JP5274795B2 - タンパク質のリフォールディング方法 - Google Patents

Description

本発明は、タンパク質のリフォールディング方法に関し、詳しくはアンフォールディングされたタンパク質を活性のあるタンパク質構造へと巻き戻すリフォールディング方法に関する。

タンパク質の機能・構造の解明・解析は、例えば、病気の治療や創薬に直結し、極めて重要である。このため、種々のタンパク質を様々な方法で合成・生産し、それらの構造を調べ、生体内における作用機構と役割を解明することが活発に行われている。そして、今や、タンパク質の機能は、それらを構成するアミノ酸の配列・鎖長のみならず、それらの取る秩序だった立体構造（高次構造）によって決まることは周知のこととなっている。

工業的にも、遺伝子工学の発展により、さまざまなタンパク質を組換え体として大量に調製し、医薬品製造や食品加工、臨床診断等の多岐にわたる産業に利用されてきた。ベクター技術の開発によって大腸菌や酵母の菌体内で、標的とするタンパク質を大量に産生させる技術が、少ない資源で簡単に再現性良く実行できるようになってきた。
しかし、組換え体で発現させたタンパク質の多くは立体構造に秩序が無く、高次構造が制御されておらず、不活性な封入体（インクルージョンボディ）と呼ばれる小粒子顆粒を形成することが多い。このため、大腸菌による生産プロセスでは、インクルージョンボディを解きほぐし（アンフォールディング）、高次構造を整え、秩序だった立体構造を持つ可溶性タンパク質に変換する操作、すなわち、インクルージョンボディをアンフォールディングし、さらにリフォールディング（巻き戻し）することが必要である。

この種のリフォールディングは、大腸菌や酵母による生産タンパク質のみならず、熱履歴等の、ある種の原因で失活したタンパク質の再生にも応用でき、極めて重要な技術である。したがって、従来から、このリフォールディングは盛んに研究され、種々の方法が提案されているが、それらのほとんどは、リフォールディング率が低いうえに、ある限定されたタンパク質（特に、分子量の低い特定タンパク質）に対して偶発的に好ましい結果が得られたに過ぎないことが多く、現在、このリフォールディングは、種々のタンパク質に適用可能な、一般性、普遍性のある、しかも、リフォールディング率の高い効率的で経済的な方法とはなっていない。

古くから良く用いられているリフォールディング操作は透析法と希釈法である。
透析法は、透析に供することで予め添加されたタンパク質変性剤（アンフォールディング剤：例えば塩酸グアニジンおよび／または尿素など）を徐々に希釈して緩衝液等に置き換え、機能のある蛋白質立体構造へとリフォールディングする方法である。本方法の応用例として、タンパク質変性剤濃度を、さらにゆっくりと減少させることで、機能のあるタンパク質立体構造へのリフォールディングの収率を上げる段階的希釈法が知られている
（例えば、非特許文献１）。
しかし、透析法は、外液にタンパク質溶液の百倍以上の容積が通常必要になり、また数日の時間を必要とするので、産業上実用的ではない。

希釈法は、透析法と比べて、比較的短時間で終わり容積も比較的少なくて済むので広く用いられている。希釈法は、タンパク質変性剤（アンフォールディング剤）を加えたアンフォールディングされたタンパク質溶液を、緩衝液などで過剰に希釈することで、アンフォールディング状態から機能のあるタンパク質立体構造へとタンパク質をリフォールディングする方法である。希釈法はタンパク質を機能のある立体構造へとリフォールディング
する最も簡便で低コストの方法であるが、リフォールディングの収率が悪く（例えば、非特許文献２）、大希釈をするので収量が少ないのが現状である。

人工シャペロンとして、β−シクロデキストリンやシクロアミロースを用い、このシャペロン溶液に界面活性剤でアンフォールディングしたタンパク質を混ぜると、界面活性剤の人工シャペロンによる取り込み除去が生じ、この過程でタンパク質がリフォールディングするとの報告（非特許文献３〜５）もある。しかし、この方法は、ｃａｒｂｏｎｉｃ ａｎｈｙｄｒａｓｅ Ｂ 等で成功しているに過ぎない。しかも、繰り返し行える方法ではなく、高コストである。
Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２００３ Ｍａｒ １４；２７８（１１）：８９７９−８９８７． Ｊ ＩｍＭｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ．１９９８ Ｏｃｔ １；２１９（１−２）：１１９−１２９． Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ． Ｖｏｌ．１１７（１９９５）２３７３−２３７４ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． Ｖｏｌ．２７１（１９９６）３４７８−３４８７ ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ． Ｖｏｌ．４８６（２０００）１３１−１３５

以上のようにさまざまなリフォールディング方法が提案されてきているが、アンフォールディングされたタンパク質をリフォールディングする際に、依然としてタンパク質を大
希釈することによる収量の低下や、純度が低いといった課題があった。また、分子量が比較的大きなタンパク質に対しリフォールディング剤を加えた際に凝集沈殿が起きることが多く、収率の低下が著しかった。

本発明者らは以上の問題点を解決するため鋭意検討した結果、本発明に到達した。
すなわち、本発明は、アンフォールディングされたタンパク質のリフォールディング方法において、タンパク質の重量に対して２５〜５００重量％の非イオン性界面活性剤（Ａ１）でタンパク質を処理した後に、リン酸、ピロリン酸、トリポリリン酸及びそれらの塩からなる群より選ばれる１種以上の化合物（Ｂ１）又は炭素数１〜８の脂肪族カルボン酸及びその塩からなる群より選ばれる１種以上の化合物（Ｂ２）からなるリフォールディング剤（Ｂ）で処理することを特徴とするリフォールディング方法であって、非イオン性界面活性剤（Ａ１）が高級アルコールのアルキレンオキサイド付加物及び多価アルコール型非イオン性界面活性剤であり、リフォールディング剤（Ｂ）でタンパク質を処理する工程において、化合物（Ｂ１）の系中の濃度が１〜６モル／Ｌ又は化合物（Ｂ２）の系中の濃度が１〜６モル／Ｌであるリフォールディング方法である。

また、本発明は、前記方法でリフォールディングする工程を含むタンパク質の産生方法である。

本発明のリフォールディング方法を使用すると、リフォールディング時にタンパクの凝集が起こりにくく、かつタンパク質を大希釈しなくてもよいので従来よりも生産性が飛躍的に向上する。また、従来よりもリフォールディング効果が高いため、高純度のタンパク質を大量に得ることができる。

本発明は、アンフォールディングされたタンパク質のリフォールディング方法であり、まず凝集抑制剤（Ａ）でタンパク質を処理した後に、続いて一般式（１）で示される基を有する化合物（Ｂ１）および／またはオキシカルボニル基を有する化合物（Ｂ２）からなるリフォールディング剤（Ｂ）で処理することを特徴とするリフォールディング方法である。

本発明のリフォールディング方法における凝集抑制剤（Ａ）とは、リフォールディング剤（Ｂ）を添加した際、およびその後の放置中にタンパクが凝集を起こすことを防ぐ薬剤である。
この凝集抑制剤（Ａ）としては、界面活性剤が挙げられ、さらに下記の非イオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤、アニオン性界面活性剤または両性界面活性剤が挙げられる。

非イオン性界面活性剤としては、高級アルコールのアルキレンオキサイド（以下、ＡＯと略記する。）付加物［例えば、炭素数８〜２４の高級アルコール（デシルアルコール、ドデシルアルコール、ヤシ油アルキルアルコール、オクタデシルアルコールおよびオレイルアルコールなど）のエチレンオキサイド（以下、ＥＯと略記する。）１〜２０モル付加物など］；炭素数６〜２４のアルキルを有するアルキルフェノールのＡＯ付加物（Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ３００など）；ポリプロピレングリコールＥＯ付加物およびポリエチレングリコールＰＯ付加物；プルロニック型界面活性剤、脂肪酸ＡＯ付加物、および多価アルコール型非イオン性界面活性剤（ＴＷＥＥＮ２０、ＴＷＥＥＮ４０、ＴＷＥＥＮ６０、ＴＷＥＥＮ８０など）などが挙げられる。

カチオン性界面活性剤としては、第４級アンモニウム塩型カチオン性界面活性剤およびアミン塩型カチオンカチオン性界面活性剤などが挙げられる。

アニオン性界面活性剤としては、炭素数８〜２４の炭化水素基を有する、エーテルカルボン酸またはその塩、硫酸エステルもしくはエーテル硫酸エステルおよびそれらの塩、スルホン酸塩、スルホコハク酸塩、脂肪酸塩、アシル化アミノ酸塩、並びに天然由来のカルボン酸およびその塩（たとえばケノデオキシコール酸、コール酸、デオキシコール酸など）が挙げられる。

両性界面活性剤としては、ベタイン型両性界面活性剤およびアミノ酸型両性界面活性剤が挙げられる。
界面活性剤としては、上記の他に特公昭５７−３９６７８号公報記載の界面活性剤が挙げられる。

本発明のリフォールディング方法における凝集抑制剤（Ａ）としては、タンパクと相互作用が少ない観点で、上記の非イオン性活性剤が好ましい。
さらに好ましくは、高級アルコールのアルキレンオキサイド付加物および多価アルコール型非イオン性界面活性剤である。

凝集抑制剤（Ａ）の添加量は、タンパク質１００部に対し、通常は１０００部以下であり、凝集抑制効果の観点から１〜５００部が好ましく、２〜３００部がさらに好ましい。

本発明において、一般式（１）におけるＰはリン原子であり、一般式（１）で示される基を有する化合物（Ｂ１）としては、無機リン酸およびそれらの塩（Ｂ１−１）；アルキルリン酸エステルおよびそれらの塩（Ｂ１−２）；並びに糖リン酸エステルおよびそれらの塩（Ｂ１−３）などが挙げられる。

無機リン酸およびその塩（Ｂ１−１）としては、リン酸、次亜リン酸、亜リン酸、次リン酸、ピロリン酸、ピロ亜リン酸、メタリン酸、トリポリリン酸、ポリリン酸、およびこれらの塩が挙げられる。
塩としてはアルカリ金属塩（ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩など）、アルカリ
土類金属塩（カルシウム塩、マグネシウム塩、バリウム塩など）、アンモニウム塩、アミン塩（１級アミン塩、２級アミン塩、３級アミン塩）、および４級アンモニウム塩（テトラアルキルアンモニウム塩など）が挙げられる。
（Ｂ１−１）のうちの塩の具体例としては、リン酸１水素２ナトリウム塩、リン酸２水素１ナトリウム塩、リン酸１水素２カリウム塩、リン酸２水素１カリウム塩、リン酸アンモニウム塩、リン酸テトラメチルアンモニウム塩、リン酸テトラエチルアンモニウム塩、リン酸トリエチルアミン塩およびリン酸トリエタノールアミン塩などのリン酸塩；亜リン酸ナトリウム、亜リン酸カリウム、亜リン酸アンモニウム塩、亜リン酸テトラメチルアンモニウム塩、亜リン酸テトラエチルアンモニウム塩、亜リン酸トリエチルアミン塩および亜リン酸トリエタノールアミン塩などの亜リン酸塩；ピロリン酸ナトリウム塩、ピロリン酸カリウム塩、ピロリン酸テトラメチルアンモニウム塩、ピロリン酸テトラエチルアンモニウム塩、ピロリン酸トリエチルアミン塩およびピロリン酸トリエタノールアミン塩などのピロリン酸塩などが挙げられる。

アルキルリン酸エステルおよびそれらの塩（Ｂ１−２）としては、炭素数１〜１２のアルキル基を有するアルキルリン酸エステル（Ｂ１−２−１）、アルキルピロリン酸エステル（Ｂ１−２−２）、アルキルトリポリリン酸エステル（Ｂ１−２−３）などがが挙げられる。
炭素数１〜１２のアルキル基を有するアルキルリン酸エステル（Ｂ１−２−１）としては、例えば、メチルリン酸エステル、エチルリン酸エステル、プロピルリン酸エステル、２−プロピルリン酸エステル、ブチルリン酸エステル、２−ブチルリン酸エステル、ｔ−ブチルリン酸エステル、ペンチルリン酸エステル、ヘキシルリン酸エステル、シクロヘキシルリン酸エステル、オクチルリン酸エステル、ノニルリン酸エステル、デシルリン酸エステルなどが挙げられる。
炭素数１〜１２のアルキル基を有するアルキルピロリン酸エステル（Ｂ１−２−２）としては、例えば、メチルピロリン酸エステル、エチルピロリン酸エステル、プロピルピロリン酸エステル、２−プロピルピロリン酸エステル、ブチルピロリン酸エステル、２−ブチルピロリン酸エステル、ｔ−ブチルピロリン酸エステル、ペンチルピロリン酸エステル、ヘキシルピロリン酸エステル、シクロヘキシルピロリン酸エステル、オクチルピロリン酸エステル、ノニルピロリン酸エステル、デシルピロリン酸エステルなどが挙げられる。
炭素数１〜１２のアルキル基を有するアルキルトリポリリン酸エステル（Ｂ１−２−３）としては、例えば、メチルトリポリリン酸エステル、エチルトリポリリン酸エステル、プロピルトリポリリン酸エステル、２−プロピルトリポリリン酸エステル、ブチルトリポリリン酸エステル、２−ブチルトリポリリン酸エステル、ｔ−ブチルトリポリリン酸エステル、ペンチルトリポリリン酸エステル、ヘキシルトリポリリン酸エステル、シクロヘキシルトリポリリン酸エステル、オクチルトリポリリン酸エステル、ノニルトリポリリン酸エステル、デシルトリポリリン酸エステルなどが挙げられる。
上記（Ｂ１−２−１）〜（Ｂ１−２−３）の塩としては、前述の（Ｂ１−１）で挙げた塩と同様のアルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩、アンモニウム塩、アミン塩および４級アンモニウム塩が挙げられる。

糖リン酸エステルおよびそれらの塩（Ｂ１−３）としては、アデノシン３リン酸（ＡＴＰ）、アデノシン２リン酸（ＡＤＰ）、アデノシン１リン酸（ＡＭＰ）および環状アデノシンモノリン酸（ｃ−ＡＭＰ）とそのナトリウム塩、カリウム塩、トリエチルアミン塩、トリエタノールアミン塩などが挙げられる。

リン原子を含有する化合物（Ｂ１）のうち、リフォールディング効果の観点から好ましいのは（Ｂ１−１）および（Ｂ１−３）であり、さらに好ましいのは、リン酸、ピロリン酸、ポリリン酸、アデノシン３リン酸、アデノシン２リン酸、アデノシン１リン酸およびそれらの塩である。

本発明におけるオキシカルボニル基を有する化合物（Ｂ２）は、いずれもオキシカルボニル基（−ＣＯＯ−）を有することを特徴としている。
化合物（Ｂ２）としては、分子中に少なくとも１個のカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）もしくは１個のカルボキシレートアニオン基（−ＣＯＯ^--）を有する化合物（Ｂ２−１）並びに、分子中に少なくとも１個のエステル基（−ＣＯＯＲ）を有する化合物（Ｂ２−２）が挙げられる。なお、これらのオキシカルボニル基と水酸基を同時に有する乳酸などのオキシカルボン酸も挙げられる。

分子内に少なくとも１個のカルボキシル基もしくはカルボキシレートアニオン基を有する化合物（Ｂ２）としては、以下のカルボン酸、エーテルカルボン酸およびそれらの塩が挙げられる。

（Ｂ２）のうちのカルボン酸としては、炭素数１〜３６（カルボニル基の炭素原子も含む。以下同様）の脂肪族カルボン酸（Ｂ２−１−１）および芳香族カルボン酸（Ｂ２−１−２）などが挙げられる。

脂肪族カルボン酸（Ｂ２−１−１）としては、炭素数１〜３６の脂肪族飽和モノカルボン酸（ギ酸、酢酸、プロピオン酸、酪酸、イソ酪酸、吉草酸、カプロン酸、エナント酸、カプリル酸、ベラルゴン酸、ラウリル酸、ミリスチン酸、ステアリン酸、ベヘン酸、２−エチルヘキサン酸など）；炭素数３〜３６の脂肪族不飽和モノカルボン酸（アクリル酸、メタクリル酸、オレイン酸など）；炭素数３〜３６の脂肪族オキシカルボン酸（グリコール酸、乳酸、酒石酸、グルコン酸など）； 炭素数２〜３６の脂肪族飽和ジカルボン酸（シュウ酸、マロン酸、コハク酸、グルタル酸、アジピン酸、ピメリン酸、スベリン酸、アゼライン酸、セバシン酸など）およびそれらのモノアルキルエステル；炭素数４〜３６の脂肪族不飽和ジカルボン酸（マレイン酸、フマール酸、イタコン酸など）；並びに、３価以上（好ましくは３〜１２価）の脂肪族多価カルボン酸（クエン酸、ブタンテトラカルボン酸、シクロペンタンテトラカルボン酸、エチレンジアミン四酢酸、ジエチレントリアミン五酢酸など）などが挙げられる。

カルボン酸のうちの芳香族カルボン酸（Ｂ２−１−２）としては、炭素数７〜３６の芳香族モノカルボン酸（安息香酸、桂皮酸、ヒドロキシ安息香酸など）；炭素数８〜３６の芳香族ジカルボン酸（フタル酸、イソフタル酸、テレフタル酸など）；炭素数９〜３６の芳香族トリカルボン酸およびテトラカルボン酸（トリメリット酸、ピロメリット酸など）；芳香族オキシカルボン酸（サリチル酸など）が挙げられる。

その他のカルボン酸としては、上記の脂肪族不飽和モノもしくはジカルボン酸を必須構成単量体とする重合体（例えば、ポリアクリル酸、ポリマレイン酸、アクリル酸／アクリル酸アルキルエステル共重合体など：数平均分子量５００〜５０，０００）が挙げられる。

カルボン酸としては、さらに、上記のジカルボン酸または３価以上の多価カルボン酸の部分アルキル（アルキル基としては炭素数１〜１２のもの）エステル（例えば、シュウ酸モノメチル、コハク酸モノメチル、マレイン酸モノメチル、シュウ酸モノエチル、クエン酸モノメチル、クエン酸ジメチルなど）が挙げられる。

（Ｂ２−１）のうちのエーテルカルボン酸としては、下記一般式（２）で示される化合物が挙げられる。

Ｒ¹−Ｏ−（Ｒ²Ｏ）p−Ｒ³−ＣＯＯＨ （２）

（式中、Ｒ¹は炭素数１〜３６の炭化水素基、Ｒ²は炭素数２〜４のアルキレン基、Ｒ³は炭素数１〜３のアルキレン基、ｐは１〜５０の整数を表す。）

Ｒ¹は炭素数１〜３６の炭化水素基であって、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、２−プロピル基、ｎ−ブチル基、２−ブチル基、ｔ−ブチル基、ペンチル基、ｎ−ヘキシル基、シクロヘキシル基、オクチル基、ノニル基およびデシル基などが挙げられる。
Ｒ2は炭素数２〜４のアルキレン基であって、エチレン基、１，２−プロピレン基、１，３−プロピレン基、１，２−ブチレン基、１，４−ブチレン基などが挙げられる。
Ｒ3は炭素数１〜３のアルキレン基であって、メチレン基、エチレン基、１，２−プロピレン基、１，３−プロピレン基が挙げられる。
ｐは通常１〜５０の整数であって、好ましくは１〜２０、さらに好ましくは１〜１０、特に好ましくは１〜４である。

エーテルカルボン酸の具体例としては、ポリオキシエチレンヘキシルエーテルカルボン酸、ポリオキシエチレンオクチルエーテルカルボン酸、ポリオキシエチレンノニルエーテルカルボン酸、ポリオキシエチレンデシルエーテルカルボン酸、ポリオキシエチレンデシルヒドロキシエーテルカルボン酸、ポリオキシエチレンドデシルエーテルカルボン酸、ポリオキシプロピレンヘキシルエーテルカルボン酸、ポリオキシプロピレンオクチルエーテルカルボン酸、ポリオキシプロピレンノニルエーテルカルボン酸、ポリオキシプロピレンデシルエーテルカルボン酸、ポリオキシプロピレンドデシルエーテルカルボン酸などが挙げられる。

（Ｂ２−１）のうちの、カルボキシレートアニオン基を有する化合物としては、上記カルボン酸もしくはエーテルカルボン酸の塩が挙げられる。
塩としては前述の（Ｂ１）で挙げた塩と同様のアルカリ金属塩アルカリ、土類金属塩アンモニウム塩、アミン塩および４級アンモニウム塩が挙げられる。

カルボン酸塩の具体例としては、上記の炭素数１〜３６の脂肪族飽和モノカルボン酸塩（ギ酸ナトリウム、ギ酸アンモニウム、ギ酸グアニジウム、酢酸ナトリウム、酢酸アンモニウム、酢酸グアニジウム、プロピオン酸ナトリウム、プロピオン酸アンモニウム、プロピオン酸グアニジウム、酪酸ナトリウム、カプロン酸ナトリウムなど）；炭素数３〜３６の脂肪族不飽和モノカルボン酸（アクリル酸ナトリウムなど）；炭素数３〜３６の脂肪族オキシカルボン酸塩（グリコール酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、乳酸アンモニウム、乳酸グアニジウム、酒石酸ナトリウム、酒石酸カリウム、酒石酸アンモニウム、酒石酸グアニジウム、グルコン酸ナトリウムなど）；炭素数２〜３６の脂肪族飽和ジカルボン酸塩（シュウ酸ナトリウム、コハク酸ナトリウム、グルタル酸ナトリウムなど）；炭素数４〜３６の脂肪族不飽和ジカルボン酸塩（マレイン酸ナトリウムなど）；上記のジカルボン酸または３価以上の多価カルボン酸の部分アルキルエステルの塩（シュウ酸モノメチルナトリウム、コハク酸モノメチルナトリウム、マレイン酸モノメチルカリウム、シュウ酸モノエチルナトリウム、クエン酸モノメチルナトリウム、クエン酸ジメチルナトリウムなど）；が挙げられる。

エーテルカルボン酸塩としては、ポリオキシエチレンヘキシルエーテルカルボン酸ナトリウム、ポリオキシエチレンオクチルエーテルカルボン酸ナトリウム、ポリオキシエチレンノニルエーテルカルボン酸ナトリウム、ポリオキシエチレンデシルエーテルカルボン酸ナトリウム、ポリオキシエチレンデシルヒドロキシエーテルカルボン酸ナトリウム、ポリオキシエチレンドデシルエーテルカルボン酸ナトリウム、ポリオキシプロピレンヘキシルエーテルカルボン酸ナトリウム、ポリオキシプロピレンオクチルエーテルカルボン酸ナトリウム、ポリオキシプロピレンノニルエーテルカルボン酸ナトリウム、ポリオキシプロピレンデシルエーテルカルボン酸ナトリウム、ポリオキシプロピレンドデシルエーテルカルボン酸ナトリウムなどが挙げられる。

分子中に少なくとも１個のエステル基を有する化合物（Ｂ２−２）としては、カルボン酸アルキルエステル（Ｂ２−２−１）およびカルボン酸のアルキレンオキサイド付加物（Ｂ−２−２）などが挙げられる。
カルボン酸アルキルエステル（Ｂ２−２−１）を構成するカルボン酸としては、前述の分子内に少なくとも１個のカルボキシル基もしくはカルボキシレートアニオン基を有する化合物（Ｂ２−１）と同様のカルボン酸が挙げられる。
また、エステル基中のアルキル基として、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、２−プロピル基、ｎ−ブチル基、２−ブチル基、ｔ−ブチル基、ペンチル基、ｎ−ヘキシル基、シクロヘキシル基、オクチル基、ノニル基もしくはデシル基などの、炭素数が1〜１２の直鎖もしくは分岐の脂肪族アルキル基が挙げられる。

カルボン酸アルキルエステル（Ｂ２−２−１）の具体例としては、ギ酸メチル、酢酸メチル、ギ酸エチル、酢酸エチル、酢酸ｎ−ブチル、ステアリン酸メチル、ステアリン酸ｎ−ブチルなど）；シュウ酸ジメチル、コハク酸ジメチル、マレイン酸ジメチル、シュウ酸ジエチル、コハク酸ジエチル、アジピン酸ジメチルなど）；３価以上の脂肪族多価カルボン酸の全てのカルボキシル基がエステル化されているもの（クエン酸トリメチルおよびエチレンジアミン四酢酸テトラメチルなど）などが挙げられる。

カルボン酸のアルキレンオキサイド付加物としては、上記の（Ｂ２−１）で挙げたカルボン酸の、炭素数２〜４のアルキレンオキサイド１〜５０モル付加物などが挙げられる。
アルキレンオキサイドとしては、エチレンオキサイド（以下、ＥＯと略記する。）、プロピレンオキサイド（以下、ＰＯと略記する。）およびブチレンオキサイドが挙げられる。

カルボン酸のアルキレンオキサイド付加物の具体例としては、モノカルボン酸のＥＯ付加物（ギ酸ＥＯ１〜１０モル付加物、酢酸ＥＯ１〜１０モル付加物、プロピオン酸ＥＯ１０モル付加物、酪酸ＥＯ１〜１０モル付加物、カプロン酸ＥＯ２〜２０モル付加物、ラウリル酸ＥＯ１〜２０モル付加物など）；オキシカルボン酸のＥＯ付加物（グリコール酸ＥＯ１〜２０モル付加物、乳酸ＥＯ１〜２０モル付加物、酒石酸ＰＯ１〜５モル付加物など）；脂肪族多価カルボン酸のＥＯ付加物（シュウ酸ＥＯ１〜２０モル付加物、マロン酸ＥＯ１〜２０モル付加物、コハク酸ＥＯ１〜２０モル付加物、グルタル酸ＥＯ１〜２０モル付加物、クエン酸ＥＯ１〜２０モル付加物、マレイン酸ＥＯ１〜２０モル付加物など）；芳香族カルボン酸のＥＯ付加物（フタル酸ＥＯ１〜３０モル付加物、テレフタル酸ＥＯ１〜３０モル付加物など）が挙げられる。

これらの化合物（Ｂ−２）のうち、リフォールディング効果の観点から好ましいのはカルボキシル基もしくはカルボキシレートアニオン基を有する化合物（Ｂ２−１）であり、さらに好ましいのは脂肪族カルボン酸（Ｂ２−１−１）であり、特に炭素数１〜８の脂肪族カルボン酸、例えばギ酸、酢酸、プロピオン酸、乳酸、酒石酸およびそれらの塩である。

本発明におけるアンフォールディングされたタンパク質とは、いかなる方法でアンフォールディングされたタンパク質でもよいが、リフォールディング効果の観点から好ましいのは塩酸グアニジン、尿素またはこれらの併用でアンフォールディングされたタンパク質であり、塩酸グアニジン、尿素またはこれらの合計の濃度が通常０．５モル／Ｌ以上の水溶液中でアンフォールディングされたタンパク質である。
なお、タンパク質が、分子内にＳ−Ｓ結合を含むタンパク質である場合には、塩酸グアニジンおよび／または尿素以外に、さらに２−メルカプトエタノール、ジチオスレイトール、シスチンまたはチオフェノールを加えてアンフォールディングされたタンパク質であってもよい。

本発明のリフォールディング方法は、アンフォールディングされたタンパク質のリフ
ォールディング方法であり、タンパク質を前述のリフォールディング剤で処理する工程を含み、この工程においてリン含有リフォールディング剤（Ｂ１）の場合は、系中の化合物（Ｂ１）の濃度として、通常０．２〜６モル／Ｌで使用され、オキシカルボニル基含有リフォールディング剤（Ｂ２）の場合は、系中の化合物（Ｂ２）の濃度とし、通常て０．０１〜６モル／Ｌで使用される方法である。
リン含有リフォールディング剤（Ｂ１）の場合は、系中の（Ｂ１）の濃度が、通常０．２モル／Ｌ以上、好ましくは０．３モル／Ｌ以上、さらに好ましくは０．５モル／Ｌ以上である。この濃度範囲にあることにより、アンフォールディングされたタンパク質の構造を正常な構造に戻す作用が効果的に発現できる。
（Ａ）の濃度が低過ぎると、リフォールディング効果（アンフォールディングされたタンパク質をリフォールディングすることができる割合）が乏しい。

本発明におけるリン系化合物（Ｂ１）は、系中での濃度が０．２モル／Ｌ以上になると、前記一般式（１）で示される基とタンパク質との水素結合が形成されやすくなるための平衡濃度に達するものと推定される。
なお、従来からリフォールディングの工程において、一般的なリン酸系化合物（例えばリン酸／リン酸ナトリウムなど）が緩衝剤として使用されることがあるが、これらの緩衝剤は、通常０．０２モル／Ｌ以下、高くても０．０５モル／Ｌ以下の濃度で使用されており、リフォールディング作用は認められなかった。
また、系中のリン系化合物（Ｂ１）の濃度が高過ぎると、系の粘度が高くなる傾向があるため、後工程のタンパク質の産生工程におけるタンパク質の分離精製が困難となるため好ましくない。

オキシカルボニル基含有リフォールディング剤（Ｂ２）の場合は、系中の（Ｂ２）の濃度が０．０１モル／Ｌ以上、好ましくは０．０２モル／Ｌ以上、さらに好ましくは０．１モル／Ｌ以上である。この濃度範囲にあることにより、アンフォールディングされたタンパク質の構造を正常な構造に戻す作用が効果的に発現できる。
（Ｂ２）の濃度が低過ぎると、リフォールディング効果（アンフォールディングされたタンパク質をリフォールディングすることができる割合）が乏しい。
本発明における（Ｂ２）は、系中での濃度が０．０１モル／Ｌになると、オキシカルボニル基とタンパク質との特異的な水素結合が形成されやすくなるための平衡濃度に達するものと推定される。
また、系中の（Ｂ２）の濃度が高過ぎると、系の粘度が高くなる傾向があるため、後工程のタンパク質の産生工程におけるタンパク質の分離精製が困難となるため好ましくない。

なお、本発明における「該タンパク質をリフォールディング剤で処理する工程」とは、該タンパク質とリフォールディング剤とを不均一部分が無くなる程度に撹拌・混合する工程であり、その後、リフォールディングをより充分に進めるために必要により一定時間静置することも含まれる。静置時間は例えば１〜５０時間である。

本発明のリフォールディング方法において、さらにｐＨ調整剤（Ｃ）を、予め凝集抑制剤（Ａ）、リフォールディング剤（Ｂ）またはこれらの両方に含有させておくことによりリフォールディング効果を向上させることができ、好ましい。例えば、凝集抑制剤（Ａ）を０．０５モル／ＬのｐＨ調整剤（Ｃ）水溶液で希釈調製して使用してもよい。

同様に、タンパク質安定化剤（Ｄ）を予め（Ａ）、（Ｂ）またはこれらの両方に含有させておくことによりリフォールディング効果を向上させることができ、好ましい。例えば（Ｂ）に０．００１モル／Ｌのタンパク質安定化剤（Ｄ）水溶液で希釈調製して使用してもよい。

ｐＨ調整剤（Ｃ）としては、Ｔｒｉｓ（Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミノエタンスルホン酸）、ＨＥＰＥＳ（Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸）、およびリン酸緩衝剤（例えば、リン酸１水素２ナトリウム＋塩酸水溶液、またはリン酸２水素１ナトリウム＋水酸化ナトリウム水溶液）などが挙げられる。
なお、リン酸緩衝剤を使用する場合は、リン酸緩衝剤がリン酸塩であるため本発明における（Ｂ１）と一部重複する場合もある。しかし、前述のようにｐＨ調整が目的で使用するリン酸緩衝剤の添加濃度の上限は高くても０．０５モル／Ｌであり、本発明のリフォールディング剤としてのリン系化合物（Ｂ１）とｐＨ調整が目的のリン酸緩衝剤とを併用する場合は、（Ｂ１）の系内濃度は０．２〜５．９５モル／Ｌであることが好ましい。

一般的にリフォールディング操作はｐＨ７〜８で行われ、ｐＨ調整剤（Ｃ）の添加量は、この範囲に調整するためであれば、特に限定されないが、（Ｂ１）の添加量に対し、通常は２０％以下であり、リフォールディング効果の観点から０．００１〜２０重量％が好ましく、０．０１〜２０重量％がさらに好ましい。
また、（Ｂ２）の添加量に対して、ｐＨ調整剤（Ｃ）の添加量は、通常は２０重量％以下であり、リフォールディング効果の観点から０．００１〜２０重量％が好ましく、０．０１〜２０重量％がさらに好ましい。

タンパク質安定化剤（Ｄ）としては還元剤、ポリオール類、金属イオン、キレート試薬などが挙げられる。
還元剤としては２−メルカプトエタノール、ジチオトレイトール、アスコルビン酸、還元型グルタチオンおよびシステインなどが挙げられる。
ポリオール類としてはグリセリン、ブドウ糖、ショ糖、エチレングリコール、ソルビトールおよびマンニトールなどが挙げられる。
金属イオンとしてはマグネシウムイオン、マンガンイオンおよびカルシウムイオンなどの２価金属イオンが挙げらる。
キレート試薬としてはエチレンジアミン４酢酸（ＥＤＴＡ）およびグリコールエーテルジアミン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−４酢酸（ＥＧＴＡ）などが挙げられる。

タンパク質安定化剤（Ｄ）の添加量は、（Ｂ１）の添加量に対し、通常は１０重量％以下であり、リフォールディング効果の観点から０．００１〜１０重量％が好ましく、０．０１〜５重量％がさらに好ましい。
また、（Ｂ２）の添加量に対し、タンパク質安定化剤（Ｄ）の添加量は、通常は１０重量％以下であり、リフォールディング効果の観点から０．００１〜１０重量％が好ましく、０．０１〜５重量％がさらに好ましい。

本発明のリフォールディング方法において、タンパク質の系中の濃度は、好ましくは０．２〜３０ｍｇ／ｍＬ、さらに好ましくは０．２〜２０ｍｇ／ｍＬ、特に好ましくは０．２５〜５ｍｇ／ｍＬである。０．２ｍｇ／ｍＬ以上であればタンパク質の生産効率の観点から好ましく、３０ｍｇ／ｍＬ以下であれば系内の粘度が高くなりすぎることが少ないため生産効率が低下しないので好ましい。
また、（Ｂ１）および（Ｂ２）の、タンパク質の重量に対する添加量（重量）は、タンパク質１部に対して好ましくは５〜２，０００部、リフォールディング効果の観点からさらに好ましくは１０〜１，０００部である。

本発明のタンパク質の産生方法は、上記のリフォールディング方法でリフォールディングする工程を含むタンパク質の産生方法である。
本発明のタンパク質産生方法で得られるタンパク質は、上記のリフォールディング方法で得られるため、従来よりも純度が高く、また大希釈を行う必要がないため高い収量を得ることができる。
本発明のタンパク質の産生方法としては、例えば、以下のような順序の工程による産生
方法が挙げられる。
（１）タンパク質の培養工程：大腸菌などのタンパク質生産体に酵素または組み換えタンパク質を培養させる。
（２）溶菌工程：溶菌剤などの使用によってでタンパク質生産体内のインクルージョンボディを取り出す。
（３）アンフォールディング工程；インクルージョンボディ懸濁液（例えば１０ｍｇタンパク質／ｍＬ）に０．５モル／Ｌ以上のアンフォールディング剤および２０ミリモル／Ｌ以下の還元剤を加え軽くかきまぜ室温で数時間放置する。
（４）リフォールディング工程：アンフォールディングされたタンパク質懸濁液に、（Ａ）を加えて軽くかき混ぜた後、（Ｂ１）または（Ｂ２）を加えて軽くかき混ぜ、室温で１晩放置しリフォールディングを行う。
（５）分離・取り出し工程：懸濁液から目的とする正常なタンパク質をカラムクロマトグラフィーなどによって分離して取り出す。

上記の（１）のタンパク質の培養工程におけるタンパク質生産体としては、以下の細菌細胞、エシェリヒア属菌およびバチルス属菌などが挙げられる。
細菌細胞としては、連鎖球菌属（ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ）、ブドウ球菌属（ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ）、エシェリヒア属菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、ストレプトミセス属菌（ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）およびバチルス属菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞、真菌細胞：例えば酵母細胞およびアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）細胞、昆虫細胞：例えばドロソフィラＳ２（ＤｒｏｓｏｐｈｉｌａＳ２）、スポドプテラＳf９（
ＳｐｏｄｏｐｔｅｒａＳｆ９）細胞、動物細胞：例えば、ＣＨＯ、ＣＯＳ、Ｈｅｌａ、Ｃ１２７、３Ｔ３、ＢＨＫ、２９３およびボウズ（Ｂｏｗｓ）メラノーマ細胞、ならびに植物細胞等が挙げられる。
エシェリヒア属菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）としては、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２ＤＨ１〔プロシージング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．）６０巻、１６０頁（１９６８年）を参照〕、ＪＭ１０３〔ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）９巻、３０９頁（１９８１年）を参照〕、ＪＡ２２１〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）１２０巻、５１７頁（１９７８年）を参照〕、ＨＢ１０１〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）４１巻、４５９頁（１９６９年）を参照〕、Ｃ６００〔ジェネティックス（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）３９巻、４４０頁（１９５４年）を参照〕、ＭＭ２９４〔ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）２１７巻、１１１０頁（１９６８年）を参照〕などが挙げられる。
バチルス属菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）としては、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＭＩ１１４〔ジーン、２４巻、２５５頁（１９８３年）を参照〕、２０７−２１〔ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）９５巻、８７頁（１９８４年）を参照〕などが挙げられる。

組み換えタンパク質の培養方法として、目的タンパク質をコードするｃＤＮＡを含有する発現ベクターは、
（ｉ）目的タンパク産生細胞からメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を分離し、該ｍＲＮＡから単鎖のｃＤＮＡを、次に二重鎖ＤＮＡを合成し、該相補ＤＮＡをファージまたはプラスミドに組み込む。
（ｉｉ）得られた組み換えファージまたはプラスミドで宿主を形質転換し、培養後、目的タンパクの一部をコードするＤＮＡプローブとのハイブリダイゼーション、あるいは抗体を用いたイムノアッセイ法により目的とするＤＮＡを含有するファージあるいはプラスミドを単離する。
（ｉｉｉ）その組み換えＤＮＡから目的とするクローン化ＤＮＡを切りだし、該クローン
化ＤＮＡまたはその一部を発現ベクター中のプロモーターの下流に連結することによって製造することができる。
その後、適当な方法により、宿主を発現ベクターで形質転換し培養する。培養は通常１５〜４３℃で３〜２４時間行い、必要により通気、攪拌を加えることもできる。

溶菌工程における溶菌方法としては、超音波による物理的破砕、リゾチーム等の溶菌酵素による処理、界面活性剤等の溶菌剤による処理などのいずれもが使用でき、生産性の観点から溶菌剤による処理が好ましく、有用タンパクを変性させないといった観点から特に特願２００５−１１９１３３記載の溶菌剤による処理が好ましい。

アンフォールディング工程において使用されるアンフォールディング剤としては、塩酸グアニジン、尿素およびこれらの併用などが挙げられる。
なお、タンパク質が、分子内にＳ−Ｓ結合を含むタンパク質である場合には、還元剤として塩酸グアニジンおよび／または尿素以外に、さらに２−メルカプトエタノール、ジチオスレイトール、シスチンまたはチオフェノールなどを加えてもよい。

タンパク質の分離・取り出し工程におけるカラムクロマトグラフィーに使用される充填剤としてはシリカ、デキストラン、アガロース、セルロース、アクリルアミド、ビニルポリマーなどが挙げられ、市販品ではＳｅｐｈａｄｅｘシリーズ、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌシリーズ、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅシリーズ（以上、Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）、Ｂｉｏ−Ｇｅｌシリーズ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）等があり入手可能である。

本発明のタンパク質は、上記のタンパク質産生方法で得られたタンパク質である。
本発明のタンパク質産生方法で得られるタンパク質としては、酵素、組み換えタンパク質および核酸などが挙げられる。

酵素としては、加水分解酵素、異性化酵素、酸化還元酵素、転移酵素、合成酵素および脱離酵素などが挙げられる。
加水分解酵素としては、プロテアーゼ、セリンプロテアーゼ、アミラーゼ、リパーゼ、セルラーゼ、グルコアミラーゼなどが挙げられる。
異性化酵素としては、グルコースイソメラーゼが挙げられる。
酸化還元酵素としては、ペルオキシダーゼなどが挙げられる。
転移酵素としては、アシルトランスフェラーゼ、スルホトランスフェラーゼなどが挙げられる。
合成酵素としては、脂肪酸シンターゼ、リン酸シンターゼ、クエン酸シンターゼなどが挙げられる。
脱離酵素としては、ペクチンリアーゼなどが挙げられる。

組み換えタンパク質としては、タンパク製剤、ワクチン等が挙げられる。
タンパク製剤としては、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターロイキン１〜１２、成長ホルモン、エリスロポエチン、インスリン、顆粒状コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、組織プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）、ナトリウム利尿ペプチド、血液凝固第VIII因子、ソマトメジン、グルカゴン、成長ホルモン放出因子、血清アルブミン、カルシトニン等が挙げられる。
ワクチンとしては、Ａ型肝炎ワクチン、Ｂ型肝炎ワクチン、Ｃ型肝炎ワクチン等が挙げられる。

核酸としては、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）およびリボ核酸（ＲＮＡ）が挙げられる。

以下の実施例により本発明を更に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
下記の実施例１〜５および比較例１〜６の方法でリフォールディングを行いタンパク質を得た。
リフォールディング時の凝集状態に関して観察し、さらに得られたタンパク質の酵素活性を測定し、生産性を評価した。

実施例１
１０ｍｌの滅菌済み試験管に、１０ｍｇの塩化リゾチーム（ナカライテスク社製）および６モル／Ｌ塩酸グアニジン（和光純薬製）水溶液を１ｍｌ加えて、室温で１晩放置しリパーゼをアンフォールディングさせた。
このアンフォールディングされたタンパク質溶液に０．１２５％ＴＷＥＥＮ８０（「ポリソルベート８０」：三洋化成工業社製）２ｍｌを加え軽くかきまぜ、続いて２モル／Ｌリン酸塩（リン酸１水素２ナトリウム：リン酸２水素１ナトリウム＝１：１モル比）（ともに和光純薬製）を３ｍｌ加えて室温で１晩放置してリフォールディングを行った（系中の化合物（Ｂ）の濃度＝１．０モル／Ｌ、リフォールディング工程のタンパク質の系中濃度＝１．７ｍｇ／ｍＬ）。

実施例２
２モル／Ｌリン酸塩のかわりに２モル／Ｌトリポリリン酸ナトリウム（和光純薬製）を加えること以外は実施例１と同様の方法でリフォールディングをおこなった（系中の化合物（Ｂ）の濃度＝１．０モル／Ｌ、リフォールディング工程のタンパク質の系中濃度＝１．７ｍｇ／ｍＬ）。

実施例３
２モル／Ｌリン酸塩のかわりに２モル／Ｌ酢酸ナトリウム塩（和光純薬製）を加えること以外は実施例１と同様の方法でリフォールディングをおこなった（系中の化合物（Ｂ）の濃度＝１．０モル／Ｌ、リフォールディング工程のタンパク質の系中濃度＝１．７ｍｇ／ｍＬ）。

実施例４
２モル／Ｌリン酸塩のかわりに２モル／Ｌ酢酸アンモニウム塩（和光純薬製）を加えること以外は実施例１と同様の方法でリフォールディングをおこなった（系中の化合物（Ｂ）の濃度＝１．０モル／Ｌ、リフォールディング工程のタンパク質の系中濃度＝１．７ｍｇ／ｍＬ）。

実施例５
２モル／Ｌリン酸塩の代わりに２モル／Ｌ酢酸ナトリウム塩（和光純薬製）を加え、０．１２５％ＴＷＥＥＮ８０のかわりに、０．１２５％オレイルアルコールＥＯ１８モル付加物（エマルミン１８０：三洋化成工業製）２ｍｌを加えること以外は実施例１と同様の方法でリフォールディングをおこなった（系中の化合物（Ｂ）の濃度＝１．０モル／Ｌ、リフォールディング工程のタンパク質の系中濃度＝１．７ｍｇ／ｍＬ）。

比較例１
アンフォールディングされたタンパク質溶液に、凝集抑制剤は一切加えず、１．２モル／Ｌリン酸塩（リン酸１水素２ナトリウム：リン酸２水素１ナトリウム＝１：１モル比）（ともに和光純薬製）を５ｍｌのみ加えて室温で１晩放置してリフォールディングを行ったこと以外は実施例１と同様におこなった。（系中の化合物（Ｂ）の濃度＝１．０モル／Ｌ、リフォールディング工程のタンパク質の系中濃度＝１．７ｍｇ／ｍＬ）。

比較例２
アンフォールディングされたタンパク質溶液に、凝集抑制剤は一切加えず、１．２モル／Ｌ酢酸ナトリウム塩（和光純薬製）を５ｍｌのみ加えて室温で１晩放置してリフォールディングを行ったこと以外は実施例１と同様におこなった。（系中の化合物（Ｂ）の濃度＝１．０モル／Ｌ、リフォールディング工程のタンパク質の系中濃度＝１．７ｍｇ／ｍＬ）。

比較例３
このアンフォールディングされたタンパク質溶液に、０．０５％ＴＷＥＥＮ８０（「ポリソルベート８０」：三洋化成工業社製）と１．２モル／Ｌリン酸塩（リン酸１水素２ナトリウム：リン酸２水素１ナトリウム＝１：１モル比）（ともに和光純薬製）からなるリフォールディング剤５ｍｌとを同時に加えて室温で１晩放置してリフォールディングを行った（系中の化合物（Ｂ）の濃度＝１．０モル／Ｌ、リフォールディング工程のタンパク質の系中濃度＝１．７ｍｇ／ｍＬ）。

比較例４ ［大希釈によるリフォールディング−１］
２１０ｍｌの滅菌瓶にアンフォールディングされたタンパク質溶液１ｍｌと、０．１モル／Ｌリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ＝７：和光純薬製）２００ｍｌを入れ軽くかき混ぜ室温で１晩放置してリフォールディングをおこなった。（系中の化合物（Ｂ）の濃度：０．１０モル／Ｌ、リフォールディング工程のタンパク質濃度：０．０５ｍｇ／ｍＬ）

比較例５ ［大希釈によるリフォールディング−２］
１４０ｍｌ容の滅菌瓶に、アンフォールディングされたタンパク質溶液１ｍｌおよび０．０５％セチルトリメチルアンモニウムブロマイド（ＣＴＡＢ）（東京化成製）溶液７０ｍｌを加えて、室温で１時間放置し、２％シクロアミロース（江崎グリコ製）溶液を３０ｍｌ加え１晩放置した（系中の化合物（Ｂ）の濃度：０モル／Ｌ、リフォールディング工程のタンパク質濃度＝０．１ｍｇ／ｍＬ）。

比較例６ ［透析によるリフォールディング］
アンフォールディングされたタンパク質溶液１ｍｌを透析装置に入れ、０．１モル／Ｌ Ｔｒｉｓバッファー（ｐＨ＝７：和光純薬製）を徐々に加え、徐々に希釈していきリフォールディングをおこなった。２００ｍｌのＴｒｉｓバッファーを加えたところで終了した（系中の化合物（Ｂ）の濃度：０モル／Ｌ、リフォールディング工程のタンパク質濃度＝０．０５ｍｇ／ｍＬ）。

＜凝集抑制効果の確認＞
実施例１〜５、および比較例１〜６において、リフォールディング中の凝集抑制効果を下記の尺度で判断した。
○：目視で凝集物が一切認められない
×：目視で一部でも凝集物が認められる

＜酵素活性の測定＞
１０ｍｌの滅菌済み試験管に０．５重量パーセント濃度の枯草菌溶液を３ｍｌを入れ、実施例１〜５または比較例１〜６で得られたタンパク質溶液を１０μｌマイクロピペットで加えて軽くかき混ぜた。吸光度（４５０ｎｍ）を紫外可視分光光度計（島津製作所製、ＵＶ−２５５０）で３分毎に１２分間測定し、時間に対する吸光度の減少割合から分解反応の初速度Ｋａを算出した。
また実施例１〜５または比較例１〜６のそれぞれのタンパク質濃度と同濃度の「リゾチーム」水溶液を調製し、それらを用いて上記と同様に枯草菌の分解反応の初速度Ｋｂを算出した。
実施例１〜５および比較例１〜６の酵素活性（％）を以下の式で算出した。
酵素活性（％）＝（Ｋａ／Ｋｂ）×１００

＜タンパク質の生産性の評価＞
タンパク質の生産性を以下の指標で定義し、評価した。
生産性
＝リフォールディング工程のタンパク質の系中濃度（ｍｇ／ｍＬ）×酵素活性（％）

実施例１〜５と比較例１〜６の凝集抑制効果、酵素活性、生産性の評価結果を表１と表２に示す。

本発明のリフォールディング方法を用いると、有用な各種のタンパク質を、凝集させること無く、高純度で、かつ効率よく産生することができる。
本発明のタンパク質産生方法で得られるタンパク質としては、酵素、組み換えタンパク質および核酸などが挙げられる。

Claims (7)

1. アンフォールディングされたタンパク質のリフォールディング方法において、タンパク質の重量に対して２５〜５００重量％の非イオン性界面活性剤（Ａ１）でタンパク質を処理した後に、リン酸、ピロリン酸、トリポリリン酸及びそれらの塩からなる群より選ばれる１種以上の化合物（Ｂ１）又は炭素数１〜８の脂肪族カルボン酸及びその塩からなる群より選ばれる１種以上の化合物（Ｂ２）からなるリフォールディング剤（Ｂ）で処理することを特徴とするリフォールディング方法であって、
   非イオン性界面活性剤（Ａ１）が高級アルコールのアルキレンオキサイド付加物及び多価アルコール型非イオン性界面活性剤であり、
   リフォールディング剤（Ｂ）でタンパク質を処理する工程において、化合物（Ｂ１）の系中の濃度が１〜６モル／Ｌ又は化合物（Ｂ２）の系中の濃度が１〜６モル／Ｌであるリフォールディング方法。
2. 高級アルコールのアルキレンオキサイド付加物が、炭素数８〜２４の高級アルコールのエチレンオキサイド１〜２０モル付加物である請求項１に記載のリフォールディング方法。
3. 多価アルコール型非イオン性界面活性剤が、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミテート、ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート及びポリオキシエチレンソルビタンモノオレートである請求項１又は２に記載のリフォールディング方法。
4. アンフォールディングされたタンパク質が、塩酸グアニジンおよび／または尿素でアンフォールディングされたタンパク質である請求項１〜３いずれか記載のリフォールディング方法。
5. ｐＨ調整剤（Ｃ）および／またはタンパク質安定化剤（Ｄ）の存在下で非イオン性界面活性剤（Ａ１）および／またはリフォールディング剤（Ｂ）でタンパク質を処理する請求項１〜４いずれか記載のリフォールディング方法。
6. リフォールディング剤（Ｂ）で処理する工程における系中のタンパク質の濃度が０．２〜３０ｍｇ／ｍＬである請求項１〜５いずれか記載のリフォールディング方法。
7. 請求項１〜６のいずれか記載のリフォールディング方法でリフォールディングする工程を含むタンパク質の産生方法。