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JP5166025B2 - エピトープアナログ - Google Patents

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JP5166025B2
JP5166025B2 JP2007516810A JP2007516810A JP5166025B2 JP 5166025 B2 JP5166025 B2 JP 5166025B2 JP 2007516810 A JP2007516810 A JP 2007516810A JP 2007516810 A JP2007516810 A JP 2007516810A JP 5166025 B2 JP5166025 B2 JP 5166025B2
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シー． ダイアモンド，デイビッド
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マンカインド コーポレイション
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Description

発明の分野
一つの実施形態では、本明細書中に開示の発明は、クラスＩＭＨＣ制限Ｔ細胞エピトープに対応するペプチドのアナログ及びその生成方法に関する。これらのアナログは、ＭＨＣ分子と直接相互作用する残基におけるアミノ酸置換を含むことができ、改善されているか、修飾されているか、又は有用な免疫特性を付与することができる。特に、腫瘍関連抗原ＳＳＸ−２、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＰＲＡＭＥ、ＰＳＭＡ、チロシナーゼ、及びメラン−Ａ由来のエピトープアナログが同定されている。さらに、種々の置換が非標準残基であるノルロイシン及び／又はノルバリンを含むアナログ類を開示する。
［関連出願の相互参照］
本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）項の下、「ＳＳＸ−２ペプチドアナログ」と題される２００４年６月１７日に出願された米国特許仮出願番号６０／５８１，００１号及び「ＮＹ−ＥＳＯペプチドアナログ(NY-ESO PEPTIDE ANALOGS)」と題される２００４年６月１７日に出願された米国特許仮出願番号６０／５８０，９６２号に対する優先権を主張する。（それぞれ、その全体が本明細書中で参考として援用される）
関連技術の説明
主要組織適合複合体及びＴ細胞標的認識
Ｔ−リンパ球（Ｔ細胞）は、特定抗原シグナルに応答して機能する抗原特異的免疫細胞である。Ｂリンパ球及びそれらが産生する抗体も、また抗原特異的物体である。しかしながら、Ｂリンパ球と異なり、Ｔ細胞は、遊離型又は可溶型の抗原に応答しない。Ｔ細胞が抗原に応答するためには、抗原が主要組織適合複合体（ＭＨＣ）として知られる提示複合体に結合することが必要である。
ＭＨＣタンパク質は、Ｔ細胞が、本来持つ細胞又は「自己」細胞を外来細胞と区別する手段を提供する。ＭＨＣ分子は、その後Ｔ細胞によってモニタリングされる潜在的なペプチドエピトープを提示する免疫受容体のカテゴリーに入る。クラスＩＭＨＣ及びクラスＩＩＭＨＣの２つのＭＨＣクラスが存在する。ＣＤ４＋Ｔ細胞は、クラスＩＩＭＨＣタンパク質と相互作用し、主にヘルパー表現型を有する一方で、ＣＤ８＋Ｔ細胞は、クラスＩＭＨＣタンパク質と相互作用し、主に細胞溶解性表現型を有するが、それぞれ、調節機能、特に抑制機能も示し得る。両ＭＨＣは、その構造の大部分が細胞外表面に存在する膜貫通タンパク質である。さらに、両ＭＨＣクラスは、その外側部分にペプチド結合溝を有する。天然又は外来のタンパク質の小フラグメントがこの溝で結合し、細胞外環境に提示される。
抗原提示細胞（ＡＰＣ）と呼ばれる細胞は、ＭＨＣを使用して抗原をＴ細胞に示す。抗原がＭＨＣ上に提示されると、Ｔ細胞は抗原を認識することができる。この要件は、ＭＨＣ制限と呼ばれる。抗原が認識可能なＭＨＣによって示されない場合、Ｔ細胞は抗原シグナルを認識せず、これに対して作用しない。認識可能なＭＨＣに結合したペプチドに特異的なＴ細胞は、これらのＭＨＣ−ペプチド複合体に結合し、免疫応答の次の段階に進む。
［発明の概要］
ＳＳＸ−２41-49アナログの実施の形態
実施の形態には、ＭＨＣクラスＩ制限Ｔ細胞エピトープのアナログＳＳＸ−２41-49ＫＡＳＥＫＩＦＹＶ（配列番号１）、ｐＡＰＣによってプロセッシングされてエピトープアナログを提示することができるこれらのアナログを含むポリペプチド、及びアナログを発現する核酸が含まれる。アナログは、野生型エピトープと比較して類似又は改善された免疫学的特性を有し得る。
１つの実施形態は、配列ＫＡＳＥＫＩＦＹＶ（配列番号１）を用いたエピトープに対する免疫化によって生成されたＴ細胞株からのサイトカイン産生を誘発するのに十分な量で配列ＫＡＳＥＫＩＦＹＶ（配列番号１）の１つ又は複数のアミノ酸置換を含む配列を有する単離ＳＳＸ−２ペプチドに関する。１つの態様では、十分な量は１０μＭ以下である。さらなる態様では、３μＭ以下である。さらなる態様では、１μＭ以下である。さらなる態様では、０．３μＭ以下である。１つの態様では、標準アミノ酸で置換される。さらなる態様では、十分な量は０．３μＭ以下である。１つの態様では、Ｔｙｒ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ａｌａ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｔｒｐ、Ｐｈｅ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、又はＳｅｒなどの標準アミノ酸で置換される。
さらなる態様では、置換には、非標準アミノ酸が含まれる。１つの態様では、非標準アミノ酸は、例えば、Ｎｌｅ、Ｎｖａ、Ａｂｕ、又は標準アミノ酸のＤ型立体異性体である。さらなる態様では、置換には、修飾末端アミノ酸が含まれる。１つの態様では、修飾末端アミノ酸は、アミド化Ｃ末端アミノ酸である。さらなる態様では、少なくとも１つの置換は、アミノ酸の付加であってよく、付加はＣ末端付加である。さらなる態様では、ペプチドには、さらに、任意の部位において、好ましくは、任意のＭＨＣ相互作用に関与しないことが明らかなＰ３部位、Ｐ５部位、又はＰ７部位におけるアミノ酸の保存的置換が含まれる。
さらなる実施の形態は、Ｐ１〜Ｐ９の９個のアミノ酸の単離ペプチドに関し、この単離ペプチドは各部位に１つのアミノ酸を含む。例えば、Ｐ１は、Ｋ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ｐｈｇ、Ｐｈｅ（４−Ｆ）、Ｐｈｅ（４−ＮＯ2）、ＭｅＴｙｒ、β−（３−ベンゾチエニル）−Ａｌａ、又はＤ−Ｌｙｓである；Ｐ２は、Ａ、Ｌ、Ｖ、Ｉ、Ｍ、Ｄ−ＡＩａ、Ｎａｌ−２、Ａｂｕ、Ａｉｂ、Ｎｌｅ、又はＮｖａである；Ｐ３は、Ｓである；Ｐ４は、Ｅ、Ｑ、Ｎｌｅ、又はＮｖａである；Ｐ５は、Ｋである；Ｐ６は、Ｉ、Ｌ、Ｖ、Ｎｌｅ、又はＮｖａである；Ｐ７は、Ｆである；Ｐ８は、Ｙ、Ｆ、Ｐｈｅ（４−Ｆ）である；Ｐ９のＰΩ（Ｐ−オメガ）は、Ｖ、Ｉ、Ａ、Ｎｖａ、ＭｅＶａｌ、又はＡｂｕである。場合によっては、配列は、ＫＡＳＥＫＩＦＹＶではない。
さらなる実施の形態は、Ｐ１〜Ｐ９の９個のアミノ酸の単離ペプチドに関し、この単離ペプチドは各部位に１つのアミノ酸を含む。例えば、Ｐ１は、Ｋ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ｐｈｇ、Ｐｈｅ（４−Ｆ）、Ｐｈｅ（４−ＮＯ2）、ＭｅＴｙｒ、β−（３−ベンゾチエニル）−Ａｌａ、又はＤ−Ｌｙｓである；Ｐ２は、Ｖ、Ｌ、Ｍ、Ａｂｕ、Ｎｌｅ、又はＮｖａである；Ｐ３は、Ｓである；Ｐ４は、Ｅ、Ｑ、Ｎｌｅ、又はＮｖａである；Ｐ５は、Ｋである；Ｐ６は、Ｉ、Ｌ、Ｖ、Ｎｌｅ、又はＮｖａである；Ｐ７は、Ｆである；Ｐ８は、Ｙ、Ｆ、Ｐｈｅ（４−Ｆ）である；Ｐ９でのＰΩは、Ｖ、Ｉ、Ａ、Ｎｖａ、ＭｅＶａｌ、Ａｂｕ、又はＶ−ＮＨ2である。
さらなる実施の形態は、Ｐ１〜Ｐ９の９個のアミノ酸の単離ペプチドに関し、この単離ペプチドは各部位に１つのアミノ酸を含む。例えば、Ｐ１は、Ｋ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ｐｈｇ、Ｐｈｅ（４−Ｆ）、Ｐｈｅ（４−ＮＯ2）、ＭｅＴｙｒ、β−（３−ベンゾチエニル）−Ａｌａ、又はＤ−Ｌｙｓである；Ｐ２は、Ａ、Ｌ、Ｖ、Ｍ、Ａｂｕ、Ｎｌｅ、又はＮｖａである；Ｐ３は、Ｓである；Ｐ４は、Ｅ、Ｑ、Ｎｌｅ、又はＮｖａである；Ｐ５は、Ｋである；Ｐ６は、Ｉ、Ｌ、Ｖ、Ｎｌｅ、又はＮｖａである；Ｐ７は、Ｆである；Ｐ８は、Ｙ
、Ｆ、Ｐｈｅ（４−Ｆ）である；Ｐ９は、Ｖである；Ｐ１０でのＰΩは、Ｉ又はＬである。
さらなる実施の形態は、Ｐ１〜Ｐ９の９個のアミノ酸の単離ペプチドに関し、この単離ペプチドは各部位に１つのアミノ酸を含む。例えば、Ｐ１は、Ｋ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ｐｈｇ、Ｐｈｅ（４−Ｆ）、Ｐｈｅ（４−ＮＯ2）、ＭｅＴｙｒ、β−（３−ベンゾチエニル）−Ａｌａ、又はＤ−Ｌｙｓである；Ｐ２は、Ｖである；Ｐ３は、Ｓである；Ｐ４は、Ｅ、Ｑ、Ｎｌｅ、又はＮｖａである；Ｐ５は、Ｋである；Ｐ６は、Ｉ、Ｌ、Ｖ、Ｎｌｅ、又はＮｖａである；Ｐ７は、Ｆである；Ｐ８は、Ｙ、Ｆ、Ｐｈｅ（４−Ｆ）である；Ｐ９は、Ｖである；Ｐ１０でのＰΩは、Ｉ、Ｌ、Ｖ、又はＮｌｅである。
さらなる実施の形態は、Ｐ１〜Ｐ９の９個のアミノ酸の単離ペプチドに関し、この単離ペプチドは各部位に１つのアミノ酸を含む。例えば、Ｐ１は、Ｋ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ｐｈｇ、Ｐｈｅ（４−Ｆ）、Ｐｈｅ（４−ＮＯ2）、ＭｅＴｙｒ、β−（３−ベンゾチエニル）−Ａｌａ、又はＤ−Ｌｙｓである；Ｐ２は、Ｌである；Ｐ３は、Ｓである；Ｐ４は、Ｅ、Ｑ、Ｎｌｅ、又はＮｖａである；Ｐ５は、Ｋである；Ｐ６は、Ｉ、Ｌ、Ｖ、Ｎｌｅ、又はＮｖａである；Ｐ７は、Ｆである；Ｐ８は、Ｙ、Ｆ、Ｐｈｅ（４−Ｆ）である；Ｐ９は、Ｖである；Ｐ１０でのＰΩは、Ｉ、Ｌ、Ｖ、Ｎｌｅ、又はＮｖａである。
さらなる実施の形態は、配列Ｋ｛Ｌ、Ｖ、Ｍ、Ｉ、Ｄ−Ａｌａ、Ｄ−Ｖａｌ、Ｎａｌ−２、Ａｉｂ、Ａｂｕ、Ｎｌｅ、又はＮｖａ｝ＳＥＫＩＦＹＶ；又は｛Ｆ、Ｐｈｇ、Ｙ、Ｐｈｅ（４−Ｆ）、Ｐｈｅ（４−ＮＯ2）、Ｏ−メチル−Ｔｙｒ、又はβ−（３−ベンゾチエニル−Ａｌａ｝ＡＳＥＫＩＦＹＶ；又は｛Ｙ、Ｆ、又はＷ｝｛Ｖ、Ｍ、又はＩ｝ＳＥＫＩＦＹＶ；又は｛Ｆ又はＷ｝ＬＳＥＫＩＦＹＶ；又はＫ｛Ａ、Ｖ、又はＬ｝ＳＥＫＩＦＹＩ；又はＫ｛Ｌ又はＶ｝ＳＥＫＩＦＹＶ−ＮＨ2；又はＦＶＳＥＫＩＦＹ｛Ｉ、Ａ、Ｎｖａ、Ａｂｕ、又はＭｅＶａｌ｝；又はＦＶＳ｛Ｑ、Ｎｌｅ、Ｎｖａ｝ＫＩＦＹＶ；又はＦＶＳＥＫ｛Ｌ、Ｖ、Ｎｌｅ、又はＮｖａ｝ＦＹＶ；又はＦＶＳＥＫＩＦ｛Ｆ、Ｐｈｅ（４−Ｆ）｝Ｖ；又はＫＡＳＥＫＩＦＹＶ｛Ｉ、Ｌ、｝；又はＫＶＳＥＫＩＦＹＶ｛Ｉ、Ｌ、Ｖ、又はＮｌｅ｝；又はＫＬＳＥＫＩＦＹＶ｛Ｌ、Ｖ、Ｎｌｅ、又はＮｖａ｝を有する単離ペプチドに関する。
さらなる実施の形態は、配列Ｋ｛Ｌ、Ｖ、Ｍ、Ａｂｕ、Ｎｌｅ、又はＮｖａ｝ＳＥＫＩＦＹＶ；又は｛Ｆ又はＰｈｇ｝Ａ ＳＥＫＥＦＹＶ；又はＹＶＳＥＫＩＦＹＶ；又はＦ｛Ｌ、Ｖ、又はＩ｝ＳＥＫＩＦＹＶ；又はＷ｛Ｌ又はＩ｝ＳＥＫＩＦＹＶ；又はＫ｛Ｖ又はＬ｝ＳＥＫＩＦＹＩ．；又はＦＶＳＥＫＩＦＹ｛Ｉ又はＮｖａ｝を有する単離ペプチドに関する。
さらなる実施の形態は、配列Ｋ｛Ｖ又はＬ｝ＳＥＫＩＦＹＶ；又は｛Ｆ又はＹ｝ＡＳＥＫＩＦＹＶ；又はＦＶＳＥＫＩＦＹＩを有する単離ペプチドに関する。
さらなる実施の形態は、ペプチドが上記実施の形態及び本明細書中のいずれかのペプチド配列を有する、クラスＩＭＨＣ／ペプチド複合体に関する。１つの態様では、複合体は、クラスＩＭＨＣ／ＳＳＸ−２41-49複合体を認識するＴＣＲと交差反応性を示す。さらなる態様では、複合体は、ＨＬＡ−Ａ２／ＳＳＸ−２41-49複合体である。
さらなる実施の形態は、免疫原性組成物であって、上記実施の形態いずれかの及び本明細書中のペプチド配列を含む、免疫原性組成物に関する。１つの態様では、ペプチドは、例えば、配列Ｋ｛Ｌ、Ｖ、Ｍ、Ａｂｕ、Ｎｌｅ、又はＮｖａ｝ＳＥＫＩＦＹＶ；又は｛Ｆ又はＰｈｇ｝ＡＳＥＫＩＦＹＶ；又はＹＶＳＥＫＩＦＹＶ；又はＦ｛Ｌ、Ｖ、又はＩ｝ＳＥＫＩＦＹＶ；又はＷ｛Ｌ又はＩ｝ＳＥＫＩＦＹＶ；又はＫ｛Ｖ又はＬ｝ＳＥＫＩＦＹＩ
；又はＦＶＳＥＫＩＦＹ｛Ｉ又はＮｖａ｝、又はＫ｛Ｖ又はＬ｝ＳＥＫＩＦＹＶ；又は｛Ｆ又はＹ｝ＡＳＥＫＩＦＹＶ；又はＦＶＳＥＫＩＦＹＩを有する。
いくつかのさらなる実施の形態は、ＭＨＣクラスＩ制限Ｔ細胞エピトープＮＹ−ＥＳＯ−１157-165つまり、ＳＬＬＭＷＩＴＱＣ（配列番号１）のアナログ、ｐＡＰＣによってプロセッシングされてエピトープアナログを提示することができるこれらのアナログを含むポリペプチド、及びアナログを発現する核酸に関する。アナログは、野生型エピトープと比較して類似又は改善された免疫特性を有することができる。
１つの実施の形態は、配列ＳＬＬＭＷＩＴＱＣ（配列番号１）を持つエピトープに対する免疫化によって生成されたＴ細胞株からのサイトカイン産生を誘発するのに十分な量の１つ又は複数のアミノ酸置換を含むＳＬＬＭＷＩＴＱＣ（配列番号１）の配列を有する単離ＮＹ−ＥＳＯ−１157-165ペプチドに関する。例えば、１つの態様では、十分な量は１０μＭ以下である。さらなる態様では、十分な量は３μＭ以下である。また、さらなる態様では、十分な量は１μＭ以下である。さらなる態様では、十分な量は０．３μＭ以下である。１つの態様では、置換には、標準アミノ酸が含まれる。さらなる態様では、置換には、非標準アミノ酸が含まれる。１つの態様では、非標準アミノ酸は、例えば、Ｔｙｒ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ａｌａ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｎｌｅ、Ｎｖａ、Ｔｒｐ、Ｐｈｅ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ａｂｕ、及び標準アミノ酸のＤ型立体異性体である。さらなる態様では、置換には、修飾末端アミノ酸が含まれる。１つの態様では、修飾末端アミノ酸は、アミド化Ｃ末端アミノ酸である。さらなる態様では、少なくとも１つの置換は、アミノ酸の付加であり、付加はＣ末端付加である。
１つの実施の形態は、
Ｐ１が、Ｓ、Ｆ、Ｋ又はＷであり、
Ｐ２が、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｎｌｅ又はＮｖａであり、
Ｐ３がＬであり、
Ｐ４が、Ｍ、Ｌ又はＮであり、
Ｐ５がＷであり、
Ｐ６が、Ｉ、Ａ、Ｌ、Ｖ又はＮであり、
Ｐ７がＴであり、
Ｐ８が、Ｑ、Ｅ、Ｄ又はＴであり、
Ｐ９のＰΩがＣ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ａ、Ｎｖａ、Ｎｌｅ、Ｖ−ＮＨ2又はＬ−ＮＨ2である配列を有するが、配列がＳＬＬＭＷＩＴＱ｛Ｃ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ａ｝、ＦＶＬＭＷＩＴＱＡ又はＦＩＬＭＷＩＴＱ｛Ｌ、Ｉ｝ではない単離ペプチドに関する。
別の実施の形態は、
Ｐ１がＹであり、
Ｐ２が、Ｌ、Ｖ、Ｉ、Ｎｌｅ又はＮｖａであり、
Ｐ３がＬであり、
Ｐ４が、Ｍ、Ｌ又はＮであり、
Ｐ５がＷであり、
Ｐ６が、Ｉ、Ａ、Ｌ、Ｖ又はＮであり、
Ｐ７がＴであり、
Ｐ８が、Ｑ、Ｅ、Ｄ又はＴであり、
Ｐ９のＰΩがＶ、Ｉ、Ｌ、Ｎｖａ、Ｎｌｅ、Ｖ、Ｖ−ＮＨ2又はＬ−ＮＨ2である配列を有するが、配列がＹＶＬＭＷＩＴＬ又はＹＬＬＭＷＩＴ｛Ｉ、Ｌ｝ではない単離ペプチドに関する。
さらなる実施の形態は、配列｛Ｓ、Ｙ｝ＬＬＭＷＩＴＱ｛Ｃ、Ｖ｝｛Ｌ、Ｉ、Ｎｌｅ｝
を有する単離十アミノ酸長ペプチドに関する。
さらに別の実施の形態は、配列ＳＩＬＭＷＩＴＱ｛Ｃ、Ｖ、Ｌ、Ａ｝、ＹＬＬＭＷＩＴＱ｛ＮＶａ、Ｎｌｅ｝、Ｆ｛Ｌ、Ｖ｝ＬＭＷＩＴＱ｛Ｖ、Ｌ、Ｉ｝、Ｙ｛Ｉ、Ｎｖａ、Ｎｌｅ｝ＬＭＷＩＴＱＶ、ＹＬＬＬＷＩＴＱＶ又はＴＶＬＭＷＩＴＱＶを有する単離ペプチドに関する。
さらなる実施の形態は、配列｛Ｓ、Ｆ｝ＶＬＭＷＩＴＱＶ、ＳＬＭＷＩＴＱＮｖａ又はＳＮｖａＬＭＷＩＴＱＶを有する単離ペプチドに関する。
さらに別の実施の形態は、配列ＳＮｖａＬＭＷＩＴＱＶを有する単離ペプチドに関する。
いくつかの実施の形態は単離ペプチドに関する。このペプチドは、
Ｐ０
が、Ｘ、ＸＸ又はＸＸＸで、Ｘが任意のアミノ酸又は非アミノ酸を示し、
Ｐ１がＫ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ｐｈｇ、Ｐｈｅ（４−Ｆ）、Ｐｈｅ（４−ＮＯ2）、ＭｅＴｙｒ、β−（３−ベンゾチエニル）−Ａｌａ又はＤ−Ｌｙｓであり、
Ｐ２がＡ、Ｌ、Ｖ、Ｉ、Ｍ、Ｄ−Ａｌａ、Ｎａｌ−２、Ａｂｕ、Ａｉｂ、Ｎｌｅ又はＮｖａであり、
Ｐ３がＳであり、
Ｐ４がＥ、Ｑ、Ｎｌｅ又はＮｖａであり、
Ｐ５がＫであり、
Ｐ６がＩ、Ｌ、Ｖ、Ｎｌｅ又はＮｖａであり、
Ｐ７がＦであり、
Ｐ８がＹ、Ｆ、Ｐｈｅ（４−Ｆ）であり、
Ｐ９のＰΩがＶ、Ｉ、Ａ、Ｎｖａ、ＭｅＶａｌ、Ａｂｕ又はＶ−ＮＨ2であるか、或いはＰ９がＶであり、
Ｐ１０のＰΩがＩ、Ｌ、Ｖ、Ｎｌｅ又はＮｖａであり、
ＰΩ＋１がＸ、ＸＸ又はＸＸＸで、Ｘが任意のアミノ酸又は非アミノ酸を示す配列を含むか、又はこの配列から実質的に構成され得、配列がＫＡＳＥＫＩＦＹＶではない。
単離ペプチドは、下記配列：
Ｋ｛Ｌ、Ｖ、Ｍ、Ｉ、Ｄ−Ａｌａ、Ｄ−Ｖａｌ、Ｎａｌ−２、Ａｉｂ、Ａｂｕ、Ｎｌｅ又はＮｖａ｝ＳＥＫＩＦＹＶ、又は
｛Ｆ、Ｐｈｇ、Ｙ、Ｐｈｅ（４−Ｆ）、Ｐｈｅ（４−ＮＯ2）、Ｏ−メチル−Ｔｒｙ又はβ−（３−ベンゾチエニル−Ａｌａ｝ＡＳＥＫＩＦＹＶ、又は
｛Ｙ、Ｆ又はＷ｝｛Ｖ、Ｍ又はＩ｝ＳＥＫＩＦＹＶ、又は
｛Ｆ又はＷ｝ＬＳＥＫＩＦＹＶ、又は
Ｋ｛Ａ、Ｖ又はＬ｝ＳＥＫＩＦＹＩ、又は
Ｋ｛Ｌ又はＶ｝ＳＥＫＩＦＹＶ−ＮＨ2、又は
ＦＶＳＥＫＩＦＹ｛Ｉ、Ａ、Ｎｖａ、Ａｂｕ又はＭｅＶａｌ｝、又は
ＦＶＳ｛Ｑ、Ｎｌｅ、Ｎｖａ｝ＫＩＦＹＶ、又は
ＦＹＳＥＫ｛Ｌ、Ｖ、Ｎｌｅ又はＮｖａ｝ＦＹＶ、又は
ＦＶＳＥＫＩＦ｛Ｆ、Ｐｈｅ（４−Ｆ）｝Ｖ、又は
ＫＡＳＥＫＩＦＹＶ｛Ｉ、Ｌ｝、又は
ＫＶＳＥＫＩＦＹＶ｛Ｉ、Ｌ、Ｖ又はＮｌｅ｝、又は
ＫＬＳＥＫＩＦＹＶ｛Ｌ、Ｖ、Ｎｌｅ又はＮｖａ｝
を含むか、又はこの配列から実質的に構成され得る。
単離ペプチドは、下記配列：
Ｋ｛Ｌ、Ｖ、Ｍ、Ａｂｕ、Ｎｌｅ又はＮｖａ｝ＳＥＫＩＦＹＶ、又は
｛Ｆ又はＰｈｇ｝ＡＳＥＫＩＦＹＶ、又は
ＹＶＳＥＫＩＦＹＶ、又は
Ｆ｛Ｌ、Ｖ又はＩ｝ＳＥＫＩＦＹＶ、又は
Ｗ｛Ｌ又はＩ｝ＳＥＫＩＦＹＶ、又は
Ｋ｛Ｖ又はＬ｝ＳＥＫＩＦＹＩ、又は
ＦＶＳＥＫＩＦＹ｛Ｉ又はＮＶａ｝
を含むか、又はこの配列から実質的に構成され得る。
また、単離ペプチドは、下記配列：
Ｋ｛Ｖ又はＬ｝ＳＥＫＩＦＹＶ、又は
｛Ｆ又はＹ｝ＡＳＥＫＩＦＹＶ、又は
ＦＶＳＥＫＩＦＹＩ、又は
ＫＶＳＥＫＩＦＹＶ
を含むか、又はこの配列から実質的に構成されることができる。
さらに、単離ペプチドは、配列ＫＶＳＥＫＩＦＹＶを含むか、又はこの配列から実質的に構成され得る。
単離ペプチドは、クラスＩＭＨＣペプチド結合溝に対して親和性を有する。ＭＨＣは例えば、ＨＬＡ−Ａ２とすることができる。
いくつかの実施の形態は、クラスＩのＭＨＣ／ペプチド複合体に関し、ペプチドは、請求項１に記載のペプチドの配列を有する。クラスＩＭＨＣ／ペプチド複合体は、クラスＩＭＨＣ／ＳＳＸ−２41-49複合体を認識するＴＣＲと交差反応性である。クラスＩＭＨＣ／ペプチド複合体は、ＨＬＡ−Ａ２／ＳＳＸ−２41-49複合体である。
他の実施の形態は、遊離配列と結合する上記及び本明細書中に記載のペプチド配列を含むポリペプチドに関する。
なおさらなる実施の形態は、上記又は本明細書中に記載のペプチドが含まれる免疫原性組成物に関する。
他の実施の形態は、上記又は本明細書中に記載のポリペプチドをコードする核酸又は発現のための核酸手段に関する。また、いくつかの実施の形態は、このような核酸又は核酸手段を含む免疫原性組成物に関する。
いくつかの実施の形態は、ＣＴＬ応答を誘導、維持又は増幅する方法に関する。この方法は、上記及び本明細書中に記載の組成物の節内投与を含む。
他の実施の形態は、上記又は本明細書中に記載の組成物及び免疫増強剤の節内投与を含む、クラスＩＭＨＣ制限Ｔ細胞応答を同調させる方法に関する。
さらなる実施の形態は、上記又は本明細書中に記載の組成物の節内投与を含む、ＣＴＬ応答を誘導、維持又は同調させる方法に関する。
いくつかの実施の形態は、クラスＩＭＨＣ結合溝に対してＫＡＳＥＫＩＦＹＶと同程度か、又はそれよりも強い親和性を有する配列ＫＡＳＥＫＩＦＹＶにおいて１個〜３個の置換を含む単離ペプチドに関する。解離の半減期が、上記クラスＩＭＨＣ結合溝からのＫＡ
ＳＥＫＩＦＹＶの解離の半減期と同程度か、又はそれよりも長くてもよい。単離ペプチドは、ペプチドＫＡＳＥＫＩＦＹＶに対する特異性によりＴ細胞に認識される。
さらに別の実施の形態は、
Ｐ１がＫ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ｐｈｇ、Ｐｈｅ（４−Ｆ）、Ｐｈｅ（４−ＮＯ2）、ＭｅＴｙｒ、β−（３−ベンゾチエニル）−Ａｌａ又はＤ−Ｌｙｓであり、
Ｐ２がＡ、Ｌ、Ｖ、Ｉ、Ｍ、Ｄ−Ａｌａ、Ｎａｌ−２、Ａｂｕ、Ａｉｂ、Ｎｌｅ又はＮｖａであり、
Ｐ３がＳであり、
Ｐ４がＥ、Ｑ、Ｎｌｅ又はＮｖａであり、
Ｐ５がＫであり、
Ｐ６がＩ、Ｌ、Ｖ、Ｎｌｅ又はＮｖａであり、
Ｐ７がＦであり、
Ｐ８がＹ、Ｆ、Ｐｈｅ（４−Ｆ）であり、
Ｐ９のＰΩがＶ、Ｉ、Ａ、Ｎｖａ、ＭｅＶａｌ又はＡｂｕである配列であって、ＫＡＳＥＫＩＦＹＶではない配列、
又は
Ｐ１がＫ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ｐｈｇ、Ｐｈｅ（４−Ｆ）、Ｐｈｅ（４−ＮＯ2）、ＭｅＴｙｒ、β−（３−ベンゾチエニル）−Ａｌａ又はＤ−Ｌｙｓであり、
Ｐ２がＶ、Ｌ、Ｍ、Ａｂｕ、Ｎｌｅ又はＮｖａであり、
Ｐ３がＳであり、
Ｐ４がＥ、Ｑ、Ｎｌｅ又はＮｖａであり、
Ｐ５がＫであり、
Ｐ６がＩ、Ｌ、Ｖ、Ｎｌｅ又はＮｖａであり、
Ｐ７がＦであり、
Ｐ８がＹ、Ｆ、Ｐｈｅ（４−Ｆ）であり、
Ｐ９のＰΩがＶ、Ｉ、Ａ、Ｎｖａ、ＭｅＶａｌ、Ａｂｕ又はＶ−ＮＨ2である配列、
又は
Ｐ１がＫ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ｐｈｇ、Ｐｈｅ（４−Ｆ）、Ｐｈｅ（４−ＮＯ2）、ＭｅＴｙｒ、β−（３−ベンゾチエニル）−Ａｌａ又はＤ−Ｌｙｓであり、
Ｐ２がＡ、Ｌ、Ｖ、Ｍ、Ａｂｕ、Ｎｌｅ又はＮｖａであり、
Ｐ３がＳであり、
Ｐ４がＥ、Ｑ、Ｎｌｅ又はＮｖａであり、
Ｐ５がＫであり、
Ｐ６がＩ、Ｌ、Ｖ、Ｎｌｅ又はＮｖａであり、
Ｐ７がＦであり、
Ｐ８がＹ、Ｆ、Ｐｈｅ（４−Ｆ）であり、
Ｐ９がＶであり、
Ｐ１０のＰΩがＩ又はＬである配列、
又は
Ｐ１がＫ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ｐｈｇ、Ｐｈｅ（４−Ｆ）、Ｐｈｅ（４−ＮＯ2）、ＭｅＴｙｒ、β−（３−ベンゾチエニル）−Ａｌａ又はＤ−Ｌｙｓであり、
Ｐ２がＶであり、
Ｐ３がＳであり、
Ｐ４がＥ、Ｑ、Ｎｌｅ又はＮｖａであり、
Ｐ５がＫであり、
Ｐ６がＩ、Ｌ、Ｖ、Ｎｌｅ又はＮｖａであり、
Ｐ７がＦであり、
Ｐ８がＹ、Ｆ、Ｐｈｅ（４−Ｆ）であり、
Ｐ９がＶであり、
Ｐ１０のＰΩがＩ、Ｌ、Ｖ又はＮｌｅである配列、
又は
Ｐ１がＫ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ｐｈｇ、Ｐｈｅ（４−Ｆ）、Ｐｈｅ（４−ＮＯ2）、ＭｅＴｙｒ、β−（３−ベンゾチエニル）−Ａｌａ又はＤ−Ｌｙｓであり、
Ｐ２がＬであり、
Ｐ３がＳであり、
Ｐ４がＥ、Ｑ、Ｎｌｅ又はＮｖａであり、
Ｐ５がＫであり、
Ｐ６がＩ、Ｌ、Ｖ、Ｎｌｅ又はＮｖａであり、
Ｐ７がＦであり、
Ｐ８がＹ、Ｆ、Ｐｈｅ（４−Ｆ）であり、
Ｐ９がＶであり、
Ｐ１０のＰΩがＩ、Ｌ、Ｖ、Ｎｌｅ又はＮｖａである配列を含むか、又はこの配列から実質的に構成される単離ペプチドに関する。
いくつかの実施の形態は、
Ｐ０がＸ、ＸＸ又はＸＸＸで、Ｘが任意のアミノ酸又は非アミノ酸を示し、
Ｐ１がＳ、Ｆ、Ｋ、Ｗ又はＹであり、
Ｐ２がＬ、Ｉ、Ｖ、Ｎｌｅ又はＮｖａであり、
Ｐ３がＬであり、
Ｐ４がＭ、Ｌ又はＮであり、
Ｐ５がＷであり、
Ｐ６がＩ、Ａ、Ｌ、Ｖ又はＮであり、
Ｐ７がＴであり、
Ｐ８がＱ、Ｅ、Ｄ又はＴであり、
Ｐ９のＰΩがＣ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ａ、Ｎｖａ、Ｎｌｅ、Ｖ−ＮＨ2又はＬ−ＮＨ2であり、
ＰΩ＋１がＸ、ＸＸ又はＸＸＸで、Ｘが任意のアミノ酸又は非アミノ酸を示する配列であって、ＳＬＬＭＷＩＴＱ｛Ｃ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ａ｝、ＦＶＬＭＷＩＴＱＡ、ＦＩＬＭＷＩＴＱ｛Ｌ、Ｉ｝、ＹＶＬＭＷＩＴＬ又はＹＬＬＭＷＩＴ｛Ｉ、Ｌ｝ではない配列、
Ｐ１がＳ、Ｆ、Ｋ又はＷであり、
Ｐ２がＬ、Ｉ、Ｖ、Ｎｌｅ又はＮｖａであり、
Ｐ３がＬであり、
Ｐ４がＭ、Ｌ又はＮであり、
Ｐ５がＷであり、
Ｐ６がＩ、Ａ、Ｌ、Ｖ又はＮであり、
Ｐ７がＴであり、
Ｐ８がＱ、Ｅ、Ｄ又はＴであり、
Ｐ９のＰΩがＣ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ａ、Ｎｖａ、Ｎｌｅ、Ｖ−ＮＨ2又はＬ−ＮＨ2である配列であって、ＳＬＬＭＷＩＴＱ｛Ｃ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ａ｝、ＦＶＬＭＷＩＴＱＡ又はＦＩＬＭＷＩＴＱ｛Ｌ、Ｉ｝ではない配列、
又は
Ｐ１がＹであり、
Ｐ２がＬ、Ｖ、Ｉ、Ｎｌｅ又はＮｖａであり、
Ｐ３がＬであり、
Ｐ４がＭ、Ｌ又はＮであり、
Ｐ５がＷであり、
Ｐ６がＩ、Ａ、Ｌ、Ｖ又はＮであり、
Ｐ７がＴであり、
Ｐ８がＱ、Ｅ、Ｄ又はＴであり、
Ｐ９のＰΩがＶ、Ｉ、Ｌ、Ｎｖａ、Ｎｌｅ、Ｖ、Ｖ−ＮＨ2又はＬ−ＮＨ2である配列で
あって、ＹＶＬＭＷＩＴＬ又はＹＬＬＭＷＩＴ｛Ｉ、Ｌ｝ではない配列を含むか、又はこの配列から実質的に構成される単離ペプチドに関する。
さらなる実施の形態は、クラスＩＭＨＣ／ペプチド複合体であって、該ペプチドが上記実施の形態又は本明細書中に記載のいずれかのペプチド配列を有する複合体に関する。１つの態様では、複合体は、クラスＩＭＨＣ／ＮＹ−ＥＳＯ−１157-165複合体を認識するＴＣＲと交差反応性を示す。さらなる態様では、複合体は、ＨＬＡ−Ａ２／ＮＹ−ＥＳＯ−１157-165複合体である。
上記実施の形態の１つの態様では、ペプチドは、ＨＬＡ−Ａ２等のクラスＩＭＨＣペプチド結合溝に親和性を示す。
さらなる実施の形態は、遊離配列と結合して実施の形態のいずれかのペプチド配列を含むポリペプチドに関する。
さらなる実施の形態は、実施の形態のいずれかのペプチドを含む免疫原性組成物に関する。１つの態様では、ペプチドは、本明細書中に記載の配列を有することができる。
さらなる実施の形態は、実施の形態のいずれかのペプチドをコードするが、好ましくは、非標準アミノ酸置換を持たない核酸に関する。さらなる態様では、核酸を、ベクター中でコードすることができる。
さらなる実施の形態は、実施の形態のいずれかのペプチドをコードする核酸を含む免疫原性組成物に関する。
さらなる実施の形態は、実施の形態のいずれかの組成物又はペプチドを節内投与することによるＣＴＬ応答の誘導方法に関する。さらなる態様では、本方法により、ＣＴＬを維持することが可能である。さらなる態様では、本方法により、クラスＩＭＨＣ制限Ｔ細胞応答を増幅することが可能である。さらなる態様では、本方法により、クラスＩＭＨＣ制限Ｔ細胞応答を同調させることが可能である。さらなる態様では、本方法はまた、免疫増強剤を含む。
いくつかの実施の形態は、天然のエピトープ配列中に１〜３個又は４個のアミノ酸置換を含む配列を有する単離ペプチドであって、該配列のエピトープに対する免疫化によって生成されたＴ細胞株からのサイトカイン産生を誘発するのに必要なペプチドの濃度が、例えば１０μＭ、１μＭ、及び０．３μＭ等の特定の濃度以下である単離ペプチドに関する。標準アミノ酸及び非標準アミノ酸等による置換が含まれる。標準アミノ酸のＤ型立体異性体、Ｎｖａ、又はＮｌｅのような非標準アミノ酸は、本明細書中に記載の非標準アミノ酸のいずれかである。置換には、修飾末端アミノ酸が含まれ、修飾末端アミノ酸は、アミド化Ｃ末端アミノ酸である。置換の１つは、アミノ酸の付加であり、例えば、付加はＣ末端付加である。
他の実施の形態は、標的関連抗原セグメントの配列と少なくとも１つの相違を含むアミノ酸配列を有するペプチドであって、該セグメントがＭＨＣタンパク質のペプチド結合溝に対する既知又は予測される親和性を有し、少なくとも１つの相違が該セグメント中のＭＨＣ結合モチーフアンカー部位の残基のＮｌｅ又はＮｖａ残基への置換であるペプチドに関する。アンカーの部位は、Ｐ２又はＰΩのような第１のアンカー部位である。アンカー部位は、補助的なアンカー部位である。上記相違には、上記セグメント中の疎水性残基のＮｌｅ又はＮｖａ残基への置換が含まれる。いくつかの態様では、Ｉ、Ｌ、又はＶは、ＭＨＣ結合モチーフのアンカー部位中の好ましい残基である。いくつかの態様では、ペプチ
ドは、例えば、約８〜１４アミノ酸長、より好ましくは９〜１０アミノ酸長を有することができる。
タンパク質は、例えば、クラスＩＭＨＣタンパク質のようなヒトＭＨＣタンパク質である。ＭＨＣタンパク質は、例えば、ＨＬＡ−Ａ２、Ａ３、Ａ２４、Ａ３０、Ａ６６、Ａ６８、Ａ６９、Ｂ７、Ｂ８、Ｂ１５、Ｂ２７、Ｂ３５、Ｂ３７、Ｂ３８、Ｂ３９、Ｂ４０、Ｂ４８、Ｂ５１、Ｂ５２、Ｂ５３、Ｂ６０、Ｂ６１、Ｂ６２、Ｂ６３、Ｂ６７、Ｂ７０、Ｂ７１、Ｂ７５、Ｂ７７、Ｃ４、Ｃｗ１、Ｃｗ３、Ｃｗ４、Ｃｗ６、Ｃｗ７及びＣｗ１０等のタイプである。いくつかの態様において、ＭＨＣタンパク質は、ＨＬＡ−Ａ２及びＡ２４である。ＭＨＣは、アンカー残基結合ポケットを有してもよく、該ポケットは、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１のＢ又はＦ−ポケットに相同的である。結合ポケットがエピトープアンカー残基に適合し、それにより、ＭＨＣ分子の結合特異性が定義される、結合ポケットの形成に関与するＭＨＣ残基は、当該技術分野でよく知られている。このような情報をまとめたものの一つが、ハイパーテキスト・トランスファー・プロトコル（http://）「sdmc.lit.org.sg:8080/fimm/」のＦＩＭＭ（機能免疫学）ウェブサイトで見ることができる。それぞれの全体が本明細書中で参考として援用される、Schonbach C., Koh J.L.Y., Sheng X., Wong L., and V.Brusic.「ＦＩＭＭ：機能分子免疫学のデータベース」 Nucleic Acids Research, 2000, Vol. 28. No. 1 222-224、及びSchonbach C., Koh JL, Flower DR, Wong L., and Brusic V. 「ＦＩＭＭ：機能分子免疫学のデータベース（２００２年改訂）」 Nucleic Acids Research, 2002, Vol. 30, No. 1 226-229も参照のこと。また、ペプチドは、上記ＭＨＣに対する上記セグメントの特性に相当する特性と実質的に同じであるか、又はそれよりも良好である少なくとも１つの結合特性を有する。例えば、結合特性は、上記セグメントの結合特性と比較して高い可能性がある。また、結合特性は例えば親和性又は結合の安定性である。
ペプチドは、セグメントの免疫原性と実質的に同程度又はより良好な免疫原性を有し得る。免疫原性を向上させることができる。免疫原性は、上記セグメントに交差反応性を示す免疫応答を誘発することができるか、ＣＴＬ応答を誘発することができる。例えば、ＭＨＣ−四量体アッセイ、サイトカインアッセイ、細胞毒性アッセイを使用して、ペプチドを認識する免疫応答の測定、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの免疫化系を使用した、上記セグメントを認識する免疫応答の測定、又は他の任意の適切な方法によって免疫原性を評価することができる。免疫化系には、ヒト細胞が含まれる。例えば、トランスジェニックマウスを含むｉｎ ｖｉｖｏでの免疫化系を使用して免疫原性を評価することができる。ペプチドは、上記ＭＨＣの上記セグメントに少なくとも類似する結合特性を有する。例えば、いくつかの態様では、「類似する」と見なされるものを、本開示に基づいて決定することができる。いくつかの態様では、「類似性」は、例えば、最大半量結合、相対親和性、安定性（解離半減期）、及び交差反応性／機能的結合力のためのペプチド濃度に基づく。例として、ペプチドが、天然ペプチドの値の２倍、さらに３倍、４倍、５倍、又は１０倍以内という結果又は特徴を有する場合、ペプチドが類似すると見なすことができる。また、例えば、交差反応性／機能的結合力について、データが天然ペプチドの３倍〜１０倍以内である場合、類似の結果である。別の例として、天然ペプチドの２、３、４、５、６、７、１０、１５、又は２０％以内である場合、結合率が類似すると見なすことができる。また、いくつかの態様では、ＥＤ５０値が天然配列の２倍又は３倍以内である場合、ＥＤ５０値が類似すると見なすことができる。類似の解離半減期は、例えば、２倍又は３倍以内である。さらに別の例として、交差反応性について、野生型と約２倍異なる値を類似すると見なすことができる。これらの類似の値は例示のみを目的とし、いくつかの実施の形態のいくつかの態様の文脈で示す。他の「類似の」値を、本明細書中の他の実験及び教示に基づいて決定される。
ペプチドは、セグメントと免疫学的な交差反応性を示す。交差反応性を、セグメントを
用いた免疫化及びペプチド認識をアッセイすることによって評価することができる。交差反応性を、ペプチドを用いた免疫化及びセグメント認識をアッセイすることによって評価することができる。
上記及び本明細書中に記載のペプチドを、例えば、２つの相違を含むように修飾することができる。いくつかの場合、各相違は独立してＮｌｅ又はＮｖａ残基を含むことができる。いくつかの場合、１つの相違には、Ｎｌｅ又はＮｖａ残基を含むことができない。また、上記及び本明細書中に記載のペプチドは、３つ又はそれを超える相違を含む。
標的関連抗原は、腫瘍関連抗原である。標的関連抗原は、病原体関連抗原である。
他の実施の形態は、上記及び本明細書中に記載の本発明のペプチドを含む免疫原性組成物に関する。さらなる実施の形態は、このような組成物を哺乳動物、例えば、リンパ系に直接投与することを含む、免疫化方法に関する。
さらに他の実施の形態は、Ｔ細胞エピトープアナログの作製方法に関する。本方法は、標的関連抗原セグメントのアミノ酸配列を提供することを含み、該セグメントがＭＨＣタンパク質のペプチド結合溝に対して既知又は予測される親和性を有し、ＭＨＣ結合モチーフのアンカー部位に対応する配列の少なくとも１つのアミノ酸をＮｌｅ又はＮｖａに置換すること、及び、置換した配列を含むペプチドを合成することを含む。合成は、例えば、化学合成又は他の任意の合成方法である。
いくつかの実施の形態は、Ｔ細胞エピトープペプチドアナログであって、該アナログが、ＭＨＣ結合モチーフのアンカー部位に対応する少なくとも１つの天然の残基が、Ｎｌｅ又はＮｖａ残基と置換することによって天然のエピトープペプチドと異なる、Ｔ細胞エピトープペプチドアナログに関する。
さらなる実施の形態は、免疫活性であり、１つ又は複数のＭＨＣアンカー残基に非天然アミノ酸を保有するペプチドを示す組成物を生成する方法及び得られた組成物に関する。
［好ましい実施形態の詳細な説明］
Ｔ細胞エピトープを含むペプチドは、通常、以下の複数の要因のうちの１つにより、免疫原又は免疫調節物質としては不十分である：最適薬物動態プロファイル、ＭＨＣ分子への結合の制限（Ｋonの減少及びＫoffの増加）、正常な免疫レパートリーに存在するＴ細胞による内因性認識の減少（例えば、種々の耐性形態による）。ペプチドの免疫学的特性を向上させるために、配列が天然のエピトープと異なるペプチドのスクリーニング及び使用に関して種々のストラテジーが行われている。このようなアナログは、複素環式ペプチド及び代替ペプチドリガンド（ＡＰＬ）等の当該技術分野で種々の名称で知られている。このようなアナログの生成には、遺伝学的に標準的にコードされる残基由来のアミノ酸が最も頻繁に使用されている（例えば、Valmori, D. 他., J. Immunol. 160: 1750-1758, 1998を参照のこと）。非標準アミノ酸の使用は、典型的には、ペプチドの生化学的安定性を改善するための試みに関連している（例えば、Blanchet, J.-S. 他., J. Immunol. 167:5852-5861, 2001を参照のこと）。
一般に、アナログは以下の２つの主なクラスに分類することができる：（１）より良好なＨＬＡ結合プロファイル及びより高い免疫応答を達成するためのペプチドアンカー残基の修飾、及び（２）自己抗原に対するＴ細胞耐性を回避するためのペプチドアンカー残基及びＴＣＲ接触残基の修飾。
いくつかの実施形態は、以下の保持又は改善される特性（これらに限定されない）の少なくとも１つを有するアナログに関する：
１．ＴＣＲに対する交差反応性及び機能的結合力。
２．ＭＨＣクラスＩへの結合に対する親和性及び安定性。
３．細胞毒性によって評価された免疫に対するｉｎ ｖｉｖｏでの効果。
４．ＩＦＮ−γのｅｘ ｖｉｖｏでの産生によって評価された、免疫に対する
ｉｎ ｖｉｖｏでの効果。
５．タンパク質分解に対する耐性の増大。
いくつかの実施形態は、アナログを含むペプチド配列であって、当該配列のアミノ酸を、例えば、Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３、ＰΩ等の位置指定子を使用して表したペプチド配列に関する。さらに、ペプチド配列を、Ｐ０及び／又はＰΩ＋１指定子が含まれるように表すことができる。いくつかの態様では、Ｐ０は、Ｘ、ＸＸ、又はＸＸＸで、Ｘは任意のアミノ酸であるか、アミノ酸ではない。同様に、いくつかの態様では、ＰΩ＋１は、Ｘ、ＸＸ、又はＸＸＸで、Ｘは任意のアミノ酸であるか、アミノ酸ではない。したがって、例えば、ＸＸＸは、任意のアミノ酸残基又は非アミノ酸の組み合わせを意味する。したがって、これらの実施形態は、特定の配列のＮ末端又はＣ末端に３つまでの付加的なアミノ酸（アミノ酸残基の任意の組み合わせ）を有するポリペプチドを含む。また、いくつかの態様では、実施形態は、Ｎ末端又はＣ末端に付加的なアミノ酸を含まなくてもよい。
結合ポケットがエピトープアンカー残基に適合し、それにより、ＭＨＣ分子の結合特異性が定義されるような結合ポケットの形成に関与するＭＨＣ残基は、当該技術分野でよく知られている。このようなをまとめたものの一つが、ハイパーテキスト・トランスファー・プロトコル（http://）「sdmc.lit.org.sg:8080/fimm/」のＦＩＭＭ（機能免疫学）ウェブサイトで見ることができる。それぞれの全体が本明細書中で参考として援用される、Schonbach C., Koh J.L.Y., Sheng X., Wong L., and V.Brusic. 「ＦＩＭＭ：機能分子免疫学のデータベース」 Nucleic Acids Research, 2000, Vol. 28. No. 1 222-224、及びSchonbach C., Koh JL, Flower DR, Wong L., and Brusic V. 「ＦＩＭＭ：機能分子免疫学のデータベース（２００２年改訂）」 Nucleic Acids Research, 2002, Vol. 30, No. 1 226-229も参照のこと。
語句「遊離配列」は、直接若しくはＮ末端トリミング又は他の生理学的過程と組み合わせた免疫プロテアソームプロセッシングによってエピトープ又はアナログを遊離可能にする状況が得られる、より大きな配列に含まれるエピトープ又はアナログを含むか、又はコードするペプチドをいう。いくつかの態様では、アナログ又はエピトープを、設計するか操作することができる。
他の実施形態は、エピトープアレイ及び、プロセッシングしてアナログを遊離することができるエピトープアナログ配列を含む他のポリペプチドに関する。さらなる実施形態は、このようなポリペプチドをコードする核酸、特に、ＤＮＡプラスミド、又は単にアナログ及びこれらの発現物に関する。アナログ、アナログを含むポリペプチド、及びコードする核酸は全て、免疫原性組成物、特に、リンパ内送達に適した組成物の成分であり、その全ては、さらなる実施形態に関する。
免疫特性が向上したペプチドアナログを、ＭＨＣ−ペプチド複合体の結合を増大させて形成を安定化させるように、ＭＨＣ分子との相互作用に関与するアンカー残基を修飾することによって設計することができる。このような修飾を、制限されたＭＨＣ分子の結合モチーフ又は好ましいアンカー残基の知識によって導くことができる。種々の置換を有するアナログの特性を予測するために使用することができる種々の規則、指標、及びアルゴリズムがさらに存在し、置換は、遺伝学的に標準的にコードできるアミノ酸から選択される
という制限を受ける。
しかし、アンカー残基を非標準アミノ酸で置換した際の結果を予測するデータベースやアルゴリズムは存在せず、その有用性は今まで十分に調査されていない。非標準アミノ酸であるノルロイシン（Ｎｌｅ）及びノルバリン（Ｎｖａ）を、ＭＨＣ結合ペプチドのアンカー残基部位に有利に置換することができることを本明細書中に開示する。これらは、疎水性又は巨大なアミノ酸、詳細には、Ｉ、Ｌ、又はＶが占める部位に置換されることが好ましい。
ＭＨＣ結合モチーフは、一般に、８〜１０アミノ酸長以内の一般的に知られた部位の好ましい残基側鎖に関して定義される（例えば、Rammensee 他., 「ＭＨＣリガンド及びペプチドモチーフ」 (Molecular Biology Intelligence Unit), Springer-Verlag, Germany, 1997 Landes Bioscience, Austin, Texas; and Parker, 他., 「個々のペプチド側鎖の独立した結合に基づく潜在的ＨＬＡ−Ａ２結合ペプチドをランク付けするためのスキーム」 J. Immunol. 152:163-175を参照のこと）。ＭＨＣ結合の予測に使用可能なウェブサイトのアルゴリズムも利用できる。例えば、Hans-Georg Rammensee, Jutta Bachmann, Niels Emmerich, Stefan Stevanovicのワールド・ワイド・ウェブページ: SYFPEITHI: MHCリガンド及びペプチドモチーフのインターネットデータベース(syfpeithi.bmi- heidelberg.com/scripts/MHCServer.dll/home.htmによるハイパーテキスト・トランスファー・プロトコルアクセス)を参照のこと。他にも、「bimas.dcrt.nih.gov/molbio/hla bind」がある。クラスＩ制限エピトープについて、Ｃ末端の部位ＰΩは、典型的には、第１のアンカーである。第２の部位Ｐ２は、しばしば第１のアンカーであるか、あるいは、Ｐ３及び／又はＰ５がこの役割を果たし得る。Ｐ２部位〜Ｐ７部位は全て、１つ又は別のＭＨＣの第２又は補助的アンカー部位として認識されている（Rammensee 他.及び米国特許出願公開番号第２００３−０２１５４２５号の表６（その開示全体が本明細書中で参考として援用される、２００１年１２月７日に出願された、「抗原提示細胞におけるエピトープ同期化」と題される米国特許出願番号第１０／０２６，０６６号を参照のこと)。クラスＩＩ制限エピトープであるＰ１、Ｐ４、Ｐ６、Ｐ７及びＰ９は、アンカー部位として認識されている。上記は、一般的指針として意図され、例示と見なすべきであり、網羅的、制限的と見なすべきではない。結合モチーフ及びアンカー残基等の多くの分析及び統計は、化学論文及び特許書類並びにインターネットで利用可能である。この慣習及び結果により、本明細書中の教示と組み合わせた場合、エピトープアナログを設計するための有用なガイドが当業者に与えられる。
提示ＭＨＣ分子に実際に結合するペプチドの長さは、一般的に知られたモチーフ配列よりも長くてよい。クラスＩＩＭＨＣ分子の結合溝の末端は開いており、それにより、コアモチーフのいずれかの末端で伸長することができる。対照的に、結合溝は、クラスＩＭＨＣ分子の両末端で閉じており、それにより、結合ペプチドの末端は、一般に、モチーフに対応していなければならないが、長さの有意な変動を、結合ペプチドの中心領域の隆起及び折り畳みによって適合することができ、それにより、少なくとも約１４アミノ酸長までのペプチドを提示することができる（例えば、Probst-Kepper, M. 他., J. Immunol. 173:5610-5616, 2004を参照のこと）。
エピトープアナログは、クラスＩＭＨＣ分子との相互作用並びに元のエピトープを認識するＴ細胞受容体との相互作用の維持又は増加に関係するＫon及びＫoffを改善し得るか、特定のＴ細胞集合の拡大の増強に反映されるｉｎ ｖｉｖｏ又はｅｘ ｖｉｖｏにおけるでの活性を修飾又は改善し得るか、特定のＴ細胞によるサイトカイン産生を改善することができるか、ペプチドと反応したＴ細胞によって介在される、天然エピトープを保有する標的に対するｉｎ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｔｒｏでの細胞毒性を改善し得る。さらに、このようなアナログは、より最適な形態で、複数の異なるＭＨＣクラスＩ分子と相互作
用し得る。
免疫特性が改善されたこのようなペプチドアナログは、１つ又は複数の非標準アミノ酸を含む１つ又は複数の置換を含む。非標準アミノ酸のうち、ノルバリン又はノルロイシンからなる第１のアンカー残基の置換が好ましく、これは、以下に例示するように、置換は、ＭＨＣクラスＩとの相互作用を改善し得るだけでなく、天然のエピトープに特異的なＴＣＲとの交差反応性を保存し、ｉｎ ｖｉｖｏでの免疫プロファイルを改善し得るからである。より詳細には、Ｐ２アミノ酸残基のＡ、Ｌ又はＶからノルバリン又はノルロイシンへの変異により免疫特性が改善されたので、好ましい。さらに、Ｃ末端残基のノルバリン又は好ましくはノルロイシンへの修飾により、アナログの免疫特性が改善された。さらに、Ｐ２又はＰΩにおける、ノルバリン及び／又はノルロイシンを含む第１及び／又は第２のアンカー残基に複数の置換を含むアナログは、免疫特性の改善に関連し得る。
ノルバリン（Ｎｖａ）及びノルロイシン（Ｎｌｅ）のある使用は、米国特許番号第６，６８５，９４７号、ＰＣＴ公開番号第ＷＯ０３／０７６５８５号Ａ２及び同第ＷＯ０１／６２７７６号Ａｌ、並びに米国特許公開番号第２００４０２５３２１８号Ａ１に記載されている。これらの参考文献は、免疫学的特性を改善するための、ＭＨＣ結合ペプチドのアンカー部位において置換されたＮｖａ又はＮｌｅの一般的有用性を教示していない。第２１８号公報は、置換された残基は、ＴＣＲ相互作用部位に組み込まれるが、ＭＨＣ相互作用部位には組み込まれないことを教示している。
本発明のさらに別の実施形態では、ペプチドは、免疫原性を示すが、脳炎誘発性ではないＮＳ特異的抗原由来のペプチドのアナログである。この目的のために最も適切なペプチドは、脳炎誘発性自己ペプチドがＴ細胞受容体（ＴＣＲ）結合部位で修飾されているが、ＭＨＣ結合部位で修飾されておらず、それにより、免疫応答が活性化されるが、反応不顕化されないペプチドである（Karin 他, 1998; Vergelli 他, 1996）。
第７７６号公報に開示されたＮｌｅが組み込まれたＨＬＡ−Ａ２．１制限ペプチドは、ＣＥＡ、ｐ５３及びＭＡＧＥ−３に由来する。ＣＥＡペプチドＩ（Ｎｌｅ）ＧＶＬＶＧＶ及びｐ５３ペプチドＳ（Ｎｌｅ）ＰＰＰＧＴＲＶでは、ＮｌｅはＰ２部位に存在する。ノルロイシンの一般的な有用性についての教示はなく、天然の配列と比較した場合、どのようにしてこのような置換によってアナログの特性が変化するのか、又は変化するのかどうかを開示していない。
いくつかの本発明の実施形態は、ＭＨＣへの結合を促進する部位にＮｖａ及び／又はＮｌｅが組み込まれたエピトープアナログに関する。いくつかの実施形態は、詳細には、ＨＬＡ−Ａ２．１制限エピトープ、ＣＥＡ、ｐ５３及び／若しくはＭＡＧＥ−３由来のＨＬＡ−Ａ２．１エピトープ、又はＭＡＧＥ−３、ＣＥＡ及び／若しくはｐ５３由来の他のペプチド中のＮｌｅ及び／又はＮｖａの使用を除外する。いくつかの実施形態は、上記の参照される特許文献中に開示の１つ又は複数の特異的配列を特に除外する。他の例示的実施形態は、Ｐ３、Ｐ５及び／又はＰΩアンカー部位、非Ａ２−ＨＬＡ制限エピトープ又は非Ａ２．１−ＨＬＡ制限エピトープのアナログを作製するための補助的アンカー部位、癌遺伝子又は癌胎児性タンパク質に由来しないペプチドのアンカー部位、及びＣＴ抗原由来のペプチドのアンカー部位におけるＮｌｅ及び／又はＮｖａの使用を含む。
一般に、このようなアナログは、薬剤単独又は治療と組み合わせて、免疫応答の発症及び調節への鍵であるＭＨＣ分子及びＴ細胞受容体との相互作用の最適化、感染症、癌、又は炎症等の種々の疾患の免疫療法及び／又は予防に有用である。
アナログの産生
ペプチド合成法又は所望のペプチドアナログをコードする核酸の発現を利用したペプチドの製造を含む、当業者に既知の任意の方法を使用してアナログを産生することができる。したがって、アナログが１つ又は複数の非標準アミノ酸を含む場合、アナログはペプチド産生法によって産生される可能性がより高い。アナログが１つ又は複数の標準アミノ酸による置換のみを含む場合、当業者に既知の任意の方法を使用して発現ベクターから上記アナログを発現することができる。あるいは、遺伝子治療法を使用して上記ペプチドを発現することができる。
アナログ試験
アナログの有用性及び／又は活性を同定した。この方法では、有用な及び／又は改善されたアナログを同定することができる。有用であるには、アナログは、必ずしも同定アッセイで改善されていることが見出されなくてもよい。したがって、有用なペプチドは、耐性化された患者で有用であるか、又はタンパク質分解に耐性を示す等の他の特性を含む。改善されると、ペプチドの、ＴＣＲへの結合、ＭＨＣ分子への結合が明確に改善され、免疫応答又は任意の他の生物活性が改善される。有用であるには、ペプチドは、マウス試験系を使用した場合に改善されないが、ヒト免疫系での相違により、ヒトで試験した場合に改善することができる。あるいは、有用性は、耐性化したヒトにおける耐性を破壊する可能性に起因する。あるいは、有用性は、改善されたアナログの改善を同定するためのさらなる置換に関する基盤としたペプチドを使用する能力に起因し得る。
有用性、改善された特性を評価し、アナログを野生型と比較するために、１つ又は複数の以下のアッセイを行った：ＨＬＡ−Ａ*０２０１に対するペプチド結合親和性；ペプチド−ＨＬＡ−Ａ*０２０１複合体の安定性アッセイ、交差反応性アッセイ（野生型のペプチド特異的ＣＴＬによるペプチドアナログの認識又はペプチドアナログを使用して生成されたＣＴＬによる野生型ペプチドの認識）、ＩＦＮ−γ分泌アッセイ、細胞毒性アッセイ及び／又はＥｌｉｓｐｏｔアッセイ等の免疫原性アッセイ、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの腫瘍細胞溶解アッセイ、ｅｘ ｖｉｖｏでの腫瘍細胞溶解及びｉｎ ｖｉｖｏでの腫瘍細胞溶解等の抗原性アッセイ、及びタンパク質分解耐性の増大を同定するためのタンパク質分解アッセイ。例示的なアッセイの詳細は、実施例で提示される。
アナログの使用
クラスＩＭＨＣ制限Ｔ細胞応答、及び特に抗原に対するエフェクター及び記憶ＣＴＬ応答を誘導、同調、維持、調節及び増幅するために開示されたアナログを使用する有用な方法が、「ＣＴＬ応答の誘導方法」と題される米国特許出願番号第０９／３８０，５３４号及び同第０９／７７６，２３２号、「ＭＨＣクラスＩ制限免疫応答の制御方法」と題される２００３年６月１７日に出願された米国仮出願番号第６０／４７９，３９３号、「予防又は治療目的のための、ＭＨＣクラスＩ制限エピトープに対する免疫応答の誘導、増大及び持続法」と題される米国特許出願番号第１０／８７１，７０７号（公開番号第２００５００７９１５２号）及び２００４年１２月２９日に出願された米国仮特許出願番号第６０／６４０，４０２号に記載されている。アナログはさらに最適化されたアナログを得るための調査において使用することができる。多くのハウスキーピングエピトープは２００２年４月４日に出願された米国出願番号第１０／１１７，９３７号（公開番号第２００３０２２０２３９号Ａ１）及び同第１０／６５７，０２２号（同第２００４−０１８０３５４号）並びに２００３年９月５日に出願されたＰＣＴ出願番号第ＰＣＴ／ＵＳ２００３／０２７７０６号（公開番号第ＷＯ０４０２２７０９号Ａ２）並びに２００１年４月６日に出願された米国仮出願番号第６０／２８２，２１１号、２００１年１１月７日に出願された同第６０／３３７，０１７号、２００２年３月７日に出願された同第６０／３６３，２１０号、２００２年９月５日に出願された同第６０／４０９，１２３号で提供され、これらの各出願は、「エピトープ配列」と題されている。さらにアナログはこれらの出願に記載されている様々な態様のうちの任意のものに使用することができる。エピトープクラスタ
（アナログからなるか又はアナログを包含する）が、「エピトープクラスタ」と題され、２０００年４月２８日に出願された米国特許出願番号第０９／５６１，５７１号に開示され、より完全に定義される。アナログを使用及び伝達する方法が、それぞれ「ＣＴＬ応答を誘導する方法」と題される米国特許出願番号第０９／３８０，５３４号及び同第０９／７７６，２３２号（公開番号第２００２０００７１７３号Ａ１）及びＰＣＴ出願番号第ＰＣＴＵＳ９８／１４２８９号（公開番号第ＷＯ９９０２１８３号Ａ２）に記載される。このような免疫療法のための有益なエピトープ選択法が、「抗原提示細胞におけるエピトープ同期化」と題され、２０００年４月２８日に出願された米国特許出願番号第０９／５６０，４６５号、２００１年１２月７日に出願された同第１０／０２６，０６６号（公開番号第２００３０２１５４２５号Ａ１）、２００１年１１月７日に出願された同第１０／００５，９０５号、「エピトープ発見法」と題される同第０９／５６１，０７４号、「エピトープクラスタ」と題され、２０００年４月２８日に出願された同第０９／５６１，５７１号、「癌のための抗血管新生製剤」と題され、２００２年３月７日に出願された同第１０／０９４，６９９号（公開番号第２００３００４６７１４号Ａ１）、「エピトープ配列」と題され、２００２年４月４日に出願された出願番号第１０／１１７，９３７号（公開番号第２００３０２２０２３９号Ａ１）及びＰＣＴＵＳ０２／１１１０１号（公開番号第ＷＯ０２０８１６４６号Ａ２）、「エピトープ配列」と題され、２００３年９月５日に出願された出願番号第１０／６５７，０２２号及びＰＣＴ出願番号第ＰＣＴ／ＵＳ２００３／０２７７０６号（公開番号第ＷＯ０４０２２７０９号Ａ２）に開示される。ワクチンプラスミドの全体の設計の態様は、「標的関連抗原のエピトープをコードする発現ベクター」と題され、２０００年４月２８日に出願された米国特許出願番号第０９／５６１，５７２号、「標的関連抗原のエピトープをコードする発現ベクター及びこれらの設計法」と題され、２００２年１１月７日に出願された同第１０／２９２，４１３号（公開番号第２００３０２２８６３４号Ａ１）、「標的関連抗原のエピトープをコードする発現ベクター」と題され、２００２年８月２０日に出願された同第１０／２２５，５６８号（公開番号第２００３０１３８８０８号）及び２００３年８月１９日に出願されたＰＣＴ出願番号第ＰＣＴ／ＵＳ２００３／０２６２３１号（公開番号第ＷＯ２００４／０１８６６６号）、並びに「プラスミド増幅における望ましくない複製中間体の回避」と題される米国特許番号第６，７０９，８４４号に開示される。特定の癌に対する免疫応答を導く上で特に有益な特異抗原の組み合わせは、「様々なタイプの癌のためのワクチンにおける腫瘍関連抗原の組み合わせ」と題される、２００３年６月１７日に出願された米国仮特許出願番号第６０／４７９，５５４号及び２００４年６月１７日に出願された米国特許出願番号第１０／８７１，７０８号並びにＰＣＴ出願番号第ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０１９５７１号（公開番号第ＷＯ２００４／１１２８２５号）に開示される。腫瘍血管新生に関連する抗原（例えば、ＰＳＭＡ、ＶＥＧＦＲ２、Ｔｉｅ−２）は、「癌のための抗血管新生製剤」と題され、２００２年３月７日に出願された米国特許出願番号第１０／０９４，６９９号（公開番号第２００３００４６７１４号Ａ１）に開示されるように、癌性疾患に関してもまた有用である。標的を定めた生物反応修飾物質の投与による免疫応答の誘発、維持及び操作方法は、２００４年１２月２９日に出願された米国仮出願番号第６０／６４０，７２７号に開示される。ＣＤ４＋細胞を介さずに免疫応答を誘導する方法は、２００４年１２月２９日に出願された米国仮出願番号第６０／６４０，８２１号で開示される。例示的な疾患、組織及び抗原並びに標的組織、標的細胞及び標的疾患に関するエピトープは、「ＣＴＬ応答の誘導法」と題され、２００１年２月２日に出願された米国出願番号第０９／７７６，２３２号（公開番号第２００２０００７１７３号）に記載される。例示的な方法は、「様々なタイプの癌の診断における腫瘍関連抗原の組み合わせ」と題され、２００４年６月１７日に出願された米国仮出願番号第６０／５８０，９６９号及び２００５年６月１７日に出願された米国特許出願番号第＿／＿号(代理人整理番号：MANNK.050A)に見出される。方法及び組成物はまた、「様々なタイプの癌のための組成物における腫瘍関連抗原の組み合わせ」と題され、２００４年１２月２９日に出願された米国仮出願番号第６０／６４０，５９８号に開示される。免疫応答性を評価、モニタリングする診断法と、アナログの利用を
含む免疫化との統合は、「診断と治療法の統合による、積極的な免疫治療の有効性の改善」と題され、２００４年６月１７日に出願された米国仮特許出願第６０／５８０，９６４号及び２００５年６月１７日に出願された米国特許出願番号第＿／＿号(代理人整理番号MANNK.040A)においてより完全に議論される。免疫原性ポリペプチドコードベクターは、「標的関連抗原のエピトープをコードする発現ベクター及びこれらの設計法」と題され、２００２年１１月７日に出願された米国特許出願番号第１０／２９２，４１３号（公開番号第２００３０２２８６３４号Ａ１）並びに「癌細胞及び腫瘍間質で発現する主要なエピトープ及びそれに次ぐ主要なエピトープに対する多価免疫応答を誘導する方法及び組成物」と題され、(代理人整理番号 MANNK.053PR)、２００５年６月１７日に出願された米国仮出願番号第＿／＿，＿号に開示される。さらに、重要な方法及び組成物を含む有用な開示は、「癌腫のための多価の同調−増幅免疫治療」と題され、２００５年６月１７日(代理人整理番号. MANNK.054PR)に出願された米国仮出願番号第＿／＿，＿号に見出される。さらなる方法、組成物、ペプチド及びペプチドアナログは、「ＳＳＸ−２ペプチドアナログ」及び「ＮＹ−ＥＳＯペプチドアナログ」と題され、２００４年６月１７日に出願された米国仮出願番号第６０／５８１，００１号及び同第６０／５８０，９６２号にそれぞれ開示される。この段落で言及されるこれらの出願の全ては、これらが教示する全てに関して、全体が参照として本明細書中に援用される。さらなるアナログ、ペプチド及び方法が、２００５年６月１７日に出願され、「ＳＳＸ−２ペプチドアナログ」と題される米国特許出願番号第＿／＿，＿号(代理人整理番号：MANNK.038A)、「ＮＹ−ＥＳＯ−１ペプチドアナログ」と題される米国特許出願番号第＿／＿，＿号(代理人整理番号：MANNK.039A)、及び「エピトープアナログ」と題される米国特許出願番号第＿／＿，＿号(代理人整理番号：MANNK.051A)に開示される。これらに制限はされないが、例としてこれらの参考文献は、これらがクラスＩＭＨＣ制限エピトープ、そのアナログ、アナログの設計、エピトープ及びアナログの使用、エピトープの使用法及び作製法、並びにこれらの発現のための核酸ベクターの設計及び使用について教示する事柄に関して、参照によって援用される。
抗原
ＭＨＣ制限様態においてＴ細胞によって認識される多くのエピトープを持つ抗原が存在し、これらに対する免疫応答の操作は、潜在的に治療性又は予防性を有する。本明細書中に記載されているＭＨＣ結合ペプチドのアナログを作製するための原則は、一般的にこれらの抗原及びそれらのエピトープのいずれかに適用可能である。本開示の具体的な焦点は、腫瘍関連抗原（ＴｕＡＡ）ＳＳＸ−２、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＰＲＡＭＥ、ＰＳＭＡ、チロシナーゼ、及びＭｅｌａｎ−Ａからのエピトープである。
Ｈｏｍ−Ｍｅｌ−４０としても既知であるＳＳＸ−２は、保存性の高い精巣癌抗原のファミリーの成員である(Gure, A.O.他 Int. J. Cancer 72:965-971, 1997、これは、本明細書にその全体が参照によって援用される)。このＴｕＡＡ抗原としての同定は、「メラノーマ特異抗原をコードする単離核酸分子及びその使用」と題される米国特許番号第６，０２５，１９１号で教示され、これはその全体が参照により本明細書に援用される。精巣癌抗原は多様な腫瘍に見出されるが、一般的に精巣を除く正常な成人組織には存在しない。ＳＳＸ−２は、滑膜肉腫、メラノーマ、頭部及び頸部癌、乳癌、結腸及び卵巣癌を含む多くの異なるのタイプの腫瘍で発現する。多様な癌におけるその幅広い発現に加えて、末期の疾患の患者におけるＳＳＸ−２は免疫原性でもある。さらに、転移性腫瘍の患者におけるこの抗原に対する自然発生的な体液性免疫応答及び細胞性免疫応答の証拠が存在し(Ayyoub M他, Cancer Res. 63(17):5601-6, 2003、Ayyoub M他 J Immunol. 168(4):1717-22, 2002)、これはその全体が参照により本明細書に援用される。２つのＨＬＡ−Ａ２制限Ｔ細胞エプトープが逆Ｔ細胞免疫、すなわちＳＳＸ−２41-49(Ayyoub M他 J Immunol. 168(4): 1717-22, 2002、「ＨＬＡ分子と結合する、ＳＳＸ又はＮＹ−ＥＳＯ−１分子において見出されるアミノ酸配列から成る単離ペプチド」と題される米国特許番号第６５４８０６４号、「エピトープ配列」と題される米国特許出願番号第１０／１１７，９３７号)
及びＳＳＸ−２103-111（Wagner C他 Cancer Immunity 3:18, 2003））を用いて近年同定され、これらはそれぞれその全体が参照により本明細書に援用される。両方のエピトープのＣ末端は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのプロテアソーム消化によって効率的に生成することができる。ＳＳＸ−２陽性の患者の腫瘍浸潤リンパ節由来の単離ＨＬＡ−Ａ*０２０１／ＳＳＸ−２41-49多量体+ＣＤ８+Ｔ細胞が高い機能性結合力を示し、効果的にＳＳＸ−２陽性腫瘍を認識することができるが、自然発生的に起こる免疫応答は、腫瘍の増殖を停止するのに十分ではなく、それはおそらくこれらの免疫応答が疾患の進行のかなり遅い段階まで発現せず、活性化したＴ細胞が十分な数存在しないためである。さらに、米国特許番号第６，５４８，０６４号（これは、その全体が参照により本明細書に援用される）は、ＳＳＸ−２エピトープのＰ２部位及びＰΩ部位の両方で、Ｔ又はＡ残基を置換することを記載している。
ＮＹ−ＥＳＯ−１は、多種多様な腫瘍において見られる精巣癌抗原であり、ＣＴＡＧ−１（精巣癌抗原−１）及びＣＡＧ−３（癌抗原−３）としても知られている。腫瘍関連抗原（ＴｕＡＡ）としてのＮＹ−ＥＳＯ−１は、「食道癌関連抗原をコードする単離核酸分子、抗原自体、及びそれらの使用」と題される米国特許第５，８０４，３８１号に開示されて、これは、その全体が参照により本明細書に援用される。広範な配列同一性を有する抗原をコードするパラロガスな遺伝子座であるＬＡＧＥ−１ａ／ｓ及びＬＡＧＥ−１ｂ／Ｌは、公的に入手可能なヒトゲノムのアセンブリ中に開示されており、選択的スプライシングを介して生じると結論付けられている。さらに、ＣＴ−２（又はＣＴＡＧ−２、精巣癌抗原−２）は、ＬＡＧＥ−１ｂ／Ｌの対立遺伝子、突然変異体又は配列不一致のいずれかであるように思われる。広範な配列同一性のために、ＮＹ−ＥＳＯ−１からの多くのエピトープはまた、これら他の抗原を発現している腫瘍に対して免疫性を誘導することができる。タンパク質は、アミノ酸７０までは事実上同一である。７１から１３４では、ＮＹ−ＥＳＯ−１とＬＡＧＥの間の同一性の最大長は６残基であるが、潜在的に交差反応可能な配列が存在する。そして、１３５から１８０まで、ＮＹ−ＥＳＯ及びＬＡＧＥ−１ａ／ｓは、ただ一つの残基以外は同一であるが、ＬＡＧＥ−１ｂ／Ｌは選択的スプライシングにより関連性がない。ＣＡＭＥＬ及びＬＡＧＥ−２抗原は、ＬＡＧＥ−１のｍＲＮＡに由来するが、選択的リーディングフレームに由来すると思われ、そのため関連性のないタンパク質配列が生じてしまう。つい最近、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ２７７３１５．５（その全体が参照により本明細書に援用される）ヒト染色体ＸのクローンであるＲＰ５−８６５Ｅ１８及びＲＰ５−１０８７Ｌ１９、完全配列は、この領域内の３つの独立遺伝子座を報告しており、ＬＡＧＥ１（ゲノムアセンブリ中のＣＴＡＧ−２に対応）、並びにＬＡＧＥ２−Ａ及びＬＡＧＥ２−Ｂ（両者ともゲノムアセンブリ中のＣＴＡＧ−１に対応）と標識されている。
ＮＹ−ＥＳＯ−１157-165は、「癌関連抗原をコードする単離核酸分子、抗原自体、及びその使用」と題される米国特許番号第６，２７４，１４５号においてＨＬＡ−Ａ２制限エピトープとして同定され、「エピトープ配列」と題される米国特許出願番号第１０／１１７，９３７号（公開番号第２００３０２２０２３９号）は、このＣ末端がｉｎ ｖｉｔｒｏでのアッセイにおいて、ハウスキーピングプロテアソームによって生成することを報告している。ＰΩでＡ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ、Ｆ、Ｍ、Ｗ又はＧを置換するアナログは、単独で、又は別の位置でＡと組み合わせて、「ＮＹ−ＥＳＯ−１ペプチド誘導体及びその使用」と題される米国特許番号第６，４１７，１６５号及び同第６，６０５，７１１号に開示されている。この段落で開示されている参考文献は、その全体が参照により本明細書に援用される。
ＭＡＰＥ、ＤＡＧＥ及びＯＩＰ４としても既知であるＰＲＡＭＥは、元々はメラノーマ抗原と思われていた。続いて、これはＣＴ抗原として認識されているが、多くのＣＴ抗原（例えば、ＭＡＧＥ、ＧＡＧＥ及びＢＡＧＥ）とは違い、これは急性脊髄性白血病で発現
する。ＰＲＡＭＥは、主として、限定された配列相同性を共有する仮想タンパク質から成るＭＡＰＥファミリーの成員である。ＴｕＡＡとしてのＰＲＡＭＥの実用性は、「腫瘍拒絶抗原前駆体ＤＡＧＥをコードする単離核酸分子及びその使用」と題される米国特許番号第５，８３０，７５３号で教示され、これは、その全体が参照により本明細書に援用される。「Ｔ細胞ペプチドエピトープ及び該選択されたエピトープを組み込むワクチンの選択法及び製造法」と題される米国特許出願番号第１０／１８１，４９９号（これは、その全体が参照により本明細書に援用される）は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの免疫プロテアソームによる消化を利用して、ＰＲＡＭＥ425-433を含む多様で潜在的なエピトープを同定する。
その全体が参照により本明細書に援用される、「前立腺特異的膜抗原」と題される米国特許番号第５，５３８，８６６号に記載されているＴｕＡＡであるＰＳＭＡ（前立腺特異的膜抗原）が正常な前立腺上皮によって、前立腺癌においてはより高いレベルで発現される。これはまた、非前立腺腫瘍の血管新生においても見出されている。したがって、ＰＳＭＡは、前立腺癌及び他の腫瘍の血管新生の両方を対象とするワクチンの基礎を形成することができる。この後者の考え方は、米国特許公開番号第２００３００４６７１４号、ＰＣＴ公開番号第ＷＯ０２／０６９９０７号、及び「癌のための抗血管新生ワクチン」と題され、２００１年３月７日に出願された米国仮特許出願番号第６０／２７４，０６３号並びに「癌のための抗血管新生製剤」と題され、２００２年３月７日に出願された米国出願番号第１０／０９４，６９９号においてより完全に記載され、これらはそれぞれその全体が参照により本明細書に援用される。上記公開書類及び出願書類で開示される教示及び実施形態は、本発明に関連があり、有用である主要物及び実施形態をサポートするように考慮される。簡潔に言えば、腫瘍は増殖する際、新生血管の内部成長させる。これは、血管新生しない腫瘍の中心部が一般的に壊死性(necrotic)であるので、成長を維持するために必要であると理解され、血管新生阻害剤は腫瘍の退行を引き起こすと報告されている。このような新生血管又は血管新生は、確立した血管で見出されない抗原を発現し、したがって、特異的に標的化することができる。血管新生抗原に対してＣＴＬを誘導することによって、血管は崩壊し、栄養物の腫瘍への流れ（及び腫瘍からの廃棄物の除去）を遮断し、退行を導くことができる。
ＰＳＭＡ ｍＲＮＡの選択的スプライシングもまた、Ｍｅｔ58で始まるタンパク質へと導き、これにより、その全体が参照により本明細書に援用される「選択的スプライシングされた前立腺特異的な膜抗原をコードする単離核酸分子、及びその使用」と題される米国特許番号第５，９３５，８１８号に記載されるように、ＰＳＭＡの推定膜アンカー領域を欠失させる。その全体が参照により本明細書に援用されるＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ２６１７１５である、ＰＳＭＡ様タンパク質と称されるタンパク質は、ＰＳＭＡのアミノ酸３０９〜７５０とほぼ同一であるが、異なる発現プロファイルを有する。したがって、より好ましいエピトープは、アミノ酸５８〜３０８に位置するＮ末端を有するエピトープである。ＰＳＭＡ288-297は、その全体が参照により本明細書に援用される「ＨＬＡ結合ペプチド及びその使用」と題されるＷＯ０１／６２７７６におけるＨＬＡ−Ａ２結合モチーフを保有するように同定される。ハウスキーピングプロテアソームによる消化及びＨＬＡ−Ａ２との実際の結合によるｉｎ ｖｉｔｒｏでのその製造は、「エピトープ配列」と題される米国特許出願番号第２００３−０２２０２３９号に開示されている。
チロシナーゼは、メラニン細胞分化の最も特異的なマーカの一つであると考えられているメラニン生合成酵素である。チロシナーゼはわずかな細胞型、主にメラニン細胞で発現され、しばしばメラノーマにおいて高レベルであることが分かった。ＴｕＡＡとしてのチロシナーゼの有用性は、その全体が参照により本明細書に援用される「一部の異常細胞がＨＬＡ−Ａ２／チロシナーゼ由来ペプチドの複合体を提示する細胞異常を患う個体を識別する方法、及びその個体の治療法」と題される米国特許第５，７４７，２７１号に教示されている。
ＭＡＲＴ−１（Ｔ細胞により認識されるメラノーマ抗原）とも呼ばれるＭｅｌａｎ−Ａは、メラノーマにおいて高いレベルで発現する別のメラニン生合成タンパク質である。ＴｕＡＡとしてのＭｅｌａｎ−Ａ／ＭＡＲＴ−１の有用性は、「メラノーマ抗原並びに診断法及び治療法におけるその使用」と題される米国特許番号第５，８７４，５６０号及び同第５，９９４，５２３号、並びに「ＨＬＡ−Ａ２により提示される少なくとも１つの腫瘍拒絶抗原へプロセッシングされる腫瘍拒絶抗原前駆体をコードする単離核酸配列」と題される米国特許番号第５，６２０，８８６号で教示され、これらは全てその全体が参照により本明細書に援用される。このＴｕＡＡからのエピトープを制限する免疫優勢ＨＬＡ−Ａ２は、Ｍｅｌａｎ−Ａ26-35である。これは、ハウスキーピングプロテアソームによって製造されることが示されており(Morel, S他 Immunity 12:107-117, 2000)、その全体が参照により本明細書に援用される。Ｐ２でＬを置換する改善されたアナログを含む標準アミノ酸を組み込む様々なアナログが、「ＨＬＡ分子と結合する単離ノナペプチド及び単離デカペプチド並びにそれらの使用」と題される米国特許番号第６，０２５，４７０号に開示され、これはその全体が参照により本明細書に援用される。生化学的安定性の改善という主目的を伴う非標準アミノ酸を組み込むアナログの使用が、Blanchet, J.-S.他, J. Immunol. 167:5852-5861, 2001で報告されており、これはその全体が参照により本明細書に援用される。
ＳＳＸ−２ ４１−４９アナログ
上述のように、ＳＳＸ−２41-49への応答を含む、癌患者におけるＳＳＸ−２への自然な免疫応答は、癌を制御するのに効果的ではない可能性がある。さらに、野生型ＳＳＸ−２41-49は、その臨床的潜在性をさらに制限することができる適当な免疫原性ペプチドにすぎない。スーパーアゴニストアナログの使用によって誘導されるより強いＳＳＸ−２特異的な免疫応答は、ＳＳＸ−２陽性腫瘍を有する患者に対して臨床的恩恵をもたらす。
したがって、一実施形態では、アナログは組成物中で使用され、被検体の免疫応答を刺激して、標的抗原を示す標的細胞に対する免疫応答を増大させることができる。上記実施形態は、腫瘍性疾患及びウイルス性疾患の治療及び予防における実用性を有すると考えられる。
野生型のＳＳＸ−２41-49は、ｉｎ ｖｉｖｏで効果的に腫瘍を除去することを妨げ得る適当な免疫原性ペプチドにすぎないので、方法が、より効果があるか又は改善された多様な特性を有するｄｅ ｎｏｖｏ設計ＳＳＸ−２41-49バリアントに使用された。より免疫原性のあるＳＳＸ−２アナログペプチドを使用することで、臨床的応答をより良くするために、より強い免疫応答を刺激すること及び／又は自然に起こる免疫応答を増幅することを可能にした。したがって、野生型エピトープに対する結合特性（親和性及びＨＬＡ−Ａ*０２０１／ペプチド複合体安定性）、免疫原性、抗原性及び交差反応性が、各アナログに関して分析され、改善された特性を同定した。いくつかの実施形態では、特性の改善とは、アナログが野生型よりもいくつかの目的に良好に使用することができるということを一般的に意味する。したがって、アナログは改善された結合、安定性又は改善された活性を示す必要はなく、このプロセスの或る特定の部分を媒介する能力の低減さえ示すことがあるが、それでもなお、別の方法では使用のために改善し得る。例えば、活性全てというわけではないが、いくつかの活性を維持するアナログは、野生型抗原に耐性があるヒトシステムにおいてより良好である。
これまでに、好適なアンカー残基を組み込むことによる天然腫瘍関連ペプチドエピトープの修飾は、ＨＬＡ分子と共に結合プロファイルの改善を伴うアナログを生成させ、免疫原性を増大させている。最も成功した例の１つは、Ｍｅｌａｎ−Ａ２６〜３５エピトープのＡ２７Ｌペプチドアナログである。「Ｍｅｌａｎ−Ａ／ＭＡＲＴ−１免疫優勢ペプチド
アナログを選択することによるｉｎ ｖｉｔｒｏでの特異的な腫瘍反応性ＣＴＬの生成の増大」Valmori他, J Immunol. 1998,160(4):1750-8、これはその全体が参照により本明細書に援用される。元のエピトープが２部位において最適なアンカーアミノ酸残基を欠いているので、元のエピトープはＨＬＡ−Ａ２分子と安定な複合体を形成することができなかった。修飾されたＡ２７Ｌ Ｍｅｌａｎ Ａ２６〜３５ペプチドアナログは、ＨＬＡ−Ａ２分子に対する結合プロファイルが明らかに増大し、その野生型より大きな免疫原性を示している。このアナログで患者に免疫性を付与することにより、細胞表面に提示される野生型のエピトープを認識できる強いＴ細胞免疫応答を引き起こすことができる。同様の修飾を、ＧＰ１００ ２０９〜２１７(「ＨＬＡ−Ａ*０２０１結合残基で修飾されたメラノーマ抗原ｇｐ１００由来のペプチドを有するメラノーマ反応性ＣＴＬの誘導の改善」Parkhurst他、J Immunol. 1996,157(6):2539-48、これは、その全体が参照により本明細書に援用される)、Ｈｅｒ−２ ３６９〜３７７(「ＭＨＣ接触残基の変更によるＨＥＲ−２／ｎｅｕプロトオンコジーンの免疫優勢エピトープの免疫原性の改善」Vertuani他、J Immunol. 2004, 172(6):3501-8、これはその全体が参照により本明細書に援用される)のような他の多くの腫瘍関連エピトープを用いることで得ることに成功している。
この時点までに、ＳＳＸ−２41-49アナログが多様な癌、特にＳＳＸ−２陽性癌及び／又は腫瘍を治療するためにＳＳＸ−２を基とするワクチンの開発にかなり有望であったにもかかわらず、このアナログは設計且つ研究されてこなかった。したがって、滑膜肉腫Ｘ切断点２（ＳＳＸ−２）の野生型配列に対するアナログの同定及び製造に使用することができる方法が本明細書中に開示される。この方法を使用して、アミノ酸２４１〜２４９の野生型の配列に基づく９５個の新規ＳＳＸ−２４１−４９アナログのパネルを多様な改善された特性で同定した。改善された特性には、クラスＩＭＨＣ及びＴ細胞受容体（ＴＣＲ）分子との結合、並びにＩＦＮ−γ分泌、細胞毒性、及び腫瘍細胞溶解のような生物反応が挙げられるが、これらに限定されない。野生型エピトープとの交差反応性を維持するという効果の改善を伴うペプチドが同定された。これらのアナログの中で、いくつかは、野生型ＳＳＸ−２４１−４９ペプチドのスーパーアゴニストバリアントであることが実証されており、そのアナログのいくつかはＨＬＡ−Ａ＊０２０１分子及び広範な安定性を有するペプチド−ＨＬＡ複合体に対して非常に高い親和性を有することが示されている。マウスをこれらのアナログで免疫化した場合、ＨＨＤトランスジェニックマウスにおけるＣＴＬ免疫応答の増大を誘導することができる。得られたＣＴＬは、ｉｎ ｖｉｖｏ及びｉｎ
ｖｉｔｒｏの両方でＡ２＋及びＳＳＸ−２＋腫瘍細胞系を効果的に溶解することができ、このアナログを使用して生じたＣＴＬが、細胞表面に自然発生的に提示された野生型ＳＳＸ−２４１−４９エピトープを認識することができることを示している。野生型ＳＳＸ−２４１−４９エピトープと比較して、アナログは癌ワクチンの開発のより良い候補物質である。
実施形態には、ヒト精巣癌（ＣＴ）抗原ＳＳＸ−２（ＳＳＸ−２41-49）のアミノ酸４１〜４９に対する配列に関連する９又は１０個のアミノ酸長の１つ又は複数のペプチドの集合が挙げられる。個々のペプチドの実施形態は、野生型の配列において定義された１つからいくつかのアミノ酸置換を有する。置換されたアミノ酸は、多様に通常遺伝的にコードされるアミノ酸の標準的なセット、これらの誘導体、これらのＤ−立体異性体、又は他の非標準Ｌ−アミノ酸の別の成員である。これらのアナログは、クラスＩＭＨＣ分子及びＴＣＲ分子並びに免疫応答における他の成分と、野生型エピトープの相互作用を研究するのに、また、免疫学的特性のさらなる最適化を伴うさらなるアナログを設計するのに有用である。上記アナログのいくつかの実施形態は、免疫学的特性が試験されているＨＬＡ−トランスジェニックマウスモデルにおいて、野生型エピトープと少なくとも同様の免疫学的特性を有する。ＳＳＸ−２が、耐性の程度が予測され得る自己抗原であるので、このようなペプチドはヒトにおいて有用であり、アナログにおけるアミノ酸の相違によって、野生型エピトープと交差反応性であるが、陰性選択を回避しているＴ細胞の集団を刺激する
のを助けることができる。様々なペプチドの実施形態は、ＭＨＣに対するより大きな親和性若しくはＭＨＣとのより大きな結合安定性を有し、野生型エピトープを認識するＴ細胞からと同程度のサイトカイン製造を誘導するのに、より大きなサイトカイン製造を誘導するか又はより小さなペプチド濃度を必要とし、より免疫原性があり、野生型エピトープに対する交差反応性細胞溶解応答を誘導又は増幅することができ、或いは耐性を破壊することができるという１つ又は複数の改善された免疫学的特性を有する。
一実施形態においてアナログは、Ｐ１、Ｐ２、Ｐ４、Ｐ６、Ｐ８、Ｐ９及びＰ１０から成る群から選択される残基における置換を少なくとも１つ有する。さらなる実施形態において、アナログは、Ｐ１、Ｐ２、Ｐ４、Ｐ６、Ｐ８、Ｐ９及びＰ１０から成る群から選択される残基における置換を少なくとも２つ有する。さらなる実施形態において、アナログは、Ｐ１、Ｐ２、Ｐ４、Ｐ６、Ｐ８、Ｐ９及びＰ１０から成る群から選択される残基における置換を少なくとも３つ有する。さらなる実施形態において、アナログは、Ｐ２部位及びＰ９部位における置換を有する。さらなる実施形態においてペプチドは、Ｐ１残基、Ｐ２残基及びＰ９残基における置換を有する。さらなる実施形態において、ペプチドアナログは、Ｐ１残基、Ｐ２残基及びＰ４残基における置換を有する。さらなる実施形態において、ペプチドアナログは、Ｐ１残基、Ｐ２残基及びＰ６残基における置換を有する。さらなる実施形態において、ペプチドアナログは、Ｐ１残基、Ｐ２残基及びＰ８残基における置換を有する。一実施形態では２つの置換が、特性の改善を引き起こす。さらなる実施形態では、１つの置換が、特性の改善を引き起こす。さらなる実施形態では３つの置換が、特性の改善を引き起こす。さらなる実施形態では１つ又は複数の置換が、特性の改善を引き起こすが、なお野生型の配列と交差反応す、野生型の配列を認識するＴＣＲによって依然として認識される。
一実施形態は、アナログを遊離させるようにプロセッシングすることができるエピトープアナログ配列を含むエピトープアレイ及び他のポリペプチドに関する。さらなる実施形態は、このようなポリペプチド又は単にアナログをコードする核酸、特にＤＮＡプラスミド、及びこれらの発現に関する。アナログ、アナログを含むポリペプチド、及びコード核酸は全て、免疫原性組成物、とりわけ、さらなる実施形態を構成する、リンパ管内輸送に適した組成物である。
アナログ設計
実施形態は、配列ＫＡＳＥＫＩＦＹＶの置換を含むＳＳＸ−２41-49ペプチドに関する
（図１参照）。さらなる実施形態では、アナログは一般的に配列ＫＡＳＥＫＩＦＹＶＹを有するＳＳＸ−２41-50十アミノ酸長ペプチドのアナログである。ペプチドを構成する残
基又はアミノ酸は、Ｎ末端からＣ末端まで番号を付けたペプチド内の位置を示すために、Ｐ１−Ｐ９又はＰ１−Ｐ１０として本明細書中に言及され、Ｐ１は9 mer（９アミノ酸長
）におけるＮ末端のリジンに対応し、Ｐ９はＰ１及びＣ末端のバリンに対応する。あるいは、残基は、これらが含まれる分子の主な活性を方向付ける。例えば、Ｐ２残基は、Ｎ末端の第１のアンカー分子として記載され、一方Ｐ９（又は十アミノ酸長ではＰ１０）は、第１のＣ末端のアンカーとして記載される。残基Ｐ４、Ｐ６及びＰ８は、最初にＴＣＲ相互作用に関係する。置換には、当業者に既知の標準アミノ酸及び非標準アミノ酸を含む任意のアミノ酸を使用することができる。多くの例示的なアミノ酸が本明細書中に開示されているが、本明細書中に開示される置換は、全ての推測される置換を含むリストを意味するものではなく、可能性のある置換の例示である。当業者は、本明細書中のアナログに使用するために購入又は化学的に製造される多くの他の非標準アミノ酸を、カタログ及び参照において見出すことができる。
多くの可能性のあるアナログは、Ｎ末端の第１のアンカー（Ｐ２部位）、Ｎ末端の第２のアンカー（Ｐ１部位）、Ｎ末端の第１及び第２のアンカー（Ｐ１部位及びＰ２部位）、Ｎ末端の第１／第２のアンカー（Ｐ１部位及びＰ２部位）、及びＣ末端第１のアンカー（Ｐ９部位）などにおいて、より良いＨＬＡ結合プロファイル及びより高い免疫応答を達成するためのペプチドアンカー残基の修飾により製造された。さらに、アンカー残基及びＴＣＲ接触残基における修飾を伴うペプチドが、自己抗原に対するＴ細胞耐性を回避するために製造され、これらの修飾には、Ｎ末端の第１の／第２のアンカー（Ｐ１部位及びＰ部位）及び第２のＴＣＲ認識部位（Ｐ４部位、Ｐ６部位及び／又はＰ８部位）での修飾、Ｎ末端の第１／第２のアンカー（Ｐ１部位及びＰ２部位）での修飾、並びにＣ末端の第１のアンカー（Ｐ９）及び第２のＴＣＲ認識部位（Ｐ４部位、Ｐ６部位及び／又はＰ８部位）での修飾が含まれた。さらに、十アミノ酸長アナログが生成された。
改善された特性を有するアナログを残基が最大に生成するであろう選択は、ＭＨＣペプチド相互作用の研究、ＴＣＲペプチド相互作用の研究及び当該技術分野で既知のこれまでのアナログの分析を必要とした。いくつかの残基は、最初に特定の相互作用を伴い、いくつかの残基は二次的な相互作用、又は三次的な相互作用を伴うことさえある。したがって、上記残基がどのようにこれらの分子と結合するかという知識は、上記分析に関係している。さらに、野生型残基のいくつかは、これらが目的とする相互作用に十分に働くという意味で好ましく、一方、他の野生型の残基は、相互作用にあまり十分に働かないという意味で好ましくない。したがって、一実施形態では、好ましくない残基が置換され得る。例えば、Ｃ末端のバリンはＨＬＡ分子との強い相互作用を生むので、一般的に好ましいアンカー残基であり、よって、この残基を置換するのはあまり好ましくない。しかし、有益なアンカー残基を組み込むことによる野生型の腫瘍関連ペプチドエピトープの修飾が、ＨＬＡ分子との結合プロファイルの改善及び免疫原性の増大を伴うアナログを生成する。最も成功した例の１つは、Ｍｅｌａｎ−Ａ２６−３５エピトープのＡ２７Ｌペプチドアナログである(Valmori D他 J Immunol. 160(4):1750-8,1998、これはその全体が参照により本明細書に援用される)。元のエピトープは部位２で最適なアンカー残基を欠くので、ＨＬＡ−Ａ２分子と安定な複合体を形成することはできなかった。対照的に、修飾されたＭｅｌａｎ Ａ26-35Ａ２７Ｌペプチドアナログは、ＨＬＡ−Ａ２分子との結合プロファイルが明白に増大し、野生型よりも大きい免疫原性を示した。このアナログを用いて、患者を免疫化することにより、細胞表面で提示された野生型エピトープを認識することができる、強いＴ細胞免疫応答を生じた。ＧＰ１００ ２０９〜２１７(Parkhurst MR他J Immunol. 157(6):2539-48,1996、これは、その全体が参照により本明細書に援用される)、Ｈｅｒ−２ ３６９〜３７７(Vertuani S他J Immunol. 172(6):3501-8,2004、これはその全体が参照により本明細書に援用される)のような他の多くの腫瘍関連エピトープを用いることにより、同様の修飾が得られた。
置換する残基の個数の選択には、野生型のエピトープを認識するＴ細胞によって依然として認識されるであろうエピトープの質を十分に維持しつつ、より良好な残基を置換することが必要とされる。したがって、一実施形態では、１つ又は２つの置換が野生型のペプチドで為される。さらなる実施形態では、野生型のペプチドとの交差反応性を依然として維持しつつ、２つよりも多い置換が野生型のペプチドで為される。
したがって、一般的には、ＴＣＲ認識に関係するペプチドの一部は、野生型エピトープと交差反応するとともに、免疫原性が改善されるように置換されることが望ましい。例えば、免疫原性の増大を示すペプチドが好ましい。Ｎ末端のＰ２すなわち第２のアミノ酸は、改善した結合特性により、改善した免疫原性を生むプロセスに最初に関わると考えられているので、好ましい置換部位であり、目的の置換を同定するために多くの修飾が例示的なアナログにおいて為された。同様の考え方が、ＭＨＣ結合にも重要であるカルボキシ末端部位、すなわちＰΩにもあてはまる。
したがって、一実施形態において、アナログには、野生型のアラニンをより疎水性の残
基に置換する、Ｐ２残基における置換が挙げられる。さらなる実施形態では疎水性残基はまた、より巨大な側鎖を有することができる。さらなる実施形態では、Ｐ１の残基は、より疎水性の残基で置換することができる。さらなる実施形態では、Ｐ１及びＰ２残基の両方がより疎水性の残基で置換することができる。さらなる実施形態では、Ｐ１、Ｐ２及びＰ９の残基の少なくとも１つを置換することができる。さらなる実施形態では、Ｐ１、Ｐ２及びＰ９の残基の少なくとも２つを置換することができる。さらなる実施形態では、Ｐ１、Ｐ２、Ｐ９、Ｐ４、及びＰ６での残基の少なくとも２つを、ＴＣＲ結合に関連する１つ又は複数の残基を含んで、置換することができる。
さらに、ＴＣＲ又はＭＨＣ分子との結合を二次的にのみ伴うこれらの残基の置換が、有益である。例えば、二次的なＴＣＲ結合アミノ酸の置換は、依然として結合し、応答を生じ、且つＭＨＣ分子との結合を妨げないが、好ましくは自己抗原の耐性問題を克服するアナログを生成することができる。これは、癌を有する患者が抗原に部分的に耐性化し得るので有用である。したがって、この耐性を克服するために、いくつかの活性を維持するアナログが、より改善された免疫原性を有するアナログより好ましい可能性があるが、それは、このアナログが免疫系により「自己」として認識される可能性が低いからである。
１．Ｎ末端に近接した第１のアンカー修飾（Ｐ２）
Ｎ末端の第１のアンカーは、ペプチドの第２のＮ末端アミノ酸であり、Ｎ末端に近接した第１のアンカーである。これは、最初にＭＨＣ分子との相互作用に関わり、置換が結合及び安定性の改善をもたらし得る。しかし、これはまた、ＴＣＲ相互作用にも二次的に関わり得る。したがって、この部位の置換は、ＭＨＣ分子との相互作用の改善並びにＴＣＲとの相互作用の改善を伴うペプチドをもたらし得る。
野生型の配列におけるこの部位で見出されるアラニンは、一般的にＭＨＣ分子との相互作用に関して好ましくないと考えられている。したがって、好ましい実施形態のアナログは、この部位での置換を有する。一実施形態では、野生型の配列において見出された元のＡｌａ４２は、より疎水性のアミノ酸で置換することができる。標準アミノ酸及び非標準アミノ酸を含む、利用可能であるか又は当業者に既知である任意のものを含めた、より疎水性の任意のアミノ酸を使用することができる。さらなる実施形態では、元のＡｌａ４２は、巨大な側鎖も保有しているより疎水性のアミノ酸で置換される。より疎水性のアミノ酸の例としては、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、α−アミノ酪酸、ノルロイシン及びノルバリンが挙げられるが、これらに限定されない。
Figure 0005166025
２．Ｎ末端の第２のアンカー修飾（Ｐ１）
Ｎ末端の第２のアンカーは、Ｎ末端の第１のアミノ酸である。この残基は、Ｌｙｓ４１であり、ＨＬＡ−Ａ*０２０１分子との相互作用における第２のアンカー残基として定義される。しかし、これはまた、Ｔ細胞受容体との相互作用に或る程度関与する。したがって、この位置の修飾は、より免疫原性で、腫瘍ワクチンの開発により好適ないくつかのヘテロクリティックアナログを生成することができる。この位置でのリジンが一般的に好ましいと考えられるが、置換は特性の大きな改善を伴う。
したがって、一実施形態では、野生型の配列において見出される元のＬｙｓ４３はより疎水性のアミノ酸で置換することができる。標準アミノ酸及び非標準アミノ酸を含む、利用可能であるか又は当業者に既知である任意のものを含めた、より疎水性の任意のアミノ酸を使用することができる。さらなる実施形態では、Ｌｙｓ４３は芳香族アミノ酸で置換することができる。より疎水性のアミノ酸の例としては、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ及びＤ−Ｌｙｓが挙げられるが、これらに限定されない。
Figure 0005166025
３．Ｎ末端の第１及び第２の修飾（Ｐ２及びＰ１）
一実施形態では、第１及び第２のアンカー残基の両方が置換され、ＨＬＡ分子に対する結合親和性の改善をもたらした。さらなる実施形態では、２重の置換が、ＨＬＡ分子に対する結合安定性が改善した。さらなる実施形態では、結合及び／又は安定性が改善されず、低減すらする場合もあったが、耐性化された個体による活性又は認識のような、分子の他の特性が改善された。
Figure 0005166025
４．Ｎ末端の第１／第２のアンカー及びＣ末端の第１の修飾（Ｐ２、Ｐ１及びＰ９）
野生型ペプチドのＣ末端のＶａｌは、一般的に好ましいアンカー残基であり、最初にＭＨＣ分子との相互作用に関わる。しかし、どのアミノ酸が第１及び第２のＮ末端の修飾を伴うアナログを改善するかを同定するために、置換が行われた。これらのＣ末端の置換は、1つ又は複数のＮ末端の修飾なしでも使用することができる。
これらの修飾が、結合親和性及び安定性を改善し、いくつかの場合には、交差反応性が低減したアナログをもたらすことが示された。このように、いくつかの実施形態では、Ｃ末端への置換は、交差反応性を低減させることなく、結合及び／又は安定性の改善を伴うペプチドをもたらした。しかし、別の実施形態では、Ｃ末端への置換が同程度又は低減した交差反応性と共に、結合及び／又は安定性の改善を伴うペプチドをもたらした。各分子は、或る特定の場合又は或る特定の患者において使用することができる。一実施形態では、Ｃ末端のバリンが大きな脂肪族アミノ酸で置換される。
Figure 0005166025
５．Ｎ末端の第１／第２のアンカー及びＴＣＲ残基修飾
ＴＣＲ部位は、一般的にＰ４、Ｐ６及びＰ８残基として認識され、ＴＣＲとの結合に関わる第１の残基である。しかし、他の残基も、程度低いものの相互作用に関わる。一実施形態では、ＴＣＲ相互作用に最初に関わる１つ又は複数の部位を、相互作用を増大するために置換することができる。おそらく、これらの置換は、ＭＨＣ分子との結合を妨げないヘテロクリティックアナログを生成することができ、野生型ペプチドの耐性問題を克服することができる。さらなる実施形態では、ＴＣＲ置換の少なくとも１つは、Ｐ１、Ｐ２及び／又はＰ９部位での少なくとも１つの置換を含むことができる。さらなる実施形態では、Ｐ４、Ｐ６及びＰ８部位での任意の１つ又は複数の置換は極性アミノ酸である。さらなる実施形態では、置換はＰ８部位での芳香族アミノ酸である。さらなる実施形態では、置換はＰ６部位での巨大脂肪族側鎖を有するアミノ酸である。さらなる実施形態では、置換は相互作用を保つために大きな側鎖を有するアミノ酸である。
Figure 0005166025
６．Ｃ末端アミド
いくつかの実施形態では、Ｃ末端の残基が遊離型カルボン酸の場所でアミドを含むように修飾することができる。したがって、例えば、ペプチドが９−ｍｅｒ（九アミノ酸長）である場合、Ｐ９残基が修飾され得る。ペプチドが１０−ｍｅｒ（十アミノ酸長）である場合、Ｐ１０
残基が修飾され得る。好ましくは、これは、血液、リンパ液及びＣＮＳを含むが、これらに限定されない生体媒質中で安定性が増大したペプチド又はアナログをもたらす。好ましくは、ペプチドは他の必要な活性を維持し、ワクチン接種の使用に適したアナログをすなわちイムノゲンとしてもたらすことができる。
Figure 0005166025
７．10 mer（１０アミノ酸長）
一般的なＭＨＣ結合ペプチドの長さは、約８〜約１１のアミノ酸長で変化する。しかし、これまでに使用されたＨＬＡ−Ａ*０２０１の多くは、９−ｍｅｒｓ（九アミノ酸長）
又は１０−ｍｅｒｓ（十アミノ酸長）である。したがって、一実施形態では、アナログは野生型の配列ＳＳＸ−２41-50のアナログである。しかし、野生型１０−ｍｅｒが正確な
結合モチーフを有さず、免疫学的活性を示さないので、１０−ｍｅｒはＰ１０部位におけるアミノ酸の置換並びに様々な野生型及びアナログの効果の同定によって作り出された（図１参照）。
８．残存する残基
図１Ａ及び図１Ｂに関して、任意の残基もまた保存的アミノ酸で置換することができる。保存的置換は、効果を生み出すことのできる上記置換のいずれかと対になり得る。あるいは保存的置換は、一次的、二次的又は三次的なレベルでさえ、何らかの活性に関係しているとは考えられない残基で特異的である。このような残基には、Ｐ３、Ｐ５及びＰ７が挙げられる。アナログを生成するために、例えばＰ３部位のセリンをアラニン又はスレオニンで置換することができる。一般的には、このような保存的置換は、アナログの活性に有意な影響を与えないが、いくつかの実施形態では、これらはある特定の活性を増大又は低減する。
ＮＹ−ＥＳＯ−１157-165アナログ
アナログの設計の多様な実施形態及び態様に関する多くの特性が、一般的に又はＳＳＸ−２エピトープに適用されるように、上記に開示されている。このような開示はまた、このエピトープ及びこれに続くエピトープに適用可能であるということを理解すべきである。簡潔にするために、このような開示を明確に再び述べることを最小限にとどめる。
いくつかの実施形態は、ＭＨＣクラスＩ制限Ｔ細胞エピトープＮＹ−ＥＳＯ−１157-165のアナログ、ＳＬＬＭＷＩＴＱＣ（配列番号１）、エピトープアナログを提示するためにｐＡＰＣによってプロセッシングすることができるこれらのアナログを含むポリペプチ
ド、及びアナログを発現する核酸に関する。このアナログは、野生型のエピトープに比べて同程度又は改善された免疫学的特性を有する。
一実施形態は、置換を包含する特異的な配列と共に、ＮＹ−ＥＳＯ−１157-165のアナログを誘導体化及び改善する方法に関する。アナログは、置換を少なくとも１つ含むが、標準アミノ酸又は非標準アミノ酸を単独で又は様々な組み合わせで含む複数の置換を有する。アナログは、特性が維持又は改善されたペプチドをもたらす。
エピトープＮＹ−ＥＳＯ−１157-165は、ＮＹ−ＥＳＯ−１発現細胞系に対するエピトープ特異的なＴ細胞活性を測定することによって、ＮＹ−ＥＳＯ−１発現細胞系で提示されることが示されており(Jaeger, E他 J. Exp. Med. 187:265-270,1998、「癌関連抗原をコードする単離核酸分子、抗原自体、及びこれらの使用」と題される米国特許番号第６，２７４，１４５号)、これはその全体が参照により本明細書に援用される。ペプチドＮＹ−ＥＳＯ−１157-165の物理化学的特性を改善する方法が、本明細書にその全体が参照により援用される「ＮＹ−ＥＳＯ−１ペプチド誘導体及びその使用」と題される米国特許番号第６，４１７，１６５号）に記載されており、ＭＨＣとの相互作用を維持又は増大し、活性を妨げるジスルフィドＣ−Ｃ結合形成を妨げるような特性のない、他のアミノ酸を有する末端のシステインの交換から成る。しかし、Ｃ末端システイン残基の唯一の操作は、主要組織適合性（ＭＨＣ）及び／又はＴ細胞受容体（ＴＣＲ）結合に関するペプチド全体の、複数の残基を最適化するという利点を相殺する。したがって、Ｃｙｓ残基を変異させるという実用性を越えて、ペプチド全体のさらなるアミノ酸を変異させるのにかなり多くの機会が存在する。例えば、置換は、治療におけるより効果的な適用を可能にする方法において、ＭＨＣ及び／又はＴＣＲとの結合をさらに最適化するのに使用することができる。
いくつかの実施形態は、ヒト精巣癌（ＣＴ）抗原ＮＹ−ＥＳＯ−１（ＮＹ−ＥＳＯ−１157-165）のアミノ酸１５７〜１６５の配列における９又は１０個のアミノ酸長の１つ又は複数のペプチドの集合に関する。
アナログ設計
アナログは、一般的に配列ＳＬＬＭＷＩＴＱＣ（配列番号１）を有するＮＹ−ＥＳＯ−１157-165のアナログである。野生型のアミノ酸が好ましいか、好ましくないかの分析には、他のペプチドとＭＨＣ又はＴＣＲの相互作用に関するこれまでの分析を使用した。例えば、Ｃ末端のシステインは、ＨＬＡ分子との強い相互作用を生み出さないので、一般的には好ましくないアンカー残基であり、したがって、この残基を置換することは非常に好ましい。しかし、Ｐ１部位のセリンは一般的に好ましいにも関わらず、芳香族化合物を置換することにより、特性が改善されたペプチドを製造することができることが見出された。さらに、Ｐ２部位のロイシンは一般的にこのましいが、疎水性及び／又は巨大なアミノ酸の置換は特性が改善されたペプチドをもたらした。最初にＴＣＲとの相互作用を伴う残基（Ｐ４、Ｐ６及びＰ８）は、Ｐ８においては、芳香族化合物が一般的に有益な特性を有するペプチドを製造した。
好ましい一実施形態は、Ｐ２部位における置換を有するアナログに関する。好ましくは、置換は疎水性の残基である。さらに好ましくは、置換は巨大な疎水性の残基である。さらなる実施形態ではＰ１の残基は、より疎水性の残基で置換される。さらなる実施形態ではＰ１及びＰ２残基は両方とも、より疎水性の残基で置換される。さらなる実施形態では、Ｐ１、Ｐ２及びＰ９の残基の少なくとも１つが置換される。さらなる実施形態では、Ｐ１、Ｐ２及びＰ９の残基の少なくとも２つが置換される。さらなる実施形態では、ＴＣＲ結合に関わる１つ又は複数の残基を含むＰ１、Ｐ２、Ｐ９、Ｐ４及びＰ６の残基の少なくとも２つが置換される。さらなる実施形態では、Ｐ８が残基を芳香族化合物で置換される
。以下の置換の例は、図１３Ａ〜図１３Ｃに示される。
１．Ｎ末端に近接した第１のアンカー修飾（Ｐ２）
Ｎ末端の第１のアンカーは、ペプチドの第２のＮ末端アミノ酸であり、したがって、Ｎ末端に近接した第１のアンカーである。元のロイシン１５８は、ＮＨＣ分子との結合に関して「好ましくない」とは考えられないが、置換により結合が改善されたペプチドを製造することができる。したがって、一実施形態では、野生型の配列中の元のＬｅｕ１５８は、同程度又はより疎水性のアミノ酸で置換される。標準アミノ酸及び非標準アミノ酸などの、利用可能であるか又は当業者に既知のものを含めた、任意の疎水性アミノ酸を利用することができる。さらなる実施形態では、元のＬｅｕ１５８は巨大な側鎖を有するより疎水性のアミノ酸で置換される。より疎水性のアミノ酸の例としては、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、α−アミノ酪酸、ノルロイシン及びノルバリンが挙げられるが、これらに限定されない。さらに、ナフタール側鎖もまた置換される。好ましくは、置換によりＨＬＡ分子との結合及び安定性の改善がもたらされる。しかし、この残基は二次的又は三次的にＴＣＲ相互作用に関わり、置換はまたＴＣＲによる認識の改善をもたらす。
２．Ｎ末端の第２のアンカー修飾（Ｐ１）
Ｎ末端の第２のアンカーは、Ｎ末端の第１のアミノ酸すなわちＰ１である。この残基は多数の相互作用に関係する。Ｓｅｒ１５７の残基は、ＨＬＡ−Ａ*０２０１分子との相互作用における第２のアンカー残基として定義され、これはまた、Ｔ細胞受容体との相互作用に或る程度関与する。したがって、この部位の修飾は、より免疫原性であるとともに腫瘍ワクチンの開発により好適な、いくつかのヘテロクリティックアナログを生成する。したがって、置換は広範な質の改善をもたらし得る。
セリンは、「好ましくない」とは考えられてはいないが、多くの置換はペプチドの質の改善をもたらす。したがって、一実施形態では、野生型配列中の元のＳｅｒ１５７が、より疎水性のアミノ酸で置換される。標準アミノ酸及び非標準アミノ酸などの、利用可能であるか又は当業者に既知のものを含めた、任意のより疎水性のアミノ酸を利用することができる。より疎水性のアミノ酸の例には、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、及びＤ−Ｌｙｓが挙げられるが、これらに限定されない。
３．Ｎ末端の第１の修飾及び第２の修飾（Ｐ２及びＰ１）
一実施形態では、第１及び第２のアンカー残基の両方が置換され、ＨＬＡ分子に対する結合親和性の改善をもたらした。さらなる実施形態では、２重の置換が、ＨＬＡ分子に対する結合の安定性が改善された。さらなる実施形態では、結合及び／又は安定性が改善されず、低減する場合もあったが、耐性化された個体による活性又は認識などの、分子の他の特性が改善された。
４．Ｎ末端の第１／第２のアンカー及びＣ末端の第１の修飾（Ｐ２、Ｐ１及びＰ９）
野生型ペプチドのＣ末端のシステインは一般的に好ましくないアンカー残基である。この残基は最初にＭＨＣ分子との相互作用に関わるので、ＭＨＣ分子とのより強い相互作用をもたらす残基を置換することが好ましい。したがって、置換は、結合親和性及び安定性の改善を示し、いくつかの場合では、交差反応性の低減を伴うアナログをもたした。いくつかの実施形態では、Ｃ末端への置換は交差反応性を低減することなく、結合及び／又は安定性の改善を伴うペプチドをもたらす。しかし、別の実施形態では、Ｃ末端への置換は、同程度又は低減した交差反応性と共に、結合及び／又は安定性の改善を伴うペプチドをもたらす。この残基の置換は、ペプチドの改善をもたらすことがこれまでに示されているので、好ましくは、ＭＨＣ分子との相互作用並びにＴＣＲによる認識のような、他の相互作用が改善されたペプチドを製造することができる。したがって、いくつかの実施形態では、Ｃ末端の置換は少なくとも１つの他の置換と対になる。Ｃ末端へのアミノ酸置換の例
には、バリン、リジン、アラニン、及びイソロイシンが挙げられるが、これらに限定されない。
５．Ｎ末端の第１／第２のアンカー及びＴＣＲ残基修飾
ＴＣＲとの相互作用に関わる第１の残基は、一般的にＰ４残基、Ｐ６残基、及びＰ８残基として認識される。しかし、他の残基はまた、それほどではないにせよ相互作用を関わる。一実施形態では、相互作用の改善をもたらすために、ＴＣＲ相互作用を最初に関わる１つ又は複数の部位が置換される。好ましくは、これらの置換は、ＭＨＣ分子と結合することを妨げないが、野生型ペプチドの耐性問題を克服することができるヘテロクリティックアナログを生じることができる。一実施形態では、少なくとも１つのＴＣＲ置換は、Ｐ１部位、Ｐ２部位及び／又はＰ９部位での置換を少なくとも１つ含む。一実施形態では、ある程度の極性を有するアミノ酸を、Ｐ４、Ｐ６、及びＰ８で置換することができる。さらなる実施形態では、芳香族化合物であるアミノ酸をＰ８部位で置換することができる。
６．Ｃ末端アミド
いくつかの実施形態では、Ｃ末端残基を、遊離型カルボン酸の変わりにアミドを含むように修飾することができる。したがって、例えば、ペプチドが９−ｍｅｒ（九アミノ酸長）である場合、Ｐ９残基が修飾される。ペプチドが１０−ｍｅｒ（十アミノ酸長）である場合、Ｐ１０残基が修飾される。好ましくは、これは血液、リンパ液、及びＣＮＳを含むが、これらに限定されない生体媒質において、安定性が増大したペプチド又はアナログをもたらす。好ましくは、ペプチドは他の活性を維持し、ワクチン接種の使用に適したアナログ又はイムノゲンとしてもたらすことができる。
７．10 mer（１０アミノ酸長）
一般的なＭＨＣ結合ペプチドの長さは、約８〜約１１のアミノ酸長である。しかし、これまでに使用されたＨＬＡ−Ａ*０２０１の多くは、９−ｍｅｒｓ（九アミノ酸長）又は
１０−ｍｅｒｓ（十アミノ酸長）である。したがって、一実施形態では、アナログは野生型配列ＮＹ−ＥＳＯ−１157-166の１０−ｍｅｒである。しかし、野生型１０−ｍｅｒが
正確な結合モチーフを有さず、免疫学的活性を示さないので、１０−ｍｅｒはＰ１０部位でのアミノ酸の置換並びに様々な野生型及びアナログの効果の同定によって作り出された（図１３Ａ〜図１３Ｃ参照）。一実施形態では、野生型のＣ末端で付加又は置換される残基は、ノルバリン、ロイシン、イソロイシン、バリン及びアラニンから成る群から選択される。
８．残存残基
図１３Ａ及び図１３Ｃに関して、任意の残基もまた保存的アミノ酸で置換することができる。保存的置換は、効果を生み出すことのできる上記置換のいずれかと対になり得る。あるいは保存的置換は、一次的、二次的又は三次的なレベルでさえ、何らかの活性に関係しているとは考えられない残基で特異的である。このような残基には、Ｐ３、Ｐ５及び／又はＰ７が挙げられ得る。保存的置換は当業者に既知であるが、例えばＰ３部位のロイシンは、アナログを製造するためにアラニン又はスレオニンで置換される。一般的には、このような保存的置換は、アナログの活性に有意な影響を与えない。しかし、いくつかの実施形態では、これらはある特定の活性を増大又はある特定の活性を低減し得る。既知の相互作用のために、このような保存的置換が活性のいずれかへの有意な影響を有するであろうということは考えにくい。
ＰＳＭＡ288-297アナログ
アナログの設計の多様な実施形態及び態様に関する多くの特性が、一般的に又は特定のエピトープに適用されるように、上記に開示されている。このような開示はまた、このエピトープ及びこれに続くエピトープに適用可能であるということを理解すべきである。簡潔にするために、このような開示を明確に再び述べることを最小限にとどめる。
いくつかの実施形態は、ＭＨＣクラスＩ制限Ｔ細胞エピトープＰＳＭＡ288-297のアナログ、ＧＬＰＳＩＰＶＨＰＩ、エピトープアナログを提示するためにｐＡＰＣによってプロセッシングすることができるこれらのアナログを含むポリペプチド及びアナログを発現する核酸に関する。このアナログは、野生型のエピトープに比べて同程度又は改善された免疫学的特性を有する。ヒト癌細胞によるこのエピトープの提示を立証する証拠は、以下の実施例３２で提示される。
一実施形態は、置換を包含する特異的な配列を持つＰＳＭＡ288-297のアナログを誘導体化及び改善する方法に関する。アナログは、置換を少なくとも１つ含むが、標準アミノ酸又は非標準アミノ酸を単独又は様々な組み合わせで含む複数の置換を有する。アナログは、特性が維持又は改善されたペプチドをもたらす。
いくつかの実施形態は、ヒトＰＳＭＡのアミノ酸２８８〜２９７に対する配列に関する９又は１０個のアミノ酸長の１つ又は複数のペプチドの集合に関する。
アナログ設計
いくつかの実施形態では、ＰＳＭＡ288-297アナログは配列ＧＬＰＳＩＰＶＨＰＩの置換を含む。以下の実施例２の表７に示されるように、結合モチーフのデータに関する参考資料は、Ｐ２アンカー残基が、Ａ２．１制限エピトープの任意の部位における親和性に最も大きく寄与をすることを示している。この場合、Ｐ２部位のアミノ酸は、ロイシンが好ましい。ＰΩアンカー残基は、イソロイシンが好ましい。Ｔ２細胞アッセイシステム（図示せず）を使用したｉｎ ｖｉｔｒｏにおける結合の研究により、天然のペプチドは、一般的に、特にＳＳＸ−２及びＮＹ−ＥＳＯ−１に比べて優れた結合特性を有することが示されている。エピトープは、比較的低い濃度で有意な結合を示したが、これは、飽和状態に向かっての比較的緩やかな上昇と相関があった。野生型のエピトープは改善することができる。表７及び表８で示される分析は平均値であり、特定の配列における残基の挙動は、平均値からそれる。上記で検討されたＳＳＸ−２及びＮＹ−ＥＳＯ−１エピトープのＮｌｅ及びＮｖａで得られた好ましい結果と一致しているので、Ｎｌｅ及びＮｖａはまた、ＰＳＭＡエピトープのために上手く使用することができる。最終的には、エピトープに対するどのような耐性をも避けるのに役立つ代替物と相関がある場合、同様の結合特性であっても、ペプチドの免疫原性を効果的に増大することができる。トランスジェニックマウスモデルにおいて、天然のペプチドはエピトープに対する耐性を反映し得る程度の免疫原性（例えば、実施例３５参照）しかなく、このエピトープが由来するＰＳＭＡ領域がマウスとヒトＰＳＭＡとの間で同一である。
１．Ｎ末端に近接した第１のアンカー修飾（Ｐ２）
上記したように、このエピトープのＰ２部位における天然残基は、通常、遺伝的にコードされたアミノ酸の中で最適な残基であるが、他の好ましい疎水性残基又は巨大な疎水性残基の効果が、結合、耐性破壊及び交差反応性免疫の潜在的な改善のために研究された。例示的な置換には、Ｍｅｔ、Ｉｌｅ、Ｇｌｎ、Ｖａｌ、Ｎｖａ、Ｎｌｅ及びアミノ酪酸（Ａｂｕ）が挙げられる。
２．Ｎ末端の第２のアンカー修飾（Ｐ１）
Ｎ末端の第２のアンカーは、Ｎ末端の第１のアミノ酸である。天然のＧｌｙがこの位置であることはわずかに好ましいにすぎない。様々な観察（例えば、表７及び表８参照）がエピトープを改善する潜在性を有するアミノ酸には、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ａｂｕ及びサルコシン（Ｓａｒ、つまりＮ−メチルグリシン）が挙げられることを示す。
３．Ｃ末端の第１のアンカー修飾（ＰΩ）
この位置での天然のＩｌｅは一般的に好ましいが、最適な残基ではない。この位置での置換は結合を改善することができる。例示的な置換には、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｎｖａ、及びＮｌｅが挙げられる。
４．第２のアンカー及びＴＣＲ調査
最後から第２の部位（ＰΩ−１）は、第２のアンカー及びＴＣＲ相互作用部位の両方の役割を果たす。Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ及びＴｈｒの置換は、ＴＣＲ相互作用へのこれらの最初の効果を有するが、これらはまた、結合の改善に寄与する。Ｐ３は、結合及び免疫原性の両方をもたらし得る別の位置である。この位置でのＴｒｐの置換は、結合及び免疫原性の両方を改善する。
さらなる実施形態は、単独の置換で得られる様々な効果の組み合わせ、相乗作用、阻害のための複数の位置での置換の組み合わせに関する。
ＰＲＡＭＥ425-433アナログ
アナログの設計の多様な実施形態及び態様に関する多くの特性が、一般的に又は特定のエピトープに適用されるように、上記に開示されている。このような開示はまた、このエピトープ及びこれに続くエピトープに適用可能であるということを理解すべきである。簡潔にするために、このような開示を明確に再び述べることを最小限にとどめる。
いくつかの実施形態には、ＭＨＣクラスＩ制限Ｔ細胞エピトープＰＲＡＭＥ425-433のアナログ、ＳＬＬＱＨＬＩＧＬ、エピトープアナログを提示するためにｐＡＰＣによってプロセッシングすることができるこれらのアナログを含むポリペプチド、及びアナログを発現する核酸が含まれる。このアナログは、野生型エピトープに比べて同程度又は改善された免疫学的特性を有する。ヒト癌細胞によるこのエピトープの提示を立証する証拠は、以下の実施例３９で提示される。
一実施形態は、置換を包含する特異的な配列を持つＰＲＡＭＥ425-433のアナログを誘導体化及び改善する方法に関する。アナログは、置換を少なくとも１つ含むが、標準アミノ酸又は非標準アミノ酸を単独又は様々な組み合わせで含む複数の置換を有する。アナログは、特性が維持又は改善されたペプチドをもたらす。
いくつかの実施形態は、ヒトＰＲＡＭＥ配列のアミノ酸４２５〜４３３に対する配列に関する９又は１０個のアミノ酸長の１つ又は複数のペプチドの集合に関する。
アナログ設計
いくつかの実施形態は、配列ＳＬＬＱＨＬＩＧＬの置換を含むＰＲＡＭＥ425-433のアナログに関する。以下の実施例２の表７に示されるような、結合モチーフのデータに関する参考資料は、Ｐ２アンカー残基が、Ａ２．１制限エピトープの任意の部位における親和性に最も大きく寄与することを示している。この場合、Ｐ２部位のアミノ酸は、ロイシンが好ましい。ＰΩアンカー残基は、ロイシンがこのましいが、以上に好ましいというわけではない。表７及び表８で示される分析は平均値であり、特定の配列における残基の挙動は、平均値からそれる、野生型のＰΩ残基がその部位に必ずしも最も好ましいわけではない。他のエピトープのＮｌｅ及びＮｖａで得られた好ましい結果と一致しているので、Ｎｌｅ及びＮｖａとこの配列を置換することで同程度の改善を得ることができる。最終的には、エピトープに対するどのような耐性をも避けるのに役立つ代替物と相関がある場合、同様の結合特性であっても、ペプチドの免疫原性を効果的に増大することができる。
様々な置換に関する論理的根拠は、上記に説明されている。ＰＲＡＭＥ425-433エピトープで研究された特定の置換は、同じ論理に従い、実施例４０〜４２及び図２５〜２７に
開示されている。置換は、第１のアンカー部位Ｐ２及びＰΩ（Ｐ９）、第２のアンカー部位Ｐ１及びＰΩ−１（Ｐ８）で為された。置換はまた、ＴＣＲ相互作用部位（第２のアンカー部位に加えて）Ｐ３及びＰ６で為された。選択された置換は、ＭＨＣクラスＩペプチド複合体の結合及び／又は安定性、ペプチドの免疫学的特性を確定する鍵となる特性への影響を有する。さらに、Ｔ細胞レパートリーの検討から、また、天然エピトープに対する限定された免疫力に関与する仕組みを妨げるために、天然ペプチドを認識するＴ細胞受容体と相互作用するアナログの能力を維持する置換が、実用的価値となる。
以下の実施例は、アナログ及びアナログを同定する方法を提供する。アナログは、例えば、免疫原、ワクチン及び／又は様々な癌の治療として使用することができる。アナログは、実施例１のように生成した。ＳＳＸ−２41-49アナログは、実施例２に示されるように同定されて、生成されたアナログは実施例３に列挙され、実施例４〜２１に見られるように、改善された特性に関して試験した。ＮＹ−ＥＳＯ−１157-165アナログの試験は、実施例２２〜３０に見られるように、改善された特性に関して試験した。
[実施例１]
ペプチド合成、精製及び特徴づけ
ペプチドは、標準的なＦｍｏｃ固相化学を使用して、０．０５〜０．１ミリモルスケールでＳｙｍｐｈｏｎｙ多重ペプチド合成機(PTI technologies, MA)又はＡＢＩ ４３３Ａペプチド合成機(Applied Biosystems, Foster City, CA)のいずれかで合成した。Ｃ末端遊離酸ペプチドは、プレロードＰＥＧ−ＰＳ樹脂（Ｓｙｍｐｈｏｎｙ）又はＷａｎｇ樹脂（ＡＢＩ）を使用して合成した。Ｃ末端アミド化ペプチドは、Ｆｍｏｃ−ＰＡＬ−ＰＥＧ−ＰＳ樹脂上で合成した。樹脂はすべて、Applied Biosystems(Foster City, CA)から購入した。ペプチド合成で使用されるＦｍｏｃアミノ酸は、Novabiochem(San Diego, CA)及びAnaSpec(San Jose, CA)から購入した。合成後切断は、標準的なプロトコルにより実施された。
ペプチド精製は、準分取用ＨＰＬＣカラム又はＳＰＥカートリッジ(Phenomenex, Torrance, CA)で実施された。全てのペプチドの純度は９０％以上であった。各ペプチドの同一性は、Ｍａｌｄｉ−ＴＯＦ ＭＳ(Voyager DE, Applied Biosystems)及びＳｙｎｅｒｇｉ
Ｃ１２カラム(Phenomenex, Torrance, CA)を使用した分析用ＨＰＬＣ（Varian又はShimazu）により確認された。
[実施例２]
ｄｅ ｎｏｖｏ設計されたＳＳＸ−２41-49アナログ
抗原性が高くないペプチドの構造的修飾は、ペプチド−ＭＨＣ結合、ＣＴＬ認識及び／又は免疫原性を相当改善させることができる。効力が増強されたペプチドアナログを得るために野生型エピトープを修飾する方法に関する一般的なガイドラインが当該技術分野で既知である。よく知られている戦略は、対象となる特定のＭＨＣ分子への結合に関わる、いわゆるアンカー部位にある残基を最適化することである。ＨＬＡ−Ａ２の場合では、Ｐ２及びＰΩ部位にある疎水性残基、特にＰ２にあるＬ及びＭ、並びにＰΩにあるＶに関する顕著な優位性が観察された（ＰΩは、エピトープのＣ末端残基を示す。ＨＬＡ−Ａ２に関しては、ＰΩはペプチドの長さに応じてＰ９又はＰ１０である）。Ｆ、Ｙ及びＷのような芳香族残基でＰ１位置を置換することもまた好ましい。
Figure 0005166025
Figure 0005166025
出典：Rammensee, Bachmann, Stevanovic:ＭＨＣリガンド及びペプチドモチーフ(MHC ligands and peptide motifs). Landes Bioscience 1997。
[実施例３]
以下のアナログは、実施例１における予測の元生成した。
Figure 0005166025
Figure 0005166025
Figure 0005166025
非標準アミノ酸に関する略語：Ｎｌｅ、ノルロイシン；Ｎｖａ、ノルバリン；Ｐｈｇ、フェニルグリシン；Ｐｈｅ（４−Ｆ）、４−フルオロフェニルアラニン；Ｐｈｅ（４−ＮＯ2）、４−ニトロフェニルアラニン；Ａｂｕ、α−アミノ酪酸；Ａｉｂ、α−アミノイソ酪酸；ＭｅＬｅｕ、メチルロイシン；ＭｅＶａｌ、メチルバリン；β−（３−ベンゾチエニル）Ａｌａ、β−（３−ベンゾチエニル）アラニン；Ｏ−メチル−Ｔｙｒ、Ｏ−メチルチロシン；Ｃｈａ、シクロヘキシルアラニン；Ｎａｌ−１、β−（１−ナフチル）アラニン；Ｎａｌ−２、β−（２−ナフチル）アラニン；−ＮＨ２は、カルボキシ末端がアミドへ変更されたことを示す。
[実施例４〜２１]
ＳＳＸ２41-49アナログの試験
実施例３で生成されたアナログを、以下の実施例４〜２１で、結合及び生物学的作用のような活性に関して試験した。
[実施例４]
Ｔ２細胞を使用したペプチド結合
ＨＬＡ−Ａ*０２０１に対するペプチドアナログ及び野生型エピトープの親和性は、Ｔ２細胞ベースアッセイ（Regner M, 他., Exp Clin Immunogenet. 1996; 13(1):30-5、これはその全体が参照により本明細書に援用される）を使用して評価した。
結合アッセイに関して簡潔に述べると、ＴＡＰの発現を欠如し、その結果細胞表面上で安定なＭＨＣクラスＩを構築しないＴ２細胞を、種々の濃度のペプチド（対照又はアナログ）を用いて３７℃で一晩パルス化して、十分に洗浄して、ＭＨＣクラスＩ（Ａ２対立遺伝子）を認識する、蛍光タグ付けした抗体で染色して、ＦａｃｓＳｃａｎ分析器にかけた
。一定の濃度のアナログと陰性対照（非ＭＨＣ結合剤）の間のＭＦＩ（平均蛍光強度）の差異は、ＭＨＣとペプチドとの間の安定化複合体がどれだけＴ２細胞の表面上に提示されたかの関数である。したがって、ペプチドの限界濃度では、主としてＫonの尺度であり、ペプチドの飽和レベルでは、Ｋon及びＫoffの両方の尺度である。結合は、数学的に関連する２つの要因：最大半量結合（飽和に相当するシグナルの５０％となるペプチド濃度）及び相対親和性（１／ＲＡ）により定量化された。相対親和性ＲＡは、対照（野生型ペプチド）に対して正規化された結合、例えばペプチドアナログに対する対照の最大半量結合の比である。１／ＲＡ指数が大きいほど、且つ最大半量結合が小さいほど、アナログとＭＨＣ間の相互作用のＫonは高い。これらの結合パラメータにより、野生型ペプチドに対して改善された５３個のアナログが同定された。これらの改善された結合剤は、ＭＨＣ及び／又はＴＣＲとの相互作用に関与することが既知である部位を含む１個、２個、３個又は複数個の置換（標準及び／又は非標準アミノ酸を含む）を有する。しかしながら、ＭＨＣ結合に対する全体的な影響は、修飾に依存していた。このようなペプチドアナログは、治療用組成物において、或いは治療用組成物をさらに派生させるための構造基盤として有用である。
[実施例５]
Ｔ２細胞を使用したペプチド安定性
ＭＨＣ上でのペプチド安定性（Ｋoff）は通常、単に結合（Ｋon）から推察され得ない。さらに、結合とともに、ＭＨＣクラスＩ上でのペプチドの安定性は、Ｔ細胞の活性化が「シグナル１」（Ｔ細胞受容体とのＭＨＣペプチド複合体相互作用）の持続期間に依存するため、このようなペプチドの免疫学的特性に関して重要であることがよく知られている。安定性アッセイに関して簡潔に述べると、ＴＡＰの発現が欠如し、その結果細胞表面上で安定なＭＨＣクラスＩを構築しないＴ２細胞を、ＭＨＣクラスＩの最大注入（「飽和」）を達成することが既知の濃度のペプチド（対照又はアナログ）を用いて３７℃で一晩パルス化して、十分に洗浄して、内因性タンパク質合成を阻止するエメチンの存在下で種々の間隔で追跡した。十分な洗浄後、ＭＨＣクラスＩ（Ａ２対立遺伝子）を認識する、蛍光タグ付けした抗体で細胞を染色して、ＦａｃｓＳｃａｎ分析器にかけた。一定の濃度のアナログと陰性対照（非ＭＨＣ結合剤）の間のＭＦＩ（平均蛍光強度）間の差異は、ＭＨＣとペプチドとの間の安定化複合体がどれだけＴ２細胞の表面上に提示されたかの関数である。経時的なシグナルの減衰は、０時間での（追跡間隔の初めでの）結合に対する安定性指数５０％として数学的に表された。
このような改善されたアナログは、ＭＨＣ及び／又はＴＣＲとの相互作用に関与することが既知である部位を含む１個、２個、３個又は複数個の置換（標準及び／又は非標準アミノ酸を含む）を有し、ＭＨＣ安定性に対する全体的な効果が修飾に依存している。このようなペプチドアナログは、治療用組成物において、或いは治療用組成物をさらに派生させるための構造基盤として有用である。４３個のアナログが、天然ペプチドに対して安定性が増大された。
結合及び安定性の両方が改善されたアナログは、改善された組成物において、或いは治療上の有益性を有する改善された組成物を生成するための構造基盤として有用である。
[実施例６]
アナログの免疫学的特性：交差反応性及び機能的結合力の評価
ペプチドの免疫学的特性は、ＭＨＣ分子への結合（Ｋon及びＫoff）及びＴＣＲ（ＴＣＲとＭＨＣペプチド複合体間の相互作用の親和性）の関数として記載される。第１のＭＨＣアンカー残基への修飾は概して、ＭＨＣ分子への結合に対する全体的な影響に関してかなりの程度の予測が可能である。
第２のＭＨＣアンカー残基の修飾は、ペプチド−ＭＨＣ相互作用に対して、Ｋon及びＫoffとともに、ＴＣＲに対するＭＨＣペプチド複合体の相互作用の親和性に影響を与える。
全体的な免疫学的特性の使用及びモデリングの提唱された方法と緊密に結び付いた態様によるペプチドアナログの迅速且つ合理的なスクリーニングを可能にする方法が考案された（一元的なＭＨＣ相互作用及びＴＣＲ結合特性に関するＫon及びＫoff）。この方法は、ヒトＭＨＣ（例えば、Ａ２対立遺伝子）を保有するトランスジェニックマウスで、有用な応答を発生するのに十分強力な免疫化法を使用して、天然（非突然変異）エピトープ（ＳＳＸ−２41-49）に対するＴ細胞系を生成させることを包含し得る。ペプチドアナログは、コンピテントＡＰＣの存在下、ｅｘ ｖｉｖｏで応答を引き起こし、天然（非突然変異）エピトープに特異的なＴ細胞の機能的影響を測定した。予測される影響が交差反応性ペプチドの場合では二相性であったため（抗原誘導性細胞死、即ちＡＩＣＤに起因して限界濃度で活性化し、またより高濃度で阻害する）、評価は、様々な濃度のアナログで実施された。以下の３つのパラメータの測定は、ペプチドアナログの基本的且つ有用な特徴を規定する：
１．Ｔ細胞活性化を引き起こす影響（例えば、サイトカイン生産）を誘発ためのペプチドアナログの最小所要濃度
２．任意のアナログ濃度における最大（ピーク値）影響（例えば、サイトカイン生産）
３．活性化影響（例えば、サイトカイン濃度）のピーク値におけるアナログ濃度
例えば、パラメータ＃１及び３と関連する値の低減をもたらすが、＃２と関連する値の増大をもたらすアナログが有用である。対照としての天然エピトープ及び非関連非交差反応性ペプチドの使用は、潜在的な値を有するアナログの種類を同定する際に有用である。天然のエピトープの特性に定量的と同程度であるか、或いはそれらからやや減衰される特性を示すアナログは、それらが交差反応性を保持する一方で、天然のペプチドの免疫学的特性と異なった免疫学的特性（例えば、ＡＩＣＤを誘導するより低い傾向又はｉｎ ｖｉｖｏで耐性を破壊するか、又は応答性を回復させる能力）を示し得るという事実から、依然として有用であると考えられる。
このスクリーニング法の幾つかの利点としては、実用性及び迅速性、読出しとして潜在的にバイアスされたＴ細胞クローンに代わる、より適切なポリクローナルＴ細胞系の使用、並びにＴＣＲに対するペプチド−ＭＨＣ複合体の交差反応性及び機能的結合力へと転換され得るＫon、Ｋoffのようなパラメータ、及びＴＣＲ親和性を統合している複合値が挙げられる。これらのパラメータは、ｉｎ ｖｉｖｏ免疫学的特性を予測することができ、したがって、ペプチドアナログをさらに評価、最適化及び実際に適用するための有用なパネルを描くことができる。ＭＨＣへ結合し、且つ一般的に知られている野生型ペプチドに特異的なＴＣＲに対する交差反応性を保持するアナログは、このアッセイにおいて測定可能な影響を誘発すると予測される。全体的な方法を図２に示す。
Ｔ細胞系の生成に使用される方法は下記の通りである：Ａ２ヒト対立遺伝子を保有するＨＨＤトランスジェニックマウス（Pascolo他 J. Exp. Med. 185(12):2043-51, 1997、これはその全体が参照により本明細書に援用される）を、ｐＩｐＣ２５μｇと混合したＳＳＸ−２天然エピトープ（４１〜４９）５０μｇを用いて、両側投与により０日目、４日目、１４日目及び１８日目に鼠径リンパ節へ免疫化した。最終追加免疫の７日後に、マウスを屠殺して、脾細胞の懸濁液を、完全ＨＬ−１培地中で５×１０6個の細胞／ｍｌで調製した。細胞を平底９６ウェルプレートにおいて、種々の濃度のペプチドとともに４８時間（２００μｌ／ウェル）、ウェルへ添加した１０Ｕ／ｍｌのｒＩＬ−２とともにインキュベートした。上清を回集して、ＩＦＮ−γの濃度をＥＬＩＳＡのような標準的な方法により評価した。
[実施例７]
単一部位で置換されたアナログの交差反応性及び機能的結合力
上記（実施例６、図２）の方法を適用して、野生型バージョンの天然ＳＳＸ−２41-49エピトープ（ＫＡＳＥＫＩＦＹＶ）において単一の置換を有するアナログのライブラリー全体を精査した（図３）。ｅｘ ｖｉｖｏでＩＦＮ−γ生産を誘発するためのアナログの最小所要量と任意のアナログ濃度でのサイトカイン生産の最大量との間に強力な逆相関関係が見られた。
Ｌ、Ｖ又はＭによるＡ42の置換は、このアッセイで評価されるペプチドの免疫原性特性を改善させた。Ｌ及びＶ突然変異体は活性であった。Ｍは、天然エピトープよりも活性であった。Ｉ突然変異体は、野生型エピトープを認識するＴＣＲに対する交差反応性を保持した。
非標準アミノ酸Ａｂｕ、Ｎｌｅ又はＮｖａによる４２位のＡの置換は、サイトカイン生産を誘発するのに要するアナログの最小量、及び生産されるサイトカインの最大量の両方に関して、野生型エピトープに対してペプチドの免疫原性特性を改善させた。Ｄ−Ａｌａ、Ｄ−Ｖａｌ、Ｎａｌ−２又はＡｉｂを包含する突然変異体は、このアッセイにおいて、天然ペプチドに対して交差反応性の保持及び免疫活性の低減を示すが、依然としてそれらの特性を調節又は増強するためのさらなる誘導体化に有用である。４２位でのＮａｌ−１は、活性を抑止させた。
第１の残基Ｋ41の変更は、Ｆ又はＰｈｇによる置換が活性を改善させるのに対して、Ｗ、Ｄ−Ｌｙｓ及びＣｈａは、このアッセイで免疫原性特性を消失させることを示した。Ｙ、Ｐｈｅ−４Ｆ、Ｐｈｅ（４−ＮＯ２）、Ｏ−メチル−Ｔｒｙ又はβ−（３−ベンゾチエニル−Ａｌａ）によるＫの置換は活性を保持した。
Ｉによる置換によるＶ49（Ｃ末端残基）位の修飾は、元のエピトープに比較してより低レベルで活性を保持した。−ＮＨ２の付加による最終残基の修飾は、ペプチドの活性を消失させ、これは、続いてＬ又はＶで４２位にあるＡを変更することにより回復した。このことは、野生型ペプチドよりも低い活性を有するアナログが依然としてさらなる誘導体化に有用であることを直接的に示している。
[実施例８]
２つの部位で置換されたアナログの交差反応性及び機能的結合力
上記（実施例６、図２）の方法を適用して、野生型バージョンでの野生型ＳＳＸ−２41-49エピトープにおいて２つの置換を有するアナログのライブラリー全体を精査した（図４）。
１位及び２位における協調的な修飾は、アナログの活性に対して可変的な影響を有する。例えば、Ｙ、Ｆ又はＷによるＫ４１の置換は、Ｖ、Ｍ又はＩによるＡ４２の置換と共に、野生型ペプチドに対してアナログの活性を保存又は増強した。ＴＣＲへの結合にＰ１残基がある程度関与するので、このような二重突然変異ペプチドは、耐性破壊をもたらす方法でＴＣＲとの相互作用に影響を与える機会を増大する（したがって、実践的な適用に有用である）。以下の組合せ：Ｙ（４１位）とＶ（４２位）、Ｗ（４１位）とＩ又はＩ（４２位）、及びＦ（４１位）とＬ、Ｖ、Ｉ（４２位）は、野生型ペプチドより活性であるアナログを生じた。４１位にあるＹと４２位にあるＩ、又は４１位にあるＷと４２位にあるＶ又はＭとの組合せは、野生型ペプチドの活性と類似した活性を付与した。４１位におけるＤ−リシンによるＫの置換は、このアッセイにおいて、活性が保持されたアナログを生じた。非標準アミノ酸を包含するこのようなペプチドの代謝的分解がｉｎ ｖｉｖｏで減
少されるため、このようなペプチドは非常に有用である。
４２位にあるＶ又はＬと４９位にあるＩの組合せは、天然ペプチドを上回って増大された活性をもたらした。
[実施例９]
複数の部位で置換されたアナログの交差反応性及び機能的結合力
上記（実施例６、図２）の方法適用して、野生型バージョンの天然ＳＳＸ−２41-49エピトープに対して３つ又はそれ以上の置換を有するアナログのライブラリー全体を精査した（図５）。
４９位にあるＩ又はＡと組み合わせた、４１位及び４２位にあるＦ並びにＶは、野生型エピトープよりも改善された活性又は類似した活性をもたらした。それに対し、４９位にあるＬ又はＭは、活性が激しく減少した。
最終部位の非標準アミノ酸であるＮｖａ、Ａｂｕ又はＭｅＶａｌを含む三重突然変異体は、免疫活性の保持又は改善をもたらした。このようなペプチドは、ｉｎ ｖｉｖｏでの安定性の増大及び酵素分解に対する耐性により、極めて有用である。
推定ＴＣＲ結合領域内のアミノ酸残基の修飾は、ＭＨＣグルーブにおける立体構造が天然ペプチドの立体構造とわずかに異なるため、交差反応性ととともにＭＨＣへの結合を保持し、免疫応答又は耐性破壊の回復に有用である、価値のあるペプチドを生じる４４位（Ｑ、Ｎｖａ又はＮｌｅ）、４６位（Ｌ、Ｖ、Ｎｌｅ又はＮｖａ）又は４８位（Ｆ又はＰｈｅ−４Ｆ）におけるさらなる置換は、活性なアナログを生じるが、４４位にあるＤ、Ｎ、Ｓ又はＴ、４６位にあるＭ、或いは４８位にあるＴ、Ｓ、Ｐｈｇ、或いは４８位にあるＴを伴う４６位にあるＬは、活性を欠いたアナログを生じた。最終的に、５個の置換を有する２つのアナログは活性を示さなかった（図５）。
[実施例１０]
天然ペプチドを包含し、様々な部位で突然変異した10 mer（１０アミノ酸長）の交差反応性及び機能的結合力
上記（実施例６、図２）の方法を適用して、一般的に知られているＳＳＸ−２41-49ペ
プチドを包含する十アミノ酸長のアナログのライブラリー全体を精査した（図６）。
十アミノ酸長ＳＳＸ２ ４１−５０は、４１−４９ 9 mer（９アミノ酸長）に特異的な
Ｔ細胞系を刺激する際に、４１−４９ 9 mer（９アミノ酸長）に対して著しく活性が低かった。５０位にあるＹ残基のＩ又はＬへの変更は、Ｖ、Ｎｌｅ又はＮｖａへの変更よりも程度が低いか、又は全くないが、このアッセイで活性の回復をもたらした。十アミノ酸長アナログの活性のさらなる最適化は、Ｌ又はＶにより２位にあるＡを変更することにより得ることができる。Ａ４２Ｌ置換は、Ｙ５０Ｎｖａ 10 mer（１０アミノ酸長）の活性を
回復した。天然ペプチドと比較して、ｉｎ ｖｉｔｒｏで活性が類似又は低減した（しか
し、交差反応性は保持された）ペプチドアナログは、ｉ）より限定されたＡＩＣＤ、ｉｉ）クラスＩＭＨＣ上で安定性が増大し及び／又は耐性破壊に重要であるＴＣＲとの相互作用がわずかに変化することによる、潜在的に高いｉｎ ｖｉｖｏ活性に起因して、免疫応
答の誘導又は追加免疫に依然として有用である。
[実施例１１]
天然エピトープに対する免疫性の増強を誘発するためのアナログの使用（ｅｘ ｖｉｖｏでの評価）
マウスの３つのグループ（ｎ＝４）を、０日目、３日目、１４日目及び１７日目にＰＢＳ２５μｌ中ＳＳＸ−２41-49天然エピトープを発現するプラスミド２５μｇ／各リンパ節で鼠径リンパ節へ直接的に接種することにより免疫化した。これに続いて、２８日目及
び３１日目に２回のさらなるペプチド追加免疫（同量）を行った。免疫化のスケジュールを図７に示す。追加免疫の１週後に、脾細胞をｅｘ ｖｉｖｏでＳＳＸ−２41-49天然ペプチドで刺激して、様々なＥ：Ｔ比で51Ｃｒ標識化した標的細胞（Ｔ２細胞）を試験した（図８）。アナログＡ４２Ｖは、追加免疫剤としてアナログＡ４２Ｌ又は野生型ペプチド自体と比較して、天然ペプチドを発現する標的細胞に対してより高い応答を誘発することが結果により示された。これは、ｅｘ ｖｉｖｏでの実験により確定される結合及び安定性パラメータと相関した。
[実施例１２]
天然エピトープに対する免疫性の増強を誘発するためのアナログの使用（ｉｎ ｖｉｖｏでの評価）
マウスの８つのグループ（ｎ＝４）を、０日目、３日目、１４日目及び１７日目にＰＢＳ２５μｌ中ＳＳＸ−２41-49天然エピトープを発現するプラスミド２５μｇ／各リンパ節で鼠径リンパ節へ直接的に接種することにより免疫化した。これに続いて、図９に示されるように、陰性対照ペプチド（Ｍｅｌａｎ Ａ２６−３５「ＥＡＡ」）、天然ペプチド又はアナログを使用して、２８日目及び３１日目に２つのさらなるペプチドの追加免疫（同量）を行った。
ｉｎ ｖｉｖｏにおける天然ペプチドに対するでの応答を評価するために、脾細胞を同腹子対照ＨＨＤマウスから単離して、２０μｇ／ｍＬ又は１μｇ／ｍｌの天然ペプチドとともに２時間インキュベートした。続いて、これらの細胞をＣＦＳＥhi蛍光で染色して（４．０μＭ又は１μＭ、１５分間）、ＣＦＳＥlo蛍光（０．４μＭ）で染色した同等数の対照脾細胞とともに免疫化マウスの静脈内に同時注入した。１８時間後、標的細胞の特異的な排除は、誘発された動物から脾臓及びＰＢＭＣを取り出すこと、及びフローサイトメトリーによりＣＦＳＥ蛍光を測定することにより測定された。ペプチド注入した脾細胞に対応する集合の相対的な減少は、対照（未注入）集合に対して算出され、特異的溶解％として表した。図１０（脾臓）及び図１１（血液）は、図７に記載されるレジメンにより誘発されるｉｎ ｖｉｖｏでの細胞毒性を示す。３つの試験ペプチド（Ａ４２Ｖ、Ｋ４１Ｆ及びＫ４１Ｙ）は、２０並びに１μｇ／ｍｌの天然ペプチドでコーティングされた標的細胞に対して、脾臓及び血液の両方において、天然ペプチドに比べて活性が増大した。興味深いことに、結合と、ＭＨＣとの相互作用におけるアナログの安定性と、天然ペプチドに対してｉｎ ｖｉｖｏでの免疫性を発生させる能力との間で限られた相関が見られたにすぎなかった（図１１）。
[実施例１３]
腫瘍細胞に対する応答の増強を誘発するためのアナログの使用
マウスの８つのグループ（ｎ＝４）を、０日目、３日目、１４日目及び１７日目にＰＢＳ２５μｌ中ＳＳＸ−２41-49天然エピトープを発現するプラスミド２５μｇ／各リンパ節で鼠径リンパ節へ直接的に接種することにより免疫化した。これに続いて、図９に示されるように、陰性対照ペプチド（Ｍｅｌａｎ Ａ２６−３５「ＥＡＡ」）、天然ペプチド又はアナログを使用して、２８日目及び３１日目に２つのさらなるペプチドの追加免疫（同量）を行った。
追加免疫の１週後に、脾細胞をｅｘ ｖｉｖｏでＳＳＸ−２41-49野生型ペプチドで刺激して、様々なＥ：Ｔ比で51Ｃｒ標識化したヒト腫瘍細胞細胞（６２４．３８メラノーマ細胞）に対して試験した（図１２）。アナログＡ４２Ｖ及びＫ４１Ｆ Ａ４２Ａ Ｖ４９Ｉは、天然ＳＳＸ−２41-49エピトープを発現するヒト腫瘍細胞に対する細胞毒性の増大を介する免疫応答を誘発した。
[実施例１４]
Ｎ末端近接第１のアンカー修飾（第２のＡＡ）
表３に示される置換アナログを試験した場合、アナログは、野生型ペプチドエピトープと比較して結合及び安定性が改善したプロファイルを示した。しかしながら、各アナログに関する改善の規模は様々であり、Ａ４２Ｖの置換は、ＨＬＡ−Ａ*０２０１分子との結合親和性に関して最高の改善を示した。さらに、Ａ４２Ｖ−ＨＬＡ−Ａ*０２０１複合体の安定性は、野生型ペプチドとＨＬＡ−Ａ*０２０１との間で形成される複合体よりも良好であり、Ｔ１／２は１１．５時間から２０時間まで延長した。４２ＡのＬ、Ｖ及びＭへの置換を伴うペプチドは、かなりの低濃度で野生型ペプチド特異的ＣＴＬのＩＦＮ−γ分泌を誘導することが可能であった。４２ＡのＩへの置換は、結合及び安定性が改善したプロファイルを有するアナログを生成した。Ｐ２部位にある残基もまた、ある程度までＴＣＲとの相互作用に携わる。この観察はまた、野生型エピトープに比べて、ＨＬＡ−Ａ*０２０１との類似した結合親和性が類似した４２ＡがＡｉｂに置換されたアナログによる結果によっても支持された。
[実施例１５]
Ｎ末端の第２のアンカー修飾（第１のＡＡ）
Ｎ末端の第２のアンカーは、Ｎ末端にある第１のアミノ酸である。したがって、一実施形態では、野生型配列で見出される元のＬｙｓ４３は、より疎水性且つ巨大なアミノ酸で置換される。標準アミノ酸及び非標準アミノ酸を含む当業者に利用可能なもの或いは当業者に既知であるものを包含する、任意のより疎水性且つ巨大なアミノ酸もまた使用することができる。より疎水性のアミノ酸の例としては、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ及びＤ−Ｌｙｓが挙げられるが、これらに限定されない。
Ｌｙｓ４１の残基は、ＨＬＡ−Ａ*０２０１分子と相互作用する第２のアンカー残基として定義され、Ｔ細胞受容体との相互作用にある程度携わる。したがって、この部位の修飾は、より免疫原性が高く且つ腫瘍ワクチンの開発により適切な幾つかのヘテロクリティックアナログを生成することができる。
表３から、Ｌｙｓ４１をＴｙｒ、Ｐｈｅ又はＰｈｅ誘導体（フェニルグリシン、ｐ−フルオロフェニルアラニン、ｐ−ニトロフェニルアラニン）に置換することにより、得られたアナログはＨＬＡ−Ａ*０２０１分子とより高い親和性を有し、安定な複合体が形成することを理解することができる。他方で、予測アルゴリズムに基づくと、Ｔｒｐアナログは、Ｔｙｒ及びＰｈｅアナログの親和性と類似した親和性を有するはずであるが、上記ＬｙｓをＴｒｐ又はＴｒｐ誘導体に置換したアナログは、ＨＬＡ−Ａ*０２０１分子との親和性が著しく低減した。実験データは、予測されるアルゴリズムの限界を実証している。例えば、Ｌｙｓ４１のＰｈｇへの置換は、ＨＬＡ−Ａ*０２０１分子との親和性及び安定性をが改善したアナログを生じているが、野生型ペプチド特異的ＣＴＬとの交差反応性は明らかに乏しかった。他方で、ＨＬＡ−Ａ*０２０１分子との親和性は、野生型ペプチドの親和性とほぼ同じであったが、ｐ−ニトロフェニルアラニンアナログは、かなり低濃度で野生型ペプチド特異的ＣＴＬのＩＦＮ−γ分泌を誘導することが示された。
[実施例１６]
Ｎ末端の第１／第２のアンカー修飾
Ｎ末端にある第１及び第２のアンカー残基両方が修飾される場合、一般的な傾向は、得られたアナログのＨＬＡ−Ａ*０２０１分子との親和性及び安定性が改善されるが（表３）、但しほんのわずかに例外を伴う：（Ｋ４１Ｙ、Ａ４２Ｖ）、（Ｋ４１Ｙ、Ａ４２Ｍ）及び（Ｋ４１（Ｄ−Ｌｙｓ）、Ａ４２Ｖ）。さらに、得られたアナログは、野生型ペプチド特異的ＣＴＬと非常に良好な交差反応性を有した。Ｋ４１Ｗ置換をＡ４２Ｖ又はＡ４２Ｌと組み合わせることにより、結合／安定性プロファイルが改善され、これらのアナログはまた、野生型ペプチドと目的の交差反応性活性を有した。Ｎ末端の第１のアンカー及び
第２のアンカーの組合せ修飾は、より大きくペプチド構造及び立体構造を変化させた。
[実施例１７]
Ｎ末端の第１／第２のアンカー及びＣ末端の第１の修飾
野生型ペプチドのＣ末端のＶａｌは、好ましいアンカー残基であった。しかしながら、それを、１つのさらなる−ＣＨ２基を有するＩｌｅへ突然変異させた場合に、効果の改善が観察され、類似の改善が、ＶａｌをＡｂｕに置換した場合でも観察された。他のアナログは、ＭＨＣ分子との結合親和性及び安定性が改善したが、それらの交差反応性の結果は良好ではなかった。これらのアナログの結果により、ペプチドＣ末端アンカー残基がまた、Ｔ細胞の認識において重要な役割を果たすことが示された（表４）。
[実施例１８]
Ｎ末端の第１／第２のアンカー及びＴＣＲ部位修飾
第２のＴＣＲ結合アミノ酸残基の置換は好ましくは、ＭＨＣ分子への結合を干渉しないが、自己抗原の耐性問題を克服するヘテロクリティックアナログを生成する。Ｎ末端の第１／第２のアンカー残基（Ｋ４１Ｆ及びＡ４２Ｖ）とＴＣＲ部位の置換を組み合わせることにより、結合親和性及び安定性が改善されたアナログが生成された（表６）。Ｋ４１Ｆ、Ａ４２Ｖ、Ｅ４４（Ｎｖａ）／（Ｎｌｅ）突然変異体及びＫ４１Ｆ、Ａ４２Ｖ、Ｉ４６Ｌ／（Ｎｖａ）／（Ｎｌｅ）突然変異体のようなこれらのアナログの幾つかは、より低濃度で野生型ペプチド特異的ＣＴＬのＩＦＮ−γ生産を誘導した。
[実施例１９]
Ｎ末端アミド
ペプチドの遊離型カルボン酸のＣ末端をアミドで置換することで、タンパク質分解に対する安定性を付与することにより生物培地においてペプチド安定性を改善させ、ペプチドに対するジペプチジルカルボキシペプチダーゼ耐性を付与した。しかしながら、得られたアナログの幾つかは、ＭＨＣ分子との親和性、並びに免疫原性及び抗原性が低減した。興味深いことに、本出願で開示される３つのアナログ（表７）は、ＭＨＣ分子との結合能力を失うが、ＳＳＸ−２41-49−ＮＨ２（Ａ４２Ｖ）は、野生型ペプチドの濃度と同様の濃度でＩＦＮ−γの分泌を誘導する能力により示されるように、野生型ペプチド特異的ＣＴＬとの反応性を保持した。しかしながら、ＳＳＸ−２41-49−ＮＨ２（Ａ４２Ｌ）は、より低濃度でＩＦＮ−γ生産を刺激することが可能であった。
[実施例２０]
10 mer（１０アミノ酸長）
典型的なＭＨＣ結合ペプチドの長さは、八アミノ酸長から１１アミノ酸長まで様々であり、ほとんどのＨＬＡ−Ａ*０２０１結合ペプチドは、九アミノ酸長又は十アミノ酸長で
ある。これまでの観察では、天然配列由来の9 mer（９アミノ酸長）及び10 mer（１０ア
ミノ酸長）はともに、同じＭＨＣに関する結合モチーフを有することが見出されており、また同じＮ末端を有していた。プロテアソームプロセッシングの観点から、天然配列由来
の9 mer（９アミノ酸長）及び10 mer（１０アミノ酸長）は別個のエピトープであるが、
それにもかかわらず抗原的に交差反応性であった。野生型エピトープＳＳＸ−２41-49の
場合、エピトープは九アミノ酸長ペプチド及び十アミノ酸長ペプチドであるＳＳＸ−２41-50は、適切なＭＨＣ結合モチーフを欠き、免疫学的活性を示さなかった。したがって、
野生型エピトープは、適切な結合モチーフを作ることができるアミノ酸を用いて十アミノ酸長へ伸長された。表８に示すように、多くの十アミノ酸長アナログが、ＨＬＡ−Ａ*０
２０１分子とより低い結合親和性を有する一方で、アナログＳＳＸ−２41-50（Ａ４２Ｌ
、Ｙ５０Ｌ／Ｖ／Ｎｌｅ／Ｎｖａ）は、ＨＬＡ−Ａ*０２０１分子に対する結合親和性が
改善された。特に、２つの十アミノ酸長アナログ、Ａ４２Ｌ及びＹ５０Ｎｌｅ／Ｎｖａは、野生型ペプチドよりも低濃度で野生型ペプチドに対して免疫化されたＴ細胞からＩＦＮ−γ生産を誘導することが可能であった。
[実施例２１]
耐性化を克服するためのアナログの使用
アナログが野生型エピトープを上回った改善を示し得る一態様は、ヒト系における免疫原性の増大及び耐性破壊である。生殖細胞系の差異に起因しようと、陰性選択における差異に起因しようと、ＴＣＲレパートリーにおける差異は、変則的な結果を与える可能性を有する。このような問題に対処するために、アナログは、ＣＴＬを生成するためのＨＬＡ−Ａ２+血液のｉｎ ｖｉｔｒｏでの免疫化で使用される。未処置のドナーでさえも使用するｉｎ ｖｉｔｒｏでの免疫化に関する手法は、当該技術分野で既知である（例えば、Stauss 他., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:7871-7875, 1992、Salgaller 他. Cancer Res. 55:4972-4979, 1995、Tsai 他., J. Immunol. 158:1796-1802, 1997及びChung 他.,
J. Immunother. 22:279-287, 1999、これらはそれぞれ、その全体が参照により本明細書に援用される）。
具体的には、正常ドナー由来のＰＢＭＣは、フィコール・ハイパック中での遠心分離によりバフィコートから精製された。培養はすべて、潜在的な異種病原体への暴露及びＦＢＳペプチドの認識を回避するために、自己血漿（ＡＰ）を使用して実施された。ペプチド特異的ＣＴＬのｉｎ ｖｉｔｒｏでの生成をするために、自己樹状細胞（ＤＣ）をＡＰＣとして用いた。その全体が参照により本明細書に援用されるKeogh 他., 2001に記載されるように、ＤＣが生成されて、ＣＴＬは、ＤＣ及びにペプチドよりＰＢＭＣから誘導された。簡潔に述べると、単球に富んだ細胞分画を、ＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−４とともに５日間培養して、２μｇ／ｍｌのＣＤ４０リガンドを有する培養培地中でさらに２日間培養して成熟させた。２４ウェルプレートで２×１０6個のＣＤ８＋に富んだＴリンパ球／ウェル及び２×１０5個のペプチドパルス化ＤＣ／ウェルを、１０％ＡＰ、１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−７及び２０ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２を加えたＲＰＭＩ２ｍｌ中で同時培養した。培養物は、７日目及び１４日目に自己照射ペプチドパルス化ＤＣで再刺激した。免疫原性は、本明細書中に記載するｉｎ ｖｉｔｒｏでの細胞毒性及びサイトカイン生産アッセイを使用してアッセイした。
[実施例２２〜３０]
ＮＹ−ＥＳＯ−１157-165アナログの試験
図１３に列挙されるアナログは、以下の通り実施例２２〜３０で、結合及び生物学的影響のような活性に関して試験した。
[実施例２２]
単一部位で置換されたアナログの交差反応性及び機能的結合力（図１３Ａ〜Ｃ）
上記（実施例６）の方法を適用して、自然（又は野生型）バージョンでの野生型ＮＹ−ＥＳＯ−１157-165エピトープにおいて単一の置換を有するアナログのライブラリー全体を精査した（図１３）。ｅｘ ｖｉｖｏでＩＦＮ−γ生産を誘発するためのアナログの最小必要量と任意のアナログ濃度でのサイトカイン生産の最大量との間に強力な逆相関関係が見られた。
Ｆ又はＫによるＳ１５７の置換は、ＭＨＣ結合及び一般的に知られているエピトープに特異的なＴ細胞との交差反応性を部分的に有するアナログを生じた。ＩによるＬ１５８の置換は、この方法により評価されるペプチドの免疫学的特徴を改善させたのに対して、Ｌ１５８Ｖは、活性の部分的保持をもたらした。アミノ酸Ｖ、Ｌ、Ａ又はＩのいずれかによるＣ１６５の修飾は、免疫特性を改善した。
Ｎ末端部位又は他の箇所で置換を有し、野生型ペプチドに対してこのアッセイにおいて保持されるが、増大されない活性を提示するペプチドは、ヒトにおいて有用である。さらに、当該ペプチドは、以下に記載するように、それらの特性を改善されるためのさらなる
誘導体化のための材料である。
[実施例２３]
２つの部位で置換されたアナログの交差反応性及び機能的結合力（図１３Ａ〜Ｃ）
上記（実施例６）の方法を適用して、野生型ＮＹ−ＥＳＯ−１157-165エピトープにおいて２つの置換を有するアナログのライブラリー全体を精査した。２位及び９位での同時半保存的修飾は、アナログの明確な独自性に応じて、アナログの免疫特性に対して強い影響を有することが示された。Ｌ１５８ＩをＣ１６５Ｖ又はＣ１６５Ｌと組み合わせることにより、野生型ペプチドと比べて活性がさらに増大した。同様に、Ｌ１５８Ｖは、Ｃ１６５Ｖ又はＣ１６５Ｌアナログの活性を改善して、野生型ペプチドと比べて活性をさらに増大した。Ｌ１５８Ｖは、Ｃ１６５Ａ又はＣ１６５Ｉアナログの活性を部分的に保持し、第１のアンカー残基の二重突然変異の興味深い影響を示した。同様に、Ｌ１５８Ｉは、Ｃ１６５Ａアナログの活性を部分的に保持した。
１位及び９位での同時修飾は、アナログの明確な独自性に応じて、アナログの免疫特性に対して強い影響を有した。９位でのＣ１６５Ｎｖａ（ノルバリン）又はＮｌｅ（ノルロイシン）と組み合わせたＳ１５７Ｙは、Ｓ１５７Ｙ単独又は野生型ペプチドを上回る実質的に改善された活性をもたらした。Ｃ１６５Ｖ突然変異体もまた、Ｓ１５７Ｙ突然変異体の活性を回復した。９位でのＶ−ＮＨ２又はＬ−ＮＨ２は、Ｓ１５７Ｙアナログの活性を部分的に回復したが、Ａ−ＮＨ２は回復しなかった。Ｓ１５７Ｆと９位のＶ、Ｌ、Ｉ、及び程度は低いがＡとの組合せは、アナログの強力な活性を保持し、ＴＣＲとの相互作用における第１の残基の関与に起因して、９位での単一突然変異体よりも有用である。Ｓ１５７Ｋと９位でのＶ、Ｌ、Ｉ、及び程度は少ないがＡとの組合せは、アナログの強力な活性を保持し、ＴＣＲとの相互作用における第１の残基の関与及び１位でのＫのペプチド溶解性に対する全体的に有益な効果に起因して、９位での単一突然変異体よりも有用である。[実施例２４]
複数の部位で置換されたアナログの交差反応性及び機能的結合力（図１３Ａ〜Ｃ）
上記（実施例６）の方法を適用して、野生型ＮＹ−ＥＳＯ−１エピトープに対して複数の置換を有するアナログのライブラリー全体を精査した。
Ｌ１５８Ｎｖａ又はＬ１５８Ｎｌｅは、Ｓ１５７Ｙ Ｃ１６５Ｖ突然変異体の活性を大幅に改善させた。１５８位でのＶ又はＩと、１６５位でのＶ、Ｌ、Ａ又はＩの組合せは、野生型ペプチドと比べてアナログの効果を部分的に回復することができる。Ｓ１５７Ｙ Ｌ１５８Ｉ Ｃ１６５Ｖは、野生型ペプチド並びにＣ１６５Ｖ又はＣ１６５Ｉを伴うＳ１５７Ｖ及びＣ１６５Ｌ又はＩを伴うＳ１５７Ｉと比べて活性が増大し、ＭＨＣ結合及び野生型ペプチドに特異的なＴ細胞との交差反応性を保持した。
１６０位でのＬ又はＮ、１６２位でのＡ、Ｌ、Ｖ又はＮ、或いは１６４位でのＥ、Ｄ又はＴのほかに、１５７位及び１６５位でのＹ並びにＶを含む三重置換は、交差反応性アッセイにおいてペプチドの活性を保持し、１６０位、１６２位及び１６４位
がＴＣＲとの相互作用に関与するため、これらのアナログをｉｎ ｖｉｖｏでのＴ細胞耐性を破壊するのに有用な化合物としている。
１６５位でのＶ、Ｌ、Ｉに加えて１５７Ｆ及び１５８Ｖを含む三重置換は、実施例２に記載するアッセイにおいて活性を示した。さらに、１６５位でのＶ又はＡに加えてＳ１５７Ｆ及びＬ１５８Ｉを包含する三重突然変異体は活性を保持した。総合すると、これらのデータは、複数の置換の複雑な相互作用的且つ非線形的な特性を強調している。
最後に、１５８Ｖ及び１６５Ｖとともに、Ｓ１５７Ｗ、及び程度はより大きいがＳ１５
７Ｔを含む三重突然変異体は、野生型ペプチドに対して、それぞれ活性が保持又は増大された。
[実施例２５]
野生型ペプチドを包含し、様々な部位で突然変異された10 mer（１０アミノ酸長）の交差反応性及び機能的結合力（図１３Ａ〜Ｃ）
上記（実施例６）の方法を適用して、一般的に知られているＮＹ−ＥＳＯ−１157-165
ペプチドを包含する十アミノ酸長のアナログのライブラリー全体を精査した。10 mer（１０アミノ酸長）自体は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの活性をかなり低減する一方で、１６６位で
のＬ、又は１５７位でのＹ及び１６５位でのＶと組み合わせた１６６位でのＬ、Ｉ、Ｎｌｅのような、この位置での様々な置換は、活性を部分的に回復した。
野生型ペプチドと比較して、ｉｎ ｖｉｔｒｏで活性が類似又は低減された（しかし、交差反応性は保持された）ペプチドアナログは、ｉ）より限定されたＡＩＣＤ（抗原誘導細胞死）、ｉｉ）クラスＩＭＨＣの安定性の増大及び／又はわずかに変更されたＴＣＲとの相互作用に起因した、ｉｎ ｖｉｖｏでのより高い活性に起因して、免疫応答の誘導又は追加免疫に依然として有用である。したがって、これらのアナログは耐性破壊に有用である。
[実施例２６]
アナログの免疫学的特性の評価：ＭＨＣクラスＩ分子へのペプチドの結合（図１３Ａ〜Ｃ）
ＨＬＡ−Ａ*０２０１に対するペプチド類縁類体及び野生型Ｉプトープの親和性は、Ｔ２細胞ベースのアッセイ（その全体が参照により本明細書に援用されるRegner M, 他., Exp Clin Immunogenet. 1996; 13(1):30-5)により評価した。結合アッセイに関して簡潔に述べると、ＴＡＰの発現を欠き、その結果細胞表面上で安定なＭＨＣクラスＩを構築しないＴ２細胞を、種々の濃度のペプチド（対照又はアナログ）を用いて３７℃で一晩パルス化して、十分に洗浄して、ＭＨＣクラスＩ（Ａ２対立遺伝子）を認識する蛍光タグ付けした抗体で染色して、ＦａｃｓＳｃａｎ分析器にかけた。Ａ２を結合するペプチドは、細胞表面でのその存在を安定化する。一定の濃度のアナログと陰性対照（非ＭＨＣ結合ペプチド）の間のＭＦＩ（平均蛍光強度）の差異は、ＭＨＣとペプチドとの間の安定化複合体がどれだけＴ２細胞の表面上に提示されるかの関数である。したがって、ペプチドの限界濃度では、主としてＫonの尺度であり、ペプチドの飽和レベルでは、Ｋon及びＫoffの両方の尺度である。図１３では、結合は、数学的に関連する２つの要因：最大半量結合（飽和に相当するシグナルの５０％となるペプチド濃度）及び対照（野生型ペプチド）に対して正規化された結合、即ちペプチドアナログに対する対照の最大半量結合の比である、相対親和性（１／ＲＡ）により定量化される。１／ＲＡ指数が大きいほど、且つ最大半量結合が小さいほど、アナログとＭＨＣ分子間の相互作用のＫonは高い。図１３では、このような結合パラメータが野生型ペプチドと比べて改善された３９個のアナログが記載されている。このような改善された結合剤は、正確な／対となる修飾に依存するＭＨＣ結合に対する全体的な影響を伴って、ＭＨＣ及び／又はＴＣＲとの相互作用に関与することが既知である部位で、標準及び／又は非標準アミノ酸の１つ、２つ、３つ又は複数の置換を有する。このようなペプチドアナログは、治療用組成物において、或いは治療用組成物をさらに派生させるための構造基盤として有用である。
[実施例２７]
免疫化の方法（図１４）
８つのマウスのグループ（ｎ＝４）を、０日目、３日目、１４日目及び１７日目に各リンパ節へＰＢＳ２５μｌ中野生型ＮＹ−ＥＳＯ−１157-165エピトープを発現するプラスミド２５μｇで鼠径リンパ節へ直接的に接種することにより免疫化した。これに続いて、
図１４示すように、陰性対照ペプチド（ＨＢＶｃ）、野生型ペプチド又はアナログを使用して、２８日目及び３１日目に２回のペプチドの追加免疫（同量）を行った。
[実施例２８]
野生型エピトープに対して免疫性の増強を誘発するためのアナログの使用（ｅｘ ｖｉｖｏでの評価）（図１５Ａ〜Ｃ）
ｉｎ ｖｉｖｏにおいて野生型エピトープに対して得られる応答を評価するために、脾細胞を同腹子対照ＨＨＤマウスから単離して、２０μｇ／ｍＬ又は１μｇ／ｍｌの野生型ペプチドとともに２時間インキュベートした。続いて、これらの細胞をＣＦＳＥhi及びＣＦＳＥmed蛍光で染色して（それぞれ４．０μＭ又は１μＭ、１５分間）、ＣＦＳＥlo蛍光（０．４μＭ）で染色した同等数の対照脾細胞とともに免疫化マウスの静脈内へ同時注入した。１８時間後、標的細胞の特異的な排除は、誘発された動物から脾臓及びＰＢＭＣを取り出すこと、及びフローサイトメトリーによりＣＦＳＥ蛍光を測定することにより測定された。ペプチド注入した脾細胞に対応する集合の相対的な減少は、対照（未注入）集合に対して算出され、特異的溶解率（％）として表した。図１５Ａは、陰性対照ペプチドを施したマウスにおけるｉｎ ｖｉｖｏでの細胞毒性の減少を示す。図１５Ｂは、プラスミドで免疫化し、且つ野生型ペプチドで増幅させたマウスにおける細胞毒性の変動を示す。図１５Ｃは、プラスミドで免疫化して、且つアナログＬ１５８Ｎｖａ Ｃ１６５Ｖで増幅させたマウスにおけるほぼ一定した細胞毒性を示す。
[実施例２９]
野生型エピトープに対して免疫性の増強を誘発するアナログごとの比較（ｅｘ ｖｉｖｏでの評価）（図１６Ａ〜Ｂ）
上述の免疫化プロトコル（実施例８）において、また、実施例９に記載する方法を使用して、限界量（１μＭ、図１６Ａ）又は上部最適量（２０μＭ、図１６Ｂ）の野生型ペプチドでコーティングした標的細胞に対するｉｎ ｖｉｖｏでの細胞毒性は、２段階に関してそれぞれプラスミド及びペプチドアナログを使用した、同調並びに増幅プロトコルに続いて評価した。平均特異的溶解率（％）＋／−ＳＥとして表される結果により、アナログＬ１５８Ｖ Ｃ１６５Ｎｖａが最高の活性を誘導すること、並びにアナログＬ１５８Ｖ Ｃ１６５Ｖ、Ｌ１５８Ｖ Ｃ１６５Ｎｖａ及びＳ１５７Ｋ Ｌ１５８Ｖ Ｃ１６５Ｖが、野生型ペプチド又はＣ１６５Ｖ突然変異体と同じ範囲で効果を示すことが示された。複数の置換はＴＣＲ結合部位を変更し得るため、このようなアナログは、自己エピトープに対する耐性を破壊する際に、野生型ペプチドよりも有用である。さらに、Ｓ１５７Ｋ三重突然変異体は、直接的な実用的意義を伴って、野生型ペプチド又は他のアナログの溶解性の低さを改善させることができる。
[実施例３０]
野生型エピトープに対して免疫性の増強を誘発するためのアナログの使用（サイトカイン生産によるｅｘ ｖｉｖｏでの評価）（図１７Ａ〜Ｂ）
上述の免疫化プロトコル（実施例２７）において、また実施例２８に記載する誘発後に、脾細胞を単離して、プールして、１０μＭの野生型ペプチドＮＹ−ＥＳＯ−１157-165で、それぞれ３日間及び６日間ｉｎ ｖｉｔｒｏで刺激した。上清を回収して、ＩＦＮ−γの濃度をＥＬＩＳＡにより測定した。アナログＬ１５８Ｎｖａ Ｃ１６５Ｖは、ｅｘ ｖｉｖｏでの刺激時に、より迅速に高レベルのＩＦＮ−γを生産するＴ細胞を誘導した（図１７Ａ）。Ｓ１５７Ｆ Ｌ１５８Ｖ Ｃ１６５Ｖ、Ｌ１５８Ｖ Ｃ１６５Ｎｖａ、及びＬ１５８Ｖ Ｃ１６５Ｖのような他のアナログは、野生型ペプチドによるｅｘ ｖｉｖｏでの再刺激時にＩＦＮ−γを生産が増大するＴ細胞を誘導した（図１７Ｂ）。一方、Ｃ１６５Ｖは、実施例２７〜２８に記載するプロトコルに続く、野生型ペプチドに比べて、Ｔ細胞のＩＦＮ−γを生産する能力の増大を誘導することはできなかった。
[実施例３１]
ＥＬＩＳＡによる結合及び安定性の特性化（ｉＴｏｐｉａ試験）
プレースホルダーペプチドを注入したクラスＩモノマーを含有する、アビジンコーティングしたマイクロタイタープレートを使用して、ペプチド結合、親和性及びオフ速度を評価した。モノマーコーティングされたプレートは、ｉＴｏｐｉａエピトープディスカバリーシステムキット(Beckman Ciulter, Inc., San Diego, CA, USA)の一部として供給された。アッセイ緩衝液、抗ＭＨＣ−ＦＩＴＣ ｍＡｂ及びβ２−ミクログロブリン並びに対照ペプチドもまたこのキットに供給された。
結合アッセイ：
天然ペプチド及びアナログはまず、結合アッセイにより各ＭＨＣ分子に対する結合能に関して評価された。このアッセイは、標準的な最適結合条件下における個々のペプチドのＨＬＡ分子に対する結合能を測定する。プレースホルダーペプチドを放出させて、プレートに結合したＭＨＣ重鎖のみを残して、モノマーコーティングされたプレートをまず取り剥がした。続いて、試験ペプチドを、抗ＭＨＣ−ＦＩＴＣ ｍＡｂとともに、最適なフォールディング条件下で導入した。プレートを２１℃で１８時間インキュベートした。抗ＭＨＣ−ＦＩＴＣ ｍＡｂは、リフォールディングされたＭＨＣ複合体へ優先的に結合する。したがって、各ペプチドから得られる蛍光強度は、ＭＨＣ分子と複合体を形成するペプチドの能力に関連していた。各ペプチドの結合は、キット中に提供される陽性対照ペプチドとの比較で評価され、結果は、「結合％」と表した。天然ペプチドと比べて「より良好な結合剤」と同定されるアナログは続いて、親和性及びオフ速度アッセイで分析した。
親和性アッセイ：
親和性アッセイに関して、プレースホルダーペプチドの最初の取り剥がし後に、一定の対立遺伝子に関する各試験ペプチドの濃度を増大させ（１０-4〜１０-8Ｍの範囲）、一連のウェルへ添加して、上述の条件下でインキュベートした。プレートを蛍光光度計上で読み取った。Ｓ字形用量応答曲線が、Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して作成された。最大の５０％を達成するのに要されるペプチドの量をＥＤ50値として記録した。
オフ速度アッセイ：
オフ速度アッセイに関して、２１℃での１８時間のインキュベーション後にプレートを洗浄して、過剰量のペプチドを除去した。続いて、プレートを対立遺伝子特異的モノマープレート上で３７℃にてインキュベートした。プレートは、相対蛍光強度に関して複数の時点（０、０．５、１、１．５、２、４、６及び８時間）で測定した。ペプチドの５０％がＭＨＣモノマーから解離するのに要する時間をＴ１／２値（時間）として定義する。
ｉＳｃｏｒｅ算出：
ｉＳｃｏｒｅは、ｉＴｏｐｉａソフトウェア内に提供される多重パラメータ算出である。その値は、結合、親和性及び安定性のデータに基づいて算出された。
[実施例３２]
ＰＳＭＡ228-297の抗原性の検証
ＨＨＤトランスジェニックマウス（ｎ＝４）を、０日目、３日目、１４日目及び１７日目にＰＳＭＡ288-297ペプチド（各リンパ節に対して、ｐＩ：Ｃ１２．５μｇを加えてＰＢＳ２５μｌ中２５μｇ）で免疫化した。追加免疫の１週後に、脾細胞をｅｘ ｖｉｖｏで天然ＰＳＭＡ288-297ペプチドで刺激して、51Ｃｒ標識化したヒト腫瘍細胞（ＰＳＭＡ+Ａ２+ＬｎＣａｐ細胞、又は陰性対照としてＭＨＣクラスＩブロッキング抗体でコーティングしたＬｎＣａｐ細胞）に対して様々なＥ：Ｔ比で試験した。％特異的溶解率（平均値±ＳＥＭ）として表した結果により、ＰＳＭＡ特異的Ｔ細胞は、免疫介在性誘発を可能にする様式で腫瘍細胞のＭＨＣクラスＩ上でＰＳＭＡエピトープの提示を確認し、ＭＨＣク
ラスＩの利用可能性に応じた様式で、ヒト腫瘍細胞を溶解させることが可能であることが示された（図１８）。
[実施例３３〜３８]
ＰＳＭＡ288-297アナログの試験
図１９及び図２０に列挙されるアナログは、以下の通り実施例３３〜３８で、結合親和性及び安定性の改善、天然エピトープとの交差反応性並びに免疫原性のような様々な特性に関して試験した。
[実施例３３]
単一部位で置換されたアナログの交差反応性及び機能的結合力
実施例３１に記載する手順を使用して、ＰＳＭＡ288-297及びアナログの結合特性を互いに比較して評価した（図１９を参照）。結合に関する陽性対照は、ｍｅｌａｎ−Ａ26-35 Ａ２７Ｌであった。実質的に実施例６に記載されるように、天然エピトープとの交差反応性は、アナログペプチドを使用して、天然エピトープに特異的なＴ細胞系からのＩＦＧ−γ分泌を刺激することにより評価された。図１９で示されるデータは、１０μｇ／ｍｌのアナログ（およそ１０μＭ）で刺激することにより作成された。この濃度は概して、アナログに関して最大又はほぼ最大のＩＦＮ−γ生産をもたらし、したがって交差反応性を表すのに選択された。
観察されるアナログの親和性をＥＤ５０として図１９に報告する。Ｍｅｔ、Ｉｌｅ、Ｇｌｎ、Ｖａｌ、Ｎｖａ、Ｎｌｅ及びＡｂｕは、Ｐ２位で置換された。これらは概して、同様の親和性をもたらした。Ｎｌｅ及びＭｅｔ置換はまた、解離の半減期の時間として測定される結合の安定性を同程度に維持した。Ｖａｌ、Ｎｖａ及びＡｂｕアナログは、類似したレベルのＩＦＮ−γ生産を誘発した。
Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｎｖａ及びＮｌｅは、ＰΩ第１のアンカー部位でＩｌｅに代わって置換された。４つ全てが、類似した結合親和性を有した。Ｖａｌ及びＮｖａ置換は、交差反応性及びアナログが改善された免疫原性を有し得ることを示し、結合の安定性を改善し、ＩＦＮ−γの生産量を増大させた。
Ｐ１でのＳｅｒ、Ｓａｒ及びＡｂｕ置換は、結合特性を同程度に維持したが、交差反応性はあまり類似していなかった。ＰΩ−１位でのＡｌａ、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ及びＴｈｒ置換もまた、結合特性を同程度に維持した。最後に、Ｐ３位でのＴｒｐ置換は、結合の親和性及び安定性を約２倍増大し、並びに天然ペプチドの２倍以内のＩＦＮ−γ生産を示し、これらはすべて一般的に類似した値であった。
[実施例３４]
２つの部位で置換されたアナログの交差反応性及び機能的結合力
このエピトープにおける置換が結合親和性を大いに損なわないという上記に見られる傾向を、二重置換で検査して継続し（図２０）、天然ペプチドと比較して結合親和性が類似しているか又は結合親和性が改善しているかを一様に示した。両方の第１のアンカー部位で置換を有するアナログの中でも、Ｐ２でのＮｖａ又はＮｌｅ、ＰΩでのＶａｌ、Ｐ２でのＶａｌ及びＰΩでのＮｖａを有するものが、結合安定性を改善し、前者２つは、ＩＦＮ−γ生産を増大させた（第３のアナログに関してはデータが入手不可能であった）。ＰΩでのＶａｌ及びＮｖａ置換はまた、Ｐ１でのＡｌａ及びＡｂｕ置換と対にされた。これらのアナログは全て、単一のＰΩ置換と比較して改善された強い結合安定性及びＩＦＮ−γ生産が改善しており、したがってＰ１置換をさらに改善させた。ＰΩ Ｎｖａ置換はまた、Ｐ３Ｔｒｐ置換に、類似した交差反応性を回復させることが可能であった。
[実施例３５]
３つの部位で置換されたアナログの交差反応性及び機能的結合力
Ｐ１、Ｐ２及びＰ３、Ｐ１、Ｐ２及びＰΩ、Ｐ２、Ｐ３及びＰΩ、並びにＰ１、Ｐ３及びＰΩの三重置換を行った（図２１）。全ての場合において、Ｐ１置換はＡｌａであり、Ｐ３置換はＴｒｐであり、ＰΩ置換はＶａｌ又はＮｖａであった。上述のように、天然ペプチドに少なくとも類似した親和性が維持された。Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３に関して、Ｐ２でのＮｖａ及びＮｌｅが、結合の安定性を改善させた。このＰ２ Ｎｖａアナログは、同量のＩＦＮ−γを誘発したのに対して、Ｎｌｅアナログは、かなりの増大を示した。
Ｐ１、Ｐ２、ＰΩに関して、Ｐ２及びＰΩでのＮｖａ及びＶａｌのいずれかの組合せは、結合安定性を改善させた。このＰ２ Ｎｖａ ＰΩ Ｖａｌアナログはまた、ＩＦＮ−γ生産においてかなりの増大を示した（他のものに関するデータはない）。この三重置換におけるＰ２及びＰΩの両方でのＶａｌは、天然ペプチドのほぼ半分の結合安定性及びＩＦＮ−γ生産を示した。
Ｐ２、Ｐ３、ＰΩに関して、Ｎｖａ／Ｗ／Ｖアナログのみが、結合又はＩＦＮ−γ生産の改善を示した。試験した２つのＰ１、Ｐ３、ＰΩアナログに関して、Ｖａｌ又はＮｖａであるＰΩは、結合安定性を改善させたが、交差反応性が低かった。
[実施例３６]
様々なアナログの交差反応性免疫原性
ＨＨＤトランスジェニックマウスの群（ｎ＝８）を、０日目、３日目、１４日目及び１７日目に鼠径リンパ節へ直接接種することにより、ｐＩ：Ｃ１２．５μｇを加えたＰＢＳ２５μｌ中のペプチド（天然エピトープＰＳＭＡ288-297或いは第１又は第２のアンカー残基での置換を保有するアナログ）２５μｇで免疫化した。
最終追加免疫の１０日後に、マウスを屠殺して、脾細胞を調製して、ＥＬＩＳＰＯＴ分析によりＩＦＮ−γ生産を評価した。様々な数の脾細胞／ウェルを、抗ＩＦＮ−γ抗体でコーティングしたＥＬＩＳＰＯＴプレートにおいて、１０μｇ／ｍｌの天然ペプチドで刺激した。インキュベーションの４８時間後に、アッセイを展開して、天然ＰＳＭＡ288-297ペプチドを認識したサイトカイン生産Ｔ細胞の頻度を自動的に計数した。データは、スポット形成コロニーの数／ウェル（三重反復実験の平均値±ＳＤ）として図２２に表した。データは、天然ペプチドよりもわずかに高い（が、有意な）活性を示す他のアナログ（Ｉ２９７Ｎｖａ又はＧ２８８Ａｂｕ又はＬ２８９Ｎｌｅ Ｉ２９７Ｎｖａ）とともに、Ｉ２９７Ｖ及びＰ２９０Ｗアナログにより達成される、天然エピトープに対する免疫応答のプライミングの増大を示す。天然エピトープの低い免疫原性が耐性を反映する程度にこれらのアナログの活性の改善は、耐性破壊を表す。
[実施例３７]
プラスミドにより誘導されるＰＳＭＡ288-297に対する応答の、Ｉ２９７Ｖアナログによる増幅
ＨＨＤトランスジェニックマウスの２つの群（ｎ＝８）を、０日目、３日目、１４日目及び１７日目に鼠径リンパ節へ直接接種することにより、ＰＢＳ２５μｌ中のＰＳＭＡ288-297を発現するプラスミド２５μｇで免疫化した。これに続いて、天然ペプチド又はＩ２９７Ｖアナログのいずれかを用いて、２８日目及び３１日目に２回のペプチド追加免疫（２５μｇ）を行った。
最終追加免疫の１０日後に、マウスを屠殺して、脾細胞を調製して、ＥＬＩＳＰＯＴ分析によりＩＦＮ−γ生産を評価した。様々な数の脾細胞／ウェルを、抗ＩＦＮ−γ抗体でコーティングしたＥＬＩＳＰＯＴプレートにおいて、１０μｇ／ｍｌの天然ペプチドで刺
激した。インキュベーションの４８時間後に、アッセイを展開して、ＰＳＭＡ228-297ペプチドを認識するサイトカイン生産Ｔ細胞の頻度を自動的に計数した。データは、５０万個のレスポンダー細胞に対して正規化した特異的Ｔ細胞の頻度（三重反復実験の平均値±ＳＤ）として図２３に表した。データにより、脾細胞の数／ウェルとは関係なく、天然エピトープ特異的Ｔ細胞の頻度が、Ｉ２９７Ｖアナログで免疫化したマウス群においてかなり高かったことが示された。
[実施例３８]
ヒト腫瘍細胞に対するｅｘ ｖｉｖｏでの細胞毒性
ＨＨＤトランスジェニックマウス（ｎ＝４）を、０日目、３日目、１４日目及び１７日目に鼠径リンパ節へ直接接種することにより、ＰＢＳ２５μｌ中のＰＳＭＡ288-297エピトープを発現するプラスミド２５μｇで免疫化した。これに続いて、アナログＩ２９７Ｖ用いて、２８日目及び３１日目に２回のペプチド追加免疫（同量）を行った。追加免疫の１週後に、脾細胞をｅｘ ｖｉｖｏで天然ＰＳＭＡ288-297ペプチドで刺激して、51Ｃｒ標識化したヒト腫瘍細胞（Ｌｎｃａｐ、Ａ２+ＰＳＭＡ+、若しくは６２４．３８Ａ２+ＰＳＭＡ-又は対照６２４．２８細胞Ａ２-ＰＳＭＡ-）に対して様々なＥ：Ｔ比で試験した。得られた免疫性は、Ｌｎｃａｐに対する細胞毒性を仲介する際に有効であった（図２４）。
[実施例３９]
ＰＲＡＭＥ425-433の抗原性の検証
ＨＨＤトランスジェニックマウス（ｎ＝４）を、０日目、３日目、１４日目及び１７日目にＰＲＡＭＥ425-433ペプチド（各リンパ節に対して、ｐＩ：Ｃ１２．５μｇに加えてＰＢＳ２５μｌ中２５μｇ）で免疫化した。追加免疫の１週後に、脾細胞をｅｘ ｖｉｖｏで天然ＰＲＡＭＥ425-433ペプチドで刺激して、様々なＥ：Ｔ比で51Ｃｒ標識化したヒト腫瘍細胞（ＰＲＡＭＥ+Ａ２+６２４．３８メラノーマ細胞、又は陰性対照６２４．３８細胞、Ａ２発現が欠失）に対して試験した。％特異的溶解率（平均値±ＳＥＭ）として表した結果により、ＰＲＡＭＥ特異的Ｔ細胞は、免疫介在性誘発を可能にする様式で、腫瘍細胞のＭＨＣクラスＩ上でＰＲＡＭＥ425-433エピトープの提示を確認し、ヒト腫瘍細胞を溶解させることが可能であることが示された（図２５）。
[実施例４０〜４８]
ＰＲＡＭＥ425-433アナログの試験
図２６〜２８に列挙されるアナログは、以下の通り実施例４０〜４８で、親和性及び結合の安定性の改善、天然エピトープとの交差反応性並びに免疫原性のような様々な特性に関して試験した。実施例３１に記載する手順を使用して、ＰＲＡＭＥ425-433及び６９個のアナログのＨＬＡ−Ａ*０２０１結合特性を互いに比較して評価した。結合に関する陽性対照は、ｍｅｌａｎ−Ａ26-35Ａ２７Ｌであった。観察されるアナログの親和性を％結合（陽性対照と比較して）及びＥＤ５０として報告する。結合の安定性を解離の半減時間として報告する。天然エピトープとの交差反応性は、実質的に実施例６に記載されるように、アナログペプチドを使用して、天然エピトープに特異的なＴ細胞系からのＩＦＧ−γ分泌を刺激することにより評価された。図２６〜２８で示されるデータは、およそ０．３μＭのアナログペプチドを用いて刺激することにより作成された。結果は、３つの別個の実験から収集されて、それぞれにおいて天然ペプチドにより誘発されるＩＦＮ−γの量に対して正規化された。場合によっては、報告される値は、２つの測定の平均値である。アスタリスク「*」は、ＩＦＮ−γ生産がバックグラウンドと識別できなかったことを示す。
[実施例４０]
単一部位で置換されたアナログの交差反応性及び機能的結合力（図２６）
Ｖａｌ、Ｍｅｔ、Ｉｌｅ、Ｎｌｅ、Ｎｖａ及びＡｂｕの単一置換が、Ｐ２の第１のアンカー部位にあるＬｅｕに対して行われた。これらのアナログは全て、天然ペプチドの２０％以内の％結合を示した。ＥＤ５０は、Ｍｅｔ及びＮｖａアナログに関して確定した。前者は幾らか改善されたが、天然ペプチドに匹敵する親和性を有したのに対して、後者の親和性は約３倍低減されたが、依然としてＰＳＭＡ288-287エピトープに匹敵していた。Ｐ２置換は全て、少なくとも天然ペプチドに類似した結合安定性を維持した。Ｍｅｔ、Ｎｌｅ及びＮｖａアナログは、天然ペプチドの２倍以内のＩＦＮ−γ生産を誘発し、Ｖａｌアナログは、いくらか少ないＩＦＮ−γ生産を誘発した。
Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｈｒ、Ｏｒｎ（オルニチン）及びＨｓｅ（ホモセリン）の単一置換が、Ｐ１部位のＳｅｒで行われた。これらのアナログは全て、天然ペプチドの２０％以内の％結合を示したが、但し、高い側に当該範囲を超過するＰｈｅアナログを除く。ＬｙｓアナログのＥＤ５０は確定しなかったが、他の５つのアナログは、天然ペプチドの３倍以内の親和性を有した。結合の安定性は概して天然ペプチドと同程度であり、Ｐｈｅ Ｐ１アナログは、天然ペプチドの１２．２時間と比較して１７．７時間の解離の半減時間を伴ってこの群で最大の結合安定性を示す。天然ペプチドの４０％のＩＦＮ−γを誘発したＬｙｓ Ｐ１アナログを除いて、これらのアナログは全て、それらが天然ペプチドの２倍以内のＩＦＮ−γ生産を誘発したため、交差反応性とみなされた。
Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ａｌａ、Ｎｌｅ、Ｎｖａ、Ａｂｕの単一置換が、ＰΩアンカー部位に対して行われ、並びにアミド基の付加によるカルボキシ末端の修飾が行われた。測定した結合親和性は、少なくとも天然ペプチドと同程度であった。結合の安定性はまた、一般的に類似しているが、Ｎｖａアナログにおける高域での異常値である１７．２時間のｔ１／２、及びたった３時間のかなりで低減されたｔ１／２を有するＣ末端アミドの低域での異常値が見られた。Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ａｌａ及びＡｂｕ ＰΩアナログはあまり良好ではない交差反応性を示すが、他のものは天然ペプチドの２倍以内のＩＦＮ−γ生産を誘発した。
主としてＴＣＲ相互作用に影響を及ぼす位置での単一の置換も行われた：Ｐ３及びＰ６でのＮｌｅ、Ｎｖａ及びＡｂｕ、並びにＰ８でのＡｌａ、Ｓｅｒ及びＳａｒ。Ｐ６ Ｎｖａアナログは、天然ペプチドの２倍以内のＩＦＮ−γを生産したが、Ｐ６ Ａｂｕアナログは４４％で終結した。
[実施例４１]
２つの部位で置換されたアナログの交差反応性及び機能的結合力
二重置換アナログは、上記の単一置換の様々な組合せを使用して、Ｐ１及びＰ２、Ｐ２及びＰΩ、並びにＰ１及びＰΩで行われた（図２７Ａ及び２７Ｂ）。検査したＰ１−Ｐ２二重置換はいずれも、結合親和性又は安定性に対して根本的な変化をもたず、いずれもＩＦＮ−γアッセイにおいて有意な交差反応性を示さなかった。同様の傾向が、Ｐ２−ＰΩ二重置換アナログで見られるが、Ｌ４２６Ｎｖａ Ｌ４３３Ｎｌｅアナログは、結合特性が同様にいくらか改善されるとともに、ＩＦＮ−γアッセイにおいて天然ペプチドとの交差反応性の有意なレベルを示す。最後に、Ｐ１−ＰΩ二重置換に関して、検査したアナログもまた、少なくとも同程度の結合特性を有する一般的な傾向があったが、交差反応性アッセイにおいてはＩＦＮ−γをほとんど誘発しなかった。この分類における例外は、結合安定性がいくらか改善され、有意な交差反応性を示したＳ４２５Ｔ Ｌ４３３Ｎｌｅアナログ、並びに４倍以上低減されたＥＤ50、ほぼ２倍の解離の半減時間を有し、且つ天然ペプチドよりも多くのＩＦＮ−γを誘発したＳ４２５Ｆ Ｌ４３３Ｎｌｅアナログであった。
[実施例４２]
３つの部位で置換されたアナログの交差反応性及び機能的結合力
Ｐ１でＰｈｅ又はＴｈｒ、Ｐ２でＮｖａ又はＭｅｔ、並びにＰΩでＮｌｅを有する４つの三重置換アナログを研究した。Ｓ４２５Ｔ Ｌ４２６Ｍ Ｌ４３３Ｎｌｅアナログは同程度の親和性を有したのに対して、他の３つのアナログに関しては、親和性は改善された。Ｐ２ Ｎｖａ置換を有するアナログはともに、結合安定性の増大及び有意なレベルの交差反応性を示した。図２８を参照されたい。
[実施例４３]
Ｌ４２６Ｎｖａ Ｌ４３３Ｎｌｅアナログの交差反応性免疫原性
ＨＨＤトランスジェニックマウスの２つの群（ｎ＝８）を、０日目、３日目、１４日目及び１７日目に鼠径リンパ節へ直接接種することにより、ＰＢＳ２５μｌ中のＰＲＡＭＥ425-433を発現するプラスミド（以下の実施例４９に記載するｐＣＴＬＲ２）２５μｇで免疫化した。これに続いて２８日目及び３１日目に天然ペプチド又はＰＲＡＭＥエピトープアナログＬ４２６Ｎｖａ Ｌ４３３Ｎｌｅによる２回のペプチド追加免疫（２．５μｇ）を行った。
最終追加免疫の１０日後に、マウスを屠殺して、脾細胞を調製して、１０μｇ／ｍｌの天然ペプチドによる０．５×１０6個の細胞／ウェルのｉｎ ｖｉｔｒｏでの刺激後に、ＩＦＮ−γ生産を評価した。インキュベーションの４８時間後に、上清を収集して、ＰＲＡＭＥ425-433ペプチドに応じて生産されるＩＦＮ−γの濃度をＥＬＩＳＡにより測定した。データは図２９に表し、ＰＲＡＭＥ425-433Ｌ４２６Ｎｖａ Ｌ４３３Ｎｌｅアナログで追加免疫したマウスにおけるＩＦＮ−γ生産の有意な増強を示す。
[実施例４４]
Ｌ４２６Ｎｖａ Ｌ４３３Ｎｌｅアナログに誘導されるｉｎ ｖｉｖｏでの細胞毒性
ＨＨＤトランスジェニックマウスの２つの群（ｎ＝８）を上記実施例４３に記載するように免疫化した。
天然エピトープに対して得られるｉｎ ｖｉｖｏでの応答を評価するために、脾細胞を同腹子対照ＨＨＤマウスから単離して、２０μｇ／ｍＬ又は１μｇ／ｍｌの天然ペプチドとともに２時間インキュベートした。続いて、これらの細胞をＣＦＳＥhi及びＣＦＳＥmed蛍光で染色して（それぞれ４．０μＭ又は１μＭ、１５分間）、ＣＦＳＥlo蛍光（０．４μＭ）で染色した同等数の対照脾細胞とともに免疫化マウスの静脈内へ同時注入した。１８時間後、標的細胞の特異的な排除は、誘発された動物から脾臓及びＰＢＭＣを取り出すこと、及びフローサイトメトリーによりＣＦＳＥ蛍光を測定することにより測定された。ペプチド注入した脾細胞に対応する集合の相対的な減少は、対照（未注入）集合に対して算出され、％特異的溶解率として表した。図３０における結果は、アナログが追加免疫剤として天然ペプチドに置き換わる場合に、細胞毒性の保存された誘導を示した。この傾向により、アナログが細胞毒性免疫性の誘導を改善させることができることが示される。[実施例４５]
ｉｎ ｖｉｖｏでの細胞毒性及び四量体染色
ＨＨＤトランスジェニックマウスの７つの群（ｎ＝４）を、０日目、３日目、１４日目及び１７日目に鼠径リンパ節へ直接接種することにより、ＰＢＳ２５μｌ中のＰＲＡＭＥ425-433を発現するプラスミドであるｐＣＴＬＲ２ ２５μｇで免疫化した。これに続いて、２８日目及び３１日目に、天然ペプチド、陰性対照（ＥＡＡＧＩＧＩＬＴＶペプチド）或いは第１及び／又は第２のアンカー残基に突然変異を有するＰＲＡＭＥ425-433エピトープアナログ（Ｓ４２５Ｆ、Ｌ４２６Ｎｖａ Ｌ４３３Ｎｌｅ、Ｓ４２５Ｔ Ｌ４３３Ｎｌｅ及びＳ４２５Ｔ Ｌ４２６Ｎｖａ Ｌ４３３Ｎｌｅ）による２回のペプチド追加免疫（２．５μｇ）を行った。
天然エピトープに対するｉｎ ｖｉｖｏでの応答を評価するために、脾細胞を同腹子対照ＨＨＤマウスから単離して、０．２μｇ／ｍＬ又は２０μｇ／ｍｌの天然ペプチドとともに２時間インキュベートした。続いて、これらの細胞をＣＦＳＥ蛍光で染色して（それぞれ１及び２．５μＭ、１５分間）、ＣＦＳＥlo蛍光（０．４μＭ）で染色した同等数の対照脾細胞とともに免疫化マウスの静脈内へ同時注入した。１８時間後、標的細胞の特異的な排除は、誘発された動物から脾臓を取り出すこと、及びフローサイトメトリーにより得られた細胞懸濁液中のＣＦＳＥ蛍光を測定することにより測定された。ペプチド注入した脾細胞に対応する集合の相対的な減少は、対照（未注入）集合に対して算出され、％特異的溶解率として表した。さらに、ＰＲＡＭＥ425-433特異的Ｔ細胞の頻度は、四量体／ＣＤ８共染色により評価した。第１又は第２のアンカー残基に突然変異を包含するアナログによる追加免疫は、ｉｎ ｖｉｖｏでの細胞毒性及び四量体染色に基づいて、天然ペプチドと比較した場合に匹敵する免疫活性を示した。アナログは、無関係のペプチドで追加免疫した「ＥＡＡ群」との比較により示されるように、免疫応答を増幅することが可能であった。その点に関して、Ｓ４２５Ｆ、Ｌ３３Ｎｌｅ、Ｌ４２６Ｎｖａ Ｌ４３３Ｎｌｅ、Ｓ４２５Ｔ Ｌ４３３Ｎｌｅ又はＳ４２５Ｔ Ｌ４２６Ｎｖａ Ｌ４３３Ｎｌｅを含むアナログは全て、ｉｎ ｖｉｖｏでの細胞毒性により評価されるように、天然エピトープに対する免疫性を拡大させることが可能であった。しかしながら、Ｌ４３３Ｎｌｅ、Ｌ４２６Ｎｖａ Ｌ４３３Ｎｌｅ及びＳ４２５Ｔ Ｌ４２６Ｎｖａ Ｌ４３３Ｎｌｅアナログだけが、プラスミドでプライミングし、且つ陰性対照ペプチドで追加免疫したマウスよりも有意に高いレベルにまで、天然エピトープに対して特異的なＴ細胞のサブセットを拡張させた（図３１）。
[実施例４６]
ｅｘ ｖｉｖｏでのサイトカイン生産
ＨＨＤトランスジェニックマウスの３つの群（ｎ＝４）を、０日目、３日目、１４日目及び１７日目に鼠径リンパ節へ直接接種することにより、ＰＢＳ２５μｌ中のＰＲＡＭＥ425-433を発現するプラスミドであるｐＣＴＬＲ２ ２５μｇで免疫化した。これに続いて、２８日目及び３１日目に、ＰＲＡＭＥエピトープアナログＬ４２６Ｎｖａ Ｌ４３３Ｎｌｅ及びＳ４２５Ｔ Ｌ４２６Ｎｖａ Ｌ４３３Ｎｌｅ又は陰性対照ペプチドＭｅｌａｎ Ａ（ＥＡＡＧＩＧＩＬＴＶ）により２回のペプチド追加免疫（２．５μｇ）を行った。
最終追加免疫の１０日後に、マウスを屠殺して、脾細胞を調製して、１０μｇ／ｍｌの天然ペプチドとのインキュベーションの４８時間後に、ＥＬＩＳＡによりＩＦＮ−γ生産を評価した。データは、ｐｇ／ｍｌでのサイトカイン濃度（三重反復実験の平均値±ＳＤ）として図３２に表した。両方のアナログで追加免疫したマウス由来の脾細胞によるｅｘ
ｖｉｖｏでのサイトカイン生産、及びＳ４２５Ｔ Ｌ４２６Ｎｖａ Ｌ４３３Ｎｌｅに対する応答よりもＬ４２６Ｎｖａ Ｌ４３３Ｎｌｅに対するより高い応答がデータにより示された。
[実施例４７]
アナログによるペプチド追加免疫後のヒト腫瘍細胞系に対するｅｘ ｖｉｖｏでの細胞毒性
ＨＨＤトランスジェニックマウス（ｎ＝４）を、０日目、３日目、１４日目及び１７日目に鼠径リンパ節へ直接接種することにより、ＰＢＳ２５μｌ中のＰＲＡＭＥ425-433を発現するプラスミドであるｐＣＴＬＲ２ ２５μｇで免疫化した。これに続いて、２８日目及び３１日目に、アナログＬ４２６Ｎｖａ Ｌ４３３Ｎｌｅによる２回のペプチド追加免疫（２．５μｇ）を行った。追加免疫の１週後に、脾細胞をｅｘ ｖｉｖｏで天然ペプチドで刺激して、51Ｃｒ標識化したヒト腫瘍細胞（ＩＦＮ−γで前処理したか、若しくは
前処理しないＰＲＡＭＥ+６２４．３８メラノーマ細胞、又は陰性対照６２４．３８細胞、ＨＬＡ−Ａ２発現が欠失）に対して様々なＥ：Ｔ比で試験した。アナログＬ４２６Ｎｖａ Ｌ４３３Ｎｌｅは、Ａ２を発現するヒト腫瘍細胞発現（６２４．３８）に対する有意な細胞毒性を介在する免疫応答を誘発し、ＩＦＮ−γによるそれらの前処理時にわずかに上昇された。対比して、Ａ２−６２４．２８細胞に対しては有意な活性は測定されなかった。図３３を参照されたい。
[実施例４８]
ＰＲＡＭＥ425-433に対するｉｎ ｖｉｔｒｏでの免疫化
ｉｎ ｖｉｔｒｏでの免疫化は、図３４に提示した一般的なスキームに従って実施された。減少血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、フィコール分離により健常なドナー（ＨＬＡ−Ａ*０２０１+）から得られた。新鮮なＰＢＭＣ（２．５×１０6個）を、５ｎｇ／ｍｌのＰＲＡＭＥ425-433又はペプチドアナログとともにＴ細胞培養培地中で平板培養した。続いて、７２及び９６時間後に、２０ＩＵ／ｍｌのインターロイキン２を各ウェルへ添加して、さらなる添加ペプチド（５ｎｇ／ｍｌ）を７日目に添加した。培養物をさらに１０日間インキュベートした後、エフェクター細胞を収集して、四量体染色に使用した。ＩＶＳ ＰＢＭＣをＰＲＡＭＥ425-433四量体で標識化して、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ(BD,San Jose,
CA)上で分析した。四分円を、無関係のＨＢＶ四量体及びＳＳＸ２四量体で染色した陰性対照に基づいて設定して、最低１０，０００ゲートのイベントを捕捉した。四量体陽性細胞は、リンパ球集合のパーセントとして表される。ＰＲＡＭＥ425-433特異的四量体は、天然ペプチドと比較した場合にペプチドアナログによるＩＶＳ後に有意に増強された。図３５を参照のこと。これは、アナログが好適な免疫原になり得ることを実証している。
[実施例４９]
ＰＲＡＭＥ425-433エピトープを発現するプラスミドであるｐＣＴＬＲ２
ｐＣＴＬＲ２は、ＰＲＡＭＥアミノ酸残基４２５〜４３３由来のＨＬＡ Ａ２特異的ＣＴＬエピトープであるＳＬＬＱＨＬＩＧＬ、及びＰＲＡＭＥのエピトープクラスター領域であるアミノ酸４２２〜５０９を有する１つのポリペプチドをコードする組換えＤＮＡプラスミドワクチンである。プラスミド中の上記ポリペプチドに関するｃＤＮＡ配列は、抗原提示細胞による取り込み時にポリペプチドに関するメッセンジャーの効率的な転写を可能にするサイトメガロウイルス（ＣＭＶｐ）由来のプロモーター／エンハンサー配列の制御下にある。コード配列の３’末端にあるウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル（ＢＧＨポリＡ）は、メッセンジャーのポリアデニル化に関するシグナルを提供して、その安定性並びに核から細胞質への移行を増大させる。核へのプラスミド運搬を促進するために、サルウイルス４０由来の核移行配列（ＮＩＳ）をプラスミド骨格へ挿入させている。免疫応答をさらに追加免疫するために、ＣｐＧ免疫賦活モチーフの１つのコピーをプラスミドへ操作している。最後に、プラスミド中の２つの原核生物の遺伝的要素は、Ｅ．ｃｏｌｉにおける増幅、カナマイシン耐性遺伝子（Ｋａｎ Ｒ）及びｐＭＢ細菌複製起点に関与する（図３６を参照）。
免疫原の翻訳産物の配列
コードされるポリペプチドのアミノ酸配列（１５０アミノ酸残基長）を以下に付与する。
ｍａｌｑｓｌｌｑｈｌｉｇｌｓｎｌｔｈｖｌｙｐｖｐｌｅｓｙｅｄｉｈｇｔｌｈｌｅｒｌａｙｌｈａｒｌｒｅｌｌｃｅｌｇｒｐｓｍｖｗｌｓａｎｐｃｐｈｃｇｄｒｔｆｙｄｐｅｐｉｌｃｐｃｆｍｐｎｋｒｓｌｌｑｈｌｉｇｌｇｄａａｙｓｌｌｑｈｌｉｇｌｉｓｐｅｋｅｅｑｙｉａｓｌｌｑｈｌｉｇｌｋｒｐｓｉｋｒｓｌｌｑｈｌｉｇｌ（配列番号１００）。
最初の８９個のアミノ酸残基は、ＰＲＡＭＥ４２２〜５０９を表すエピトープクラスター領域である。このエピトープクラスター領域内に、各種エピトープ予測アルゴリズムを使用して、多数の潜在的なＨＬＡ Ａ２特異的ＣＴＬエピトープが見出されている。アミノ酸残基９０〜１５０は、包埋されたＰＲＡＭＥ４２５〜４３３ＣＴＬエピトープの４つのコピー（太字処理）を有するエピトープ遊離（ｓｙｎｃｈｒｏｔｏｐｅ（商標））配列である。ＰＲＡＭＥ ＣＴＬエピトープのプロセッシングに重要な役割を果たすことが示されている短いアミノ酸配列が、規定ＰＲＡＭＥ ＣＴＬエピトープに隣接している。さらに、アミノ酸配列ｉｓｐｅｋｅｅｑｙｉａ（ＰＲＡＭＥアミノ酸２７６〜２８６に相当、イタクック体で）は、コードされるポリペプチドの発現の検出を促進するためにスティングオブビーズ領域へ組み込まれている。
四量体、ＥＬＩＳＰＯＴ、ＥＬＩＳＡ及び細胞毒性を包含する各種免疫学的アッセイを使用して、エピトープＰＲＡＭＥ425-433に特異的な強力なＣＴＬ応答が、ｐＣＴＬＲ２
プラスミドで免疫化したＨＬＡ−Ａ２トランスジェニックマウスから検出されており、ｐＣＲＬＲ２に関する免疫原性有効性を示唆している。これらのデータにより、上記プラスミドは、抗原提示細胞により摂取されて、コードされるポリペプチドが合成されて、タンパク質分解的にプロセッシングされて、九アミノ酸長エピトープペプチドを生産して、提示のためにＨＬＡ−Ａ２結合されることが示された。
プラスミド構築
長い相補的オリゴヌクレオチドの組の段階的な連結は、「スティングオブビーズ」エピトープ遊離配列（アミノ酸９０〜１５０）のアミノ酸残基をコードするｃＤＮＡの生成をもたらした。これらのｃＤＮＡは、ＰＲＡＭＥエピトープクラスター領域（アミノ酸１〜８９）をコードするｃＤＮＡとのさらなる連結に使用することができる制限酵素のための適切な付着末端を保有し、これらは鋳型としてＰＲＡＭＥをコードするｃＤＮＡに関してＰＣＲを実施することにより増幅された。続いて、挿入片全体が、Ａｆｌ ＩＩとＥｃｏＲ Ｉ部位との間でベクター骨格へ連結された。コード配列全体は、ＤＮＡシーケンシングにより確認された。
[実施例５０]
抗原特異的Ｔ細胞応答の発生
Ｈ−２クラスＩ陰性のＨＬＡ−Ａ２．１トランスジェニックＨＨＤマウスを、病原体を含まない条件下で飼育して、ＨＬＡ−Ａ２．１制限ヒト腫瘍関連細胞毒性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）エピトープの免疫原性の評価に使用した。８〜１２週齢の雌マウスを、ｉｎ ｖｉｖｏでの細胞毒性研究のためのリンパ管内の免疫化及び脾細胞の単離に使用した。マウスを両側からの鼠径リンパ節注入により免疫化した。マウスは、イソフルオランの吸入により麻酔して、無菌条件下で手術を行った。手術の準備後に、鼠径ひだにおいて長さが０．５ｃｍの切開を行い、鼠径リンパ節を露出させた。最大用量のプラスミドＤＮＡワクチン又はペプチド２５μｌ（２５μｇ）を、０．５ｍＬインスリンシリンジを使用してリンパ節へ直接注入した。滅菌６−０ナイロン皮膚縫合糸で創傷を閉じた。
[実施例５１]
ヒト腫瘍細胞に対するｅｘ ｖｉｖｏでの細胞毒性
ＨＨＤトランスジェニックマウス（ｎ＝４／群）を、０日目、３日目、１４日目及び１７日目に、ＰＢＳ２５μｌ中２５μｇ／各リンパ節でｍｅｌａｎ−Ａ26-35Ａ２７エピトープアナログを発現するプラスミドｐＳＥＭ（米国特許出願第１０／２９２，４１３号（公開番号第２００３０２２８６３４号Ａ１）（その全体が参照により援用される）でより完全に記載されている）で免疫化した。これに続いて、アナログＡ２７Ｌ、２７Ｎｖａ又はＡ２７Ｌ Ｖ３５Ｎｖａを用いて、２８日目及び３１日目に２回のさらなるペプチド追加免疫（同量）を行った。追加免疫の１週後に、脾細胞をｅｘ ｖｉｖｏで天然ｍｅｌａ
ｎ−Ａ26-35ペプチドで刺激して、51Ｃｒ標識化したヒト腫瘍細胞（６２４．３８細胞）に対して様々なＥ：Ｔ比で試験した。Ａ２７Ｌ又はＡ２７Ｎｖａアナログで追加免疫した後に得られる免疫性は、天然ペプチドＥＡＡＧＩＧＩＬＴＶに匹敵し、且つより有効であった（図３７）。プライミング用プラスミドは、Ａ２７Ｌアナログを発現するため、実験は上記ペプチドを支持する潜在的な傾向を有しており、その結果、Ａ２７Ｎｖａアナログで得られる相当な細胞毒性は、プライミングが上記の同配列を利用した場合その効力より低く見積もられ得る。
[実施例５２]
四量体分析
ＣＤ８＋抗原特異的Ｔ細胞の測定には、クラスＩのＭＨＣ／ペプチド複合体によるＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の同族認識を要する。これは、それぞれが特異的ペプチドに結合される４つのＨＬＡ ＭＨＣクラスＩ分子の複合体から構成され、且つ蛍光タンパク質と結合されたクラスＩのＭＨＣ四量体を使用して実施することができる。したがって、四量体アッセイは、特定のＭＨＣ分子において複合体形成される所与のタンパク質に特異的な全Ｔ細胞集合の定量化を可能にする。さらに、結合は機能的経路に依存しないため、この集合は、機能的状態に関わらず、特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞すべてを包含する。免疫化動物におけるＣＴＬ応答は、ＨＬＡ−Ａ*０２０１ ＭＡＲＴ１（ＥＬＡＧＩＧＩＬＴＶ）−ＰＥ ＭＨＣ四量体（Beckman Coulter、Ｔ０１００８）又はチロシナーゼ369-377（ＹＭＤＧＴＭＳＱＶ）特異的四量体試薬（ＨＬＡ−Ａ*０２０１チロシナーゼＰＥ、Beckman Coulter）及びＦＩＴＣ結合ラット抗マウスＣＤ８ａ（Ｌｙ−２）モノクローナル抗体(BD Biosciences)を用いて、密度遠心分離(Lympholyte Mammal, Cedarlane Labs)後に減少血から単離した単核細胞を共染色することにより測定した。データは、ＢＤ ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒフローサイトメータを使用して収集し、ｃｅｌｌｑｕｅｓｔソフトウェアを使用して、リンパ球集合をゲーティングすること及びＣＤ８+ＣＴＬ集合内の四量体+細胞の割合を算出することにより分析した。
[実施例５３]
四量体染色（プラスミドプライミング、ペプチド追加免疫−天然対アナログ）
ＨＨＤトランスジェニックマウスの２つの群（ｎ＝８）を、０日目、３日目、１４日目及び１７日目にＰＢＳ２５μｌ中チロシナーゼ３６９−３７７を発現するプラスミド２５μｇ／各リンパ節を鼠径リンパ節へ直接接種することにより免疫化した。これに続いて、２８日目及び３１日目に、天然ペプチド又は３７７Ｎｖａアナログによる２回のさらなるペプチド追加免疫（類似した量）を行った。１０日後、チロシナーゼ３６９−３７７特異的四量体試薬（ＨＬＡ−Ａ*０２０１チロシナーゼ−ＰＥ、Beckman Coulter）を使用して、免疫応答をモニタリングした。個々のマウスを、眼窩洞後静脈を介して出血させて、２，０００ｒｐｍで２５分間、密度遠心分離(Lympholyte Mammal, Cedarlane Labs)を使用してＰＢＭＣを単離した。ＰＢＭＣは、ＣＤ８に対するマウス特異的抗体(BD Biosciences)及びチロシナーゼ四量体試薬で共染色して、特異的パーセントは、ＦＡＣＳ ｃａｌｉｂｅｒフローサイトメータ(BD)を使用して、フローサイトメトリーにより確定された。チロシナーゼ特異的ＣＤ８+細胞のパーセントは、アナログによる天然ペプチドの置換が、チロシナーゼ特異的サブセットの拡張を保存したことを示す。アナログがチロシナーゼ特異的Ｔ細胞の拡張を改善させることができることが傾向により示される（図３８）。
[実施例５４]
ｉｎ ｖｉｖｏでの細胞毒性及び四量体染色（天然ペプチドとアナログ候補物のパネルとの間の直接的な比較）
ＨＨＤトランスジェニックマウスの４つの群（ｎ＝６）を、０日目、３日目、１４日目及び１７日目に、リンパ節１つ当たりＰＢＳ２５μｌ中のチロシナーゼ369-377及びＭｅｌａｎ−Ａ26-35Ａ２７Ｌエピトープを発現するプラスミド（ｐＳＥＭ）２５μｇを鼠径
リンパ節へ直接接種することにより免疫化した。これに続いて、２８日目及び３１日目に、左鼠径リンパ節へのＭｅｌａｎ−Ａ26-35Ａ２７Ｌ並びに右鼠径リンパ節への第１及び／又は第２のアンカー残基での置換を保有するチロシナーゼ369-377アナログの２回のさらなるペプチド追加免疫（類似した量）を行った。対照として、プラスミドのみで免疫化したマウス又は未処置マウスを使用した。
天然チロシナーゼ及びＭｅｌａｎ Ａエピトープに対するｉｎ ｖｉｖｏでの応答を評価するために、脾細胞を同腹子対照ＨＨＤマウスから単離して、個々にＨＬ−１無血清培地(Cambrex)中で２０×１０6個の細胞／ｍｌの濃度で２０μｇ／ｍＬの天然ペプチド（Ｍｅｌａｎ−Ａ26-35又はチロシナーゼ369-377）とともに２時間インキュベートした。続いて、これらの細胞をＣＦＳＥ（Ｖｙｂｒａｎｔ ＣＦＤＡ ＳＥ細胞トレーサーキット、Molecular Probes）で染色して（それぞれ１及び２．５μＭ、１５分間）、ＣＦＳＥlo蛍光（０．４μＭ）で染色した同等数の対照非ペプチドコーティング脾細胞とともに免疫化ＨＨＤマウス又は未処置対照ＨＨＤマウスの静脈内へ同時注入した。１８時間後、標的細胞の特異的な排除は、誘発された動物から脾臓を取り出すこと、及びフローサイトメトリーにより得られた細胞懸濁液中のＣＦＳＥ蛍光を測定することにより測定された。ペプチド注入した脾細胞に対応する集合の相対的な減少は、対照（未注入）集合に対して算出され、％特異的溶解率として表した。さらに、チロシナーゼ369-377及びＭｅｌａｎ−Ａ26-35特異的Ｔ細胞の頻度は、四量体／ＣＤ８共染色（ＨＬＡ−Ａ*０２０１四量体、Beckman
Coulter）により評価した。
チロシナーゼアナログＶ３７７Ｎｖａは、天然ペプチドと同様に、及びチロシナーゼアナログＭ３７０Ｖ Ｖ３７７Ｎｖａよりも多く、チロシナーゼ特異的Ｔ細胞の集合を拡張させ、且つ細胞毒性免疫性を増幅させることが可能であった（図３９）。
[実施例５５]
ヒト腫瘍細胞に対するｅｘ ｖｉｖｏでの細胞毒性
ＨＨＤトランスジェニックマウス（ｎ＝４／群）を、０日目、３日目、１４日目及び１７日目に、リンパ節１つ当たりＰＢＳ２５μｌ中のチロシナーゼ369-377エピトープを発現するプラスミド（ｐＳＥＭ）２５μｇを鼠径リンパ節へ直接接種することにより免疫化した（図４０における一般的なプロトコルに従って）。これに続いて、天然ペプチド又は第１のアンカー残基Ｐ２及びＰΩ（３７０及び３７７）での置換を保有するアナログを用いて、２８日目及び３１日目に２回のペプチド追加免疫（同量）を行った。追加免疫の１週後に、脾細胞をｅｘ ｖｉｖｏで天然チロシナーゼ369-377ペプチドで刺激して、51Ｃｒ標識化したヒト腫瘍細胞（６２４．３８細胞）に対して様々なＥ：Ｔ比でアッセイした。天然ペプチド及びＭ３７０Ｖ Ｖ３７７Ｎｖａアナログは、６２４．３８細胞に対して強健な細胞毒性を発生させた（図４１）。天然ペプチドでは細胞溶解性活性の幾らかの希釈が見られたのに対して、アナログでは全く見られず、実施例５２における四量体の結果から得られるより大きな免疫原性の徴候を強化した。先行例と合わせると、この観察は、よりストリジェントなアッセイ（ｉｎ ｖｉｖｏでの細胞毒性及び四量体染色）をより高感度アッセイ（ｉｎ ｖｉｔｒｏでの刺激後のｅｘ ｖｉｖｏでの細胞毒性）を補完することの有用性を示しており、潜在的に有用なアナログを概要する。
上述の様々な方法及び技法は、本発明を実施するための多数の方法を提供する。当然のことながら、記載される目的及び利点の必ずしもすべてが、本明細書中に記載する任意の特定の実施形態により達成され得るわけではないことが理解されよう。したがって、例えば、上記方法は、本明細書中に教示されるある利点又は利点の群を、本明細書中に教示又は示唆され得るような他の目的又は利点を必ずしも達成せずに、達成或いは最適化する様式で実施されてもよいことが当業者に理解されよう。
さらに、当業者は、種々の実施形態からの様々な特徴の互換性を認識するであろう。同様に、上記で論述される様々な要素、特徴及び工程、並びにこのような要素、特徴又は工程それぞれに関する他の既知の等価体は、当業者により混合及び調和されて、本明細書中に記載する原理による方法を実施することができる。様々な要素、特徴及び工程には、具体的に包含されるものもあれば、多様な実施形態で具体的に排除されるものもある。
本発明は、ある特定の実施形態及び実施例の内容で開示されているが、本発明は、具体的に開示される実施形態を超えて、他の代替的実施形態及び／又は使用、並びにそれらの明瞭な変更及びこれらの等価体にまで拡大することが当業者に理解されよう。
9 mer（９アミノ酸長）の各アミノ酸部位でのＳＳＸ−２41-49アナログについて調査した置換を要約した図である。 10 mer（１０アミノ酸長）の各アミノ酸部位でのＳＳＸ−２41-49アナログについて調査した置換を要約した図である。 アナログ同定のための好ましい実施形態の方法の概略図である。 １つの部位で置換されたＳＳＸ−２41-49アナログの交差反応性及び機能的結合力を示す表である。 ２つの部位で置換されたＳＳＸ−２41-49アナログの交差反応性及び機能的結合力を示す表である。 ２つを超える部位で置換されたＳＳＸ−２41-49アナログの交差反応性及び機能的結合力を示す表である。 ４１〜４９個のペプチドを含む、一般的に知られるＳＳＸ−２41-49十アミ ノ酸長アナログの交差反応性及び機能的結合力を示す表である。 ＳＳＸ−２41-49アナログの注射スキームを示す図である。 腫瘍細胞溶解におけるＳＳＸ−２41-49Ａ４２Ｖ、Ａ４２Ｌアナログ、及び野生型の活性を示す図である。 追加免疫のためにＳＳＸ−２41-49アナログペプチドを使用したｉｎ ｖｉｖｏでの細胞毒性研究及びｅｘ ｖｉｖｏでの細胞毒性研究のための注射スキームを示す図である。 対照（野生型ペプチド）及びＥＡＡ（Ｍｅｌａｎ Ａ２６−３５）と比較した多数のアナログについてのｉｎ ｖｉｖｏでの特異的溶解の結果を示す表である。 対照（野生型ペプチド）及びＥＡＡ（Ｍｅｌａｎ Ａ２６−３５）と比較した多数のアナログについてのｉｎ ｖｉｖｏでの特異的溶解の結果並びにＭＨＣ結合及びＭＨＣ安定性を示す表である。 野生型の対照と比較した多数のアナログでの免疫化後に行った腫瘍細胞（６２４．３８ヒト腫瘍細胞）の特異的溶解率を示す図である。 9 mer（９アミノ酸長）及び10 mer（１０アミノ酸長）についての各アミノ酸部位で調査した置換並びに得られた結果を要約した図である。 9 mer（９アミノ酸長）及び10 mer（１０アミノ酸長）についての各アミノ酸部位で調査した置換並びに得られた結果を要約した図である。 9 mer（９アミノ酸長）及び10 mer（１０アミノ酸長）についての各アミノ酸部位で調査した置換並びに得られた結果を要約した図である。 ＮＹ−ＥＳＯ−１アナログの分析及び試験のために使用した注射スキームを示す図である。 誘発した動物由来の脾臓及びＰＢＭＣの除去及びフローサイトメトリーによるＣＦＳＥ蛍光の測定によって測定した標的細胞の特異的消失を示す図である。 誘発した動物由来の脾臓及びＰＢＭＣの除去及びフローサイトメトリーによるＣＦＳＥ蛍光の測定によって測定した標的細胞の特異的消失を示す図である。 誘発した動物由来の脾臓及びＰＢＭＣの除去及びフローサイトメトリーによるＣＦＳＥ蛍光の測定によって測定した標的細胞の特異的消失を示す図である。 ＮＹ−ＥＳＯ−１アナログでの追加免疫後に野生型ペプチドでコーティングした標的細胞に対するｉｎ ｖｉｖｏでの細胞毒性を示す図である。 ＮＹ−ＥＳＯ−１アナログでの追加免疫後に野生型ペプチドでコーティングした標的細胞に対するｉｎ ｖｉｖｏでの細胞毒性を示す図である。 サイトカイン産生によって評価した野生型エピトープに対する免疫性の増強を誘発するアナログの能力のｅｘ ｖｉｖｏでの分析を示す図である。 サイトカイン産生によって評価した野生型エピトープに対する免疫性の増強を誘発するアナログの能力のｅｘ ｖｉｖｏでの分析を示す図である。 ＰＳＭＡ288-297エピトープの抗原性を実証するためのプロトコール及び試験結果を示す図である。 １つの部位で置換されたＰＳＭＡ288-297アナログの交差反応性及び機能的結合力を示す表である。 ２つの部位で置換されたＰＳＭＡ288-297アナログの交差反応性及び機能的結合力を示す表である。 ２つを超える部位で置換されたＰＳＭＡ288-297アナログの交差反応性及び機能的結合力を示す表である。 Ｅｌｉｓｐｏｔによって測定した種々のＰＳＭＡ288-297アナログの免疫原性を示す図である。 Ｅｌｉｓｐｏｔによって測定したＩ２９７Ｖアナログによる抗ＰＳＭＡ288-297応答の増幅に関するアッセイの結果を示す図である。 Ｉ２９７Ｖアナログでの追加免疫の結果を示す図である。アッセイは、追加免疫によってＰＳＭＡ+ヒト腫瘍株に対する細胞毒性免疫が得られることを示した。 ＰＲＡＭＥ425-433エピトープの抗原性を実証するためのプロトコール及び試験結果を示す図である。 １つの部位で置換されたＰＲＡＭＥ425-433アナログの交差反応性及び機能的結合力を示す表である。 ２つの部位で置換されたＰＲＡＭＥ425-433アナログの交差反応性及び機能的結合力を示す表である。 ２つの部位で置換されたＰＲＡＭＥ425-433アナログの交差反応性及び機能的結合力を示す表である。 ２つを超える部位で置換されたＰＲＡＭＥ425-433アナログの交差反応性及び機能的結合力を示す表である。 Ｅｌｉｓｐｏｔによって測定したＰＲＡＭＥ425-433アナログの免疫原性を示す図である。 Ｌ４２６Ｎｖａ Ｌ４３３Ｎｌｅアナログでの追加免疫の結果を示す図である。アッセイは、追加免疫によって天然エピトープをコーティングした細胞に対する細胞毒性免疫が得られることを示した。 ＰＲＡＭＥアナログのｉｎ ｖｉｖｏでの評価のためのプロトコール及び評価結果を示す図である。 アナログ誘導された天然エピトープ再刺激Ｔ細胞におけるサイトカイン産生のｅｘ ｖｉｖｏでの刺激のためのプロトコールを示す図である。 Ｌ４２６Ｎｖａ Ｌ４３３Ｎｌｅアナログでの追加免疫の結果を示す図である。アッセイは、追加免疫によってヒト腫瘍細胞株に対する細胞毒性免疫が得られることを示した。 ＰＲＡＭＥ425-433に対するｉｎ ｖｉｔｒｏでの免疫化のためのプロトコールを示す図である。 ＰＲＡＭＥ425-433アナログでのｉｎ ｖｉｔｒｏでの免疫化後の四量体分析の結果を示す図である。 プラスミド（ｐＣＴＬＲ２）（ＰＲＡＭＥ425-433エピトープを発現するプラスミド）の構造を示す図である。 ヒト腫瘍細胞をプラスミドＤＮＡでプライミングし、ペプチドで追加免疫したＴ細胞で溶解した実験のアッセイ結果を示す図である。 Ｔｙｒ369-377でのプラスミドプライミング及びＶ３７７ｖａアナログでのペプチド追加免疫後の四量体分析結果を示す図である。 多価ＭｅｌａｎＡ Ａ２７Ｎｖａ／チロシナーゼアナログ免疫化動物を用いたＣＦＳＥのｉｎ ｖｉｖｏ誘導の結果を示す図である。 チロシナーゼアナログ免疫原性評価プロトコールの概略図である。 プラスミドでプライミングし、Ｔｙｒ369-377アナログで追加免疫したＨＨＤ由来のエフェクター細胞でコーティングした６２４．３８細胞に体する免疫応答の結果を示す図である。

Claims (17)

  1. 下記配列：
    Ｋ｛Ｌ、Ｖ、Ｍ、Ａｂｕ、Ｎｌｅ又はＮｖａ｝ＳＥＫＩＦＹＶ、又は
    ｛Ｆ、Ｙ又はＰｈｇ｝ＡＳＥＫＩＦＹＶ、又は
    ＹＶＳＥＫＩＦＹＶ、又は
    Ｆ｛Ｌ、Ｖ、又はＩ｝ＳＥＫＩＦＹＶ、又は
    Ｗ｛Ｌ又はＩ｝ＳＥＫＩＦＹＶ、又は
    Ｋ｛Ｖ又はＬ｝ＳＥＫＩＦＹＩ、又は
    ＦＶＳＥＫＩＦＹ｛Ｉ又はＮｖａ｝
    からなる、単離ペプチド。
  2. 下記配列：
    Ｋ｛Ｖ又はＬ｝ＳＥＫＩＦＹＶ、又は
    ｛Ｆ又はＹ｝ＡＳＥＫＩＦＹＶ、又は
    ＦＶＳＥＫＩＦＹＩ、又は
    ＫＶＳＥＫＩＦＹＶ
    からなる、請求項１に記載の単離ペプチド。
  3. 配列ＫＶＳＥＫＩＦＹＶからなる、請求項１に記載の単離ペプチド。
  4. クラスＩＭＨＣペプチドの結合溝に対して親和性を有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の単離ペプチド。
  5. 前記クラスＩＭＨＣがＨＬＡ−Ａ２である、請求項４に記載の単離ペプチド。
  6. 請求項１〜３のいずれか１項に記載のペプチドの配列からなるペプチドとクラスＩＭＨＣを含む、クラスＩＭＨＣ／ペプチド複合体。
  7. クラスＩＭＨＣ／ＳＳＸ−２41-49複合体を認識するＴＣＲと交差反応性である、請求項６に記載のクラスＩＭＨＣ／ペプチド複合体。
  8. 前記クラスＩＭＨＣ／複合体は、ＨＬＡ−Ａ２／ＳＳＸ−２41-49複合体である、請求項７に記載のクラスＩＭＨＣ／ペプチド複合体。
  9. 遊離配列と結合した請求項１〜３のいずれか１項に記載のペプチド配列からなるポリペプチド。
  10. 請求項１〜３のいずれか１項に記載のペプチドを含む免疫原性組成物。
  11. 請求項９に記載のポリペプチドを含む免疫原性組成物。
  12. 請求項９に記載のポリペプチドをコードする核酸。
  13. 請求項１〜３のいずれか１項に記載のペプチドをコードする核酸。
  14. 請求項１２又は１３に記載の核酸を含む免疫原性組成物。
  15. 請求項１０に記載の組成物を含む、ＣＴＬ応答を誘導、維持又は増幅させるための筋内投与用の医薬。
  16. 請求項１０、１１又は１４に記載の組成物と免疫増強剤を含む、クラスＩＭＨＣに制限されるＴ細胞応答を同調させるための節内投与用の医薬。
  17. 請求項１４に記載の組成物を含む、ＣＴＬ応答を誘導、維持又は同調させるための節内投与用の医薬。
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