JP5240205B2

JP5240205B2 - 精巣の疼痛又は不快感行動及び頻尿併発モデル動物

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Publication number: JP5240205B2
Application number: JP2009548957A
Authority: JP
Inventors: 正幸棚橋; 克郎吉岡
Original assignee: Astellas Pharma Inc
Current assignee: Astellas Pharma Inc
Priority date: 2008-01-11
Filing date: 2009-01-09
Publication date: 2013-07-17
Anticipated expiration: 2029-01-09
Also published as: US8426673B2; JPWO2009088054A1; EP2292089A1; US20100313282A1; CA2711865A1; WO2009088054A1; US20130202534A1

Description

本発明は、精巣の疼痛又は不快感行動と頻尿症状を併発した病態モデル動物、及び、該病態モデル動物を使用した骨盤疼痛症候群、とりわけ非細菌性慢性前立腺炎の治療薬のスクリーニング方法に係るものである。

骨盤疼痛症候群とは、2002年に国際禁制学会（International Continence Society）によって『下部尿路機能、性機能、腸機能もしくは婦人科機能の不全を示唆する症状を伴う、持続的もしくは再発性の骨盤疼痛の発現であり、明らかな感染やその他の明らかな病変が無いもの』と定義された骨盤部における疼痛疾患の総称である (非特許文献１参照)。骨盤疼痛症候群の構成疾患は、泌尿器疼痛、婦人科疼痛、肛門／直腸疼痛、神経学的疼痛、筋肉疼痛に分類され、とりわけ泌尿器疼痛症候群が挙げられる。この泌尿器疼痛症候群は、更に膀胱痛症候群、尿道痛症候群、陰茎痛症候群、前立腺痛症候群および陰嚢痛症候群に分類される (非特許文献２参照)。
非細菌性慢性前立腺炎は、代表的な泌尿器疼痛疾患の一つであり、1999年に米国国立衛生研究所（NIH）が提唱した前立腺炎症候群の４分類のカテゴリーIIIとして、会陰部、精巣部、陰茎部などの骨盤部の疼痛／不快感と残尿感、頻尿などの排尿症状を主症状とする一群の疾患として分類されている。しかし、カテゴリーIの急性細菌性前立腺炎やカテゴリーIIの慢性細菌性前立腺炎とは異なり、病因が不明であるために決定的な治療法は見出されていない。前立腺肥大症や間質性膀胱炎、過活動膀胱など下部尿路症状を呈する他の疾患と比べて、非細菌性慢性前立腺炎に特徴的な症状としては、精巣を含む男性生殖器の疼痛があり、NIHの慢性前立腺炎症状インデックス(NIH-CPSI)にも挙げられている（例えば、非特許文献３参照）。

一般的な鎮痛薬の評価モデルとしては、ラットの腹腔内に酢酸を投与して疼痛行動（writhing）を惹起した動物モデルが汎用されている（例えば、非特許文献４参照）。
下部尿路周辺の疼痛の評価モデルとしては、酢酸をラットの膀胱内に投与した膀胱疼痛モデルや（例えば、非特許文献５参照）、シクロフォスファミドをラットに投与して膀胱壁に障害して膀胱炎を惹起した疾患モデル（例えば、非特許文献６参照）、アセトンをアフリカ緑サルに膀胱内投与して過敏性膀胱症候群を惹起した疾患モデル（例えば、非特許文献７参照）、オーエスキー病ウイルス(pseudorabies virus)をマウスの尾底筋に注入した神経性膀胱炎のモデル（例えば、非特許文献８参照）、或いは、カプサイシンをラットの前立腺内に注入して前立腺内の炎症とその炎症に相関した疼痛行動を惹起した疾患モデル（例えば、非特許文献９参照）が報告されている。
一方、前立腺炎のげっ歯類モデルとしては、ホルモンやストレス、大豆欠乏／過剰給餌、尿道の機械的閉塞によるものや、刺激物質（ethanol/DNBS）の尿道経由での前立腺への滴下によるものが報告されている（例えば、非特許文献１０参照）。

Urology, 2003, 61, p37-49 European Urology, 2004, 46, p681-689 Journal of Urology, 1999, 162, p369-375 Arzneimittal-Forschung Drug Research, 1975, 25(10), p1505-1509 The Journal of Urology, 2004, 172, p1529-1532 The Journal of Urology, 2000, 164, p203-208 Neurourology & Urodynamics, 1995, 14(6), p657-665 American Journal of Physiology Regulatory Integrative and Comparative Physiology, 2007, 293, p1191-1198 European Urology, 2007, 51, p1119-1127 Prostate Cancer and Prostatic Diseases, 10, p15-29

非細菌性慢性前立腺炎の治療薬の創製の為には、多数の被験物質を効率的に評価できる病態モデル動物を用いたスクリーニングが不可欠である。しかし、非細菌性慢性前立腺炎の病態を反映したモデル動物は報告されていない。
そこで、本発明者らは、非細菌性慢性前立腺炎の特徴的な症状である精巣の疼痛／不快感と頻尿症状を評価するモデル動物とそれを用いたスクリーニング方法の開発を目的として、鋭意検討を行った。

その結果、動物の精巣内に刺激物質を投与することにより、疼痛又は不快感行動と排尿機能変化を惹起させることができることを見出した。
すなわち、本発明は、
［１］小型哺乳動物の精巣内に刺激物質を投与して疼痛又は不快感行動および頻尿症状を惹起させることを特徴とする病態モデル動物；
［２］刺激物質が酢酸又は神経成長因子（NGF）である［１］に記載の病態モデル動物；
［３］小型哺乳動物がげっ歯類動物である［１］に記載の病態モデル動物；及び
［４］げっ歯類動物がラットである［３］に記載の病態モデル動物；に関する。
また、本発明は、
［５］［１］〜［４］のいずれかに記載の病態モデル動物に被験物質を投与し、疼痛又は不快感行動及び／又は頻尿症状を測定することを特徴とする骨盤疼痛症候群の治療薬のスクリーニング方法；
［６］骨盤疼痛症候群が泌尿器疼痛症候群である［５］に記載の治療薬のスクリーニング方法；
［７］泌尿器疼痛症候群が非細菌性慢性前立腺炎である［６］に記載の治療薬のスクリーニング方法；及び
［８］病態モデル動物の精巣内に刺激物質を投与する前又は後に被検物質を投与し、その疼痛又は不快感行動及び／又は頻尿症状を改善する披験物質を選択することを特徴とする［５］〜［７］のいずれかに記載のスクリーニング方法；に関する。

本発明の病態モデル動物は、精巣内に刺激物質を投与することにより、代表的な鎮痛薬で抑制される疼痛又は不快感行動を起こすとともに、膀胱を直接障害していないにもかかわらず、頻尿症状を発現する。当該病態モデル動物は泌尿器／生殖器における疼痛／不快感と頻尿症状を有する下部尿路疾患、とりわけ非細菌性慢性前立腺炎の病態モデルとして極めて有用である。
従って、本発明により、非細菌性慢性前立腺炎の治療剤候補物質を効率的に評価することができる。

ラット精巣内への蒸留水および酢酸水溶液投与による特徴的な行動の発現回数を示した図である。 1%酢酸精巣内投与によるラット特徴的行動回数に対する、インドメタシンの効果を示した図である。有意差は Student's t-test 法により算出し、＊は p＜0.01 を表す。ラット精巣内への 100 μg/kgNGF 投与による特徴的な行動の発現時間を示した図である。有意差は Dunnett 法により算出し、＊は p＜0.01 を表す。 100 μg/kg NGF 精巣内投与によるラット特徴的な行動の発現時間に対する、モルヒネの効果を示した図である。有意差は Student's t-test 法により算出し、＊は p＜0.01 を表す。ラット精巣内への蒸留水および1% 酢酸投与による有効膀胱容量の変化を示した図である。有意差は Student's t-test 法により算出し、＊は p＜0.05 を表す。ラット精巣内への生理食塩水および 100 μg/kg NGF投与による有効膀胱容量の変化を示した図である。有意差は Student's t-test 法により算出し、＊は p＜0.01 を表す。

以下、本発明を更に詳細に説明する。
本発明で用いる小型哺乳動物としては、例えば、げっ歯類動物であるラット、マウス、スナネズミ、ウサギ、モルモット、ハムスター等が挙げられる。小型哺乳動物は雄であれば、週齢、体重等については、目的とするスクリーニングに適用可能である限り、特に制限はない。
本発明で用いる刺激物質とは、動物の体内に投与することにより疼痛及び／又は不快感を生じさせて疼痛又は不快感行動を惹起する物質であり、例えば、酢酸、神経成長因子 (NGF)、プラズマキニン、セロトニン、ヒスタミン、アセチルコリン、ATP、プロスタグランジン、アラキドン酸、アラキドン酸代謝物、カプサイシン、サイトカイン、血小板活性化因子、活性酸素、一酸化窒素 (NO)、グルタミン酸、タキキニン、ニューロキニン、血管作動性腸ペプチド (VIP)、Pituitary adenylate cyclase activating peptide (PACAP)、コレシストキニン、ドーパミン、ノルアドレナリン、ニューロペプチドY、ガラニン、ボンベシン、ニューロメジン、オピオイドペプチド、ノシセプチン、ノシスタチン、オレキシン、カンナビノイド、神経栄養因子、エンドセリン、バソプレッシン、ホルモン、起炎物質、カリウムイオン、水素イオンおよび、上記生理活性物質の生理作用を直接的または間接的に活性化および阻害する化学物質が挙げられる。刺激物質の投与量は、動物の種類や体重、刺激物質の性質に応じて適宜調整する。例えば、ラットに投与する場合には、酢酸は0.1%〜10％水溶液を1mL/kg程度の量で、NGFは0.1〜1000μg/mL/kgが好適である。通常は水、生理食塩水又は溶媒に希釈して注射器で精巣内に投与するが、特にこの方法に限らない。

疼痛又は不快感行動とは、疼痛／不快刺激を受けた動物に観察される特徴的な行動であり、例えば、1) 床と平行方向に体全体を伸ばす、2) 下腹部を床に押し付ける、3) 床と垂直方向に背中を丸めた状態で伸びる、4) 後肢を体の内側に入れ込み、脇腹を屈曲させる、5) 陰嚢を含めた下腹部周辺を舐める、6) 後肢で身体を掻く、7)後肢を噛む、といった行動が挙げられる。被検動物の疼痛又は不快感行動は、刺激物質投与後５〜２５分、１０〜３０分といった一定時間内の上記1)〜7)の一部又は全ての回数および時間を計測することにより評価できる。
頻尿症状とは排尿回数の増加を意味し、何らかの原因で尿量が多くなる多尿に基づくものと、尿量が正常にも関わらず尿意が頻繁に起こるものに分類される。これら頻尿症状は動物モデルにおいて、排尿回数、排尿間隔などの観察または膀胱内圧や膀胱容量の測定等により評価できる。例えば、膀胱容量の測定は、実施例２に示す有効膀胱容量の測定により行うことができる。他にも、継時的にラットの排尿量と排尿回数を測定することにより、排尿量/1回排尿として測定できる。

本発明のスクリーニング方法において、被検物質の投与は刺激物質投与前後のいずれでもよいが、通常は刺激物質投与の5分〜2時間前に投与される。
被験物質としては、公知又は新規な合成化合物、ペプチド、タンパク質等の他に、例えば、温血哺乳動物の組織抽出物、細胞培養上清等が用いられる。公知合成化合物として、例えば、WO01/14380、WO01/32653、WO01/78693、WO02/20479、WO02/20513、WO03/027111、特開2003-231687、WO2005/049033、WO2005/103010、WO2005/076695、WO2007/123269等に開示されたtrkA受容体阻害剤や、WO95/01338、WO95/24381、WO01/87281、WO01/30779、WO02/102778、WO96/06843、WO97/19078、WO05/49087、特開平11-292878、特開平11-292877、US6544983等に開示されたＰＤＥ４阻害剤が挙げられる。
被験物質の投与は、被験物質の特性に合わせて経口投与、静注投与、経皮投与等により行う。被験物質を経口投与する場合は、水や有機溶媒に溶解して液状にし、シリンジやスポイト等で動物に強制投与する方法が好ましい。
本発明のスクリーニング方法の実施に際しては、被検物質の代わりに、披検物質投与溶媒を投与した対照群を比較対照に用いることが好ましい。

以下に実施例に基づいて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
実施例１
１．ラット精巣内への刺激物質投与方法
雄性Wistar ラット 5〜12 週齢 (日本チャールズリバー社製) を用いた。ラットの腰部を背中側から保定し、精巣の位置を確認し、27G の注射針の付いた注射筒を用い、刺激物質の液量として 1 mL/kg を左右両精巣内に投与した。
２．精巣内投与の確認方法
精巣内投与が成功すれば、精巣が膨らみ、触ると硬い感触となる。投与後精巣が膨らまない個体については、投与失敗と判断し、実験使用動物より除外した。また、刺激物質と同時に色素を精巣内投与し、実験終了後に精巣内の色素の分布を目視することによっても、刺激物質投与が成功したか否かを確認した。
３．データ解析
各群の値は平均値および標準誤差で示した。２群の比較には、当業者に良く知られた検定法であるパラメトリック Student's t-test 法によって有意差を検定した。３群以上の検定にはパラメトリック Dunnett 法によって有意差を検定した。有意水準は両側 5 % とした。

４．ラット酢酸精巣内投与モデルの行動変化
(1) 酢酸用量検討：0.3, 1, 3% 酢酸水溶液もしくはコントロール群として注射用蒸留水を 1 mL/kg で左右の精巣に投与し、透明塩化ビニール製の観察ケージ (夏目製作所) にて行動観察を行った。コントロール群および0.3%酢酸精巣内投与群では，ラットの行動に特に変化は認められなかった。一方，１および3%の酢酸投与群においては、処置後約 5 分から以下のような特徴的な行動が現れた： 1) 床と平行方向に体全体を伸ばす、2) 下腹部を床に押し付ける、3) 床と垂直方向に背中を丸めた状態で伸びる、4) 後肢を体の内側に入れ込み、脇腹を屈曲させる、5) 陰嚢を含めた下腹部周辺を舐める。これら特徴的な行動のうち、発生頻度の多かった1)〜3) の回数を、酢酸投与後 5〜20 分の15分間計測した。その結果、前述したように蒸留水投与群および0.3%酢酸投与群では前述の特徴的な行動の発現は認められなかったが、１および3%酢酸投与群では、1)〜3)の特徴的な行動の平均値および標準誤差はそれぞれ 16±2 回および 19±6 回観察された (図１)。

(2) 鎮痛薬評価：1% 酢酸精巣投与前 1 時間に、抗炎症薬であるインドメタシン 5 mg/kg (シグマ社) および vehicle 群として 0.1 % Na₂CO₃水溶液を液量として 3 mL/kg を経口投与し、酢酸投与後 5〜20 分の 15 分間における特徴的行動の回数を前述と同様に計測した。vehicle 投与群の特徴的行動回数の平均値および標準誤差は 19±6 回で、1% 酢酸精巣内投与前に何も投与していない control 群と比べ、1%酢酸精巣内投与による特徴的行動の回数に影響を与えなかったが、インドメタシン投与群では、vehicle 投与群に比べ、特徴的な行動回数が3±2 回と顕著かつ有意に減少した (図２)。

５．ラット神経成長因子 (NGF) 精巣内投与モデルの行動変化
(1) NGF 用量検討：10, 30, 100 μg/mL NGF (mouse NGF 2.5S, Alomone labs社) もしくはコントロール群として生理食塩水をいずれも1 mL/kg の液量を左右精巣に投与し、観察ケージにて行動観察を行った。30および100μg/mL NGF投与群において、投与後約 10 分から以下のような特徴的な行動が現れた： 1) 後肢により、身体を激しく掻く、2) 後足の足先を噛む、3) 陰嚢を含めた下腹部周辺を舐める。これら特徴的な行動のうち、1)の「後肢により、身体を激しく掻く」行動の頻度が多く，また長時間観察されるそこで1) の行動時間を、NGF 投与後 10〜30 分の20分間にストップウォッチにて計測した。コントロール群と比べ、NGF 投与群では特徴的な行動変化が認められ、100μg/mL NGF投与では、身体を激しく掻く時間は155±29 秒とコントロール群の 1.0±0.4秒に比べて顕著かつ有意に長く観察された (図３)。

(2) 鎮痛薬評価：100 μg/kg NGF 投与前 30 分に、麻薬性鎮痛薬であるモルヒネ 5 mg/kg (武田薬品工業) および vehicle 群として生理食塩水をいずれも液量として 1 mL/kg を皮下投与し、NGF 投与後 10〜30 分の20分間における前述の身体を激しく掻く時間を測定した。vehicle 投与群の特徴的な行動変化時間は 167 ±31 秒であり、100μg/kg NGF 投与前に何も投与していない control 群と比べ、100μg/kg NGF 投与による身体を激しく掻く時間に影響を与えなかったが、モルヒネ投与群では、vehicle 投与群に比べ、9±4 秒と顕著かつ有意に減少した (図４)。

実施例２
１．膀胱機能測定
雄性Wistar ラット8〜12 週齢 (日本チャールズリバー社製) を用いた。ジエチルエーテル麻酔下に腹部を切開し、膀胱を露出させた。膀胱頂部より PE50 で作製したカテーテルを膀胱内に挿入し、挿入口において膀胱壁とカテーテルを絹糸で結紮した。カテーテルは腹腔から皮下を通し、頸部の背側から対外に出した。動物は手術後、個別ケージにて飼育し、翌日にラットをボルマンケージ (夏目製作所) に保定した。膀胱に留置したカテーテルに三方活栓を装着し、インフュージョンポンプ (テルモ) を用いて、4 mL/hr の注入速度で生理食塩水を膀胱内に持続注入した。また同時に圧トランスデューサー(ライフキット、日本光電) に接続し、ポリグラフシステム (RMP-6008M、日本光電)に組み込まれたひずみ圧用アンプ（AP-621G、日本光電）を介し、レコーダー(LINEARCORDER WR3320、グラフテック) にて継時的に膀胱内圧を測定した。この膀胱機能測定における排尿間隔から各排尿の膀胱内注入開始から排尿までの時間を算出し、その時間に膀胱内への生理食塩水の注入速度を乗じることにより有効膀胱容量を算出した。
２．データ解析
各群の値は平均値および標準誤差で示した。2 群の比較には、当業者に良く知られた検定法であるパラメトリック Student's t-test 法によって有意差を検定した。有意水準は両側 5 % とした。

３．ラット精巣内酢酸投与モデルの排尿機能変化
膀胱内圧測定開始後約 3 時間以上経過し、排尿パターンが安定した時点で約 1 時間の精巣内投与前の有効膀胱容量を測定した。その後、ラットをボルマンケージから取り出し、精巣内に 1 % 酢酸水溶液もしくは注射用蒸留水を液量として 1 mL/kg を左右両精巣に投与した。精巣内投与後 30〜60 分の有効膀胱容量を測定し、精巣内投与前値からの変化率を算出した。注射用蒸留水処置群の有効膀胱容量の変化率は 97±8% と特に変化は認められなかった。一方，1 % 酢酸水溶液精巣内投与により有効膀胱容量は53±12 %と顕著に低下した。また，その低下は注射用蒸留水投与群との比較においても有意な変化であった (図５)。

４．ラット精巣内 NGF 投与モデルの排尿機能変化
膀胱内圧測定開始後約 3 時間以上経過し、排尿パターンが安定した時点で約 1 時間の精巣内投与前の有効膀胱容量を測定した。その後、ラットをボルマンケージから取り出し、精巣内に 100 μg/kg もしくは生理食塩水を液量として 1 mL/kg を左右両精巣に投与した。精巣内投与後 30〜60 分の有効膀胱容量を測定し、精巣内投与前値からの変化率を算出した。生理食塩水投与群の有効膀胱容量の変化率は104±14% と特に変化は認められなかった。一方，100 μg/kg NGF精巣内投与により有効膀胱容量は29±9%と顕著に低下した。また，その低下は生理食塩水投与群との比較においても有意な変化であった (図６)。

実施例３ラット酢酸精巣内処置モデルを用いたスクリーニング
１．行動変化
実施例１と同様に作成するラット酢酸精巣内処置モデルの特徴的行動の回数を測定する。被検物質は1〜100 mg/kg を0.5% メチルセルロース水溶液に溶解あるいは懸濁して液量3〜5 mL/kg とし、1% 酢酸精巣処置の15〜60 分前に経口投与し、酢酸処置後 5〜20 分の 15 分間における特徴的行動の回数を計測する。
２．排尿機能変化
実施例２と同様にラット酢酸精巣内処置モデルの排尿機能変化を測定する。
被検物質は1〜100 mg/kg を0.5% メチルセルロース水溶液に溶解あるいは懸濁して液量3〜5 mL/kg とし、1% 酢酸精巣処置の15〜60分前に経口投与する。約 1 時間の精巣内処置前の有効膀胱容量と精巣内処置後 30〜60 分の有効膀胱容量を測定し、変化率を算出する。
３．被検物質の選択
0.5% メチルセルロース水溶液のvehicle 投与群に比べ、特徴的な行動回数及び有効膀胱容量の変化率の一方または両方が有意に減少した被検物質を、非細菌性慢性前立腺炎の治療剤候補物質として選択する。

本発明の精巣の疼痛又は不快感行動と頻尿を併発した病態モデル動物は骨盤疼痛症候群、とりわけ非細菌性慢性前立腺炎の病態を反映したモデルとして極めて有用であり、この病態モデル動物を用いたスクリーニング方法により、骨盤疼痛症候群、とりわけ非細菌性慢性前立腺炎の治療剤候補物質を効率的に評価することができる。

Claims

小型哺乳動物の精巣内に刺激物質を投与して疼痛又は不快感行動および頻尿症状を惹起させることを特徴とする病態モデル動物。
刺激物質が酢酸又は神経成長因子（NGF）である請求項１記載の病態モデル動物。
小型哺乳動物がげっ歯類動物である請求項１記載の病態モデル動物。
げっ歯類動物がラットである請求項３記載の病態モデル動物。
請求項１〜４のいずれか記載の病態モデル動物に被験物質を投与し、疼痛又は不快感行動及び／又は頻尿症状を測定することを特徴とする骨盤疼痛症候群の治療薬のスクリーニング方法。
骨盤疼痛症候群が泌尿器疼痛症候群である請求項５の治療薬のスクリーニング方法。
泌尿器疼痛症候群が非細菌性慢性前立腺炎である請求項６の治療薬のスクリーニング方法。
病態モデル動物の精巣内に刺激物質を投与する前又は後に被検物質を投与し、その疼痛又は不快感行動及び／又は頻尿症状を改善する披験物質を選択することを特徴とする請求項７のスクリーニング方法。