JP5101521B2 - メチシリン耐性黄色ブドウ球菌をオキサシリンに対し感作する組成物および方法 - Google Patents

Description

本発明の技術分野は、抗菌性処置のための組成物および方法であり、特に選択されたカテキンの相乗的組合せを含むメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）（ＭＲＳＡ）の処置である。

従来、エピガロカテキンガレート（ＥＧＣＧ）およびその他の茶カテキンは抗細菌剤として使用されていて、そのような活性の例は当技術分野で周知である（例えば、Ｊｐｎ．Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１９９１年、第４６巻、８３９〜８４５ページ参照）。しかし、顕著な抗細菌活性を示すためには、一般に用量が多く、それ故、顕著な抗細菌活性は、通常、生理条件下にてまたは生体内にて達成されていない。同じような高い濃度が、ＭＲＳＡが他者へ感染することを防止するために選ばれたカテキンを用いて、米国特許第５，３５８，７１３号にてシマムラにより報告された。

米国特許第５，８０７，５６４号において、シマムラにより、ある抗菌性薬剤の最小阻止濃度を減少させるためにある抗菌性薬剤があるカテキンと組み合わされ、選択されたカテキンはアミカシン、クロラムフェニコールおよび各種のベータ−ラクタム抗生物質について感作物質であることが報告された。同様に、バラポリフェノールが各種のベータ−ラクタム抗生物質の最小阻止濃度を減少させることが報告された（例えば、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００４年、第４８巻、第１号、６７〜７３ページ）。しかしながら、少なくともいくつかのカテキンに関して、その要求有効濃度は依然相対的に高かった。ＭＲＳＡ感染を治療するための他の試みにおいて、ＥＰ ０ ７６１ ２２６にて述べられているように、選択されたカテキンが特殊なテアフラビンと組み合わされて、ある抗菌性組成物が製造された。残念ながら、あるカテキンに関して同じ問題がそのままであった。選択されたカテキンのさらなる公知の組合せにおいて、Ｍｏｒｒｅｅらは、米国特許第６，６５２，８９０号にて、ＥＧＣおよびＥＣの混合物が、窒素酸化物を発現する、腫瘍細胞のＮＡＤＨ酸化酵素を阻害するのに有効であり、その結果癌を治療することを開示した。しかし、このような組合せの、細菌に対する効果はこの文献に開示されなかった。

カテキンを抗菌性薬剤（ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ ｄｒｕｇ）として用いるさらなる知られている試みにおいて、Ｓｔａｐｌｅｔｏｎらにより国際公開公報２００５／０３４９７６号に述べられているように、各種のカテキンが化学修飾された。このような化学修飾されたカテキンは、対応する非修飾体と比べて顕著な抗細菌効果を示したが、一方で、合成と精製がコストを高め、また人体への投与が安全で有効であることがまだ示されていない。

このように、ＭＲＳＡを除去するおよび／または種々の抗生物質に対してＭＲＳＡを感作する多くの方法および組成物がこの分野において知られているにも拘わらず、これらの全てにまたは殆ど全てに一つまたはそれ以上の不都合がある。それ故、いまだ、ＭＲＳＡ感染の治療および／または化学予防のための改善された医薬品の必要性が存在する。

発明の要旨
本発明は、ある種の非ガロイルカテキンが選択された抗生物質（ここにおいて、この選択された抗生物質は既にガロイルカテキンと組み合わされている。）に対するＭＲＳＡの感作を増加するという知見に向けられている。

本発明の主題の１態様において、黄色ブドウ球菌のメチシリン耐性株におけるある抗菌性薬剤のＭＩＣ（最小阻止濃度）の低減のための方法は、前記抗菌性薬剤のＭＩＣを第一レベルに低減するために有効な濃度のガロイルカテキンに前記黄色ブドウ球菌を曝露する段階を含む。さらなる段階として、非ガロイルカテキン投与は当該抗菌薬のＭＩＣを第一レベルから第二レベルまでに相乗的にさらに低減することが認識される。および、なお別の段階において、前記抗菌性薬剤のＭＩＣを二次レベルまで低減するために有効な濃度の前記ガロイルカテキンの存在下にて、前記黄色ブドウ球菌が前記非ガロイルカテキンに曝露される。

最も好ましくは、前記抗菌性薬剤は、ベータ−ラクタム抗生物質（例えば、オキサリシン、メチシリン、ペニシリン）、テトラサイクリン型抗生物質（例えば、テトラサイクリン、クアトリマイシン、エピテトラサイクリンなど）および／またはクロラムフェニコール型の抗菌性薬剤（例えば、クロラムフェニコール、デキストラマイシン、１−デオキシクロラムフェニコールなど）として特徴付け得る。前記ガロイルカテキンはＥＣＧまたはＥＧＣＧでありおよび／または非ガロイルカテキンはＥＣまたはＥＧＣである。特定の組合せに依存して、第一レベルは、前記黄色ブドウ球菌を前記ガロイルカテキンに曝露しない場合の、前記抗菌性薬剤のＭＩＣの５０％に等しいまたは５０％より低いことが、第二レベルは、前記黄色ブドウ球菌を前記ガロイルカテキンに曝露しない場合の、前記抗菌性薬剤のＭＩＣの５％に等しいまたは５％より低いことが、意図される。

他の意図される態様において、第一レベルは、前記黄色ブドウ球菌を前記ガロイルカテキンに曝露しない場合の、前記抗菌性薬剤のＭＩＣの５％に等しくまたは５％より低く、第二レベルは、前記黄色ブドウ球菌を前記ガロイルカテキンに曝露しない場合の、前記抗菌性薬剤のＭＩＣの０．５％に等しいまたは０．５％より低い。それ故、少なくともいくつかの例において、前記黄色ブドウ球菌は、１０μｇ／ｍｌ未満の濃度のガロイルカテキンにおよび５０μｇ／ｍｌに等しいまたはそれ未満の濃度の非ガロイルカテキンに曝露される。

別の視点から見ると、本発明者らは、１つの段階において、黄色ブドウ球菌が、ガロイルカテキンおよび抗菌性薬剤の組合せ（ここにおいて、前記ガロイルカテキンおよび前記抗菌性薬剤は増殖を抑制するには有効ではない濃度にて存在する。）に曝露される、黄色ブドウ球菌のメチシリン耐性株（例えば、ＢＢ５６８，ＥＭＲＳＡ−１６ またはＥＭＲＳＡ−１５）の生育を抑制する方法、を意図する。別の段階において、前記黄色ブドウ球菌は、前記黄色ブドウ球菌の生育を抑制するために有効な濃度における組合せの存在下にて、非ガロイルカテキンに曝露される。

上述の方法と同様に、このような方法において、好ましくは、抗菌性薬剤は６０μｇ／ｍｌの濃度のベータ−ラクタム抗生物質であり、前記ガロイルカテキンは５μｇ／ｍｌの濃度のＥＣＧであり、および／または、前記非ガロイルカテキン（例えばＥＣまたはＥＧＣ）は、少なくとも２５μｇ／ｍｌの濃度、より典型的に少なくとも５０μｇ／ｍｌの濃度で存在する。

したがって、本発明の主題の別の態様において、抗菌性薬剤（例えばベータ−ラクタム抗生物質）組成物は、ガロイルカテキンおよび非ガロイルカテキンを含み、前記非ガロイルカテキンは、前記ガロイルカテキンに関して前記抗菌性薬剤のＭＩＣを相乗的に低減するための濃度にて存在する。意図される組成物はさらに、前記ガロイルカテキンおよび前記非ガロイルカテキンが前記ガロイルカテキンに関して前記抗菌性薬剤のＭＩＣを低減するために有効な相乗的組合せにて存在する組成物に関連する情報を含む。

最も好ましくは、前記ガロイルカテキンはＥＣＧまたはＥＧＣＧであり、前記非ガロイルカテキンはＥＣまたはＥＧＣである。典型的に、前記非ガロイルカテキンおよび前記ガロイルカテキンは少なくとも３：１の重量比にて存在し、さらに典型的に少なくとも６：１の重量比にて存在する。本組成物は、数多くの方法で製剤化し得ることを認識すべきであるが、局所製剤（例えば、スプレー、クリーム、軟膏など）が特に好ましい。

本発明の様々な目的、特徴、態様および利点は、以下の本発明の好ましい実施形態の詳細な説明から明らかとなる。

図面の簡単な説明
図１は、ＥＭＲＳＡ−１６に対するオキサシリンのＭＩＣに関するＥＣおよびＥＣＧの組合せの相乗的効果を描いたグラフである。
図２Ａは、オキサシリンに対して黄色ブドウ球菌を感作するＥＣＧの能力へのＥＣ，ＥＧＣおよびＥＧＣＧの効果を要約した表である。
図２Ｂは、オキサシリンに対して黄色ブドウ球菌を感作するＥＧＣＧの能力に対するＥＣおよびＥＧＣの効果を要約した表である。

詳細な説明
本発明者らは、意外にも、ガロイルカテキンを用いる種々の抗菌性薬剤に対するＭＲＳＡのカテキンが媒介する感作を、ガロイルカテキンと非ガロイルカテキンとを、最も好ましくは対応する非ガロイルカテキンとを組み合わせることにより、さらに亢進できることを見出した。意外なことに、抗菌性薬剤の感作を亢進する前記非ガロイルカテキンは、前記非ガロイルカテキンを単独で用いた場合、前記抗菌性薬剤のＭＩＣに関して殆どまたは全く効果を有しないようである。

ここにおいて用いられるとき、「ＭＲＳＡ」、「黄色ブドウ球菌のメチシリン耐性株」および「メチシリン耐性黄色ブドウ球菌」の用語は、互換可能に用いられ、多数の抗菌性薬剤、より典型的に全てのベータ−ラクタム抗菌性薬剤に対し耐性の黄色ブドウ球菌を意味する。さらなる耐性がセファロスポリンおよび／またはカルバペネウムに関しても存在し得る。病院に関連するＭＲＳＡ分離株は、しばしばエリスロマイシン、クリンダマイシンおよびテトラサイクリン等の一般に使用されている他の抗菌性薬剤剤に対して多重耐性であり、一方、地域社会に関連するＭＲＳＡ分離株は、しばしばベータ−ラクタム抗菌薬およびエリスロマイシンにのみに耐性である。耐性はＮＣＬＳ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｆｏｒ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ）の次の手順により確認することができ、典型的に、オキサシリンＭＩＣ試験における４μｇ／ｍｌに等しいまたはそれ以上のＭＩＣ、オキサシリンディスク拡散試験またはセフォキシチンディスク拡散試験におけるそれぞれ１０ｍｍまたは１９ｍｍ以下の拡散ディスクにより示される。またここで用いられるとき、「最小阻止濃度」および「ＭＩＣ」は、互換可能に用いられ、下記所定の培地におけるある抗細菌剤の最小濃度であり、この最小濃度より低い濃度では細菌の生育は増殖が阻害されない。

またここで用いられるとき、「ガロイルカテキン」という用語は、化合物のＣ環（命名に関し、後記化学式１を参照）が置換または非置換の安息香酸基、最も典型的には没食子酸エステル基によって修飾されている化合物を指す。最も典型的に、前記置換または非置換安息香酸エステル基は前記Ｃ環に３位において共有結合している。このような置換安息香酸における意図される置換基は、１または２以上の水酸基、これら水酸基の個々のエステル基、これら水酸基の様々なアルキルエーテル基、アミノ基、ニトロ基、硫酸基および／またはリン酸基を含み、これらの各々はさらに置換され得る。

これと異なり、ここで用いられる「非ガロイルカテキン」という用語は、化合物におけるＣ環が置換基により修飾され得るまたは修飾され得ない化合物を意味するが、このＣ環の３位においての置換基は安息香酸エステル基ではない。かくして、数多くの他の適する置換基の中で、非ガロイルカテキンのＣ環の３位は水素またはヒドロキシル基である。

本発明の主題のある好ましい態様において、本発明者らは、黄色ブドウ球菌のＥＭＲＳＡ−１６株を、この株のオキサシリンに対する感受性を増加させるために、ガロイルカテキンであるエピカテキンガレート（ＥＣＧ）の濃度を０ｍｃｇ／ｍｌから１２．５ｍｃｇ／ｍｌの間で変化させて培養した。次いで、ＭＩＣを記録し、これらの実験を、０ｍｃｇ／ｍｌから５０ｍｃｇ／ｍｌの間で変化する濃度の非ガロイルカテキンであるエピカテキンの存在下にて繰り返した。驚いたことに、非ガロイルカテキンの添加は、著しくおよび相乗的に、ＭＩＣを低減させた。似た結果が、エピカテキンを非ガロイルであるエピガロカテキンに置き換えた際に得られた。これとは異なり、ガロイルであるエピガロカテキンガレートが用いられた際には、有意なおよび相乗的な効果は実質的に得られなかった。

あらゆる特定の理論または仮説に縛られることを望まないが、本発明者らは、ナノモル濃度のカテキンは、カテキンの性質により、リン脂質に入ってその柵を分け、生体膜の構造と機能を調整することができるのであろうと考えている。ガロイルカテキンは、その非ガロイル類縁体よりも、ホスファチジルコリンおよびホスファチジルエタノールアミンの２重層に、より深く浸透すると考えられる。かくして、ＥＣｇおよびＥＧＣｇは、膜内において、より深い位置を占め、ＥＣおよびＥＧＣは、より浅い（リン脂質―水の境界により近い）位置に局在している、と予想される。これらの膜への浸透の相違は、これらの分子の、ブドウ球菌のベータ−ラクタム耐性を修飾する能力に対応している。興味深いことに、脂質２重層に組み込まれるＥＣｇおよびＥＧＣｇの量はＥＣの存在下で顕著に増加し、ブドウ球菌ベータ−ラクタム耐性のレベルを低減するカテキンガレートの能力が非ガロイルカテキンにより強化され得る可能性を向上させる。

本発明の主題の他の意図する態様において、多数のガロイルカテキンが、エピカテキンガレート（ＥＣＧ）以外にも、ここでの使用に適していると思われることを認識すべきである。他のガロイルカテキンの中で、適切な化合物は、カテキンガレート（ＣＧ）、ガロカテキンガレート（ＧＣＧ）、エピガロカテキンガレート（ＥＧＣＧ）、テアフラビンモノガレートＡ、テアフラビンモノガレートＢおよびテアフラビンジガレートを含む。ここで意図されるカテキン（ガロイルおよび非ガロイル）は、光学異性体、キラル中心および／または立体異性体ならびにそのような構造の全て及びそれらの混合物が、ここにおいて意図されていることに留意すべきである。同様に、非ガロイルカテキンは、カテキン（Ｃ）、ガロカテキン（ＧＣ）およびエピガロカテキン（ＥＧＣ）を含む多くの代替の化合物を含み得る。

したがって、ここで意図される好ましいガロイルおよび非ガロイルカテキンは、式１に従う構造を有する。

［ここで、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ３’、Ｒ４’およびＲ５’は、独立して水素原子、水酸基またはＭであり、ＭはＯＣ（Ｏ）Ｒ、ＯＣ（Ｓ）Ｒ、ＯＣ（ＮＨ）Ｒ、ＯＲまたはＲであり、Ｒは置換されることもあるアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アルカリル基またはアリル基（および、最も好ましくは、モノ、ジ、またはトリヒドロキシル化安息香酸基）であり、この化学構造におけるＡ、ＢおよびＣはそれぞれ環を示し、Ｒ３″が没食子酸エステル基であるとき、カテキンはガロイルカテキンであり、Ｒ３″がＭであるとき（ただし、ＯＣ（Ｏ）ＲにおけるＲは没食子酸エステルラジカルではない。）、カテキンは非ガロイルカテキンである。］

ガロイルカテキンの適した濃度について、一般に、全ての濃度が、その濃度が少なくともある程度の感作を達成できる（すなわち、ガロイルカテキン非存在の同等条件下での生育と比較して抗菌性薬剤薬のＭＩＣを低減する）限りにおいて、適切とされることを意図する。さらに、異なるガロイルカテキンが、匹敵する条件下にて、ＭＩＣにおける異なる低減を示すことを認識すべきである。またさらに、ガロイルカテキンの適した濃度はまた少なくとも非ガロイルカテキンの予め定められた濃度により部分的に決定され得る。したがって、ガロイルカテキン（ＥＣＧを含む）の様々な濃度が意図され、一般に０ｍｃｇ／ｍｌから５０ｍｇ／ｍｌ（およびさらにそれ以上）であるが、さらに典型的に１ｍｃｇ／ｍｌから１ｍｇ／ｍｌであり、最も典型的に５ｍｃｇ／ｍｌから１００ｍｃｇ／ｍｌである。

同様に、意図される非ガロイルカテキンの濃度はさまざまであり、非ガロイルカテキンの特定の化学構造、ガロイルカテキンの濃度や種類、細菌株および／または抗菌性薬剤薬を含む、様々な要素に依存する。しかし、非ガロイルカテキンの濃度は、０ｍｃｇ／ｍｌから５０ｍｇ／ｍｌの間（およびさらにそれ以上）、さらに典型的に１ｍｃｇ／ｍｌから１ｍｇ／ｍｌの間、最も典型的に５ｍｃｇ／ｍｌから１００ｍｃｇ／ｍｌの間である。さらに、非ガロイルカテキンは、ガロイルカテキンに対して、好ましくは少なくとも等モルで、さらに好ましくは１．１倍から２．０倍のモル過剰で、もっとさらに好ましくは２．０倍から４．０倍のモル過剰で、最も好ましくは２．０倍から１０．０倍のモル過剰で存在する（しかし必ずしもそうである必要はない。）。

さらに、非ガロイルカテキンはガロイルカテキンの対応するカテキンであることが好ましい。例えば、第一レベルへの感作がＥＣＧにより行われた場合、非ガロイルカテキンはＥＣであることが好ましい。別の例においては、第一レベルへの感作がＥＧＣＧにより行われた場合、非ガロイルカテキンはＥＧＣであることが好ましい。しかし、１種より多いカテキン（ガロイルおよび／または非ガロイル）が意図される組合せとして用いられ得ることが理解されるべきである。例えば、第一レベルへの感作が少なくとも１種類のガロイルカテキンを含むカテキン混合物により行われ得、および、第二の低いレベルへの感作が、次いで、単一の非ガロイルカテキンにより行われ得る。一方および望まれる場合には、第一レベルへの感作が単一のカテキンにより行われ得、および、第二の低いレベルへの感作が、次いで、少なくとも１種類の非ガロイルカテキンを含む混合物により行われ得る。

カテキンの混合物が用いられる場合、この混合物は植物（例えば、茶木、ぶどう、ブルーベリー、その他）から単離されたものであることが特に好ましい。このようなカテキンの単離物は、ガロイル（カテキン）と非ガロイル（カテキン）の比率が予め定められた特定の調合物に標準化でき得る。例えば、ガロイルカテキン部分が優位である緑茶抽出物における個々のカテキンの通常の百分率は、ＥＧＣＧが１０〜１５％、ＥＣＧが２〜３％、ＥＣが２％およびＥＧＣが２〜３％であり得る（例えば、スガヌマら、キャンサー・リサーチ、第５９巻、４４〜４７ページ、１９９９年）。他方、抽出物は非ガロイルカテキンを主に有するように調製されまたは修飾され得る（例えば、ＥＧＣおよびＥＣ１０〜２０％、ＥＣＧ２〜３％およびＥＧＣＧ５％）。加えて、カフェイン、テオブロミン、テオフィリンおよび例えば没食子酸などのフェノール酸もまた緑茶抽出物の構成要素であり得、通常ポリフェノールよりも少量で存在する。他の意図される抽出物の中で、特に適したポリフェノール抽出物は、ポリフェノンＥおよびポリフェノンＢを含み、両方とも日本の三井農林（〒１０５−８４２７、日本国東京都港区西新橋１−２−９）より商業的に利用可能であり、また特殊な調製のためのさらなる基礎材料として利用し得る。

抗菌性薬剤に関して、非ガロイルカテキンが、既に多くの抗菌性薬剤（全てまたは殆ど全てのベータ−ラクタム抗生物質、テトラサイクリンおよび／またはクロラムフェニコール型薬剤を含む。）に対して感作されたＭＲＳＡの感受性をさらに増加（すなわちＭＩＣを低減する）させ得ることを一般に意図する。かくして、他の抗菌薬の中で、意図される抗生物質は、様々なペニシリン（例えば、ベンザチンペニシリン、ベンジルペニシリン（ペニシリンＧ）、フェノキシメチルペニシリン（ペニシリンＶ）、ディクロキサシリン、フルクロキサシリン、アモキサシリン、アンピシリンなど）、様々なセファロスポリン（例えばセファレキシン、セファロシン、セファゾリン、セフロキシム、セファマンドール、セフトリアキソン、セフォタキシムなど）、様々なカルバペネム（例えばイミペネム、メロペネム、エルタペネムなど）、モノバクタム（例えばアズトレオナム）、様々なテトラサイクリン（例えばテトラサイクリン、クアトリマイシン、エピテトラサイクリンなど）および様々なクロラムフェニコール型の抗菌薬（例えばクロラムフェニコール、デクストラマイシン、１−デオキシクロラムフェニコールなど）を含む。

抗菌性薬剤の種類とガロイルカテキンの濃度に依存して、非ガロイルカテキンを用いた感作の向上は顕著に変動し得ることを認識すべきである。しかしながら、感作の向上（すなわちＭＩＣの低減）は、少なくとも２倍（例えば、２０ｍｃｇ／ｍｌから１０ｍｃｇ／ｍｌ）、さらに典型的には少なくとも３倍、もっと典型的には４〜６倍、そして最も好ましくは少なくとも５〜１０倍（例えば、５０ｍｃｇ／ｍｌから１０ｍｃｇ／ｍｌ）であることが一般に認識される。

ガロイルカテキンおよび／または非ガロイルカテキンに対してＭＲＳＡを曝露することが好ましいが、しかし、抗菌性薬剤の存在下で行われることが必ずしも必要ではないことが、さらに認識される。最も典型的に（しかし再び必ずしも必要ではないが）、ガロイルカテキンまたは非ガロイルカテキンは、ＭＲＳＡが存在する環境へ、一緒に投与される。例えば、および特に投与が生体外または局所投与（例えば、殺菌プレー、体外培養、局所用軟膏など）である場合、カテキンの組合せは抗生物質溶液に混ぜられ得る。他の例において、および特にこの組合せが哺乳類へ投与される場合、カテキンの組合せは、また経口でおよび抗生物質調合と別々に（この投与は経口投与または非経口投与であってもなくともよい。）投与し得る。

したがって、ガロイルカテキンおよび／またはガロイルカテキンは数多くの剤形により投与され得、特に好ましい剤形は、経口用固形製剤（例えば、単離されたカテキン、または茶抽出物からのポリフェノール粉末）または液体製剤（例えば、液体カテキン製剤または茶抽出物）を含む。さらに好ましい剤形として、局所製剤（例えば、クリーム、軟膏、ゲル、ローションなど）を含む。当技術分野でよく知られた商業的に利用可能な調合物が多く存在し、これらの全てがここでの使用に適していると考えられる。このような剤形中のガロイルカテキンおよび／または非ガロイルカテキンの濃度は、通常、単一投与単位が１ｍｇ／ｍｌ未満の局所濃度となるような濃度である。

これらにおよびさらなる考慮に基き、発明者らは、それ故、黄色ブドウ球菌が、抗菌性薬剤のＭＩＣを第一レベルまで低減するために有効な濃度におけるガロイルカテキンに曝露される、ＭＲＳＡにおける抗菌性薬剤のＭＩＣを低減する方法を意図する。他の段階において非ガロイルカテキンの投与が抗菌性薬剤のＭＩＣを相乗的に第一レベルから第二レベルにさらに低減することが、またさらに別の段階において抗菌性薬剤のＭＩＣを第二レベルに低減するために有効な濃度のガロイルカテキンの存在下に前記黄色ブドウ球菌が前記非ガロイルカテキンに曝露されることが、認識（例えば、記載または表示された情報により）される。例えば、典型的な投与において、適切な第一のレベルは、黄色ブドウ球菌を該ガロイルカテキンに曝露しない場合の抗菌性薬剤のＭＩＣを５０％に等しくまたは５０％より低く、および適切な第二レベルは、黄色ブドウ球菌をガロイルカテキンに曝露しない場合の抗菌性薬剤のＭＩＣを５％に等しいまたは５％より低い。このような例において、本発明者らは、ＭＲＳＡが１０μｇ／ｍｌ以下の濃度のガロイルカテキンおよび５０μｇ／ｍｌ以下の濃度の非ガロイルカテキンに曝露されたことを見出した。他の例において、本発明者らは、第一レベルは前記ＭＩＣの５％に等しくまたは５％より低く、および第二レベルは前記ＭＩＣの０．５％に等しいまたは０．５％より低い、ことを見出した。

したがって、適した方法として、ＭＲＳＡがガロイルカテキンおよび抗菌性薬剤の組合せに曝露される、ＭＲＳＡの生育を抑制する方法（ここにおいて、前記ガロイルカテキンおよび前記抗菌性薬剤は生育を抑制するのに有効でない濃度（例えば、ＥＣＧが５μｇ／ｍｌであり、ベータ−ラクタム抗生物質が６０μｇ／ｍｌである。）が含まれる。別の段階において、ＭＲＳＡは、次に、ＭＲＳＡの生育を抑制するために有効な濃度の組合せの存在下において、非ガロイルカテキン（例えば、少なくとも２５ｍｃｇ／ｍｌの、さらに典型的に少なくとも５０ｍｃｇ／ｍｌのＥＣまたはＥＧＣ）に曝露される。このような方法は、ＭＲＳＡ（例えば、ＢＢ５６８、ＥＭＲＳＡ−１６およびＥＭＲＳＡ−１５）を耐性または中間的性質（特に抗菌性薬剤に関して）から感受性に変換するために特に好ましい。

またさらなる意図する態様において、医薬組成物が意図され、これらの医薬組成物は、ガロイルカテキン（例えばＥＣＧまたはＥＧＣＧ）、非ガロイルカテキン（ＥＣまたはＥＧＣ）および場合により抗菌薬（例えばベータ−ラクタム抗生物質）を含み、前記非ガロイルカテキンはガロイルカテキンに関して抗菌薬の最小阻止濃度を相乗的に低減する濃度にて存在する。このような組成物は、通常さらに、ガロイルカテキンおよび非ガロイルカテキンがガロイルカテキンに関して抗菌薬のＭＩＣを低減する相乗的に組合せにて存在していることを示す情報を伴っている。他の適した比率の内で、非ガロイルカテキンおよびガロイルカテキンは少なくとも１：１の重量比で、さらに典型的に少なくとも３：１の重量比で、さらにもっと典型的に６：１の重量比で存在する。すでに上に議論したとおり、前記組成物は、経口剤形および局所剤形を含む数多くの方法により製剤化できることを認識すべきである。しかしながら、この剤形は局所用剤形であることが特に好ましい。

実験

ＥＣにより媒介されるＥＣＧの細胞膜への結合促進
黄色ブドウ球菌の膜は、独特であり、フォスファチジルグリセロール（６３−７４％）、リジルフォスファチジルグリセロール（１７−２２％）およびカルディオリピン（５−１５％）から構成されている。本発明者らは、カジヤらにより説明されたＨＰＬＣアッセイ（カジヤ、Ｋ、Ｓ．クマザワ、Ｔ．ナカヤマ、２００１年、茶カテキンと脂質２重膜の相互作用における立体効果、Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、第６５巻、２６３８〜２６４３頁）を用いて、非ガロイルカテキンがＥＣＧの黄色ブドウ球菌への結合を促進する能力を決定した。ＥＣ、ＥＧＣ、ＥＣＧおよびＥＧＣＧは日本国東京都にある東京フードテクノ株式会社により提供された。黄色ブドウ球菌ＢＢ５６８はＰＢＰ２ａを構成的に生成し（チューリッヒ大学のＢ．Ｂｅｒｇｅｒ−Ｂａｃｈｉ（Ｂａｃｈｉの「ａ」は「ａ−ウムラウト」）により供与された）、ＥＭＲＳＡ−１５およびＥＭＲＳＡ−１６はロンドンにあるロイヤルフリー病院由来の臨床上の単離体であった。中期対数増殖期のＥＭＲＳＡ−１６へのＥＣＧの結合は２５ｍｃｇ／ｍｌ濃度のＥＣにより促進された。３５℃での２０分間の温置後、１３％のＥＣプールが結合し、２２％のＥＣＧが細胞に伴われていた。ＥＣの存在下にて、ＥＣＧの結合は４１％に上昇し、ＥＣの結合もまた、ＥＣＧ（３５．５％）の存在によって促進された。ＥＣはそれ故、ＰＣおよびＰＥリポソームへの結合と同様に、ＥＣＧの黄色ブドウ球菌細胞への結合を促進するようである。

黄色ブドウ球菌を用いる感作試験
この協同的な結合は促進された生物活性を誘発したか否かを調べるため、オキサシリンに対する黄色ブドウ球菌の感受性の程度を増加させるＥＣおよびＥＧＣの能力が決定された。チェッカーボードＭＩＣアッセイが、２％塩化ナトリウム溶液が追加されたＭｕｅｌｌｅｒ−Ｈｉｎｔｏｎブロス（オキソイド、ベージングストーク、英国）の２００μｌ中に約１０^４ＣＦＵを有する９６−ウェルマイクロタイタートレイ中にて行われた。ＭＩＣ値は３５℃の２４時間培養後に得られた。黄色ブドウ球菌ＡＴＣＣ２９２１３が標準の感受性株として用いられた。３重組合せについての分別阻害濃度（ＦＩＣ）指数は、次の通りに計算された。

ここで、Ｃ^ｃｏｍｂ _ＢおよびＣ^ｃｏｍｂ _Ｃは試験されたカテキン濃度であり、Ｃ^ｃｏｍｂ _ＯＸＡは生育を阻害する組合せにおけるオキサシリンの最小濃度であり、ＭＩＣ_ＯＸＡ、ＭＩＣ_ＢおよびＭＩＣ_Ｃはそれぞれ単独で用いられた場合の化合物のＭＩＣである。２つの化合物の組合せに関する項（Ｃ^ｃｏｍｂ _Ｃ／ＭＩＣ_Ｃ）は除外された。０．５以下であるＦＩＣ指数は相乗性を示す。

我々は、ＥＭＲＳＡ−１６、ＥＭＲＳＡ−１５およびＢＢ５６８をオキサシリンに対して感作するＥＣＧの能力に対するＥＣ、ＥＧＣおよびＥＧＣＧの影響を決定し、これらの実験の結果を図２Ａに記載する。ＢＢ５６８、ＥＭＲＳＡ−１６およびＥＭＲＳＡ−１５に対するオキサシリンのＭＩＣはそれぞれ２５６ｍｇ／ｍｌ、５１２ｍｇ／ｍｌおよび１６ｍｇ／ｍｌであった。カテキン化合物は、６４〜５１２ｍｇ／ｍｌの範囲のＭＩＣを有し、固有の抗ブドウ球菌活性を殆どまたは全く有していなかった。１２．５ｍｇ／ｍｌのＥＣＧ濃度が、黄色ブドウ球菌ＢＢ５６８およびＥＭＲＳＡ−１６についてのオキサシリンのＭＩＣをオキサシリンの限界点以下に低減した。同様の効果が、ＥＭＲＳＡ−１５について他の低濃度である３．１２ｍｇ／ｍｌにて得られた。意外なことに、非ガロイルカテキンであるＥＣおよびＥＧＣはこれら単離体に対するオキサシリンのＭＩＣを低減することができなかった。しかし、これらの化合物は、顕著にＥＣＧがオキサシリン耐性を減じる性質を促進した。ＥＣＧの３．１２ｍｇ／ｍｌの濃度が、ＭＩＣを、ＢＢ５６８について６４ｍｇ／ｍｌにおよびＥＭＲＳＡ−１６について１２８ｍｇ／ｍｌに低減した。ＥＣの６．２５ｍｇ／ｍｌとの組合せにおいて、これら単離体について８ｍｇ／ｍｌへオキサシリン感受性が増加した。２５ｍｇ／ｍｌへＥＣ濃度を増加することにより、３．１２ｍｇ／ｍｌのＥＣＧの存在下、２ｍｇ／ｍｌの値が得られた。ＥＧＣがＥＣＧと組合されて使用されたとき、同様の低減が観測された。ＦＩＣ指数は、３つ全ての黄色ブドウ球菌について、オキサシリン、ＥＣＧとＥＣまたはＥＧＣの間で強い相乗作用があることを示した。高濃度において、ＥＣＧ（１２．５ｍｇ／ｍｌ以上）とＥＣおよびＥＧＣ（５０ｍｇ／ｍｌ以上）両方との組合せは、オキサシリン不在下におけるＥＭＲＳＡ−１６の生育を阻害した。

ＥＣ、ＥＧＣおよびＥＣＧにより媒介されるオキサシリンに対する感作の亢進は、図１（ＥＭＲＳＡ−１６についてのオキサシリンのＭＩＣに対するＥＣＧおよびＥＣの効果を示している。）に示されているように、明らかに濃度依存的であった。ガロイルカテキンＥＧＣＧは、ＥＣＧ存在下のオキサシリンのＭＩＣを低減することについての効果が大きく劣っていた。例えば、３．１２ｍｇ／ｍｌのＥＣＧと組み合わせた場合、２５ｍｇ／ｍｌのＥＧＣＧはＭＩＣを２倍しか低減しなかった。より高濃度の１２．５ｍｇ／ｍｌのＥＣＧにおいて、ＥＧＣＧは、ＥＣＧのＢＢ５６８およびＥＭＲＳＡ−１６株についてのＭＩＣを低減する能力を弱めた。ＥＧＣＧは、ＢＢ５６８、ＥＭＲＳＡ−１６およびＥＭＲＳＡ−１５をオキサシリンに対して感作させることができたが、その効果はＥＣＧについてのそれと比較して顕著に小さかった。ＥＣおよびＥＧＣの両方が感受性を促進したが（図２Ｂに示す通り）、その影響は、図２Ａの通り、［ＥＣ／ＥＧＣ−ＥＣＧ−オキサシリン］の組合せと比較して、対応して乏しかった。

本発明者らは、それ故に、ＥＣおよびＥＧＣのような非ガロイルカテキンの能力はブドウ球菌の細胞質膜を標的にすることを通じてガロイルカテキンであるＥＣＧおよびＥＧＣＧによってＭＲＳＡ株のオキサシリン感受性を亢進する、と考える。このような仮説は、膜結合と感受性の間に因果関係があるつながりがあるのであれば、ＥＣまたはＥＧＣの存在下におけるＥＣＧの膜結合の増加によって確認されるであろう。このような仮説のさらなる裏づけとして、カテキンは一般に細胞に浸透できない事実があり、この事実は、カテキンが細胞の生物物理的特性を変更することによって（例えば、脂質２重層に関与するたんぱく質の機能を低減し、膜を介した物質輸送に影響を与えることによって）黄色ブドウ球菌におけるベータ−ラクタム耐性を調節しているであろうことを、より裏づけている。

上述のデータは、抗生物質の存在下におけるガロイルカテキンおよび非ガロイルカテキン間の相互作用の、これらの抗微生物作用に関する重要なおよび相乗的な性質を明らかに示している。このような知見には、ガレート基はエピカテキンガレートの活性に必須であることが従前の研究において示唆されていたことから（Ｓｔａｐｌｅｔｏｎ，Ｐ．Ｄ．，Ｓ．Ｓｈａｈ，Ｊ．Ｃ．Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｙ．Ｈａｒａ，Ｊ．Ｍ．Ｔ．Ｈａｍｉｌｔｏｎ−Ｍｉｌｌｅｒ，ａｎｄＰ．Ｗ．Ｔａｙｌｏｒ．カテキンと没食子酸塩により黄色ブドウ球菌のベータ−ラクタム耐性の調整、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊ．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｌ．Ａｇｅｎｔｓ、第２３巻、４６２〜４６７ページ、２００４年）、特に驚かされる。さらに、非ガロイルカテキンは、エステル基を有していないため、エステラーゼ阻害化合物として作用することはありそうもないことである。加えて、エステラーゼに対して安定なＥＣＧ誘導体が、オキサシリンと一緒に黄色ブドウ球菌に対して用いられた際、同様の活性を有し、このことは、体外ではエステラーゼ活性は決定的に重要な要素ではないことを示唆している（Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｊ．Ｃ．，Ｃ．Ｈｅａｄｌｅｙ，Ｐ．Ｄ．Ｓｔａｐｌｅｔｏｎ，ａｎｄ Ｐ．Ｗ．Ｔａｙｌｏｒ．黄色ブドウ球菌のベータ−ラクタム耐性の調節のための加水分解的に安定している（−）−エピカテキンガレート類似体の合成と抗菌活性、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．第１５巻、２６３３〜２６３５ページ、２００５年）。しかしながら、不活性化の他の形態、特にカテキン部分の修飾を、ＥＣおよびＥＧＣが可能性ある阻害剤として作用するとき、除外することができないことが知られている。

このように、オキサシリンに対するＭＲＳＡを感作する方法および組成物の特定の実施態様および適用が開示されている。しかしながら、ここでの本発明思想から離れることなく、既に述べられている内容の他に多くの修飾が当業者にとって可能であることは明らかである。本発明の主題は、それ故、添付された特許請求の範囲の精神を除いて、制限されるべきでない。加えて、本件明細書および特許請求の範囲の両方の解釈において、全ての用語は、その文脈に沿って可能な、最も広い方法によって解釈されるべきである。特に、「含む」および「含有する」は、非限定的な要素、構成部分および段階を指し、参照された要素、構成部分または段階が存在し得ること、または利用しうること、または明示して述べられていない他の要素、構成部分および段階と一緒にし得ることを示していると、解釈されるべきである。さらにその上、この明細書に参照によって取り込まれた参照における用語の定義または使用が、本明細書において提供された用語の定義と矛盾または反対するものである場合、本明細書において提供された用語の定義を適用し、参照における用語の定義は適用されない。

図１は、ＥＭＲＳＡ−１６に対するオキサシリンのＭＩＣに関するＥＣおよびＥＣＧの組合せの相乗的効果を描いたグラフである。 図２Ａは、オキサシリンに対して黄色ブドウ球菌を感作するＥＣＧの能力へのＥＣ，ＥＧＣおよびＥＧＣＧの効果を要約した表である。 図２Ｂは、オキサシリンに対して黄色ブドウ球菌を感作するＥＧＣＧの能力に対するＥＣおよびＥＧＣの効果を要約した表である。

Claims (13)

1. 局所用医薬の製造におけるガロイルカテキン、非ガロイルカテキン、および抗菌性薬剤の使用であって、
   前記局所用医薬は、前記ガロイルカテキンを、前記抗菌性薬剤の黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）に対する最小阻止濃度を低減させるために有効な濃度として０ｍｃｇ／ｍｌよりも多く５０ｍｇ／ｍｌまでの範囲の濃度で含んでおり、
   前記局所用医薬は、前記非ガロイルカテキンを、前記抗菌性薬剤の最小阻止濃度をさらに相乗的に低減する濃度として０ｍｃｇ／ｍｌよりも多く５０ｍｇ／ｍｌまでの範囲の濃度で含んでおり、
   前記ガロイルカテキンは、ＥＣＧであり、
   前記非ガロイルカテキンは、ＥＣまたはＥＧＣであり、
   前記非ガロイルカテキンおよび前記ガロイルカテキンは少なくとも３：１の重量比にて存在し、
   前記抗菌性薬剤がベータ−ラクタム抗生物質、テトラサイクリンおよびクロラムフェニコールからなる群より選ばれる
   ことを特徴とする、使用。
2. 前記黄色ブドウ球菌が、ＢＢ５６８、ＥＭＲＳＡ−１６およびＥＭＲＳＡ−１５からなる群より選ばれる、請求項１に記載の使用。
3. 前記抗菌性薬剤の最小阻止濃度の前記低減が、前記最小阻止濃度の５０％に等しいまたは５０％より低い、請求項１に記載の使用。
4. 前記抗菌性薬剤の最小阻止濃度の前記相乗的な低減が、前記最小阻止濃度の５％に等しいまたは５％より低い、請求項１に記載の使用。
5. 前記ガロイルカテキンの濃度が１０μｇ／ｍｌ未満の濃度であり、および、前記非ガロイルカテキンの濃度が５０μｇ／ｍｌに等しいまたは５０μｇ／ｍｌ未満の濃度である、請求項１に記載の使用。
6. 局所用医薬の製造におけるガロイルカテキン、非ガロイルカテキン、および抗菌性薬剤の使用であって、
   前記局所用医薬が、前記黄色ブドウ球菌のメチシリン耐性株の生育を抑制するために構成されたものであり、
   前記ガロイルカテキンおよび前記抗菌性薬剤は、単独では前記生育を抑制するのに有効でない濃度にて存在しており、前記ガロイルカテキンの濃度は０ｍｃｇ／ｍｌよりも多く５０ｍｇ／ｍｌまでの範囲であり、
   前記ガロイルカテキンは、ＥＣＧであり、
   前記非ガロイルカテキンは、ＥＣまたはＥＧＣであり、
   前記非ガロイルカテキンおよび前記ガロイルカテキンは少なくとも３：１の重量比にて存在し、
   前記抗菌性薬剤が、ベータ−ラクタム抗生物質、テトラサイクリンおよびクロラムフェニコールからなる群より選ばれる
   ことを特徴とする、使用。
7. 前記抗菌性薬剤が、６０μｇ／ｍｌ濃度である請求項６に記載の使用。
8. 前記非ガロイルカテキンが少なくとも２５μｇ／ｍｌの濃度である、請求項６に記載の使用。
9. 前記非ガロイルカテキンが少なくとも５０μｇ／ｍｌの濃度である、請求項６に記載の使用。
10. 前記黄色ブドウ球菌がＢＢ５６８、ＥＭＲＳＡ−１６およびＥＭＲＳＡ−１５からなる群より選ばれる、請求項６に記載の方法。
11. ガロイルカテキン、非ガロイルカテキンおよび抗菌薬を含み、
    前記非ガロイルカテキンは、前記ガロイルカテキンに関する抗菌性薬剤の最小阻止濃度を相乗的に低減する濃度として０ｍｃｇ／ｍｌよりも多く５０ｍｇ／ｍｌまでの範囲の濃度にて存在し、
    前記ガロイルカテキンは、ＥＣＧであり、
    前記非ガロイルカテキンは、ＥＣまたはＥＧＣであり、
    前記非ガロイルカテキンおよび前記ガロイルカテキンは少なくとも３：１の重量比にて存在し、
    前記抗菌薬が、ベータ−ラクタム抗生物質、テトラサイクリンおよびクロラムフェニコールからなる群より選ばれる
    ことを特徴とする、局所用抗菌性医薬組成物。
12. 前記黄色ブドウ球菌が、ＢＢ５６８、ＥＭＲＳＡ−１６およびＥＭＲＳＡ−１５からなる群より選ばれる、請求項１１に記載の局所用抗菌性医薬組成物。
13. 前記非ガロイルカテキンおよび前記ガロイルカテキンが少なくとも６：１の重量比にて存在する、請求項１１に記載の局所用抗菌性医薬組成物。

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