JP5132851B2 - 新しい免疫防御性インフルエンザ抗原及びそのワクチン接種への使用 - Google Patents

Description

【０００１】
本発明は、自然状態では存在しない新しい免疫防御性インフルエンザ抗原に関する。本発明は、更に、ワクチン接種のための抗原の使用及び抗原を調製する方法のみならずそれらを含有するワクチンに関する。
【０００２】
インフルエンザは、ミクソウイルス群のＲＮＡウイルスが引き起こす。インフルエンザウイルスは、核タンパク質及び基質タンパク質の抗原性の相違に基づき３つの型（Ａ，Ｂ及びＣ）に分類することができる。タイプＣが７本のＲＮＡセグメントを有するのに対しタイプＡ型およびＢ型インフルエンザウイルスはそれぞれ８本のＲＮＡセグメントを含有する。Ａ型インフルエンザが最有力であり、また、例えばブタや馬のような動物に対してだけでなくヒトに対しても病原性である。
【０００３】
Ｂ型インフルエンザは、ヒトで疾病を引き起こす。Ｃ型インフルエンザは、あまり重篤でなく、ヒト及びブタから単離される。このウイルスは、空気、多くは咳及びくしゃみの間に吐出された水滴を介して伝播する。インフルエンザウイルスは、通常咳、高熱及び筋肉痛を伴う気道の感染症を引き起こす。
【０００４】
インフルエンザ感染症は、感染個体の死因となることはまずないが、病的状態は重篤になる可能性がある。それゆえに、インフルエンザ流行は、結果として実質的な経済損失となる。更に、インフルエンザ感染は、例えば心臓麻痺の苦しみを有する人、ＣＡＲＡ患者又は高齢者のような特定集団にとってはより危険である可能性がある。インフルエンザワクチンは、それゆえ多いに望ましい。
【０００５】
Ａ型インフルエンザウイルスは、その膜内に、免疫原性は高いが極めて変化しやすい２つのタンパク質、すなわちヘマグルチニンとノイラミニダーゼを含有する。これらの２つのタンパク質の可変性のため、広域で持続するＡ型インフルエンザワクチンは、これまで開発されなかった。通常使用されるインフルエンザワクチンは、ウイルスの抗原ドリフトに追随するため殆ど毎年適応させなければならない。この状況で、ワクチンは免疫した人の約８０％を守ることができる。ウイルスに、抗原シフトとして知られる、より劇的な変化が生じた場合は、ワクチンは、もはや防御するものではない。
【０００６】
急速に変化するヘマグルチニン及び／又はノイラミニダーゼに基づかず、それゆえそれらに基づく周知の抗原及びワクチンの不都合のないワクチンに使用するための新しい免疫防御性の抗体を提供することが本発明の目的である。
【０００７】
本発明につながる研究で、防御を誘発することができる、ヘマグルチニン及びノイラミニダーゼ以外の、良く保存されたインフルエンザの膜タンパク質が発見された。この研究方法に特に有用なのは膜タンパク質Ｍ２である。
【０００８】
Ｍ２ ｍＲＮＡは、Ａ型インフルエンザウイルスの第７ＲＮＡセグメントがコードする。それはスプライスされたｍＲＮＡによりコードされる（Lamb et al., 1981）。ヘマグルチニンやノイラミニダーゼのように、Ｍ２タンパク質は、Ａ型インフルエンザウイルスの不可欠な膜タンパク質である。しかし、このタンパク質はとても小さく、たった９７アミノ酸長である。アミノ末端の２４個のアミノ酸は膜表面の外側に露出しており、１９個のアミノ酸は脂質２重層にかかり、残りの５４残基は膜の細胞質側に位置する（Lamb el al., 1985）。
【０００９】
Ｍ２タンパク質は、Ａ型インフルエンザ感染細胞の細胞表面で多量に発現する（Lamb et al., 1985）。このタンパク質は、ウイルス粒子自身の膜でも見出されるが、極めて少量であり、ウイルス粒子あたりＭ２が１４〜６８分子である（Zebedee and Lamb, 1988）。Ｍ２タンパク質は、位置５０のシステインへのパルミチン酸の付加により翻訳後修飾される（Sugrue et al., 1990）。
【００１０】
Ｍ２タンパク質は、非共有結合の相互作用により結合する、ジスルフィド結合した２個の２量体からなるホモ４量体である（Sugrue and Hay, 1991）。部位特異的突然変異誘発により、Holsinger and Lamb (1991)は、位置１７および１９のシステイン残基はジスルフィド架橋形成に含まれることを証明した。位置１７のシステインだけが、分析した全てのウイルスに存在し、それゆえ、おそらくこれが最重要残基であると思われる。システイン１９も存在するウイルス株では、２番目のジスルフィド架橋が、同じ２量体内（すでにＣｙｓ１７−Ｃｙｓ１７で連結された）か他の２量体と形成されるかは不明である。
【００１１】
Ｍ２タンパク質配列と並べることにより、Ａ型インフルエンザウイルスの異なるヒト系統から単離された、Ｍ２タンパク質の細胞外部分の著しい保存が、明らかとなった（Table １）。１９３３年に最初のヒトＡ型インフルエンザ株、Ａ／ＷＳ／３３（Ｈ１Ｎ１）、が単離されてから、最近配列決定されたウイルスＡ／Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ／３９／８９（Ｈ３Ｎ２）まで、Ｍ２タンパク質の細胞外ドメインでは、アミノ酸変化が全く観察されていない。２系統のウイルス株がこの保存傾向にあてはまらない、１個のアミノ酸変化を示すＡ／ＰＲ／８／３４と３個のアミノ酸相違を示すＡ／Ｆｏｒｔ Ｍｏｎｍｏｕｔｈ／１／４７（Ｈ１Ｎ１）である。これら２つの株は、多分、進化系統樹の横枝を意味するのだろう。
【００１２】
Table １はウイルス株Ａ／ＷＳＮ／３３（Markushin et al. (1988)）、Ａ／ＰＲ／８／３４（Allen et al. (1980)、Winter and Fields(1980) ）、Ａ／ＷＳ／３３、Ａ／Ｆｏｒｔ Ｗａｒｒｅｎ／１／５０、Ａ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／１／５７及びＡ／Ｐｏｒｔ Ｃｈａｌｍｅｒｓ／１／７３（全てZebedee and Lamb(1989)に記載）、Ａ／Ｕｄｏｒｎ／７２（Lamb and Lai(1981)）、Ａ／Ｌｅｎｉｎｇｒａｄ／１３４／５７（Klimov et al.(1992)）、Ａ／Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ／６／６０（Cox et al.(1988)）、Ａ／Ｂａｎｇｋｏｋ／１／７９（Ortin et al.(1983)）、Ａ／Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ／８３（Belshe et al. (1988)）、Ａ／Ｆｏｒｔ Ｍｏｎｍｏｕｔｈ／１／４７（EMBL U02084）、Ａ／ＵＳＳＲ／９０／７７（EMBL X53029）及びＡ／Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ／３９／８９（EMBL L 18999）のＡ型インフルエンザＭ２タンパク質の細胞外ドメインのアミノ酸配列の概要を示す。
【００１３】
【表１】

【００１４】
膜タンパク質のこの型の保存された形質は、ワクチン開発の良き候補とすることができることを本発明者は予想する。原則として、抗Ｍ２抗体の防御能は既知である。実験データは、抗Ｍ２タンパク質（１４Ｃ２）細胞外部分のモノクローナル抗体は、ウイルスの伝播を縮小することができることを実証するが、in vitroではウイルスの感染力は減少しない（Zebedee and Lamb, 1988）。
【００１５】
更に、受動投与したモノクローナル抗体（１４Ｃ２）は、マウスの肺でのウイルス増殖を阻害することができることが証明された（Treanor et al., 1990）。両研究方法とも、抗Ｍ２抗体の投与に依存する。しかし、反復投与での異種免疫グロブリンの免疫原性は、身体からの抗体除去となり、こうして処置の効力の減少につながることから、感染に対する防御手段としてのモノクローナル抗体の受動投与は、好ましくは回避する。
【００１６】
相同抗体でも抗イディオタイプ抗体を誘発する。更に、ウイルスに感染したヒトは抗Ｍ２抗体を有するが、これらは感染を防御しない（その濃度かその特性のどちらかが、効果付与に十分でない）。これが、抗Ｍ２抗体の受動投与がヒトにおける使用に適切である見込みをなくす。この抗原に基づくヒトのワクチンを開発する試みが消え去ることも教示する。
【００１７】
最近、同種又は異種ウイルスの感染に対するマウスの防御が説明された（Slepushikin et al., 1995）。この著者等は、不完全フロイントアジュバントと免疫化のための完全Ｍ２タンパク質を発現するＳｆ９細胞の膜抽出物を使用した。しかし、ヒトに禁止される非常に強力なフロイントアジュバントの使用に基づくことより、この方法もまたヒトのワクチン接種には適切でない。
【００１８】
要約すれば、インフルエンザに対する防御を提供するための抗体の使用は、好ましくは控えるべきである。更に、抗体での予防処置は、ヒトに効果的でありそうもない。ヒトに使用することができない不完全フロイントアジュバントに依存しており、高等動物では禁忌であることより、記載されたようにヒトの完全Ｍ２タンパク質での免疫化は現実的でない。
【００１９】
したがって、既存のものに代わるインフルエンザ抗原を提供するための本発明の目的は、広範なスペクトルのインフルエンザ株に対する十分な免疫防御性であり、フロイントアジュバントに依存せず、ヒトに使用することができることである。
【００２０】
本発明によって、自然状態では存在しない、新規性のある抗原を調製することが可能であることが今見出される。このためには、保存されたインフルエンザ膜タンパク質の細胞外部分又はその機能的断片を、例えばタンパク質である提示性担体に融合する。保存されたインフルエンザ膜タンパク質は、例えばよく保存されたＭ２タンパク質の細胞外部分である。
【００２１】
膜タンパク質は、好ましくは、提示性担体として提示性（ポリ）ペプチドに遺伝子的に融合し、ここでこの（ポリ）ペプチドは細胞外部分を安定化し、驚いたことに、こうして得られた融合物の免疫原性を増強する。提示性（ポリ）ペプチドが、細胞外部分を野生型構造にさせ、こうしてウイルス上及び感染細胞上でも見出せる形態で抗原を提示すると考えられる。
【００２２】
‘保存されたインフルエンザ膜タンパク質の機能的断片’とは、機能的断片を受け入れない同一種類の対照部分で見出されるより、種類の試験部分に免疫防御的用量を投与する場合に、統計的に有意なより高い免疫防御性を誘発することができる断片をいう。
【００２３】
本発明の一つの実施態様では、Ｍ２タンパク質の２３アミノ酸の細胞外部分をヒトＢ型肝炎ウイルスコアタンパク質のアミノ末端に融合させた。こうして、遊泳Ｎ末端が細胞外環境に伸長する場合に、ウイルス粒子及び感染細胞中のＭ２タンパク質の野生型構造を模倣する。
【００２４】
代わりの提示性（ポリ）ペプチドは、複数のＣ３ｄドメイン（Dempsey et al., 1996）、破傷風毒素フラグメントＣ又は酵母Ｔｙ粒子である。‘提示性（ポリ）ペプチド’は周囲に対し実質的に野生型形状である細胞外部分を呈示することができるすべての１個以上のアミノ酸を包含することを意味する。
【００２５】
代わるものとして、提示性担体は、グリカン、ポリエチレングリコール、擬ペプチド（peptide mimetics）、合成ポリマー等のような非ペプチド構造体であることができる。
【００２６】
適切な受容細胞における新規な抗原の発現後、それ自体（受容細胞に依存する）か、又は膜フラグメントの部分若しくは遊離形態のいずれかで用いることができる。
【００２７】
用語‘提示性担体’は、（ポリ）ペプチド等の、全ての種類の提示性分子を表示するため用いる。
【００２８】
抗原及び提示性（ポリ）ペプチドのコード情報を含んでいる遺伝子構築は、上記のような新しい抗原を調製するため用いることができるのみならず、場合によっては、適切な転写及び／又は翻訳制御配列存在下、ＤＮＡワクチン中又はワクシニアベースワクチン中で使用することもできることは当業者には明らかであろう。
【００２９】
提示性（ポリ）ペプチドは、単一の又は多コピーの状態で融合生成物中に取り込まれることができる。補体タンパク質第３フラグメントｄ（Ｃ３ｄ）は、好ましくは、より多いコピー数、好ましくは３コピー以上で用いられる。
【００３０】
本発明の好ましい実施態様では、融合タンパク質は更に適切な内部部位（Schoedel et al., 1992）又はＣ末端（Borisova et al., 1989）において付加的なペプチドを含むことができる。この付加的なペプチドは、抗原の防御能力のさらなる増大を目的とし、例えばヘルパーＴ細胞エピトープ又は細胞障害性Ｔ細胞エピトープでありえる。
【００３１】
本発明の抗原は、場合により、適切な転写及び／又は翻訳及び／又は分泌制御配列の存在下で、少なくとも保存されたインフルエンザ膜タンパク質の細胞外部分又はその機能的フラグメントの遺伝子構築、及び場合により、それに操作可能に結合した提示性（ポリ）ペプチドをコードする配列を調製し、適切な受容細胞内のこの遺伝子構造体に結合し、受容細胞内の遺伝子構造物を発現し、及び場合により受容細胞又はその培地から単離することによって得られる。
【００３２】
転写及び／又は翻訳及び／又は分泌制御配列の必要条件は、遺伝子がベクター内に組み込まれるべきかどうか又は受容細胞のゲノム内への組み込みがこれらのシグナルがすでに用意されている位置であるかどうかに依存する。
【００３３】
提示性（ポリ）ペプチドのコード配列は、融合タンパク質が抗原とペプチド性構造体との融合である場合、又もし所望ならばＤＮＡ構造体中の２個の構造体を直接結合する場合にのみ存在する。全ての他の例では、提示性担体を異なる方法で抗原に追加することもできる。
【００３４】
適切な受容細胞は、例えばE. coli, Lactococcus lactis、Lactobacillus plantarum、酵母（例えばPichia pastoris）、昆虫細胞（例えばSf9）、哺乳類細胞（例えばVero細胞）等から選択される。L. lactisの場合、抗原を単離するのでなく、改変された細菌を鼻腔内又は経口で直接用いることができることを必要とする。
【００３５】
本発明は、少なくとも本発明の抗原を含むワクチンに更に関する。この抗原は、単離した形態又は膜フラグメントの部分として若しくは受容細胞上に発現された状態であることができる。本発明の抗原は、適切な賦形剤と一緒に用いることができる。
【００３６】
ワクチン設計の当業者は、適切な賦形剤を選択することができる。ガイダンスを例えばMethods in molecular medicine: Vaccine Protocols (1996). Eds. Robinson, A., Farrar, G.H. and Wilblin, C.N. Humana Press, Totowa, New Jersey, USAに見出すことができる。
【００３７】
本発明の抗原は、単独で又はノイラミニダーゼ、ヘマグルチニン若しくはもとのままのＭ２のような１種以上の他のインフルエンザ抗原と組み合わせて使用することができる。
【００３８】
更に、本発明はインフルエンザに対するワクチンの調製における抗原の使用に関する。ワクチンは、例えば融合生成物を含んでいるワクチンのような直接ワクチン又は２次的なＤＮＡワクチンであることができる。後者は、受容体内で機能することができる真核生物のプロモーターの制御下にある融合ｃＤＮＡを含んでいるワクチンである。実際の抗原は、それからワクチンの受容者で産生される。
【００３９】
本発明のワクチンは、ヒト及び動物（例えばＡ型インフルエンザに感染することが周知のブタや馬）の両者での使用を意味する。
【００４０】
ここに記載されるようなＡ型インフルエンザの新規な融合抗原を調製するための同様の研究方法は、融合抗原又は、Ｂ型やＣ型インフルエンザの融合抗原をコードするＤＮＡを含有する同様の融合抗原及びワクチンを調製することに採用することができる。
【００４１】
本発明は
ａ）場合により、適切な転写及び／又は翻訳及び／又は分泌制御配列の存在下で、少なくとも保存されたインフルエンザ膜タンパク質の細胞外部分またはその機能的断片をコードする配列及び少なくともそれに操作可能に結合した提示性（ポリ）ペプチドを含む遺伝子構築を調製し、
ｂ）適切な受容細胞内にこの遺伝子構築を持ち込み、
ｃ）受容細胞内の遺伝子構築の発現を達成し、及び
ｄ）場合により、受容細胞又は培地から該抗原を単離する
工程を含む、抗原の調製方法にも関する。
【００４２】
本発明は、本発明を決して制限する意図はない、下記の実施例により更に説明するつもりである。実施例は、種々の提示性（ポリ）ペプチドも用いるＭ２配列の融合タンパク質の調製及び免疫化でのその使用を詳細に記載する。ここに記載したＭ２及び提示性担体の代わりに、当業者は他の保存されたインフルエンザ膜タンパク質及び他の提示性担体を選択することができるだろう。
【００４３】
実施例では、以下の図を参照する：
【００４４】
Figure １：ｐＡＴＩＰＭ２mlの構築
Ｅ１及びＥ２＝インフルエンザＭ２タンパク質の第１及び第２エクソン、
Ｍ２ｅ＝Ｍ２タンパク質の細胞外部分、
Ｍ２ｔ＝膜貫通部分；及び
Ｍ２ｃ＝細胞質尾部。
太線＝ベクター。
（ａ）ｍ２遺伝子からのイントロンの除去、
（ｂ）Ｍ２タンパク質の細胞外部分及び膜貫通ドメイン間にＢｃｌＩ部位の導入、
（ｃ）Ａ／ＰＲ／８／３４のＭ２タンパク質の細胞外部分のヌクレオチド及びアミノ酸配列
【００４５】
Figure ２：ｐＩＰＭ２ｈＢ２Ｍｍ２ｓ２の構築。
ｏｒｉ＝複製起点
ｃａｔ＝クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、
ｂｌａ＝βラクタマーゼ、
ｌｐｐ＝リポタンパク質、
ｈＢ２Ｍ＝ヒトβ₂ミクログロブリン、
ｏｍｐａ−ｓｓ＝E.coliの外膜タンパク質Ａのシグナル配列、
ｓｓＤＮＡ＝一本鎖ＤＮＡ、
Ｍ２ｅ＝Ｍ２タンパク質の細胞外部分、
（ａ）：構築フロースキーム、
（ｂ）：主要配列の詳細。
【００４６】
Figure 3：ｐＰＬｃＩＰＭ２ＨＢｃｍの構築。
ｏｒｉ＝複製起点
ｃａｔ＝クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、
ｂｌａ＝βラクタマーゼ、
ＨＢｃ＝Ｂ型肝炎コア
ｓｓＤＮＡ＝一本鎖ＤＮＡ、
Ｍ２ｅ＝Ｍ２タンパク質の細胞外部分、
（ａ）：プラスミド構築フロースキーム、
（ｂ）：Ｂ型肝炎コア遺伝子の導入されたＢａｍＨＩ制限部位周辺配列、
（ｃ）：主要配列の詳細。
【００４７】
Figure ４：ＳＤＳ１２．５％ＰＡＧＥ上での、プラスミドｐＰＬｃ２４５（コントロール）、ｐＰＬｃＡ１（ＨＢｃの発現）又はｐＰＬｃＩＰＭ２ＨＢｃｍ（ＩＰＭ２ＨＢｃｍの発現）それぞれを含有するＭＣ１０６１〔ｐｃＩ８５７〕株のオリジナルの培養液１５０μlに相当する、可溶性分画の分析。ゲルを電気泳動した後、クマーシーブリリアントブルーで染色した。
ＭＷ＝分子量マーカー
ＮＩ＝誘発しなかった培養
Ｉ＝誘発した培養
【００４８】
Figure ５：Figure ４の場合のように、プラスミドｐＰＬｃ２４５（コントロール）、ｐＰＬｃＡ１（ＨＢｃの発現）又はｐＰＬｃＩＰＭ２ＨＢｃｍ（ＩＰＭ２ＨＢｃｍの発現）それぞれで形質転換したＭＣ１０６１〔ｐｃＩ８５７〕株のオリジナルの培養液１５０μlに相当する、可溶性分画の分析。電気泳動後、関連タンパク質をウェスタンブロッティング実験によって示した。（Ａ）抗ＨＢｃモノクローナル抗体と（Ｂ）Ｍ２タンパク質の細胞外部分に特異的なモノクローナル抗体の検出。
ＭＷ＝分子量マーカー
ＮＩ＝誘発しなかった培養
Ｉ＝誘発した培養
【００４９】
Figure ６：Ｍ２タンパク質のアミノ末端配列を、実験的に決定したＩＰＭ２ＨＢｃｍのアミノ末端と比べた。Ａ／Ｕｄｏｒｎ／７２の配列（Lamb and Zebedee, 1985）。
【００５０】
Figure ７：プラスミドｐＰＬｃ２４５（コントロール）、ｐＰＬｃＡ１（ＨＢｃの発現）又はｐＰＬｃＩＰＭ２ＨＢｃｍ（ＩＰＭ２ＨＢｃｍの発現）それぞれで形質転換したＭＣ１０６１〔ｐｃＩ８５７〕株の可溶性分画を、ドットブロットにより本来の状態で分析した。（Ａ）抗ＨＢｃモノクローナル抗体及び（Ｂ）Ｍ２タンパク質の細胞外部分に特異的なモノクローナル抗体の検出。
ＮＩ＝誘発しなかった培養
Ｉ＝誘発した培養
【００５１】
Figure ８：直腸温（Ａ１）、体重（Ａ）及び５ ＬＤ₅₀ｍ．ａ．Ａ／ＰＲ／８／３４での致死的チャレンジの後、ＩＰＭ２ＨＢｃｍを接種されたマウスの生存（Ｂ）の概要。統計学的有意は、フィッシャーの正確法によって計算した。種々の用量の抗原で免疫化したマウスをコントロール群と比べた。下記の結果が得られた：ＩＰＭ２ＨＢｃｍ ５０μgではｐ＜０．００１；１０μgではｐ＜０．００５及び５μg用量ではｐ＜０．０５であった。Figure ８Ｃは、３０ ＨＡＵ Ｘ−４７での致死的チャレンジ後のＩＰＭ２ＨＢｃｍ及びＩＭ２ＨＢｃｍそれぞれで腹腔内にワクチン接種を受けたマウスの生存を示す。Figure ８Ｄは、３０ ＨＡＵ Ｘ−４７での致死的挑戦（lethal challenge）後のＩＰＭ２ＨＢｃｍ及びＩＭ２ＨＢｃｍそれぞれで鼻腔内にワクチン投与を受けたマウスの生存を示す。
【００５２】
Figure ９：Figure ８に示した４種の血清サンプルの分析。免疫前血清（ａ）、一回目の免疫後に採取した血清（ｂ）、２回目の免疫後（ｃ）、３回目の免疫後（ｄ）、そしてチャレンジ後得られた血清（ｅ）を最初に１／５０に希釈した。連続希釈段階は１／３とした．プロットした吸光度は、「結果、血清サンプルの分析」に記載したように得られた修正値である。
【００５３】
Figure １０：ｐＰＬｃＩＭ２ＨＢｃｍの構築。
ｏｒｉ＝複製起点
ｃａｔ＝クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、
ｂｌａ＝βラクタマーゼ、
Ｍ２ｅ＝Ｍ２タンパク質の細胞外部分
ＨＢｃ＝Ｂ型肝炎コア
【００５４】
Figure １１：ＳＤＳ １２．５％ ＰＡＧＥゲル上での、プラスミドｐＰＬｃ２４５（コントロール）、ｐＰＬｃＡ１（ＨＢｃの発現）、ｐＰＬｃＩＰＭ２ＨＢｃｍ（Ａ／ＰＲ／８／３４に由来するＭ２タンパク質の細胞外部分を含む融合タンパク質ＩＰＭ２ＨＢｃｍの発現）又はｐＰＬｃＩＭ２ＨＢｃｍ（より普遍的Ｍ２配列を含有するＩＭ２ＨＢｃｍの発現）それぞれを含有するＭＣ１０６１〔ｐｃＩ８５７〕株の、ＨＢｃ５μg又はＩ（Ｐ）Ｍ２ＨＢｃｍ（ＥＬＩＳＡで測定した（材料及び方法を参照））を含有する、可溶性分画の分析。
ＭＷ＝分子量マーカー
ＮＩ＝誘発しなかった培養
Ｉ＝誘発した培養
【００５５】
Figure １２：ウェスタンブロット上での、プラスミドｐＰＬｃ２４５（コントロール）、ｐＰＬｃＡ１（ＨＢｃの発現）、ｐＰＬｃＩＰＭ２ＨＢｃｍ（ＩＰＭ２ＨＢｃｍの発現）又はｐＰＬｃＩＭ２ＨＢｃｍ（ＩＭ２ＨＢｃｍの発現）を含有するＭＣ１０６１〔ｐｃＩ８５７〕株の、ＨＢｃ２．５μg又はＩ（Ｐ）Ｍ２ＨＢｃｍ（ＥＬＩＳＡで測定した（材料及び方法を参照））を含有する、可溶性分画の分析。
ＭＷ＝分子量マーカー、
ＮＩ＝誘発しなかった培養、
Ｉ＝誘発した培養。
【００５６】
Figure １３：ｈｂｃ及びｉ（ｐ）ｍ２ｈｂｃのＰＣＲ増幅のため用いたオリゴヌクレオチドの概要。オリゴヌクレオチドの名称に続く‘ｓ’又は‘ａ’は、センス（ｓ）又はアンチセンス（ａ）指向でのこれらのプライマーの使用を意味する。囲み線の配列は、変更したＬｅｕコドンを表す。
【００５７】
Figure １４：L.lactisのベクターにおけるｈｂｃ及びｍ２ｈｂｃ融合構築の概要。
ｏｒｉ＝E. coliの複製起点、
ｏｒｉ（＋）＝L. lactisの複製起点、
ｅｒｍＡ及びｅｒｍＭ＝エリスロマイシン抵抗性遺伝子、
Ｐ１＝L. lactisプロモーター、
ｂｌａ＝βラクタマーゼ、
ＨＢｃ＝Ｂ型肝炎コア、
Ｍ２ｅ＝Ｍ２タンパク質の細胞外部分、
ｕｓｐ４５−ｓｓ＝ｕｓｐ４５のシグナル配列、
ｍＩＬ２＝マウスインターロイキン２及び
ｍＩＬ６＝マウスインターロイキン６。
【００５８】
Figure １５：ウェスタンブロットでのＢ型肝炎コア（ＨＢｃ）発現及びＭ２−ＨＢｃ融合タンパク質発現の分析。ｐＴＲＥＸ１（コントロール）、ｐＴ１ＨＢｃ、ｐＴ１ＨＢｃＩＬ２、ｐＴ１ＨＢｃＩＬ６（ＨＢｃ単独又はｍＩＬ２若しくはｍＩＬ６との組み合わせ、それぞれの発現）、ｐＴ１ＰＭ２ＨＢｃ、ｐＴ１ＰＭ２ＨＢｃＩＬ２、ｐＴ１ＰＭ２ＨＢｃＩＬ６（ＩＰＭ２ＨＢｃｍ単独又はｍＩＬ２若しくはｍＩＬ６との組み合わせ、それぞれの発現）、ｐＴ１Ｍ２ＨＢｃ、ｐＴ１Ｍ２ＨＢｃＩＬ２、ｐＴ１Ｍ２ＨＢｃＩＬ６（ＩＭ２ＨＢｃｍ単独又はｍＩＬ２若しくはｍＩＬ６組み合わせ、それぞれの発現）それぞれを含有する、１０⁹個相当のL. lactis細菌のＭＧ１３６３株を、ＳＤＳ １２．５％ ＰＡＧＥゲルで分析した。最初の抗体ｐ−ａｎｔｉ−ＨＢｃ（Daco Corporation, Carpinteria, CA., USA）を５，０００倍に希釈した。結合した抗体を、１／２０００希釈のアルカリフォスファターゼ標識ポリクローナル抗ウサギＩｇＧ（Southern Biotechnology Associates, Birmingham, AL., USA）で検出した。Ｉ（Ｐ）Ｍ２ＨＢｃは、ＩＰＭ２ＨＢｃｍかＩＭ２ＨＢｃｍのどちらかを表す。
ＭＷ＝分子量マーカー、
Ｃ＝コントロール及び
−＝抗原だけの発現。
【００５９】
Figure １６：ウェスタンブロットでのＭ２−ＨＢｃ融合タンパク質発現の分析。ｐＴ１ＨＢｃ（コントロール）、ｐＴ１ＰＭ２ＨＢｃ、ｐＴ１ＰＭ２ＬＨＢｃ（ＩＰＭ２ＨＢｃｍの発現）、ｐＴ１Ｍ２ＨＢｃ、ｐＴ１Ｍ２ＬＨＢｃ（ＩＭ２ＨＢｃｍの発現）それぞれを含有する、２〜３×１０⁹個相当のL. lactis細菌のＭＧ１３６３株を、ＳＤＳ １２．５％ ＰＡＧＥゲルで分離した。融合タンパク質をポリクローナルマウス抗Ｍ２ｅ抗体（材料及び方法を参照）のＩｇＧ分画を用いて検出した。結合した抗体を、１／２０００希釈のアルカリフォスファターゼ結合ポリクローナル抗マウスＩｇＧ（γ鎖特異的）（Southern Biotechnology Associates, Birmingham, AL., USA）で検出した。
ＭＷ＝分子量マーカー、
Ｃ＝コントロール、
Ｅ＝E. coliでの使用に最適なロイシンコドン及び
Ｌ＝L. lactisでの使用に最適なロイシンコドン。
これらは、それぞれプラスミドｐＴ１ＰＭ２ＬＨＢｃ及びｐＴ１Ｍ２ＬＨＢｃである。Ｉ（Ｐ）Ｍ２ＨＢｃは、ＩＰＭ２ＨＢｃｍ又はＩＭ２ＨＢｃｍを表す。
【００６０】
Figure １７：Ｍ２タンパク質及びＣ３ｄの細胞外部分のＰＣＲ増幅のために用いるオリゴヌクレオチドの概要。
オリゴヌクレオチドの名称に続く‘ｓ’又は‘ａ’は、センス（ｓ）又はアンチセンス（ａ）指向でのこれらのプライマーの使用を意味する。囲み線の配列は変更したＬｅｕコドンを表す。
【００６１】
Figure １８：L.lactisでのｍ２ｃ３ｄ３融合の構築概要。
ｏｒｉ＝E. coliの複製起点、
ｏｒｉ（＋）＝L. lactisの複製起点、
ｅｒｍＡ及びｅｒｍＭ＝エリスロマイシン抵抗性遺伝子、
Ｐ１＝L. lactisプロモーター、
ｂｌａ＝βラクタマーゼ、
Ｍ２ｅ＝Ｍ２タンパク質の細胞外部分、
ｕｓｐ４５−ｓｓ＝ｕｓｐ４５のシグナル配列、
ｓｐａＸ＝Staphylococcus aureus タンパク質Ａに由来するアンカー配列、
Ｃ３ｄ＝補体タンパク質３フラグメントｄ、及び
ｍＩＬ６＝マウスインターロイキン６。
【００６２】
Figure １９：ｔｔｆｃ及びｍ２ｔｔｆｃのＰＣＲ増幅のため用いるオリゴヌクレオチドの概要。
オリゴヌクレオチドの名称の後の‘ｓ’又は‘ａ’は、センス（ｓ）又はアンチセンス（ａ）指向でのこれらのプライマーの使用を意味する。囲み線の配列は変更したＬｅｕコドンを表す。
【００６３】
Figure ２０：L.lactisのベクターでのｍ２ｔｔｆｃの構築概要。
ｏｒｉ＝E. coliの複製起点、
ｏｒｉ（＋）＝L. lactisの複製起点、
ｅｒｍＭ及びｅｒｍμ＝エリスロマイシン抵抗性遺伝子、
Ｐ１＝L. lactisプロモーター、
ｂｌａ＝βラクタマーゼ、
ＴＴＦＣ＝破傷風毒素フラグメントＣ、
Ｍ２ｅ＝Ｍ２タンパク質の細胞外部分、
ｕｓｐ４５−ｓｓ＝ｕｓｐ４５のシグナル配列、
ｍＩＬ２＝マウスインターロイキン２及び
ｍＩＬ６＝マウスインターロイキン６。
【００６４】
Figure ２１：ウェスタンブロットでのＩＰＭ２ＴＴＦＣ融合タンパク質発現の分析。ｐＴ１ＴＴ（コントロール）、ｐＴ１ＰＭ２ＬＴＴ（ＩＰＭ２ＴＴの発現）、ｐＴ１ＰＭ２ＬＴＴＩＬ２（ｍＩＬ２と組み合わせたＩＰＭ２ＴＴの発現）又はｐＴ１ＰＭ２ＬＴＴＩＬ６（ｍＩＬ６と組み合わせたＩＰＭ２ＴＴの発現）それぞれを含有する、１０⁹個相当のL. lactis細菌のＭＧ１３６３株を、ＳＤＳ １０％ ＰＡＧＥゲルで分析した。
最初の抗体、ポリクローナルマウス抗Ｍ２ｅ抗体のＩｇＧ分画（材料及び方法を参照）を２５００倍に希釈した。結合した抗体を、１／２０００希釈のホースラディッシュペルオキシダーゼ標識ポリクローナル抗マウスＩｇＧ（Southern Biotechnology Associates, Birmingham, AL., USA）で検出した。４−クロロ−１−ナフトール３０mg（Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo., USA）をメタノール１０mlに溶解した。次に、ＰＢＳ４０ml（pH７．４）とＨ₂Ｏ₂１５０μlを添加した。
ＭＷ＝分子量マーカー、
−＝抗原だけの発現、
ｍＩＬ２＝ｍＩＬ２と組み合わせた抗原の発現、
ｍＩＬ６＝ｍＩＬ６と組み合わせた抗原の発現。
【００６５】
Figure ２２：ｇｐ６７バキュロウイルスタンパク質の分泌シグナルのＰＣＲ増幅に用いるプライマーセット。
【００６６】
Figure ２３：ｓｇｐＭ２Ｃ３ｄ３融合の構築中にＭ２タンパク質の細胞外部分のＰＣＲ増幅に用いるプライマーセット。
【００６７】
Figure ２４：バキュロウイルス転移ベクターｐＡＣｓｇｐＭ２Ｃ３ｄ３の構築。
ｂｌａ＝βラクタマーゼ、
太い灰色線＝バキュロウイルス相同部位、
Ｃ３ｄ＝補体タンパク質３フラグメントｄ、
Ｍ２ｅ＝Ｍ２タンパク質の細胞外部分、
ｏｒｉ＝複製起点、
ｐｈＰ＝バキュロウイルスポリヘドリンプロモーター、及び
ｓｇｐ６７＝バキュロウイルスタンパク質ｇｐ６７の分泌シグナル。
【００６８】
Figure ２５：ｓｇｐＭ２Ｃ３ｄ３融合の主要ヌクレオチド及びアミノ酸配列の詳細。
Ｃ３ｄ＝補体タンパク質３フラグメントｄ、
Ｍ２ｅ＝Ｍ２タンパク質の細胞外部分、及び
ｓｇｐ６７＝バキュロウイルスタンパク質ｇｐ６７の分泌シグナル。
【００６９】
Figure ２６：ポリヘドリン遺伝子座のＰＣＲ増幅による組換え型ＡｃＮＰＶ／ｓｇｐＭ２Ｃ３ｄ３バキュロウイルスの分析（プライマーTTTACTGTTTTCGTAACAGTTTTG及びCAACAACGCACAGAATCTAG）。コントロール反応を、親の転移ベクターｐＡＣｓｇｐＭ２Ｃ３ｄ３及び野生型ＡｃＮＰＶバキュロウイルスを用いて実施した。
Ｍ＝ＤＮＡサイズマーカー。
【００７０】
Figure ２７：回収した上清のウェスタン分析（１０％ＰＡＧＥゲル）により決定した、組換えＡｃＮＰＶ／ｓｇｐＭ２Ｃ３ｄ３バキュロウイルス組換え体に感染した昆虫細胞Ｓｆ９による分泌Ｍ２Ｃ３ｄ３の発現。偽感染した細胞又は野生型ＡｃＮＰＶバキュロウイルス感染後に得られた上清をコントロールとして含む。
ＭＷ＝分子量マーカー。
【００７１】
Figure ２８：５ ＬＤ₅₀ ｍ．ａ．Ｘ４７の致死チャレンジ後のマウス生存の概要。ＩＭ２ＨＢｃｍ３×１０μgでワクチン接種したマウスを受動免疫したマウス（Ｐ）と比べた。
【００７２】
Figure ２９：ＤＮＡワクチン構築物の概要。
ＲＴ＝逆転写酵素
ＰＣＭＶ＝サイトメガロウイルスプロモーター
ｂｌａ＝βラクタマーゼ
ｎｐｔ＝ネオマイシン抵抗性
【００７３】
Figure ３０：ウェスタンブロットで分析したＨＥＫＴ細胞における発現。最初の抗体（ｐａＭ２（材料及び方法を参照））を２，０００倍に希釈した。結合した抗Ｍ２抗体をアルカリフォスファターゼ標識抗マウスＩｇＧで検出した。
ＭＷ＝分子量マーカー
Ｍ２＝昆虫細胞で発現したＭ２タンパク質
１＝ｐＣＤＮＡ３
２＝ｐＣＩＭ２
３＝ｐＣＩＭ２ＨＢｃｍ
４＝ｐＣＩＰ３Ｍ２ＨＢｃｍ。
【００７４】
Figure ３１：ＥＬＩＳＡで分析したＭ２タンパク質に対する抗体応答。
Ａ．マイクロタイタープレートを、ｈｂ２Ｍ又はＩＰＭ２ｈＢ２Ｍそれぞれ（材料及び方法を参照）を含有するペリプラズムでコートした。
Ｂ．マイクロタイタープレートを、昆虫細胞で発現するＭ２タンパク質（材料及び方法を参照）でコートした。
以下の略語を使用する。
１ ＬＤ₅₀：致死量、感染したマウスの半数を殺すために必要なウイルスチャレンジ。
ＢＣＩＰ：５―ブロモー４―クロロ−３―インドリルフォスフェート
ｂｐ：塩基対
ＣＩＰ：仔牛腸フォスファターゼ
Ｃ３ｄ：補体タンパク質３フラグメントｄ
ＤＥＡ：ジエチルアミン
ＨＡＵ：赤血球凝集単位
ｈＢ２Ｍ：ヒトβ２ミクログロブリン
ＨＢｃ：Ｂ型肝炎コアタンパク質
ＩＭ２ＨＢｃｍ：ＨＢｃと融合したＡ型インフルエンザ共通Ｍ２タンパク質フラグメント
ＩＰＭ２ｈＢ２Ｍｍ：ｈＢ２Ｍと融合したＡ型インフルエンザＭ２タンパク質フラグメント（Ａ／ＰＲ／８／３４由来）
ＩＰＭ２ＨＢｃ：１番目のメチオニンとＭ２タンパク質の細胞外部分の開始位置間に４個の付加アミノ酸を含有する、ＨＢｃと融合したＡ型インフルエンザＭ２タンパク質フラグメント（Ａ／ＰＲ／８／３４由来）
ＩＰＭ２ＨＢｃｍ：ＨＢｃと融合したＡ型インフルエンザＭ２タンパク質フラグメント（Ａ／ＰＲ／８／３４由来）
ＩＰＴＧ：イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド
ｍ．ａ．：適応したマウス
Ｍ２Ｃ３ｄ３：３コピーのＣ３ｄと融合した共通インフルエンザＭ２フラグメント
ｃＭ２Ｃ３ｄ３：Ｍ２Ｃ３ｄ３の細胞質形態
ｓＭ２Ｃ３ｄ３：Ｍ２Ｃ３ｄ３の分泌形態
ｓＭ２Ｃ３ｄ３Ｘ：細胞壁に共有結合的に付着したＭ２Ｃ３ｄ３の形態
ＭＥＳ：２−（Ｎ−モルフォリノ）エタンスルホン酸
ＭＰＬＡ：モノフォスフォリル脂質Ａ
ＮＢＴ：ニトロブルーテトラゾリウム
ＯｍｐＡ−ｓｓ：外膜タンパク質Ａシグナル配列
ＰＣＲ：ポリメラーゼ連鎖反応
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ：ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動
ＴＤＭ：トレハロースジコリノミコレート
ｐｈＰ：バキュロウイルスポリヘドリンプロモーター
ｓｇｐ６７：バキュロウイルスｇｐ６７タンパク質分泌シグナル
【００７５】
実施例
緒言
本実施例は、Ａ型インフルエンザウイルスＭ２タンパク質に基づく種々の融合抗原の調製を示す。Ｍ２フラグメントは種々の提示性担体のアミノ末端に融合している。
【００７６】
材料及び方法
１．菌種及びプラスミド
Escherichia coliでの発現に役立つ全てのプラスミド構築物は、トランスフォーメーションの高い効率のため、菌株ＭＣ１０６１（ｈｓｄＲ ｍｃｒＢ ａｒａＤ１３９Δ（ａｒａＡＢＣ−ｌｅｕ）７６９７ ΔｌａｃＸ７４ ｇａｌＵ ｇａｌＫ ｒｐｓＬ ｔｈｉ （Casadaban and Cohen, 1980）で行った。突然変異誘発後の最初のトランスフォーメーションをＷＫ６λｍｕｔＳ（Δ（ｌａｃ−ｐｒｏＡＢ）、ｇａｌＥ、ｓｔｒＡ、ｍｕｔＳ：：Ｔｎ１０／ｌａｃＩ^q、ＺΔＭ１５、ｐｒｏＡ⁺Ｂ⁺；Zell and Fritz, 1987）で行なった。β₂ミクログロブリン及び誘導体の発現研究を、E. coli株Ｃ３０００（Ｈｆｒ、ｓｕｐ^-、ｔｈｉ（λ^-））で行った。Ｂ型肝炎コア及び誘導体の発現研究を、ＭＣ１０６１〔ｐｃＩ８５７〕で実施した。
【００７７】
ｐｃＩ８５７は、Remaut et al., 1983bに記載される。このプラスミドｐｃＩ８５７Ｋ１の誘導体は、Steidler et al., 1994に記載される。
【００７８】
プラスミドｐ７１４（Parker and Wiley, 1989）はDr. K. Parkerの、またプラスミドｐＰＬｃＡ１（Nassal, 1988）は、Dr. M. Nassalの好意により贈与された。プラスミドｐＰＬｃ２４５はRemaut et al., 1983aに記載される。
【００７９】
Lactococcus lactisでの構築及び発現のため、ＭＧ１３６３株（Gasson, 1983）を用いた。L. lactis、での構成的発現ベクターｐＴＲＥＸ１（Wells and Schofield, 1996）は、Dr. K. Schofieldの好意により贈与された。インターロイキン２の発現のためのプラスミドｐＬ２ＭＩＬ２はSteidler et al., 1995に記載される。インターロイキン６の発現のための類似のプラスミドが、Steidler et al., 1996に記載される。
【００８０】
ベクターｐＳＧ５．Ｃ３ｄ．ＹＬ（Dempsey et al., 1996）は、Dr. Fearonからの寄贈された。
【００８１】
バキュロウイルス運搬ベクターｐＡＣＧＰ６７Ａ（Pharmingen, San Diego, CA, USA）は、ｇｐ６７バキュロウイルスタンパク質に由来する分泌シグナルに続くポリヘドリンプロモーター及び外来性遺伝子配列挿入のクローニング部位を含有する、バキュロウイルスゲノムの修飾セグメントを含有した。相同組換えによりバキュロウイルスゲノム（又はその修飾体）への組込みを可能にする構築であった。得られた組換え体バキュロウイルスは、ｇｐ６７分泌シグナルの切断により分泌タンパク質としてポリヘドリンプロモーターから得られる遺伝子を発現することができた。
【００８２】
２．ウイルス
インフルエンザウイルスＡ／ＰＲ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）は、いくつかの肺継代接種によりマウスに適用した。適応後、ウイルスを卵中で増殖させ（Kendal et al, 1982）、ショ糖勾配で精製した。力価〔（血球凝固単位（ＨＡＵ）（Hirst, 1941; Kendal et al, 1982））〕及びマウスでの致死率を測定した。ｍ．ａ．Ａ／ＰＲ／８／３４のための、１ ＬＤ₅₀は、５０μl中に存在する１０ＨＡＵに相当する。
インフルエンザ株Ｘ−４７（Ｈ３Ｎ２）（Baez et al., 1980）を異種チャレンジのため実験に用いた。この株は、いくつかの肺継代接種によりマウスに適用した。
【００８３】
雌Ｂａｌｂ／ｃマウスは、Charles River Wiga（Sulzfeld, Germany）から購入した。このマウスは、６〜７週齢で用いた。
【００８４】
４．抗体
Ｂ型肝炎コアタンパク質特異的モノクローナルマウス抗体は、Dr. Sc. H. Claeys（Bloedtransfusiecetrum, Leuven）の好意により寄贈された。
【００８５】
ヒトβ₂ミクログロブリン特異的モノクローナルマウス抗体をＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ（Mannheim, Germany）から購入した。
【００８６】
マウスＩｇＧ又はマウスＩｇＧ（γ鎖特異的）特異的アルカリホスファターゼ結合抗体を、Sigma Chemical Co.（St. Louis, Mo., USA）から購入した。
【００８７】
５．増殖培地
E. coliは、他に記載がない場合は、ＬＢ培地（１％トリプトン、０．５％イースト抽出物及び０．５％ＮａＣｌ）中で増殖させた。発現したタンパク質が増殖培地中に分泌されそれを精製すべき場合、０．２％カサミノ酸を補った最少Ｍ９培地（Miller, 1972）を実験に用いた。
【００８８】
０．５％グルコースを補った（ＧＭ１７）Ｍ１７増殖培地（Difco, Laboratories, Detroit, MI, USA）をL. lactisの培養に用いた。エリスロマイシンを、５μg/mlの濃度で用いた（ＧＭ１７Ｅ培地）。L. lactisを、振盪しないで２８℃で増殖させた。
【００８９】
ハイブリドーマ及びミエローマ細胞を、１０％牛胎児血清、０．３mg/mlＬ−グルタミン、０．４mMピルビン酸ナトリウム、１００u／mlペニシリン及び１００ng/mlストレプトマイシンを補ったＲＰＭＩ１６４０で増殖させた。
【００９０】
Sf9昆虫細胞を１０％牛胎児血清、１００Ｕ／mlペニシリン及び１００ng/mlストレプトマイシンを補ったＴＣ１００で増殖させた。
【００９１】
６．アジュバント
最初の免疫化のため、Ribiアジュバント（Ribi Immunochem Research Inc., Hamilton, MT, USA）を用いた。Ribiアジュバントの完全用量は、５０μgＭＰＬＡ（モノフォスフォリル脂質Ａ）、５０μgＴＤＭ（トレハロースジコリノミコレート）、２％スクアレン及び０．０１％Ｔｗｅｅｎ８０を含有した。
【００９２】
第２及び第３の免疫化のため、ＭＰＬＡ（Ribi Immunochem Research Inc., Hamilton, MT, USA）を単独で又は等量のアジュバントペプチド（Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo., USA）と一緒に用いた
【００９３】
７．ＤＮＡ操作
制限酵素、ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ及びＴ４ＤＮＡリガーゼ（Boehringer, Mannheim, Germany; Gibco BRL, Bethesda, Md. USA、又はNew England Biolabs, Beverly, MA, USA）を製造者の薦めに従って用いた。分析的目的のプラスミドＤＮＡは、Birnboim and Doly (1979)に従い抽出した。調製目的のプラスミドＤＮＡは、Kahn et al. (1979)に従い単離した。ＤＮＡの制限酵素断片は、Vogelstein and Gillespie (1979)及びStruhl (1985)によるGeneclean 方法で単離した。必要な材料をＢｉｏ１０１（La Jolla, CA., USA）から購入した。L. lactisからのプラスミドＤＮＡ単離では、細菌の前処理が細胞壁を弱めるために必要であった。細菌ペレットをＴＥ５０μl（１０mMＴｒｉｓ−ＨＣｌ pH８−１mMＥＤＴＡ）中に再懸濁した。その後、別のＴＥ５０μl、１０mg/mlリゾチーム（Boehringer, Mannheim, Germany）及び２００ｕ／mlムタノリシン（Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo., USA）を添加した。この混合物を３７℃で１０分間インキュベーションし、それから５分間氷上に置いた。もう一つの処理は、これと同一で、E. coliから単離したプラスミドに用いた。
全てのL. lactisでの構築には、精製したプラスミドＤＮＡ（Qiagen, Hilden, Germany）を用いた。ＤＮＡフラグメントをQiaex II（Qiagen, Hilden, Germany）を用いてアガロースゲルから精製した。
【００９４】
８．ＰＣＲ増幅
全てのＰＣＲ反応は、以下の基本的プロトコールで実施した。各反応で、精製テンプレート約５０ng及びセンスとアンチセンスオリゴヌクレオチド５０pmol（Life Technologies, Paisley, UK）を用いた。サンプルを９４℃まで加熱した後、Vent_R（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ２単位を添加した。アニーリング温度（Ｔ_a）は、プライマーの組成に従って、融解温度（Ｔ_m）の約７℃以下に設定した。これらのＰＣＲ増幅で、最高の結果は６０℃において得られた。ｈｂｃ及び融合遺伝子ｉｐｍ２ｈｂｃとｉｍ２ｈｂｃの合成を、７２℃で４５秒間実施した。Ｍ２タンパク質の細胞外部分（ｃｍ２とｓｍ２）をコードする配列の合成は、７２℃で２０秒間放置した。合計１３回の増幅を行った。コントロール反応はオリゴヌクレオチドを含有しなかった。異なる濃度、すなわち２、３及び４mMのＭｇＳＯ₄を用いた。最も厳しい条件下で、有意量の期待したフラグメントを産生するＰＣＲ反応を、更なるクローニングに用いた。
【００９５】
Ｃ３ｄ３フラグメントを、ＰｗｏＤＮＡポリメラーゼ（Boehringer Mannheim, Germany）を用いてＣ３ｄｓ及びＣ３ｄａオリゴヌクレオチドとともにｐＳＧ５．Ｃ３ｄ．ＹＬから増幅した。アニーリング温度を６０℃に設定し、合成を７２℃で２分間行った。
【００９６】
バキュロウイルスｇｐ６７分泌シグナルの増幅を、ＧＰ６７ｓ及びＧＰ６７ａプライマーを用いてｐＡＣＧＰ６７ＡからＴａｑポリメラーゼ（Boehringer Mannheim, Germany）によって行った。７２℃１分間の合成を、合計２５回行った。
【００９７】
９．ライゲーション
L. lactisのライゲーションをReady-To-Go（登録商標）Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden）で行った。２０℃で１時間インキュベーションした後、混合物をフェノール（Life Technologies, Paisley, UK）及びクロロフォルム／イソアミルアルコール（２４／１）で抽出した。ＤＮＡをｓｅｅ−ＤＮＡ（Amercham International, Buckinghamshire, UK）で沈殿させた。完全に再懸濁したペレットを、エレクトロポレーション（Wells et al., 1993）に用いた。
【００９８】
１０．タンパク質精製培地
Whatmann International Ltd.（Miadstone, UK）から購入したＣＦ１１セルロースを除いた、全てのクロマトフラフィー培地をPharmacia Bioteck（Uppsala, Sweden）から購入した。
【００９９】
１１．タンパク質ゲル
タンパク質サンプルをLaemmli, 1970に従いＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で分析した。電気泳動後、タンパク質を、１０％トリクロロ酢酸で固定し、０．０５％クマーシーブリリアントブルーＲ−２５０で染色した。過剰色素を、脱染液（３０％メタノール−７％酢酸）中でゲルをインキュベーションすることによって除去した。ゲルを、乾燥する前に、２枚の浸透性セロファンシート間で、４０％エタノール中に浸漬した。
【０１００】
１２．ウェスタンブロット及びドットブロット
免疫学的性質決定のため、タンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ−ゲルからニトロセルロース膜（孔径０．４５μm、Schleicher & Schuell, Dassal, Germany）上に、乾燥ブロッティング装置（Plexi-labo, Gent, Belgium）を用いて、電気泳動的に移動させた。フィルターを、２．５％スキムミルク粉末及び０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（ブロッキングバッファー）で少なくとも２時間ＰＢＳ pH７．４（１４．５mMリン酸バッファーpH７．４−１５０mMＮａＣｌ）中で遮断した。
【０１０１】
ブロッキングバッファー中に希釈した、最初の抗体を用いるインキュベーションを室温で３０〜６０分間行った。過剰量の未結合抗体を、ブロッキングバッファーで３回洗浄して除去した。結合抗体を、適切な特異性のアルカリフォスファターゼ結合抗体で検出した。続いて、フィルターをＰＢＳ pH７．４−０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００で２回洗浄した。
【０１０２】
第３の洗浄工程は、基質バッファー（１００mMＴｒｉｓ−ＨＣｌ pH９．５−１００mMＮａＣｌ−５mMＭｇＣｌ₂）を用いて行った。フィルターを、１６５μg/mlニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）と１６５μg/ml５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸（ＢＣＩＰ）の基質バッファー中で、明らかなシグナルが現れるまでインキュベートした。ブロットを、最後に、水道水で徹底的に洗浄し、乾燥した。
【０１０３】
ドットブロット分析を、タンパク質を電気泳動で移動するのではなくニトロセルロース膜を通してサンプルをろ過することを除き、ウェスタンブロットと同様の方法で行った。
【０１０４】
１３．ＥＬＩＳＡ
すべてのＥＬＩＳＡで、０．１％カゼイン溶液を、ブロッキング及び用いた抗体を希釈するために用いた。カゼイン（２．５％）の原液を以下のように調製した：カゼイン粉末６．２５gを、３７℃で一晩攪拌して３００mM ＮａＯＨ ２００mlに溶解させた。それから、２Ｎ ＨＣｌを添加してpHを７．０に調整した。最終容量は、２５０ml（Nunc bulletin no. 7, December 1989）とした。アジ化ナトリウム（０．０２％）を防腐剤として添加した。
【０１０５】
異なるＥＬＩＳＡを、Ｂ型肝炎コア又はヒトβ２ミクログロブリン融合タンパク質の濃度測定のために開発した。マイクロタイタープレート（タイプIIＦ９６maxisorp Nunc A/S, Roskilde, Denmark）を、ＩＰＭ２ＨＢｃｍ又はＩＰＭ２ｈＢ２Ｍｍを含有する１／２希釈の一連のサンプルを用いて、室温で１．５時間又は４℃で一晩コートした。
【０１０６】
同一のプレート上に、２μg/mlから始まる一連の１／２希釈の精製ＨＢｃ又はｈＢ２Ｍそれぞれを、標準として用いた。全てのインキュベーション工程の間、プレートを、ブロッキング後にプレートを洗浄しなかったことを除き、水道水で２回及びＰＢＳ（pH７．４）−０．０５％トリトンＸ−１００で一回洗浄した。マイクロタイタープレートを０．１％カゼイン溶液で２時間室温又は４℃で一晩ブロックした。
【０１０７】
最初の抗体として、マウス抗ＨＢｃ又はマウス抗ｈＢ２Ｍそれぞれを用いた。結合した抗体を、アルカリホスファターゼ標識抗マウスＩｇＧ（γ鎖特異的）抗体で検出した。抗体溶液のインキュベーションは室温で１．５時間行った。最後にマイクロタイタープレートを、１mg/mlｐ−ニトロフェニルホスフェートを含有する基質バッファー（１０％ジエタノールアミン−０．５mM ＭｇＣｌ₂−０．０２％ＮａＮ₃ pH９．８）で１時間インキュベートした。４０５nmでの吸光度を測定し、波長４９０nmを標準化に用いた。
【０１０８】
１４．ポリクローナル抗Ｍ２の調製
ＩＰＭ２ＨＢｃｍで免疫化し、ｍ．ａ．Ａ／ＰＲ／８／３４Ａ型インフルエンザウイルス（結果、免疫化を参照）を用いた致死的チャレンジを生き残った全てのマウスを、２５mg/ml トリブロモエタノール２５０μl（腹腔内注射）で麻酔し、血液サンプルを心臓穿刺により採取した。
【０１０９】
この血清を、下記の通りに単離した。粗血清がウェスタンブロットで高いバックグラウンドを示したので、ＩｇＧ分画を調製した。粗血清を０．４５μmフィルター（Millipore Millex-HV, Millipore, Bedford, MA, USA）を通してろ過し、添加液（ＰＢＳ−１０mMＥＤＴＡ、pH８）で１０倍に希釈した。この混合物を、平衡タンパク質Ｇセファロース４Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗカラム（φ＝１cm、ｈ＝８cm）に装填した。結合したＩｇＧ分子を、１００mMグリシン−ＨＣｌ（pH２．７）で溶出した。１mlのフラクションを、pHを中性にするため１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH９．５）５０μlを含むチューブに回収した。
【０１１０】
プールしたピークフラクションの抗Ｍ２抗体含量は、２．６μg/mlであった。これは、免疫化マウスの血清中の抗Ｍ２抗体の検出と比較できる、ＥＬＩＳＡで測定した。マウスモノクローナル抗ヒトβ２ミクログロブリン（Cymbus Bioscience, Southampton, UK）を、標準として用いた。
【０１１１】
１５．血清調製
５個の血液サンプルを、全てのマウスから採取した：免疫前血清（ａ）、最初の免疫後採取した血清（ｂ）、第２の免疫後（ｃ）と第３の免疫後（ｄ）及びチャレンジ後に採取した血清（ｅ）。この血液を３７℃で３０分間インキュベートした。サンプルを氷上に少なくとも１時間放置し、微量遠心機により１６，０００ｇ、５分間で２度遠心した。血清を分離した。
【０１１２】
異なるマウスから得た血清の等量を、抗体産生物の分析のためプールした。
【０１１３】
１６．ＲＴ−ＰＣＲ
Ａ／Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ／６／６０（２１５ ＨＡＵ）の尿膜腔液を、６５℃で３０分間、ＡＭＶバッファー（Boehringer, Mannheim, Germany）中でインキュベートした。この混合物の１／２０を、逆転写酵素（ＲＴ）反応に用いた。このｖＲＮＡ（ウイルスのゲノムＲＮＡ）混合物すなわち５０μmolオリゴヌクレオチド（ＲＴ―ＮＴＲＮＡ７）、１０mMＤＴＴ及び２．５mMｄＮＴＰも添加した。７０℃で１０分間インキュベーション後、ＡＭＶ逆転写酵素（Boehringer, Mannheim, Germany）２０単位及びＲＮａｓｅ阻害剤（Boehringer, Mannheim, Germany）４０単位を添加した。ＲＴ反応を４２℃で１時間行った。この反応混合物の１／３を上記のＰＣＲ反応に用いた。
【０１１４】
１７．トランスフェクションン及び発現
ＨＥＫＴ細胞を、２×１０⁵細胞／穴で６穴プレートに播種し、２４時間増殖させた。ｐＤＮＡ２μgとＦｕＧｅｎｅ ＴＭ ６ トランスフェクション試薬（Boehringer, Mannheim, Germany）を細胞に加えた。トランスフェクション４８時間後、細胞を、１００μlＰＢＳ（pH７．４）−５mMＥＤＴＡ−０．５％Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ４０中で溶解させた。可溶性分画を、１０，０００ｇでの５分間の遠心分離をして単離した。ペレットを、ＰＢＳ １００μl（pH７．４）中に再懸濁させた。
【０１１５】
１８．ＤＮＡワクチン接種
プラスミドＤＮＡを、１μg／μlの濃度で用いた。３週間おきに３回、筋肉内注射した。血清を、すべての免疫化２週間後に血清を採取し、プールし、Ｍ２タンパク質の細胞外部分の抗体反応をＥＬＩＳＡで分析した（上記材料及び方法を参照）。
【０１１６】
１９．ＥＬＩＳＡII
マイクロタイタープレートを、Ｓｆ９昆虫細胞で発現する（Black et al., 1993a, b）1μg/mlのＭ２でコートした。この方法の残りは、材料及び方法の始めの部分に記載した通りとした。
【０１１７】
２０．プラスミド一覧
２０．１ E. coli
ｐＡＴＩＰＭ２ｍ１：Ａ／ＰＲ／８／３４由来の連続したｍ２遺伝子
ｐＩＰＭ２ｈＢ２Ｍｍ２ｓ２：Ｍ２の正しいアミノ末端を有する、ＩＰＭ２ｈＢ２Ｍｍ発現プラスミド
ｐＰＬｃＩＰＭ２ＨＢｃ：開始メチオニンとＭ２ｅのアミノ末端の間に４個のアミノ酸を有する、ＩＰＭ２ＨＢｃ発現プラスミド
ｐＰＬｃＩＰＭ２ＨＢｃｍ：Ｍ２ｅの正しいアミノ末端を有する、ＩＰＭ２ＨＢｃｍ発現プラスミド。Ｍ２配列は、Ａ／ＰＲ／８／３４由来である
ｐＰＬｃＩＭ２ＨＢｃｍ：共通Ｍ２の正しいアミノ末端を有する、ＩＭ２ＨＢｃｍ発現プラスミド
【０１１８】
２０．２ L. lactis
ｐＴ１ＴＴ：ＴＴＦＣ発現プラスミド
ｐＴ１ＰＭ２ＬＴＴ：L. lactisに適合したロイシンコドンを有する、ＩＰＭ２ＴＴ発現。Ｍ２ｅの配列は、Ａ／ＰＲ／８／３４に由来する。
ｐＴ１ＰＭ２ＬＴＴＩＬ２：ｍＩＬ２と組み合わせて、適合したロイシンコドンを有する、ＩＰＭ２ＴＴ発現プラスミド
ｐＴ１ＰＭ２ＬＴＴＩＬ６：ｍＩＬ６と組み合わせて、適合したロイシンコドンを有する、ＩＰＭ２ＴＴ発現プラスミド
ｐＴ１ＨＢｃ：ＨＢｃ発現プラスミド
ｐＴ１ＨＢｃＩＬ２：ｍＩＬ２と組み合わせてＨＢｃ発現
ｐＴ１ＨＢｃＩＬ６：ｍＩＬ６と組み合わせてＨＢｃ発現
ｐＴ１ＰＭ２ＨＢｃ：ＩＰＭ２ＨＢｃｍ発現プラスミド。Ｍ２ｅの配列は、Ａ／ＰＲ／８／３４に由来する。
ｐＴ１ＰＭ２ＨＢｃＩＬ２：ｍＩＬ２と組み合わせてＩＰＭ２ＨＢｃｍ発現
ｐＴ１ＰＭ２ＨＢｃＩＬ６：ｍＩＬ６と組み合わせてＩＰＭ２ＨＢｃｍ発現
ｐＴ１Ｍ２ＨＢｃ：共通Ｍ２ｅ配列を有する、ＩＭ２ＨＢｃｍ発現プラスミド
ｐＴ１Ｍ２ＨＢｃＩＬ２：ｍＩＬ２と組み合わせてＩＭ２ＨＢｃｍ発現
ｐＴ１Ｍ２ＨＢｃＩＬ６：ｍＩＬ６と組み合わせてＩＭ２ＨＢｃｍ発現
ｐＴ１ＰＭ２ＬＨＢｃ：L. lactisに適合するロイシンコドンを有する、ＩＰＭ２ＨＢｃｍ発現プラスミド
【０１１９】
ｐＴ１ＰＭ２ＬＨＢｃＩＬ２：ｍＩＬ２と組み合わせて、適合ロイシンコドンを有する、ＩＰＭ２ＨＢｃｍ発現
ｐＴ１ＰＭ２ＬＨＢｃＩＬ６：ｍＩＬ６と組み合わせて、適合ロイシンコドンを有する、ＩＰＭ２ＨＢｃ発現プラスミド
ｐＴ１Ｍ２ＬＨＢｃ：L. lactisに適合するロイシンコドンを有する、ＩＭ２ＨＢｃｍ発現
ｐＴ１Ｍ２ＬＨＢｃＩＬ２：ｍＩＬ２と組み合わせて、適合ロイシンコドンを有する、ＩＭ２ＨＢｃｍ発現
ｐＴ１Ｍ２ＬＨＢｃＩＬ６：ｍＩＬ６と組み合わせて、適合ロイシンコドンを有する、ＩＭ２ＨＢｃｍ発現
ｐＴ１ｃＭ２Ｌ：L. lactisに適合するロイシンコドンを有する、Ｍ２ｅの細胞質形態の発現プラスミド
ｐＴ１ｃＭ２ＬＣ３ｄ：適合ロイシンコドンを有するｃＭ２ＬＣ３ｄの発現
ｐＴ１ｃＭ２ＬＣ３ｄ３：適合ロイシンコドンを有する、（３個の連続Ｃ３ｄドメインを有する）ｃＭ２ＬＣ３ｄ３発現
ｐＴ１ｓＭ２ＬＸ：L. lactisに適合するロイシンコドンを有する、Ｍ２ｅの分泌された及び固着された形態の発現プラスミド
ｐＴ１ｓＭ２ＬＣ３ｄ：適合ロイシンコドンを有する、ｓＭ２ＬＣ３ｄ発現
ｐＴ１ｓＭ２ＬＣ３ｄ３：適合ロイシンコドンを有する、（３個の連続Ｃ３ｄドメインを有する）ｓＭ２ＬＣ３ｄ３発現
【０１２０】
２０．３
ｐＵＣＭ２：Ａ／Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ／６／６０由来の連続したｍ２遺伝子を含有するプラスミド
ｐＣＤＮＡ３：真核生物の遺伝子発現の基本的ベクター
ｐＣＩＭ２：Ａ／Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ／６／６０由来の連続したｍ２遺伝子を保有しＤＮＡワクチン接種に用いるプラスミド。
ｐＣＩＭ２ＨＢｃｍ：ｉｍ２ｈｂｃｍを有する、ＤＮＡワクチン接種に用いるプラスミド
ｐＣＩＰ３Ｍ２ＨＢｃｍ：ＤＮＡワクチン接種に用いるプラスミド、３倍のＢ型肝炎コアに遺伝的に融合したＭ２タンパク質の細胞外ドメインを含む。融合タンパク質であるＩＰ３Ｍ２ＨＢｃｍは、Ｍ２ｅの正しいアミノ末端から始まる。Ｍ２の配列はＡ／ＰＲ／８／３４に由来する。
【０１２１】
実験の部
１．ｐＡＴＩＰＭ２ｍの構築
Ａ型インフルエンザウイルスのＲＮＡセグメント７、すなわちＡ／ＰＲ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）を、Min Jou et al., 1980における、ＲＮＡセグメント４に対して記載された手法によりクローン化した。得られたプラスミドは、ｐＡＴＩＰＭＡと名付けられ、市販のものを入手することができる（LMBP catalogue 1992, no. 1774）。
【０１２２】
Ｍ２タンパク質のｍＲＮＡは、ＲＮＡセグメント７の同一線上の転写物（collinear transcript）ではない。実際、６８９ヌクレオチドのイントロンを除去しなければならなかった（Lamb et al., 1981）。
【０１２３】
プラスミドｐＡＴＩＰＭＡにおいて、ＳｔｕＩは、第２エキソンの最初のヌクレオチドの後ろを切断する（Figure １ａ参照）。このヌクレオチドを、第１エキソンをコードするために用いる合成オリゴヌクレオチドに包含される。成熟Ｍ２タンパク質のアミノ末端をコードする合成第１エキソンを、一本鎖ＧＡＴＣが５′末端に突出した形で含むように設計した。これにより、前述のベクターｐＡＴＩＰＭＡのＢａｍＨＩ部位に連結し、そして本来の第１エキソンを置き換えることができた。
【０１２４】
さらに、使用コドンは、Ｅ．coli内で発現するように最適化された。
【０１２５】
次に、部位特異的突然変異誘発（Stanssens et al., 1989）により、Ｍ２タンパク質の細胞外部分と膜固着部位の接合点に、ＢｃｌＩ部位を導入した(Figure ２６参照)。細胞外部分のアミノ酸配列は、変更されていない。得られたプラスミドｐＡＴＩＰＭ２ｍ１は、Ａ／ＰＲ／８／３４の、連続したｍ２遺伝子を持っている。
【０１２６】
２．ＩＰＭ２ｈＢ２Ｍｍの構築
Parker and Wiley（1989）は、プラスミドｐ７１４を用いてヒトβ２ミクログロブリンをＥ．coliの細胞周辺質で発現させた。このプラスミドは、Ｅ．coliの外部膜タンパク質Ａのシグナル配列（ＯｍｐＡ−ｓｓ）に先行されるβ２ミクログロブリンをコードする部位を含んでいる（Figure ２ａ参照）。ＯｍｐＡシグナル配列は、この配列が融合したタンパク質の、細胞周辺質への輸送に必要とされている。輸送の後、シグナル配列は切除される。プラスミドｐ７１４上では、ヒトβ２ミクログロブリンは、リポタンパク質（ｌｐｐ）とｌａｃＵＶ５プロモーターに制御されている。中期対数増殖期の培養細胞へのＩＰＴＧ１ｍＭの添加によりβ２ミクログロブリンの生産が誘導される。
【０１２７】
ｐＡＴＩＰＭ２ｍ１からＢａｍＨＩ−ＢｃｌＩフラグメントとして単離した、Ｍ２タンパク質の細胞外部分をコードする配列を、ｏｍｐＡのシグナル配列とヒトβ２ミクログロブリンの間に挿入した（詳しくは Figure ２ａを参照）。構築のために、取り除かなければならない９個の付加的なヌクレオチドが、ｏｍｐａシグナル配列とｍ２フラグメントの間にあった。これを、Nakamaye and Eckstein, 1986にしたがって、ルーピングアウト突然変異誘発により行なった。結果として、プラスミドｐＩＰＭ２ｈＢ２Ｍｍ２ｓ２を得た。
【０１２８】
３．ＩＰＭ２ｈＢ２Ｍｍの局在化
新しく培養した、ｐ７１４またはｐＩＰＭ２ｈＢ２Ｍｍ２ｓ２を含むＣ３０００のプレカルチャーをアンピシリンを含むＬＢ中で１／１００に希釈した。上述のとおり、ｈｂ２ｍ遺伝子およびｉｐｍ２ｈｂ２ｍｍ遺伝子はｌａｃＵＶ５の制御下にある。カルチャーの密度が、およそ５．５×１０⁸菌体数／mlに達した時にそれらを二つに分け、それぞれのカルチャーのうち、片方をＩＰＴＧ１mMで誘導した。３時間の誘導の後、菌体を回収し、分別した。菌体の細胞周辺腔を、浸透圧ショック法（Neu and Heppel, 1965）で単離した。残りの菌体を音波処理（Vibra cell, Sonics & Materials Inc., Danbury, Conn., USA）し、１６，０００ｇで１０分間遠心分離して、細胞質を単離した。その異なるサンプルを、ＳＤＳ １５％ ＰＡＧＥゲルで解析した。シグナル配列を含んだままの前駆体は、菌体と結合していっしょに残っていたのに対し、ヒトＢ２Ｍおよび融合タンパク質ＩＰＭ２ｈＢ２Ｍｍは、細胞周辺腔に局在化していた。モデル１２０Ａオンラインフェニルチオヒダントインアミノ酸分析装置と組み合わせたモデル４７０Ａガス相シークエンサー（Applied Biosystems, Foster City, CA., USA）での自動エドマン分解による、成熟ＩＰＭ２ｈＢ２Ｍｍのアミノ末端の決定（Dr. J. Bandekerckhoveの好意による）は、ＯｍｐＡシグナル配列が、正確に切除されていることを証明した。
【０１２９】
４．ＩＰＭ２ｈＢ２Ｍｍの精製
融合タンパク質ＩＰＭ２ｈＢ２Ｍｍを、Ｅ．coliの細胞周辺腔において効率的に発現することができた。浸透圧ショック法は、量が多いときには特に決定的な方法であるにもかかわらず、Steidler et al.（1994）は以前に、Ｋｉｌタンパク質の制御された発現を基にした、細胞周辺腔タンパク質を増殖培地中に放出させるための洗練された方法を記載している。
【０１３０】
Ｋｉｌ遺伝子は、互換性プラスミド（compatible plasmid）上に、λファージの左側のプロモーターであり、正確に制御されたＰ_Lプロモーターの制御下に存在する（Remaut et al, 1981）。プラスミドｐｃＩ８５７Ｋ１もまた、Ｐ_Lプロモーターの温度感受性リプレッサーｃＩ８５７を備えている。融合タンパク質ＩＰＭ２ｈＢ２Ｍｍは、１ｍＭのＩＰＴＧでの誘導で、およびＫｉｌを誘導するためにカルチャーを２８℃から４２℃に切り替える産生期（production phase）後期に合成される。
【０１３１】
上述した標準的誘導法を用いて発酵（BioFlo IV fermentor, New Brunswick Scientific Co., Edison, N.J., USA）を行った。カルチャーを、ｃｏｎｔｉｆｕｇｅ １７ＲＳ（Heraeus Instruments, Hanau, Germany）で、１１，０００gで遠心分離して、増殖培地を分離した。増殖培地の塩化ナトリウム濃度を３００mMに調整して、緩衝剤ＭＥＳ（２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸）２０mM、pH６．５で処理した。この溶液を、ＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｃｅｌカラム（φ＝５cm、ｈ＝６．５cm）に、ＭＥＳ２０mMでpH６．５−ＮａＣｌ３００mMでの平衡状態で充填した。これらの条件下では、ＩＰＭ２ｈＢ２Ｍｍは、基剤に結合しなかった。貫流の硫酸アンモニウム濃度を、pH７の３．８M（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄溶液で０．８Mにした。混合液を、トリス−ＨＣｌ ２０ｍＭ、pH ７．５、０．８M （ＮＨ₄）₂ＳＯ₄の緩衝状態で（Ｐｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム（φ＝５cm、ｈ＝１７cm）に充填した。硫酸アンモニウム濃度勾配を、０．８Mから始めて０まで減少させたことでは、結合融合タンパクは遊離されなかった。これは、カラムをpH勾配を、２０mMトリス−ＨＣｌpH７．５から、５mM酢酸ナトリウムpH５．５で溶出することにより達成した。ピークフラクション（peak fractions）を回収し、ジメチルアミン（ＤＥＡ）２０mM、pH８．５中に１０倍希釈した。
【０１３２】
完全な混合液を、２０mMのＤＥＡ（pH８．５）で緩衝状態にしたＳｅｐｈａｒｏｓｅ Ｑカラム（φ＝０．８cm、ｈ＝２．３cm）に充填した。該タンパク質を０〜１Mの塩勾配でカラムから溶出した。ピークフラクションを回収し、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−１００ゲル分離カラム（φ＝１．５cm、ｈ＝４７cm）に充填した。期待分子量約１５ｋＤａの唯一のピークが観察された。この精製されたＩＰＭ２ｈＢ２Ｍｍを、Ｍ２タンパク質に対するモノクローナル抗体を産出するハイブリドーマを作る目的でマウスを免疫にするために用いた。
【０１３３】
５．Ｍ２タンパク質に対するモノクローナル抗体の産出
Ｂａｌｂ／ｃマウスを、精製したＩＰＭ２ｈＢ２Ｍｍで３回免疫した。最初の注射に際しては、完全量のＲｉｂｉアジュバントを使用した。第二回目および第三回目の免疫化は、５０μgのＭＰＬＡ存在下で行われた。注射は、３週間の間隔を空けて行われた。最後の免疫化から３日後に、標準的なプロトコル（Kohler and Milstein, 1975）を用いて脾臓細胞を単離し、ミエローマ細胞ＳＰ２／０−ＡＧ１４と融合した。異なる免役グロブリン産生細胞クローンからの上清について、ＥＬＩＳＡ法およびウェスタンブロット法により、もう一方の融合タンパク質ＩＰＭ２ＨＢｃｍ（後述）に対する反応性の試験をした。偽のポジティブクローンを排除するため、Ｂ型肝炎コアタンパク質を単体でコントロールとして用いた。抗体のアイソタイプを決定した（Isotrip, Boehringer Mannheim, Germany）。Ｍ２タンパク質の細胞外部分を認識する２種類の異なった免役グロブリンサブタイプＩｇＭおよびＩｇＧ２ａが得られた。特に、ＩｇＧ２ａ抗体を、さらなる実験で用いた。
【０１３４】
６．ＨＢｃおよびＩＰＭ２ＨＢｃｍの発現
指数増殖カルチャーを２８℃から４２℃へシフトさせることにより、Ｐ_Lプロモーターに制御されているタンパク質の発現を行った（Remaut et al., 1981）。ｐＰＬｃ２４５（コントロール）、ｐＰＬｃＡ１（ｈｂｃ遺伝子をもつ）またはｐＰＬｃＩＰＭ２ＨＢｃｍ（融合タンパク質ｉｐｍ２ｈｂｃを含む）をそれぞれ含むＭＣ１０６１〔ｐｃＩ８５７〕の飽和プレカルチャーを、ＬＢ培地（カナマイシン５０μg／mlおよびアンピシリン１００μg／ml）中に１／１００に希釈して、振とうさせながら２８℃で約４時間培養した。培養が４．５×１０⁸から５．５×１０⁸菌個数／mlの密度に達した時点で、それらを分けて、半分を２８℃で４時間インキュベートし、他の半分を４２℃に切り替えた。菌体を、遠心分離によって濃縮した（微量遠心分離器で１６，０００ｇ、２分間）。
【０１３５】
培地を取り除き、菌体をＴＥバッファー（１0mM トリス - ＨＣｌ - 1mM EDTA, pH 7.6）に再懸濁した。音波処理（Vibra cell, Sonics & Materials Inc., Danbury, Conn., USA）により菌体を開裂して、菌体の破片を超小型遠心分離器中で１６，０００ｇ、１０分間、沈殿させた。上清を単離し、ペレットをＴＥバッファーに再懸濁した。サンプルはＳＤＳ １２．５％ ＰＡＧＥゲルで、ウェスタンブロットおよびドットブロットで解析した。
【０１３６】
７．ＩＰＭ２ＨＢｃｍの大規模産生
菌株ＭＣ１０６１〔ｐｃＩ８５７、ｐＰＬｃＩＰＭ２ＨＢｃｍ〕をＢｉｏＦｌｏ ＩＶ 発酵槽（New Brunswick Scientific Co., Edison, N.J., USA）で培養した。カルチャーの密度が５．５×１０⁸個／mlに達した時点で温度を４２℃に上げた。３時間の誘導の後、カルチャーをｃｏｎｔｉｆｕｇｅ １７ＲＳ（Heraeus Instruments, Hanau, Germany）中で、１１，０００ｇで遠心分離した。菌体を回収し、ペレット状にした菌体の重さ（g）の２倍に相当する体積（ml）のバッファー（５０mM トリス − ＨＣｌ pH８ − １５０mM ＮａＣｌ−５％グリセロールおよび２５mlに対してプロテアーゼ阻害カクテル錠１個（CompleteTM; Boehringer, Mannheim, Germany））に再懸濁した。この懸濁液を、リゾチーム１mg／ml（その都度２５mMトリス−ＨＣｌ、pH８に溶解した）で、氷上で１時間半処理した。続いて、菌体を２５mM、pH８のＥＤＴＡの存在下で、０．２％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００で溶解した。氷上で３０分間インキュベートした後、溶解物をＳｏｒｖａｌｌ ＳＳ−３４ローター（Du Pont Company, Wilmington, DE, USA）で４８，０００ｇ，１時間遠心分離した。上清を取り除き、ＩＰＭ２ＨＢｃｍの精製に用いた。
【０１３７】
８．ＩＰＭ２ＨＢｃｍによる免役化
アジュバントの存在下において、精製したＩＰＭ２ＨＢｃｍをＢａｌｂ／ｃマウスの腹腔内に３回注射した。コントロールマウスは、pH７．４のＰＢＳバッファーおよびアジュバントのみを受けた。最初の免役化では、用量の半分のＲｉｂｉアジュバントを用いた。第２および第３回目の注射では、ＭＰＬＡ２５μgおよびＭＤＰ２５μgを用いた。
【０１３８】
マウスに軽くエーテル麻酔を施した後、ＢＰＳバッファー（いかなるアジュバントもなしに、ＩＰＭ２ＨＢｃｍか、あるいはＩＭ２ＨＢｃｍを１０μg含む）中の抗原溶液５０μlを鼻孔に入れることにより、鼻腔内的に３回、免疫化した。
【０１３９】
９．L.lactisでの発現
プラスミドｐＴ１ＨＢｃ、ｐＴ１ＰＭ２ＨＢｃまたはｐＴ１Ｍ２ＨＢｃをそれぞれ含む、または、ｍＩＬ２の派生体（ｐＴ１ＨＢｃＩＬ２、ｐＴ１ＰＭ２ＨＢｃＩＬ２およびｐＴ１Ｍ２ＨＢｃＩＬ２）もしくは、ｍＩＬ６の派生物（ｐＴ１ＨＢｃＩＬ６、ｐＴ１ＰＭ２ＨＢｃＩＬ６およびｐＴ１Ｍ２ＨＢｃＩＬ６）をそれぞれ含む、L.lactisの菌株ＭＧ１３６３からの単一コロニーを、各々ＧＭ１７Ｅ １０mlに植え付けた。ＭＧ１３６３〔ｐＴＲＥＸ１〕を、コントロールとして用いた。菌体を、２８℃で１６時間培養した。細胞を、２，０００g、２０分間（Sorvall 11 RT6000 D）遠心分離して回収した。増殖培地を分離して、菌体を、ＴＥ２５０μlに再懸濁した。再懸濁の後、リゾチーム１０mg／mlを加えた、追加のＴＥ２５０μlおよびムタノリシン（mutanolysin）２００ｕ／mlを加えた。この混合液を、３７℃で１０分間インキュベートして、氷上に５分間置いた。次に、Laemmliサンプルバッファー（トリス-ＨＣｌ pH ６．８ １００ml- ＳＤＳ ５％ - β-メルカプトエタノール 1.2M − ブロモフェノールブルー 0.008% - グリセロール 16%）を加え、そしてサンプルを５分間、煮沸した。もとの培養液量１mlと等量である、１０⁹個体の菌体をＳＤＳ１２．５％ＰＡＧＥゲルで解析した。カルチャー上清中におけるｍＩＬ２またはｍＩＬ６の生産量を、ＣＴＬＬ２細胞（mIL2, Gillis et al., 1978）の増殖をもとにした、あるいはＢ細胞ハイブリドーマすなわち７ＴＤ１（mIL6, Van Snick et al., 1986）の増殖をもとにしたバイオアッセイで評価した。
【０１４０】
１０．受動免疫
ＩＭ２ＨＢｃｍ粒子の精製製剤を生後７週間のメスＢａｌｂ／ｃマウスの免疫化に用いた。合計４０個体のマウスを、１０pgのＩＭ２ＨＢｃｍで免疫化した。コントロール集団の４０個体のマウスは、バッファーのみを受けた。適当なアジュバントと組み合わせた全３回の注射は、３週間の間隔をおいて行った（材料および方法参照）。３度目の免疫化の２週間後、それぞれの群の２８個体から採血し、血清を単離した（材料および方法参照）。この血清を、感染２４時間前に、未投与のマウスに腹腔内投与した。この方法は、受動免疫と呼ばれている。１２個体のマウスが、ＩＭ２ＨＢｃｍ免疫化マウスからの血清８００μlを受け、他の１２個体のマウスが、コントロール集団からの血清を受けた。これらの２４個体のマウスおよび残りの免疫化された２４個体のマウスを、３度目の免疫化から３週間後に、５ ＬＤ₅₀ｍ．ａ．Ｘ４７でチャレンジした。エーテル麻酔後に、ウイルスを全量５０μlで鼻腔内投与した。1日おきに直腸温度および体重を測定することにより、病状を追跡した。
【０１４１】
１１．ＤＮＡワクチン接種のための構造体（Figure ２９）
異種のＤＮＡワクチン接種ベクターを作るために、サイトメガロウイルスプロモーターを持つ哺乳類発現ベクターｐＣＤＮＡ３（Invitrogen, Leek, The Netherlands）を用いた。
【０１４２】
Ａ型インフルエンザウイルス Ａ／Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ／６／６０から、ＲＴ−ＰＣＲにより、とぎれのないｍ２遺伝子を単離した（材料および方法参照）。増幅フラグメントを、ＢｇｌＩＩおよびＸｂａＩで切断して、ＢｇｌＩＩおよびＸｂａＩで開環したｐＵＣ１９に挿入した。このプラスミドを、ｐＵＣＭ２とした。ｍ２遺伝子の塩基配列を決定して、該遺伝子の寒冷適合形態（cold adapted form）との一致を示した。ｍ２遺伝子を、ｐＵＣＭ２から３２１ｂｐのＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩフラグメントとして単離し、ＥｃｏＲＩとＸｂａＩで開環したｐＣＤＮＡ３に挿入した。これが、結果としてプラスミドｐＣＩＭ２となった。
【０１４３】
２つの融合遺伝子、ｉｐ３ｍ２ｈｂｃｍおよびｉｍ２ｈｂｃｍもまた、ｐＣＤＮＡ３に挿入した。ｉｍ２ｈｂｃｍ遺伝子をｐＰＬｃＩＭ２ＨＢｃｍからＰＣＲで増幅した。このフラグメントをＳｐｅＩで切断し、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼでリン酸化した。この６３０ｂｐのフラグメントを、ＥｃｏＲＶとＸｂａＩで開環したｐＣＤＮＡ３に挿入した。得られたプラスミドを、ｐＣＩＭ２ＨＢｃｍとした。
【０１４４】
ｐＰＬｃＩＰＭ２ＨＢｃの構築の間に（Figure ３ａ参照）、Ｍ２ｅフラグメントが２つまたは３つ挿入されたプラスミドも得られた。これらのプラスミドを、それぞれｐＰＬｃＩＰ２Ｍ２ＨＢｃおよびｐＰＬｃＩＰ３Ｍ２ＨＢｃとした。ｉｐ３ｍ２ｈｂｃｍ遺伝子を、ｐＰＬｃＩＰ３Ｍ２ＨＢｃからＰＣＲで増幅した。このフラグメントを、ＳｐｅＩで切断し、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼでリン酸化して、ＥｃｏＲＶとＸｂａＩで開環したｐＣＤＮＡ３に挿入した。得られたプラスミドをｐＣＩＰ３Ｍ２ＨＢｃｍとした。
【０１４５】
プラスミドＤＮＡをEndoFree Plasmid Giga kit（Qiagen, Hilden, Germany）で単離した。分光光度計による解析により、ｐＤＮＡの濃度を測定した。
【０１４６】
１２．ＨＥＫＴ細胞内での発現
プラスミドｐＣＤＮＡ３、ｐＣＩＭ２、ｐＣＩＭ２ＨＢｃｍおよびｐＣＩＰ３Ｍ２ＨＢｃｍをＨＥＫＴ細胞に形質移入した（材料および方法参照）。感染から４８時間後に、細胞を溶解し、ウェスタンブロッティング法で解析した。
【０１４７】
１３．血清の解析
毎回の免疫化から２週間後に、血清サンプルを採取し、ＥＬＩＳＡ法で解析した。Figure ３１のパネルＡにおいて、ＨＢｃ融合タンパク質を発現させることができる２つのベクターを、コントロールベクターと比較している。ＥＬＩＳＡ法は、材料および方法に記載されたとおりに実施した。
【０１４８】
結果
１．ＩＰＭ２ＨＢｃｍの構築
プラスミドｐＰＬｃＡ１（Figure ３ａ参照）は、バクテリオファージλ（Dr. Nassalから寄贈）のＰ_Lプロモーターの制御下にある肝炎ｂコア（hepatitis b core:hbc）遺伝子を含んでいる。ｐＰＬｃＡ１から単離した３４６ｂｐのＮｃｏＩ−ＸｂａＩＨＢｃフラグメントは、ｐＭａ５８の誘導体である、ＮｃｏＩとＸｂａＩで開環したｐＭａ５８１に挿入した。このプラスミドをｐＭａＨＢｃとした。我々は、部位特異的突然変異誘発によりＢａｍＨＩ部位を、肝炎ｂコア遺伝子の５′末端の、開始コドンの直後に、ＨＢｃの読み取りフレームの中に正確に位置付けて、導入した（詳細はFigure ３ａおよびｂを参照）。得られたプラスミドをｐＭａＨＢｃｍとした。Ｍ２タンパク質の細胞外部分をコードする情報をｐＡＴＩＰＭ２ｍ１からもたらされた７２ｂｐのＢａｍＨＩ−ＢｃｌＩフラグメントとして、ＢａｍＨＩで開環したｐＭａＨＢｃｍに挿入してクローン化し、ベクターｐＩＰＭ２ＨＢｃを得た。次に、発現ベクターｐＰＬｃＡ１中のｈｂｃ遺伝子を４１８ｂｐのＮｃｏＩ−ＸｂａＩ ｍ２ｈｂｃフラグメントと置換して、ｐＰＬｃＩＰＭ２ＨＢｃを作成した。Ｍ２タンパク質の、最初のメチオニンと細胞外部分が始まる部分の間に、余分な４つのアミノ酸があり、構築のためには、これを取り除かなければならなかった。これは、ルーピングアウト突然変異誘発（Deng and Nickolov, 1992）により行った。得られたプラスミドをｐＰＬｃＩＰＭ２ＨＢｃｍと名づけた（Figure ３ａおよびｃ参照）。
【０１４９】
２．融合タンパク質の発現
プラスミドｐＰＬｃ２４５（コントロール）、ｐＰＬｃＡ１（ｈｂｃ遺伝子）およびｐＰＬｃＩＰＭ２ＨＢｃｍ（ｉｐｍ２ｈｂｃ遺伝子）を、ＭＣ１０６１〔ｐｃＩ８５７〕に形質転換した。培養および誘導の後、細菌を超音波処理して溶解した。溶解産物を遠心分離して、上清の半分をＳＤＳ １２．５％ ＰＡＧＥゲルにのせた（Figure ４参照）。同じフラクションをウェスタンブロットでも解析した。２つの異なるモノクローナル抗体を使用した：Ｂ型肝炎コアタンパク質に特異的な抗体、およびＭ２タンパク質の細胞外部分に対するモノクローナル抗体（ＩｇＧ２ａ）である。
【０１５０】
Ｂ型肝炎コアに対するモノクローナル抗体は、１つはＢ型肝炎コアタンパク質に相当し、もう１つは融合タンパク質に相当している、２つの異なるバンドを明らかにした（Figure ５Ａ参照）。後者のタンパク質は移動度が低く、Ｍ２タンパク質の細胞外ドメインの挿入に相当している。Ｍ２フラグメントの存在は、Ｍ２タンパク質の細胞外部分に対する抗体の特異性によって確かめられた（Figure ５Ｂ参照）。
【０１５１】
ＩＰＭ２ＨＢｃｍのＮ末端アミノ酸配列は、モデル１２０Ａオンラインフェニルチオヒダントインアミノ酸解析機に組み合わされたモデル４７０ガス相シークエンサー（Applied Biosystems, Foster City, CA., USA）での自動エドマン分解により決定した。この解析により、Ａ型インフルエンザウイルスのＭ２タンパク質のアミノ末端配列と全く同じ、Ｎ末端配列Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕが明らかになった。最初のアミノ酸、メチオニンをＥ．coli中で除去した。したがって、融合タンパク質のアミノ末端は、野生型Ｍ２タンパク質のそれと一致する（Table １；Lamb et al., 1985）。
Ｂ型肝炎コアはＥ．coli中で発現したときにも、Ｂ型肝炎感染患者の血液に蔓延するウイルス性のコア粒子と区別できない粒子と自然に結合する。Clarke and co-workers（１９８７）は、Ｂ型肝炎コアタンパク質のアミノ末端に挿入したペプチドが、粒子の表面で検出することができることを示した。
【０１５２】
電子顕微鏡写真（Dr. G. Engler）は、ＩＰＭ２ＨＢｃｍ融合タンパク質は、同様の粒子を形成することができることを示した。Ｍ２タンパク質の細胞外部分の挿入が、このタンパク質の表面局在化につながるのか否かを研究するため、ＨＢｃ又はＩＰＭ２ＨＢｃｍを含む溶解性フラクションをドットブロットでニトロセルロース膜上に置いた。ドットブロットを、ＨＢｃに対する、又はＭ２に対するモノクローナル抗体で処理した。Figure ７は、Ｍ２タンパク質に対する抗体にさらされたときの、溶解性ｐＰＬｃＩＰＭ２ＨＢｃｍフラクションにおけるシグナルを、明確に示している（パネルＢ）。溶解性フラクションが、ニトロセルロース膜上に、株の状態であったことから、我々は、エピトープが、Ｂ型肝炎コア粒子の表面に位置すると結論する。
【０１５３】
３．ＩＰＭ２ＨＢｃｍの精製
菌体の溶解物を、材料および方法のとおりに調製した。トリス−ＨＣｌ（ｐH８）、およびＮａＣｌの濃度を、それぞれ２０mMおよび５０mMに調整した。この混合液を２０mMトリス−ＨＣｌ（ｐH８）−５０mMＮａＣｌで平衡状態としたＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム（φ＝２．５cm，ｈ＝５．５cm）に充填した。融合タンパクは、カラムには保持されていなかった。貫流のため、最終濃度が１．２Ｍになるように３．８Ｍの（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄、ｐH７を加えた。この混合液を、冷室で攪拌しながら１６時間放置した。沈殿物をＣＦ１１セルロースカラム（φ＝２．５cm，ｈ＝３．５cm）で除去した。該カラムを、ＰＢＳ（pH７．４）で溶出した。約５０mlの溶出液を、Centiprep３０（Amicon Corporation, Danvers, Ill., USA）中で５mlに濃縮し、ＰＢＳ、pH７．４で平衡状態にしたＳｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−３００カラム（φ＝２．５cm，ｈ＝９１cm）に充填した。ピークフラクションを集めておき、ＩＰＭ２ＨＢｃｍの濃度を、ＥＬＩＳＡ法により測定した。ＬＰＳ含有量を測定した（LAL Coatest（登録商標）Endotoxin purchased from Endosafe Inc., Charlston, SC., USA）が、免疫化を妨げないためには十分に少ない量であった（５〜９ng／５０μg ＩＰＭ２ＨＢｃｍ）。
【０１５４】
４．免疫化
精製したＩＰＭ２ＨＢｃｍ粒子を、生後７週間のメスのＢａｌｂ／ｃマウスの免疫化に用いた。１２個体のマウスの、４つの異なるグループを評価した。第１のグループはＩＰＭ２ＨＢｃｍを５０μg、第２は１０μg、第３は５μgを受け、第４はコントロールグループであり、アジュバントが入ったバッファーのみを受けた。適量のアジュバントと共に、全部で３回の注射がなされた。注射は、３週間の間隔で施された。最後の注射から３週間後に、５ ＬＤ₅₀ｍ．ａ．Ａ／ＰＲ／８／３４でマウスをチャレンジした。エーテル麻酔後、全量５０μgのウイルスを鼻腔投与した。1日おきに直腸温度および体重を測定することにより、病状を追跡した。
【０１５５】
ＩＰＭ２ＨＢｃｍで免疫化したすべてのマウスが、後述のインフルエンザチャレンジに対して有意な防御を示した。コントロールグループが１１個体のうち２個体だけだったのに対して、投与量に依存して１２個体中９〜１１個体のマウスがインフルエンザ感染を生き延びた（Figure ８Ｂ参照）。
【０１５６】
５．血清サンプルの解析
初回の注射の１日前（採血ａ）および毎回の注射から２週間後（採血ｂ、ｃおよびｄ）に、血液サンプルを採取した。チャレンジの３週間後に、マウスがインフルエンザ感染から十分回復したときに、最後の血液サンプル（ｅ）を採取した。Ｍ２タンパク質の細胞外部分に対するＩｇＧ抗体を同定するために、血清をＥＬＩＳＡ法（材料および方法参照）で解析した。そのために、我々は、別の融合タンパクであるＩＰＭ２ｈＢ２Ｍｍを用いた。どちらも未精製培養上清として、マイクロタイタープレートの半分をヒトβミクログロブリンでコートし、もう半分を融合タンパクＩＰＭ２ｈＢ２Ｍｍでコートした。用いたＩＰＭ２ｈＢ２Ｍｍの濃度は、１μg/mlであった。両方の条件設定において、同じ濃度の全タンパク質を用いた。それゆえ、ｈＢ２Ｍを発現している細菌の培養上清のｈＢ２Ｍ含量を、精製されたｈＢ２Ｍ（Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo., USA）を加えて、１μg/mlに調整しなければならなかった。１／５０から始まる、異なった種類の希釈系（１／３）を、ｈＢ２ＭとＩＰＭ２ｈＢ２Ｍｍでコートしたウェル上に載せた。さらにＥＬＩＳＡ法を、材料および方法に記載したとおりに行った。
【０１５７】
Ｍ２タンパク質の細胞外部分への特異的反応性に対する値を得るため、その希釈におけるｈＢ２Ｍの吸光度を、対応する希釈率のＩＰＭ２ｈＢ２Ｍｍの吸光度から減算した。Figure ９は、３回のワクチン注射を受けたマウスにおける、Ｍ２タンパク質の細胞外部分に対する強い抗体反応を示している。血清中の力価は、チャレンジの後にさらに増加した。
【０１５８】
６．ＩＭ２ＨＢｃｍの構築
Ａ型インフルエンザウイルスに対する、共通のワクチンを作ることが、本発明の目的である。上記のワクチン接種の研究において、我々は、もとのＭ２配列をもたらしたインフルエンザウイルスＡ／ＰＲ／８／３４に対する防御を示した（相同防御）。このウイルスからのＭ２タンパク質の細胞外部分は、現在までに配列決定された他のほとんどのウイルスと、ただ１つのアミノ酸において異なる（Table １参照）。したがって、構築は、２０位のグリシンをアスパラギン酸に変更することで行った。
【０１５９】
そうするために、我々はｐＰＬｃＩＰＭ２ＨＢｃｍ、ｐＭａＩＰＭ２ＨＢｃ２の構築（Figure ３ａ参照）における媒介ベクターを用いた。プラスミドｐＭａＩＰＭ２ＨＢｃ２はまだ、Ｍ２タンパク質の最初の完成コドンから始まる、突然変異ｍ２（１２個の余分なヌクレオチドの欠失）フラグメントを含んでいない。それゆえ、このフラグメントをＳｇｒＡＩとＥｃｏＲＩで切断することにより、ｐＰＬｃＩＰＭ２ＨＢｃｍから単離した。この４９９ｂｐのＳｇｒＡＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントをＳｇｒＡＩとＥｃｏＲＩで開環したベクターｐＭａＩＰＭ２ＨＢｃ２（ｐＭａＩＰＭ２ＨＢｃ３の構築で得られた）（Figure １０参照）にクローン化した。
【０１６０】
Deng and Nickoloff（１９９２）による部位特異的突然変異誘発によって、Ｍ２タンパク質の細胞外部分を、より共通のＭ２配列（Gly20→Asp）に変えた。新しいプラスミドをｐＩＭ２ＨＢｃｍとした。塩基配列は、モデル３７３Ａシークエンサー（Applied Biosystems Forester city, CA., USA）で決定され、望まれた突然変異を含むことが示された。突然変異Ｍ２フラグメントを、４９９ｂｐのＳｇｒＡＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントとしてｐＩＭ２ＨＢｃｍから単離して、ＳｇｒＡＩとＥｃｏＲＩで開環した発現ベクターｐＰＬｃＩＰＭ２ＨＢｃｍに再導入して、ｐＰＬｃＩＭ２ＨＢｃｍを作成した。
【０１６１】
７．ＩＭ２ＨＢｃｍの発現
それぞれｐＰＬｃ２４５、ｐＰＬｃＡ１、ｐＰＬｃＩＰＭ２ＨＢｃｍまたはｐＰＬｃＩＭ２ＨＢｃｍを含む菌株ＭＣ１０６１〔ｐｃＩ８５７〕を実験の部に記載したとおりに培養した。菌体を回収し、超音波処理して開裂した。溶解性フラクションを単離して、Ｂ型肝炎コアタンパク質またはもたらされた融合タンパク質の濃度を、ＥＬＩＳＡ法により測定した。ＨＢｃ５μgまたはＩ（Ｐ）Ｍ２ＨＢｃｍを含む溶解性フラクションをＳＤＳ １２．５％ ＰＡＧＥゲルで解析した（Figure １１参照）。同じフラクションをウェスタンブロットによっても解析した（Figure １２参照）。問題のタンパク質は、Ｂ型肝炎コアタンパク質に対する抗体、またはＭ２タンパク質の細胞外部分に特異的なモノクローナル抗体で検出した。新規な融合タンパク質ＩＭ２ＨＢｃｍは、ＩＰＭ２ＨＢｃｍと同じ効率で発現していると結論することができる。さらに、Ｍ２タンパク質の、細胞外部分におけるアミノ酸変化（Ｇｌｙ２０→Ａｓｐ）は、モノクローナル抗Ｍ２抗体の結合に影響を及ぼしていなかった。
【０１６２】
８．異種チャレンジに対する免疫化
ポイント４に記載したのと類似の方法を、インフルエンザでの異種チャレンジに対するマウスの防御に対する、ＩＰＭ２ＨＢｃｍおよびＩＭ２ＨＢｃｍの効果をテストするために用いた。１０μgのＩＰＭ２ＨＢｃｍまたはＩＭ２ＨＢｃｍ（ＩＰＭ２ＨＢｃｍと同じ方法で精製した）を、免疫化のために用いた。マウスを３０ ＨＡＵ Ｘ−４７でチャレンジした。
【０１６３】
免疫化されたすべてのマウスが、異種チャレンジに対して有意な程度の防御を示した。コントロールグループにおいては、１１個体のうち２個体のみであったのに対して、１２個体のうち８個体（ＩＰＭ２ＨＢｃｍの場合、ｐ＜０．０５）または１２個体（ＩＭ２ＨＢｃｍの場合、ｐ＜０．０００１）が、インフルエンザ感染を生き延びた（Figure ８Ｃ）。
【０１６４】
鼻腔内投与の効果をテストするため、同じ方法がとられた、ここでは腹腔内注射のかわりに、抗体を鼻腔内投与した。この場合においても、防御は明らかであった：コントロールグループにおいては、１１個体のうち２個体のみだったのに対して、１２個体のうち１２個体（ＩＰＭ２ＨＢｃｍの場合、ｐ＜０．０００１）または１１個体（ＩＭ２ＨＢｃｍの場合、ｐ＜０．００１）が、インフルエンザ感染を生き延びた（Figure ８Ｄ）。
【０１６５】
９．L.lactisにおける、Ｍ２−ＨＢｃ融合タンパク質の発現のためのベクターの構築
Ｂ型肝炎コアタンパク質と２つの融合タンパクＩＰＭ２ＨＢｃｍおよびＩＭ２ＨＢｃｍを、Lactcoccus lactisで発現させるために、プラスミドｐＴＲＥＸ１（Wells and Schofield, 1996）を用いた。このプラスミドは、Ｅ．coliバクテリオファージＴ７遺伝子１０（Wells and Shofield）の転写開始部位に続く、本格的なL.lactisの染色体プロモーターＰ１を有する。転写終結因子は、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼからもたらされた。プラスミドｐＴＲＥＸ１はまた、エリスロマイシン抵抗性の２つの遺伝子も有する。
【０１６６】
発現プラスミドｐＴＲＥＸ１をＳｐｈＩで３′ＣＡＴＧ突出を残して（クレノウＤＮＡポリメラーゼで除去した）切断した。除去したヌクレオチドは、他の遺伝子のＰＣＲ増幅のためのセンスリンカーに含めた。直線化されたベクターをＢａｍＨＩで切断して、ＣＩＰ（仔牛腸フォスファターゼ, Boehringer, Mannheim, Germany）で処理した。
【０１６７】
遺伝子ｈｂｃ、ｉｐｍ２ｈｂｃおよびｉｍ２ｈｂｃをＰＣＲで増幅した（材料および方法参照）。アンチセンスリンカー（ＨＢｃａ）は、すべての増幅において同じであり、終始コドンの後ろにＳｐｅＩおよびＢｃｌＩ部位を配置した。ｉｐｍ２ｈｂｃおよびｉｍ２ｈｂｃの増幅のためには、同じセンスオリゴヌクレオチド（Ｍ２ｓ）を用いることができる、なぜならＭ２タンパク質の細胞外部分におけるＧｌｙ→Ａｓｐの突然変異は、はるか下流に位置するからである。
【０１６８】
ｐＰＬｃＡ１からのｈｂｃの増幅はベクターがＳｃａＩで直線化された後にだけ可能である。さらなるクローニングには、最も厳しい条件で十分な量のフラグメントを産出する増幅反応を用いた。増幅されたフラグメントｈｂｃ、ｉｐｍ２ｈｂｃまたはｉｍ２ｈｂｃをＢｃｌＩで切断し、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼでリン酸化して、ＳｐｈＩおよびＢａｍＨＩで開環したｐＴＲＥＸ１に挿入した（Figure １４参照）。新しいプラスミドをそれぞれ、ｐＴ１ＨＢｃ、ｐＴ１ＰＭ２ＨＢｃ（ここで、Ｍ２タンパク質の細胞外部分は、ウイルスＡ／ＰＲ／８／３４からもたらされた）およびｐＴ１Ｍ２ＨＢｃ（ここで、Ｍ２タンパク質の細胞外部分の配列は、現在までに配列決定された、ほぼすべてのヒトＡ型インフルエンザウイルスに存在する型に相当する）とした。挿入されたフラグメントの塩基配列は、３７３Ａ型シークエンサー（Applied Biosystems, Forester city, CA., USA）で決定され、正しいことが示された。
【０１６９】
Lactococcus lactisを、改善されたワクチン輸送媒体として用いる観点から、２種のマウスサイトカイン、インターロイキン２（ｍＩＬ２）およびインターロイキン６（ｍＩＬ６）を、同じオペロンの第２シストロンとして、抗体として挿入した。そのような方法で、我々は、分泌されたマウスンターロイキン２または６と一緒に、抗体（例えばＩＭ２ＨＢｃｍ）を発現する細菌を得ることができた。増殖培地の中においてインターロイキンの分泌が得られるように、それらをlactococcusのｕｓｐ４５分泌シグナルペプチドにはめ込み融合させた（van Asseldonk et al., 1990）。プラスミドｐＴ１ＨＢｃ、ｐＴ１ＰＭ２ＨＢｃおよびｐＴ１Ｍ２ＨＢｃをＳｐｅＩで切断し、ＣＩＰで処理した。マウスンターロイキン２遺伝子を、プラスミドｐＬ２ＭＩＬ２（Steidler et al., 1995）から、５７２ｂｐのＸｂａＩ−ＳｐｅＩフラグメントとして単離した。このフラグメントを、ＳｐｅＩで開環したｐＴ１ＨＢｃ、ｐＴ１ＰＭ２ＨＢｃおよびｐＴ１Ｍ２ＨＢｃに挿入して、それぞれｐＴ１ＨＢｃＩＬ２、ｐＴ１ＰＭ２ＨＢｃＩＬ２およびｐＴ１Ｍ２ＨＢｃＩＬ２とした。同様の方法で、マウスンターロイキン６をｐＬ２ＭＩＬ６（Steidler et al., 1996）から６８７ｂｐのＸｂａＩ−ＳｐｅＩフラグメントとして単離して、ＳｐｅＩで開環したｐＴ１ＨＢｃ、ｐＴ１ＰＭ２ＨＢｃおよびｐＴ１Ｍ２ＨＢｃに挿入して、それぞれｐＴ１ＨＢｃＩＬ６、ｐＴ１ＰＭ２ＨＢｃＩＬ６およびｐＴ１Ｍ２ＨＢｃＩＬ６を作成した。
【０１７０】
１０．L.lactisにおけるＨＢｃおよびＭ２ＨＢｃの発現
抗原のみ（ｐＴ１ＨＢｃ、ｐＴ１ＰＭ２ＨＢｃおよびｐＴ１Ｍ２ＨＢｃ）またはマウスインターロイキン２（ｐＴ１ＨＢｃＩＬ２、ｐＴ１ＰＭ２ＨＢｃＩＬ２およびｐＴ１Ｍ２ＨＢｃＩＬ２）またはマウスインターロイキン６（ｐＴ１ＨＢｃＩＬ６、ｐＴ１ＰＭ２ＨＢｃＩＬ６およびｐＴ１Ｍ２ＨＢｃＩＬ６）と組み合わせた発現のためのプラスミドを含むLactococcus lactis菌株ＭＧ１３６３（Gasson, 1983）を材料および方法に記載したとおりに培養した。ＭＧ１３６３〔ｐＴＲＥＸ１〕をコントロールとして用いた。
【０１７１】
１０⁹個体相当の菌体をＳＤＳ １２．５％ ＰＡＧＥで解析した。Ｂ型肝炎コアおよびＭ２−ＨＢｃ融合タンパク質の発現を、材料および方法に記載したとおりに行ったウェスタン免疫ブロッティング法で解析した（Figure １５参照）。ＭＧ１３６３〔ｐＴ１Ｍ２ＨＢｃＩＬ６〕におけるＩＭ２ＨＢｃの発現は、他の構築物におけるほどは高くなかった。異なったコロニーをスクリーニングすることにより、単一クローンを同等の発現レベルで単離することができた。
【０１７２】
インターロイキンの産生および増殖培地中への分泌を、バイオアッセイで解析した。ｍＩＬ２の生物学的活性を、ヒトＩＬ２スタンダードと比較したＴ細胞系統ＣＴＬＬ２（Gillis et al., 1978）の増殖により検出した。ｍＩＬ６の生物学的活性を、Ｂ細胞ハイブリドーマ７ＴＤ１（Van Snick et al., 1986）の増殖により測定した。Table２は、異なった発現プラスミドにより生産されたインターロイキン２および６の、培養培地１mlあたりの濃度の一覧を示している。ｍＩＬ６を産生している培養物の上清が、ｍＩＬ２検出における増殖に至ることはなく、その逆もなかった。
【０１７３】
【表２】

【０１７４】
１１．Ｍ２ｅをコードする配列の、L.lactisにおける発現への適応
２つの融合タンパク質ＩＰＭ２ＨＢｃｍおよびＩＭ２ＨＢｃｍは、ウェスタンブロットではほとんど検出することができなかったので、我々は引き続き、Ｍ２タンパク質の細胞外部分の使用コドンを、L.lactisに適合させることにより、それら２つのタンパク質の生産量を増加させることにした（van de Guchte et al., 1992）。
【０１７５】
Ｍ２タンパク質の細胞外部分の５′末端に、我々は、Ｅ．coliにおける発現には最適であるが（６８％）、L.lactisにおける翻訳には不足する（８％、パーセンテージはvan de Guchet et al., 1992に記載）、２つの連続的なロイシンコドン（ＣＵＧ ＣＵＧ）を観察した。それゆえ、それらのコドンをＵＵＡに置換した。ｉｐｍ２ｈｂｃおよびｉｍ２ｈｂｃに対する遺伝子を、それぞれｐＰＬｃＩＰＭ２ＨＢｃｍとｐＰＬｃＩＭ２ＨＢｃｍから、２つの置換されたロイシンコドンを含む新たなセンスプライマーＭ２Ｌｓと一緒に、ＰＣＲで増幅した（Figure １３参照）。アンチセンスプライマーとして我々は、ＨＢｃａを再び用いた（Figure １３参照）。遺伝子のクローニングはFigure １４に示したのと同じである。そのようにして作成したベクターを、ｐＴ１ＰＭ２ＬＨＢｃおよびｐＴ１Ｍ２ＬＨＢｃとした。
【０１７６】
もとの融合タンパク質と比較した、突然変異されたＭ２ＨＢｃタンパク質の発現量を、ウェスタンブロットで解析した（Figure １６参照）。L.lactis適合ロイシンコドンと一緒のＭ２ＨＢｃ融合タンパク質の発現量は、実際に、より多くなった。使用コドンのL.lactis機械的翻訳への適合化は、生産されたタンパク質の量に積極的な影響を有すると結論した。上記と類似した方法で、マウスンターロイキン６遺伝子をｐＴ１ＰＭ２ＬＨＢｃおよびｐＴ１Ｍ２ＬＨＢｃに挿入して、それぞれｐＴ１ＰＭ２ＬＨＢｃＩＬ６およびｐＴ１Ｍ２ＬＨＢｃＩＬ６とした。
【０１７７】
１２．Lactococcus lactisにおけるＭ２Ｃ３ｄの構築
第２キャリアータンパク質Ｃ３ｄもまた、Ｍ２タンパク質の細胞外部分の提示について魅力のある分子である。Dempsey et al.（１９９６）は、３つの連続するＣ３ｄ分子に対する抗体の結合が、強い抗体反応を作り出すことにおいて、フロイント完全アジュバントにおいて投与された抗体よりも効果的であることを示した。
【０１７８】
適合化したロイシンコドンと一緒の、Ｍ２タンパク質の細胞外部分の共通配列を、最初のＣ３ｄ分子のアミノ末端への融合に用いた。３つの異なる融合タンパク質をコードする配列を構築した。最初の例では、Ｍ２ＨＢｃ融合タンパク質と同様に、Ｍ２Ｃ３ｄ３融合タンパク質は、L.lactisの細胞質で発現した（ｃＭ２Ｃ３ｄ３）。第２のケースでは、Ｍ２Ｃ３ｄ３タンパク質は、ｕｓｐ４５−シグナル配列への骨格融合をすることにより、増殖培地中に分泌され（ｓＭ２Ｃ３ｄ３）、最後の構築物は、分泌型からの誘導体であり、加えて、最後のＣ３ｄ分子の後ろに、細胞壁中で融合タンパク質を共有結合するためのアンカー配列を含んでいる。
【０１７９】
増幅したＣ３ｄ３フラグメントを、まずｐＵＣ１８の誘導体中にサブクローン化して、ｐＵＣＢ／Ｓと名づけた。ｐＵＣ１８を、ＨｉｎｄＩＩＩで直線化して、ＢｇｌＩＩリンカーを挿入した。得られたプラスミドをＳｍａＩで開環し、ＳｐｅＩリンカーを挿入して、プラスミドｐＵＣＢ／Ｓを得た（Figure １８参照）。Ｃ３ｄの３連のコピーをｐＳＧ５．Ｃ３ｄ３．ＹＬ（Dr.D.Fearonからの寄贈）から、オリゴヌクレオチドＣ３ｄｓおよびＣ３ｄａと一緒のＰＣＲで増幅した（Figure １７参照）。この増幅フラグメントをＢｇｌＩＩおよびＳｐｅＩで切断した。得られた２８３０ｂｐＢｇｌＩＩ−ＳｐｅＩフラグメントを、ＢｇｌＩＩおよびＳｐｅＩで開環したベクターｐＵＣＢ／Ｓにクローン化した（Figure １８参照）。遺伝子ｃｍ２およびｓｍ２をＰＣＲで増幅した。正しい読み取り枠中にＢａｍＨＩ部位という我々の目的のために行った、ｃｍ２の増幅のために、我々は、センスオリゴヌクレオチドＭ２Ｌｓ（Figure １３参照）およびアンチセンスリンカーＭ２Ｃａを用いた(Figure １７参照)。おなじアンチセンスリンカーを、ｓｍ２の増幅に用いた。ｓｍ２の増幅のためのセンスオリゴヌクレオチドであるＭ２ＬＳｓは、完成Ｍ２タンパク質の最初のコドンから始まる。
【０１８０】
Ｍ２Ｃ３ｄ３の細胞質型の合成のため、Ｍ２タンパク質の細胞外部分をコードする情報を、上記ｍ２ｈｂｃ遺伝子と同じｐＴＲＥＸ１に挿入した（Figure １８も参照）。増幅したｃｍ２フラグメントをＢａｍＨＩで切断して（７７ｂｐ）、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼでリン酸化し、ＳｐｅＩとＢａｍＨＩで開環したｐＴＲＥＸ１に挿入して、ｐＴ１ｃＭ２Ｌを作成した。Ｍ２Ｃ３ｄ３の分泌およびアンカー型を合成するため、Ｍ２タンパク質の細胞外部分をコードする情報をｐＴ１ＮＸに挿入した。ベクターｐＴ１ＮＸは、ｕｓｐ４５−シグナル配列（ｕｓｐ４５−ｓｓ）およびStaphylococcus aureusタンパク質Ａ（ｓｐａＸ）からもたらされたアンカー配列を有する。該プラスミドｐＴ１ＮＸをＮａｅＩにより、ｕｓｐ４５−ｓｓの末端とＢａｍＨＩの位置で正確に切断した。増幅フラグメントｓｍ２を、ＢａｍＨＩで切断し、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼでリン酸化した。この７３ｂｐのｓｍ２フラグメントをＮａｅＩおよびＢａｍＨＩで開環したｐＴ１ＮＸに挿入して、プラスミドｐＴ１ｓＭ２ＬＸを得た（Figure １８参照）。次にｐＵＣＣ３ｄから単離した、１本鎖Ｃ３ｄフラグメントをｃｍ２またはｓｍ２配列の末端のＢａｍＨＩ部位に挿入することができる。その後、１つ又は２つの付加的Ｃ３ｄコピーを挿入することができる。
【０１８１】
１３．Lactococcus lactisにおけるＭ２ＴＴＦＣの構築
第３キャリアータンパク質、破傷風毒素フラグメントＣ（ＴＴＦＣ）をも用いることができる。ＴＴＦＣは、L.lactis中でＰ１プロモーター（ｐＴ１ＴＴ）の制御下においてすでに発現している（Wells and Schofield, 1996）。抗体産生のため、ｍＩＬ２またはｍＩＬ６との組み合わせでＴＴＦＣを発現しているL.lactisは、免疫化実験で成功のうちに用いられている（Patent GB 9521568.7）。Ｉ（Ｐ）Ｍ２ＨＢｃｍを発現しているL.lactisでの現在の免疫化実験における抗体反応の解析のポジティブコントロールとして、Ｍ２タンパク質の細胞外部分とＴＴＦＣのアミノ末端の間に融合を作成した。
【０１８２】
ｔｔｆｃ遺伝子を、ｐＴ１ＴＴからＰＣＲで増幅した（材料および方法参照）。センスオリゴヌクレオチド（ＴＴＦＣｓ）により、スレオニンに相当するｔｔｆｃの第２コドンの前の、正しい読み取り枠の位置にＢａｍＨＩ部位が供給された。アンチセンスリンカー（ＴＴＦＣａ）により、ＳｐｅＩおよびＢａｍＨＩ部位が、終止コドンの後ろに供給された（Figure １９参照）。さらなるクローニングには、最も厳しい条件下で、十分な量のフラグメントを産出する増幅反応を用いた（材料および方法参照）。増幅したｔｔｆｃフラグメントを、ＢａｍＨＩで切断し、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼでリン酸化し、ＢｇｌＩで開環したｐＡＴＩＰＭ２ｍ１に挿入した（Figure ２０参照）。このプラスミド構築物を、ｐＡＴＩＰＭ２ＴＴとした。このプラスミドから、ｍ２ｔｔｆｃ遺伝子をＰＣＲで増幅した（Figure １９参照）。増幅したｍ２ｔｔｆｃをＢａｍＨＩで切断し、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼでリン酸化して、ＳｐｅＩおよびＢａｍＨＩで開環したｐＴＲＥＸ１に挿入した（Figure ２０参照）。該新規プラスミドをｐＴ１ＰＭ２ＬＴＴとした。この構築物において、Ｍ２タンパク質の細胞外部分は、L.lactis内で用いるのに適した２つのロイシンコドンと一緒に、ウイルスＡ／ＰＲ／８／３４からもたらされた。挿入されたフラグメントの配列は３７３Ａ型シークエンサー（Applied Biosystems, Foster City, CA., USA）で決定され、正しいことが示された。
【０１８３】
マウスンターロイキン遺伝子ｍＩＬ２およびｍＩＬ６を、ｍ２ｔｔｆｃと同じオペロンに挿入した。マウスンターロイキン２遺伝子を、５７２ｂｐのＸｂａＩ−ＳｐｅＩフラグメントとしてプラスミドｐＬ２ＭＩＬ２から単離した（Steidler et. al., 1995）。このフラグメントをＳｐｅＩで開環したｐＴ１ＰＭ２ＬＴＴに挿入してｐＴ１ＰＭ２ＬＴＴＩＬ２とした（Figure ２０参照）。同様にして、マウスンターロイキン６遺伝子をｐＬ２ＭＩＬ６（Steidler et. al., 1996）から６８７ｂｐのＸｂａＩ−ＳｐｅＩフラグメントとして単離して、ＳｐｅＩで開環したｐＴ１ＰＭ２ＬＴＴに挿入して、ｐＴ１ＰＭ２ＬＴＴＩＬ６とした（Figure ２０参照）。
【０１８４】
１４．L.lactisにおけるＴＴＦＣおよびＭ２ＴＴＦＣの発現
抗体のみの（ｐＴ１ＰＭ２ＬＴＴ）、マウスインターロイキン２と組み合わせた（ｐＴ１ＰＭ２ＬＴＴＩＬ２）またはマウスインターロイキン６と組み合わせた（ｐＴ１ＰＭ２ＬＴＴＩＬ６）、発現のためのプラスミドを含むLactococcus lactisの菌株ＭＧ１３６３（Gasson, 1983）を、上記材料および方法のとおりに培養した。ＭＧ１３６３〔ｐＴ１ＴＴ〕をコントロールとして用いた。同量の１０⁹個体の菌体を、ＳＤＳ １０％ ＰＡＧＥで解析した。ＩＰＭ２ＴＴＦＣ融合タンパク質の発現を、材料および方法に記載したとおりに行ったウェスタン免疫ブロッティングで解析した（Figure ２１参照）。インターロイキンの産生と増殖培地中への分泌を、バイオアッセイで解析した。L.lactis〔ｐＴ１ＰＭ２ＬＴＴＩＬ２〕は、約５００ng/mlのｍＩＬ２を、L.lactis〔ｐＴ１ＰＭ２ＬＴＴＩＬ６〕は約１μg/mlのｍＩＬ６を産出した。これらの結果は、２種のインターロイキンと組み合わせたＩ（Ｐ）Ｍ２ＨＢｃｍで得られた発現レベルに匹敵するものであった。
【０１８５】
１５．ｐＡＣｓｇｐＭ２Ｃ３の構築と対応する組み換えバキュロウイルスの産出
増幅したバキュロウイルスｇｐ６７分泌シグナルの配列を、ＳｐｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断し、続いてｐＵＣｓｇｐで得られたｐＵＣＣ３ｄのＳｐｅＩ−ＨｉｎｄＩＩＩベクターフラグメントにサブクローン化した。ｐＵＣｓｇｐをＨｉｎｄＩＩＩおよびＮａｅＩで処理した後、ｇｐ６７分泌シグナルを、ＨｉｎｄＩＩＩで処理したＭ２ｅフラグメント（共通配列）（ＰＣＲ増幅により得られた（プライマーＭ２ＳｓおよびＵＭ２ＥＣａ））と結合した。ｐＵＣｓｇｐＭ２としたこの構築物を、ＢａｍＨＩで処理し、続いて３つの連続するＣ３ｄフラグメントを有するＢｇｌＩＩ−ＢａｍＨＩｐＵＣＣ３ｄ３フラグメントと結合することによって再環化して、ｐＵＣｓｇｐＭ２Ｃ３ｄ３を得た。
【０１８６】
このフラグメントは、ＢａｍＨＩ（脱リン酸化された）−ＥｃｏＲＩ ｐＵＣＣ３ｄフラグメント、ＢｇｌＩＩ（脱リン酸化された）−ＥｃｏＲＩ ｐＵＣＣ３ｄフラグメントおよびＢｇｌＩＩ−ＢａｍＨＩｐＵＣＣ３ｄフラグメントを結合した後に、削除した。ｓｇｐＭ２Ｃ３ｄ３融合配列を含むｐＵＣｓｇｐＭ２Ｃ３ｄ３のＳｐｅＩフラグメントを、バキュロウイルス輸送ベクターｐＡＣＧＰ６７ＡのＳｐｅＩ−ＸｂａＩフラグメントとの置換により、ポリヘドリンプロモーターの後ろに挿入した。ｐＡＣｓｇｐＭ２Ｃ３ｄ３とした、得られた輸送ベクターを、組み換えＡｃＮＰＶ／ｓｇｐＭ２Ｃ３ｄ３バキュロウイルスを、King and Possee, 1992に記載された方法に従って、Ｓｆ９昆虫細胞とＢａｃｕｌｏＧｏｌｄバキュロウイルスＤＮＡ（Pharmingen, San Diego, CA, USA）のリン酸カルシウム共役感染により生産するために、用いた。対応する組み換えＡｃＮＰＶ／ｓｇｐＭ２Ｃ３ｄ３バキュロウイルスのゲノム中における、ポリヘドリンプロモーターの後ろのｓｇｐＭ２Ｃ３ｄ３融合配列の存在を、ＰＣＲ解析によって確認した。
【０１８７】
１６．分泌されたＭ２Ｃ３ｄ３のＳｆ９昆虫細胞による発現
対数増殖期のＳｆ９昆虫細胞を、多重感染（＞１０）で組み換えＡｃＮＰＶ／ｓｇｐＭ２Ｃ３ｄ３バキュロウイルスに感染させた。続いて、上清を回収する前に、細胞を血清なしのＴＣ１００培地に移し、さらに４８時間培養した。同量のアセトン（前もって−２０度に保った）を加えることにより、タンパク質を沈殿させて、続いてウェスタンブロッティングで解析した。
【０１８８】
好ましい構築物においては、３コピーかそれ以上のＣ３ｄタンパク質が、Ｍ２タンパク質の細胞外領域の後にある。
【０１８９】
１７．受動免疫
生存率をFigure ２８に示した。両方のコントロールグループでは１２個体のうち１個体のみが致死インフルエンザチャレンジで生き残り、一方３×１０pgのＩＭ２ＨＢｃｍで免疫した１２個体のマウスのうち１１個体、または受動免疫されたすべてのマウスが防御された。この実験は、ワクチン処理の間に生産された抗Ｍ２抗体が、観察された防御の原因であることを証明している。
【０１９０】
１８．ＤＮＡワクチン処理
Table３は、ｍ．ａ． Ｘ４７での致死チャレンジ（５ ＬＤ₅₀）に対する生存率について、３×１００μgのｐＣＩＭ２を注射した１２個体のマウスを、１００μgのｐＣＤＮＡ３を３回注射されたコントロールグループと比較した、ＤＮＡワクチン処理の結果を表している。異種の（免疫抗体＝共通Ｍ２、チャレンジ＝Ｍ２をもたらすＡ／ＰＲ／８／３４）インフルエンザチャレンジに対する部分的防御を証明することができる。
【０１９１】
【表３】

【０１９２】
１９．ＨＥＫＴ細胞における発現
溶解性フラクションおよびペレットにおける、完全なＭ２タンパク質の発現量は、検出するには少なすぎた。ＨＥＫＴ細胞にとって毒性であろう、Ｍ２タンパク質のイオンチャンネル活性のために、発現が低く保たれている可能性がある。しかしながら、２つの融合タンパク質、ＩＭ２ＨＢｃｍおよびＩＰ３Ｍ２ＨＢｃｍは良好に発現した。この実験は、ＤＮＡワクチン処理の研究で用いたベクターが、おそらくｐＣＩＭ２を除いて、該タンパク質を発現させることができるということを証明している。
【０１９３】
２０．血清の解析
反応は弱いものであるが、Ｍ２タンパク質の細胞外部分に対する特異的な抗体反応を証明できる。Figure ３１のパネルＢにおいては、ｐＣＩＭ２をコントロールベクターと比較している。このＥＬＩＳＡ法において、昆虫細胞で発現したＭ２タンパク質は、コーティングに用いられた（材料および方法参照）。特に３回目の免疫化の後に、特異的な抗−Ｍ２応答を証明できる。ｐＣＩＭ２でのさらに強い抗−Ｍ２反応は、Ｍ２タンパク質細胞質領域に位置する付加的なエピトープによるものである。
【０１９４】
考察
今日の文献は、高度に保存されたＡ型インフルエンザウイルスのＭ２タンパク質の細胞外部分の、免疫系に対する提示に関するいくつかのシステムを記述している。Ｍ２フラグメントは、Ｍ２−ドメインの遊泳Ｎ末端を維持するためにキャリアータンパク質のアミノ末端と融合されており、この方法で、Ｍ２タンパク質の野生型構造を真似ている。最初の融合タンパク質である、ヒトβ２ミクログロブリンと関連付けられたＭ２（ＩＰＭ２ｈＢ２Ｍｍ）を、モノクローナル抗体を産生するために用いた。第２の融合タンパク質である、Ｂ型肝炎コアタンパク質と関連付けられたＭ２（ＩＰＭ２ＨＢｃｍ）を、ワクチン化の研究に用いた。免疫化の過程においても産生されるキャリアータンパク質に対する抗体の修正をしなければならなかったので、両タンパク質はＭ２タンパク質の細胞外部分に対する特異的抗体反応の検出にも用いることができるであろう。
【０１９５】
ＩＰＭ２ＨＢｃｍでのワクチン化の研究は、５〜５０μgの投与量の範囲でマウスを防御したが、免疫化されたマウスは、それでも高い死亡率を示したので、用いた範囲での投与量は、どうやら得られた防御に対してそれほど決定的なパラメーターではないことを示している。これは、防御の程度について明確に分かれた結果を得るために、非常に多量のウイルス（５ ＬＤ₅₀）をチャレンジに用いたためであろう。本来のインフルエンザ感染においては、感染するウイルス粒子の数がもっと低いので、死亡率も徐々に減少するであろうと考えられる。
【０１９６】
免疫化したマウスの血清の解析は、特にウイルスチャレンジの後において、Ｍ２タンパク質の細胞外部分に対する本質的な抗体反応を示した。この強い反応は、鼻腔内に対する腹腔内という投与方法の違いによるものであろう。あるいは、それは、侵入ウイルスに対する、より完全な防御メカニズムの原理で説明されるのかもしれない。
【０１９７】
Slepushkin et al.（1995）は、同種又は異種のウイルスチャレンジに対する、本来の完全なＭ２タンパク質を含む膜抽出物に基づいた、ワクチン化の方法を記述した。しかし、彼らは非常に強力なアジュバントであり、医薬用途には不適切である、フロイント不完全アジュバントを使用している。
【０１９８】
対照的に、ここに記述した発明のＭ２細胞外ドメイン融合は、純粋型（少なくとも純度９５％）で得ることができ、安全なアジュバントと組み合わせて投与することができる。チャレンジが相当に厳しかったという事実にもかかわらず、高い程度の防御が得られた。Ｍ２細胞外ドメインがほとんど同一の配列である（Ａ型インフルエンザのＭ２タンパク質の細胞外部分のアミノ酸配列の一覧を示すｔａｂｌｅ１参照）という観点から、獲得された防御は、これまでに知られているすべてのヒトＡ型インフルエンザ系に対して類似のものであろうことが期待されうる。
【０１９９】
ＣＴＬエピトープのような、インフルエンザ特異的Ｔヘルパーエピトープを融合タンパクの中に包含する（例えば、内部に、またはＢ型肝炎コアタンパク質のＣ末端に結合させる）ことによって、ワクチンはさらに改善されるであろう。さらに、例えば鼻腔内に対する腹腔内のように、他の免疫化ルートも可能である。
【０２００】
Ｍ２ＨＢｃｍ融合タンパク質の発現のために、グラム陰性組織、Ｅ．coliに加えて、L.lactisも用いた。L.lactisにおいては、発現した融合タンパクを精製する必要はない。菌体は、鼻腔内又は経口的に直接投与することができる。
【０２０１】
第３の見込まれるキャリアータンパク質も、第３補体タンパク質フラグメントｄ（Ｃ３ｄ）と名づけられて記述されている（Dempsey et al., 1996）。好ましい構築物において、Ｍ２タンパク質の細胞外部分の後ろにＣ３dタンパク質の３コピーがある。このＭ２Ｃ３ｄ３融合タンパク質は、適切な制御配列への遺伝子融合によって、細胞壁に固定した細胞外型としても、増殖培地中に分泌させるようにも、発現させることができる。
【０２０２】
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Claims (15)

1. インフルエンザＡウイルスの保存されたインフルエンザＭ２膜タンパク質の２３アミノ酸の細胞外部分と提示性担体との融合産生物を含む、インフルエンザ抗原であって、該提示性担体が、Ｂ型肝炎コアタンパク質、１個以上のＣ３ｄドメイン、破傷風毒素フラグメントＣ及び酵母Ｔｙ粒子から選択される（ポリ）ペプチドである、インフルエンザ抗原。
2. 抗原が、細胞膜内又は細胞膜上で融合産生物を発現するLactococci細胞からなる、請求項１に記載のインフルエンザ抗原。
3. インフルエンザＡウイルスの保存されたインフルエンザＭ２膜タンパク質の２３アミノ酸の細胞外部分に対するコーディング配列及びそれらに操作可能に連結する提示性（ポリ）ペプチドに対するコーディング配列を含む遺伝子構築物を調製し、適切な受容細胞中にこの遺伝子構築物を持ち込み、受容細胞中でこの遺伝子構築物の発現をもたらすことによって得ることができ、該提示性（ポリ）ペプチドが、Ｂ型肝炎コアタンパク質、１個以上のＣ３ｄドメイン、破傷風毒素フラグメントＣ及び酵母Ｔｙ粒子から選択される、請求項１又は２に記載のインフルエンザ抗原。
4. ヒト及び動物のインフルエンザに対するワクチンの調製に用いる、請求項１〜３のいずれか１項記載のインフルエンザ抗原。
5. ヒト及び動物のＡ型インフルエンザに対するワクチンの調製に用いる、請求項１〜４のいずれか１項記載のインフルエンザ抗原。
6. 少なくとも請求項１〜５のいずれか１項記載の抗原を含む、インフルエンザに対するワクチン。
7. 抗原が単離された形態である、請求項６記載のワクチン。
8. 抗原が膜フラグメントの一部分である、請求項６記載のワクチン。
9. 抗原が、抗原を発現している受容細胞の膜内に固着している、請求項６記載のワクチン。
10. 抗原が、細胞外皮内又は細胞外皮上で融合産生物を発現するLactococci細胞からなる、請求項６記載のワクチン。
11. ヘマグルチニン、ノイラミニダーゼ、核タンパク質及び／又はもとのままのＭ２から選択される、１個以上の他のインフルエンザ抗原を更に含む、請求項６〜１０のいずれか１項記載のワクチン。
12. インフルエンザに対するワクチンの調製のための、請求項１〜５のいずれか１項記載の抗原の使用。
13. 下記工程：
    ａ）インフルエンザＡウイルスの保存されたインフルエンザＭ２膜タンパク質の２３アミノ酸の細胞外部分に対するコーディング配列及びそれらに操作可能に連結する提示性（ポリ）ペプチドに対するコーディング配列を含む遺伝子構築物を調製し、
    ｂ）遺伝子構築物を適切な受容細胞中に導き、及び
    ｃ）受容細胞中の遺伝子構築物の発現をもたらす、
    工程を含み、該提示性（ポリ）ペプチドが、Ｂ型肝炎コアタンパク質、１個以上のＣ３ｄドメイン、破傷風毒素フラグメントＣ及び酵母Ｔｙ粒子から選択される、請求項１〜５のいずれか１項記載の抗原の調製方法。
14. 請求項１〜５のいずれか１項記載の抗原を発現する受容細胞
15. 細胞が、Lactococcus細胞である、請求項１４に記載の受容細胞。

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