は：配列番号：５のヌクレオチド配列を有する核酸；配列番号：５のヌクレオチド配列において、１個以上、好ましくは、１または数個、例えば、２、３、４、５、６、７、８、または９個程度のヌクレオチドが欠失、置換若しくは付加されたヌクレオチド配列を有する核酸；上記核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る核酸；ならびに配列番号：５のヌクレオチド配列と少なくとも５０％、好ましくは、６０、７０、７５、８０、８５％以上、さらに好ましくは９０、９３、９６、９９％、または９９．５％以上の相同性を有するヌクレオチド配列を有する核酸である。

本発明におけるβ−ユーデスモールシンターゼ活性を有する酵素をコードする、さらに好ましい核酸は配列番号：５に示すヌクレオチド配列からなる核酸である。

本発明は、もう１つの態様において、セスキテルペンシンターゼ活性を有するポリペプチドであって、
（ａ）配列番号：８〜１３のいずれかのアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（ｂ）配列番号：８〜１３のいずれかのアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチド、および
（ｃ）配列番号：８〜１３のいずれかのアミノ酸配列と５０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド、
からなる群より選択される、ポリペプチドに関するものである。本発明のポリペプチドは、上述のα−フムレンシンターゼ活性を有するものである。従って、本発明のポリペプチドを用いて、ファルネシルジリン酸からα−フムレンおよびβ−カリオフィレンを得ることができる。例えば、ファルネシルジリン酸を含む細胞や植物などに本発明のポリペプチドを注入して、得られるα−フムレンおよびβ−カリオフィレンの量を増大させること、あるいはα−フムレンおよびβ−カリオフィレンの生成速度を促進させることなどもできる。好ましくは、本発明のポリペプチドは、ファルネシルジリン酸からα−フムレンを主生成物として、例えば、生成物の５０％より多く、好ましくは、６０、７０、７５、８０、８５、９０、９３、９６、または９９％以上で変換することができるものである。

本発明のポリペプチドは、具体的には、配列番号：８〜１３のいずれかのアミノ酸配列を有するポリペプチド、配列番号：８〜１３のいずれかのアミノ酸配列において、１個以上、好ましくは、１または数個、例えば、２、３、４、５、６、７、８、または９個程度のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチド、および配列番号：８〜１３のいずれかのアミノ酸配列と少なくとも５０％以上、好ましくは、６０、７０、７５、８０、８５％以上、さらに好ましくは９０、９３、９６、９９％、または９９．５％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド、上記本発明のα−フムレンシンターゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸によりコードされるポリペプチドなどである。いずれのアミノ酸配列を有する場合であっても、本発明のポリペプチドは、α−フムレンシンターゼ活性を有するものである。

上記アミノ酸配列の相同性は、例えば、Ｇｅｎｄｏｃを用いて測定することができる。

本発明におけるα−フムレンシンターゼ活性を有する好ましい酵素は：配列番号：８のアミノ酸配列を有するポリペプチド；配列番号：８のアミノ酸配列において、１個以上、好ましくは、１または数個、例えば、２、３、４、５、６、７、８、または９個程度のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチド；ならびに配列番号：８のアミノ酸配列と少なくとも５０％以上、好ましくは、６０、７０、７５、８０、８５％以上、さらに好ましくは９０、９３、９６、９９、９９．５％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドである。

本発明におけるα−フムレンシンターゼ活性を有する、さらに好ましい酵素は配列番号：８のアミノ酸配列からなるポリペプチドである。

本発明におけるβ−ユーデスモールシンラーゼ活性を有する好ましい酵素は：配列番号：１２のアミノ酸配列を有するポリペプチド；配列番号：１２のアミノ酸配列において、１個以上、好ましくは、１または数個、例えば、２、３、４、５、６、７、８、または９個程度のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチド；ならびに配列番号：１２のアミノ酸配列と少なくとも５０％以上、好ましくは、６０、７０、７５、８０、８５％以上、さらに好ましくは９０、９３、９６、９９、９９．５％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドである。

本発明におけるβ−ユーデスモールシンターゼ活性を有する、さらに好ましい酵素は配列番号：１２のアミノ酸配列からなるポリペプチドである。

従って、本発明は、さらなる態様において、上記本発明のセスキテルペンシンターゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸に関するものである。このような核酸も本明細書にいう本発明の核酸に含まれる。本発明はさらなる態様において、上記本発明のα−フムレンシンターゼ活性あるいはβ−ユーデスモールシンターゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸に関するものである。

本発明は、別の態様において、上記本発明の核酸を含むベクターに関するものである。本発明のベクターは、上記本発明の核酸を含んでいればいずれのものであってもよい。該核酸以外の構成要素は、該ベクターを用いる細胞などの対象、目的など種々の条件に応じて、適宜選択され得る。本発明のベクターを例えば、大腸菌のごとき細菌の細胞、ショウガ植物のごとき植物の細胞などに導入し、産生されたセスキテルペンシンターゼ活性を有するポリペプチドを回収することにより、本発明のセスキテルペンシンターゼ活性を有するポリペプチドを得ることもできる。

特に、配列番号：１のヌクレオチド配列を有する核酸；配列番号：１のヌクレオチド配列において、１個以上、好ましくは、１または数個、例えば、２、３、４、５、６、７、８、または９個程度のヌクレオチドが欠失、置換若しくは付加されたヌクレオチド配列を有する核酸；上記核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る核酸；あるいは配列番号：１のヌクレオチド配列と少なくとも５０％、好ましくは、６０、７０、７５、８０、８５％以上、さらに好ましくは９０、９３、９６、９９％、または９９．５％以上の相同性を有するヌクレオチド配列を有する核酸、あるいはまた配列番号：１に示すヌクレオチド配列からなる核酸を含むベクターを細胞に導入して、基質、例えばファルネシルジリン酸を含む培地にて培養することにより、α−フムレンを主生成物として得ることができる。ファルネシルジリン酸からα−フムレンまたはβ−ユーデスモールへの変換を促進する薬剤、例えばＭｇＣｌ_２、ＭｎＣｌ_２、ＮａＷＯ_４、ＮａＦなどが培地に含有されていてもよい。

さらに、配列番号：５のヌクレオチド配列を有する核酸；配列番号：５のヌクレオチド配列において、１個以上、好ましくは、１または数個、例えば、２、３、４、５、６、７、８、または９個程度のヌクレオチドが欠失、置換若しくは付加されたヌクレオチド配列を有する核酸；上記核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る核酸；あるいは配列番号：５のヌクレオチド配列と少なくとも５０％、好ましくは、６０、７０、７５、８０、８５％以上、さらに好ましくは９０、９３、９６、９９％、または９９．５％以上の相同性を有するヌクレオチド配列を有する核酸、あるいはまた配列番号：５に示すヌクレオチド配列からなる核酸を含むベクターを細胞に導入して、基質、例えばファルネシルジリン酸を含む培地にて培養することにより、β−ユーデスモールを主生成物として得ることができる。

本発明は、さらなる態様において、上記本発明の核酸または上記本発明のベクターが導入された細胞に関するものである。上記本発明の核酸またはベクターは、当該技術分野で既知の方法を用いて細胞に導入され得る。ベクターを導入される細胞はいずれのものであってもよく特に制限はないが、例えば、ショウガに属する植物などの植物細胞、大腸菌などの細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞、哺乳類細胞などが挙げられる。かかる細胞を培養して、産生されたポリペプチドを回収することにより、上記本発明のポリペプチドを得ることができる。

本発明は、もう１つの態様において、上記本発明の核酸または上記本発明のベクターを導入された植物に関するものである。かかる植物は、当業者に既知の方法により生成され得る。このような本発明の植物は、その内部でセスキテルペンシンターゼ、例えばα−フムレンシンターゼやβ−ユーデスモールシンターゼを産生し、それにより通常の植物と比較して増大した量のセスキテルペン類、例えばα−フムレンやβ−ユーデスモールを産生する。

α−フムレンは抗菌作用を有することが知られているので、本発明のα−フムレンシンターゼをコードする核酸またはベクターを含む植物は、用いられる農薬の量を低減することができるなどの効果を有する。さらにβ−ユーデスモールは抗うつ作用を有するといわれており、本発明のβ−ユーデスモールシンターゼをコードする核酸またはベクターを含む植物から放たれるβ−ユーデスモール含有精油の作用によりうつ病を緩和する効果も期待される。

α−フムレンを製造する際に使用する細胞や植物は、例えば、メバロン酸経路のごときファルネシルジリン酸の産生を促進する経路の反応を触媒する酵素をコードする核酸などをさらに含んでいてもよく、そのことによってα−フムレンやβ−ユーデスモールなどのセスキテルペン類の増産が可能となる。

本発明は、別の態様において、上記本発明の核酸またはベクターを含む細胞を培養して、あるいは上記本発明の核酸またはベクターを含む植物を成長させて、α−フムレンシンターゼ活性を有するポリペプチドやβ−ユーデスモールシンターゼ活性を有するポリペプチドなどのセスキテルペンシンターゼ活性を有するポリペプチドを得る方法に関するものである。細胞の培養条件は、細胞の種類など種々の条件に応じて適宜選択され得る。植物の生長条件も同様に適宜選択されうる。上記方法にて得られたポリペプチドの純度を上げるために、当業者に公知の生成方法を適用することができる。本発明は、さらなる態様において、上記のセスキテルペンシンターゼを得る方法により得ることのできる、セスキテルペンシンターゼ活性を有するポリペプチドにも関するものである。

本発明は、別の態様において、上記本発明のポリペプチドまたは上記方法により得ることのできるポリペプチドを基質と反応させて、セスキテルペン類を製造する方法に関するものである。例えば、α−フムレンシンターゼ活性を有するポリペプチドをファルネシルジリン酸と反応させることによりα−フムレンを製造することができ、β−ユーデスモールシンターゼ活性を有するポリペプチドをファルネシルジリン酸と反応させることによりβ−ユーデスモールを製造することができる。好ましくは、本発明の方法において、α−フムレンが主生成物であり、生成物の５０％より多く、好ましくは、６０、７０、７５、８０、８５、９０、９３、９６、または９９％以上で生じる。好ましくは、本発明の方法において、β−ユーデスモールが主生成物であり、生成物の５０％より多く、好ましくは、６０、７０、７５、８０、８５、９０、９３、９６、または９９％以上で生じる。

本発明のセスキテルペン類を製造する方法は、得られたセスキテルペン類を精製する工程を含んでいてもよい。精製に用いる手段・方法は、当業者によく知られている。さらに本発明は、さらなる態様において、上記のセスキテルペン類の製造方法により得ることのできるセスキテルペン類に関するものである。

以下に実施例を示して本発明を具体的かつ詳細に説明するが、実施例は本発明を限定するものと解してはならない。

（１）α−フムレンシンターゼｃＤＮＡの取得
ハナショウガの地下茎から、Spectrum（商標）Plant Total RNA Kit（Sigma-Aldrich）を用いてトータルＲＮＡを調製した。SuperScript（商標）III First-strand Synthesis Kit（Invitrogen）を用いて、ポリ（ｄＴ）プライミングにより、ＲＮＡ ３μｇを反応混合溶液２０μｌ中にてｃＤＮＡに逆転写した。ハナショウガと密接に関連する被子植物のセスキテルペンシンターゼの２つの保存ドメインの配列に基づき、以下のプライマーペアを設計した：５’−ＡＹＣＷＹＴＴＹＧＡＩＲＡＩＧＡＲＡＴ−３’（フォワード；配列番号：１４）および５’−ＴＡＩＧＨＲＴＣＡＷＡＩＲＴＲＴＣＲＴＣ−３’（リバース；配列番号：１５）。ｃＤＮＡ １μｌ、１μＭ 各プライマー、２００μＭ 各ｄＮＴＰ、および１Ｕ ＥｘＴａｇポリメラーゼ（TaKaRa）を含む反応混合溶液 ５０μｌを用いて、１次ＰＣＲ反応を以下の条件で行った：変性９４℃で２分間、次に、９４℃３０秒、３５℃で１分３０秒、７２℃で１分を４サイクル、９４℃で３０秒、４０℃で１分３０秒、７２℃で１分を３０サイクル、最後に７２℃で３分間伸長。得られた１次反応溶液 ５μｌを鋳型として用い、同じ条件にて２次ＰＣＲ反応を行い、６７０ｂｐのフラグメントを得た。得られたフラグメントを精製し、pGEM-Teasy vector（Promega）にクローン化して配列決定した。全長ｃＤＮＡを単離するために、Smart RACE cDNA Amplification Kit（BD Biosciences Clontech）、５’−ＧＣＡＴＣＴＣＣＡＴＴＣＡＡＧＧＴＣＧＧＣＡＡ−３’（５’ＲＡＣＥ；配列番号：１６）および５’−ＧＡＧＣＡＧＣＣＴＴＴＡＧＣＡＡＴＡＧＡＧＧＴＧＴＣ−３’（３’ＲＡＣＥ；配列番号：１７）、ならびにAdvantage（登録商標）2 Polymerase Mix（Clontech）を用いて、製造元の指示に従いフラグメントを５’末端および３’末端に向かって伸長させ、６種類の異なる全長ｃＤＮＡを得た。これらのｃＤＮＡのヌクレオチド配列を配列番号：１〜６に、該ｃＤＮＡによりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列を配列番号：８〜１３に示す。また、配列番号：１により特定されるｃＤＮＡをＺＳＳ１と命名した。配列番号：１のヌクレオチド配列に対する配列番号：２〜６のヌクレオチド配列の相同性、および配列番号：８のアミノ酸配列に対する配列番号：９〜１３のアミノ酸配列の相同性をＧｅｎｄｏｃを用いて決定した。結果をそれぞれ表１および２に示す。

ＺＳＳ１は、推定分子量６４．５ｋＤａ、およびＰＩ ５．２５を有する５４８アミノ酸からなるポリペプチドをコードする１６４７ｂｐ（終止コドンを含む）の推定ＯＲＦを含有し、既知のセスキテルペンシンターゼと類似するものであった。ＧｅｎＢａｎｋデータベースの配列類似性サーチにより、ＺＳＳ１は、Zingiber officinale由来のゲルマクレンＤシンターゼと最も密接に関連し、６３％のアミノ酸配列同一性を有することが示された。有意な同一性は、他の被子植物種由来のセスキテルペンシンターゼについても観察され、これは５０％（Elaeis oleifera セスキテルペンシンターゼ）から３４％（Arabidopsis thaliana β−カリオフィレン／α−フムレンシンターゼ（Chen, F., Tholl, D., Auria, J.C.D., Farooq, A., Pichersky, E. and Gershenzon, J. (2003) Biosynthesis and emission of terpenoid volatiles from Arabidopsis flowers. The Plant Cell 15: 481-494.））の同一性を示すものであった。アミノ酸配列および系統発生分析（結果は示していない）から、ＺＳＳ１は、被子植物のセスキテルペンおよびジテルペンシンターゼの群であるＴＰＳサブファミリー（Bohlmann, J., Meyer-Gauen, G. and Croteau, R. (1998) Plant terpenoid synthases: molecular biology and phylogenetic analysis. Proc Natl Acad Sci USA 95: 4126-4133.）に属することが分かった。さらに、コードされる色素体輸送ペプチドの明らかな欠失は、多くのセスキテルペンの仮定細胞質生合成部位（Lichtenthaler, H.K. (1999) The 1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate pathway of isoprenoid biosynthesis in plants. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 50: 4765.）と一致することが分かった。ＺＳＳ１ヌクレオチド配列の他の被子植物由来のヌクレオチド配列との相同性を表３に示す。

（２）ＺＳＳ１ゲノムＤＮＡ配列の取得
Plant Genomic Isolation Mini Kit（Qiagen）を用いて、ハナショウガの葉からゲノムＤＮＡを単離した。配列番号：１のｃＤＮＡ配列に基づき設計したプライマーペア、５’−ＡＴＧＧＡＧＡＧＧＣＡＧＴＣＧＡＴＧＧＣＣＣＴＴＧ−３’（フォワード；配列番号：１８）および５’−ＡＡＴＡＡＧＡＡＡＧＧＡＴＴＣＡＡＣＡＡＡＴＡＴＧＡＧＡＧ−３’（リバース；配列番号：１９）を用いてＰＣＲ反応を行い、ＺＳＳ１ゲノムＤＮＡを単離した。ｃＤＮＡとゲノムＤＮＡのヌクレオチド配列の比較により、７個のエクソンおよび６個のイントロンが明らかになった（図１参照）。ＺＳＳ１のイントロンとエクソンの構成は、N. tabacum由来の５−エピ−アリストロチェンシンターゼ、H. muticus由来のベチスピラジエンシンターゼ、およびRicinus communis由来のカスベンシンターゼ（Back, K. and Chappell, J. (1995) Cloning and Bacterial Expression of a Sesquiterpene Cyclase from Hyoscyamus muticus and Its Molecular Comparison to Related Terpene Cyclases. J. Biol. Chem. 13: 7375-7371；Facchini, P.J. and Chappell, J. (1992) Gene family for an elicitor-induces sesquiterpene cyclase in tobacco. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89: 11088-11092.；Mau, C.J and West, C.A. (1994) Cloning of casbene synthase cDNA: evidence for conserved structural features among terpenoid cyclases in plants. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 91: 8497-8501.）のものと非常に類似するものであった。さらに、植物セスキテルペンシンターゼは、高度に保存されたエクソン−イントロン組成を有するという事実（Back, K. and Chappell, J. (1995) Cloning and Bacterial Expression of a Sesquiterpene Cyclase from Hyoscyamus muticus and Its Molecular Comparison to Related Terpene Cyclases. J. Biol. Chem. 13: 7375-7371）と一致するものであった。これらの知見は、被子植物種のジテルペンシンターゼ（Mau and West, 1994）にまで拡大できるものであった。

DNA Walking SpeedUp（商標）Premix Kit（Seegene, Seoul, South Korea）のアニーリングコントロールプライマーセット、および以下の３ペアの標的特異的プライマーを用いたネステッドＰＣＲにより、ＺＳＳ１ゲノムＤＮＡ配列のさらなる上流および下流領域を得た；上流；５’−ＴＣＴＣＴＴＴＡＴＣＡＴＣＣＴＴＴＧＡＧＴＧＧ−３’（配列番号：２０）、５’−ＡＴＣＣＡＧＣＡＡＴＡＴＣＴＡＣＴＴＧＡＴＣＡＣＣ−３’（配列番号：２１）、５’−ＣＴＴＣＡＴＧＡＧＧＡＡＴＡＴＴＧＡＡＴＡＡＡＴＧＴＧＡＧ−３’（配列番号：２２）、および下流；５’−ＡＧＴＣＡＡＣＣＴＴＴＣＡＡＡＡＴＣＡＡＡＴＧ−３’（配列番号：２３）、５’−ＣＧＡＴＡＣＧＴＡＣＡＣＣＡＡＴＴＣＴＧＡＣＡＣ−３’（配列番号：２４）、５’−ＣＡＣＴＡＣＧＡＴＧＡＡＡＧＡＴＡＡＴＡＴＣＴＣＴＴＴＧＧ−３’（配列番号：２５）。得られた増幅産物を配列決定（配列番号：７）し、翻訳開始部位の４３〜４８ｂｐ上流の推定ＴＡＴＡボックス（ＴＴＡＴＡＡＴ）、ならびに２９ｂｐのポリＡテール、ならびに３個の可能性のあるＡＡＴＡＡＡポリアデニル化シグナルを明らかにした（図１参照）。

（３）Ｓ１ヌクレアーゼアッセイ
ＺＳＳ１の転写開始部位を、Ｓ１ヌクレアーゼにより同定した。フォワードプライマー（５’−ＡＴＣＴＣＴＴＣＣＴＴＡＴＣＡＣＣＡＡＣ−３’（配列番号：２６））、およびＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ToYoBo）および１０μＣｉ ［γ−^３２Ｐ］ＡＴＰで５’末端標識したリバースプライマー（５’−ＴＡＡＣＡＧＡＴＡＧＴＡＣＣＧＡＣＡＣＣＣ−３’（配列番号：２７））を用いてＰＣＲ反応を行い、標識ＰＣＲフラグメントを得た。得られた標識フラグメントを、ハナショウガの葉由来のトータルＲＮＡ１００μｇとハイブリダイゼーションバッファー（８０％ ホルムアミド、０．４Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ［ｐＨ６．４］）中７５℃にて１０分間インキュベーションし、３７℃にて一晩さらにインキュベーションし、次に、Ｓ１ヌクレアーゼを用いて消化した。未消化ＤＮＡをエタノールにより沈殿させ、ホルムアミドダイ溶液に溶解し、６％ 変性ポリアクリルアミドゲル上での電気泳動により、フラグメントサイズが１６１〜１６５ｂｐであると決定した。これは、転写開始部位が翻訳開始部位の１１７〜１２２ｂｐ上流に位置することを示唆するものであった。

（４）ＺＳＳ１酵素活性
ＺＳＳ１の全長ＯＲＦを、Advantage（登録商標）HF 2 polymerase（Clontech）、フォワードプライマー５’−ＣＡＣＣＡＴＧＧＡＧＡＧＧＣＡＧＴＣＧＡＴＧＧＣ−３’（配列番号：２８）およびリバースプライマー５’−ＡＡＴＡＡＧＡＡＡＧＧＡＴＴＣＡＡＣＡＡＡＴＡＴＧＡＧＡＧ−３’（配列番号：１９）を用いて増幅し、増幅産物をpET101/DTOPO directional expression vector（Invitrogen）にクローン化した。得られた組換えプラスミドｐＥＴ−ＺＳＳ１でE.coli BL21-CodonPlus（DE3）（Stratagene）を形質転換した。

組換えE.coli細胞を、アンピシリン（５０μｇ／ｍＬ）含有ＬＢ培地５０ｍｌ中、３７℃にてＯＤ_６００＝０．５〜０．６まで増殖させた。次に、ＩＰＴＧ（終濃度１ｍＭ）を添加して、さらに２０時間１８℃にて増殖させた。細胞を遠心分離により回収し、超音波破砕器（Branson W185 D, NY）を用いて、チルド抽出バッファー（５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、５ｍＭ アスコルビン酸ナトリウム、０．５ｍＭ フェニルメチルスルホニルフルライド、５ｍＭ ジチオスレイトール、および１０％（ｖ／ｖ）グリセロールを含む５０ｍＭ ＭＯＰＳＯ、ｐＨ７．０）中１０ｘ１０秒間処理することにより、細胞を粉砕した。細胞片を１５，０００ｇでの遠心分離により除去し、α−フムレンシンターゼを得た。得られた酵素をＨｉｓタグ標識し、ニッケル−ニトリロ三酢酸アガロースカラム（Qiagen）にて製造元の指示に従い精製した。溶出液を、Econopac 10DGカラム（Bio-Rad）を通して、アッセイバッファー（１０ｍＭ ＭＯＰＳＯ、ｐＨ ７．０、１ｍＭ ジチオスレイトール、および１０％（ｖ／ｖ）グリセロール）中に脱塩し、得られた酵素溶液を以下の実験に用いた。

テフロン（登録商標）シールしたスクリューキャップガラス試験管内の揮発性の生成物を捕捉するため、ペンタン０．５ｍＬを重層した。酵素溶液９００μｌ、２０ｍＭ ＭｇＣｌ_２、０．２ｍＭ ＭｎＣｌ_２、０．２ｍＭ ＮａＷＯ_４、０．１ｍＭ ＮａＦ、および２０μＭ［１−^３Ｈ］−（Ｅ，Ｅ）−ＦＰＰ（５５５ＧＢｑ／ｍｏｌ、American Radiolabeled Chemicals）を含む反応溶液１ｍｌを３０℃にて３時間インキュベーションすることにより、酵素アッセイを行った。インキュベーション後、反応混合溶液を液体窒素にて素早く凍結させ、反応を止めた。融解後、混合溶液をペンタンで３回抽出し、合わせた抽出液を、無水ＭｇＳＯ_４およびシリカゲルカラム（６０Å、Merck）を用いてカラムクロマトグラフィー処理し、酸素化生成物を含まないセスキテルペン炭化水素フラクションを得た。続いて、混合溶液をジエチルエーテルにより３回抽出し、合わせた抽出液を同様にＭｇＳＯ_４−シリカゲルカラムに通して、酸素化生成物を回収した。各フラクションのアリコートを採取し、液体シンチレーションカウントを行い、酵素活性を決定した。ネガティブコントロールとして、ＺＳＳ１インサートを含まないｐＥＴ１０１／ＤＴＯＰＯプラスミドで形質転換したE.coli BL21-CodonPlus（DE3）の抽出液を用いた。後述のように、酵素はＦＰＰからα−フムレンを合成する活性を有することが分かった。

（５）生成物の同定
ＧＣ−ＭＳによる分析に十分な生成物を得るために、組換えE.coli細胞培養液２５０ｍｌから酵素を抽出した。酵素溶液３．８ｍｌおよび８０μＭ 未標識ＦＰＰ（Echelon Research Laboratories Inc. Salt Lake City, UT）を含む溶液４ｍｌ中で反応を行った。バッファー、塩、およびインキュベーション条件は上述の通りである。一晩インキュベーション後、ペンタン（３ｘ１ｍｌ）で抽出して炭化水素フラクションを得、次に、上述の通りＭｇＳＯ_４−シリカゲルカラムに通した。最後に、合わせたペンタン抽出液を、氷上、おだやかな窒素流の下で約１００μｌまで濃縮した。

生成物を、DB-WAXカラム（０．２５ｍｍ×０．２５ｍｍ×３０ｍ、J&W Scientific, Folsom, CA）を備えたShimadzu QP5050A GC/MSシステムにて、ＧＣ−ＭＳ分析した（スプリットインジェクション（２μＬ）比２２：１、インジェクター温度２５０℃；温度；開始温度４０℃（３分維持）から、８０℃まで毎分３℃、１８０℃まで毎分５℃、２４０℃（５分維持）まで毎分１０℃の速度で昇温；ヘリウムフロー；１．８ｍＬ／分）。質量スペクトルを、質量範囲ｍ／ｚ４０−４００、電圧７０ｅＶ、およびインターフェイス温度２３０℃にて測定した。酵素反応により、２種類のセスキテルペン生成物が得られ、これらは、スタンダードとの保持時間および質量スペクトルの比較によりα−フムレン（９３．７５％）およびβ−カリオフィレン（６．２５％）であると同定された（図２参照）。

（６）ＺＳＳ１発現の同定
RNAqueous（登録商標）Micro Kit（Ambion）を用いてハナショウガの葉から、そしてSpectrum（商標）Plant Total RNA Kit （Sigma-Aldrich）を用いてハナショウガの幹および地下茎から、トータルＲＮＡを抽出し、上述の通りｃＤＮＡを合成した。ゲノムＤＮＡの増幅を排除するよう設計した５’−ＧＧＴＧＡＡＣＴＴＧＡＧＣＡＧＣＣＴＴＴＡＧＣＡＡＴ−３’（フォワード；配列番号：２９）および５’−ＧＴＣＴＣＴＴＴＴＧＴＴＧＣＡＴＣＴＴＣＴＣＣＣＡＡ−３’（リバース；配列番号：３０）を用いてＲＴ−ＰＣＲ（アニーリング温度：６８℃を３０サイクル）を行い、異なる組織におけるＺＳＳ１発現の相違を調べた。内部標準として、５’−ＡＡＧＧＡＧＴＧＣＣＣＣＡＡＣＧＣＣＧＡＧＴＧ−３’（フォワード；配列番号：３１）および５’−ＧＣＣＴＴＣＴＧＧＴＴＧＴＡＧＡＣＧＴＡＧＧＴＧＡＧ−３’（リバース；配列番号：３２）を用いてユビキチンを増幅した（ＺＳＳ１と同じ温度条件を２５サイクル）。結果を図３に示す。ＺＳＳ１は、葉および地下茎において発現しているが、幹では発現していないことが分かった。さらに、地下茎におけるＺＳＳ１発現レベルは、葉におけるものより有意に高いものであった。これらの結果は、地下茎オイル中のα−フムレンの含有量（１４．４％）が、葉オイル（２．０％）中のものより高いこと（Chane, M.J., Vera, R. and Chalchat, J.C. (2003) Chemical composition of the essential oil from rhizomes, leaves and flowers of Zingiber zerumbet Smith from Reunion Island. J. Essent. Oil. Res. 15: 202-205.）と相関するものであった。

（７）ＺＳＳ１発現誘導パターン
葉および地下茎における発現誘導パターンをさらに調べるために、ＭｅＪＡ処理および機械的に損傷したハナショウガ由来のＲＮＡを用いて、リアルタイムＰＣＲを行った。ＭｅＪＡ処理は、０．１％ Ｔｗｅｅｎ ２０に溶解した３００μＭ ＭｅＪＡをハナショウガにスプレーすることにより行った。対照には、０．１％ Ｔｗｅｅｎ ２０のみをスプレーした。機械的損傷は、葉を鋏で切ることにより行った。処理の０、４、８、２４、４８、および７２時間後に、葉および地下茎を回収し、液体窒素にて凍結し、ＲＮＡの抽出まで−８０℃にて保存した。SuperScript（商標）III First-strand Synthesis Supermix for qRT-PCR（Invitrogen）を用いて、製造元の指示に従い葉および地下茎から抽出したトータルＲＮＡ１μｇからｃＤＮＡを合成し、SYBR（登録商標）Green PCR Master Mix (Applied Biosystems）を用いて、ABI 7300 Sequence Detectionシステムにて定量的ＰＣＲを行った（９５℃、１０分、次に、９５℃１５秒、６７℃４０秒を４０サイクル）。内部標準としてユビキチンを用いた。ＺＳＳ１増幅には、プライマーペア：５’−ＧＣＡＡＧＴＧＡＴＧＧＴＧＧＡＧＣＡＡＡＡ−３’（フォワード；配列番号：３３）および５’−ＣＣＧＡＧＣＴＡＣＴＴＧＴＧＴＴＧＧＡＣＧＴ−３’（リバース；配列番号：３４）を用い、ユビキチンの増幅には、上述のプライマー（配列番号：３１および３２）を用いた。ΔΔＣｔ法（Livak, K.J. (1997) Comparative Ct method. ABI Prism 7700 Sequence Detection System. User Bulletin no. 2. PE Applied Biosystems.）により、相対的発現量を決定した。結果を図４に示す。葉において、ＭｅＪａ処理により転写が誘導され、ＭｅＪＡ処理の４８時間後にはピーク（約８倍）に達した。地下茎における転写は、ＭｅＪＡ処理の２４時間後に最大２から３倍誘導された。一方、対照において、転写レベルは、葉および地下茎における機械的損傷によりわずかに影響されるのみであった。このことから、ＭｅＪＡ処理することにより、あるいは機械的損傷を与えることにより、植物において酵素が増産されることが分かった。

（８）大腸菌におけるα−フムレンの著量産生
大腸菌におけるＤ−メバロノラクトンからＦＰＰへの生物変換を促進させ、α−フムレン産生を調べた。ｐＡＣＹ１８４を基本骨格とする、ｔａｃプロモーター（Ｐｔａｃ）、ｒｒｎＢターミネーター（ＴｒｒｎＢ）、およびクロラムフェニコール耐性遺伝子（Ｃｍ^ｒ）を有するｐＡＣプラスミド（海洋バイオテクノロジー 三沢博士より分譲）に、Streptmyces sp. CL190由来のメバロン酸経路遺伝子クラスター（Mevalonate pathway gene cluster）（６．５ｋｂ；東京大学 葛山准教授より分譲）を挿入してｐＡＣ−Ｍｅｖを得た（図５参照）。使用したメバロン酸経路遺伝子クラスターは、メバロン酸経路の反応を触媒する酵素であるＭＶＡキナーゼ、ＤＰＭＶＡデカルボキシラーゼ、ＰＭＶＡキナーゼ、ＩＰＰイソメラーゼ、ＨＭＧ ＣｏＡレダクターゼ、およびＨＭＧ ＣｏＡシンターゼをコードする核酸を含むものである。ｐＡＣ−Ｍｅｖ、および上述のｐＥＴ−ＺＳＳ１をE.coli BL21-CodonPlus（DE3）に導入し、１００μｇ／ｍＬ アンピシリンおよび３０μｇ／ｍＬ クロラムフェニコールを含むＬＢ培地中、３０℃にて一晩培養した。培養液 ５００μＬ（全培養液の約１％に相当）を、１００μｇ／ｍＬ アンピシリンおよび３０μｇ／ｍＬ クロラムフェニコールを含むTerrific broth培地 ５０ｍＬに植菌し、３０℃にてＯＤ_６００＝０．５まで培養した。ＩＰＴＧ（終濃度１ｍＭ）、０．５ｍｇ／ｍＬ Ｄ−メバロノラクトン、２０％ ｖ／ｖ ドデカンを添加し、２５℃にて２日間培養した。ドデカン層を回収し、回収したドデカン層 １μｌを上述の通りＧＣ−ＭＳ分析した。ＧＣ分析により、保持時間約２６．２５分のところに対照系には見られないピークが検出された（図６Ａ中矢印で示す）。このピーク付近（図６Ａの四角で囲った部分）を拡大したのが図６Ｂである。このピークを分取し、ＭＳ分析を行った結果を図７Ａに示す。α−フムレン標品のＭＳ分析結果（図７Ｂ）とパターンが一致し、実験で得られた生成物がα−フムレンであることが確認された。これらの結果より、ＺＳＳ１およびｐＡＣ−Ｍｅｖを導入したE.coliにおいてα−フムレンが特異的に著量産生されていることが確認できた。

（１）β−ユーデスモールシンターゼｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡの取得
これらのＤＮＡを下記方法によって得ることができた。ハナショウガの地下茎から、Spectrum（商標）Plant Total RNA Kit（Sigma-Aldrich）を用いてトータルＲＮＡを調製した。SuperScript（商標）III First-strand Synthesis Kit（Invitrogen）を用いて、ポリ（ｄＴ）プライミングにより、ＲＮＡ ３μｇを反応混合溶液２０μｌ中にてｃＤＮＡに逆転写した。ハナショウガと密接に関連する被子植物のセスキテルペンシンターゼの２つの保存ドメインの配列に基づき、以下のプライマーペアを設計した：５’−ＴＴＹＣＧＡＹＴＩＹＴＩＭＧＲＭＡＲＣＡＩＧＧ−３’（フォワード；配列番号：３５）および５’−ＴＡＩＧＨＲＴＣＡＷＡＩＲＴＲＴＣＲＴＣ−３’（リバース；配列番号：１５）。ｃＤＮＡ １μｌ、１μＭ 各プライマー、２００μＭ 各ｄＮＴＰ、および１Ｕ ＥｘＴａｇポリメラーゼ（TaKaRa）を含む反応混合溶液 ５０μｌを用いて、１次ＰＣＲ反応を以下の条件で行った：変性９４℃で２分間、次に、９４℃３０秒、３５℃で１分３０秒、７２℃で１分を４サイクル、９４℃で３０秒、４０℃で１分３０秒、７２℃で１分を３０サイクル、最後に７２℃で３分間伸長。得られた１次反応溶液 ５μｌを鋳型として用い、同じ条件にて２次ＰＣＲ反応を行い、５８１ｂｐのフラグメントを得た。得られたフラグメントを精製し、pGEM-Teasy vector（Promega）にクローン化して配列決定した。全長ｃＤＮＡを単離するために、Smart RACE cDNA Amplification Kit（BD Biosciences Clontech）、５’−ＣＣＣＡＡＴＡＡＴＡＡＣＣＴＴＣＣＡＣＡＡＣＴＣＧＧ−３’（５’ＲＡＣＥ；配列番号：３６）および５’−ＣＣＧＡＧＴＴＧＴＧＧＡＡＧＧＴＴＡＴＴＡＴＴＧＧＧ−３’（３’ＲＡＣＥ；配列番号：３７）、ならびにAdvantage（登録商標）2 Polymerase Mix（Clontech）を用いて、製造元の指示に従いフラグメントを５’末端および３’末端に向かって伸長させ、全長ｃＤＮＡを得て、ＺＳＳ５と命名した。このｃＤＮＡのヌクレオチド配列は配列番号：５に示されている。

ＺＳＳ５は、推定分子量６４．４ｋＤａ、およびＰＩ ５．０９を有する５５４アミノ酸からなるポリペプチド（配列番号：１２）をコードする１６６２ｂｐの推定ＯＲＦを含有するものであった。ＺＳＳ５によりコードされるポリペプチド（ＺＳＳ５ポリペプチド）のアミノ酸配列は、植物のテルペン合成酵素において保存された領域を有し、金属イオン結合モチーフＤＤＸＸＤを含んでいた。ＺＳＳ５ポリペプチドはangiospermのセスキテルペンシンターゼに対して最も類似性が高く、ＺＳＳ５の単離に使用したのと同じハナショウガのＺＳＳ１に対して８２％の類似性、Zingiber officinaleのゲルマクレンＤシンターゼ（Picaud, S., Olsson, M.E., Brodelius, M. and Brodelius, P.E. (2006) Cloning, expression, purification and characterization of recombinant (+)-germacrene D synthase from Zingiber officinale. Arch. Biochem. Biophys. 452, 17-28）に対して６８％の類似性、Elaeis oleiferaのセスキテルペンシンターゼ（Cha, T.S. and Shah, F.H. (2000) A mesocarp-and species-specific cDNA clone from oil palm encodes for sesquiterpene synthase. Plant. Sci. 154, 153-160）に対して６２％の類似性を示した。

さらに、Plant Genomic Isolation Mini Kit（Qiagen）を用いて、ハナショウガの葉からゲノムＤＮＡを単離した。配列番号：５のｃＤＮＡ配列に基づき設計したプライマーペア、５’−ＡＴＧＧＡＧＡＡＧＣＡＡＴＣＡＣＴＡＡＣ−３’（フォワード；配列番号：３８）および５’−ＣＴＴＡＴＴＧＡＡＧＴＡＧＴＣＡＣＡＡＧＡＴＴＣ−３’（リバース；配列番号：３９）を用いてＰＣＲ反応を行い、ＺＳＳ５ゲノムＤＮＡを単離した。

（２）大腸菌でのＺＳＳ５の発現、およびインビトロでのファルネシルジリン酸からのβ−ユーデスモールの生成
ＺＳＳ５の全長ＯＲＦを、Advantage（登録商標）HF 2 polymerase（Clontech）、フォワードプライマー５’−ＣＡＣＣＡＴＧＧＡＧＡＡＧＣＡＡＴＣＡＣＴＡＡＣ−３’（配列番号：４０）およびリバースプライマー５’−ＣＴＴＡＴＴＧＡＡＧＴＡＧＴＣＡＣＡＡＧＡＴＴＣＡＡＣ−３’（配列番号：４１）を用いて増幅し、増幅産物をpET101/DTOPOベクター（Invitrogen）にクローン化した。得られた組換えプラスミドpET-ZSS5でE.coli BL21-CodonPlus（DE3）（Stratagene）を形質転換した。

組換えE.coli細胞を、アンピシリン（５０μｇ／ｍＬ）含有ＬＢ培地５０ｍｌ中、３７℃にてＯＤ_６００＝０．５〜０．６まで増殖させた。次に、ＩＰＴＧ（終濃度１ｍＭ）を添加して、さらに２０時間１８℃にて増殖させた。細胞を遠心分離により回収し、超音波破砕器（Branson W185 D, NY）を用いて、チルド抽出バッファー（５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、５ｍＭ アスコルビン酸ナトリウム、０．５ｍＭ フェニルメチルスルホニルフルライド、５ｍＭ ジチオスレイトール、および１０％（ｖ／ｖ）グリセロールを含む５０ｍＭ ＭＯＰＳＯ、ｐＨ７．０）中１０×１０秒間処理することにより、細胞を粉砕した。細胞片を１５，０００ｇでの遠心分離により除去し、β−ユーデスモールシンターゼ含有上清を得た。得られた上清をニッケル−ニトリロ三酢酸アガロースカラム（Qiagen）にて精製した。溶出液を、Econopac 10DGカラム（Bio-Rad）に通すことによりアッセイバッファー（１０ｍＭ ＭＯＰＳＯ、ｐＨ ７．０、１ｍＭ ジチオスレイトール、および１０％（ｖ／ｖ）グリセロール）中に脱塩し、得られた酵素溶液を以下の実験に用いた。

テフロン（登録商標）シールしたスクリューキャップガラス試験管内の揮発性の生成物を捕捉するため、ペンタン０．５ｍＬを重層した。酵素溶液９００μｌ、２０ｍＭ ＭｇＣｌ_２、０．２ｍＭ ＭｎＣｌ_２、０．２ｍＭ ＮａＷＯ_４、０．１ｍＭ ＮａＦ、および２０μＭ［１−^３Ｈ］−（Ｅ，Ｅ）−ＦＰＰ（５５５ＧＢｑ／ｍｏｌ、American Radiolabeled Chemicals）を含む反応溶液１ｍｌを３０℃にて３時間インキュベーションすることにより、酵素アッセイを行った。インキュベーション後、反応混合溶液を液体窒素にて素早く凍結させ、反応を止めた。融解後、混合溶液をペンタンで３回抽出し、合わせた抽出液を、無水ＭｇＳＯ_４およびシリカゲルカラム（６０Å、Merck）を用いてカラムクロマトグラフィー処理し、酸素化生成物を含まないセスキテルペン炭化水素フラクションを得た。続いて、混合溶液をジエチルエーテルにより３回抽出し、合わせた抽出液を同様にＭｇＳＯ_４−シリカゲルカラムに通して、酸素化生成物を回収した。各フラクションのアリコートを採取し、液体シンチレーションカウントを行い、酵素活性を決定した。後述のように、生成物のＧＣ−ＭＳ分析のために、８０μＭの未標識ＦＰＰを基質として同様の反応をスケールアップ（最終体積４ｍＬ）して一晩行った。酵素はＦＰＰからβ−ユーデスモールを合成する活性を有することが分かった。

（３）生成物の同定
生成物を、DB-WAXカラム（０．２５ｍｍ×０．２５ｍｍ×３０ｍ、J&W Scientific, Folsom, CA）を備えたShimadzu QP5050A GC/MSシステムにて、ＧＣ−ＭＳ分析した（スプリットインジェクション（１μＬ）比２２：１、インジェクター温度２５０℃；温度；開始温度４０℃（３分維持）から、８０℃まで毎分３℃、１８０℃まで毎分５℃、２４０℃（５分維持）まで毎分１０℃の速度で昇温；ヘリウムフロー；１．８ｍＬ／分）。質量スペクトルを、質量範囲ｍ／ｚ ４０−４００、電圧７０ｅＶ、およびインターフェイス温度２３０℃にて測定した。化合物をスタンダードとの保持時間あるいは質量スペクトルデータベースの比較により同定した。主生成物はβ−ユーデスモールであり、全生成物の６２．６％を占めた。１０−エピ−γ−ユーデスモール（１６．８％）、α−ユーデスモール（１０％）、アリストレン（５．６％）および２種の未知生成物（５％）を含む７つのマイナーなピークも認められた（図８参照）。ネガティブコントロールとして、ＺＳＳ５インサートを含まないｐＥＴ１０１／ＤＴＯＰＯプラスミドで形質転換したE.coli BL21-CodonPlus（DE3）の抽出液を用いて反応を行い、同様に分析したところ、上記生成物は認められなかった。

（４）大腸菌におけるβ−ユーデスモールの著量生産
メバロン酸経路の遺伝子クラスターをHaradaらの方法（論文投稿中）に従って構築した。以下にその手順を説明する。ｔａｃプロモーター（Ｐｔａｃ）およびｒｒｎＢターミネーター（ＴｒｒｎＢ）をｐＴＴＱ１８からＰＣＲにより増幅し、それぞれをｐＡＣＹＣ１８４のＥａｇＩ−ＳａｌＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ−ＣｌａＩ部位に移した。ヒドロキシメチルグルタリルＣｏＡシンターゼ（ＨＭＧＳ）、ヒドロキシメチルグルタリルＣｏＡレダクターゼ（ＨＭＧＲ）、メバロネートキナーゼ（ＭＫ）、ホスホメバロネートキナーゼ（ＰＭＫ）、メバロネートジホスフェートデカルボキシラーゼ（ＭＰＤ）およびイソペンテニルピロホスフェートイソメラーゼ（ＩＰＰＩ）をコードする遺伝子を、T. Kuzuyama博士から供与いただいた（Takagi, M., Kuzuyama, T., Takahashi, S. and Seto, H. (2000) A gene cluster for the mevalonate pathway from Streptomyces sp. strain CL190. J. Bacteriol. 182, 4153-4157）。重複伸長部分を用いて各遺伝子を連結し、ＰｔａｃとＴｒｒｎＢ間に挿入してｐＡＣ−Ｍｅｖを得た。ｐＥＴ−ＺＳＳ５およびｐＡＣ−Ｍｅｖで同時形質転換してＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）を得た。かくして得られた代謝経路を修飾された大腸菌を、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）およびクロラムフェニコール（３０μｇ／ｍｌ）を含むテリフィックブロスにて、ＯＤ_６００が０．５に達するまで３７℃で振盪培養した。１ｍＭ ＩＰＴＧ、０．５ｍｇ／ｍｌ Ｄ−メバロノラクトン（東京化成）および２０％（ｖ／ｖ）ドデカンを補足した後、さらに２５℃で４８時間振盪培養して増殖させた。その後、ドデカン層を抽出し、ＧＣ−ＭＳ分析に供した。

ＧＣ−ＭＳ分析の結果を図９に示す。β−ユーデスモールが主生成物であり、全生成物の７２．４％を占めた。次いで、１０−エピ−γ−ユーデスモール（１１．２％）、α−ユーデスモール（７．１％）そしてアリストレン（６．１％）の順であった。生成したβ−ユーデスモール量は１００ｍｇ／Ｌであった。ｐＥＴおよびｐＡＣ−Ｍｅｖで同時形質転換した大腸菌ではセスキテルペン生成物は検出されなかった。

本発明により、セスキテルペンシンターゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸、該核酸を含むベクターおよび細胞、該核酸によりコードされるポリペプチド、ならびにこれらの核酸、ポリペプチド、細胞等を用いることを特徴とするセスキテルペン類の製造方法などが提供されるので、本発明は、医薬品の分野、医薬部外品の分野、化粧品の分野、香料の分野などに利用可能である。

図１は、ＺＳＳ１のゲノム配列を示す。 図２Ａは、得られたα−フムレンおよびβ−カリオフィレンの保持時間を示すグラフである。 図２Ｂは、得られたα−フムレンの質量スペクトルを示すグラフである。 図２Ｃは、得られたβ−カリオフィレンの質量スペクトルを示すグラフである。 図３は、ハナショウガの葉、幹および地下茎由来のＺＳＳ１の電気泳動像である。 図４Ａは、ＭｅＪＡ処理した葉および地下茎におけるＺＳＳ１発現量を示すグラフである。図中、菱形は処理試料を、そして三角は対照を示す。 図４Ｂは、機械的損傷した葉および地下茎におけるＺＳＳ１発現量を示すグラフである。図中、菱形は処理試料を、そして三角は対照を示す。 図５は、ｐＡＣ−Ｍｅｖのマップである。 図６Ａは、ｐＡＣ−ＭｅｖおよびｐＥＴ−ＺＳＳ１を導入した大腸菌培養液のドデカン抽出物のガスクロマトグラフィー（ＧＣ）の結果を示す。図中、灰色の線は実験系を、黒色の線は対照を示す。対照はプラスミドを導入していない大腸菌を用いた系である。 図６Ｂは図６Ａのチャートの四角で囲ったピーク周辺を拡大したものである。図中、灰色の線は実験系を、黒色の線は対照を示す。対照はプラスミドを導入していない大腸菌を用いた系である。 図７Ａは、得られた培養液のドデカン抽出物の質量スペクトル（ＭＳ）を示すグラフである。 図７Ｂはα−フムレン標品のＭＳを示すグラフである。 図８ＡはｐＥＴ−ＺＳＳ５で形質転換された大腸菌による生成物のＧＣチャートを示す。？は未同定物質のピークを示す。 図８Ｂは図８Ａの各ピークに相当する物質のＭＳ（各上段）および標準物質またはデータベースのＭＳ（各下段）を示す。ＲｔはＧＣでのピークの保持時間（分）である。 図９ＡはｐＥＴ−ＺＳＳ５およびｐＡＣ−Ｍｅｖで同時形質転換された大腸菌による生成物のＧＣチャートを示す。？は未同定物質のピークを示す。 図８Ｂは図８Ａに示すβ−ユーデスモールのピークに相当する物質のＭＳの結果を示す。ＲｔはＧＣでのピークの保持時間（分）である。

SEQ ID NO:14:PCR primer, n at position 11 is inosine, and n at position 13 is inosine
SEQ ID NO:15:PCR primer, n at position 3 is inosine, and n at position 12 is inosine
SEQ ID NO:16:PCR primer
SEQ ID NO:17:PCR primer
SEQ ID NO:18:PCR primer
SEQ ID NO:19:PCR primer
SEQ ID NO:20:PCR primer
SEQ ID NO:21:PCR primer
SEQ ID NO:22:PCR primer
SEQ ID NO:23:PCR primer
SEQ ID NO:24:PCR primer
SEQ ID NO:25:PCR primer
SEQ ID NO:26:PCR primer
SEQ ID NO:27:PCR primer
SEQ ID NO:28:PCR primer
SEQ ID NO:29:PCR primer
SEQ ID NO:30:PCR primer
SEQ ID NO:31:PCR primer
SEQ ID NO:32:PCR primer
SEQ ID NO:33:PCR primer
SEQ ID NO:34:PCR primer
SEQ ID NO:35:PCR primer, n at position 9 is inosine, n at position 12 is inosine, and n at position 21 is inosine.
SEQ ID NO:36:PCR primer
SEQ ID NO:37:PCR primer
SEQ ID NO:38:PCR primer
SEQ ID NO:39:PCR primer
SEQ ID NO:40:PCR primer
SEQ ID NO:41:PCR primer

Claims (16)

1. セスキテルペンシンターゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸であって、配列番号：１のヌクレオチド配列からなる核酸。
2. α−フムレンシンターゼ活性を有する請求項１記載の核酸。
3. セスキテルペンシンターゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸であって、配列番号：５のヌクレオチド配列からなる核酸。
4. β−ユーデスモールシンターゼ活性を有する請求項３記載の核酸。
5. セスキテルペンシンターゼ活性を有するポリペプチドであって、配列番号：８のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
6. α−フムレンシンターゼ活性を有する請求項５記載のポリペプチド。
7. セスキテルペンシンターゼ活性を有するポリペプチドであって、配列番号：１２のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
8. β−ユーデスモールシンターゼ活性を有する請求項７記載のポリペプチド。
9. 請求項１記載の核酸を含むベクター。
10. 請求項３記載の核酸を含むベクター。
11. 請求項９または１０記載のベクター、および大腸菌におけるＤ−メバロノラクトンからファルネシルジリン酸への生物変換を促進させるメバロン酸経路遺伝子クラスターを含むベクターを大腸菌に導入し、大腸菌を培養することを特徴とする、セスキテルペンの製造方法。
12. 請求項９記載のベクター、および大腸菌におけるＤ−メバロノラクトンからファルネシルジリン酸への生物変換を促進させるメバロン酸経路遺伝子クラスターを含むベクターを大腸菌に導入し、大腸菌を培養することを特徴とする、α−フムレンの製造方法。
13. 請求項１０記載のベクター、および大腸菌におけるＤ−メバロノラクトンからファルネシルジリン酸への生物変換を促進させるメバロン酸経路遺伝子クラスターを含むベクターを大腸菌に導入し、大腸菌を培養することを特徴とする、β−ユーデスモールの製造方法。
14. 請求項５または７記載のポリペプチドをファルネシルジリン酸と反応させることを特徴とする、セスキテルペンの製造方法。
15. 請求項５記載のポリペプチドをファルネシルジリン酸と反応させることを特徴とする、α−フムレンの製造方法。
16. 請求項７記載のポリペプチドをファルネシルジリン酸と反応させることを特徴とする、ベータ−ユーデスモールの製造方法。

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