JP5087201B2 - 抗原に小胞体シャペロンポリペプチドを連結した分子ワクチン - Google Patents
抗原に小胞体シャペロンポリペプチドを連結した分子ワクチン Download PDFInfo
- Publication number
- JP5087201B2 JP5087201B2 JP2002518253A JP2002518253A JP5087201B2 JP 5087201 B2 JP5087201 B2 JP 5087201B2 JP 2002518253 A JP2002518253 A JP 2002518253A JP 2002518253 A JP2002518253 A JP 2002518253A JP 5087201 B2 JP5087201 B2 JP 5087201B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- polypeptide
- cell
- cells
- nucleic acid
- crt
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims description 339
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title claims description 215
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 title claims description 189
- 108010006519 Molecular Chaperones Proteins 0.000 title claims description 65
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 title claims description 64
- 239000000427 antigen Substances 0.000 title claims description 62
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 title claims description 62
- 210000002472 endoplasmic reticulum Anatomy 0.000 title description 65
- 108010008038 Synthetic Vaccines Proteins 0.000 title description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 221
- 108090000549 Calreticulin Proteins 0.000 claims description 182
- 102000004082 Calreticulin Human genes 0.000 claims description 181
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 99
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 83
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 76
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 76
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 65
- 102100034922 T-cell surface glycoprotein CD8 alpha chain Human genes 0.000 claims description 63
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 63
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 claims description 54
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 54
- 108091054437 MHC class I family Proteins 0.000 claims description 48
- 102000043129 MHC class I family Human genes 0.000 claims description 46
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 claims description 43
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 claims description 40
- 230000028993 immune response Effects 0.000 claims description 36
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 claims description 35
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 32
- 230000004927 fusion Effects 0.000 claims description 31
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 26
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 claims description 25
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 21
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 19
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 17
- 230000004044 response Effects 0.000 claims description 17
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 claims description 16
- 241000710960 Sindbis virus Species 0.000 claims description 15
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 15
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 14
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 13
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 13
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 11
- 239000007924 injection Substances 0.000 claims description 11
- 238000002347 injection Methods 0.000 claims description 11
- 241000341655 Human papillomavirus type 16 Species 0.000 claims description 10
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 10
- 244000052769 pathogen Species 0.000 claims description 10
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 8
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 claims description 7
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims description 6
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 claims description 6
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 5
- 101000793651 Homo sapiens Calreticulin Proteins 0.000 claims description 5
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 claims description 5
- 210000001130 astrocyte Anatomy 0.000 claims description 4
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 4
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical group [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 239000010931 gold Substances 0.000 claims description 4
- 210000002510 keratinocyte Anatomy 0.000 claims description 4
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 claims description 4
- 210000000274 microglia Anatomy 0.000 claims description 4
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 claims description 4
- 102000053922 human CALR Human genes 0.000 claims description 3
- 230000002601 intratumoral effect Effects 0.000 claims description 3
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 claims description 3
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims description 2
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 claims description 2
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 claims 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 claims 1
- 230000002101 lytic effect Effects 0.000 claims 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 125
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 106
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 90
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 87
- 101710163595 Chaperone protein DnaK Proteins 0.000 description 63
- 101710178376 Heat shock 70 kDa protein Proteins 0.000 description 63
- 101710152018 Heat shock cognate 70 kDa protein Proteins 0.000 description 63
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 60
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 60
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 59
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 59
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 55
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 48
- 229940022005 RNA vaccine Drugs 0.000 description 35
- 108700021021 mRNA Vaccine Proteins 0.000 description 35
- 108010041986 DNA Vaccines Proteins 0.000 description 32
- 229940021995 DNA vaccine Drugs 0.000 description 32
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 29
- 102100036011 T-cell surface glycoprotein CD4 Human genes 0.000 description 28
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 28
- 101000767631 Human papillomavirus type 16 Protein E7 Proteins 0.000 description 26
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 26
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 25
- 210000004988 splenocyte Anatomy 0.000 description 25
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 24
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 23
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 23
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 22
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 21
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 21
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 21
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 17
- 241000701806 Human papillomavirus Species 0.000 description 16
- 102000002812 Heat-Shock Proteins Human genes 0.000 description 15
- 108010004889 Heat-Shock Proteins Proteins 0.000 description 15
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 15
- 230000001640 apoptogenic effect Effects 0.000 description 15
- 206010056342 Pulmonary mass Diseases 0.000 description 14
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 14
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 14
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 13
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 13
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 13
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 13
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 13
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 12
- 102100028082 Tapasin Human genes 0.000 description 12
- 108010059434 tapasin Proteins 0.000 description 12
- 108010056891 Calnexin Proteins 0.000 description 11
- 102000034342 Calnexin Human genes 0.000 description 11
- 108091061960 Naked DNA Proteins 0.000 description 11
- 230000006870 function Effects 0.000 description 11
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 description 11
- 238000001543 one-way ANOVA Methods 0.000 description 11
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 11
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 10
- 230000001772 anti-angiogenic effect Effects 0.000 description 10
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 10
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 10
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 10
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 10
- 238000011580 nude mouse model Methods 0.000 description 10
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 10
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 10
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 9
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 9
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 description 9
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 9
- 102000004388 Interleukin-4 Human genes 0.000 description 9
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 description 9
- 102000003855 L-lactate dehydrogenase Human genes 0.000 description 9
- 108700023483 L-lactate dehydrogenases Proteins 0.000 description 9
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 9
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 9
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 9
- 230000005809 anti-tumor immunity Effects 0.000 description 8
- 230000014102 antigen processing and presentation of exogenous peptide antigen via MHC class I Effects 0.000 description 8
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 8
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 8
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 8
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 7
- 108700018351 Major Histocompatibility Complex Proteins 0.000 description 7
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 7
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 7
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 7
- 241001493065 dsRNA viruses Species 0.000 description 7
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 7
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 7
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 7
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 7
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 7
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 7
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 7
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 7
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 7
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 7
- 241000710929 Alphavirus Species 0.000 description 6
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 6
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 6
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 6
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 6
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 6
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 6
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 6
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 6
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 6
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 6
- 206010061289 metastatic neoplasm Diseases 0.000 description 6
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 6
- 239000000816 peptidomimetic Substances 0.000 description 6
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 6
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 6
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 5
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 5
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 5
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 5
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 5
- 108010004729 Phycoerythrin Proteins 0.000 description 5
- 230000024932 T cell mediated immunity Effects 0.000 description 5
- 238000011161 development Methods 0.000 description 5
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 5
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 5
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 5
- 210000000207 lymphocyte subset Anatomy 0.000 description 5
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 5
- 210000004088 microvessel Anatomy 0.000 description 5
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- 230000002685 pulmonary effect Effects 0.000 description 5
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 5
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 5
- 230000020382 suppression by virus of host antigen processing and presentation of peptide antigen via MHC class I Effects 0.000 description 5
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 5
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 5
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 4
- 206010008342 Cervix carcinoma Diseases 0.000 description 4
- 238000011238 DNA vaccination Methods 0.000 description 4
- 101150013359 E7 gene Proteins 0.000 description 4
- 102100039328 Endoplasmin Human genes 0.000 description 4
- 102000004457 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 4
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 4
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 4
- 102000005431 Molecular Chaperones Human genes 0.000 description 4
- 241000710961 Semliki Forest virus Species 0.000 description 4
- 108091008874 T cell receptors Proteins 0.000 description 4
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 description 4
- 208000006105 Uterine Cervical Neoplasms Diseases 0.000 description 4
- 230000033115 angiogenesis Effects 0.000 description 4
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 4
- 238000009566 cancer vaccine Methods 0.000 description 4
- 229940022399 cancer vaccine Drugs 0.000 description 4
- -1 capsids Proteins 0.000 description 4
- 238000009125 cardiac resynchronization therapy Methods 0.000 description 4
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 4
- 201000010881 cervical cancer Diseases 0.000 description 4
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 4
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 4
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 4
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 4
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 4
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 4
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 4
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 description 4
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 description 4
- 108010017007 glucose-regulated proteins Proteins 0.000 description 4
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 4
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 4
- 239000012642 immune effector Substances 0.000 description 4
- 229940121354 immunomodulator Drugs 0.000 description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 4
- 230000021633 leukocyte mediated immunity Effects 0.000 description 4
- 230000001394 metastastic effect Effects 0.000 description 4
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 4
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 4
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 4
- 231100001221 nontumorigenic Toxicity 0.000 description 4
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 4
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 4
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 4
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 4
- 241000894007 species Species 0.000 description 4
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 4
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 4
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 4
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 4
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 3
- QOSSAOTZNIDXMA-UHFFFAOYSA-N Dicylcohexylcarbodiimide Chemical compound C1CCCCC1N=C=NC1CCCCC1 QOSSAOTZNIDXMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 3
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 3
- 101000839464 Leishmania braziliensis Heat shock 70 kDa protein Proteins 0.000 description 3
- 102100035133 Lysosome-associated membrane glycoprotein 1 Human genes 0.000 description 3
- 101710116782 Lysosome-associated membrane glycoprotein 1 Proteins 0.000 description 3
- 102000043131 MHC class II family Human genes 0.000 description 3
- 108091054438 MHC class II family Proteins 0.000 description 3
- 108010023335 Member 2 Subfamily B ATP Binding Cassette Transporter Proteins 0.000 description 3
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 3
- 241001631646 Papillomaviridae Species 0.000 description 3
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 3
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 3
- 108010065868 RNA polymerase SP6 Proteins 0.000 description 3
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 3
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 3
- 230000005867 T cell response Effects 0.000 description 3
- 210000000173 T-lymphoid precursor cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000030741 antigen processing and presentation Effects 0.000 description 3
- 230000005975 antitumor immune response Effects 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 3
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 3
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 3
- 230000036541 health Effects 0.000 description 3
- 230000028996 humoral immune response Effects 0.000 description 3
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 3
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 3
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 3
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 3
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 3
- 238000007913 intrathecal administration Methods 0.000 description 3
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 3
- 125000005647 linker group Chemical group 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 210000004877 mucosa Anatomy 0.000 description 3
- 108010091748 peptide A Proteins 0.000 description 3
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 3
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 3
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 3
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 3
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 3
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 3
- 229940023143 protein vaccine Drugs 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 3
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 3
- 238000011200 topical administration Methods 0.000 description 3
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 2
- 102100030346 Antigen peptide transporter 1 Human genes 0.000 description 2
- XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N Argon Chemical compound [Ar] XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000017420 CD3 protein, epsilon/gamma/delta subunit Human genes 0.000 description 2
- 101150010856 CRT gene Proteins 0.000 description 2
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 2
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 description 2
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101710113864 Heat shock protein 90 Proteins 0.000 description 2
- 102000008949 Histocompatibility Antigens Class I Human genes 0.000 description 2
- 101001044447 Homo sapiens Interferon kappa Proteins 0.000 description 2
- 101001012157 Homo sapiens Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2 Proteins 0.000 description 2
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 2
- 241000713772 Human immunodeficiency virus 1 Species 0.000 description 2
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 2
- 102100022469 Interferon kappa Human genes 0.000 description 2
- 125000003412 L-alanyl group Chemical group [H]N([H])[C@@](C([H])([H])[H])(C(=O)[*])[H] 0.000 description 2
- 125000000415 L-cysteinyl group Chemical group O=C([*])[C@@](N([H])[H])([H])C([H])([H])S[H] 0.000 description 2
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 2
- 102000004856 Lectins Human genes 0.000 description 2
- 108090001090 Lectins Proteins 0.000 description 2
- 241000589242 Legionella pneumophila Species 0.000 description 2
- 239000012097 Lipofectamine 2000 Substances 0.000 description 2
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 2
- 241000714177 Murine leukemia virus Species 0.000 description 2
- 241000187479 Mycobacterium tuberculosis Species 0.000 description 2
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 2
- 241000223960 Plasmodium falciparum Species 0.000 description 2
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 2
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 2
- 102100030086 Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2 Human genes 0.000 description 2
- 201000000582 Retinoblastoma Diseases 0.000 description 2
- 241000713311 Simian immunodeficiency virus Species 0.000 description 2
- 108700009124 Transcription Initiation Site Proteins 0.000 description 2
- 206010046865 Vaccinia virus infection Diseases 0.000 description 2
- 241000710959 Venezuelan equine encephalitis virus Species 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 2
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 2
- 125000006295 amino methylene group Chemical group [H]N(*)C([H])([H])* 0.000 description 2
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 2
- 238000003149 assay kit Methods 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 230000036770 blood supply Effects 0.000 description 2
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 2
- 210000002798 bone marrow cell Anatomy 0.000 description 2
- AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M caesium chloride Chemical compound [Cl-].[Cs+] AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 2
- 239000002458 cell surface marker Substances 0.000 description 2
- 230000010307 cell transformation Effects 0.000 description 2
- 230000007969 cellular immunity Effects 0.000 description 2
- 230000036755 cellular response Effects 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 2
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 238000012137 double-staining Methods 0.000 description 2
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 2
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 2
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 2
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 2
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000003630 glycyl group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 2
- 239000001307 helium Substances 0.000 description 2
- 229910052734 helium Inorganic materials 0.000 description 2
- SWQJXJOGLNCZEY-UHFFFAOYSA-N helium atom Chemical compound [He] SWQJXJOGLNCZEY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000002443 helper t lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 2
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 2
- 230000002055 immunohistochemical effect Effects 0.000 description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 239000002523 lectin Substances 0.000 description 2
- 210000002414 leg Anatomy 0.000 description 2
- 229940115932 legionella pneumophila Drugs 0.000 description 2
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 2
- 238000007834 ligase chain reaction Methods 0.000 description 2
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 2
- 210000003141 lower extremity Anatomy 0.000 description 2
- 208000037841 lung tumor Diseases 0.000 description 2
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 2
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 2
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 229940022007 naked DNA vaccine Drugs 0.000 description 2
- 230000001338 necrotic effect Effects 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 2
- XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M propidium iodide Chemical compound [I-].[I-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CCC[N+](C)(CC)CC)=C1C1=CC=CC=C1 XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 230000012846 protein folding Effects 0.000 description 2
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 2
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 2
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M sodium pyruvate Chemical compound [Na+].CC(=O)C([O-])=O DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000003153 stable transfection Methods 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 238000004809 thin layer chromatography Methods 0.000 description 2
- 210000002303 tibia Anatomy 0.000 description 2
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 2
- 238000012384 transportation and delivery Methods 0.000 description 2
- 231100000588 tumorigenic Toxicity 0.000 description 2
- 230000000381 tumorigenic effect Effects 0.000 description 2
- 208000007089 vaccinia Diseases 0.000 description 2
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- AWNBSWDIOCXWJW-WTOYTKOKSA-N (2r)-n-[(2s)-1-[[(2s)-1-(2-aminoethylamino)-1-oxopropan-2-yl]amino]-3-naphthalen-2-yl-1-oxopropan-2-yl]-n'-hydroxy-2-(2-methylpropyl)butanediamide Chemical compound C1=CC=CC2=CC(C[C@H](NC(=O)[C@@H](CC(=O)NO)CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCCN)=CC=C21 AWNBSWDIOCXWJW-WTOYTKOKSA-N 0.000 description 1
- BDNKZNFMNDZQMI-UHFFFAOYSA-N 1,3-diisopropylcarbodiimide Chemical compound CC(C)N=C=NC(C)C BDNKZNFMNDZQMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710197241 Accessory gland-specific peptide 70A Proteins 0.000 description 1
- 241000701242 Adenoviridae Species 0.000 description 1
- 102400000068 Angiostatin Human genes 0.000 description 1
- 108010079709 Angiostatins Proteins 0.000 description 1
- 108090000672 Annexin A5 Proteins 0.000 description 1
- 102000004121 Annexin A5 Human genes 0.000 description 1
- 102100030343 Antigen peptide transporter 2 Human genes 0.000 description 1
- 241000701412 Baculoviridae Species 0.000 description 1
- 108010006654 Bleomycin Proteins 0.000 description 1
- 241000588832 Bordetella pertussis Species 0.000 description 1
- 241001148111 Brucella suis Species 0.000 description 1
- 101100071585 Caenorhabditis elegans hsp-16.2 gene Proteins 0.000 description 1
- 102100029968 Calreticulin Human genes 0.000 description 1
- 101710098119 Chaperonin GroEL 2 Proteins 0.000 description 1
- 102000019034 Chemokines Human genes 0.000 description 1
- 108010012236 Chemokines Proteins 0.000 description 1
- 241000606161 Chlamydia Species 0.000 description 1
- 241001647372 Chlamydia pneumoniae Species 0.000 description 1
- 241000606153 Chlamydia trachomatis Species 0.000 description 1
- 102100031186 Chromogranin-A Human genes 0.000 description 1
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 1
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 1
- 241000450599 DNA viruses Species 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- 102000007260 Deoxyribonuclease I Human genes 0.000 description 1
- 108010008532 Deoxyribonuclease I Proteins 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 238000008157 ELISA kit Methods 0.000 description 1
- 241000605310 Ehrlichia chaffeensis Species 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 102400001047 Endostatin Human genes 0.000 description 1
- 108010079505 Endostatins Proteins 0.000 description 1
- 108010009900 Endothelial Protein C Receptor Proteins 0.000 description 1
- 102100030024 Endothelial protein C receptor Human genes 0.000 description 1
- YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N Epihygromycin Natural products OC1C(O)C(C(=O)C)OC1OC(C(=C1)O)=CC=C1C=C(C)C(=O)NC1C(O)C(O)C2OCOC2C1O YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- VGGSQFUCUMXWEO-UHFFFAOYSA-N Ethene Chemical compound C=C VGGSQFUCUMXWEO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005977 Ethylene Substances 0.000 description 1
- 108010040476 FITC-annexin A5 Proteins 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 241000713813 Gibbon ape leukemia virus Species 0.000 description 1
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- 108010027992 HSP70 Heat-Shock Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000018932 HSP70 Heat-Shock Proteins Human genes 0.000 description 1
- 241000700586 Herpesviridae Species 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 101000812663 Homo sapiens Endoplasmin Proteins 0.000 description 1
- 206010020429 Human ehrlichiosis Diseases 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 206010061598 Immunodeficiency Diseases 0.000 description 1
- 208000029462 Immunodeficiency disease Diseases 0.000 description 1
- 125000000570 L-alpha-aspartyl group Chemical group [H]OC(=O)C([H])([H])[C@]([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 125000002059 L-arginyl group Chemical group O=C([*])[C@](N([H])[H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])N([H])C(=N[H])N([H])[H] 0.000 description 1
- 125000000010 L-asparaginyl group Chemical group O=C([*])[C@](N([H])[H])([H])C([H])([H])C(=O)N([H])[H] 0.000 description 1
- 125000002066 L-histidyl group Chemical group [H]N1C([H])=NC(C([H])([H])[C@](C(=O)[*])([H])N([H])[H])=C1[H] 0.000 description 1
- 125000002061 L-isoleucyl group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])[C@](C([H])([H])[H])([H])C(C([H])([H])[H])([H])[H] 0.000 description 1
- 125000003440 L-leucyl group Chemical group O=C([*])[C@](N([H])[H])([H])C([H])([H])C(C([H])([H])[H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 125000001176 L-lysyl group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C(N([H])[H])([H])[H] 0.000 description 1
- 125000002842 L-seryl group Chemical group O=C([*])[C@](N([H])[H])([H])C([H])([H])O[H] 0.000 description 1
- 125000000769 L-threonyl group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])[C@](O[H])(C([H])([H])[H])[H] 0.000 description 1
- 125000002707 L-tryptophyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C2C(C([C@](N([H])[H])(C(=O)[*])[H])([H])[H])=C([H])N([H])C2=C1[H] 0.000 description 1
- 125000003580 L-valyl group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(C([H])([H])[H])(C([H])([H])[H])[H] 0.000 description 1
- 241000186779 Listeria monocytogenes Species 0.000 description 1
- PEEHTFAAVSWFBL-UHFFFAOYSA-N Maleimide Chemical compound O=C1NC(=O)C=C1 PEEHTFAAVSWFBL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000011202 Member 2 Subfamily B ATP Binding Cassette Transporter Human genes 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102100026262 Metalloproteinase inhibitor 2 Human genes 0.000 description 1
- 108060004795 Methyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 101000793654 Mus musculus Calreticulin Proteins 0.000 description 1
- 241000186359 Mycobacterium Species 0.000 description 1
- 241000186367 Mycobacterium avium Species 0.000 description 1
- 108700009457 Mycobacterium tuberculosis HSP70 Proteins 0.000 description 1
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 206010029113 Neovascularisation Diseases 0.000 description 1
- 102000007999 Nuclear Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010089610 Nuclear Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108020004711 Nucleic Acid Probes Proteins 0.000 description 1
- 108700001237 Nucleic Acid-Based Vaccines Proteins 0.000 description 1
- 108091005461 Nucleic proteins Proteins 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 241000526686 Paracoccidioides brasiliensis Species 0.000 description 1
- 241000701945 Parvoviridae Species 0.000 description 1
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000700625 Poxviridae Species 0.000 description 1
- 101710132595 Protein E7 Proteins 0.000 description 1
- 108010066717 Q beta Replicase Proteins 0.000 description 1
- 101000793674 Rattus norvegicus Calreticulin Proteins 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000606695 Rickettsia rickettsii Species 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 241001138501 Salmonella enterica Species 0.000 description 1
- 241000191967 Staphylococcus aureus Species 0.000 description 1
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 1
- 101800000849 Tachykinin-associated peptide 2 Proteins 0.000 description 1
- 244000269722 Thea sinensis Species 0.000 description 1
- 241000656145 Thyrsites atun Species 0.000 description 1
- 108010031372 Tissue Inhibitor of Metalloproteinase-2 Proteins 0.000 description 1
- 241000710924 Togaviridae Species 0.000 description 1
- 241000223997 Toxoplasma gondii Species 0.000 description 1
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 1
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 1
- 208000002687 Venezuelan Equine Encephalomyelitis Diseases 0.000 description 1
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 description 1
- 108010067674 Viral Nonstructural Proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000003187 abdominal effect Effects 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 108010042591 activated protein C receptor Proteins 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 108700010877 adenoviridae proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 150000001336 alkenes Chemical class 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000002622 anti-tumorigenesis Effects 0.000 description 1
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 229910052786 argon Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000002565 arteriole Anatomy 0.000 description 1
- FZCSTZYAHCUGEM-UHFFFAOYSA-N aspergillomarasmine B Natural products OC(=O)CNC(C(O)=O)CNC(C(O)=O)CC(O)=O FZCSTZYAHCUGEM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000015736 beta 2-Microglobulin Human genes 0.000 description 1
- 108010081355 beta 2-Microglobulin Proteins 0.000 description 1
- 230000001588 bifunctional effect Effects 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 229960001561 bleomycin Drugs 0.000 description 1
- OYVAGSVQBOHSSS-UAPAGMARSA-O bleomycin A2 Chemical compound N([C@H](C(=O)N[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)NCCC=1SC=C(N=1)C=1SC=C(N=1)C(=O)NCCC[S+](C)C)[C@@H](O[C@H]1[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)O[C@@H]1[C@H]([C@@H](OC(N)=O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)C=1N=CNC=1)C(=O)C1=NC([C@H](CC(N)=O)NC[C@H](N)C(N)=O)=NC(N)=C1C OYVAGSVQBOHSSS-UAPAGMARSA-O 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000006664 bond formation reaction Methods 0.000 description 1
- 210000005178 buccal mucosa Anatomy 0.000 description 1
- 239000007975 buffered saline Substances 0.000 description 1
- 238000009435 building construction Methods 0.000 description 1
- 101150039352 can gene Proteins 0.000 description 1
- 238000005251 capillar electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 210000000234 capsid Anatomy 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000009614 chemical analysis method Methods 0.000 description 1
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 230000000973 chemotherapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 229940038705 chlamydia trachomatis Drugs 0.000 description 1
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 1
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 230000000139 costimulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002784 cytotoxicity assay Methods 0.000 description 1
- 231100000263 cytotoxicity test Toxicity 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000003936 denaturing gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 230000009025 developmental regulation Effects 0.000 description 1
- 102000038379 digestive enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108091007734 digestive enzymes Proteins 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 1
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N ethyl mercaptane Natural products CCS DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- 238000010304 firing Methods 0.000 description 1
- 238000002825 functional assay Methods 0.000 description 1
- 238000001476 gene delivery Methods 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 238000007490 hematoxylin and eosin (H&E) staining Methods 0.000 description 1
- 210000002767 hepatic artery Anatomy 0.000 description 1
- 244000052637 human pathogen Species 0.000 description 1
- 230000004727 humoral immunity Effects 0.000 description 1
- 230000008348 humoral response Effects 0.000 description 1
- 125000001165 hydrophobic group Chemical group 0.000 description 1
- 230000007813 immunodeficiency Effects 0.000 description 1
- 230000000951 immunodiffusion Effects 0.000 description 1
- 238000000760 immunoelectrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 238000011532 immunohistochemical staining Methods 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 1
- 238000001361 intraarterial administration Methods 0.000 description 1
- 230000010039 intracellular degradation Effects 0.000 description 1
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 238000011005 laboratory method Methods 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 108010026228 mRNA guanylyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 230000036210 malignancy Effects 0.000 description 1
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 210000004779 membrane envelope Anatomy 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 1
- 230000011278 mitosis Effects 0.000 description 1
- 102000035118 modified proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091005573 modified proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 210000002850 nasal mucosa Anatomy 0.000 description 1
- 210000005170 neoplastic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001613 neoplastic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002853 nucleic acid probe Substances 0.000 description 1
- 229940023146 nucleic acid vaccine Drugs 0.000 description 1
- JRZJOMJEPLMPRA-UHFFFAOYSA-N olefin Natural products CCCCCCCC=C JRZJOMJEPLMPRA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000006384 oligomerization reaction Methods 0.000 description 1
- 231100000590 oncogenic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002246 oncogenic effect Effects 0.000 description 1
- 108091008819 oncoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000027450 oncoproteins Human genes 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 238000002559 palpation Methods 0.000 description 1
- 229960002566 papillomavirus vaccine Drugs 0.000 description 1
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 1
- 230000007918 pathogenicity Effects 0.000 description 1
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 1
- 239000008196 pharmacological composition Substances 0.000 description 1
- NMHMNPHRMNGLLB-UHFFFAOYSA-N phloretic acid Chemical compound OC(=O)CCC1=CC=C(O)C=C1 NMHMNPHRMNGLLB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000037452 priming Effects 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 1
- 230000004952 protein activity Effects 0.000 description 1
- 238000002731 protein assay Methods 0.000 description 1
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000000163 radioactive labelling Methods 0.000 description 1
- 238000002601 radiography Methods 0.000 description 1
- 238000001959 radiotherapy Methods 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 1
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000017248 retroviral genome replication Effects 0.000 description 1
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- 229940075118 rickettsia rickettsii Drugs 0.000 description 1
- 239000012266 salt solution Substances 0.000 description 1
- 238000003345 scintillation counting Methods 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 229940054269 sodium pyruvate Drugs 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 238000010532 solid phase synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000002798 spectrophotometry method Methods 0.000 description 1
- 125000003003 spiro group Chemical group 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000010189 synthetic method Methods 0.000 description 1
- 238000007910 systemic administration Methods 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 150000003536 tetrazoles Chemical class 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 150000003557 thiazoles Chemical class 0.000 description 1
- 150000003556 thioamides Chemical class 0.000 description 1
- 150000003568 thioethers Chemical class 0.000 description 1
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 1
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 1
- 230000002463 transducing effect Effects 0.000 description 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 1
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- 210000000689 upper leg Anatomy 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 210000005166 vasculature Anatomy 0.000 description 1
- 108010060757 vasostatin Proteins 0.000 description 1
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/0005—Vertebrate antigens
- A61K39/0011—Cancer antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/0005—Vertebrate antigens
- A61K39/0011—Cancer antigens
- A61K39/001102—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- A61K39/001103—Receptors for growth factors
- A61K39/001106—Her-2/neu/ErbB2, Her-3/ErbB3 or Her 4/ErbB4
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/04—Immunostimulants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
- C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
- C07K14/4725—Proteoglycans, e.g. aggreccan
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
- C07K14/70539—MHC-molecules, e.g. HLA-molecules
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/515—Animal cells
- A61K2039/5154—Antigen presenting cells [APCs], e.g. dendritic cells or macrophages
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
- A61K2039/6031—Proteins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/35—Fusion polypeptide containing a fusion for enhanced stability/folding during expression, e.g. fusions with chaperones or thioredoxin
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Mycology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Oncology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
Description
【０００１】
連邦支援研究に関しての陳述
本発明は、国立衛生研究所(RO1 CA72631)；NCDDG(RFA CA-95-020)からの援助の下、連邦政府の支援によりなされた。米国政府は、本発明における特定の権利を有しうる。
【０００２】
発明の背景
発明の分野
本発明は、免疫学と医学の分野に含まれ、小胞体シャペロンポリペプチド(例えば、カルレティキュリン(calreticulin))およびポリペプチドもしくはペプチド抗原をコードするキメラもしくはハイブリッド核酸分子を用いて、抗原特異的免疫応答、特に細胞傷害性Tリンパ球(CTL)によって媒介される応答の増強を誘導するための組成物および方法を提供する。裸の(naked)DNAおよび自己複製RNAレプリコンワクチンが提供される。
【０００３】
背景技術の説明
DNAワクチンは、抗原特異的免疫療法を誘導するための魅力的な方法となっている。DNAワクチンの形態としては、「裸の」DNA、例えば、プラスミドDNA(米国特許第5,580,859号；第5,589,466号；第5,703,055号)、ウイルスDNAなどが挙げられる。基本的には、所望の免疫原性タンパク質もしくはペプチドをコードするDNA分子が個体に投与され、タンパク質がin vivoで生成される。「裸の」DNAワクチンの使用は、安全であるという利点を有する。なぜならば、例えばプラスミド自体は免疫原性が低く、高純度で容易に調製することができ、そしてタンパク質または他の生物学的試薬と比較して、高度に安定しているからである。しかしながら、DNAワクチンは効力が限られる。幾つかのストラテジーが、DNAワクチンの効力を増大するために適用されている。そのようなストラテジーには、例えば、迅速な細胞内分解のための抗原のターゲティング；APC受容体に対するリガンドに融合することによる抗原提示細胞(APC)への抗原の指向；ケモカインもしくは抗原性の病原性配列への抗原の融合、サイトカインもしくは補助的刺激分子またはアジュバント組成物との同時注射が含まれる。
【０００４】
癌ワクチンは、癌治療において魅力的な方法である。なぜならば、癌ワクチンは身体において複数の部位における全身性腫瘍を根絶する効力および新生物性細胞と非新生物性細胞とを識別する特異性を有しうるからである(Pardoll (1998) Nature Med. 4：525-531)。免疫系の抗腫瘍効果は、主に細胞性免疫によって媒介される。免疫系の細胞媒介性構成要素は、腫瘍を根絶することができる多数のエフェクター機構を備える、これらの抗腫瘍免疫応答のほとんどが、T細胞によって調節される。従って、腫瘍特異的T細胞応答の増強を目的とした癌ワクチン(特にDNAワクチンとして)を開発して、腫瘍を制御することが望まれる。
【０００５】
HPV腫瘍形成タンパク質E6およびE7は、HPVに関連する子宮頸癌のほとんどで共発現されており、細胞トランスフォーメーションの誘導および維持に重要である。従って、E6もしくはE7タンパク質をターゲティングするワクチンは、HPV関連子宮頸部悪性腫瘍を予防および治療するための機会を提供しうる。HPV-16 E7は、よく特性付けられた細胞質/核タンパク質で、HPV関連癌細胞においてE6よりも保存されており、多くのHPVワクチンに利用されている。
【０００６】
カルレティキュリン(CRT)は、細胞の小胞体(ER)の内腔に位置する豊富な46キロダルトン(kDa)タンパク質であり、レクチン活性を示し、そして初期の糖タンパク質の折畳みおよび組立て(assembly)に参加する。例えば、Nash (1994) Mol. Cell. Biochem. 135：71-78；Hebert (1997) J. Cell. Biol. 139：613-623；Vassilakos (1998) Biochemistry 37：3480-3490；Spiro (1996) J. Biol. Chem. 271：11588-11594を参照されたい。CRTは、抗原プロセシングに関連する輸送体、例えばTAP-1およびTAP-2によってERに輸送されたペプチドに会合する(Spee (1997) Eur. J. Immunol. 27：2441-2449)。またCRTは、in vitroでペプチドと複合体を形成する。マウスへの投与では、これらの複合体はペプチド特異的CD8+T細胞応答を引き出した(Basu (1999) J. Exp. Med. 189：797-802；Nair (1999) J. Immunol. 162：6426-6432)。マウスの腫瘍から精製されたCRTは、CRTが採取された腫瘍に特異的な免疫を引き出したが、抗原的に異なる腫瘍に対しては免疫を引き出さなかった(Basu, 前掲)。in vitroにおいてマウス樹状細胞(DC)にCRT-ペプチド複合体をパルスすること(pulsing)によって、ペプチドがDC上のMHCクラスI分子によって再提示され、ペプチド特異的CTL応答が刺激された(Nair,前掲)。
【０００７】
またCRTは抗脈管形成効果を有する。CRTおよびアミノ酸残基1-180を含む断片(「バソスタチン(vasostatin)」と呼ばれている)は、腫瘍増殖を抑制することができる内皮細胞インヒビターである(Pike (1999) Blood. 94：2461-2468)。腫瘍増殖および転移は、十分な血液供給の存在に依存する。腫瘍がより大きく増殖するので、十分な血液供給は新しい血管形成(脈管形成とよばれるプロセス)によって確保されることが多い(Folkman (1982) Ann. NY Acad. Sci. 401：212-27；Hanahan (1996) Cell. 86：353-364)。腫瘍の脈管構造を標的とし、損傷を与える治療薬は、腫瘍増殖を防止または遅延させることができ、そして退行もしくは休止を促進することさえもできる。
【０００８】
自己複製RNAワクチン(RNAレプリコン)は、核酸ワクチンの重要で、より強力な形態として現れた。RNAレプリコンワクチンは、アルファウイルスベクター、例えば、シンドビスウイルス(Xiong (1989) Science 243：1188-1191)、セムリキ森林ウイルス(Ying (1999) Nature Med. 5：823-827)またはべネズエラウマ脳脊髄炎ウイルス(Pushko (1997) Virology 239：389-401)ベクターから誘導しうる。これらのワクチンは自己複製および自己制御し、そしてRNAまたはDNAのいずれかとして投与され、次いでトランスフェクトした細胞中でまたはin vivoでRNAレプリコンに転写されうる(Berglund (1998) Nature Biotechnol. 16：562-565)。自己複製RNAは、多様な範囲の細胞型に感染し、高レベルで目的の抗原の発現を可能にする(Huang (1996) Curr. Opin. Biotechnol. 7：531-535)。さらに、ウイルス複製は、感染宿主細胞にとって有毒なので、自己複製RNAは最終的にはトランスフェクトした細胞の溶解を引き起こす(Frolov (1996) J. Virol. 70：1182-1190)。従って、これらのベクターには、宿主ゲノムに組み込まれるという裸のDNAワクチンに関連する懸念が生じない。このことは、潜在的に腫瘍形成性であるタンパク質、例えばHPV E6およびE7タンパク質をターゲティングするワクチン開発にとって特に重要である。
【０００９】
Chen ((2000) Cancer Research 60：1035-1042)により、ヒトパピローマウイルス16型(HPV-16) E7抗原とマイコバクテリウム・ツベルクローシス(Mycobacterium tuberculosis)熱ショックタンパク質70(HSP 70)との連結によりDNAワクチンの効力が増強されることが示された。他の研究では、腫瘍細胞もしくはウイルス感染細胞から単離された熱ショックタンパク質(HSP)複合体を用いた免疫感作は、強力な抗腫瘍(Janetzki (1998) J. Immunother. 21：269-276)または抗ウイルス免疫(Heikema (1997) Immunol. Lett. 57：69-74)を誘導することができることが示されている。また免疫原性HSP-ペプチド複合体は、in vitroでペプチドとHSPとを混合することで再構成することができる(Ciupitu (1998) J. Exp. Med. 187：685-691)。またHSPに基づくタンパク質ワクチンは、HSPに抗原を融合することによって投与することができる(Suzue (1996) J. Immunol. 156：873-879,「HSP 70融合タンパク質はHIV-1 p24に対する体液性および細胞性免疫応答を引き出した(HSP 70 fusion protein elicited humoral and cellular immune responses to HIV-1 p24)」)。これらの実験により、1)腫瘍細胞もしくはウイルス感染細胞から誘導されたHSP-ペプチド複合体は、腫瘍もしくはウイルス特異的免疫を刺激することができること；2)この免疫応答の特異性はHSPに結合した腫瘍に由来するペプチドによって引き起こされるのであって、HSP自体では引き起こされないこと；および3)免疫応答を、HSPドナーのMHCと同一または異なるMHCを有するマウスで誘導することができることが示されている(Przepiorka (1998) Mol. Med. Today 4：478-484；Srivastava (1998) Immunity 8：657-665)。これらの研究により、HSPを免疫療法において使用することがより魅力的になった一方、ここまで試験されたHSPワクチンは、タンパク質に基づくワクチンまたはDNAに基づくワクチンの形態のみである。
【００１０】
発明の概要
本発明は、小胞体シャペロンポリペプチドを含む第1ポリペプチドドメインと少なくとも1種の抗原性ペプチドを含む第2ポリペプチドドメインとを含むキメラタンパク質をコードする核酸を提供する。抗原性ペプチドは、MHCクラスI結合性ペプチドエピトープを含むことができる。抗原性ペプチド、例えばMHCクラスI結合性ペプチドエピトープは、約8アミノ酸残基〜約11アミノ酸残基の長さであることができる。
【００１１】
小胞体シャペロンポリペプチドには、典型的なシャペロンである、カルレティキュリン、カルネキシン(calnexin)、タパシン(tapasin)もしくはER60ポリペプチドに類似のシャペロン機能を有する任意のERポリペプチド；あるいはそれらの類似体もしくは擬似体(mimetic)、またはそれらの機能的断片が含まれる。そのような機能的断片は、例えば下記の実施例１および２に記載されるような、慣例のスクリーニング試験を用いてスクリーニングすることができる。従って、別の実施形態では、小胞体シャペロンポリペプチドは、カルネキシンポリペプチドまたはその等価物、ER60ポリペプチドまたはその等価物、GRP94/GP96もしくはGRP94ポリペプチドまたはその等価物、あるいはタパシンポリペプチドまたはその等価物を含むか、またはからなる。
【００１２】
一実施形態において、カルレティキュリンポリペプチドは、ヒトカルレティキュリンポリペプチドを含む。別の実施形態において、ヒトカルレティキュリンポリペプチド配列は配列番号１を含むか、あるいは本質的に配列番号１の第1残基付近〜第180残基付近の配列からなるか、または本質的に配列番号１の第181残基付近〜第417残基付近の配列からなることができる。
【００１３】
一実施形態において、抗原(例えば、MHCクラスI結合性ペプチドエピトープ)は、病原体から誘導される。例えば抗原は、病原体によって発現されるペプチドを含む。病原体は、例えばパピローマウイルス、ヘルペスウイルス、レトロウイルス(例えば、HIV-1などの免疫不全ウイルス)、アデノウイルスなどのウイルスであることができる。パピローマウイルスはヒトパピローマウイルスであってよく；例えば、抗原(例えば、クラスI結合性ペプチドエピトープ)をHPV-16 E7ポリペプチドから誘導することができる。一実施形態において、HPV-16 E7ポリペプチドは実質的に非腫瘍形成性である。すなわち、HPV-16 E7ポリペプチドは網膜芽細胞腫ポリペプチド(pRB)に結合しないか、あるいはin vivoで発現または送達された場合に、HPV-16 E7ポリペプチドが事実上、非腫瘍形成性である程度に低い親和性でpRBに結合する。
【００１４】
別の実施形態において、病原体は細菌、例えば、ボルデテラ・ペルツシス(Bordetella pertussis)；エーリキア・チャフェンシス(Ehrlichia chaffeensis)；スタフィロコッカス・アウレウス(Staphylococcus aureus)；トキソプラズマ・ゴンジイ(Toxoplasma gondii)；レジオネラ・ニューモフィラ(Legionella pneumophila)；ブルセラ・スイス(Brucella suis)；サルモネラ・エンテリカ(Salmonella enterica)；マイコバクテリウム・アビウム(Mycobacterium avium); マイコバクテリウム・ツベルクローシス；リステリア・モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)；クラミジア・トラコマチス(Chlamydia trachomatis)；クラミジア・ニューモニエ(Chlamydia pneumoniae)；リケッチシア・リケッチー(Rickettsia rickettsii)；または例えばパラコクシジオイデス・ブラシリエンシス(Paracoccidioides brasiliensis)などの真菌;あるいは、他の病原体、例えばプラスモジウム・ファルシパルム(Plasmodium falciparum)である。
【００１５】
別の実施形態において、MHCクラスI結合性ペプチドエピトープは腫瘍細胞から誘導される。腫瘍細胞に由来するペプチドエピトープは、腫瘍関連抗原、例えば、腫瘍特異的抗原(例えば、HER-2/neu抗原など)を含むことができる。
【００１６】
一実施形態において、単離されたまたは組換え核酸分子は、例えば、構成的、誘導性または組織特異的プロモーターなどのプロモーターに機能的に連結される。プロモーターは、免疫系の細胞(例えば抗原提示細胞(APC)を含む)を含む任意の細胞において、例えば構成的、誘導性または組織特異的な方法で発現させることができる。
【００１７】
別の実施形態において、APCは、樹状細胞、ケラチノサイト、星状細胞、単球、マクロファージ、Bリンパ球、小膠細胞または活性化内皮細胞などである。
【００１８】
また本発明は、小胞体シャペロンポリペプチドを含む第1ポリペプチドドメインと少なくとも1種の抗原性ペプチドを含む第2ポリペプチドドメインとを含むキメラタンパク質をコードする核酸配列を含む発現カセットを提供する。別の実施形態において、第1ドメインはカルレティキュリンポリペプチドを含み、そして第2ドメインはMHCクラスI結合性ペプチドエピトープを含む。別の実施形態において、発現カセットは発現ベクター、組換えウイルス(例えば、アデノウイルス、レトロウイルス)、プラスミドを含む。発現カセットは自己複製RNAレプリコンを含むことができる。自己複製RNAレプリコンは、シンドビスウイルス自己複製RNAベクター、例えばシンドビスウイルス自己複製RNAベクターSINrep5(米国特許第5,217,879号)などを含むことができる。本発明の適用可能な実施形態の全てと同様に、ERシャペロンポリペプチドは、典型的なシャペロンである、カルレティキュリン、1、タパシンもしくはER60ポリペプチドに類似のシャペロン機能を有する任意のERポリペプチド；あるいはそれらの類似体もしくは擬似体、またはそれらの機能的断片を含むことができる。
【００１９】
また本発明は、小胞体シャペロンポリペプチドを含む第1ポリペプチドドメインと少なくとも1種の抗原性ペプチドを含む第2ポリペプチドドメインとを含むキメラタンパク質をコードする核酸を含む粒子を提供する。一実施形態においては、少なくとも2種のドメインを含む融合タンパク質をコードする核酸配列を含む発現カセットを含む単離された粒子であって、この場合、第1ドメインはカルレティキュリンポリペプチドを含み、そして第2ドメインはMHCクラスI結合性ペプチドエピトープを含む。単離された粒子は、パーティクルボンバードメント(particle bombardment)に好適な任意の物質(例えば、金など)を含むことができる。ERシャペロンポリペプチドは、本明細書で論じたように、典型的なシャペロンである、カルレティキュリン、カルネキシン、タパシンもしくはER60ポリペプチドに類似のシャペロン機能を有する任意のERポリペプチドを含むことができる。
【００２０】
また本発明は、小胞体シャペロンポリペプチドを含む第1ポリペプチドドメインと少なくとも1種の抗原性ペプチドを含む第2ポリペプチドドメインとを含むキメラタンパク質をコードする核酸配列を含む細胞を提供する。一実施形態において、細胞は、第1ドメインがカルレティキュリンポリペプチドを含み、そして第2ドメインがMHCクラスI結合性ペプチドエピトープを含む、少なくとも2種のドメインを含む融合タンパク質をコードする核酸配列を含む発現カセットを含む。細胞を、例えば本発明の核酸でトランスフェクト、感染、形質導入させることができ、あるいは本発明の組換えウイルスで感染させることができる。細胞は、本発明の発現カセットを含む細胞を含む非ヒトトランスジェニック動物から単離することができる。例えば免疫系の細胞または抗原提示細胞(APC)などのいずれの細胞も本発明の発現カセットを含むことができる。APCは、樹状細胞、ケラチノサイト、マクロファージ、単球、Bリンパ球、星状細胞、小膠細胞または活性化内皮細胞であってよい。
【００２１】
また本発明は、小胞体シャペロンポリペプチドを含む第1ポリペプチドドメインと少なくとも1種の抗原性ペプチドを含む第2ポリペプチドドメインとを含むキメラポリペプチドを提供する。抗原性ペプチドは、MHCクラスI結合性ペプチドエピトープを含むことができる。例えばin vivoまたはin vitroで合成的にまたは組換え的に生産することができる、例えば融合タンパク質のように(例えば、ペプチド結合)、ERシャペロンポリペプチドを抗原性ペプチドに化学的に連結することができる。ポリペプチドドメインを、柔軟性のある化学的リンカーによって連結することができる。
【００２２】
別の実施形態において、キメラポリペプチドの第1ポリペプチドドメインが第2ポリペプチドドメインよりもアミノ末端に近くてもよく、または第2ポリペプチドドメインが第1ポリペプチドドメインよりもアミノ末端に近くてもよい。ERシャペロンポリペプチドは、本明細書で論じたように、典型的なシャペロンである、カルレティキュリン、カルネキシン、タパシンもしくはER60ポリペプチドに類似のシャペロン機能を有する任意のERポリペプチドを含むことができる。
【００２３】
本発明は、抗原特異的免疫応答を誘導または増強することができる本発明の組成物と製薬上許容される賦形剤とを含む医薬組成物を提供する。別の実施形態において、組成物は、小胞体シャペロンポリペプチドを含む第1ドメインと抗原性ペプチドを含む第2ドメインとを含むキメラポリペプチド；小胞体シャペロンポリペプチドを含む第1ポリペプチドドメインと抗原性ペプチドを含む第2ポリペプチドドメインとを含む融合タンパク質をコードする核酸分子；小胞体シャペロンポリペプチドを含む第1ドメインと抗原性ペプチドを含む第2ドメインとを含む融合タンパク質をコードする核酸配列を含む発現カセット；小胞体シャペロンポリペプチドを含む第1ドメインと抗原性ペプチドを含む第2ドメインとを含む融合タンパク質をコードする核酸配列を含む粒子；または小胞体シャペロンポリペプチドコード配列を含む第1ドメインと抗原性ペプチドを含む第2ドメインとを含む融合タンパク質をコードする核酸配列を含む細胞、を含む。ERシャペロンポリペプチドは、本明細書で論じたように、典型的なシャペロンである、カルレティキュリン、カルネキシン、タパシンもしくはER60ポリペプチドに類似のシャペロン機能を有する任意のERポリペプチドを含むことができる。
【００２４】
本発明は、抗原特異的免疫応答を誘導または増強する方法であって、(a)抗原特異的免疫応答を誘導または増強することができる本発明の組成物(別の実施形態においては、該組成物は、小胞体シャペロンポリペプチドを含む第1ドメインと抗原性ペプチドを含む第2ドメインとを含むキメラポリペプチド；小胞体シャペロンポリペプチドを含む第1ポリペプチドドメインと抗原性ペプチドを含む第2ポリペプチドドメインとを含む融合タンパク質をコードする核酸分子；小胞体シャペロンポリペプチドを含む第1ドメインと抗原性ペプチドを含む第2ドメインとを含む融合タンパク質をコードする核酸配列を含む発現カセット；小胞体シャペロンポリペプチドを含む第1ドメインと抗原性ペプチドを含む第2ドメインとを含む融合タンパク質をコードする核酸配列を含む粒子；または小胞体シャペロンポリペプチドコード配列を含む第1ドメインと抗原性ペプチドを含む第2ドメインとを含む融合タンパク質をコードする核酸配列を含む細胞、であることができる)を含む組成物を提供し、そして(b)抗原特異的免疫応答を誘導または増強するのに十分な量の組成物を投与することを含む、前記方法を提供する。抗原特異的免疫応答は、CD8+CTL応答のような細胞性応答を含みうる。また抗原特異的免疫応答は、抗体媒介応答または体液性応答および細胞性応答を含みうる。
【００２５】
上記方法を実施する上で、組成物をex vivoで投与しても、または組成物をex vivoで抗原提示細胞(APC)に投与してもよい。別の実施形態において、APCは、樹状細胞、ケラチノサイト、マクロファージ、単球、Bリンパ球、星状細胞、小膠細胞または活性化内皮細胞である。APCは、ヒト細胞であってよい。APCは、in vivoもしくはin vitro供給源から単離することができる。さらに上記方法は、ex vivo処置されたAPCを、哺乳動物、ヒト、組織適合性の個体に、またはAPCを単離した同一の個体に投与することを含むことができる。あるいは、組成物は、哺乳動物、例えばヒトにin vivoで直接投与される。
【００２６】
組成物を、筋内、皮内または皮下に投与することができる。組成物、例えば核酸、発現カセットまたは粒子は、バリスティックインジェクション(ballistic injection)によって投与することができる。組成物を、腫瘍内または腫瘍周辺に投与することができる。
【００２７】
上記方法の別の実施形態において、抗原性ペプチドはヒトパピローマウイルスなどのウイルスから誘導することができる。抗原性ペプチドは、HPV-16 E7ペプチドであることができる。抗原性ペプチドは、HER-2/neuペプチドなどの腫瘍特異的もしくは腫瘍関連ペプチドであることができる。
【００２８】
本発明は、個体において所望の抗原に特異的なCD8+CTLの数を増大する方法であって、(a)小胞体シャペロンポリペプチドを含む第1ドメインと抗原性ペプチドを含む第2ドメインとを含むキメラポリペプチド；小胞体シャペロンポリペプチドを含む第1ポリペプチドドメインと抗原性ペプチドを含む第2ポリペプチドドメインとを含む融合タンパク質をコードする核酸分子；小胞体シャペロンポリペプチドを含む第1ドメインと抗原性ペプチドを含む第2ドメインとを含む融合タンパク質をコードする核酸配列を含む発現カセット；小胞体シャペロンポリペプチドを含む第1ドメインと抗原性ペプチドを含む第2ドメインとを含む融合タンパク質をコードする核酸配列を含む粒子；または小胞体シャペロンポリペプチドコード配列を含む第1ドメインと抗原性ペプチドを含む第2ドメインとを含む融合タンパク質をコードする核酸配列を含む細胞、を含む組成物(この場合、MHCクラスI結合性ペプチドエピトープは抗原から誘導される)を提供し、そして(b)抗原特異的CD8+CTLの数を増大するのに十分な量の組成物を投与することを含む、前記方法を提供する。
【００２９】
本発明は、個体において腫瘍の増殖を阻害する方法であって、(a)小胞体シャペロンポリペプチドを含む第1ドメインと抗原性ペプチドを含む第2ドメインとを含むキメラポリペプチド；小胞体シャペロンポリペプチドを含む第1ポリペプチドドメインと抗原性ペプチドを含む第2ポリペプチドドメインとを含む融合タンパク質をコードする核酸分子；小胞体シャペロンポリペプチドを含む第1ドメインと抗原性ペプチドを含む第2ドメインとを含む融合タンパク質をコードする核酸配列を含む発現カセット；小胞体シャペロンポリペプチドを含む第1ドメインと抗原性ペプチドを含む第2ドメインとを含む融合タンパク質をコードする核酸配列を含む粒子；または小胞体シャペロンポリペプチドコード配列を含む第1ドメインと抗原性ペプチドを含む第2ドメインとを含む融合タンパク質をコードする核酸配列を含む細胞、を含む組成物を提供し、そして(b)腫瘍の増殖を阻害するのに十分な量の組成物を投与することを含む、前記方法を提供する。本発明の一実施形態において、組成物は、腫瘍内にまたは腫瘍周辺に投与される。組成物を、抗脈管形成活性を含む第2組成物、例えばアンジオスタチン(angiostatin)、エンドスタチン(endostatin)もしくはTIMP-2またはそれらの等価物、あるいはそれらの混合物などとともに同時投与することができる。組成物を、放射線療法または化学療法組成物とともに同時投与することができる。
【００３０】
また本発明は、例えばERシャペロンと抗原性ペプチド、熱ショックタンパク質と抗原性ペプチド、ならびにそれらの等価物およびそれらの混合物を含むキメラタンパク質を含めた、本発明の免疫応答増強融合タンパク質をコードする核酸を含む自己複製RNAウイルス構築物を提供する。一実施形態において、自己複製RNAウイルスは、下記の実施例２で論じるような、SINrep5などのシンドビスウイルス自己複製RNAベクターを含む。
【００３１】
本発明の1以上の実施形態の詳細は、添付した図面と下記の記載で説明される。本発明の他の特徴、目的および利点は、記載および図面ならびに特許請求の範囲から明らかであろう。
【００３２】
本明細書で引用される全ての刊行物、特許、特許出願、GenBank配列およびATCC寄託物は、全ての目的のために参照により本明細書に明らかに組み入れられるものとする。
【００３３】
好ましい実施形態の説明
本発明は、小胞体シャペロンポリペプチドと少なくとも1種の抗原性ペプチドとを含むキメラポリペプチドのex vivoまたはin vivo投与によって誘導される、免疫応答、特に細胞傷害性T細胞免疫応答を増強するための組成物および方法を提供する。キメラポリペプチドは、キメラ分子をコードする核酸の投与によって「間接的に」投与することができ、核酸構築物、従って融合タンパク質がin vivoで発現される。一実施形態において、キメラ核酸またはポリペプチドは、DNAワクチンの形態で投与される。
【００３４】
融合タンパク質は、少なくとも2種のドメインを含む。第1ドメインは小胞体シャペロンポリペプチドを含み、そして第2ドメインは、それに対する免疫応答を誘導することが望まれる抗原から誘導されたペプチドを含む。カルレティキュリン、タパシン、ER60もしくはカルネキシンポリペプチドなどの小胞体シャペロンポリペプチドまたはそれらの機能的断片もしくは変異体のいずれも本発明に用いることができる。
【００３５】
キメラ分子の第2ドメインは、それに対する免疫応答の誘導、増強もしくは抑制が望まれる病原体、癌または任意の供給源から誘導することができる抗原性ペプチドを含む。一実施形態において、ペプチドはMHCクラスI結合性ペプチドエピトープを含む。
【００３６】
本発明の方法において、キメラポリペプチドまたはそれをコードする核酸が免疫応答を誘導または増強するために適用される。一実施形態において、本発明の組成物は、免疫学的機構および抗脈管形成機構の双方を介して免疫応答および抗腫瘍効果を相乗的に増強する。
【００３７】
本明細書に記載の実験により、本発明の方法がヒト病原体のエピトープをコードするDNAワクチンによって誘導される、細胞性免疫応答、特にCTL反応性を増強できることが示されている。ヒトHPV-16 E7を用いた。ヒトパピローマウイルス(HPV)、特にHPV-16がヒト子宮頚癌のほとんどに関連するので、ワクチン開発にとってヒトHPV-16 E7はモデル抗原である。腫瘍形成性HPVタンパク質E7は、細胞トランスフォーメーションの誘導と維持に重要であり、HPV含有子宮頸癌およびそれらの前駆体病変のほとんどで共発現される。従って、E7を標的とする本発明の組成物のような癌ワクチンを用いて、HPV関連新生物を制御することができる(Wu (1994) Curr. Opin. Immunol. 6：746-754)。
【００３８】
下記の実施例１に記載するように、これらの実験結果より、全長E7ポリペプチドに連結されたCRTを含む融合タンパク質をコードする核酸を含むDNAワクチンは、DNAワクチンの効力を増強できることが示されている。キメラCRT/E7融合遺伝子を含有する本発明のDNAワクチンを、バリスティック皮下方法によってマウスに投与した。それらは、E7特異的CD8+CTL前駆体の増大を誘導し、それによって腫瘍に対する免疫保護が改善された。E7特異的CD8+CTL前駆体のこの増大は、野生型E7もしくはCRT遺伝子を単独で含有するDNAワクチンと比較して有意なものであった。
【００３９】
さらに、CRT DNAもしくはキメラCRT/E7 DNAのいずれかを用いたC57BL/6マウス(正常な免疫系を有する近交系統)もしくはヌードマウス(T細胞および機能的な免疫系を欠いた系統)を処置することで、肺転移結節が低減され、肺結節内での脈管形成が阻害された。従って、キメラCRT/E7をコードする本発明のDNAワクチンは、強力な抗腫瘍効果の発生のための免疫学的方法と抗腫瘍形成的方法とを組み合わせた特有の方法を示す。
【００４０】
上記で論じたように、研究により熱ショックタンパク質(HSP)を免疫療法において使用することがより魅力的となった一方、ここまで試験されたHSPワクチンは、タンパク質に基づくワクチンまたはDNAに基づくワクチンの形態にすぎない。本発明により、初めて自己複製RNAワクチンの形態にあるHSPなどの抗原および本発明のキメラポリペプチドの投与が組み入れられ、そして示される。
【００４１】
下記の実施例２に記載されるように、自己複製RNAワクチン中のHSP70-ヒトパピローマウイルス16型(HSP-16)E7融合タンパク質の発現は、in vivoで発現された場合にこの抗原性ポリペプチドの効力を大いに増強した。下記に記載する結果により、E7/HSP70融合遺伝子を含有するRNAレプリコンワクチンは、ワクチン接種したマウスにおいて野生型E7遺伝子を含有するワクチンよりもかなり高いE7特異的T細胞媒介免疫応答を誘導したことが示された。in vitro研究により、E7/HSP70 RNAレプリコンでトランスフェクトしたアポトーシス細胞に由来するE7抗原を、骨髄由来樹状細胞によって取り込ませ、野生型E7 RNAレプリコンでトランスフェクトしたアポトーシス細胞よりもMHCクラスI経路を介して効率的に呈示させることができることが示された。E7へのHSP70の融合は、あまり効果的でないワクチンをE7発現腫瘍に対する有意な効力を有するワクチンへと変えた。これらの結果より、自己複製RNAワクチンの使用は本発明の融合タンパク質の免疫原性を増強できることが示された。
【００４２】
in vivoにおける抗原特異的CD8+T細胞免疫応答の増強に対する可能性のある機構は、抗原を発現する細胞からのアポトーシス小体(apoptotic body)の取り込みによるMHCクラスI経路を介した抗原提示であり、「クロスプライミング」とも呼ばれる。下記の実施例２で論じるように、CTLアッセイにより、SINrep5-E7/HSP70 RNAによってトランスフェクトしたアポトーシス細胞をパルスした骨髄由来樹状細胞におけるHPV E7ポリペプチドのMHCクラスI提示の増強が示された。
【００４３】
定義
別段定義しない限り、本明細書で使用される全ての専門用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解される意味を有する。本明細書で使用する場合、以下の用語は別段特記しない限りそれらに特有のものとされる意味を有する。
【００４４】
本明細書で使用する「抗脈管形成活性」という用語は、血管増殖(例えば、毛細血管、細動脈など)阻害のいずれの形態をも意味する。従って、そのような活性には、血管またはその置換物の増殖の遅延が含まれ、例えば、内皮細胞の増殖の遅延または阻害が挙げられるだろう。
【００４５】
本明細書で使用する「抗原」または「免疫原」という用語は、適切な量(「免疫原性上有効な量)」で投与した(または投与された核酸、例えばDNAワクチンによってin vivoで発現された)場合に「抗原性」または「免疫原性」である、すなわち単独で、あるいは別の物質と組み合わせてまたは連結もしくは融合して(1回でまたはいくらかの間隔にわたって投与することができる)、細胞性および/または体液性免疫応答を、引き出し、増大しまたは増進することができる、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質を含む化合物または組成物を意味する。
【００４６】
「カルネキシン」は、分子シャペロンとしておよびER品質管理機構の成分として機能する小胞体(ER)のよく特性付けられた膜タンパク質を示す。カルレティキュリンは、カルネキシンの可溶性類似体である。in vivoでカルレティキュリンおよびカルネキシンは、タンパク質合成、折畳みおよび翻訳後修飾中の品質管理に重要な役割を果たす。カルネキシンポリペプチドならびにそれらの等価物および類似体は、本明細書で記載されるようにERシャペロンポリペプチド属における種である(Wilson (2000) J. Biol. Chem. 275：21224-2132；Danilczyk (2000) J. Biol. Chem. 275：13089-13097；米国特許第6,071,743号および第5,691,306号)。
【００４７】
「カルレティキュリン」または「CRT」は、レクチン活性を有し、そして初期の糖タンパク質の折畳みおよび組立てに参加する、よく特性付けられたER内腔の約46kDa内在タンパク質を示す。CRTは「シャペロン」ポリペプチドとして、およびMHCクラスI輸送体TAP複合体のメンバーとして働く。CRTは、TAP1およびTAP2輸送体、タパシン、MHCクラスI重鎖ポリペプチドならびにβ2ミクログロブリンと会合して初期のMHCクラスI分子上へのペプチドエピトープのローディングにおいて機能する(Jorgensen (2000) Eur. J. Biochem. 267：2945-2954)。「カルレティキュリン」または「CRT」という用語は、本明細書に記載する典型的なCRT配列に対して実質的な同一性(本明細書で規定する)を有するポリペプチドおよび核酸分子を意味する。CRTポリペプチドは、CRTのアミノ酸配列に同一な、または実質的に同一な(本明細書で規定する)配列を含むポリペプチドである。本発明の組成物および方法で使用するCRTの典型的なヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１および配列番号２である。「カルレティキュリン」または「CRT」という用語は、天然タンパク質、ならびにCTL応答を含む免疫応答を誘導する組換え的に産生した改変タンパク質を包含する。「カルレティキュリン」または「CRT」という用語は、CRTの相同体および対立遺伝子変異体を包含し、これらにはin vitro技法によって構築された天然タンパク質の変異体および天然供給源から単離されたタンパク質が含まれる。また本発明のCRTポリペプチドおよびそれらをコードする配列には、非CRT配列、特にMHCクラスI結合性ペプチドを含む融合タンパク質；またさらに他のドメイン、例えばエピトープタグ、酵素切断認識配列、シグナル配列、分泌シグナルなどを含む融合タンパク質が含まれる。
【００４８】
本明細書で使用する「小胞体シャペロンポリペプチド」という用語は、典型的なシャペロンタンパク質である、CRT、タパシン、ER60もしくはカルネキシンと実質的に同じERシャペロン機能を有するいずれのポリペプチドをも意味する。従って、この用語には、それらの全ての機能的断片または変異体もしくは擬似体が含まれる。ポリペプチドもしくはペプチドを、実施例１で説明するような当技術分野で公知のアッセイを用いてERシャペロンとしてのその活性について慣例的にスクリーニングすることができる。本発明は特定の作用機構のいずれによっても限定されないが、in vivoでシャペロンは、MHCクラスIへテロ三量体分子(重(H)鎖、β2mおよびペプチド)の組立てを含めたERにおける多くの糖タンパク質の正確な折畳みおよびオリゴマー化を促進する。またそれらは、不完全に組立てられたMHCクラスIへテロ三量体複合体をERに保持する(Hauri (2000) FEBS Lett., 476：32-37)。
【００４９】
本明細書で使用する「エピトープ」という用語は、抗体またはT細胞受容体(TCR)と相互作用する抗原決定基または抗原性部位、例えば本発明の方法に用いられるMHCクラスI結合性ペプチド組成物を意味する。「抗原」とは、免疫応答を誘導するか、あるいは抗体またはCTLなどの免疫応答の産物によって特異的に認識または結合される分子または化学構造である。抗体またはTCRが結合する特異的な配座もしくは立体化学的「ドメイン」が「抗原決定基」または「エピトープ」である。TCRは、第3の分子、主要組織適合遺伝子複合体(MHC)クラスIもしくはクラスIIタンパク質と物理的に会合するペプチドエピトープに結合する。
【００５０】
本明細書で使用する「ER60」または「GRP94」または「gp96」または「グルコース調節タンパク質94」という用語は、ストレス誘導タンパク質の熱ショックタンパク質-90(HSP90)ファミリーのER代表種である、よく特性付けられたERシャペロンポリペプチドを示す。これらは、恐らくは先進の折畳み中間体または不完全に組立てられたタンパク質を認識することによって、分泌経路において限定された数のタンパク質に結合する。ER60ポリペプチドならびにそれらの等価物および類似体は、本明細書で記載するように、ERシャペロンポリペプチド属における種である(Argon (1999) Semin. Cell Dev.. Biol. 10：495-505；Sastry (1999) J. Biol. Chem. 274：12023-12035；Nicchitta (1998) Curr. Opin. Immunol. 10：103-109；米国特許第5,981,706号)。
【００５１】
本明細書で使用する「発現カセット」または「発現ベクター」という用語は、そのような配列と適合する宿主においてタンパク質コード配列の発現に影響を及ぼすことができるヌクレオチド配列を意味する。発現カセットには、ポリペプチドコード配列に；および場合によっては、他の配列、例えば転写終結シグナルに機能的に連結された少なくとも1つのプロモーターが含まれる。また、発現の達成に必要なまたは役立つさらなる因子、例えばエンハンサーを含むことができる。「機能的に連結された」とは、プロモーターがDNA配列の転写に介在するようなDNA配列の上流へのプロモーターの連結を意味する。従って、発現カセットには、プラスミド、組換えウイルス、「裸のDNA」組換えベクターの任意の形態などが含まれる。「ベクター」は、細胞に感染、トランスフェクト、一過的にもしくは永続的に形質導入することができる核酸を含む。ベクターは裸の核酸またはタンパク質もしくは脂質と複合体化した核酸であることができることは理解されよう。場合によっては、ベクターはウイルスもしくは細菌の核酸および/またはタンパク質、および/または膜(例えば、細胞膜、ウイルス脂質エンベロープなど)を含む。ベクターには、限定されるものではないが、DNA断片を備え、複製させることができるレプリコン(例えば、RNAレプリコン(下記の実施例２を参照されたい)、バクテリオファージ)が含まれる。従って、ベクターとしては、限定されるものではないが、RNA、自律自己複製環状もしくは線状DNAもしくはRNA、例えばプラスミド、ウイルスなどが挙げられ(米国特許第5,217,879号)が挙げられ、発現プラスミドおよび非発現プラスミドの双方が含まれる。組換え微生物または細胞培養物が発現ベクターの宿主として記載されている場合には、これには染色体外の環状および線状のDNAならびに宿主染色体に組み込まれたDNAの双方が含まれる。ベクターが宿主細胞によって維持されている場合には、ベクターは自律構造として有糸分裂の間に細胞によって安定して複製されるか、または宿主ゲノム内に組み込まれうる。
【００５２】
「化学的に連結された」という用語は、2つの部分の化学結合のいずれをも意味し、例えば、本発明の一実施形態において、ERシャペロンポリペプチドが抗原性ペプチドに化学的に連結されることである。このような化学的連結としては、組換え的に、またはin vivoで生成された融合タンパク質のペプチド結合が挙げられる。
【００５３】
「キメラ」もしくは「融合」ポリペプチドもしくはタンパク質という用語は、第2のポリペプチドもしくはペプチドドメインと会合した少なくとも1つのポリペプチドもしくはペプチド配列もしくはドメインを含む組成物を意味する。本発明の一実施形態は、第1ドメインが小胞体シャペロン、例えばCRTを含み、そして第2ドメインが抗原性エピトープ、例えばMHCクラスI結合性ペプチドエピトープを含むものである、少なくとも2つのドメインを含む融合タンパク質をコードする単離されたまたは組換え核酸分子である。付加的ドメインは、ポリペプチド、ペプチド、多糖類などを含むことができる。「融合」は、ペプチド結合、化学的連結、電荷相互作用(例えば、塩橋、H-結合などの静電引力)などによって生じた会合であることができる。ポリペプチドが組換え体である場合、「融合タンパク質」は一般的なメッセージから翻訳することができる。あるいは、ドメインの組成物を任意の化学的もしくは静電的手段によって連結することができる。また本発明のキメラ分子(例えば、CRT-クラスI結合性ペプチド融合タンパク質)は、付加的配列、例えばリンカー、エピトープタグ、酵素切断認識配列、シグナル配列、分泌シグナルなどを含むことができる。あるいは、ペプチドを単純に担体に連結し、ペプチドの操作または同定/位置決定を容易にすることができる。
【００５４】
「免疫原」または「免疫原性組成物」という用語は、「免疫原性」である、すなわち単独で、あるいは別の物質と組み合わせてまたは連結もしくは融合して、細胞性および/または体液性免疫応答を、引き出し、増大しまたは増進することができる、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質を含む化合物または組成物を意味する。免疫原性組成物は、少なくとも約5アミノ酸の長さのペプチド、10アミノ酸の長さのペプチド、15アミノ酸の長さの断片、20アミノ酸の長さの断片またはそれより大きいものであってよく；より小さい免疫原は、例えば好ましくは免疫原に連結された(化学的にまたは別な方法で)融合タンパク質、凝集物(aggregate)、コンジュゲートまたは混合物のような「担体」ポリペプチドの存在が必要である場合がある。免疫原は、ワクチンベクター(プロモーターに機能的に連結された免疫原コード配列を含む裸のDNAであってよく、例えば、発現カセット)から組換え的に発現させることができる。免疫原は、約3〜約15アミノ酸のサイズで変化しうる1以上の抗原決定基もしくはエピトープを含む。
【００５５】
例えばCRT核酸またはポリペプチドなどの分子または組成物に言及する場合には、本明細書で使用する「単離された」という用語は、分子または組成物がin vivoまたはその天然の状態で会合するタンパク質、他の核酸(例えばRNA)または他の混在物などの少なくとも1つの他の化合物から分離されたことを意味する。従って、CRT組成物は、細胞抽出物中のように、天然には会合する任意の他の成分(例えば細胞膜)から単離された場合に、単離されたとみなされる。しかしながら、また単離された組成物は実質的に純粋でありうる。単離された組成物は、均一状態にあってよく、そして乾燥していても、または水溶液中にあってもよい。純度および均一性は、例えばポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)または高性能液体クロマトグラフィー(HPLC)などの分析化学技法を用いて測定することができる。従って、単離された本発明の組成物は、in situ環境でそれらと通常会合する物質を含まない。タンパク質を均一なもしくは主要なバンドで単離した場合でさえも、所望のタンパク質とともに同時精製する微量混在物が存在する。
【００５６】
本明細書で使用する「HPV-16 E7ポリペプチドが非腫瘍形成性である」というフレーズは、網膜芽細胞腫ポリペプチド(pRB)に結合しないか、またはHPV-16 E7ポリペプチド変異体が実質的に非腫瘍形成性である程度に低い親和性でpRBに結合する、HPV-16 E7ポリペプチドの変異体(例えば、欠失、置換など)を意味する。HPV-16 E7ポリペプチドを含むHPVポリペプチドは、当技術分野で十分に記載されている。HPV-16 E7については、GenBank登録番号AF125673(1999年6月1日)が完全なHPV-16ゲノムおよび配列番号５の配列を有するHPV-16 E7タンパク質(下記を参照されたい)を示す。
【００５７】
「ポリペプチド」、「タンパク質」および「ペプチド」という用語には、変異体を誘導したポリペプチドに実質的に対応する構造と活性を有する「類似体」もしくは「保存的変異体」および「擬似体」もしくは「ペプチド擬似体(peptidomimetic)」をも含む本発明の組成物が含まれ、例えば下記で詳細に論じるような、ヒトCRTまたはHPV-16 E7ポリペプチドなどのクラスI結合性ペプチドエピトープが挙げられる。
【００５８】
「医薬組成物」という用語は、例えば被験者におけるワクチンとしての医薬的使用に好適な組成物を意味する。本発明の医薬組成物は、例えば本発明の核酸もしくはベクターもしくは細胞を含む組成物の薬理学上有効な量と製薬上許容される担体とを含む製剤である。
【００５９】
「プロモーター」という用語は、核酸の転写を指令する一連の核酸制御配列である。本明細書で使用する場合、プロモーターは、転写開始部位近くの必要な核酸配列(例えばポリメラーゼII型プロモーターの場合にはTATAエレメント)を含む。また場合によっては、プロモーターは転写開始部位から数千塩基対ほどの位置に位置することができる遠位のエンハンサーまたはリプレッサーエレメントを含む。「構成的」プロモーターは、ほとんどの環境および発生条件下で活性のあるプロモーターである。「誘導性」プロモーターは、環境または発生調節下にあるプロモーターである。「組織特異的」プロモーターは、生物の特定の組織型中で活性であるが、同じ生物の他の組織型中では活性ではない。「機能的に連結された」という用語は、核酸発現制御配列(プロモーターまたは一連の転写因子結合部位など)と第2核酸配列との間の機能的連結を意味し、この場合、発現制御配列は第2配列に対応する核酸の転写を指令する。
【００６０】
「組換え」という用語は、(1)合成された、またはその他の方法でin vitroで操作されたポリヌクレオチド(例えば「組換えポリヌクレオチド」)、(2)細胞または他の生物系で遺伝子産物を産生するための組換えポリヌクレオチドの使用方法、あるいは(3)組換えポリヌクレオチドによってコードされたポリペプチド(「組換えタンパク質」)を意味する。例えば、組換えCRTまたはMHCクラスI結合性ペプチドエピトープは、本発明を実施するために使用する場合には組換え体であってよい。また「組換え手段」は、異なる供給源に由来する様々なコード領域もしくはドメインもしくはプロモーター配列を有する核酸の発現カセットもしくは発現用ベクター(例えば、本発明を実施するために用いられるベクター中のポリペプチドコード配列の誘導性または構成的発現用)への連結を包含する。
【００６１】
「自己複製RNAレプリコン」という用語は、異種RNAおよびタンパク質の発現を可能にするように遺伝子工学的に操作された、RNAウイルス、例えばアルファウイルスゲノムRNA(例えば、シンドビスウイルス、セムリキ森林ウイルスなど)に基づく構築物を意味する。これらの組換えベクターは自己複製し、下記で詳細に説明するように、裸のRNAもしくはDNAとして細胞に導入することができる。一実施形態において、自己複製RNAレプリコンは、シンドビスウイルス自己複製RNAベクターSINrep5(米国特許第5,217,879号に詳細に記載されている)を含む。
【００６２】
「全身投与」という用語は、被験者の循環系への組成物の導入をもたらす方法での、本明細書で記載する分子ワクチンまたはCRT-クラスI結合性ペプチドエピトープ融合タンパク質などの組成物もしくは薬剤の投与を意味する。「局所(regional)」投与という用語は、腹腔内、髄腔内、硬膜下などの特定の解剖学的空間への、または特定の器官などに対する組成物の投与を意味する。例えば、局所投与は肝動脈への組成物もしくは薬物の投与を含む。「局部(local)投与」という用語は、腫瘍塊への腫瘍内注射、皮下注射、筋内注射などの、限定されたまたは限局性の解剖学的空間への組成物もしくは薬物の投与を意味する。当業者であれば、また局部投与または局所投与は循環系への組成物もしくは薬物のエントリーをもたらしうることが理解されるだろう。
【００６３】
「タパシン」は、上記で論じたように公知のERシャペロンポリペプチドである。特定の作用機構のいずれによっても限定されないが、in vivoでタパシンは、TAP(抗原プロセシングに関連する輸送体)複合体のサブユニットであり、TAP1およびMHCクラスIポリペプチドの双方に結合する。タパシンポリペプチドならびにそれらの等価物および類似体は、本明細書で記載されるようにERシャペロンポリペプチド属における種である(Barnden (2000) J. Immunol. 165：322-330；Li (2000) J. Biol. Chem. 275：1581-1586)。
【００６４】
核酸の生成と操作
本発明の方法は、上記したように、CRT-クラスIエピトープ結合性ペプチド融合タンパク質をコードする核酸の投与を提供するものである。組換えCRT含有融合タンパク質は、in vitroまたはin vivoで合成することができる。これらの組成物をコードする核酸は、「裸のDNA」の形態であってよく、あるいはin vivoまたはex vivo投与のためにプラスミド、ベクター、組換えウイルス(例えば「レプリコン」)などに組み込むことができる。本発明の核酸およびベクターを作製し、in vitroまたはin vivoで発現させることができ、これらの遺伝子およびベクターを作製および発現する様々な手段を用いることができる。当業者であれば、所望の遺伝子活性を、本発明を実施するために用いるベクター内の遺伝子および核酸(例えば、プロモーター)の発現もしくは活性をモジュレートすることによって得ることができることは理解されよう。遺伝子の発現もしくは活性または組織特異性を増大または低減するために記載される公知の方法のいずれも本発明のために使用することができる。本発明は、科学文献および特許文献において十分に記載されている当技術分野で公知の任意の方法またはプロトコールと組み合わせて実施することができる。
【００６５】
一般的技法
RNA、cDNA、ゲノムDNA、ベクター、組換えウイルスまたはそれらのハイブリッドのいずれであれ、本発明を実施するために用いる核酸配列は、様々な供給源から単離し、遺伝子工学的に操作し、増幅し、および/または組換え的に発現させることができる。細菌細胞に加えて、例えば哺乳動物、酵母、昆虫もしくは植物細胞発現系を含めた任意の組換え発現系を使用することができる。あるいは、例えばCarruthers (1982) Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 47：411-418；Adams (1983) J. Am. Chem. Soc. 105：661；Belousov (1997) Nucleic Acids Res. 25：3440-3444；Frenkel (1995) Free Radic. Biol. Med. 19：373-380；Blommers (1994) Biochemistry 33：7886-7896；Narang (1979) Meth. Enzymol. 68：90；Brown (1979) Meth. Enzymol. 68：109；Beaucage (1981) Tetra. Lett. 22：1859；米国特許第4,458,066号に記載されるような周知の化学合成技法によって、これらの核酸をin vitroで合成することができる。次いで二本鎖DNA断片を、相補鎖を合成し、適切な条件下で一緒にそれらの鎖をアニーリングさせることによって、または適切なプライマー配列とともにDNAポリメラーゼを用いて相補鎖を添加することによって得ることができる。
【００６６】
ヒトCRTを含めたCRTの配列は、当技術分野で周知である(McCauliffe (1990) J. Clin. Invest. 86：332-335；Burns (1994) Nature 367：476-480；Coppolino (1998) Int. J. Biochem. Cell Biol. 30：553-558)。核酸配列は、GenBank登録番号NM004343として載っており、配列番号１である。
【００６７】
【００６８】
核酸の操作技法、例えば配列における突然変異生成、サブクローニング、プローブ標識、配列決定分析、ハイブリダイゼーションなどは、科学文献および特許文献に十分に記載されている。例えば、Sambrook編, MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL (第2版),第1-3巻, Cold Spring Harbor Laboratory, (1989)；CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Ausubel編, John Wiley & Sons, Inc., New York (1997)；LABORATORY TECHNIQUES IN BIOCHEMISTRY AND MOLECULAR BIOLOGY：HYBRIDIZATION WITH NUCLEIC ACID PROBES, Part I. Tijssen編, Elsevier, N.Y. (1993)を参照されたい。
【００６９】
核酸、ベクター、キャプシド、ポリペプチドなどを、当業者に周知の多数の一般的手段のうちいずれかによって分析し、定量化することができる。これらとしては、例えば、NMR、分光測光法、ラジオグラフィー、電気泳動、キャピラリー電気泳動、高性能液体クロマトグラフィー(HPLC)、薄層クロマトグラフィー(TLC)および超拡散(hyperdiffusion)クロマトグラフィーなどの生化学的分析方法、様々な免疫学的方法、例えば液体もしくはゲル沈降素反応、免疫拡散、免疫電気泳動、ラジオイムノアッセイ(RIA)、酵素免疫測定法(ELISA)、免疫蛍光アッセイ、サザン分析、ノーザン分析、ドットブロット分析、ゲル電気泳動(例えば、SDS-PAGE)、RT-PCR、定量PCR、他の核酸もしくは標的もしくはシグナル増幅方法、放射標識、シンチレーション計数法およびアフィニティークロマトグラフィーが挙げられる。
【００７０】
核酸の増幅
オリゴヌクレオチドプライマーを用いて核酸を増幅して、本発明を実施するために用いる融合タンパク質コード配列を生成し、in vivo投与後のワクチンレベル(例えば、プラスミドもしくはウイルスレベル)をモニターし、活性化CTLの存在および表現型を確認することなどができる。当業者であれば、既知配列(例えば、配列番号１)を用いて好適なオリゴヌクレオチド増幅プライマーを選択し、設計することができる。また増幅方法は当技術分野で周知であり、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応、PCR(PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications, Innis編, Academic Press, N.Y. (1990)およびPCR Strategies (1995), Innis編, Academic Press, Inc., N.Y.)；リガーゼ連鎖反応(LCR) (Wu (1989) Genomics 4：560；Landegren (1988) Science 241：1077；Barringer (1990) Gene 89：117)；転写増幅(Kwoh (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86：1173)；および自立配列複製(Guatelli (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87：1874)；Qβレプリカーゼ増幅(Smith (1997) J. Clin. Microbiol. 35：1477-1491；Burg (1996) Mol. Cell. Probes 10：257-271)ならびに他のRNAポリメラーゼ介在技法(NASBA, Cangene, Mississauga, Ontario；Berger (1987) Methods Enzymol. 152：307-316；米国特許第4,683,195号および第4,683,202号；Sooknanan (1995) Biotechnology 13：563-564)が挙げられる。
【００７１】
発現カセットのクローニングおよび構築
本明細書に記載の融合タンパク質をコードする、プラスミド、組換えウイルス(例えば、下記に記載のレプリコンのようなRNAウイルス)および他のベクターを含めた発現カセットは、in vitroおよびin vivoでこれらのポリペプチドを発現するために用いられる。組換え核酸は、様々な従来技法(Roberts (1987) Nature 328：731；Schneider (1995) Protein Expr. Purif. 6435：10；Sambrook,前掲；Tijssen,前掲；Ausubel,前掲)によって発現される。プラスミド、ベクターなどは、天然供給源から単離するか、ATCCもしくはGenBankライブラリーなどの供給者から入手するか、または合成もしくは組換え方法によって調製することができる。
【００７２】
本発明を実施するために用いる核酸を、エピソーム発現系などの細胞において安定してまたは一過的に発現させることができる。選択マーカーを組み込み、形質転換細胞に選択可能な表現型を供与することができる。例えば、選択マーカーは、宿主ゲノムへの組込みを必要としないようにエピソーム維持および複製をコードすることができる。例えば、マーカーが抗生物質耐性(例えば、クロラムフェニコール、カナマイシン、G418、ブレオマイシン、ハイグロマイシン)をコードすることで、所望のDNA配列で形質転換した細胞の選択を可能にすることができる(Blondelet-Rouault (1997) Gene 190：315-317；Aubrecht (1997) J. Pharmacol. Exp. Ther. 281：992-997)。
【００７３】
in vivo 核酸投与
一実施形態において、CRT-クラスI結合性ペプチドエピトープをコードする核酸は、in vitro、ex vivoおよび/またはin vivoで細胞にトランスフェクトまたは感染することができるプラスミドまたは他のベクター、ウイルスなどの発現カセットにクローニングされる。多数の送達手法が知られており、脂質もしくはリポソームに基づく遺伝子送達(Mannino (1988) BioTechniques 6：682-691；米国特許第5,279,833号)、レトロウイルスゲノムの一部として所望の外因性配列を有する複製欠陥レトロウイルスベクター(Miller (1990) Mol. Cell. Biol. 10：4239；Kolberg (1992) J. NIH Res. 4：43；Cornetta (1991) Hum. Gene Ther. 2：215；Zhang (1996) Cancer Metastasis Rev. 15：385-401；Anderson, Science (1992) 256：808-813；Nabel (1993) TIBTECH 11：211-217；Mitani (1993) TIBTECH 11：162-166；Mulligan (1993) Science, 926-932；Dillon (1993) TIBTECH 11：167-175；Miller (1992) Nature 357：455-460)が挙げられる。
【００７４】
また発現カセットをウイルスゲノムから誘導することができる。用いることができるベクターには、組換えで改変したエンベロープもしくは非エンベロープDNAおよびRNAウイルスが含まれ、例えば、バキュロウイルス科、パルボウイルス科、ピコルナウイルス科(picornoviridae)、ヘルペスウイルス科、ポックスウイルス科、アデノウイルス科、ピコルナウイルス科(picornnaviridae)またはアルファウイルス科が挙げられる。また各親ベクターの特性の有利な長所を利用するキメラベクターを用いることができる(Feng (1997) Nature Biotechnology 15：866-870)。このようなウイルスベクターを組換えDNA技法によって改変することで目的の遺伝子を含ませることができ、そして遺伝子工学的に操作して、複製欠陥に、条件付きで複製する、または複製能力があるようにすることができる。ベクターは、アデノウイルスゲノム、アデノ随伴ウイルスゲノムまたはレトロウイルスゲノムから誘導することができる。レトロウイルスベクターは、マウス白血病ウイルス(MuLV)、テナガザル白血病ウイルス(GaLV)、サル免疫不全ウイルス(SIV)、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)およびそれらの組合せに基づくものを含むことができる(Buchscher (1992) J. Virol. 66 (5) 2731-2739；Johann (1992) J. Virol. 66 (5)：1635-1640 (1992)；Sommerfelt (1990) Virol. 176：58-59；Wilson (1989) J. Virol. 63：2374-2378；Miller (1991) J. Virol. 65：2220-2224)。アデノ随伴ウイルス(AAV)に基づくベクターは、核酸およびペプチドのin vitro産生のために細胞に形質導入することができ、in vivoおよびex vivo治療方法に用いることができる(Okada (1996) Gene Ther. 3：957-964；West (1987) Virology 160：38-47；Carter (1989) 米国特許第4,797,368号；Carterら WO93/24641 (1993)；Kotin (1994) Human Gene Therapy 5：793-801；Muzyczka (1994) J. Clin. Invst. 94：1351)。
【００７５】
自己複製 RNA レプリコンを用いた in vivo 投与
上記の発現ベクターおよび組換えウイルスに加えて、また自己複製RNAレプリコンを用いて細胞もしくは組織もしくは生物全体に感染させ、本発明の融合タンパク質発現核酸を供与することができる。従って、また本発明には、遺伝子工学的に操作して異種RNAおよびタンパク質の発現を可能にした、シンドビスウイルス、セムリキ森林ウイルス、べネズエラウマ脳脊髄炎ウイルスなどに由来するアルファウイルスゲノムRNAを含むRNAウイルスが組み入れられる。ウイルス構造遺伝子が異種コード配列によって置換された場合、本発明の融合ポリペプチドなどの異種配列の高レベルの発現が達成される。
【００７６】
これらの組換えRNAは自己複製し(「レプリコン」)、裸のRNAもしくはDNAとして細胞に導入することができる。しかしながら、これらは、感染性ウイルス粒子としてパッケージングされ、細胞から放出されるにはトランス補足性(trans complementation)を必要とする。欠陥ヘルパーRNAは、複製に必要なシス作用性配列ならびにオープンリーディングフレームの発現を駆動するRNAプロモーターを含有する。レプリコンおよび欠陥ヘルパーRNAの双方で同時トランスフェクトした細胞においては、レプリコンRNAから翻訳されるウイルス非構造タンパク質が欠陥ヘルパーRNAの複製と転写を可能にし、ウイルス粒子の構造タンパク質を産生する(Bredenbeek (1993) J. Virol. 67：6439-6446)。
【００７７】
RNAレプリコンワクチンは、アルファウイルスベクター、例えば、シンドビスウイルス(トガウイルス科)(Xiong (1989) Science 243：1188-1191)、セムリキ森林ウイルス(Ying (1999) Nat. Med. 5：823-827)またはべネズエラウマ脳脊髄炎ウイルス(Pushko (1997) Virology 239：389-401)ベクターから誘導することができる。これらのワクチンは自己複製および自己制御し、そしてRNAまたはDNAのいずれかとして投与され、次いでトランスフェクトした細胞中でまたはin vivoでRNAレプリコンに転写されうる(Berglund (1998) Nat. Biotechnol. 16：562-565)。自己複製RNAは、多様な範囲の細胞型に感染し、高レベルで目的の抗原の発現を可能にする(Huang (1996) Curr. Opin. Biotechnol. 7：531-535)。さらに、ウイルス複製は感染宿主細胞にとって有毒なので、自己複製RNAは最終的にはトランスフェクトした細胞の溶解を引き起こす(Frolov (1996) J. Virol. 70：1182-1190)。従って、これらのベクターには、宿主ゲノムに組み込まれるという裸のDNAワクチンに関連する懸念が生じない。このことは、潜在的に腫瘍形成性であるタンパク質、例えばアデノウイルスE7タンパク質をターゲティングするワクチン開発にとって特に重要である。
【００７８】
一実施形態において、Bredenbeek,前掲およびHerrmann (1998) Biochem. Biophys. Res. Commun. 253：524-531に詳細に記載されるように、自己複製RNAレプリコンはシンドビスウイルス自己複製RNAベクターSINrep5を含む。
【００７９】
ポリペプチド
他の実施形態において、本発明は、第1ドメインがカルレティキュリン(CRT)ポリペプチドを含み；そして第2ドメインがMHCクラスI結合性ペプチドエピトープを含む、少なくとも2種のドメインを含む単離されたまたは組換えポリペプチドに向けられている。上記で述べたように、本発明を実施するために用いる、CRT、ペプチドと結合するCRT断片およびMHCクラスI結合性ペプチドエピトープを含めたポリペプチドを意味する「ポリペプチド」、「タンパク質」および「ペプチド」という用語は、またCRTおよびMHCクラスI結合性ペプチドエピトープに実質的に対応する構造および活性を有する「類似体」もしくは「保存的変異体」および「擬似体」もしくは「ペプチド擬似体」を含めた本発明の組成物を含む。従って、また「保存的変異体」または「類似体」または「擬似体」という用語は、変化がポリペプチドの(保存的変異体の)構造および/または活性(「抗原性」ペプチドとの結合能力、免疫応答の刺激能力)を実質的に改変しないように改変されたアミノ酸配列を有するポリペプチドもしくはペプチドを意味する。これらとしては、アミノ酸配列の保存的な改変変異、すなわちタンパク質活性に重要ではない残基のアミノ酸置換、付加もしくは欠失、あるいはたとえ重要なアミノ酸の置換であっても構造および/または活性を実質的に改変しないような類似の特性(酸性、塩基性、正にもしくは負に荷電した、極性もしくは非極性など)を有する残基を用いたアミノ酸の置換が挙げられる。機能的な類似アミノ酸を提供する保存的置換表は、当技術分野で周知である。例えば、保存的置換を選択するための1つの典型的なガイドラインとしては、(元の残基/置換)：Ala/GlyもしくはSer；Arg/Lys；Asn/GlnもしくはHis；Asp/Glu；Cys/Ser；Gln/Asn；Gly/Asp；Gly/AlaもしくはPro；His/AsnもしくはGln；Ile/LeuもしくはVal；Leu/IleもしくはVal；Lys/ArgもしくはGlnもしくはGlu；Met/LeuもしくはTyrもしくはIle；Phe/MetもしくはLeuもしくはTyr；Ser/Thr；Thr/Ser；Trp/Tyr；Tyr/TrpもしくはPhe；Val/IleもしくはLeuが挙げられる。
【００８０】
別の典型的なガイドラインは、以下の表に示す群を使用する。タンパク質化学および構造の詳細な説明については、Schulz, GEら, Principles of Protein Structure, Springer-Verlag, New York, 1978、およびCreighton, T.E., Proteins：Structure and Molecular Properties, W.H.Freeman & Co., San Francisco, 1983を参照されたい(これらは、参照により本明細書に組み入れられるものとする)。本発明のポリペプチドにおいて行うことができる置換のタイプは、以下の5群のうちの1群内での置換として本明細書で規定する、異なる種の相同タンパク質間のアミノ酸変化の頻度分析に基づくものとすることができる：
【００８１】
上記で丸括弧中の3種のアミノ酸残基は、タンパク質構造において特別な役割を有する。Glyは、側鎖を欠く唯一の残基であり、従って鎖に対して柔軟性を付与する。Proは、その普通でない幾何学的配置のために鎖を厳密に拘束する。Cysは、タンパク質折畳みに重要なジスルフィド結合形成に参加できる。
【００８２】
生化学的、機能的(または免疫学的)特性におけるより実質的な変化は、上記の5群内以外の間などのあまり保存的でない置換を選択することによって行う。そのような変化は、(a)置換領域におけるペプチド主鎖の構造(例えば、シートもしくはらせん配座)、(b)標的部位における分子の電荷もしくは疎水性、または(c)側鎖のかさ(bulk)の維持に及ぼす影響においてより有意に異なるだろう。そのような置換の例としては、(i)別のアミノ酸によるGlyおよび/もしくはProの置換、またはGlyもしくはProの欠失もしくは挿入；(ii)疎水性残基(例えば、Leu、Ile、Phe、ValもしくはAla)に対する(または、による)親水性残基(例えば、SerもしくはThr)の置換；(iii)任意の他の残基に対する(または、による)Cys残基の置換；(iv)電気陰性電荷を有する残基(例えば、GluもしくはAsp)に対する(または、による)電気陽性側鎖を有する残基(例えば、Lys、ArgもしくはHis)の置換；あるいは(v)かさ高い(bulky)側鎖を有さない残基(例えば、Gly)に対する(または、による)かさ高い側鎖を有する残基(例えば、Phe)の置換が挙げられる。
【００８３】
当業者であれば、上記で確認された置換のみが可能な保存的置換ではないことが理解されるだろう。例えば、ある目的で、全ての荷電アミノ酸を、それらが陽性または陰性であろうともお互いに保存的置換とみなすことができる。また、コード配列において単一のアミノ酸または少ない割合のアミノ酸を変える、付加するまたは欠失する個々の置換、欠失または付加により、「保存的な改変変異体」を得ることを考えることができる。
【００８４】
「擬似体」および「ペプチド擬似体」という用語は、本発明の方法における使用が可能なペプチドの必要な構造的および/または機能的特性を有する合成化学化合物を意味し、例えば、ペプチドとMHCクラスIタンパク質との相互作用におけるCRTを模倣するものである。擬似体は、完全にアミノ酸の合成非天然類似体から構成されていても、または部分的には天然アミノ酸および部分的には非天然類似体の組合せであってもよい。また擬似体は、天然アミノ酸保存的置換が実質的に擬似体の構造および/または活性を変えない限り、そのような置換の任意の量を組込むことができる。保存的変異体と同様に、慣例の実験により、擬似体が本発明の範囲内にあるか否か、すなわち擬似体の立体化学的構造および/または機能が実施的に変化していないことが決定されるだろう。ペプチド擬似体は、典型的には以下の3群からの「非天然」構造的構成要素の任意の組合せを含むことができる：(a)天然アミド結合(「ペプチド結合」)以外の残基連結基；（b)天然アミノ酸に置き換わる非天然残基；または(c)二次構造(例えば、βターン、γターン、βシートもしくはαへリックス配座)を誘導もしくは安定させる残基。ポリペプチドは、ポリペプチドの残基の全てもしくは幾つかがペプチド結合以外の化学結合で連結されている場合に擬似体として特性付けることができる。個々のペプチド擬似体残基を、ペプチド結合、他の化学結合またはカップリング手段、例えばグルタルアルデヒド、N-ヒドロキシスクシンイミドエステル、二機能性マレイミド、N,N'-ジシクロヘキシルカルボジイミド(DDC)もしくはN,N'-ジイソプロピルカルボジイミド(DIC)によって連結することができる。ペプチド結合に代わる連結基としては、ケトメチレン(-C(=O)-NH-に代わって-C(=O)-CH2-)、アミノメチレン(CH2-NH)、エチレン、オレフィン(CH=CH)、エーテル(CH2-O)、チオエーテル(CH2-S)、テトラゾール(CN4-)、チアゾール、レトロアミド、チオアミドまたはエステルが挙げられる(Spatola (1983) Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides and Proteins, 第7巻, pp267-357, Peptide Backbone Modifications, Marcell Dekker, NY)。
【００８５】
本発明の擬似体を含めたポリペプチド、ペプチド、他の機能的誘導体の構造は、CRT、好ましくはヒトCRTの構造とアミノ酸配列に基づくものであることが好ましい(McCauliffe (1990) J. Clin. Invest. 86：332-335；Burns (1994) Nature 367：476-480；Coppolino (1998) Int. J. Biochem. Cell Biol. 30：553-558)。ヒトCRTタンパク質(GenBank 登録番号NM 004343)(配列番号２)を以下に示す：
【００８６】
個々の合成残基および擬似体を組込むポリペプチドは、当技術分野で周知の種々の方法および方法論を用いて合成することができる(例えば、Organic Syntheses Collective Volumes, Gilmanら, (dds) John Wiley & Sons, Inc., NY)。また擬似体を組込むポリペプチドを、固相合成方法を用いて作製することもできる(例えば、米国特許第5,422,426号)。また本発明のペプチドおよびペプチド擬似体を、コンビナトリアル方法論を用いて合成することもできる。ペプチドおよびペプチド擬似体ライブラリーの生成に対する様々な技法が周知であり、例えばマルチピン、ティーバッグ(tea bag)およびスプリットカップルミックス(split-couple-mix)技法が挙げられる(al-Obeidi (1998) Mol. Biotechnol. 9：205-223；Hruby (1997) Curr. Opin. Chem. Biol. 1：114-119；Ostergaard (1997) Mol. Divers. 3：17-27；Ostresh (1996) Methods Enzymol. 267：220-234)。さらに改変ポリペプチドおよびペプチドは、化学修飾によって生産することができる(Belousov (1997) Nucleic Acids Res. 25：3440-3444；Frenkel (1995) Free Radic. Biol. Med. 19：373-380；Blommers (1994) Biochemistry 33：7886-7896)。
【００８７】
またペプチドを、従来の化学合成を完全にもしくは部分的に用いて合成することもできる(Caruthers (1980) Nucleic Acids Res. Symp. Ser. 215-223；Horn (1980) Nucleic Acids Res. Symp. Ser. 225-232；Banga, A.K., Therapeutic Peptides and Proteins, Formulation, Processing and Delivery Systems (1995) Technomic Publishing Co., Lancaster, PA)。例えば、ペプチド合成を様々な固相技法(Roberge (1995) Science 269：202；Merrifield (1997) Methods Enzymol. 289：3-13)および自動化合成(例えば、製造業者使用説明書に従いABI 431A ペプチド合成機を使用して)を用いて実施することができる。
【００８８】
本発明の一実施形態において、ペプチド結合性断片またはCRTの「部分配列(sub-sequence)」を用いる。別の実施形態において、MHCタンパク質、好ましくはMHCクラスIタンパク質に結合する他のペプチドを用いる。そのようなペプチドは、任意のポリペプチド、特に公知の病原体から誘導することができ、または完全に合成であることができる。ペプチドがCRTもしくはCRT断片またはMHCタンパク質に結合するか否か、そしてどの程度結合するかを決定する方法は、当技術分野で慣例である(Jensen (1999) Immunol. Rev. 172：229-238；Zhang (1998) J. Mol. Biol. 281：929-947；Morgan (1997) Protein Sci 6：1771-1773；Fugger (1996) Mol. Med. 2：181-188；Sette (1994) Mol. Immunol. 31：813-822；Elvin (1993) J. Immunol. Methods 158：161-171；米国特許第6,048,530号；第6,037,135号；第6,033,669号；第6,007,820号)。
【００８９】
医薬組成物の製剤化および投与
本発明の様々な実施形態において、ポリペプチド、核酸、発現カセット、細胞および粒子を薬理学的組成物として個体に、個体において抗原特異的免疫応答(例えばCTL応答、下記の実施例を参照されたい)を誘導するのに十分な量で投与する。
【００９０】
核酸、ペプチドおよびポリペプチドのための製薬上許容される担体および製剤は、当業者には公知であり、科学文献および特許文献に詳細に記載されている。例えば、Remington's Pharmaceutical Science, Maack Publishing Company, Easton, PA(「Remington's」)の最新版;Banga；Putney (1998) Nat. Biotechnol. 16：153-157；Patton (1998) Biotechniques 16：141-143；Edwards (1997) Science 276：1868-1871；米国特許第5,780,431号；第5,770,700号；第5,770,201号を参照されたい。
【００９１】
本発明の方法に使用する核酸およびポリペプチドを、単独で、または医薬組成物として、当技術分野で公知の任意の手段、例えば全身、局所または局部に；動脈内、髄腔内(IT)、静脈内(IV)、非経口、胸膜腔内、局所、経口または局部投与によって、皮下、気管内(例えば、エアロゾルによって)または経粘膜(transmucosal)(例えば、頬側粘膜、膀胱粘膜、膣粘膜、子宮粘膜、直腸粘膜、鼻粘膜)のように送達することができる。実際の組成物の送達方法は、当業者には公知であるかまたは明らかであろうし、科学文献および特許文献に詳細に記載されている。例えば、Remington'sを参照されたい。
【００９２】
医薬組成物は、任意のプロトコールによって、そして投与の方法および経路および頻度、他の薬物を投与しているか否か、個体の応答などに応じて種々の単位剤形で投与することができる。典型的な核酸、ペプチドおよびポリペプチド医薬組成物の用量は、当業者には周知である。そのような用量は、種々の要因、例えば、初期応答(例えば、誘導されたCTLの数および活性、腫瘍縮小など)、特定の治療状況、患者の健康状態および耐性に応じて調節することができる。所望の応答を誘導するのに十分な医薬組成物量は、「治療上有効な用量」として規定される。投薬計画およびこの使用に有効な量、すなわち「投薬処方計画」は、種々の要因(例えば、免疫感作によって治療または予防される疾患または症状、患者の健康状態の一般的状態、患者の身体的状態、年齢、医薬製剤および医薬組成物の濃度などが挙げられる)に依存するだろう。また、投薬処方計画は、薬物動力学、すなわち医薬組成物の吸収速度、生物学的利用能、代謝、クリアランスなどを考慮する(Remington)。用量は、経験的に、例えば症状の寛解もしくは改善を評価することによって、または客観的な基準、例えば抗原特異的CTLレベルを測定することによって決定することができる。上記で述べたように、単一もしくは複数回の投与は、患者に必要であり、かつ許容される用量および頻度に応じて投与することができる。医薬組成物は、単独でまたは他の治療的処置と一緒に、あるいは予防的免疫感作として投与することができる。
【００９３】
APC の ex vivo 処置および再投与
本発明の様々な実施形態において、本発明の核酸およびポリペプチドを個体に、抗原提示細胞(APC)をex vivoで処置した後、操作されたAPCを投与することによって導入する。一実施形態において、APCを本発明の融合タンパク質コード核酸で形質導入(トランスフェクト)するかまたは感染させ；その後、APCを個体に投与する。別の実施形態において、APCを本発明の融合タンパク質(精製したもの、またはトランスフェクトし、in vivoで組換え融合タンパク質を発現する細胞からの細胞溶解物として)で刺激する。この「パルス」後に、APCを個体に投与する。
【００９４】
融合タンパク質は、例えば精製もしくは合成ポリペプチド、粗細胞溶解物(組換え融合タンパク質を作製するトランスフェクト細胞由来)などのようないずれの形態であってもよい。APCは、MHC適合(MHC-matched)細胞(組織タイピングした(tissue-typed)細胞)であってよい。APCは、組織培養細胞であっても、または治療しようとする個体から単離され、かつex vivo刺激後に再投与されるAPCであってもよい。上記のようにいずれのAPCも使用できる。APCの単離方法、培養におけるex vivo処置方法および再投与方法は、当技術分野で周知である(米国特許第5,192,537号；第5,665,350号；第5,728,388号；第5,888,705号；第5,962,320号；第6,017,527号；第6,027,488号)。
【００９５】
キット
本発明は、本発明の方法を実施するための上記の本発明の医薬組成物を含むキットを提供する。別の実施形態において、キットは、ERシャペロンポリペプチドを含む第1ドメインと抗原性ペプチドを含む第2ドメインとを含む組換えもしくは合成キメラポリペプチド(例えば、CRT-クラスI結合性ペプチドエピトープ融合タンパク質)；または例えば裸のDNA(例えばプラスミド)、ウイルス(例えばシンドビスウイルスレプリコンを含むアルファウイルスに由来する「レプリコン」)などの形態にある上記キメラポリペプチドをコードする核酸を含むことができる。キットは、方法論を教示する説明的な資料、例えば本発明を実施するために使用する組成物の投与手段、細胞または患者または動物に本発明の核酸もしくはポリペプチドを注射または感染させるための手段、得られた免疫応答をモニターし、組成物を投与した個体の応答を評価するための手段などを含むことができる。
【００９６】
本明細書で説明する実施例および実施形態は、単に説明を目的にするものであり、その観点において様々な改変と変更は当業者には示唆されるだろうし、そしてこの出願の精神および権限ならびに添付の特許請求の範囲の範囲内に含まれるべきであることは理解される。
【００９７】
実施例
以下の実施例は、請求される発明を限定するのではなく、説明するために提供される。
【００９８】
実施例１
CRT- クラス I 結合性ペプチドエピトープの投与は抗原特異的細胞傷害性 T リンパ球 (CTL) 応答の発生を増強する
以下の実施例は、本発明の組成物および方法が抗原特異的細胞傷害性Tリンパ球(CTL)応答を増強することに有効であることを実証する研究を説明する。
【００９９】
これらの研究は、カルレティキュリン(CRT)とクラスIポリペプチド結合性ペプチドエピトープの双方を含む融合タンパク質のコード配列を含むDNAワクチンを使用した。この場合、エピトープはモデル抗原、ヒトパピローマウイルス-16 E7ポリペプチド(HPV-16 E7)であった。E7特異的免疫応答によって媒介される抗腫瘍効果およびワクチン接種したマウスにおけるワクチン刺激抗脈管形成効果を評価した。キメラカルレティキュリン/E7(CRT/E7)融合遺伝子を含むDNAワクチンで皮内にワクチン接種したC57BL/6マウスは、野生型E7もしくはCRT遺伝子を単独で含むDNAワクチンと比較して、E7特異的CD8+T細胞(CTL)前駆体の劇的な増大、腫瘍防御および腫瘍処置を示した。さらに、CRT DNAまたはキメラCRT/E7 DNAのいずれかを用いたC57BL/6もしくはヌードマウスにより、肺転移性結節が低減され、そして肺結節内の脈管形成が阻害された。これらの結果は、抗原遺伝子へのCRT遺伝子の連結はDNAワクチンの効力を大いに増強し、抗原特異的CD8+T細胞(CTL)免疫応答と抗脈管形成効果の双方の有意な増強を介して抗腫瘍効果を引き出すことができることを示すものである。
【０１００】
プラスミド DNA 構築物および調製：
HPV-16 E7発現pcDNA3プラスミドの生成は、Chen (2000) Cancer Res. 60：1035-1042に記載のように行われた。また、Chen (2000) Vaccine 18：2015-2022；Ji (1999) Hum. Gene Ther. 10：2727-2740；Chen (1999) Gene Ther. 6：1972-1981；Ji (1998) Int. J. Cancer 78：41-45を参照されたい。また、例えばSeedorf (1987) EMBO J. 6：139-144；米国特許第5,629,161号；第5,501,947号；第5,547,846号；第5,180,806号；第4,777,239号を参照されたい。完全HPV-16ゲノムおよび以下の配列（配列番号５）：
を有するHPV-16 E7タンパク質を示すGenBank登録番号AF125673(1999年6月1日)を参照されたい。
【０１０１】
ウサギカルレティキュリン(ウサギ、ヒト、マウスおよびラットカルレティキュリンの間には90％を上回る相同性がある)の全長をコードするプラスミド、pcDNA3-CRTの生成においては、まずこのタンパク質をコードするDNA断片を、Chen (2000) Cancer Res.,前掲に記載の条件を用いたPCRで、ウサギカルレティキュリンcDNA鋳型(Michalak (1999) Biochem J. 344 Pt2：281-292)(Marek Michalak博士(University of Alberta, Edmonton, Canada)によって提供された)ならびにプライマーセット：5'-ccggtctagaatgctgctccctgtgccgct-3'(配列番号６)および5'-ccggagatctcagctcgtccttggcctggc-3'(配列番号７)を用いて増幅した。次いで増幅産物を制限消化酵素XbaIおよびBamHIで消化し、さらにpcDNA3ベクター(Invitrogen, Carlsbad, CA)のXbaIおよびBamHIクローニング部位にクローニングした。pcDNA3-CRT/E7の生成においては、E7 DNAを、DNA鋳型としてpcDNA3-E7ならびにプライマーセット：5'-ggggaattcatggagatacaccta-3'(配列番号７)および5'-ggtggatccttgagaacagatgg-3'(配列番号８)を用いたPCRによって増幅した。次いで増幅E7 DNA断片をBamHIで消化し、さらにpcDNA3-CRTベクターのBamHIクローニング部位にクローニングした。これらの構築物の配向と精度をDNA配列決定分析によって確認した。
【０１０２】
CRT、E7またはCRT/E7遺伝子インサートを有するプラスミドDNAおよび「空の」プラスミドベクターを、サブクローニング効率のよいDH5（商標）細胞(Life Technologies, USA)にトランスフェクトした。次いで、DNAを増幅し、二重CsCl精製(BioServe Biotechnologies, Laurel, MD)を用いて精製した。各調製物中のプラスミドDNAの完全性および大腸菌(Escherichia coli)DNAもしくはRNAの不在を、1％のアガロースゲル電気泳動を用いてチェックした。DNA濃度を、260nmで測定する光学密度で決定した。挿入されたE7断片の存在を、制限酵素消化およびゲル電気泳動によって確認した。
【０１０３】
細胞系：
TC-1細胞の生産と維持は、Lin (1996) Cancer Res. 56：21-26に記載のように行われた。腫瘍チャレンジ(challenge)の日に、TC-1細胞をトリプシン処理によって回収し、1X Hanks緩衝塩溶液(HBSS)で2回洗浄し、最後に1X HBSS中に再懸濁して、指定された注射用濃度にした。DbおよびKbを発現するヒト胎児腎293細胞系(293 Db,Kb)(Bloom (1997) J. Exp. Med. 185：453-459)は、JC Yang博士(NCI, NIH, Bethesda, MD)によって提供された。この細胞系は、10％の熱非働化ウシ胎児血清、0.3％のグルタミン、0.01M HEPES、100U/mlペニシリン、G418 100μgを含有するDMEM培地中で増殖した。
【０１０４】
マウス：
6〜8週齢のメスC57BL/6マウスをNational Cancer Institute(Frederick, MD)から購入し、Johns Hopkins Hospital(Baltimore, MD)の腫瘍学動物施設で飼育した。抗脈管形成効果を特性付けるために、免疫エフェクター不在におけるin vivo 腫瘍処置実験を、National Cancer Institute(Frederick, MD)からのBALB/c nu/nu 6週齢メスマウスを用いて実施した。全ての動物手順は、認可されたプロトコールおよび実験室動物の適切な使用と注意についての推奨に従って実施した。
【０１０５】
DNA ワクチン接種：
DNAコーティング金粒子の調製および遺伝子銃粒子媒介DNAワクチン接種を、ヘリウム駆動遺伝子銃(Bio-Rad, Hercules, CA)を用いてChen (2000) Cancer Res.,前掲の記載に従って実施した。簡単に言えば、DNAコーティング金粒子(DNA 1もしくは4μg/弾丸)を、約400p.s.i.の発射圧でヘリウム駆動遺伝子銃を用いてマウスの毛を剃り落とした腹部領域に送達した。
【０１０６】
細胞質内サイトカイン染色およびフローサイトメトリー分析：
無傷のマウス群またはワクチン接種したマウス群を、E7特異的CD8+T細胞前駆体を検出するためにMHCクラスIエピトープを含むE7ペプチド(アミノ酸(aa)49-57残基)(Feltkamp (1993) Eur. J. Immunol. 23：2242-2249)とともにインキュベートするか、またはE7特異的CD4+Tヘルパー細胞前駆体を検出するためにMHCクラスIIペプチドを含むE7ペプチド(aa30-67)(Tindle (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88：5887-5891)とともにインキュベートした。E7ペプチドは、aa49-57については1μg/mlの濃度で、そしてaa30-67については10μg/mlの濃度で20時間添加された。Golgistop（商標）(Pharmigen, San Diego, CA)を培養物から細胞を回収する6時間前に添加した。次いで細胞をFACScan（商標）バッファー中で1回洗浄して、フィコエリトリン(PE)-コンジュゲートモノクローナルラット抗マウスCD8もしくはCD4抗体(PharMingen, San Diego, CA)で染色した。細胞を、製造業者の使用説明書(PharMingen)に従ってCytofix/Cytoperm（商標）キットを用いて細胞内サイトカイン染色に供した。FITC-コンジュゲート抗IFN-γおよび抗IL-4抗体ならびに免疫グロブリンアイソタイプ対照抗体(ラットIgG1)は、全てPharMingenから購入した。フローサイトメトリー分析は、CELLQuest（商標）ソフトウエアを用いるBecton Dickinson FACScan（商標）(Becton Dickinson Immunocytometry System, Mountain View, CA)において行った。
【０１０７】
抗 E7 抗体に対する ELISA ：
血清中の抗HPV 16 E7抗体を、Wu (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92：11671-11675に記載のように直接的ELISAによって測定した。簡単に言えば、96マイクロウエルプレートを、10.5μg/mlの細菌に由来するHPV-16 E7タンパク質でコーティングし、40℃で一晩インキュベートした。次いで、ウエルを20％のウシ胎児血清を含有するPBSでブロッキングした。血清を、免疫感作後14日目にマウスから調製し、1X PBS中に連続希釈し、ELISAウエルに添加し、37℃で2時間インキュベートした。0.05％のTween-20を含有する1X PBSで洗浄した後、プレートをペルオキシダーゼ-コンジュゲートウサギ抗マウスIgG抗体(Zymed, San Francisco, CA)の1/2000希釈物で室温(RT)で1時間インキュベートした。プレートを6回洗浄し、TMB(Pierce, Rockford, IL)で顕色し、1M H2SO4で停止させた。ELISAプレートを、標準的ELISAリーダーを用いて450nmで読み取った。
【０１０８】
in vivo 腫瘍防御実験：
腫瘍防御実験において、マウス(1群あたり5匹)に2μgのCRT DNA、E7 DNA、CRT/E7 DNAを遺伝子銃を介してワクチン接種するか、またはワクチン接種しなかった。1週間後、マウスを最初のワクチン接種と同じ処方計画で追加免疫した。最後のワクチン接種の1週間後、マウスを、右脚中に5 x 104 TC-1細胞/マウスで皮下にチャレンジした。マウスを60日目に屠殺するまで、マウスを1週間に2回、触診と検査で腫瘍増殖の形跡についてモニターした。
【０１０９】
in vivo 腫瘍処置実験：
C57BL/6マウス(各群5匹)を、0日目に尾静脈を介して1 x 104細胞/マウスのTC-1腫瘍細胞で静脈内にチャレンジした。TC-1腫瘍細胞を用いたチャレンジの3日後に、マウスに遺伝子銃を介して2μgのCRT DNA、E7 DNA、CRT/E7 DNAを与えるか、またはワクチン接種しなかった。1週間後、これらのマウスを最初のワクチン接種と同じ処方計画で追加免疫した。マウスを1週間に2回モニターし、21日目に屠殺した。各マウスの肺転移性結節数は、サンプルの正体が分からない実験者によって評価および計数された。
【０１１０】
ヌード(BALB/c nu/nu)マウス(各群5匹)を、0日目に尾静脈を介して1 x 104細胞/マウスのTC-1腫瘍細胞で静脈内にチャレンジした。TC-1腫瘍細胞を用いたチャレンジの2日(D2)後に、マウスに遺伝子銃を介して16μgのCRT DNA、E7 DNA、CRT/E7 DNAまたはインサートを含まない空のプラスミドを与えた。9日目と16日目に、これらのマウスを最初のワクチン接種と同じ処方計画で追加免疫した。マウスを21日目に屠殺した。各マウスの肺結節は、サンプルの正体が分からない実験者によって評価および計数された。
【０１１１】
in vivo 抗体枯渇実験：
in vivo抗体枯渇は、Lin (1996) Cancer Res. 56：21-26に記載のように行われた。簡単に言えば、マウスを遺伝子銃を介してCRT/E7 DNA 2μgでワクチン接種し、1週間後に追加免疫し、5 x 104細胞/マウスのTC-1腫瘍細胞でチャレンジした。腫瘍チャレンジの1週間前に枯渇を開始させた。MAb GK1.5(Dialynas (1983) Immunol. Rev. 74：29-56)をCD4枯渇に使用し、MAb 2.43(Sarmiento (1980) J. Immunol. 125：2665)をCD8枯渇に使用し、そしてMAb PK136(Koo (1986) J. Immunol. 137：3742-3747)をNK1.1枯渇に使用した。フローサイトメトリー分析により、適切なリンパ球サブセットの＞99％が枯渇され、一方、他のサブセットの正常レベルが維持されたことが明らかとなった。
【０１１２】
樹状細胞の生成：
樹状細胞(DC)を、Fernandez (1999) Nat. Med. 5：405-411に記載のようにGM-CSFの存在下で骨髄細胞を培養することによって生成した。簡単に言えば、骨髄をマウスの大腿骨および脛骨から回収した。赤血球を溶解し、残りの細胞をナイロンメッシュを通過させることで小片の骨およびデブリを除去した。細胞を回収し、そして1 X 106細胞/mlを、5％のFCS、2mM メルカプトエタノール、1％の非必須アミノ酸、100U/mlペニシリンおよび100g/mlストレプトマイシン(Life Technologies, Rockville, MD)および100U/ml GM-CSF(PharMingen, San Diego, CA)を補足したRMPI 1640を含む24ウエルプレートに配置した。培地の3/2を2日ごとに入れ替え、非接着細胞を7日目に回収した。回収した細胞を、すでに記載したようにDCマーカーについてのフローサイトメトリー分析を用いて特性付けた(25)。
【０１１３】
E7 特異的 CD8+T 細胞系の生成：
E7特異的CD8+細胞系を、ワクシニアE7発現ベクター(Ji (1999) Hum. Gene Ther. 10：2727-2740に論じられているように、リソソーム関連膜タンパク質1(LAMP-1)コード配列をHPV-E7コード配列に融合させてSig/E7/LAMP-1と呼ばれるキメラDNAを構築した)の腹腔内注射によってメスC57BL/6(H-2b)マウスを免疫感作することによって生成した。脾細胞を8日目に回収した。最初のin vitro刺激については、脾細胞を20U/ml濃度のIL-2および1 TM E7ペプチド(配列番号４のアミノ酸49-57)で6日間パルスした。E7特異的CTL細胞系の増殖を、E7特異的CTLを含む1 x 106脾細胞と3 x 106の放射線照射した(irradiated)脾細胞とを混合し(2ml/ウエル)、それらに20U/ml濃度のIL-2および1 TM E7ペプチド(アミノ酸49-57)をパルスすることによって、24ウエルプレート中で実施した。この方法を6日ごとに繰り返した。E7CTL系の特異性を、CTLアッセイによって特性付けた。フローサイトメトリーを実施して、CD8マーカーの発現を示した。
【０１１４】
トランスフェクトした 293D b K b 細胞を標的細胞として用いた CTL アッセイ：
CTLアッセイを、Corr (1999) J. Immunol. 163：4721-4727に記載のように96ウエル丸底プレート中で実施した。細胞溶解を、乳酸脱水素酵素(LDH)の定量的測定によって測定した。トランスフェクトした293DbKb細胞を標的細胞として用い、一方、E7特異的CD8+T細胞はエフェクター細胞として機能した。5 x 106の293DbKb細胞を20TgのpcDNA3(空のプラスミド)、E7、CRTもしくはCRT/E7 DNAワクチンで、製造業者のプロトコールに従いリポフェクタミン2000（商標）(Life Technologies, Rockville, MD)を介してトランスフェクトした。293DbKb細胞をトランスフェクションの40〜44時間後に回収した。ELISAによって測定されるE7タンパク質発現のレベルは、E7およびCRT/E7でトランスフェクトした293DbKbにおいて類似していた。CTLアッセイを、様々な比率(1：1、3：1、9：1および27：1)で一緒に混合したエフェクター細胞と標的細胞(ウエルあたり1 x 104)を用いて最終容量200Tl中で実施した。37℃で5時間のインキュベーション後、培養培地を回収し、製造業者のプロトコールに従いCytoTox（商標）アッセイキット(Promega, Madison, WI)を用いて培養培地中のLDH量を評価した。溶解の割合を以下の等式から計算した：100 X (A-B)/(C-D)(式中、Aは実験のエフェクターシグナル値の読み取り値(reading)であり、Bはエフェクターの自発的なバックグラウンドシグナル値であり、Cは標的細胞からの最大シグナル値であり、Dは標的の自発的なバックグラウンドシグナル値である)。
【０１１５】
トランスフェクトした 293 細胞の溶解物をパルスした DC を標的細胞として用いた CTL アッセイ：
細胞溶解物をパルスした樹状細胞(DC)を標的細胞として用いたCTLアッセイを、Uger (1998) J. Immunol. 160：1598-1605に記載のプロトコールに類似したプロトコールを用いて実施した。簡単に言えば、まず5 x 106の293DbKb細胞を20TgのpcDNA3(空のプラスミド)、E7、CRTもしくはCRT/E7 DNAワクチンで、製造業者のプロトコールに従いリポフェクタミン2000（商標）(Life Technologies, Rockville, MD)を介してトランスフェクトした。トランスフェクトした293DbKb細胞をトランスフェクションの40〜44時間後に回収し、次いで3サイクルの凍結融解で処理した。タンパク質濃度は、販売業者のプロトコールに従いBioRadプロテインアッセイ(Bio-Rad, Hercules, CA)を用いて測定された。E7タンパク質量をELISAを用いて測定し、E7もしくはCRT/E7 DNAでトランスフェクトした293DbKb細胞に由来する細胞溶解物をE7タンパク質濃度について標準化した。DCを標的細胞として用い、100万個のDCに様々な濃度の細胞溶解物(50Tg/ml、10Tg/ml、2Tg/mlおよび0.4Tg/ml)を最終容量2ml中で16〜20時間パルスすることで調製した。E7特異的CD8+T細胞をエフェクター細胞として用いた。CTLアッセイを、E/T(9/1)の比率を固定して1 x 104の調製したDCと混合した9 x 104のE7特異的T細胞を用いて最終容量200Tl中で実施した。細胞溶解を、上記で記載したようにLDHの定量的測定によって測定した。
【０１１６】
組織学的および免疫組織化学的研究：
ワクチン接種したマウス由来の肺結節のパラフィンブロックを作製し、6Tmの切片に切断し、脱パラフィン化した。ヘマトキシリンおよびエオシン染色を、慣例の光学顕微鏡検査について実施し、未染色の切片を免疫組織化学的研究のために調製した。マウス抗CD31モノクローナル抗体(DAKO, Capinteria, CA)を、腫瘍内微小血管の検出に用いた。免疫組織化学的染色を、Huang (1999) Hum. Pathol. 30：587-591に記載のプロトコールを用いて双方の検体に由来する切片において実施した。微小血管密度(MVD)を、Cheng (1999) Cancer 85：651-657に記載のように測定した。簡単に言えば、染色したスライドを低い倍率(40x および100xの合計倍率)で検査し、各腫瘍中で最も高い新生血管形成領域(いわゆるホットスポット(hotspot))を同定した。各切片において、3ヶ所の最も血管新生した領域を選択した。微小血管計数は、200x倍率(20x対物レンズおよび10x接眼レンズ(Olympus BH-2顕微鏡)、接眼ミクロメーターで測定した視野サイズが視野あたり0.74mm2)で得られ、各腫瘍について3ヶ所の視野の平均数を計算して、微小血管密度(MVD)計数と呼んだ。適当な8個の血液細胞よりも大きい厚い筋肉壁および内腔を有する大血管を、計数から除外した。全ての測定は、サンプルの正体が分からない1人の病理学者によって実施された。
【０１１７】
CRT/E7 融合 DNA ワクチンの生成と特性付け：
カルレティキュリン(CRT)、E7およびカルレティキュリン/E7(CRT/E7)の構築物の概略図を図１に示す。全ての構築物は、DNA配列決定分析によって確認されている。E7含有構築物中のE7タンパク質の発現を示すために、様々なE7含有DNA構築物でトランスフェクトした293DbKb細胞の溶解物を用いたウエスタンブロット分析を実施した。野生型E7でトランスフェクトした293DbKb細胞は、HPV-16 E7に対応する30kDバンドを示した。加えて、CRT/E7でトランスフェクトした293DbKb細胞は、キメラCRT/E7タンパク質に対応するバンドを示した。陰性対照である、カルレティキュリンまたは空のプラスミドでトランスフェクトした293DbKbにおいては、目に見えるバンドは全く観察されなかった。
【０１１８】
CRT/E7 融合 DNA を用いたワクチン接種は E7 特異的 CD8+T 細胞数を有意に増強する：
CD8+Tリンパ球(CTL)は、抗腫瘍免疫の誘導において最も重要なエフェクターの1つである。本発明のCRT/E7 DNAワクチンのin vivo投与(マウスに対して)後に誘導されるE7特異的CD8+T細胞前駆体の量を決定するために、細胞内サイトカイン染色を、Ji (1999) Human Gene Therapy 10：2727-2740に記載のように使用した。細胞内サイトカイン染色は、単一細胞レベルでIFN-γ(IFN-K)産生を測定するために用いられる感度の高い機能的アッセイであり、従ってこれを適用して抗原特異的CD8+T細胞を定量化することができる。フローサイトメトリー分析(上記で論じたように実施)の結果を図２Aに二次元ヒストグラムで示す。図２Bに要約したように、CRT/E7 DNAでワクチン接種したマウスは、最も高い数のE7特異的IFN-γ発現/CD8+T細胞前駆体(204/3.5 x 105脾細胞)を誘導したが、E7 DNAでワクチン接種したマウスは、より少ない前駆体(47/3.5 x 105脾細胞)しか誘導しなかった(p<0.01)。CRT/E7キメラ構築物の免疫感作により、E7特異的CD8+T細胞前駆体数が5倍増大した。またこれらの結果より、2種のベクター(E7のみを発現するベクターと混合したCRTのみを発現するベクター)(図２Bにおける「CRT+E7」)を用いたワクチン接種はCD8+T細胞活性の増強を誘導しなかったので、CRTへのE7の融合(すなわち、融合タンパク質としての発現)がCD8+T細胞活性の増強には必要であることが示された。
【０１１９】
CRT/E7 融合 DNA を用いたワクチン接種は E7 特異的 CD4+T 細胞媒介免疫応答を増強しない：
これらの各ワクチンによって誘導されるE7特異的CD4+(「ヘルパー」)T前駆体細胞の生成およびサイトカインプロフィールを検査するために、本発明者らは免疫感作したマウス由来の脾細胞におけるCD4表面マーカーおよび細胞内IFN-K+に対する二重染色を実施し、次いでフローサイトメトリー分析を行った。免疫感作したマウス由来の脾細胞を、in vitroでE7ペプチド(aa30-67)とともに一晩培養し、CD4および細胞内IFN-K+の双方について染色した。E7ペプチド(aa30-67)は、HPV-16のE7オープンリーディングフレームタンパク質中の主要なTヘルパーエピトープを含む(Tindle (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88：5887-5891)。IFN-K+分泌CD4+T細胞の割合を、フローサイトメトリーを用いて分析した。CRT/E7キメラ構築物でワクチン接種したマウスは、野生型E7 DNA(25/3.5 x 105脾細胞 対 20/3.5 x 105脾細胞、p>0.05)または他のDNA群でワクチン接種したマウスと比較して、類似のCD4+IFNK+二重陽性細胞数を誘導した。フローサイトメトリー染色を用いて観察されたE7特異的CD4+IFNK+細胞数に、無傷のマウスまたは空のプラスミド、CRT、E7、CRT+E7もしくはCRT/E7構築物でワクチン接種したマウスの間に有意な差異はなかった。
【０１２０】
また様々なDNAワクチンでワクチン接種したマウス中のIL-4分泌性E7特異的CD4+T細胞数を評価した。IL-4分泌活性化マウス脾細胞(MiCK-2（商標）、PharMingen, San Diego, CA)を陽性対照として使用し、この研究における細胞内IL-4染色の成功を確認した。IL-4染色の特異性を、IL-4抗体を除いた場合のCD4+IL-4+T細胞の不在によって示した。CRT/E7、CRT、野生型E7 DNA、プラスミドDNAでワクチン接種したマウスまたはワクチン接種していない無傷のマウスにおいて、有意なCD4+IL-4+二重陽性細胞は同定されなかった。さらに、異なるワクチン接種群に由来するIL-4分泌CD4+IL-4+T細胞の頻度に有意な変化は観察されなかった。
【０１２１】
CRT/E7 を用いたワクチン接種はより高い力価の E7 特異的抗体を誘導した：
ワクチン接種したマウスの血清中の抗HPV 16 E7抗体量を、最後のワクチン接種の2週間後に直接的ELISAによって測定した。図３に示すように、CRT/E7ワクチン接種群は、他のワクチン接種群と比較してマウス血清中において最も高い力価の抗E7抗体を誘導した(P<0.01)。この結果より、本発明のCRT/E7キメラ構築物で接種したマウスは有意により高いE7特異的抗体応答を誘導したことが示された。
【０１２２】
CRT/E7 キメラ構築物を用いたワクチン接種は TC-1 腫瘍の増殖に対するマウスの防御を増強する：
様々なDNAワクチン構築物を用いたワクチン接種はE7発現腫瘍に対してマウスを防御するか否かを決定するために、in vivo腫瘍防御実験を実施した。マウスを、遺伝子銃を介して裸のDNA 2Tg/マウスでワクチン接種し、1週間後に同じ用量で追加免疫した。次いで、最後のワクチン接種の7日後にマウスを、右脚中に5 x 104 TC-1/マウスで皮下にチャレンジした。図４に示すように、CRT/E7キメラ構築物ワクチン接種を受けたマウスの100％が、TC-1チャレンジの60日後に腫瘍のない状態のままであった。それに反して、ワクチン接種していないマウスおよび空のプラスミド、CRT、野生型E7もしくは野生型E7+CRT DNAを受けたマウスの全てが、腫瘍チャレンジ後15日以内に腫瘍増殖を生じた。またこれらの結果より、E7のみを発現する構築物と混合したカルレティキュリンのみを発現する構築物(図４における「CRT+E7」)は抗腫瘍免疫の増強を誘導しなかったので、カルレティキュリンへのE7の融合が抗腫瘍免疫には必要であったことが示された。従って、本発明のCRT/E7キメラ構築物は、TC-1腫瘍の増殖に対する防御を有意に増強した。
【０１２３】
CRT/E7 キメラ構築物を用いたワクチン接種は肺において確立される E7 発現腫瘍を根絶する：
肺のTC-1腫瘍転移の処置においてキメラCRT/E7 DNA構築物の治療的潜在性を決定するために、まずC57BL/6マウスを、静脈内尾静脈注射を介してマウス1匹あたり1 x 104のTC-1腫瘍細胞でチャレンジした(肺転移モデル)(Ji (1998) Int. J. Cancer 78：41-45)。次いで、マウスを7日後に遺伝子銃を介して裸のDNA 2Tgで処置し、1週間後に同じ用量で追加免疫した。次いで、マウスを腫瘍チャレンジの30日後に屠殺した。図５に示すように、CRT/E7キメラ構築物でワクチン接種したマウスは、野生型E7 DNAのみ(77.6+9.8)またはカルレティキュリンDNAのみ(26.4+4.9)でワクチン接種したマウスと比較して肺結節の最も低い平均数(4.0+1.6)を示した(one-way ANOVA, P<0.001)。データは、肺転移性腫瘍結節の平均数+SEMとして表している。興味深いことに、野生型カルレティキュリンDNAでワクチン接種したマウスは、野生型E7 DNAを受けたマウスまたはワクチン接種を受けていないマウスよりも低い結節の平均数を示した(one-way ANOVA, P<0.001)。CRT単独でワクチン接種したマウスはE7特異的T細胞免疫応答を誘導しなかったので、CRT単独で観察された治療的効果(肺転移性結節のより低い数)は、CRT媒介抗脈管形成効果によって引き起こされたものでありうる。
【０１２４】
CD4+T 細胞もしくは NK 細胞ではなく、 CD8+T 細胞が本発明の CRT/E7 キメラ DNA ワクチンによって誘導される抗腫瘍効果に必須である：
E7陽性腫瘍細胞の排除に重要なリンパ球サブセットを決定するために、本発明者らは、in vivo抗体枯渇実験を実施した。リンパ球サブセットの枯渇を、腫瘍注入の日およびその後毎週、脾細胞のフローサイトメトリー分析によって評価した。適切なサブセットの99％を上回る枯渇が達成され、他のリンパ球サブセットは正常レベルであった。全ての無傷のマウスおよびCD8+T細胞を枯渇した全てのマウスにおいて、腫瘍チャレンジ後の約14日以内に腫瘍が増殖した。それに反して、枯渇していない全てのマウスおよびCD4+T細胞もしくはNK1.1細胞を枯渇した全てのマウスが腫瘍チャレンジの60日後に腫瘍のない状態のままであった。これらの結果は、CD8+T細胞が本発明のCRT/E7キメラワクチンによって誘導される抗腫瘍免疫に必須であることを示すものである。
【０１２５】
CRT/E7 DNA でトランスフェクトした細胞における MHC クラス I 経路を介した E7 の提示の増強：
上記で論じたように、本発明のCRT/E7キメラ構築物でワクチン接種したマウスは、最も高い数のE7特異的CD8+T細胞前駆体を誘導した。この効果の原因となる機構を決定するために、標的細胞においてE7のMHCクラスI提示の増強が存在するか否かを決定した。この場合、標的細胞は、CRT/E7融合タンパク質コードキメラDNAでトランスフェクトしたDbとKbとを発現するヒト胎児腎293細胞であった。エフェクター細胞としてDb制限E7特異的CD8+T細胞を用いたCTLアッセイを用いて、CRT/E7構築物でトランスフェクトした標的細胞(293DbKb細胞)は、野生型E7のみでトランスフェクトした293DbKb細胞よりも効果的に死滅されうるか否かを決定した。293DbKb細胞は安定したトランスフェクション効率を有することが示されいるが、樹状細胞はin vivoで容易にはトランスフェクトされないので、293DbKb細胞を標的細胞として用いた。さらに、293DbKb細胞におけるE7発現レベルは、様々なE7含有DNA構築物でトランスフェクトした細胞間で類似している。CTLアッセイを、無傷の293DbKb細胞および空のプラスミド、CRT、E7もしくはキメラCRT/E7 DNAでトランスフェクトした293DbKb細胞を用いて、E7特異的T細胞系を用いる様々なエフェクター/標的(E/T)比率(1：1、3：1、9：1、27：1)で実施した。図６に示すように、CRT/E7 DNAでトランスフェクトした293DbKb細胞は、野生型E7 DNAワクチンのみでワクチン接種したマウスと比較して、9：1(20.5+1.0％ 対 10.43+0.9％、P<0.001)および27：1(47.1+5.5％ 対 15.1+3.0％、P<0.001)のE/T比率で有意により高い割合の特異的溶解を誘導した。これらの結果より、本発明のキメラCRT/E7構築物でトランスフェクトした細胞は、野生型E7 DNAでトランスフェクトした細胞よりも効率的な方法でMHCクラスI経路を介して「直接的プライミング」を経てE7抗原を提示することができたことが示された。
【０１２６】
キメラ CRT/E7 タンパク質をパルスした樹状細胞における MHC クラス I 経路を介した E7 の提示の増強：
in vivoでE7特異的CD8+T細胞免疫応答を増強する別の潜在的な機構は、様々なDNA構築物を発現する溶解した細胞の取込みを介して、抗原提示細胞によるMHCクラスI経路を介したE7の提示であり、「クロスプライミング」とも呼ばれる。クロスプライミング実験は、空のプラスミド、カルレティキュリン、E7もしくはCRT/E7 DNAでトランスフェクトした293DbKb細胞の細胞溶解物をパルスした樹状細胞におけるE7のMHCクラスI提示を特性付けるために実施された。E7特異的CD8+T細胞は、エフェクター細胞として機能した。既に述べたように、293DbKb細胞は安定したトランスフェクション効率、および様々なE7含有DNA構築物でトランスフェクトした細胞間で類似したE7発現を有することが示された。トランスフェクトした293DbKb細胞の溶解物を、凍結融解のサイクルから得た。骨髄由来DCに、トランスフェクトした293DbKb細胞の溶解物の連続希釈物(50Tg/ml、10Tg/ml、2Tg/mlおよび0.4Tg/ml)をパルスした。DCを標的細胞として用い、一方、E7特異的CD8+T細胞はエフェクター細胞として機能した。CTLアッセイを、E/T比率(9/1)を固定して実施した。図７に示すように、CRT/E7 DNAでトランスフェクトした293DbKb細胞の溶解物をパルスしたDCは、他のDNA構築物でトランスフェクトした293DbKb細胞の溶解物をパルスしたDCおよび無傷のDCと比較して有意により高い割合の特異的溶解を誘導した(P<0.001)。これらの結果は、CRT/E7融合タンパク質(トランスフェクトした293DbKb細胞の細胞溶解物中に存在)をパルスした樹状細胞は、野生型E7タンパク質コード構築物のみでトランスフェクトした293DbKb細胞の溶解物をパルスした樹状細胞よりも効率的な方法でMHCクラスI経路を介してE7抗原を提示できることを示した。このデータは、E7へのCRTの融合、すなわちカルレティキュリンとの融合タンパク質としてのE7ポリペプチドの発現が、直接的およびクロスプライミング効果の双方を経てE7特異的CD8+T細胞免疫応答を増強することを示すものである。
【０１２７】
CRT もしくはキメラ CRT/E7 DNA ワクチンを用いた処置はヌードマウスの肺において確立される腫瘍を根絶する：
上記で論じたように、野生型CRT DNAで処置したマウスは、野生型E7 DNAのみを受けたマウスまたはワクチン接種していないマウスよりも肺結節の低い平均数を示した(one-way ANOVA, P<0.001)。CRTでワクチン接種したマウスは、E7特異的T細胞免疫応答を誘導しなかったので(図２を参照されたい)、CRTを単独で発現する構築物を投与した場合に観察される治療的効果(転移性肺結節数の低減)は、抗腫瘍免疫応答(すなわち、抗原特異的CTLの増大)に関連しないと考えられる。いずれの免疫エフェクター細胞も存在しない肺におけるTC-1腫瘍転移の処置において、E7もしくはCRTポリペプチド単独と比較したCRT/E7融合ポリペプチドの役割を評価するために、まずヌード(BALB/c nu/nu)マウス(Tヘルパーおよびキラー(CTL)リンパ球の双方を欠き、体液性もしくは細胞性免疫応答のいずれも誘導することできない動物)を、上記で論じたように静脈内尾静脈注射を介してマウス1匹あたり1 x 104のTC-1腫瘍細胞でチャレンジした。TC-1腫瘍細胞を用いたチャレンジの2日後、マウスに遺伝子銃を介して16TgのCRTコードDNA、E7コードDNAもしくはCRT/E7コードDNAまたはインサートを含まない空のプラスミドを与えた。9日目と16日目に、これらのマウスを最初のワクチン接種と同じ処方計画で追加免疫した。マウスを21日目に屠殺した。各マウスの肺結節を評価および計数した。図８に示すように、CRTを単独で発現する構築物もしくはCRT/E7融合タンパク質を発現する構築物で処置したヌードマウスは、野生型E7 DNAのみ(36.0+2.8)、ベクターのみ(35.5+12.0)でワクチン接種したマウスまたは無傷の群(47.5+2.1)と比較して、肺結節のより低い平均数(CRTについては6.0+2.8、CRT/E7については2.5+0.7)を示した(one-way ANOVA、P<0.001)。これらのデータより、CRTもしくはCRT/E7 DNAワクチンによって誘導される抗腫瘍効果は、抗腫瘍免疫応答に非依存的であったことが示された。
【０１２８】
CRT もしくはキメラ CRT/E7 DNA ワクチンを用いた処置はヌードマウスの肺における腫瘍の微小血管密度を有意に低減した：
免疫エフェクター不在下でのCRTもしくはCRT/E7 DNAのこの抗腫瘍効果は抗脈管形成経路を介するものか否かを決定するために、様々なDNAワクチンで処置したヌードマウスの肺腫瘍における微小血管密度(MVD)を測定した。内皮細胞を、上記したように抗CD31抗体で染色した。全ての測定は、計数前には処置データを何も知らない1人の病理学者によって実施された。CRTもしくはCRT/E7 DNAワクチンのいずれかでワクチン接種したヌードマウス(機能的免疫系を欠く)は、野生型E7で処置したヌードマウスまたは対照ベクター群よりも肺腫瘍において非常に小さいMVDを示した(one-way ANOVA、P<0.001)。これらのデータより、CRT発現ワクチンもしくはCRT/E7融合タンパク質発現ワクチンで処置したマウスは腫瘍において抗脈管形成効果を導くことができたことが示された。
【０１２９】
実施例２
自己複製 RNA ウイルスは抗原特異的 CTL 応答の増強を誘導する
一実施形態において、本発明は本発明のキメラタンパク質(小胞体(ER)シャペロンポリペプチドを含む第1ポリペプチドドメインと少なくとも1種の抗原性ペプチドを含む第2ポリペプチドドメインとを含むタンパク質)を発現することができる自己複製RNAレプリコンを提供する。以下の実施例は、本発明の方法を用いて、これらの構築物がin vivoで抗原特異的細胞傷害性Tリンパ球(CTL)応答を増強するのに効果的であることを示す研究を説明するものである。モデル系として、HPV-16 E7とマイコバクテリウム・ツベルクローシスHSP70とを含む融合タンパク質を、シンドビスウイルス自己複製RNAベクター、SINrep5においてin vivoで発現させた。このベクターによって誘導される抗原特異的免疫の効力を決定した。またこれらの結果は、in vivoでシンドビスウイルス自己複製RNAベクターにおいて発現させたERシャペロンポリペプチドと抗原性ペプチドとを含む融合タンパク質がin vivoで抗原特異的CTL応答を増強するのに効果的であることを示す。
【０１３０】
これらの実験により、E7/HSP70融合遺伝子を含むRNAレプリコンワクチンは野生型E7遺伝子を含むワクチンよりもワクチン接種したマウスにおいて有意に高いE7特異的T細胞媒介免疫応答を誘導したことが示された。さらに、in vitro研究により、E7/HSP70 RNAレプリコンでトランスフェクトしたアポトーシス細胞に由来するE7抗原は骨髄由来樹状細胞によって取り込まれ、野生型E7 RNAレプリコンでトランスフェクトしたアポトーシス細胞よりも効率的にMHCクラスI経路を介して提示されうることが示された。より重要なことには、E7へのHSP70の融合は、あまり効果的でないワクチンをE7発現腫瘍に対する有意な効力を有するワクチンへと変えたことであった。この抗腫瘍効果は、NK細胞およびCD8+T細胞に依存的であった。これらの結果より、抗原遺伝子へのHSP70の融合が自己複製RNAワクチンの効力を大いに増強したことが示された。これらの結果より、HSP70にE7を連結するシンドビスRNAワクチンはE7特異的CD8+T細胞およびNK細胞の拡大と活性化を劇的に増大し、CD4力を完全に回避し、E7発現腫瘍に対する強力な抗腫瘍免疫を生じたことが示された。
【０１３１】
さらに抗腫瘍効果を促進するシンドビスRNAワクチンの機構を調査した。シンドビスE7/HSP70 RNAワクチンは宿主細胞のアポトーシス死を誘導し、これらの細胞を貪食するように樹状細胞を促進することができ、E7特異的CD8+T細胞の拡大と活性化を劇的に増大したことを見出した。このCD8応答の増強により、E7発現腫瘍細胞系に対する有力な抗腫瘍免疫が生じた。
【０１３２】
HPV-16 E7をワクチン開発におけるモデル抗原として選択した。なぜならば、HPV、特にHPV-16は、上記で論じたようにほとんどの子宮頸癌と関連するからである。
【０１３３】
プラスミド DNA 構築物と調製：
ベクターpcDNA3-HSP70、pcDNA3-E7およびpcDNA3-E7/HSP70を、Chen (2000)前掲に記載のように作製した。シンドビスウイルスRNAレプリコンベクター、SINrep5はBredenbeek,前掲に記載されている。ベクターSINrep5-HSP70、SINrep5-E7およびSINrep5-E7/HSP70を、pcDNA3-HSP70、pcDNA3-E7およびpcDNA3-E7/HSP70をそれぞれXba IおよびPme I制限酵素で切断することでマイコバクテリウム・ツベルクローシスHSP70、HPV-16 E7およびキメラE7/HSP70をコードするDNA断片を単離することによって作製した。消化産物を、ゲルを用いて単離した。さらにこれらの単離されたDNA断片をSINrep5ベクターの対応するXabIおよびPml I部位にクローニングして、SINrep5-HSP70、SINrep5-E7およびSINrep5-E7/HSP70構築物を誘導した。これらの構築物の精度を、DNA配列決定分析によって確認した。
【０１３４】
in vitro RNA 調製：
SINrep5-HSP70、SINrep5-E7、SINrep5-E7/HSP70およびSINrep5に由来するRNA転写産物の生成を、Mandl (1998) Nature Med 4：1438-1440に記載のプロトコールを用いて実施した。SpeIは、SINrep5-HSP70、SINrep5-E7、SINrep5-E7/HSP70およびSINrep5に由来するRNAレプリコン合成のためのDNA鋳型を線状化するために用いられた。RNAワクチンをin vitroで転写し、販売業者のマニュアルに従って、標準的in vitro転写キット(Life Technologies, Rockville, MD)からのSP6 RNAポリメラーゼおよびキャッピング類似体を用いてキャッピングした。合成後、DNAをDNアーゼIを用いた消化によって除去した。合成されたRNAを定量化し、変性ホルムアルデヒドアガロースゲルを用いて分析した(Mandl (1998)前掲)。精製RNAをアリコートに分け、動物におけるワクチン接種とBHK21細胞系のトランスフェクションに用いた。転写産物のタンパク質発現を、エレクトロポレーションを用いたBHK21細胞へのRNAのトランスフェクションによって評価した。
【０１３５】
細胞系：
ベビーハムスター腎(BHK21)細胞をATCC(Rockville, MD)から入手し、5％のFBS、10％のトリプトースホスフェートブロス(tryptose phosphate broth)、2mM グルタミンおよび抗生物質を補足したGlasgow MEMで増殖させた。細胞を加湿した5％のCO2空気下中37℃で維持し、2日ごとに継代した。TC-1細胞の生産と維持は、Lin (1996) Cancer Res. 56：21-26に記載のように行われた。腫瘍チャレンジの日に、TC-1細胞をトリプシン処理によって回収し、1X Hanks緩衝塩溶液(HBSS)で2回洗浄し、最後に1X HBSS中に再懸濁して、指定された注射用濃度にした。
【０１３６】
SINrep5 RNA ワクチンの E7 タンパク質発現に対する ELISA ：
SINrep5-E7およびSINrep5-E7/HSP70 RNAからのE7タンパク質の発現を、間接的ELISA方法によって測定した。E7タンパク質量を、SINrep5-E7もしくはSINrep5-E7/HSP70でトランスフェクトしたBHK21細胞由来の細胞溶解物を用いて測定した。簡単に言えば、1000万個のBHK21細胞を、Liljestrom (1991) J. Virol. 65：4107-4113に記載のようにエレクトロポレーションを介してそれぞれ4μgのSINrep5、SINrep5-E7、SINrep5-HSP70もしくはSINrep5-E7/HSP70のRNA転写産物でトランスフェクトした。トランスフェクトしたBHK21細胞を、エレクトロポレーションの16〜20時間後に回収した。96マイクロウエルプレートを、様々なSINrep5 RNAでトランスフェクトしたBHK21細胞の溶解物で、最終容量100μlにおいてコーティングし、4℃で一晩インキュベートした。細菌に由来するHPV-16 E7タンパク質を、陽性対照として用いた。次いで、ウエルを20％のウシ胎児血清を含有するPBSでブロッキングした。希釈した抗E7Ab(Zymed, San Francisco, CA)をELISAウエルに添加し、37℃で2時間インキュベートした。0.05％のTween-20を含有するPBSで洗浄した後、プレートをペルオキシダーゼ-コンジュゲートウサギ抗マウスIgG抗体(Zymed, San Francisco, CA)の1/2000希釈物とともに、室温(RT)で1時間インキュベートした。プレートを洗浄し、1-Step（商標） Turbo TMB-ELISA(Pierce, Rockford, IL)で顕色し、1M H2SO4で停止させた。ELISAプレートを、標準的ELISAリーダーを用いて450nmで読み取った。次いで、細胞溶解物のE7タンパク質量を標準化したE7タンパク質と比較することによって計算し、決定した。
【０１３７】
マウス：
6〜8週齢のメスC57BL/6マウスをNational Cancer Institute(Frederick, MD)から購入し、Johns Hopkins Hospital(Baltimore, MD)の腫瘍学動物施設で飼育した。全ての動物手順は、認可されたプロトコールおよび実験室動物の適切な使用と注意についての推奨に従って実施された。
【０１３８】
RNA ワクチン接種：
全てのSINrep5 RNAワクチンを、上記のようにin vitro転写を用いて生成した。RNA濃度を、260nmで測定する光学密度によって決定した。さらにRNA転写産物の完全性と量を変性ゲル電気泳動を用いてチェックした。マウスを、SINrep5-E7/HSP70(これは、0.1、1および10μgの量で投与された)を除いて様々なSINrep5 RNA 10μgで右後脚の筋内にワクチン接種した。
【０１３９】
E7 抗体に対する ELISA ：
血清中の抗HPV 16 E7抗体を、Wu (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92：11671-1165に記載のように直接的ELISAによって測定した。96マイクロウエルプレートを、5μg/mlの細菌に由来するHPV-16 E7タンパク質100μlでコーティングし、4℃で一晩インキュベートした。次いで、ウエルを20％のウシ胎児血清を含有するPBSでブロッキングした。血清を、免疫感作後14日目にマウスから調製し、PBS中に連続希釈し、ELISAウエルに添加し、37℃で2時間インキュベートした。0.05％のTween-20を含有するPBSで洗浄した後、プレートをペルオキシダーゼ-コンジュゲートウサギ抗マウスIgG抗体(Zymed, San Francisco, CA)の1/2000希釈物とともにRTで1時間インキュベートした。プレートを洗浄し、1-Step（商標） Turbo TMB-ELISA(Pierce, Rockford, IL)で顕色し、1M H2SO4で停止させた。ELISAプレートを、標準的ELISAリーダーを用いて450nmで読み取った。
【０１４０】
INF- γに対する酵素免疫測定法 (ELISA) ：
脾細胞をワクチン接種の2週間後に回収し、MHCクラスIエピトープを含むE7ペプチド(aa49-57)(Feltkamp (1993) Eur. J. Immunol. 23：2242-2249)とともに、またはMHCクラスIIペプチドを含むE7ペプチド(aa30-67)(Tindle,前掲)とともに、24ウエル組織培養プレートにおいて、10％(vol/vol)のウシ胎児血清、50ユニット/mlのペニシリンおよびストレプトマイシン、2mM L-グルタミン、1mM ピルビン酸ナトリウム、2mM非必須アミノ酸を補足したRPMI 1640 2mlの全容量中で6日間培養した。上清を回収し、製造業者のプロトコールに従ってELISAキット(Endogen, Woburn, MA)を用いてIFN-γの存在についてアッセイした。
【０１４１】
細胞傷害性 T リンパ球 (CTL) アッセイ：
CTLアッセイを、Corr (1999) J. Immunol. 163：4721-4727に記載のように96ウエル丸底プレート中で実施した。細胞溶解を、乳酸脱水素酵素(LDH)の定量的測定によって測定した(Corr (1999) 前掲)。脾細胞をRNAワクチン接種の2週間後に回収し、E7ペプチド(aa49-57)とともに、24ウエル組織培養プレートにおいて、10％(vol/vol)のウシ胎児血清、50ユニット/mlのペニシリン/ストレプトマイシン、2mM L-グルタミン、1mM ピルビン酸ナトリウム、2mM非必須アミノ酸を補足したRPMI 1640 2mlの全容量中で6日間培養し、エフェクター細胞とした。TC-1腫瘍細胞を標的細胞として用いた。TC-1細胞は、様々なエフェクター/標的(E/T)比率で脾細胞と混合した。37℃で5時間のインキュベーション後、培養培地50μlを回収し、CytoTox（商標）アッセイキット(Promega, Madison, WI)の製造業者のプロトコールに従って培養培地中のLDH量を評価した。溶解の割合を以下の等式から計算した：100 X (A-B)/(C-D)(式中、Aは実験のエフェクターシグナル値の読み取り値であり、Bはエフェクターの自発的なバックグラウンドシグナル値であり、Cは標的細胞からの最大シグナル値であり、Dは標的の自発的なバックグラウンドシグナル値である)。
【０１４２】
細胞質内サイトカイン染色およびフローサイトメトリー分析：
無傷のマウス群またはワクチン接種したマウス群由来の脾細胞を、E7特異的CD4+Tヘルパー細胞前駆体を検出するためにMHCクラスIIペプチドを含むE7ペプチド(aa30-67)(Tindle (1999) 前掲)とともにインキュベートした。E7ペプチドは、10μg/mlの濃度で20時間添加された。Golgistop（商標）(PharMingen, San Diego, CA)を培養物から細胞を回収する6時間前に添加した。次いで細胞をFACScan（商標）バッファー中で1回洗浄して、フィコエリトリン(PE)-コンジュゲートモノクローナルラット抗マウスCD4抗体(PharMingen, San Diego, CA)で染色した。細胞を、製造業者の使用説明書(PharMingen)に従ってCytofix/Cytoperm（商標）キットを用いて細胞内サイトカイン染色に供した。FITC-コンジュゲート抗IFN-γ抗体および免疫グロブリンアイソタイプ対照抗体(ラットIgG1)は、全てPharMingenから購入した。分析は、CELLQuest（商標）ソフトウエアを用いるBecton Dickinson FACScan（商標）(Becton Dickinson Immunocytometry System, Mountain View, CA)において行われた。
【０１４３】
in vivo 腫瘍防御実験：
腫瘍防御実験において、マウス(1群あたり5匹)に異なる用量のSINrep5-HSP70、SINrep5-E7、SINrep5-E7/HSP70および空のSINrep5 RNAワクチンを筋内に(IM)免疫感作した。免疫感作の14日後に、マウスに、1 x 104 細胞/マウスのTC-1腫瘍細胞を尾静脈に静脈内(IV)注射した。3週間後、マウスを安楽死させた。各マウスにおける肺重量および肺結節数は、分からない様式にある実験者によって評価および計数された。
【０１４４】
in vivo 抗体枯渇実験：
in vivo抗体枯渇の手順は、例えばLin (1996) 前掲；Wu (1995) J. Exp. Med. 182：1415-1421に既に記載されている。簡単に言えば、マウスを自己複製SINrep5-E7/HSP70 RNA 1μgで筋内にワクチン接種し、尾静脈注射を介して1 x 104細胞/マウスのTC-1腫瘍細胞でチャレンジした。腫瘍チャレンジの1週間前に枯渇を開始させた。MAb GK1.5(Dialynas (1983) J. Immunol. 131：2445)をCD4枯渇に使用し、MAb 2.43(Sarmiento (1980) J. Immunol. 125：2665)をCD8枯渇に使用し、そしてMAb PK136(Koo (1986) J. Immunol. 137：3742)をNK1.1枯渇に使用した。フローサイトメトリー分析により、適切なリンパ球サブセットの＞95％が枯渇され、他のサブセットは正常レベルであったことが明らかとなった。枯渇を腫瘍チャレンジ後21日目に終了した。
【０１４５】
細胞表面マーカー染色およびフローサイトメトリー分析：
無傷のマウス群またはワクチン接種したマウス群から取り出した脾細胞を直接細胞表面マーカー染色で、Ji (1999) Human Gene Therapy 10：2727-2740に記載のように処理した。次いで細胞をFACSCAN（商標）バッファー中で1回洗浄して、PE-コンジュゲートモノクローナルラット抗マウスNK1.1抗体およびFITC-コンジュゲートモノクローナルラット抗マウスCD3抗体(Pharmingen, San Diego, CA)で染色した。NK細胞集団は、抗NK1.1抗体で染色されるが、抗CD3抗体では染色されなかった。様々な自己複製RNAワクチンで免疫感作したマウス中のNK細胞の割合をフローサイトメトリーを用いて分析した。
【０１４６】
骨髄からの樹状細胞 (DC) の生成と培養：
DCを、Lu (2000) J. Exp. Med. 191：541-550に記載のようにGM-CSFの存在下で骨髄細胞を培養することによって生成した。簡単に言えば、骨髄をマウスの脛骨から回収した。赤血球を溶解し、残りの細胞をナイロンメッシュを通過させることで小片の骨およびデブリを除去した。細胞を回収し、そして1 X 106細胞/mlを、5％のFCS、2mM β-メルカプトエタノール、1％の非必須アミノ酸、100U/mlペニシリンおよび100μg/mlストレプトマイシン(Life Technologies, Rockville, MD)および100U/ml GM-CSF(PharMingen, San Diego, CA)を補足したRMPI 1640を含む24ウエルプレートに配置した。培地の3/2を2日ごとに入れ替え、非接着細胞を7日目に回収した。回収した細胞を、DCマーカーについてのフローサイトメトリー分析(FACS)によって特性付けた。
【０１４７】
E7 特異的 CD8 + T 細胞系の生成：
E7特異的CD8+細胞系の生成を、Sig/E7/LAMP-1ワクシニアの腹腔内(IP)注射によってメスC57BL/6(H-2b)マウスを免疫感作することによって行った。脾細胞を8日目に回収した。最初のin vitro刺激については、脾細胞を20U/ml濃度のIL-2および1μM E7ペプチド(アミノ酸49-57)で6日間パルスした。E7特異的CTL細胞系の増殖を、E7特異的CTLを含む1 x 106脾細胞と3 x 106の放射線照射した脾細胞とを混合し(2ml/ウエル)、それらに20U/ml濃度のIL-2および1μM E7ペプチド(アミノ酸49-57)をパルスすることによって、24ウエルプレート中で実施した。この方法を6日ごとに繰り返した。E7 CTL系の特異性を、CTLアッセイによって特性付けた。フローサイトメトリーを実施して、CD8マーカーの発現を示した。
【０１４８】
in vitro 細胞死分析：
1000万個のBHK21細胞を、初期に述べたように4μgのSINrep5、SINrep5-E7、SINrep5-HSP70もしくはSINrep5-E7/HSP70 RNA転写産物でトランスフェクトした。無傷のBHK21細胞またはSINrep5 RNAなしでエレクトロポレーションを行ったBHK21細胞を対照として用いた。BHK21細胞を回収し、24時間ごとに72時間まで評価した。アポトーシスおよびネクローシスBHK21細胞の割合を、製造業者のプロトコールに従ってアネキシンVアポトーシス検出キット(PharMingen, San Diego, CA)を用いて分析し、次いでフローサイトメトリー分析を行った。
【０１４９】
アポトーシス細胞をパルスした DC を標的細胞として用いた CTL アッセイ：
アポトーシス細胞をパルスしたDCを標的細胞として用いたCTLアッセイを、Albert (1998) Nature 392：86-89；Albert (1998) J. Exp. Med. 188：1359-1368に記載のプロトコールに類似し、改変を加えたプロトコールを用いて実施した。簡単に言えば、まず1000万個のBHK21細胞を、エレクトロポレーションを介して様々な自己複製SINrep5 RNA 4μgでトランスフェクトした。BHK21細胞をエレクトロポレーションの16〜20時間後に回収した。SINrep5-E7もしくはSINrep5-E7/HSP70 RNA転写産物でトランスフェクトしたBHK21細胞中のE7タンパク質発現レベルは、ELISAで測定した場合には類似していた。次いで3 x 105のトランスフェクトしたBHK21細胞を、1 x 105の骨髄由来DCとともに37℃で48時間同時インキュベートした。次いでこれらの調製したDCを標的細胞として用い、Db制限E7特異的CD8+T細胞をエフェクター細胞として用いた。CTLアッセイを、様々な比率(1：1、3：1、9：1および27：1)で一緒に混合したエフェクター細胞と標的細胞(1ウエルあたり1 x 104)を用いて最終容量200μl中で実施した。37℃で5時間のインキュベーション後、培養培地50μlを回収し、上記のように培養培地中のLDH量を評価した。トランスフェクトしていないBHK21細胞、トランスフェクトしたBHK21細胞単独、未処理のDC単独、およびCD8+T細胞系単独を陰性対照として含めた。
【０１５０】
自己複製 RNA 構築物の構築と特性付け：
プラスミドDNA構築物の生成と続く自己複製SINrep5 RNA構築物の調製は、上記のように実施された。SINrep5ベクターは、シンドビスウイルスRNAレプリカーゼをコードする遺伝子およびSP6プロモーターを含む(Bredenbeek (1993) 前掲)。SINrep5、SINrep5-HSP70、SINrep5-E7、SINrep5-E7/HSP70のDNA構築物の概略図を図９Aに示した。さらに、SP6 RNAポリメラーゼを用いてこれらのDNA構築物から誘導されたRNA転写産物の概略図を図９Bに示した。メチル化M7G「キャップ」はmRNAの5'末端に位置し、自己複製において機能する配列(レプリカーゼ)、目的の遺伝子(すなわち、MHCクラスIペプチドエピトープ、E7、HSP70、E7/HSP70など)およびポリアデニル化テイル(tail)(AAAA)が続く。ELISAを実施して、様々な自己複製RNA構築物でトランスフェクトしたBHK21細胞によるE7タンパク質の発現を示した。SINrep5-E7およびSINrep5-E7/HSP70は、類似した量のE7タンパク質を発現させた。
【０１５１】
自己複製 SINrep5-E7/HSP70 RNA を用いたワクチン接種は E7 特異的細胞傷害性免疫応答を増強する：
CD8+Tリンパ球は、抗腫瘍免疫の誘導において最も重要なエフェクターの1つである。SINrep5-E7/HSP70 RNAワクチンによって誘導されるE7特異的CD8+T細胞応答の量を決定するために、CTLアッセイを用いた。マウスを、筋内注射を介して様々なSINrep5自己複製RNAワクチンで免疫感作した。脾細胞および血清サンプルを14日後に回収した。細胞傷害性アッセイを実施するために、様々な自己複製SINrep5 RNAワクチンにより誘導された脾細胞を、MHCクラスIエピトープを含むE7ペプチド(aa49-57)とともに6日間培養し、エフェクター細胞とした。TC-1腫瘍細胞を標的細胞とした。様々なE/T(エフェクター/標的比率)でTC-1細胞を脾細胞と混合した。細胞溶解をLDHの定量的測定によって決定した。本明細書で示すCTLアッセイは、実施された2回のうちの1回の代表的実験からのものである。
【０１５２】
自己複製RNA E7/HSP70ワクチンは、他のRNAワクチンと比較して、有意により高い割合の特異的溶解を誘導した(*：P<0.001、one-way ANOVA)。自己複製SINrep5-E7/HSP70は、他のSINrep5 RNAワクチンでワクチン接種したマウスと比較して、有意により高い割合の特異的溶解を誘導した(P<0.001、one-way ANOVA)。特異的溶解を誘導するSINrep5-E7/HSP70 RNAの能力は、自己複製SINrep5-E7 RNAの約4倍であることが見出された(32.7％ 対 8.8％、E/T比率45/1、P<0.001)。
【０１５３】
自己複製 SINrep5-E7/HSP70 RNA を用いたワクチン接種は E7 特異的 CD8 + T 細胞を増強することで高いレベルの INF- γを分泌させる：
自己複製SINrep5-E7/HSP70 RNAによって誘導されるE7特異的CD8+T細胞の免疫学的応答の程度を決定するために、ELISAを用いて、脾細胞の培養上清中のINF-γ濃度を検出した。マウスを、筋内注射を介して様々な自己複製RNAワクチンで免疫感作した。脾細胞および血清サンプルを14日後に回収した。様々な自己複製RNAワクチンにより誘導された脾細胞を、in vitroでMHCクラスIエピトープを含むE7ペプチド(aa49-57)とともに(またはいずれのペプチドも含まずに)6日間培養した。また陰性対照として、ペプチドを含まずにELISAを実施した。培養培地中の上清を回収し、ELISAを用いてINF-γ濃度を検出した。
【０１５４】
E7ペプチド(aa49-57)で刺激した自己複製E7/HSP70 RNA群に由来する脾細胞は、他のRNAワクチンと比較して、最も高いINF-γ濃度を分泌した(P<0.001、one-way ANOVA)。またこれらの結果により、E7へのHSP70の融合はINF-γ分泌E7特異的CD8+T細胞活性を有意に増強することが示された。従って、CD8+T細胞をE7のMHCクラスIエピトープによって誘導することができた。注釈：E7ペプチド(aa49-57)で刺激した自己複製E7/HSP70 RNA群に由来する脾細胞は、他のRNAワクチンと比較して、最も高いINF-γ濃度を分泌した(*：P<0.001、one-way ANOVA)。
【０１５５】
自己複製 SINrep5-E7/HSP70 RNA を用いたワクチン接種は有意な E7 特異的 CD4 + T 細胞媒介免疫応答を誘導しない：
これらの各RNAワクチンによるE7特異的CD4+T前駆体細胞の生成およびサイトカインプロフィールを調べるために、本発明者らは免疫感作したマウスから得た脾細胞におけるCD4表面マーカーおよび細胞内IFN-γに対する二重染色を実施し、次いでフローサイトメトリー分析を行った。脾細胞を、in vitroでE7ペプチド(aa30-67)とともに一晩培養し、CD4および細胞内IFN-γの双方について染色した。E7ペプチド(aa30-67)は、HPV-16のE7オープンリーディングフレームタンパク質中の主要なTヘルパーエピトープを含む(Tindle (1991)前掲)。IFN-γ分泌CD4+T細胞の割合を、フローサイトメトリーを用いて分析した。
【０１５６】
SINrep5-E7/HSP70 RNAでワクチン接種したマウスは、SINrep5-E7 RNA (15/3 x 105脾細胞 対 12/3 x 105脾細胞、p>0.05)または他のRNA群でワクチン接種したマウスと比較して、類似のCD4+IFN-γ+二重陽性細胞数を誘導した。フローサイトメトリー染色を用いて観察されたE7特異的CD4+IFN-γ+細胞数に、無傷のマウスまたは空のプラスミド、E7、HSP70もしくはE7/HSP70 RNAでワクチン接種したマウスの間に有意な差異はなかった。Sig/E7/LAMP-1 DNAでワクチン接種したマウス由来の脾細胞(Ji (1999)前掲)を、この研究の細胞内IFN-γ染色に対する陽性対照として用いた。
【０１５７】
ワクチン接種したマウスの血清中の抗HPV 16 E7抗体量を、ワクチン接種の2週間後に様々な希釈物(1：100、1：500、1：1000)で直接的酵素免疫測定法(ELISA)を用いて測定した。SINrep5-E7/HSP70は、他のRNAワクチン構築物によって誘導された力価と比較して、ワクチン接種したマウスの血清におけるより高い力価のE7特異的抗体を誘導しなかった。
【０１５８】
自己複製 SINrep5-E7/HSP70 RNA を用いたワクチン接種は TC-1 腫瘍の増殖に対してマウスを防御する：
自己複製SINrep5-E7/HSP70 RNAを用いたワクチン接種はE7発現腫瘍に対してマウスを防御するか否かを決定するために、in vivo腫瘍防御実験を、右後脚に筋内投与される異なる用量の自己複製SINrep5-E7/HSP70 RNAを用いて実施した。マウスを、10μgの自己複製SINrep5、 SINrep5-HSP70およびSINrep5-E7 RNAで同様にワクチン接種した。また0.1μg、1μgおよび10μgを含む異なる用量の自己複製SINrep5-E7/HSP70 RNAをマウスに注射した。ワクチン接種の1週間後に、マウスを、静脈内尾静脈注射を介して2 x 104 細胞/マウスの用量のTC-1腫瘍細胞でチャレンジした。マウスを1週間に2回モニターし、腫瘍チャレンジ後21日目に屠殺した。肺結節を、腫瘍チャレンジの21日後に評価した。肺をマウスから、空のSINrep5(10μg)、 SINrep5-HSP70(10μg)、SINrep5-E7(10μg)およびSINrep5-E7/HSP70 RNA(0.1μg、1μgもしくは10μg)を用いたワクチン接種の35日後に切断した。肺病巣の平均数を、HPV-16 E7発現腫瘍増殖を制御する上での様々な自己複製RNAワクチンの有効性の測定値として用いた。
【０１５９】
自己複製E7/HSP70 RNAワクチン(0.1μg、1μgおよび10μg)でワクチン接種したマウスの平均肺結節は、他のRNAワクチンでワクチン接種したマウスと比較して非常により小さかった(P<0.001、one-way ANOVA)。これらの結果より、自己複製RNA SINrep5-E7/HSP70ワクチンは0.1μgの低い用量でさえも静脈内腫瘍チャレンジからマウスを防御し、一方、インサートなしのSINrep5 10μg、SINrep5-E7 10μgまたはSINrep5-HSP70 10μg由来のRNAでワクチン接種したマウスはTC-1腫瘍チャレンジから多数の肺結節を生じたことが示された。
【０１６０】
CD8 + T 細胞および NK 細胞が SINrep5-E7/HSP70 RNA ワクチンを用いたワクチン接種によって誘導される抗腫瘍効果に重要である：
E7発現腫瘍細胞に対する防御に重要なリンパ球タイプを決定するために、(CD8+T細胞およびNK細胞の)in vivo抗体枯渇実験を実施した(自己複製RNAワクチンで免疫感作したマウスの脾細胞に由来するNK細胞の割合は免疫感作なしのマウスよりも高く、様々な自己複製RNAワクチン間でNK細胞の割合に有意な差異はなかった)。抗体枯渇を腫瘍チャレンジの1週間前に開始し、腫瘍チャレンジ後21日目に終了した。
【０１６１】
CD8+T細胞およびNK1.1細胞を枯渇したマウスに由来する平均肺結節は、枯渇していない群のマウスよりも有意に高かった。さらに、NK1.1細胞の枯渇により、CD8+枯渇マウスよりも腫瘍肺結節の平均数が高かった。
【０１６２】
比較すると、CD4+T細胞を枯渇したマウスに由来する平均肺結節は、枯渇していないマウスから得られた結果と似ており、このことによりCD4+T細胞がこの効果の発生に重要ではなかったことが示された。これらの結果は、CD8+T細胞がSINrep5-E7/HSP70 RNAワクチンによって誘導される抗原特異的抗腫瘍免疫に必須であり、E7/HSP70 RNAワクチンに限定されないが、NK細胞も同様に重要な役割を果たすことを示唆する。
【０１６３】
またNK細胞効果はE7/HSP70ワクチンに限定されたものか否か、またはそれは用いるベクターの結果であるかを調査した。CD3(-),NK1.1(+)細胞のフローサイトメトリー分析により、それらの存在が無傷のマウスに対して全ての構築物(E7/HSP70、E7、HSP70および対照プラスミド)において著しく増大したことが明らかになり、このことにより、NK細胞はE7/HSP70ワクチンに限定されない抗腫瘍効果の重要なエフェクターであったことが示された。
【０１６４】
自己複製 RNA ワクチンはアポトーシスを誘導する：
様々なプラスミドSINrep5 RNAワクチンからin vitroで転写されたRNAを、エレクトロポレーションを介してBHK21細胞にトランスフェクトした。RNAなしでエレクトロポレーションを行ったBHK21細胞および未処理BHK21細胞を対照として用いた。アポトーシスおよびネクローシスBHK21細胞の割合を、アネキシンV-FITCおよびヨウ化プロピジウム(PI)によって染色し、次いでフローサイトメトリー分析を行った。
【０１６５】
SINrep5 RNAワクチンでトランスフェクトした場合には、24〜72時間後にはアポトーシスBHK21細胞の割合は統計的下降を示した(SINrep5-E7/HSP70を例にとると、24時間で70.3±3.6％、48時間で49.3±4.2％、72時間で18.0±3.1％、P<0.001、one-way ANOVA)。SINrep5 RNAワクチンでトランスフェクトしたBHK21細胞は、他の2つの対照群と比較すると24時間、48時間または72時間後にはより高い割合を誘導した。様々なSINrep5 RNAワクチンのアポトーシス割合には統計的差異を見出すことができなかった。
【０１６６】
SINrep5-E7/HSP70 RNA でトランスフェクトした細胞をパルスした樹状細胞における MHC クラス I 経路を介した E7 の提示の増強：
in vivoでE7特異的CD8+T細胞免疫応答を増強する潜在的な機構は、様々なE7構築物を発現する細胞からのアポトーシス小体の取込みによるMHCクラスI経路を介したE7の提示であり、「クロスプライミング」とも呼ばれる。クロスプライミング実験は、様々な自己複製RNAでトランスフェクトしたBHK21細胞からのアポトーシス小体をパルスした樹状細胞におけるE7のMHCクラスI提示を特性付けるために実施された。既に述べたように、BHK21細胞は安定した高いトランスフェクション効率、および異なるE7含有自己複製RNAでトランスフェクトした細胞間で類似したE7発現を有することが示されている。トランスフェクトしたBHK21細胞を、骨髄由来DCとともに同時インキュベートした。DCを標的細胞として用い、一方、E7特異的CD8+T細胞はエフェクター細胞として機能した。様々なE/T比率でのCTLアッセイを実施した。
【０１６７】
SINrep5-E7/HSP70 RNAでトランスフェクトしたBHK21細胞とともに同時インキュベートしたDC標的細胞は、SINrep5-E7 RNAでトランスフェクトしたBHK21細胞とともに同時インキュベートしたDCと比較して有意により高い割合の特異的溶解を誘導した(P<0.001)。これらの結果は、E7/HSP70融合タンパク質を含有するアポトーシス小体をパルスした樹状細胞は、野生型E7タンパク質を含有するアポトーシス小体をパルスした樹状細胞よりも効率的にMHCクラスI経路を介してE7抗原を提示したことを示唆した。従って、E7へのHSP70の融合はE7特異的CD8+T細胞免疫応答を増強し；そして、本発明はいずれの特定の機構によっても限定されないが、この増強は「クロスプライミング」を介するものであると考えられた。
【０１６８】
多数の本発明の実施形態が記載されている。それにもかかわらず、様々な改変が本発明の精神と範囲から逸脱することなく行われうることが理解されるだろう。従って、他の実施形態は以下の特許請求の範囲内にある。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、実施例１で論じるように、カルレティキュリン(CRT)、HPVポリペプチドE7および本発明の融合タンパク質カルレティキュリン/E7(CRT/E7)をコードする組換えDNA構築物の概略図を示す。
【図２】 図２Aは、実施例１で論じるように、陰性対照、ならびにCRTを単独で発現するDNA、E7を単独で発現するDNAおよび本発明のCRT/E7融合タンパク質を発現するDNAでワクチン接種したマウス由来の脾細胞を、CD8およびINF-γに対する抗体で染色したFACS(フローサイトメトリー)分析を要約する二次元ヒストグラムを示す。図２Bは、ヒストグラムデータの要約図を示す。
【図３】 図３は、実施例１で論じるように、構築物単独、およびCRTを単独でコードする構築物、E7を単独でコードする構築物、CRT/E7融合タンパク質をコードする構築物、ならびにCRTとE7を個別に発現する2種の構築物の混合物を用いた最後のワクチン接種の2週間後に直接的ELISAによって測定した、ワクチン接種したマウスの血清中の抗HPV16 E7抗体量を示すデータの要約図を示す。
【図４】 図４は、実施例１で論じるように、マウスを様々なDNAワクチン構築物でワクチン接種し、その後にE7発現腫瘍でチャレンジした、in vivo腫瘍防御実験データの要約図を示す。
【図５】 図５は、実施例１で論じるように、まずマウスに腫瘍細胞を注射し、次いで様々な裸のDNA構築物でワクチン接種し(ワクチン接種1日目の後の1週間の追加免疫を含む);その後に肺結節の平均数を評価した実験からのデータの要約図を示す。データは、腫瘍細胞チャレンジ後の日数との相関関係として肺転移性腫瘍結節の平均数+SEMとして表している。
【図６】 図６は、実施例１で論じるように、様々な裸のDNA構築物でトランスフェクトした293DbKb標的細胞に対するエフェクター細胞としてDb制限E7特異的CD8+T細胞を用いたCTLアッセイのデータの要約図を示す。
【図７】 図７は、様々な裸のDNA構築物でトランスフェクトした293DbKb細胞の細胞溶解物をパルスした樹状細胞におけるE7のMHCクラスI提示を特性付けるためのクロスプライミング実験からのデータの要約図を示す。E7特異的CD8+T細胞は、エフェクター細胞として機能した；骨髄由来のDCに、トランスフェクトした293DbKb細胞の溶解物の連続希釈物をパルスした(50 mg/ml、10 mg/ml、2 mg/mlおよび0.4 mg/ml)；実施例１で論じるように、E7特異的CD8+T細胞がエフェクター細胞として機能する一方、DCは標的細胞として使用された。
【図８】 図８は、いずれの免疫エフェクター細胞も含まない肺への(すなわち、ヌードマウスへの）TC-1腫瘍転移処置における、E7もしくはCRTポリペプチド単独と比較したCRT/E7融合ポリペプチドの役割を評価するために設計した実験からのデータの要約図を示す。まずヌードマウスを腫瘍細胞でチャレンジし、2日後にTC-1腫瘍細胞でチャレンジした；その後に、マウスに様々な裸のDNA構築物をワクチン接種した。9日目および16日目に、これらのマウスを最初のワクチン接種と同じ処方計画で追加免疫した。実施例１で論じるように、マウスを21日目に屠殺し、各マウスの肺結節を評価および計数した。
【図９】 図９Aは、SINrep5、SINrep5-HSP70、SINrep5-E7、SINrep5-E7/HSP70のDNA構築物の概略図を示す。図９Bは、実施例２に詳細に説明するように、SP6 RNAポリメラーゼを用いてこれらのDNA構築物から誘導されたRNA転写産物の概略図を示す。
連邦支援研究に関しての陳述
本発明は、国立衛生研究所(RO1 CA72631)；NCDDG(RFA CA-95-020)からの援助の下、連邦政府の支援によりなされた。米国政府は、本発明における特定の権利を有しうる。
【０００２】
発明の背景
発明の分野
本発明は、免疫学と医学の分野に含まれ、小胞体シャペロンポリペプチド(例えば、カルレティキュリン(calreticulin))およびポリペプチドもしくはペプチド抗原をコードするキメラもしくはハイブリッド核酸分子を用いて、抗原特異的免疫応答、特に細胞傷害性Tリンパ球(CTL)によって媒介される応答の増強を誘導するための組成物および方法を提供する。裸の(naked)DNAおよび自己複製RNAレプリコンワクチンが提供される。
【０００３】
背景技術の説明
DNAワクチンは、抗原特異的免疫療法を誘導するための魅力的な方法となっている。DNAワクチンの形態としては、「裸の」DNA、例えば、プラスミドDNA(米国特許第5,580,859号；第5,589,466号；第5,703,055号)、ウイルスDNAなどが挙げられる。基本的には、所望の免疫原性タンパク質もしくはペプチドをコードするDNA分子が個体に投与され、タンパク質がin vivoで生成される。「裸の」DNAワクチンの使用は、安全であるという利点を有する。なぜならば、例えばプラスミド自体は免疫原性が低く、高純度で容易に調製することができ、そしてタンパク質または他の生物学的試薬と比較して、高度に安定しているからである。しかしながら、DNAワクチンは効力が限られる。幾つかのストラテジーが、DNAワクチンの効力を増大するために適用されている。そのようなストラテジーには、例えば、迅速な細胞内分解のための抗原のターゲティング；APC受容体に対するリガンドに融合することによる抗原提示細胞(APC)への抗原の指向；ケモカインもしくは抗原性の病原性配列への抗原の融合、サイトカインもしくは補助的刺激分子またはアジュバント組成物との同時注射が含まれる。
【０００４】
癌ワクチンは、癌治療において魅力的な方法である。なぜならば、癌ワクチンは身体において複数の部位における全身性腫瘍を根絶する効力および新生物性細胞と非新生物性細胞とを識別する特異性を有しうるからである(Pardoll (1998) Nature Med. 4：525-531)。免疫系の抗腫瘍効果は、主に細胞性免疫によって媒介される。免疫系の細胞媒介性構成要素は、腫瘍を根絶することができる多数のエフェクター機構を備える、これらの抗腫瘍免疫応答のほとんどが、T細胞によって調節される。従って、腫瘍特異的T細胞応答の増強を目的とした癌ワクチン(特にDNAワクチンとして)を開発して、腫瘍を制御することが望まれる。
【０００５】
HPV腫瘍形成タンパク質E6およびE7は、HPVに関連する子宮頸癌のほとんどで共発現されており、細胞トランスフォーメーションの誘導および維持に重要である。従って、E6もしくはE7タンパク質をターゲティングするワクチンは、HPV関連子宮頸部悪性腫瘍を予防および治療するための機会を提供しうる。HPV-16 E7は、よく特性付けられた細胞質/核タンパク質で、HPV関連癌細胞においてE6よりも保存されており、多くのHPVワクチンに利用されている。
【０００６】
カルレティキュリン(CRT)は、細胞の小胞体(ER)の内腔に位置する豊富な46キロダルトン(kDa)タンパク質であり、レクチン活性を示し、そして初期の糖タンパク質の折畳みおよび組立て(assembly)に参加する。例えば、Nash (1994) Mol. Cell. Biochem. 135：71-78；Hebert (1997) J. Cell. Biol. 139：613-623；Vassilakos (1998) Biochemistry 37：3480-3490；Spiro (1996) J. Biol. Chem. 271：11588-11594を参照されたい。CRTは、抗原プロセシングに関連する輸送体、例えばTAP-1およびTAP-2によってERに輸送されたペプチドに会合する(Spee (1997) Eur. J. Immunol. 27：2441-2449)。またCRTは、in vitroでペプチドと複合体を形成する。マウスへの投与では、これらの複合体はペプチド特異的CD8+T細胞応答を引き出した(Basu (1999) J. Exp. Med. 189：797-802；Nair (1999) J. Immunol. 162：6426-6432)。マウスの腫瘍から精製されたCRTは、CRTが採取された腫瘍に特異的な免疫を引き出したが、抗原的に異なる腫瘍に対しては免疫を引き出さなかった(Basu, 前掲)。in vitroにおいてマウス樹状細胞(DC)にCRT-ペプチド複合体をパルスすること(pulsing)によって、ペプチドがDC上のMHCクラスI分子によって再提示され、ペプチド特異的CTL応答が刺激された(Nair,前掲)。
【０００７】
またCRTは抗脈管形成効果を有する。CRTおよびアミノ酸残基1-180を含む断片(「バソスタチン(vasostatin)」と呼ばれている)は、腫瘍増殖を抑制することができる内皮細胞インヒビターである(Pike (1999) Blood. 94：2461-2468)。腫瘍増殖および転移は、十分な血液供給の存在に依存する。腫瘍がより大きく増殖するので、十分な血液供給は新しい血管形成(脈管形成とよばれるプロセス)によって確保されることが多い(Folkman (1982) Ann. NY Acad. Sci. 401：212-27；Hanahan (1996) Cell. 86：353-364)。腫瘍の脈管構造を標的とし、損傷を与える治療薬は、腫瘍増殖を防止または遅延させることができ、そして退行もしくは休止を促進することさえもできる。
【０００８】
自己複製RNAワクチン(RNAレプリコン)は、核酸ワクチンの重要で、より強力な形態として現れた。RNAレプリコンワクチンは、アルファウイルスベクター、例えば、シンドビスウイルス(Xiong (1989) Science 243：1188-1191)、セムリキ森林ウイルス(Ying (1999) Nature Med. 5：823-827)またはべネズエラウマ脳脊髄炎ウイルス(Pushko (1997) Virology 239：389-401)ベクターから誘導しうる。これらのワクチンは自己複製および自己制御し、そしてRNAまたはDNAのいずれかとして投与され、次いでトランスフェクトした細胞中でまたはin vivoでRNAレプリコンに転写されうる(Berglund (1998) Nature Biotechnol. 16：562-565)。自己複製RNAは、多様な範囲の細胞型に感染し、高レベルで目的の抗原の発現を可能にする(Huang (1996) Curr. Opin. Biotechnol. 7：531-535)。さらに、ウイルス複製は、感染宿主細胞にとって有毒なので、自己複製RNAは最終的にはトランスフェクトした細胞の溶解を引き起こす(Frolov (1996) J. Virol. 70：1182-1190)。従って、これらのベクターには、宿主ゲノムに組み込まれるという裸のDNAワクチンに関連する懸念が生じない。このことは、潜在的に腫瘍形成性であるタンパク質、例えばHPV E6およびE7タンパク質をターゲティングするワクチン開発にとって特に重要である。
【０００９】
Chen ((2000) Cancer Research 60：1035-1042)により、ヒトパピローマウイルス16型(HPV-16) E7抗原とマイコバクテリウム・ツベルクローシス(Mycobacterium tuberculosis)熱ショックタンパク質70(HSP 70)との連結によりDNAワクチンの効力が増強されることが示された。他の研究では、腫瘍細胞もしくはウイルス感染細胞から単離された熱ショックタンパク質(HSP)複合体を用いた免疫感作は、強力な抗腫瘍(Janetzki (1998) J. Immunother. 21：269-276)または抗ウイルス免疫(Heikema (1997) Immunol. Lett. 57：69-74)を誘導することができることが示されている。また免疫原性HSP-ペプチド複合体は、in vitroでペプチドとHSPとを混合することで再構成することができる(Ciupitu (1998) J. Exp. Med. 187：685-691)。またHSPに基づくタンパク質ワクチンは、HSPに抗原を融合することによって投与することができる(Suzue (1996) J. Immunol. 156：873-879,「HSP 70融合タンパク質はHIV-1 p24に対する体液性および細胞性免疫応答を引き出した(HSP 70 fusion protein elicited humoral and cellular immune responses to HIV-1 p24)」)。これらの実験により、1)腫瘍細胞もしくはウイルス感染細胞から誘導されたHSP-ペプチド複合体は、腫瘍もしくはウイルス特異的免疫を刺激することができること；2)この免疫応答の特異性はHSPに結合した腫瘍に由来するペプチドによって引き起こされるのであって、HSP自体では引き起こされないこと；および3)免疫応答を、HSPドナーのMHCと同一または異なるMHCを有するマウスで誘導することができることが示されている(Przepiorka (1998) Mol. Med. Today 4：478-484；Srivastava (1998) Immunity 8：657-665)。これらの研究により、HSPを免疫療法において使用することがより魅力的になった一方、ここまで試験されたHSPワクチンは、タンパク質に基づくワクチンまたはDNAに基づくワクチンの形態のみである。
【００１０】
発明の概要
本発明は、小胞体シャペロンポリペプチドを含む第1ポリペプチドドメインと少なくとも1種の抗原性ペプチドを含む第2ポリペプチドドメインとを含むキメラタンパク質をコードする核酸を提供する。抗原性ペプチドは、MHCクラスI結合性ペプチドエピトープを含むことができる。抗原性ペプチド、例えばMHCクラスI結合性ペプチドエピトープは、約8アミノ酸残基〜約11アミノ酸残基の長さであることができる。
【００１１】
小胞体シャペロンポリペプチドには、典型的なシャペロンである、カルレティキュリン、カルネキシン(calnexin)、タパシン(tapasin)もしくはER60ポリペプチドに類似のシャペロン機能を有する任意のERポリペプチド；あるいはそれらの類似体もしくは擬似体(mimetic)、またはそれらの機能的断片が含まれる。そのような機能的断片は、例えば下記の実施例１および２に記載されるような、慣例のスクリーニング試験を用いてスクリーニングすることができる。従って、別の実施形態では、小胞体シャペロンポリペプチドは、カルネキシンポリペプチドまたはその等価物、ER60ポリペプチドまたはその等価物、GRP94/GP96もしくはGRP94ポリペプチドまたはその等価物、あるいはタパシンポリペプチドまたはその等価物を含むか、またはからなる。
【００１２】
一実施形態において、カルレティキュリンポリペプチドは、ヒトカルレティキュリンポリペプチドを含む。別の実施形態において、ヒトカルレティキュリンポリペプチド配列は配列番号１を含むか、あるいは本質的に配列番号１の第1残基付近〜第180残基付近の配列からなるか、または本質的に配列番号１の第181残基付近〜第417残基付近の配列からなることができる。
【００１３】
一実施形態において、抗原(例えば、MHCクラスI結合性ペプチドエピトープ)は、病原体から誘導される。例えば抗原は、病原体によって発現されるペプチドを含む。病原体は、例えばパピローマウイルス、ヘルペスウイルス、レトロウイルス(例えば、HIV-1などの免疫不全ウイルス)、アデノウイルスなどのウイルスであることができる。パピローマウイルスはヒトパピローマウイルスであってよく；例えば、抗原(例えば、クラスI結合性ペプチドエピトープ)をHPV-16 E7ポリペプチドから誘導することができる。一実施形態において、HPV-16 E7ポリペプチドは実質的に非腫瘍形成性である。すなわち、HPV-16 E7ポリペプチドは網膜芽細胞腫ポリペプチド(pRB)に結合しないか、あるいはin vivoで発現または送達された場合に、HPV-16 E7ポリペプチドが事実上、非腫瘍形成性である程度に低い親和性でpRBに結合する。
【００１４】
別の実施形態において、病原体は細菌、例えば、ボルデテラ・ペルツシス(Bordetella pertussis)；エーリキア・チャフェンシス(Ehrlichia chaffeensis)；スタフィロコッカス・アウレウス(Staphylococcus aureus)；トキソプラズマ・ゴンジイ(Toxoplasma gondii)；レジオネラ・ニューモフィラ(Legionella pneumophila)；ブルセラ・スイス(Brucella suis)；サルモネラ・エンテリカ(Salmonella enterica)；マイコバクテリウム・アビウム(Mycobacterium avium); マイコバクテリウム・ツベルクローシス；リステリア・モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)；クラミジア・トラコマチス(Chlamydia trachomatis)；クラミジア・ニューモニエ(Chlamydia pneumoniae)；リケッチシア・リケッチー(Rickettsia rickettsii)；または例えばパラコクシジオイデス・ブラシリエンシス(Paracoccidioides brasiliensis)などの真菌;あるいは、他の病原体、例えばプラスモジウム・ファルシパルム(Plasmodium falciparum)である。
【００１５】
別の実施形態において、MHCクラスI結合性ペプチドエピトープは腫瘍細胞から誘導される。腫瘍細胞に由来するペプチドエピトープは、腫瘍関連抗原、例えば、腫瘍特異的抗原(例えば、HER-2/neu抗原など)を含むことができる。
【００１６】
一実施形態において、単離されたまたは組換え核酸分子は、例えば、構成的、誘導性または組織特異的プロモーターなどのプロモーターに機能的に連結される。プロモーターは、免疫系の細胞(例えば抗原提示細胞(APC)を含む)を含む任意の細胞において、例えば構成的、誘導性または組織特異的な方法で発現させることができる。
【００１７】
別の実施形態において、APCは、樹状細胞、ケラチノサイト、星状細胞、単球、マクロファージ、Bリンパ球、小膠細胞または活性化内皮細胞などである。
【００１８】
また本発明は、小胞体シャペロンポリペプチドを含む第1ポリペプチドドメインと少なくとも1種の抗原性ペプチドを含む第2ポリペプチドドメインとを含むキメラタンパク質をコードする核酸配列を含む発現カセットを提供する。別の実施形態において、第1ドメインはカルレティキュリンポリペプチドを含み、そして第2ドメインはMHCクラスI結合性ペプチドエピトープを含む。別の実施形態において、発現カセットは発現ベクター、組換えウイルス(例えば、アデノウイルス、レトロウイルス)、プラスミドを含む。発現カセットは自己複製RNAレプリコンを含むことができる。自己複製RNAレプリコンは、シンドビスウイルス自己複製RNAベクター、例えばシンドビスウイルス自己複製RNAベクターSINrep5(米国特許第5,217,879号)などを含むことができる。本発明の適用可能な実施形態の全てと同様に、ERシャペロンポリペプチドは、典型的なシャペロンである、カルレティキュリン、1、タパシンもしくはER60ポリペプチドに類似のシャペロン機能を有する任意のERポリペプチド；あるいはそれらの類似体もしくは擬似体、またはそれらの機能的断片を含むことができる。
【００１９】
また本発明は、小胞体シャペロンポリペプチドを含む第1ポリペプチドドメインと少なくとも1種の抗原性ペプチドを含む第2ポリペプチドドメインとを含むキメラタンパク質をコードする核酸を含む粒子を提供する。一実施形態においては、少なくとも2種のドメインを含む融合タンパク質をコードする核酸配列を含む発現カセットを含む単離された粒子であって、この場合、第1ドメインはカルレティキュリンポリペプチドを含み、そして第2ドメインはMHCクラスI結合性ペプチドエピトープを含む。単離された粒子は、パーティクルボンバードメント(particle bombardment)に好適な任意の物質(例えば、金など)を含むことができる。ERシャペロンポリペプチドは、本明細書で論じたように、典型的なシャペロンである、カルレティキュリン、カルネキシン、タパシンもしくはER60ポリペプチドに類似のシャペロン機能を有する任意のERポリペプチドを含むことができる。
【００２０】
また本発明は、小胞体シャペロンポリペプチドを含む第1ポリペプチドドメインと少なくとも1種の抗原性ペプチドを含む第2ポリペプチドドメインとを含むキメラタンパク質をコードする核酸配列を含む細胞を提供する。一実施形態において、細胞は、第1ドメインがカルレティキュリンポリペプチドを含み、そして第2ドメインがMHCクラスI結合性ペプチドエピトープを含む、少なくとも2種のドメインを含む融合タンパク質をコードする核酸配列を含む発現カセットを含む。細胞を、例えば本発明の核酸でトランスフェクト、感染、形質導入させることができ、あるいは本発明の組換えウイルスで感染させることができる。細胞は、本発明の発現カセットを含む細胞を含む非ヒトトランスジェニック動物から単離することができる。例えば免疫系の細胞または抗原提示細胞(APC)などのいずれの細胞も本発明の発現カセットを含むことができる。APCは、樹状細胞、ケラチノサイト、マクロファージ、単球、Bリンパ球、星状細胞、小膠細胞または活性化内皮細胞であってよい。
【００２１】
また本発明は、小胞体シャペロンポリペプチドを含む第1ポリペプチドドメインと少なくとも1種の抗原性ペプチドを含む第2ポリペプチドドメインとを含むキメラポリペプチドを提供する。抗原性ペプチドは、MHCクラスI結合性ペプチドエピトープを含むことができる。例えばin vivoまたはin vitroで合成的にまたは組換え的に生産することができる、例えば融合タンパク質のように(例えば、ペプチド結合)、ERシャペロンポリペプチドを抗原性ペプチドに化学的に連結することができる。ポリペプチドドメインを、柔軟性のある化学的リンカーによって連結することができる。
【００２２】
別の実施形態において、キメラポリペプチドの第1ポリペプチドドメインが第2ポリペプチドドメインよりもアミノ末端に近くてもよく、または第2ポリペプチドドメインが第1ポリペプチドドメインよりもアミノ末端に近くてもよい。ERシャペロンポリペプチドは、本明細書で論じたように、典型的なシャペロンである、カルレティキュリン、カルネキシン、タパシンもしくはER60ポリペプチドに類似のシャペロン機能を有する任意のERポリペプチドを含むことができる。
【００２３】
本発明は、抗原特異的免疫応答を誘導または増強することができる本発明の組成物と製薬上許容される賦形剤とを含む医薬組成物を提供する。別の実施形態において、組成物は、小胞体シャペロンポリペプチドを含む第1ドメインと抗原性ペプチドを含む第2ドメインとを含むキメラポリペプチド；小胞体シャペロンポリペプチドを含む第1ポリペプチドドメインと抗原性ペプチドを含む第2ポリペプチドドメインとを含む融合タンパク質をコードする核酸分子；小胞体シャペロンポリペプチドを含む第1ドメインと抗原性ペプチドを含む第2ドメインとを含む融合タンパク質をコードする核酸配列を含む発現カセット；小胞体シャペロンポリペプチドを含む第1ドメインと抗原性ペプチドを含む第2ドメインとを含む融合タンパク質をコードする核酸配列を含む粒子；または小胞体シャペロンポリペプチドコード配列を含む第1ドメインと抗原性ペプチドを含む第2ドメインとを含む融合タンパク質をコードする核酸配列を含む細胞、を含む。ERシャペロンポリペプチドは、本明細書で論じたように、典型的なシャペロンである、カルレティキュリン、カルネキシン、タパシンもしくはER60ポリペプチドに類似のシャペロン機能を有する任意のERポリペプチドを含むことができる。
【００２４】
本発明は、抗原特異的免疫応答を誘導または増強する方法であって、(a)抗原特異的免疫応答を誘導または増強することができる本発明の組成物(別の実施形態においては、該組成物は、小胞体シャペロンポリペプチドを含む第1ドメインと抗原性ペプチドを含む第2ドメインとを含むキメラポリペプチド；小胞体シャペロンポリペプチドを含む第1ポリペプチドドメインと抗原性ペプチドを含む第2ポリペプチドドメインとを含む融合タンパク質をコードする核酸分子；小胞体シャペロンポリペプチドを含む第1ドメインと抗原性ペプチドを含む第2ドメインとを含む融合タンパク質をコードする核酸配列を含む発現カセット；小胞体シャペロンポリペプチドを含む第1ドメインと抗原性ペプチドを含む第2ドメインとを含む融合タンパク質をコードする核酸配列を含む粒子；または小胞体シャペロンポリペプチドコード配列を含む第1ドメインと抗原性ペプチドを含む第2ドメインとを含む融合タンパク質をコードする核酸配列を含む細胞、であることができる)を含む組成物を提供し、そして(b)抗原特異的免疫応答を誘導または増強するのに十分な量の組成物を投与することを含む、前記方法を提供する。抗原特異的免疫応答は、CD8+CTL応答のような細胞性応答を含みうる。また抗原特異的免疫応答は、抗体媒介応答または体液性応答および細胞性応答を含みうる。
【００２５】
上記方法を実施する上で、組成物をex vivoで投与しても、または組成物をex vivoで抗原提示細胞(APC)に投与してもよい。別の実施形態において、APCは、樹状細胞、ケラチノサイト、マクロファージ、単球、Bリンパ球、星状細胞、小膠細胞または活性化内皮細胞である。APCは、ヒト細胞であってよい。APCは、in vivoもしくはin vitro供給源から単離することができる。さらに上記方法は、ex vivo処置されたAPCを、哺乳動物、ヒト、組織適合性の個体に、またはAPCを単離した同一の個体に投与することを含むことができる。あるいは、組成物は、哺乳動物、例えばヒトにin vivoで直接投与される。
【００２６】
組成物を、筋内、皮内または皮下に投与することができる。組成物、例えば核酸、発現カセットまたは粒子は、バリスティックインジェクション(ballistic injection)によって投与することができる。組成物を、腫瘍内または腫瘍周辺に投与することができる。
【００２７】
上記方法の別の実施形態において、抗原性ペプチドはヒトパピローマウイルスなどのウイルスから誘導することができる。抗原性ペプチドは、HPV-16 E7ペプチドであることができる。抗原性ペプチドは、HER-2/neuペプチドなどの腫瘍特異的もしくは腫瘍関連ペプチドであることができる。
【００２８】
本発明は、個体において所望の抗原に特異的なCD8+CTLの数を増大する方法であって、(a)小胞体シャペロンポリペプチドを含む第1ドメインと抗原性ペプチドを含む第2ドメインとを含むキメラポリペプチド；小胞体シャペロンポリペプチドを含む第1ポリペプチドドメインと抗原性ペプチドを含む第2ポリペプチドドメインとを含む融合タンパク質をコードする核酸分子；小胞体シャペロンポリペプチドを含む第1ドメインと抗原性ペプチドを含む第2ドメインとを含む融合タンパク質をコードする核酸配列を含む発現カセット；小胞体シャペロンポリペプチドを含む第1ドメインと抗原性ペプチドを含む第2ドメインとを含む融合タンパク質をコードする核酸配列を含む粒子；または小胞体シャペロンポリペプチドコード配列を含む第1ドメインと抗原性ペプチドを含む第2ドメインとを含む融合タンパク質をコードする核酸配列を含む細胞、を含む組成物(この場合、MHCクラスI結合性ペプチドエピトープは抗原から誘導される)を提供し、そして(b)抗原特異的CD8+CTLの数を増大するのに十分な量の組成物を投与することを含む、前記方法を提供する。
【００２９】
本発明は、個体において腫瘍の増殖を阻害する方法であって、(a)小胞体シャペロンポリペプチドを含む第1ドメインと抗原性ペプチドを含む第2ドメインとを含むキメラポリペプチド；小胞体シャペロンポリペプチドを含む第1ポリペプチドドメインと抗原性ペプチドを含む第2ポリペプチドドメインとを含む融合タンパク質をコードする核酸分子；小胞体シャペロンポリペプチドを含む第1ドメインと抗原性ペプチドを含む第2ドメインとを含む融合タンパク質をコードする核酸配列を含む発現カセット；小胞体シャペロンポリペプチドを含む第1ドメインと抗原性ペプチドを含む第2ドメインとを含む融合タンパク質をコードする核酸配列を含む粒子；または小胞体シャペロンポリペプチドコード配列を含む第1ドメインと抗原性ペプチドを含む第2ドメインとを含む融合タンパク質をコードする核酸配列を含む細胞、を含む組成物を提供し、そして(b)腫瘍の増殖を阻害するのに十分な量の組成物を投与することを含む、前記方法を提供する。本発明の一実施形態において、組成物は、腫瘍内にまたは腫瘍周辺に投与される。組成物を、抗脈管形成活性を含む第2組成物、例えばアンジオスタチン(angiostatin)、エンドスタチン(endostatin)もしくはTIMP-2またはそれらの等価物、あるいはそれらの混合物などとともに同時投与することができる。組成物を、放射線療法または化学療法組成物とともに同時投与することができる。
【００３０】
また本発明は、例えばERシャペロンと抗原性ペプチド、熱ショックタンパク質と抗原性ペプチド、ならびにそれらの等価物およびそれらの混合物を含むキメラタンパク質を含めた、本発明の免疫応答増強融合タンパク質をコードする核酸を含む自己複製RNAウイルス構築物を提供する。一実施形態において、自己複製RNAウイルスは、下記の実施例２で論じるような、SINrep5などのシンドビスウイルス自己複製RNAベクターを含む。
【００３１】
本発明の1以上の実施形態の詳細は、添付した図面と下記の記載で説明される。本発明の他の特徴、目的および利点は、記載および図面ならびに特許請求の範囲から明らかであろう。
【００３２】
本明細書で引用される全ての刊行物、特許、特許出願、GenBank配列およびATCC寄託物は、全ての目的のために参照により本明細書に明らかに組み入れられるものとする。
【００３３】
好ましい実施形態の説明
本発明は、小胞体シャペロンポリペプチドと少なくとも1種の抗原性ペプチドとを含むキメラポリペプチドのex vivoまたはin vivo投与によって誘導される、免疫応答、特に細胞傷害性T細胞免疫応答を増強するための組成物および方法を提供する。キメラポリペプチドは、キメラ分子をコードする核酸の投与によって「間接的に」投与することができ、核酸構築物、従って融合タンパク質がin vivoで発現される。一実施形態において、キメラ核酸またはポリペプチドは、DNAワクチンの形態で投与される。
【００３４】
融合タンパク質は、少なくとも2種のドメインを含む。第1ドメインは小胞体シャペロンポリペプチドを含み、そして第2ドメインは、それに対する免疫応答を誘導することが望まれる抗原から誘導されたペプチドを含む。カルレティキュリン、タパシン、ER60もしくはカルネキシンポリペプチドなどの小胞体シャペロンポリペプチドまたはそれらの機能的断片もしくは変異体のいずれも本発明に用いることができる。
【００３５】
キメラ分子の第2ドメインは、それに対する免疫応答の誘導、増強もしくは抑制が望まれる病原体、癌または任意の供給源から誘導することができる抗原性ペプチドを含む。一実施形態において、ペプチドはMHCクラスI結合性ペプチドエピトープを含む。
【００３６】
本発明の方法において、キメラポリペプチドまたはそれをコードする核酸が免疫応答を誘導または増強するために適用される。一実施形態において、本発明の組成物は、免疫学的機構および抗脈管形成機構の双方を介して免疫応答および抗腫瘍効果を相乗的に増強する。
【００３７】
本明細書に記載の実験により、本発明の方法がヒト病原体のエピトープをコードするDNAワクチンによって誘導される、細胞性免疫応答、特にCTL反応性を増強できることが示されている。ヒトHPV-16 E7を用いた。ヒトパピローマウイルス(HPV)、特にHPV-16がヒト子宮頚癌のほとんどに関連するので、ワクチン開発にとってヒトHPV-16 E7はモデル抗原である。腫瘍形成性HPVタンパク質E7は、細胞トランスフォーメーションの誘導と維持に重要であり、HPV含有子宮頸癌およびそれらの前駆体病変のほとんどで共発現される。従って、E7を標的とする本発明の組成物のような癌ワクチンを用いて、HPV関連新生物を制御することができる(Wu (1994) Curr. Opin. Immunol. 6：746-754)。
【００３８】
下記の実施例１に記載するように、これらの実験結果より、全長E7ポリペプチドに連結されたCRTを含む融合タンパク質をコードする核酸を含むDNAワクチンは、DNAワクチンの効力を増強できることが示されている。キメラCRT/E7融合遺伝子を含有する本発明のDNAワクチンを、バリスティック皮下方法によってマウスに投与した。それらは、E7特異的CD8+CTL前駆体の増大を誘導し、それによって腫瘍に対する免疫保護が改善された。E7特異的CD8+CTL前駆体のこの増大は、野生型E7もしくはCRT遺伝子を単独で含有するDNAワクチンと比較して有意なものであった。
【００３９】
さらに、CRT DNAもしくはキメラCRT/E7 DNAのいずれかを用いたC57BL/6マウス(正常な免疫系を有する近交系統)もしくはヌードマウス(T細胞および機能的な免疫系を欠いた系統)を処置することで、肺転移結節が低減され、肺結節内での脈管形成が阻害された。従って、キメラCRT/E7をコードする本発明のDNAワクチンは、強力な抗腫瘍効果の発生のための免疫学的方法と抗腫瘍形成的方法とを組み合わせた特有の方法を示す。
【００４０】
上記で論じたように、研究により熱ショックタンパク質(HSP)を免疫療法において使用することがより魅力的となった一方、ここまで試験されたHSPワクチンは、タンパク質に基づくワクチンまたはDNAに基づくワクチンの形態にすぎない。本発明により、初めて自己複製RNAワクチンの形態にあるHSPなどの抗原および本発明のキメラポリペプチドの投与が組み入れられ、そして示される。
【００４１】
下記の実施例２に記載されるように、自己複製RNAワクチン中のHSP70-ヒトパピローマウイルス16型(HSP-16)E7融合タンパク質の発現は、in vivoで発現された場合にこの抗原性ポリペプチドの効力を大いに増強した。下記に記載する結果により、E7/HSP70融合遺伝子を含有するRNAレプリコンワクチンは、ワクチン接種したマウスにおいて野生型E7遺伝子を含有するワクチンよりもかなり高いE7特異的T細胞媒介免疫応答を誘導したことが示された。in vitro研究により、E7/HSP70 RNAレプリコンでトランスフェクトしたアポトーシス細胞に由来するE7抗原を、骨髄由来樹状細胞によって取り込ませ、野生型E7 RNAレプリコンでトランスフェクトしたアポトーシス細胞よりもMHCクラスI経路を介して効率的に呈示させることができることが示された。E7へのHSP70の融合は、あまり効果的でないワクチンをE7発現腫瘍に対する有意な効力を有するワクチンへと変えた。これらの結果より、自己複製RNAワクチンの使用は本発明の融合タンパク質の免疫原性を増強できることが示された。
【００４２】
in vivoにおける抗原特異的CD8+T細胞免疫応答の増強に対する可能性のある機構は、抗原を発現する細胞からのアポトーシス小体(apoptotic body)の取り込みによるMHCクラスI経路を介した抗原提示であり、「クロスプライミング」とも呼ばれる。下記の実施例２で論じるように、CTLアッセイにより、SINrep5-E7/HSP70 RNAによってトランスフェクトしたアポトーシス細胞をパルスした骨髄由来樹状細胞におけるHPV E7ポリペプチドのMHCクラスI提示の増強が示された。
【００４３】
定義
別段定義しない限り、本明細書で使用される全ての専門用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解される意味を有する。本明細書で使用する場合、以下の用語は別段特記しない限りそれらに特有のものとされる意味を有する。
【００４４】
本明細書で使用する「抗脈管形成活性」という用語は、血管増殖(例えば、毛細血管、細動脈など)阻害のいずれの形態をも意味する。従って、そのような活性には、血管またはその置換物の増殖の遅延が含まれ、例えば、内皮細胞の増殖の遅延または阻害が挙げられるだろう。
【００４５】
本明細書で使用する「抗原」または「免疫原」という用語は、適切な量(「免疫原性上有効な量)」で投与した(または投与された核酸、例えばDNAワクチンによってin vivoで発現された)場合に「抗原性」または「免疫原性」である、すなわち単独で、あるいは別の物質と組み合わせてまたは連結もしくは融合して(1回でまたはいくらかの間隔にわたって投与することができる)、細胞性および/または体液性免疫応答を、引き出し、増大しまたは増進することができる、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質を含む化合物または組成物を意味する。
【００４６】
「カルネキシン」は、分子シャペロンとしておよびER品質管理機構の成分として機能する小胞体(ER)のよく特性付けられた膜タンパク質を示す。カルレティキュリンは、カルネキシンの可溶性類似体である。in vivoでカルレティキュリンおよびカルネキシンは、タンパク質合成、折畳みおよび翻訳後修飾中の品質管理に重要な役割を果たす。カルネキシンポリペプチドならびにそれらの等価物および類似体は、本明細書で記載されるようにERシャペロンポリペプチド属における種である(Wilson (2000) J. Biol. Chem. 275：21224-2132；Danilczyk (2000) J. Biol. Chem. 275：13089-13097；米国特許第6,071,743号および第5,691,306号)。
【００４７】
「カルレティキュリン」または「CRT」は、レクチン活性を有し、そして初期の糖タンパク質の折畳みおよび組立てに参加する、よく特性付けられたER内腔の約46kDa内在タンパク質を示す。CRTは「シャペロン」ポリペプチドとして、およびMHCクラスI輸送体TAP複合体のメンバーとして働く。CRTは、TAP1およびTAP2輸送体、タパシン、MHCクラスI重鎖ポリペプチドならびにβ2ミクログロブリンと会合して初期のMHCクラスI分子上へのペプチドエピトープのローディングにおいて機能する(Jorgensen (2000) Eur. J. Biochem. 267：2945-2954)。「カルレティキュリン」または「CRT」という用語は、本明細書に記載する典型的なCRT配列に対して実質的な同一性(本明細書で規定する)を有するポリペプチドおよび核酸分子を意味する。CRTポリペプチドは、CRTのアミノ酸配列に同一な、または実質的に同一な(本明細書で規定する)配列を含むポリペプチドである。本発明の組成物および方法で使用するCRTの典型的なヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１および配列番号２である。「カルレティキュリン」または「CRT」という用語は、天然タンパク質、ならびにCTL応答を含む免疫応答を誘導する組換え的に産生した改変タンパク質を包含する。「カルレティキュリン」または「CRT」という用語は、CRTの相同体および対立遺伝子変異体を包含し、これらにはin vitro技法によって構築された天然タンパク質の変異体および天然供給源から単離されたタンパク質が含まれる。また本発明のCRTポリペプチドおよびそれらをコードする配列には、非CRT配列、特にMHCクラスI結合性ペプチドを含む融合タンパク質；またさらに他のドメイン、例えばエピトープタグ、酵素切断認識配列、シグナル配列、分泌シグナルなどを含む融合タンパク質が含まれる。
【００４８】
本明細書で使用する「小胞体シャペロンポリペプチド」という用語は、典型的なシャペロンタンパク質である、CRT、タパシン、ER60もしくはカルネキシンと実質的に同じERシャペロン機能を有するいずれのポリペプチドをも意味する。従って、この用語には、それらの全ての機能的断片または変異体もしくは擬似体が含まれる。ポリペプチドもしくはペプチドを、実施例１で説明するような当技術分野で公知のアッセイを用いてERシャペロンとしてのその活性について慣例的にスクリーニングすることができる。本発明は特定の作用機構のいずれによっても限定されないが、in vivoでシャペロンは、MHCクラスIへテロ三量体分子(重(H)鎖、β2mおよびペプチド)の組立てを含めたERにおける多くの糖タンパク質の正確な折畳みおよびオリゴマー化を促進する。またそれらは、不完全に組立てられたMHCクラスIへテロ三量体複合体をERに保持する(Hauri (2000) FEBS Lett., 476：32-37)。
【００４９】
本明細書で使用する「エピトープ」という用語は、抗体またはT細胞受容体(TCR)と相互作用する抗原決定基または抗原性部位、例えば本発明の方法に用いられるMHCクラスI結合性ペプチド組成物を意味する。「抗原」とは、免疫応答を誘導するか、あるいは抗体またはCTLなどの免疫応答の産物によって特異的に認識または結合される分子または化学構造である。抗体またはTCRが結合する特異的な配座もしくは立体化学的「ドメイン」が「抗原決定基」または「エピトープ」である。TCRは、第3の分子、主要組織適合遺伝子複合体(MHC)クラスIもしくはクラスIIタンパク質と物理的に会合するペプチドエピトープに結合する。
【００５０】
本明細書で使用する「ER60」または「GRP94」または「gp96」または「グルコース調節タンパク質94」という用語は、ストレス誘導タンパク質の熱ショックタンパク質-90(HSP90)ファミリーのER代表種である、よく特性付けられたERシャペロンポリペプチドを示す。これらは、恐らくは先進の折畳み中間体または不完全に組立てられたタンパク質を認識することによって、分泌経路において限定された数のタンパク質に結合する。ER60ポリペプチドならびにそれらの等価物および類似体は、本明細書で記載するように、ERシャペロンポリペプチド属における種である(Argon (1999) Semin. Cell Dev.. Biol. 10：495-505；Sastry (1999) J. Biol. Chem. 274：12023-12035；Nicchitta (1998) Curr. Opin. Immunol. 10：103-109；米国特許第5,981,706号)。
【００５１】
本明細書で使用する「発現カセット」または「発現ベクター」という用語は、そのような配列と適合する宿主においてタンパク質コード配列の発現に影響を及ぼすことができるヌクレオチド配列を意味する。発現カセットには、ポリペプチドコード配列に；および場合によっては、他の配列、例えば転写終結シグナルに機能的に連結された少なくとも1つのプロモーターが含まれる。また、発現の達成に必要なまたは役立つさらなる因子、例えばエンハンサーを含むことができる。「機能的に連結された」とは、プロモーターがDNA配列の転写に介在するようなDNA配列の上流へのプロモーターの連結を意味する。従って、発現カセットには、プラスミド、組換えウイルス、「裸のDNA」組換えベクターの任意の形態などが含まれる。「ベクター」は、細胞に感染、トランスフェクト、一過的にもしくは永続的に形質導入することができる核酸を含む。ベクターは裸の核酸またはタンパク質もしくは脂質と複合体化した核酸であることができることは理解されよう。場合によっては、ベクターはウイルスもしくは細菌の核酸および/またはタンパク質、および/または膜(例えば、細胞膜、ウイルス脂質エンベロープなど)を含む。ベクターには、限定されるものではないが、DNA断片を備え、複製させることができるレプリコン(例えば、RNAレプリコン(下記の実施例２を参照されたい)、バクテリオファージ)が含まれる。従って、ベクターとしては、限定されるものではないが、RNA、自律自己複製環状もしくは線状DNAもしくはRNA、例えばプラスミド、ウイルスなどが挙げられ(米国特許第5,217,879号)が挙げられ、発現プラスミドおよび非発現プラスミドの双方が含まれる。組換え微生物または細胞培養物が発現ベクターの宿主として記載されている場合には、これには染色体外の環状および線状のDNAならびに宿主染色体に組み込まれたDNAの双方が含まれる。ベクターが宿主細胞によって維持されている場合には、ベクターは自律構造として有糸分裂の間に細胞によって安定して複製されるか、または宿主ゲノム内に組み込まれうる。
【００５２】
「化学的に連結された」という用語は、2つの部分の化学結合のいずれをも意味し、例えば、本発明の一実施形態において、ERシャペロンポリペプチドが抗原性ペプチドに化学的に連結されることである。このような化学的連結としては、組換え的に、またはin vivoで生成された融合タンパク質のペプチド結合が挙げられる。
【００５３】
「キメラ」もしくは「融合」ポリペプチドもしくはタンパク質という用語は、第2のポリペプチドもしくはペプチドドメインと会合した少なくとも1つのポリペプチドもしくはペプチド配列もしくはドメインを含む組成物を意味する。本発明の一実施形態は、第1ドメインが小胞体シャペロン、例えばCRTを含み、そして第2ドメインが抗原性エピトープ、例えばMHCクラスI結合性ペプチドエピトープを含むものである、少なくとも2つのドメインを含む融合タンパク質をコードする単離されたまたは組換え核酸分子である。付加的ドメインは、ポリペプチド、ペプチド、多糖類などを含むことができる。「融合」は、ペプチド結合、化学的連結、電荷相互作用(例えば、塩橋、H-結合などの静電引力)などによって生じた会合であることができる。ポリペプチドが組換え体である場合、「融合タンパク質」は一般的なメッセージから翻訳することができる。あるいは、ドメインの組成物を任意の化学的もしくは静電的手段によって連結することができる。また本発明のキメラ分子(例えば、CRT-クラスI結合性ペプチド融合タンパク質)は、付加的配列、例えばリンカー、エピトープタグ、酵素切断認識配列、シグナル配列、分泌シグナルなどを含むことができる。あるいは、ペプチドを単純に担体に連結し、ペプチドの操作または同定/位置決定を容易にすることができる。
【００５４】
「免疫原」または「免疫原性組成物」という用語は、「免疫原性」である、すなわち単独で、あるいは別の物質と組み合わせてまたは連結もしくは融合して、細胞性および/または体液性免疫応答を、引き出し、増大しまたは増進することができる、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質を含む化合物または組成物を意味する。免疫原性組成物は、少なくとも約5アミノ酸の長さのペプチド、10アミノ酸の長さのペプチド、15アミノ酸の長さの断片、20アミノ酸の長さの断片またはそれより大きいものであってよく；より小さい免疫原は、例えば好ましくは免疫原に連結された(化学的にまたは別な方法で)融合タンパク質、凝集物(aggregate)、コンジュゲートまたは混合物のような「担体」ポリペプチドの存在が必要である場合がある。免疫原は、ワクチンベクター(プロモーターに機能的に連結された免疫原コード配列を含む裸のDNAであってよく、例えば、発現カセット)から組換え的に発現させることができる。免疫原は、約3〜約15アミノ酸のサイズで変化しうる1以上の抗原決定基もしくはエピトープを含む。
【００５５】
例えばCRT核酸またはポリペプチドなどの分子または組成物に言及する場合には、本明細書で使用する「単離された」という用語は、分子または組成物がin vivoまたはその天然の状態で会合するタンパク質、他の核酸(例えばRNA)または他の混在物などの少なくとも1つの他の化合物から分離されたことを意味する。従って、CRT組成物は、細胞抽出物中のように、天然には会合する任意の他の成分(例えば細胞膜)から単離された場合に、単離されたとみなされる。しかしながら、また単離された組成物は実質的に純粋でありうる。単離された組成物は、均一状態にあってよく、そして乾燥していても、または水溶液中にあってもよい。純度および均一性は、例えばポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)または高性能液体クロマトグラフィー(HPLC)などの分析化学技法を用いて測定することができる。従って、単離された本発明の組成物は、in situ環境でそれらと通常会合する物質を含まない。タンパク質を均一なもしくは主要なバンドで単離した場合でさえも、所望のタンパク質とともに同時精製する微量混在物が存在する。
【００５６】
本明細書で使用する「HPV-16 E7ポリペプチドが非腫瘍形成性である」というフレーズは、網膜芽細胞腫ポリペプチド(pRB)に結合しないか、またはHPV-16 E7ポリペプチド変異体が実質的に非腫瘍形成性である程度に低い親和性でpRBに結合する、HPV-16 E7ポリペプチドの変異体(例えば、欠失、置換など)を意味する。HPV-16 E7ポリペプチドを含むHPVポリペプチドは、当技術分野で十分に記載されている。HPV-16 E7については、GenBank登録番号AF125673(1999年6月1日)が完全なHPV-16ゲノムおよび配列番号５の配列を有するHPV-16 E7タンパク質(下記を参照されたい)を示す。
【００５７】
「ポリペプチド」、「タンパク質」および「ペプチド」という用語には、変異体を誘導したポリペプチドに実質的に対応する構造と活性を有する「類似体」もしくは「保存的変異体」および「擬似体」もしくは「ペプチド擬似体(peptidomimetic)」をも含む本発明の組成物が含まれ、例えば下記で詳細に論じるような、ヒトCRTまたはHPV-16 E7ポリペプチドなどのクラスI結合性ペプチドエピトープが挙げられる。
【００５８】
「医薬組成物」という用語は、例えば被験者におけるワクチンとしての医薬的使用に好適な組成物を意味する。本発明の医薬組成物は、例えば本発明の核酸もしくはベクターもしくは細胞を含む組成物の薬理学上有効な量と製薬上許容される担体とを含む製剤である。
【００５９】
「プロモーター」という用語は、核酸の転写を指令する一連の核酸制御配列である。本明細書で使用する場合、プロモーターは、転写開始部位近くの必要な核酸配列(例えばポリメラーゼII型プロモーターの場合にはTATAエレメント)を含む。また場合によっては、プロモーターは転写開始部位から数千塩基対ほどの位置に位置することができる遠位のエンハンサーまたはリプレッサーエレメントを含む。「構成的」プロモーターは、ほとんどの環境および発生条件下で活性のあるプロモーターである。「誘導性」プロモーターは、環境または発生調節下にあるプロモーターである。「組織特異的」プロモーターは、生物の特定の組織型中で活性であるが、同じ生物の他の組織型中では活性ではない。「機能的に連結された」という用語は、核酸発現制御配列(プロモーターまたは一連の転写因子結合部位など)と第2核酸配列との間の機能的連結を意味し、この場合、発現制御配列は第2配列に対応する核酸の転写を指令する。
【００６０】
「組換え」という用語は、(1)合成された、またはその他の方法でin vitroで操作されたポリヌクレオチド(例えば「組換えポリヌクレオチド」)、(2)細胞または他の生物系で遺伝子産物を産生するための組換えポリヌクレオチドの使用方法、あるいは(3)組換えポリヌクレオチドによってコードされたポリペプチド(「組換えタンパク質」)を意味する。例えば、組換えCRTまたはMHCクラスI結合性ペプチドエピトープは、本発明を実施するために使用する場合には組換え体であってよい。また「組換え手段」は、異なる供給源に由来する様々なコード領域もしくはドメインもしくはプロモーター配列を有する核酸の発現カセットもしくは発現用ベクター(例えば、本発明を実施するために用いられるベクター中のポリペプチドコード配列の誘導性または構成的発現用)への連結を包含する。
【００６１】
「自己複製RNAレプリコン」という用語は、異種RNAおよびタンパク質の発現を可能にするように遺伝子工学的に操作された、RNAウイルス、例えばアルファウイルスゲノムRNA(例えば、シンドビスウイルス、セムリキ森林ウイルスなど)に基づく構築物を意味する。これらの組換えベクターは自己複製し、下記で詳細に説明するように、裸のRNAもしくはDNAとして細胞に導入することができる。一実施形態において、自己複製RNAレプリコンは、シンドビスウイルス自己複製RNAベクターSINrep5(米国特許第5,217,879号に詳細に記載されている)を含む。
【００６２】
「全身投与」という用語は、被験者の循環系への組成物の導入をもたらす方法での、本明細書で記載する分子ワクチンまたはCRT-クラスI結合性ペプチドエピトープ融合タンパク質などの組成物もしくは薬剤の投与を意味する。「局所(regional)」投与という用語は、腹腔内、髄腔内、硬膜下などの特定の解剖学的空間への、または特定の器官などに対する組成物の投与を意味する。例えば、局所投与は肝動脈への組成物もしくは薬物の投与を含む。「局部(local)投与」という用語は、腫瘍塊への腫瘍内注射、皮下注射、筋内注射などの、限定されたまたは限局性の解剖学的空間への組成物もしくは薬物の投与を意味する。当業者であれば、また局部投与または局所投与は循環系への組成物もしくは薬物のエントリーをもたらしうることが理解されるだろう。
【００６３】
「タパシン」は、上記で論じたように公知のERシャペロンポリペプチドである。特定の作用機構のいずれによっても限定されないが、in vivoでタパシンは、TAP(抗原プロセシングに関連する輸送体)複合体のサブユニットであり、TAP1およびMHCクラスIポリペプチドの双方に結合する。タパシンポリペプチドならびにそれらの等価物および類似体は、本明細書で記載されるようにERシャペロンポリペプチド属における種である(Barnden (2000) J. Immunol. 165：322-330；Li (2000) J. Biol. Chem. 275：1581-1586)。
【００６４】
核酸の生成と操作
本発明の方法は、上記したように、CRT-クラスIエピトープ結合性ペプチド融合タンパク質をコードする核酸の投与を提供するものである。組換えCRT含有融合タンパク質は、in vitroまたはin vivoで合成することができる。これらの組成物をコードする核酸は、「裸のDNA」の形態であってよく、あるいはin vivoまたはex vivo投与のためにプラスミド、ベクター、組換えウイルス(例えば「レプリコン」)などに組み込むことができる。本発明の核酸およびベクターを作製し、in vitroまたはin vivoで発現させることができ、これらの遺伝子およびベクターを作製および発現する様々な手段を用いることができる。当業者であれば、所望の遺伝子活性を、本発明を実施するために用いるベクター内の遺伝子および核酸(例えば、プロモーター)の発現もしくは活性をモジュレートすることによって得ることができることは理解されよう。遺伝子の発現もしくは活性または組織特異性を増大または低減するために記載される公知の方法のいずれも本発明のために使用することができる。本発明は、科学文献および特許文献において十分に記載されている当技術分野で公知の任意の方法またはプロトコールと組み合わせて実施することができる。
【００６５】
一般的技法
RNA、cDNA、ゲノムDNA、ベクター、組換えウイルスまたはそれらのハイブリッドのいずれであれ、本発明を実施するために用いる核酸配列は、様々な供給源から単離し、遺伝子工学的に操作し、増幅し、および/または組換え的に発現させることができる。細菌細胞に加えて、例えば哺乳動物、酵母、昆虫もしくは植物細胞発現系を含めた任意の組換え発現系を使用することができる。あるいは、例えばCarruthers (1982) Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 47：411-418；Adams (1983) J. Am. Chem. Soc. 105：661；Belousov (1997) Nucleic Acids Res. 25：3440-3444；Frenkel (1995) Free Radic. Biol. Med. 19：373-380；Blommers (1994) Biochemistry 33：7886-7896；Narang (1979) Meth. Enzymol. 68：90；Brown (1979) Meth. Enzymol. 68：109；Beaucage (1981) Tetra. Lett. 22：1859；米国特許第4,458,066号に記載されるような周知の化学合成技法によって、これらの核酸をin vitroで合成することができる。次いで二本鎖DNA断片を、相補鎖を合成し、適切な条件下で一緒にそれらの鎖をアニーリングさせることによって、または適切なプライマー配列とともにDNAポリメラーゼを用いて相補鎖を添加することによって得ることができる。
【００６６】
ヒトCRTを含めたCRTの配列は、当技術分野で周知である(McCauliffe (1990) J. Clin. Invest. 86：332-335；Burns (1994) Nature 367：476-480；Coppolino (1998) Int. J. Biochem. Cell Biol. 30：553-558)。核酸配列は、GenBank登録番号NM004343として載っており、配列番号１である。
【００６７】
核酸の操作技法、例えば配列における突然変異生成、サブクローニング、プローブ標識、配列決定分析、ハイブリダイゼーションなどは、科学文献および特許文献に十分に記載されている。例えば、Sambrook編, MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL (第2版),第1-3巻, Cold Spring Harbor Laboratory, (1989)；CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Ausubel編, John Wiley & Sons, Inc., New York (1997)；LABORATORY TECHNIQUES IN BIOCHEMISTRY AND MOLECULAR BIOLOGY：HYBRIDIZATION WITH NUCLEIC ACID PROBES, Part I. Tijssen編, Elsevier, N.Y. (1993)を参照されたい。
【００６９】
核酸、ベクター、キャプシド、ポリペプチドなどを、当業者に周知の多数の一般的手段のうちいずれかによって分析し、定量化することができる。これらとしては、例えば、NMR、分光測光法、ラジオグラフィー、電気泳動、キャピラリー電気泳動、高性能液体クロマトグラフィー(HPLC)、薄層クロマトグラフィー(TLC)および超拡散(hyperdiffusion)クロマトグラフィーなどの生化学的分析方法、様々な免疫学的方法、例えば液体もしくはゲル沈降素反応、免疫拡散、免疫電気泳動、ラジオイムノアッセイ(RIA)、酵素免疫測定法(ELISA)、免疫蛍光アッセイ、サザン分析、ノーザン分析、ドットブロット分析、ゲル電気泳動(例えば、SDS-PAGE)、RT-PCR、定量PCR、他の核酸もしくは標的もしくはシグナル増幅方法、放射標識、シンチレーション計数法およびアフィニティークロマトグラフィーが挙げられる。
【００７０】
核酸の増幅
オリゴヌクレオチドプライマーを用いて核酸を増幅して、本発明を実施するために用いる融合タンパク質コード配列を生成し、in vivo投与後のワクチンレベル(例えば、プラスミドもしくはウイルスレベル)をモニターし、活性化CTLの存在および表現型を確認することなどができる。当業者であれば、既知配列(例えば、配列番号１)を用いて好適なオリゴヌクレオチド増幅プライマーを選択し、設計することができる。また増幅方法は当技術分野で周知であり、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応、PCR(PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications, Innis編, Academic Press, N.Y. (1990)およびPCR Strategies (1995), Innis編, Academic Press, Inc., N.Y.)；リガーゼ連鎖反応(LCR) (Wu (1989) Genomics 4：560；Landegren (1988) Science 241：1077；Barringer (1990) Gene 89：117)；転写増幅(Kwoh (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86：1173)；および自立配列複製(Guatelli (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87：1874)；Qβレプリカーゼ増幅(Smith (1997) J. Clin. Microbiol. 35：1477-1491；Burg (1996) Mol. Cell. Probes 10：257-271)ならびに他のRNAポリメラーゼ介在技法(NASBA, Cangene, Mississauga, Ontario；Berger (1987) Methods Enzymol. 152：307-316；米国特許第4,683,195号および第4,683,202号；Sooknanan (1995) Biotechnology 13：563-564)が挙げられる。
【００７１】
発現カセットのクローニングおよび構築
本明細書に記載の融合タンパク質をコードする、プラスミド、組換えウイルス(例えば、下記に記載のレプリコンのようなRNAウイルス)および他のベクターを含めた発現カセットは、in vitroおよびin vivoでこれらのポリペプチドを発現するために用いられる。組換え核酸は、様々な従来技法(Roberts (1987) Nature 328：731；Schneider (1995) Protein Expr. Purif. 6435：10；Sambrook,前掲；Tijssen,前掲；Ausubel,前掲)によって発現される。プラスミド、ベクターなどは、天然供給源から単離するか、ATCCもしくはGenBankライブラリーなどの供給者から入手するか、または合成もしくは組換え方法によって調製することができる。
【００７２】
本発明を実施するために用いる核酸を、エピソーム発現系などの細胞において安定してまたは一過的に発現させることができる。選択マーカーを組み込み、形質転換細胞に選択可能な表現型を供与することができる。例えば、選択マーカーは、宿主ゲノムへの組込みを必要としないようにエピソーム維持および複製をコードすることができる。例えば、マーカーが抗生物質耐性(例えば、クロラムフェニコール、カナマイシン、G418、ブレオマイシン、ハイグロマイシン)をコードすることで、所望のDNA配列で形質転換した細胞の選択を可能にすることができる(Blondelet-Rouault (1997) Gene 190：315-317；Aubrecht (1997) J. Pharmacol. Exp. Ther. 281：992-997)。
【００７３】
in vivo 核酸投与
一実施形態において、CRT-クラスI結合性ペプチドエピトープをコードする核酸は、in vitro、ex vivoおよび/またはin vivoで細胞にトランスフェクトまたは感染することができるプラスミドまたは他のベクター、ウイルスなどの発現カセットにクローニングされる。多数の送達手法が知られており、脂質もしくはリポソームに基づく遺伝子送達(Mannino (1988) BioTechniques 6：682-691；米国特許第5,279,833号)、レトロウイルスゲノムの一部として所望の外因性配列を有する複製欠陥レトロウイルスベクター(Miller (1990) Mol. Cell. Biol. 10：4239；Kolberg (1992) J. NIH Res. 4：43；Cornetta (1991) Hum. Gene Ther. 2：215；Zhang (1996) Cancer Metastasis Rev. 15：385-401；Anderson, Science (1992) 256：808-813；Nabel (1993) TIBTECH 11：211-217；Mitani (1993) TIBTECH 11：162-166；Mulligan (1993) Science, 926-932；Dillon (1993) TIBTECH 11：167-175；Miller (1992) Nature 357：455-460)が挙げられる。
【００７４】
また発現カセットをウイルスゲノムから誘導することができる。用いることができるベクターには、組換えで改変したエンベロープもしくは非エンベロープDNAおよびRNAウイルスが含まれ、例えば、バキュロウイルス科、パルボウイルス科、ピコルナウイルス科(picornoviridae)、ヘルペスウイルス科、ポックスウイルス科、アデノウイルス科、ピコルナウイルス科(picornnaviridae)またはアルファウイルス科が挙げられる。また各親ベクターの特性の有利な長所を利用するキメラベクターを用いることができる(Feng (1997) Nature Biotechnology 15：866-870)。このようなウイルスベクターを組換えDNA技法によって改変することで目的の遺伝子を含ませることができ、そして遺伝子工学的に操作して、複製欠陥に、条件付きで複製する、または複製能力があるようにすることができる。ベクターは、アデノウイルスゲノム、アデノ随伴ウイルスゲノムまたはレトロウイルスゲノムから誘導することができる。レトロウイルスベクターは、マウス白血病ウイルス(MuLV)、テナガザル白血病ウイルス(GaLV)、サル免疫不全ウイルス(SIV)、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)およびそれらの組合せに基づくものを含むことができる(Buchscher (1992) J. Virol. 66 (5) 2731-2739；Johann (1992) J. Virol. 66 (5)：1635-1640 (1992)；Sommerfelt (1990) Virol. 176：58-59；Wilson (1989) J. Virol. 63：2374-2378；Miller (1991) J. Virol. 65：2220-2224)。アデノ随伴ウイルス(AAV)に基づくベクターは、核酸およびペプチドのin vitro産生のために細胞に形質導入することができ、in vivoおよびex vivo治療方法に用いることができる(Okada (1996) Gene Ther. 3：957-964；West (1987) Virology 160：38-47；Carter (1989) 米国特許第4,797,368号；Carterら WO93/24641 (1993)；Kotin (1994) Human Gene Therapy 5：793-801；Muzyczka (1994) J. Clin. Invst. 94：1351)。
【００７５】
自己複製 RNA レプリコンを用いた in vivo 投与
上記の発現ベクターおよび組換えウイルスに加えて、また自己複製RNAレプリコンを用いて細胞もしくは組織もしくは生物全体に感染させ、本発明の融合タンパク質発現核酸を供与することができる。従って、また本発明には、遺伝子工学的に操作して異種RNAおよびタンパク質の発現を可能にした、シンドビスウイルス、セムリキ森林ウイルス、べネズエラウマ脳脊髄炎ウイルスなどに由来するアルファウイルスゲノムRNAを含むRNAウイルスが組み入れられる。ウイルス構造遺伝子が異種コード配列によって置換された場合、本発明の融合ポリペプチドなどの異種配列の高レベルの発現が達成される。
【００７６】
これらの組換えRNAは自己複製し(「レプリコン」)、裸のRNAもしくはDNAとして細胞に導入することができる。しかしながら、これらは、感染性ウイルス粒子としてパッケージングされ、細胞から放出されるにはトランス補足性(trans complementation)を必要とする。欠陥ヘルパーRNAは、複製に必要なシス作用性配列ならびにオープンリーディングフレームの発現を駆動するRNAプロモーターを含有する。レプリコンおよび欠陥ヘルパーRNAの双方で同時トランスフェクトした細胞においては、レプリコンRNAから翻訳されるウイルス非構造タンパク質が欠陥ヘルパーRNAの複製と転写を可能にし、ウイルス粒子の構造タンパク質を産生する(Bredenbeek (1993) J. Virol. 67：6439-6446)。
【００７７】
RNAレプリコンワクチンは、アルファウイルスベクター、例えば、シンドビスウイルス(トガウイルス科)(Xiong (1989) Science 243：1188-1191)、セムリキ森林ウイルス(Ying (1999) Nat. Med. 5：823-827)またはべネズエラウマ脳脊髄炎ウイルス(Pushko (1997) Virology 239：389-401)ベクターから誘導することができる。これらのワクチンは自己複製および自己制御し、そしてRNAまたはDNAのいずれかとして投与され、次いでトランスフェクトした細胞中でまたはin vivoでRNAレプリコンに転写されうる(Berglund (1998) Nat. Biotechnol. 16：562-565)。自己複製RNAは、多様な範囲の細胞型に感染し、高レベルで目的の抗原の発現を可能にする(Huang (1996) Curr. Opin. Biotechnol. 7：531-535)。さらに、ウイルス複製は感染宿主細胞にとって有毒なので、自己複製RNAは最終的にはトランスフェクトした細胞の溶解を引き起こす(Frolov (1996) J. Virol. 70：1182-1190)。従って、これらのベクターには、宿主ゲノムに組み込まれるという裸のDNAワクチンに関連する懸念が生じない。このことは、潜在的に腫瘍形成性であるタンパク質、例えばアデノウイルスE7タンパク質をターゲティングするワクチン開発にとって特に重要である。
【００７８】
一実施形態において、Bredenbeek,前掲およびHerrmann (1998) Biochem. Biophys. Res. Commun. 253：524-531に詳細に記載されるように、自己複製RNAレプリコンはシンドビスウイルス自己複製RNAベクターSINrep5を含む。
【００７９】
ポリペプチド
他の実施形態において、本発明は、第1ドメインがカルレティキュリン(CRT)ポリペプチドを含み；そして第2ドメインがMHCクラスI結合性ペプチドエピトープを含む、少なくとも2種のドメインを含む単離されたまたは組換えポリペプチドに向けられている。上記で述べたように、本発明を実施するために用いる、CRT、ペプチドと結合するCRT断片およびMHCクラスI結合性ペプチドエピトープを含めたポリペプチドを意味する「ポリペプチド」、「タンパク質」および「ペプチド」という用語は、またCRTおよびMHCクラスI結合性ペプチドエピトープに実質的に対応する構造および活性を有する「類似体」もしくは「保存的変異体」および「擬似体」もしくは「ペプチド擬似体」を含めた本発明の組成物を含む。従って、また「保存的変異体」または「類似体」または「擬似体」という用語は、変化がポリペプチドの(保存的変異体の)構造および/または活性(「抗原性」ペプチドとの結合能力、免疫応答の刺激能力)を実質的に改変しないように改変されたアミノ酸配列を有するポリペプチドもしくはペプチドを意味する。これらとしては、アミノ酸配列の保存的な改変変異、すなわちタンパク質活性に重要ではない残基のアミノ酸置換、付加もしくは欠失、あるいはたとえ重要なアミノ酸の置換であっても構造および/または活性を実質的に改変しないような類似の特性(酸性、塩基性、正にもしくは負に荷電した、極性もしくは非極性など)を有する残基を用いたアミノ酸の置換が挙げられる。機能的な類似アミノ酸を提供する保存的置換表は、当技術分野で周知である。例えば、保存的置換を選択するための1つの典型的なガイドラインとしては、(元の残基/置換)：Ala/GlyもしくはSer；Arg/Lys；Asn/GlnもしくはHis；Asp/Glu；Cys/Ser；Gln/Asn；Gly/Asp；Gly/AlaもしくはPro；His/AsnもしくはGln；Ile/LeuもしくはVal；Leu/IleもしくはVal；Lys/ArgもしくはGlnもしくはGlu；Met/LeuもしくはTyrもしくはIle；Phe/MetもしくはLeuもしくはTyr；Ser/Thr；Thr/Ser；Trp/Tyr；Tyr/TrpもしくはPhe；Val/IleもしくはLeuが挙げられる。
【００８０】
別の典型的なガイドラインは、以下の表に示す群を使用する。タンパク質化学および構造の詳細な説明については、Schulz, GEら, Principles of Protein Structure, Springer-Verlag, New York, 1978、およびCreighton, T.E., Proteins：Structure and Molecular Properties, W.H.Freeman & Co., San Francisco, 1983を参照されたい(これらは、参照により本明細書に組み入れられるものとする)。本発明のポリペプチドにおいて行うことができる置換のタイプは、以下の5群のうちの1群内での置換として本明細書で規定する、異なる種の相同タンパク質間のアミノ酸変化の頻度分析に基づくものとすることができる：
上記で丸括弧中の3種のアミノ酸残基は、タンパク質構造において特別な役割を有する。Glyは、側鎖を欠く唯一の残基であり、従って鎖に対して柔軟性を付与する。Proは、その普通でない幾何学的配置のために鎖を厳密に拘束する。Cysは、タンパク質折畳みに重要なジスルフィド結合形成に参加できる。
【００８２】
生化学的、機能的(または免疫学的)特性におけるより実質的な変化は、上記の5群内以外の間などのあまり保存的でない置換を選択することによって行う。そのような変化は、(a)置換領域におけるペプチド主鎖の構造(例えば、シートもしくはらせん配座)、(b)標的部位における分子の電荷もしくは疎水性、または(c)側鎖のかさ(bulk)の維持に及ぼす影響においてより有意に異なるだろう。そのような置換の例としては、(i)別のアミノ酸によるGlyおよび/もしくはProの置換、またはGlyもしくはProの欠失もしくは挿入；(ii)疎水性残基(例えば、Leu、Ile、Phe、ValもしくはAla)に対する(または、による)親水性残基(例えば、SerもしくはThr)の置換；(iii)任意の他の残基に対する(または、による)Cys残基の置換；(iv)電気陰性電荷を有する残基(例えば、GluもしくはAsp)に対する(または、による)電気陽性側鎖を有する残基(例えば、Lys、ArgもしくはHis)の置換；あるいは(v)かさ高い(bulky)側鎖を有さない残基(例えば、Gly)に対する(または、による)かさ高い側鎖を有する残基(例えば、Phe)の置換が挙げられる。
【００８３】
当業者であれば、上記で確認された置換のみが可能な保存的置換ではないことが理解されるだろう。例えば、ある目的で、全ての荷電アミノ酸を、それらが陽性または陰性であろうともお互いに保存的置換とみなすことができる。また、コード配列において単一のアミノ酸または少ない割合のアミノ酸を変える、付加するまたは欠失する個々の置換、欠失または付加により、「保存的な改変変異体」を得ることを考えることができる。
【００８４】
「擬似体」および「ペプチド擬似体」という用語は、本発明の方法における使用が可能なペプチドの必要な構造的および/または機能的特性を有する合成化学化合物を意味し、例えば、ペプチドとMHCクラスIタンパク質との相互作用におけるCRTを模倣するものである。擬似体は、完全にアミノ酸の合成非天然類似体から構成されていても、または部分的には天然アミノ酸および部分的には非天然類似体の組合せであってもよい。また擬似体は、天然アミノ酸保存的置換が実質的に擬似体の構造および/または活性を変えない限り、そのような置換の任意の量を組込むことができる。保存的変異体と同様に、慣例の実験により、擬似体が本発明の範囲内にあるか否か、すなわち擬似体の立体化学的構造および/または機能が実施的に変化していないことが決定されるだろう。ペプチド擬似体は、典型的には以下の3群からの「非天然」構造的構成要素の任意の組合せを含むことができる：(a)天然アミド結合(「ペプチド結合」)以外の残基連結基；（b)天然アミノ酸に置き換わる非天然残基；または(c)二次構造(例えば、βターン、γターン、βシートもしくはαへリックス配座)を誘導もしくは安定させる残基。ポリペプチドは、ポリペプチドの残基の全てもしくは幾つかがペプチド結合以外の化学結合で連結されている場合に擬似体として特性付けることができる。個々のペプチド擬似体残基を、ペプチド結合、他の化学結合またはカップリング手段、例えばグルタルアルデヒド、N-ヒドロキシスクシンイミドエステル、二機能性マレイミド、N,N'-ジシクロヘキシルカルボジイミド(DDC)もしくはN,N'-ジイソプロピルカルボジイミド(DIC)によって連結することができる。ペプチド結合に代わる連結基としては、ケトメチレン(-C(=O)-NH-に代わって-C(=O)-CH2-)、アミノメチレン(CH2-NH)、エチレン、オレフィン(CH=CH)、エーテル(CH2-O)、チオエーテル(CH2-S)、テトラゾール(CN4-)、チアゾール、レトロアミド、チオアミドまたはエステルが挙げられる(Spatola (1983) Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides and Proteins, 第7巻, pp267-357, Peptide Backbone Modifications, Marcell Dekker, NY)。
【００８５】
本発明の擬似体を含めたポリペプチド、ペプチド、他の機能的誘導体の構造は、CRT、好ましくはヒトCRTの構造とアミノ酸配列に基づくものであることが好ましい(McCauliffe (1990) J. Clin. Invest. 86：332-335；Burns (1994) Nature 367：476-480；Coppolino (1998) Int. J. Biochem. Cell Biol. 30：553-558)。ヒトCRTタンパク質(GenBank 登録番号NM 004343)(配列番号２)を以下に示す：
個々の合成残基および擬似体を組込むポリペプチドは、当技術分野で周知の種々の方法および方法論を用いて合成することができる(例えば、Organic Syntheses Collective Volumes, Gilmanら, (dds) John Wiley & Sons, Inc., NY)。また擬似体を組込むポリペプチドを、固相合成方法を用いて作製することもできる(例えば、米国特許第5,422,426号)。また本発明のペプチドおよびペプチド擬似体を、コンビナトリアル方法論を用いて合成することもできる。ペプチドおよびペプチド擬似体ライブラリーの生成に対する様々な技法が周知であり、例えばマルチピン、ティーバッグ(tea bag)およびスプリットカップルミックス(split-couple-mix)技法が挙げられる(al-Obeidi (1998) Mol. Biotechnol. 9：205-223；Hruby (1997) Curr. Opin. Chem. Biol. 1：114-119；Ostergaard (1997) Mol. Divers. 3：17-27；Ostresh (1996) Methods Enzymol. 267：220-234)。さらに改変ポリペプチドおよびペプチドは、化学修飾によって生産することができる(Belousov (1997) Nucleic Acids Res. 25：3440-3444；Frenkel (1995) Free Radic. Biol. Med. 19：373-380；Blommers (1994) Biochemistry 33：7886-7896)。
【００８７】
またペプチドを、従来の化学合成を完全にもしくは部分的に用いて合成することもできる(Caruthers (1980) Nucleic Acids Res. Symp. Ser. 215-223；Horn (1980) Nucleic Acids Res. Symp. Ser. 225-232；Banga, A.K., Therapeutic Peptides and Proteins, Formulation, Processing and Delivery Systems (1995) Technomic Publishing Co., Lancaster, PA)。例えば、ペプチド合成を様々な固相技法(Roberge (1995) Science 269：202；Merrifield (1997) Methods Enzymol. 289：3-13)および自動化合成(例えば、製造業者使用説明書に従いABI 431A ペプチド合成機を使用して)を用いて実施することができる。
【００８８】
本発明の一実施形態において、ペプチド結合性断片またはCRTの「部分配列(sub-sequence)」を用いる。別の実施形態において、MHCタンパク質、好ましくはMHCクラスIタンパク質に結合する他のペプチドを用いる。そのようなペプチドは、任意のポリペプチド、特に公知の病原体から誘導することができ、または完全に合成であることができる。ペプチドがCRTもしくはCRT断片またはMHCタンパク質に結合するか否か、そしてどの程度結合するかを決定する方法は、当技術分野で慣例である(Jensen (1999) Immunol. Rev. 172：229-238；Zhang (1998) J. Mol. Biol. 281：929-947；Morgan (1997) Protein Sci 6：1771-1773；Fugger (1996) Mol. Med. 2：181-188；Sette (1994) Mol. Immunol. 31：813-822；Elvin (1993) J. Immunol. Methods 158：161-171；米国特許第6,048,530号；第6,037,135号；第6,033,669号；第6,007,820号)。
【００８９】
医薬組成物の製剤化および投与
本発明の様々な実施形態において、ポリペプチド、核酸、発現カセット、細胞および粒子を薬理学的組成物として個体に、個体において抗原特異的免疫応答(例えばCTL応答、下記の実施例を参照されたい)を誘導するのに十分な量で投与する。
【００９０】
核酸、ペプチドおよびポリペプチドのための製薬上許容される担体および製剤は、当業者には公知であり、科学文献および特許文献に詳細に記載されている。例えば、Remington's Pharmaceutical Science, Maack Publishing Company, Easton, PA(「Remington's」)の最新版;Banga；Putney (1998) Nat. Biotechnol. 16：153-157；Patton (1998) Biotechniques 16：141-143；Edwards (1997) Science 276：1868-1871；米国特許第5,780,431号；第5,770,700号；第5,770,201号を参照されたい。
【００９１】
本発明の方法に使用する核酸およびポリペプチドを、単独で、または医薬組成物として、当技術分野で公知の任意の手段、例えば全身、局所または局部に；動脈内、髄腔内(IT)、静脈内(IV)、非経口、胸膜腔内、局所、経口または局部投与によって、皮下、気管内(例えば、エアロゾルによって)または経粘膜(transmucosal)(例えば、頬側粘膜、膀胱粘膜、膣粘膜、子宮粘膜、直腸粘膜、鼻粘膜)のように送達することができる。実際の組成物の送達方法は、当業者には公知であるかまたは明らかであろうし、科学文献および特許文献に詳細に記載されている。例えば、Remington'sを参照されたい。
【００９２】
医薬組成物は、任意のプロトコールによって、そして投与の方法および経路および頻度、他の薬物を投与しているか否か、個体の応答などに応じて種々の単位剤形で投与することができる。典型的な核酸、ペプチドおよびポリペプチド医薬組成物の用量は、当業者には周知である。そのような用量は、種々の要因、例えば、初期応答(例えば、誘導されたCTLの数および活性、腫瘍縮小など)、特定の治療状況、患者の健康状態および耐性に応じて調節することができる。所望の応答を誘導するのに十分な医薬組成物量は、「治療上有効な用量」として規定される。投薬計画およびこの使用に有効な量、すなわち「投薬処方計画」は、種々の要因(例えば、免疫感作によって治療または予防される疾患または症状、患者の健康状態の一般的状態、患者の身体的状態、年齢、医薬製剤および医薬組成物の濃度などが挙げられる)に依存するだろう。また、投薬処方計画は、薬物動力学、すなわち医薬組成物の吸収速度、生物学的利用能、代謝、クリアランスなどを考慮する(Remington)。用量は、経験的に、例えば症状の寛解もしくは改善を評価することによって、または客観的な基準、例えば抗原特異的CTLレベルを測定することによって決定することができる。上記で述べたように、単一もしくは複数回の投与は、患者に必要であり、かつ許容される用量および頻度に応じて投与することができる。医薬組成物は、単独でまたは他の治療的処置と一緒に、あるいは予防的免疫感作として投与することができる。
【００９３】
APC の ex vivo 処置および再投与
本発明の様々な実施形態において、本発明の核酸およびポリペプチドを個体に、抗原提示細胞(APC)をex vivoで処置した後、操作されたAPCを投与することによって導入する。一実施形態において、APCを本発明の融合タンパク質コード核酸で形質導入(トランスフェクト)するかまたは感染させ；その後、APCを個体に投与する。別の実施形態において、APCを本発明の融合タンパク質(精製したもの、またはトランスフェクトし、in vivoで組換え融合タンパク質を発現する細胞からの細胞溶解物として)で刺激する。この「パルス」後に、APCを個体に投与する。
【００９４】
融合タンパク質は、例えば精製もしくは合成ポリペプチド、粗細胞溶解物(組換え融合タンパク質を作製するトランスフェクト細胞由来)などのようないずれの形態であってもよい。APCは、MHC適合(MHC-matched)細胞(組織タイピングした(tissue-typed)細胞)であってよい。APCは、組織培養細胞であっても、または治療しようとする個体から単離され、かつex vivo刺激後に再投与されるAPCであってもよい。上記のようにいずれのAPCも使用できる。APCの単離方法、培養におけるex vivo処置方法および再投与方法は、当技術分野で周知である(米国特許第5,192,537号；第5,665,350号；第5,728,388号；第5,888,705号；第5,962,320号；第6,017,527号；第6,027,488号)。
【００９５】
キット
本発明は、本発明の方法を実施するための上記の本発明の医薬組成物を含むキットを提供する。別の実施形態において、キットは、ERシャペロンポリペプチドを含む第1ドメインと抗原性ペプチドを含む第2ドメインとを含む組換えもしくは合成キメラポリペプチド(例えば、CRT-クラスI結合性ペプチドエピトープ融合タンパク質)；または例えば裸のDNA(例えばプラスミド)、ウイルス(例えばシンドビスウイルスレプリコンを含むアルファウイルスに由来する「レプリコン」)などの形態にある上記キメラポリペプチドをコードする核酸を含むことができる。キットは、方法論を教示する説明的な資料、例えば本発明を実施するために使用する組成物の投与手段、細胞または患者または動物に本発明の核酸もしくはポリペプチドを注射または感染させるための手段、得られた免疫応答をモニターし、組成物を投与した個体の応答を評価するための手段などを含むことができる。
【００９６】
本明細書で説明する実施例および実施形態は、単に説明を目的にするものであり、その観点において様々な改変と変更は当業者には示唆されるだろうし、そしてこの出願の精神および権限ならびに添付の特許請求の範囲の範囲内に含まれるべきであることは理解される。
【００９７】
実施例
以下の実施例は、請求される発明を限定するのではなく、説明するために提供される。
【００９８】
実施例１
CRT- クラス I 結合性ペプチドエピトープの投与は抗原特異的細胞傷害性 T リンパ球 (CTL) 応答の発生を増強する
以下の実施例は、本発明の組成物および方法が抗原特異的細胞傷害性Tリンパ球(CTL)応答を増強することに有効であることを実証する研究を説明する。
【００９９】
これらの研究は、カルレティキュリン(CRT)とクラスIポリペプチド結合性ペプチドエピトープの双方を含む融合タンパク質のコード配列を含むDNAワクチンを使用した。この場合、エピトープはモデル抗原、ヒトパピローマウイルス-16 E7ポリペプチド(HPV-16 E7)であった。E7特異的免疫応答によって媒介される抗腫瘍効果およびワクチン接種したマウスにおけるワクチン刺激抗脈管形成効果を評価した。キメラカルレティキュリン/E7(CRT/E7)融合遺伝子を含むDNAワクチンで皮内にワクチン接種したC57BL/6マウスは、野生型E7もしくはCRT遺伝子を単独で含むDNAワクチンと比較して、E7特異的CD8+T細胞(CTL)前駆体の劇的な増大、腫瘍防御および腫瘍処置を示した。さらに、CRT DNAまたはキメラCRT/E7 DNAのいずれかを用いたC57BL/6もしくはヌードマウスにより、肺転移性結節が低減され、そして肺結節内の脈管形成が阻害された。これらの結果は、抗原遺伝子へのCRT遺伝子の連結はDNAワクチンの効力を大いに増強し、抗原特異的CD8+T細胞(CTL)免疫応答と抗脈管形成効果の双方の有意な増強を介して抗腫瘍効果を引き出すことができることを示すものである。
【０１００】
プラスミド DNA 構築物および調製：
HPV-16 E7発現pcDNA3プラスミドの生成は、Chen (2000) Cancer Res. 60：1035-1042に記載のように行われた。また、Chen (2000) Vaccine 18：2015-2022；Ji (1999) Hum. Gene Ther. 10：2727-2740；Chen (1999) Gene Ther. 6：1972-1981；Ji (1998) Int. J. Cancer 78：41-45を参照されたい。また、例えばSeedorf (1987) EMBO J. 6：139-144；米国特許第5,629,161号；第5,501,947号；第5,547,846号；第5,180,806号；第4,777,239号を参照されたい。完全HPV-16ゲノムおよび以下の配列（配列番号５）：
【０１０１】
ウサギカルレティキュリン(ウサギ、ヒト、マウスおよびラットカルレティキュリンの間には90％を上回る相同性がある)の全長をコードするプラスミド、pcDNA3-CRTの生成においては、まずこのタンパク質をコードするDNA断片を、Chen (2000) Cancer Res.,前掲に記載の条件を用いたPCRで、ウサギカルレティキュリンcDNA鋳型(Michalak (1999) Biochem J. 344 Pt2：281-292)(Marek Michalak博士(University of Alberta, Edmonton, Canada)によって提供された)ならびにプライマーセット：5'-ccggtctagaatgctgctccctgtgccgct-3'(配列番号６)および5'-ccggagatctcagctcgtccttggcctggc-3'(配列番号７)を用いて増幅した。次いで増幅産物を制限消化酵素XbaIおよびBamHIで消化し、さらにpcDNA3ベクター(Invitrogen, Carlsbad, CA)のXbaIおよびBamHIクローニング部位にクローニングした。pcDNA3-CRT/E7の生成においては、E7 DNAを、DNA鋳型としてpcDNA3-E7ならびにプライマーセット：5'-ggggaattcatggagatacaccta-3'(配列番号７)および5'-ggtggatccttgagaacagatgg-3'(配列番号８)を用いたPCRによって増幅した。次いで増幅E7 DNA断片をBamHIで消化し、さらにpcDNA3-CRTベクターのBamHIクローニング部位にクローニングした。これらの構築物の配向と精度をDNA配列決定分析によって確認した。
【０１０２】
CRT、E7またはCRT/E7遺伝子インサートを有するプラスミドDNAおよび「空の」プラスミドベクターを、サブクローニング効率のよいDH5（商標）細胞(Life Technologies, USA)にトランスフェクトした。次いで、DNAを増幅し、二重CsCl精製(BioServe Biotechnologies, Laurel, MD)を用いて精製した。各調製物中のプラスミドDNAの完全性および大腸菌(Escherichia coli)DNAもしくはRNAの不在を、1％のアガロースゲル電気泳動を用いてチェックした。DNA濃度を、260nmで測定する光学密度で決定した。挿入されたE7断片の存在を、制限酵素消化およびゲル電気泳動によって確認した。
【０１０３】
細胞系：
TC-1細胞の生産と維持は、Lin (1996) Cancer Res. 56：21-26に記載のように行われた。腫瘍チャレンジ(challenge)の日に、TC-1細胞をトリプシン処理によって回収し、1X Hanks緩衝塩溶液(HBSS)で2回洗浄し、最後に1X HBSS中に再懸濁して、指定された注射用濃度にした。DbおよびKbを発現するヒト胎児腎293細胞系(293 Db,Kb)(Bloom (1997) J. Exp. Med. 185：453-459)は、JC Yang博士(NCI, NIH, Bethesda, MD)によって提供された。この細胞系は、10％の熱非働化ウシ胎児血清、0.3％のグルタミン、0.01M HEPES、100U/mlペニシリン、G418 100μgを含有するDMEM培地中で増殖した。
【０１０４】
マウス：
6〜8週齢のメスC57BL/6マウスをNational Cancer Institute(Frederick, MD)から購入し、Johns Hopkins Hospital(Baltimore, MD)の腫瘍学動物施設で飼育した。抗脈管形成効果を特性付けるために、免疫エフェクター不在におけるin vivo 腫瘍処置実験を、National Cancer Institute(Frederick, MD)からのBALB/c nu/nu 6週齢メスマウスを用いて実施した。全ての動物手順は、認可されたプロトコールおよび実験室動物の適切な使用と注意についての推奨に従って実施した。
【０１０５】
DNA ワクチン接種：
DNAコーティング金粒子の調製および遺伝子銃粒子媒介DNAワクチン接種を、ヘリウム駆動遺伝子銃(Bio-Rad, Hercules, CA)を用いてChen (2000) Cancer Res.,前掲の記載に従って実施した。簡単に言えば、DNAコーティング金粒子(DNA 1もしくは4μg/弾丸)を、約400p.s.i.の発射圧でヘリウム駆動遺伝子銃を用いてマウスの毛を剃り落とした腹部領域に送達した。
【０１０６】
細胞質内サイトカイン染色およびフローサイトメトリー分析：
無傷のマウス群またはワクチン接種したマウス群を、E7特異的CD8+T細胞前駆体を検出するためにMHCクラスIエピトープを含むE7ペプチド(アミノ酸(aa)49-57残基)(Feltkamp (1993) Eur. J. Immunol. 23：2242-2249)とともにインキュベートするか、またはE7特異的CD4+Tヘルパー細胞前駆体を検出するためにMHCクラスIIペプチドを含むE7ペプチド(aa30-67)(Tindle (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88：5887-5891)とともにインキュベートした。E7ペプチドは、aa49-57については1μg/mlの濃度で、そしてaa30-67については10μg/mlの濃度で20時間添加された。Golgistop（商標）(Pharmigen, San Diego, CA)を培養物から細胞を回収する6時間前に添加した。次いで細胞をFACScan（商標）バッファー中で1回洗浄して、フィコエリトリン(PE)-コンジュゲートモノクローナルラット抗マウスCD8もしくはCD4抗体(PharMingen, San Diego, CA)で染色した。細胞を、製造業者の使用説明書(PharMingen)に従ってCytofix/Cytoperm（商標）キットを用いて細胞内サイトカイン染色に供した。FITC-コンジュゲート抗IFN-γおよび抗IL-4抗体ならびに免疫グロブリンアイソタイプ対照抗体(ラットIgG1)は、全てPharMingenから購入した。フローサイトメトリー分析は、CELLQuest（商標）ソフトウエアを用いるBecton Dickinson FACScan（商標）(Becton Dickinson Immunocytometry System, Mountain View, CA)において行った。
【０１０７】
抗 E7 抗体に対する ELISA ：
血清中の抗HPV 16 E7抗体を、Wu (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92：11671-11675に記載のように直接的ELISAによって測定した。簡単に言えば、96マイクロウエルプレートを、10.5μg/mlの細菌に由来するHPV-16 E7タンパク質でコーティングし、40℃で一晩インキュベートした。次いで、ウエルを20％のウシ胎児血清を含有するPBSでブロッキングした。血清を、免疫感作後14日目にマウスから調製し、1X PBS中に連続希釈し、ELISAウエルに添加し、37℃で2時間インキュベートした。0.05％のTween-20を含有する1X PBSで洗浄した後、プレートをペルオキシダーゼ-コンジュゲートウサギ抗マウスIgG抗体(Zymed, San Francisco, CA)の1/2000希釈物で室温(RT)で1時間インキュベートした。プレートを6回洗浄し、TMB(Pierce, Rockford, IL)で顕色し、1M H2SO4で停止させた。ELISAプレートを、標準的ELISAリーダーを用いて450nmで読み取った。
【０１０８】
in vivo 腫瘍防御実験：
腫瘍防御実験において、マウス(1群あたり5匹)に2μgのCRT DNA、E7 DNA、CRT/E7 DNAを遺伝子銃を介してワクチン接種するか、またはワクチン接種しなかった。1週間後、マウスを最初のワクチン接種と同じ処方計画で追加免疫した。最後のワクチン接種の1週間後、マウスを、右脚中に5 x 104 TC-1細胞/マウスで皮下にチャレンジした。マウスを60日目に屠殺するまで、マウスを1週間に2回、触診と検査で腫瘍増殖の形跡についてモニターした。
【０１０９】
in vivo 腫瘍処置実験：
C57BL/6マウス(各群5匹)を、0日目に尾静脈を介して1 x 104細胞/マウスのTC-1腫瘍細胞で静脈内にチャレンジした。TC-1腫瘍細胞を用いたチャレンジの3日後に、マウスに遺伝子銃を介して2μgのCRT DNA、E7 DNA、CRT/E7 DNAを与えるか、またはワクチン接種しなかった。1週間後、これらのマウスを最初のワクチン接種と同じ処方計画で追加免疫した。マウスを1週間に2回モニターし、21日目に屠殺した。各マウスの肺転移性結節数は、サンプルの正体が分からない実験者によって評価および計数された。
【０１１０】
ヌード(BALB/c nu/nu)マウス(各群5匹)を、0日目に尾静脈を介して1 x 104細胞/マウスのTC-1腫瘍細胞で静脈内にチャレンジした。TC-1腫瘍細胞を用いたチャレンジの2日(D2)後に、マウスに遺伝子銃を介して16μgのCRT DNA、E7 DNA、CRT/E7 DNAまたはインサートを含まない空のプラスミドを与えた。9日目と16日目に、これらのマウスを最初のワクチン接種と同じ処方計画で追加免疫した。マウスを21日目に屠殺した。各マウスの肺結節は、サンプルの正体が分からない実験者によって評価および計数された。
【０１１１】
in vivo 抗体枯渇実験：
in vivo抗体枯渇は、Lin (1996) Cancer Res. 56：21-26に記載のように行われた。簡単に言えば、マウスを遺伝子銃を介してCRT/E7 DNA 2μgでワクチン接種し、1週間後に追加免疫し、5 x 104細胞/マウスのTC-1腫瘍細胞でチャレンジした。腫瘍チャレンジの1週間前に枯渇を開始させた。MAb GK1.5(Dialynas (1983) Immunol. Rev. 74：29-56)をCD4枯渇に使用し、MAb 2.43(Sarmiento (1980) J. Immunol. 125：2665)をCD8枯渇に使用し、そしてMAb PK136(Koo (1986) J. Immunol. 137：3742-3747)をNK1.1枯渇に使用した。フローサイトメトリー分析により、適切なリンパ球サブセットの＞99％が枯渇され、一方、他のサブセットの正常レベルが維持されたことが明らかとなった。
【０１１２】
樹状細胞の生成：
樹状細胞(DC)を、Fernandez (1999) Nat. Med. 5：405-411に記載のようにGM-CSFの存在下で骨髄細胞を培養することによって生成した。簡単に言えば、骨髄をマウスの大腿骨および脛骨から回収した。赤血球を溶解し、残りの細胞をナイロンメッシュを通過させることで小片の骨およびデブリを除去した。細胞を回収し、そして1 X 106細胞/mlを、5％のFCS、2mM メルカプトエタノール、1％の非必須アミノ酸、100U/mlペニシリンおよび100g/mlストレプトマイシン(Life Technologies, Rockville, MD)および100U/ml GM-CSF(PharMingen, San Diego, CA)を補足したRMPI 1640を含む24ウエルプレートに配置した。培地の3/2を2日ごとに入れ替え、非接着細胞を7日目に回収した。回収した細胞を、すでに記載したようにDCマーカーについてのフローサイトメトリー分析を用いて特性付けた(25)。
【０１１３】
E7 特異的 CD8+T 細胞系の生成：
E7特異的CD8+細胞系を、ワクシニアE7発現ベクター(Ji (1999) Hum. Gene Ther. 10：2727-2740に論じられているように、リソソーム関連膜タンパク質1(LAMP-1)コード配列をHPV-E7コード配列に融合させてSig/E7/LAMP-1と呼ばれるキメラDNAを構築した)の腹腔内注射によってメスC57BL/6(H-2b)マウスを免疫感作することによって生成した。脾細胞を8日目に回収した。最初のin vitro刺激については、脾細胞を20U/ml濃度のIL-2および1 TM E7ペプチド(配列番号４のアミノ酸49-57)で6日間パルスした。E7特異的CTL細胞系の増殖を、E7特異的CTLを含む1 x 106脾細胞と3 x 106の放射線照射した(irradiated)脾細胞とを混合し(2ml/ウエル)、それらに20U/ml濃度のIL-2および1 TM E7ペプチド(アミノ酸49-57)をパルスすることによって、24ウエルプレート中で実施した。この方法を6日ごとに繰り返した。E7CTL系の特異性を、CTLアッセイによって特性付けた。フローサイトメトリーを実施して、CD8マーカーの発現を示した。
【０１１４】
トランスフェクトした 293D b K b 細胞を標的細胞として用いた CTL アッセイ：
CTLアッセイを、Corr (1999) J. Immunol. 163：4721-4727に記載のように96ウエル丸底プレート中で実施した。細胞溶解を、乳酸脱水素酵素(LDH)の定量的測定によって測定した。トランスフェクトした293DbKb細胞を標的細胞として用い、一方、E7特異的CD8+T細胞はエフェクター細胞として機能した。5 x 106の293DbKb細胞を20TgのpcDNA3(空のプラスミド)、E7、CRTもしくはCRT/E7 DNAワクチンで、製造業者のプロトコールに従いリポフェクタミン2000（商標）(Life Technologies, Rockville, MD)を介してトランスフェクトした。293DbKb細胞をトランスフェクションの40〜44時間後に回収した。ELISAによって測定されるE7タンパク質発現のレベルは、E7およびCRT/E7でトランスフェクトした293DbKbにおいて類似していた。CTLアッセイを、様々な比率(1：1、3：1、9：1および27：1)で一緒に混合したエフェクター細胞と標的細胞(ウエルあたり1 x 104)を用いて最終容量200Tl中で実施した。37℃で5時間のインキュベーション後、培養培地を回収し、製造業者のプロトコールに従いCytoTox（商標）アッセイキット(Promega, Madison, WI)を用いて培養培地中のLDH量を評価した。溶解の割合を以下の等式から計算した：100 X (A-B)/(C-D)(式中、Aは実験のエフェクターシグナル値の読み取り値(reading)であり、Bはエフェクターの自発的なバックグラウンドシグナル値であり、Cは標的細胞からの最大シグナル値であり、Dは標的の自発的なバックグラウンドシグナル値である)。
【０１１５】
トランスフェクトした 293 細胞の溶解物をパルスした DC を標的細胞として用いた CTL アッセイ：
細胞溶解物をパルスした樹状細胞(DC)を標的細胞として用いたCTLアッセイを、Uger (1998) J. Immunol. 160：1598-1605に記載のプロトコールに類似したプロトコールを用いて実施した。簡単に言えば、まず5 x 106の293DbKb細胞を20TgのpcDNA3(空のプラスミド)、E7、CRTもしくはCRT/E7 DNAワクチンで、製造業者のプロトコールに従いリポフェクタミン2000（商標）(Life Technologies, Rockville, MD)を介してトランスフェクトした。トランスフェクトした293DbKb細胞をトランスフェクションの40〜44時間後に回収し、次いで3サイクルの凍結融解で処理した。タンパク質濃度は、販売業者のプロトコールに従いBioRadプロテインアッセイ(Bio-Rad, Hercules, CA)を用いて測定された。E7タンパク質量をELISAを用いて測定し、E7もしくはCRT/E7 DNAでトランスフェクトした293DbKb細胞に由来する細胞溶解物をE7タンパク質濃度について標準化した。DCを標的細胞として用い、100万個のDCに様々な濃度の細胞溶解物(50Tg/ml、10Tg/ml、2Tg/mlおよび0.4Tg/ml)を最終容量2ml中で16〜20時間パルスすることで調製した。E7特異的CD8+T細胞をエフェクター細胞として用いた。CTLアッセイを、E/T(9/1)の比率を固定して1 x 104の調製したDCと混合した9 x 104のE7特異的T細胞を用いて最終容量200Tl中で実施した。細胞溶解を、上記で記載したようにLDHの定量的測定によって測定した。
【０１１６】
組織学的および免疫組織化学的研究：
ワクチン接種したマウス由来の肺結節のパラフィンブロックを作製し、6Tmの切片に切断し、脱パラフィン化した。ヘマトキシリンおよびエオシン染色を、慣例の光学顕微鏡検査について実施し、未染色の切片を免疫組織化学的研究のために調製した。マウス抗CD31モノクローナル抗体(DAKO, Capinteria, CA)を、腫瘍内微小血管の検出に用いた。免疫組織化学的染色を、Huang (1999) Hum. Pathol. 30：587-591に記載のプロトコールを用いて双方の検体に由来する切片において実施した。微小血管密度(MVD)を、Cheng (1999) Cancer 85：651-657に記載のように測定した。簡単に言えば、染色したスライドを低い倍率(40x および100xの合計倍率)で検査し、各腫瘍中で最も高い新生血管形成領域(いわゆるホットスポット(hotspot))を同定した。各切片において、3ヶ所の最も血管新生した領域を選択した。微小血管計数は、200x倍率(20x対物レンズおよび10x接眼レンズ(Olympus BH-2顕微鏡)、接眼ミクロメーターで測定した視野サイズが視野あたり0.74mm2)で得られ、各腫瘍について3ヶ所の視野の平均数を計算して、微小血管密度(MVD)計数と呼んだ。適当な8個の血液細胞よりも大きい厚い筋肉壁および内腔を有する大血管を、計数から除外した。全ての測定は、サンプルの正体が分からない1人の病理学者によって実施された。
【０１１７】
CRT/E7 融合 DNA ワクチンの生成と特性付け：
カルレティキュリン(CRT)、E7およびカルレティキュリン/E7(CRT/E7)の構築物の概略図を図１に示す。全ての構築物は、DNA配列決定分析によって確認されている。E7含有構築物中のE7タンパク質の発現を示すために、様々なE7含有DNA構築物でトランスフェクトした293DbKb細胞の溶解物を用いたウエスタンブロット分析を実施した。野生型E7でトランスフェクトした293DbKb細胞は、HPV-16 E7に対応する30kDバンドを示した。加えて、CRT/E7でトランスフェクトした293DbKb細胞は、キメラCRT/E7タンパク質に対応するバンドを示した。陰性対照である、カルレティキュリンまたは空のプラスミドでトランスフェクトした293DbKbにおいては、目に見えるバンドは全く観察されなかった。
【０１１８】
CRT/E7 融合 DNA を用いたワクチン接種は E7 特異的 CD8+T 細胞数を有意に増強する：
CD8+Tリンパ球(CTL)は、抗腫瘍免疫の誘導において最も重要なエフェクターの1つである。本発明のCRT/E7 DNAワクチンのin vivo投与(マウスに対して)後に誘導されるE7特異的CD8+T細胞前駆体の量を決定するために、細胞内サイトカイン染色を、Ji (1999) Human Gene Therapy 10：2727-2740に記載のように使用した。細胞内サイトカイン染色は、単一細胞レベルでIFN-γ(IFN-K)産生を測定するために用いられる感度の高い機能的アッセイであり、従ってこれを適用して抗原特異的CD8+T細胞を定量化することができる。フローサイトメトリー分析(上記で論じたように実施)の結果を図２Aに二次元ヒストグラムで示す。図２Bに要約したように、CRT/E7 DNAでワクチン接種したマウスは、最も高い数のE7特異的IFN-γ発現/CD8+T細胞前駆体(204/3.5 x 105脾細胞)を誘導したが、E7 DNAでワクチン接種したマウスは、より少ない前駆体(47/3.5 x 105脾細胞)しか誘導しなかった(p<0.01)。CRT/E7キメラ構築物の免疫感作により、E7特異的CD8+T細胞前駆体数が5倍増大した。またこれらの結果より、2種のベクター(E7のみを発現するベクターと混合したCRTのみを発現するベクター)(図２Bにおける「CRT+E7」)を用いたワクチン接種はCD8+T細胞活性の増強を誘導しなかったので、CRTへのE7の融合(すなわち、融合タンパク質としての発現)がCD8+T細胞活性の増強には必要であることが示された。
【０１１９】
CRT/E7 融合 DNA を用いたワクチン接種は E7 特異的 CD4+T 細胞媒介免疫応答を増強しない：
これらの各ワクチンによって誘導されるE7特異的CD4+(「ヘルパー」)T前駆体細胞の生成およびサイトカインプロフィールを検査するために、本発明者らは免疫感作したマウス由来の脾細胞におけるCD4表面マーカーおよび細胞内IFN-K+に対する二重染色を実施し、次いでフローサイトメトリー分析を行った。免疫感作したマウス由来の脾細胞を、in vitroでE7ペプチド(aa30-67)とともに一晩培養し、CD4および細胞内IFN-K+の双方について染色した。E7ペプチド(aa30-67)は、HPV-16のE7オープンリーディングフレームタンパク質中の主要なTヘルパーエピトープを含む(Tindle (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88：5887-5891)。IFN-K+分泌CD4+T細胞の割合を、フローサイトメトリーを用いて分析した。CRT/E7キメラ構築物でワクチン接種したマウスは、野生型E7 DNA(25/3.5 x 105脾細胞 対 20/3.5 x 105脾細胞、p>0.05)または他のDNA群でワクチン接種したマウスと比較して、類似のCD4+IFNK+二重陽性細胞数を誘導した。フローサイトメトリー染色を用いて観察されたE7特異的CD4+IFNK+細胞数に、無傷のマウスまたは空のプラスミド、CRT、E7、CRT+E7もしくはCRT/E7構築物でワクチン接種したマウスの間に有意な差異はなかった。
【０１２０】
また様々なDNAワクチンでワクチン接種したマウス中のIL-4分泌性E7特異的CD4+T細胞数を評価した。IL-4分泌活性化マウス脾細胞(MiCK-2（商標）、PharMingen, San Diego, CA)を陽性対照として使用し、この研究における細胞内IL-4染色の成功を確認した。IL-4染色の特異性を、IL-4抗体を除いた場合のCD4+IL-4+T細胞の不在によって示した。CRT/E7、CRT、野生型E7 DNA、プラスミドDNAでワクチン接種したマウスまたはワクチン接種していない無傷のマウスにおいて、有意なCD4+IL-4+二重陽性細胞は同定されなかった。さらに、異なるワクチン接種群に由来するIL-4分泌CD4+IL-4+T細胞の頻度に有意な変化は観察されなかった。
【０１２１】
CRT/E7 を用いたワクチン接種はより高い力価の E7 特異的抗体を誘導した：
ワクチン接種したマウスの血清中の抗HPV 16 E7抗体量を、最後のワクチン接種の2週間後に直接的ELISAによって測定した。図３に示すように、CRT/E7ワクチン接種群は、他のワクチン接種群と比較してマウス血清中において最も高い力価の抗E7抗体を誘導した(P<0.01)。この結果より、本発明のCRT/E7キメラ構築物で接種したマウスは有意により高いE7特異的抗体応答を誘導したことが示された。
【０１２２】
CRT/E7 キメラ構築物を用いたワクチン接種は TC-1 腫瘍の増殖に対するマウスの防御を増強する：
様々なDNAワクチン構築物を用いたワクチン接種はE7発現腫瘍に対してマウスを防御するか否かを決定するために、in vivo腫瘍防御実験を実施した。マウスを、遺伝子銃を介して裸のDNA 2Tg/マウスでワクチン接種し、1週間後に同じ用量で追加免疫した。次いで、最後のワクチン接種の7日後にマウスを、右脚中に5 x 104 TC-1/マウスで皮下にチャレンジした。図４に示すように、CRT/E7キメラ構築物ワクチン接種を受けたマウスの100％が、TC-1チャレンジの60日後に腫瘍のない状態のままであった。それに反して、ワクチン接種していないマウスおよび空のプラスミド、CRT、野生型E7もしくは野生型E7+CRT DNAを受けたマウスの全てが、腫瘍チャレンジ後15日以内に腫瘍増殖を生じた。またこれらの結果より、E7のみを発現する構築物と混合したカルレティキュリンのみを発現する構築物(図４における「CRT+E7」)は抗腫瘍免疫の増強を誘導しなかったので、カルレティキュリンへのE7の融合が抗腫瘍免疫には必要であったことが示された。従って、本発明のCRT/E7キメラ構築物は、TC-1腫瘍の増殖に対する防御を有意に増強した。
【０１２３】
CRT/E7 キメラ構築物を用いたワクチン接種は肺において確立される E7 発現腫瘍を根絶する：
肺のTC-1腫瘍転移の処置においてキメラCRT/E7 DNA構築物の治療的潜在性を決定するために、まずC57BL/6マウスを、静脈内尾静脈注射を介してマウス1匹あたり1 x 104のTC-1腫瘍細胞でチャレンジした(肺転移モデル)(Ji (1998) Int. J. Cancer 78：41-45)。次いで、マウスを7日後に遺伝子銃を介して裸のDNA 2Tgで処置し、1週間後に同じ用量で追加免疫した。次いで、マウスを腫瘍チャレンジの30日後に屠殺した。図５に示すように、CRT/E7キメラ構築物でワクチン接種したマウスは、野生型E7 DNAのみ(77.6+9.8)またはカルレティキュリンDNAのみ(26.4+4.9)でワクチン接種したマウスと比較して肺結節の最も低い平均数(4.0+1.6)を示した(one-way ANOVA, P<0.001)。データは、肺転移性腫瘍結節の平均数+SEMとして表している。興味深いことに、野生型カルレティキュリンDNAでワクチン接種したマウスは、野生型E7 DNAを受けたマウスまたはワクチン接種を受けていないマウスよりも低い結節の平均数を示した(one-way ANOVA, P<0.001)。CRT単独でワクチン接種したマウスはE7特異的T細胞免疫応答を誘導しなかったので、CRT単独で観察された治療的効果(肺転移性結節のより低い数)は、CRT媒介抗脈管形成効果によって引き起こされたものでありうる。
【０１２４】
CD4+T 細胞もしくは NK 細胞ではなく、 CD8+T 細胞が本発明の CRT/E7 キメラ DNA ワクチンによって誘導される抗腫瘍効果に必須である：
E7陽性腫瘍細胞の排除に重要なリンパ球サブセットを決定するために、本発明者らは、in vivo抗体枯渇実験を実施した。リンパ球サブセットの枯渇を、腫瘍注入の日およびその後毎週、脾細胞のフローサイトメトリー分析によって評価した。適切なサブセットの99％を上回る枯渇が達成され、他のリンパ球サブセットは正常レベルであった。全ての無傷のマウスおよびCD8+T細胞を枯渇した全てのマウスにおいて、腫瘍チャレンジ後の約14日以内に腫瘍が増殖した。それに反して、枯渇していない全てのマウスおよびCD4+T細胞もしくはNK1.1細胞を枯渇した全てのマウスが腫瘍チャレンジの60日後に腫瘍のない状態のままであった。これらの結果は、CD8+T細胞が本発明のCRT/E7キメラワクチンによって誘導される抗腫瘍免疫に必須であることを示すものである。
【０１２５】
CRT/E7 DNA でトランスフェクトした細胞における MHC クラス I 経路を介した E7 の提示の増強：
上記で論じたように、本発明のCRT/E7キメラ構築物でワクチン接種したマウスは、最も高い数のE7特異的CD8+T細胞前駆体を誘導した。この効果の原因となる機構を決定するために、標的細胞においてE7のMHCクラスI提示の増強が存在するか否かを決定した。この場合、標的細胞は、CRT/E7融合タンパク質コードキメラDNAでトランスフェクトしたDbとKbとを発現するヒト胎児腎293細胞であった。エフェクター細胞としてDb制限E7特異的CD8+T細胞を用いたCTLアッセイを用いて、CRT/E7構築物でトランスフェクトした標的細胞(293DbKb細胞)は、野生型E7のみでトランスフェクトした293DbKb細胞よりも効果的に死滅されうるか否かを決定した。293DbKb細胞は安定したトランスフェクション効率を有することが示されいるが、樹状細胞はin vivoで容易にはトランスフェクトされないので、293DbKb細胞を標的細胞として用いた。さらに、293DbKb細胞におけるE7発現レベルは、様々なE7含有DNA構築物でトランスフェクトした細胞間で類似している。CTLアッセイを、無傷の293DbKb細胞および空のプラスミド、CRT、E7もしくはキメラCRT/E7 DNAでトランスフェクトした293DbKb細胞を用いて、E7特異的T細胞系を用いる様々なエフェクター/標的(E/T)比率(1：1、3：1、9：1、27：1)で実施した。図６に示すように、CRT/E7 DNAでトランスフェクトした293DbKb細胞は、野生型E7 DNAワクチンのみでワクチン接種したマウスと比較して、9：1(20.5+1.0％ 対 10.43+0.9％、P<0.001)および27：1(47.1+5.5％ 対 15.1+3.0％、P<0.001)のE/T比率で有意により高い割合の特異的溶解を誘導した。これらの結果より、本発明のキメラCRT/E7構築物でトランスフェクトした細胞は、野生型E7 DNAでトランスフェクトした細胞よりも効率的な方法でMHCクラスI経路を介して「直接的プライミング」を経てE7抗原を提示することができたことが示された。
【０１２６】
キメラ CRT/E7 タンパク質をパルスした樹状細胞における MHC クラス I 経路を介した E7 の提示の増強：
in vivoでE7特異的CD8+T細胞免疫応答を増強する別の潜在的な機構は、様々なDNA構築物を発現する溶解した細胞の取込みを介して、抗原提示細胞によるMHCクラスI経路を介したE7の提示であり、「クロスプライミング」とも呼ばれる。クロスプライミング実験は、空のプラスミド、カルレティキュリン、E7もしくはCRT/E7 DNAでトランスフェクトした293DbKb細胞の細胞溶解物をパルスした樹状細胞におけるE7のMHCクラスI提示を特性付けるために実施された。E7特異的CD8+T細胞は、エフェクター細胞として機能した。既に述べたように、293DbKb細胞は安定したトランスフェクション効率、および様々なE7含有DNA構築物でトランスフェクトした細胞間で類似したE7発現を有することが示された。トランスフェクトした293DbKb細胞の溶解物を、凍結融解のサイクルから得た。骨髄由来DCに、トランスフェクトした293DbKb細胞の溶解物の連続希釈物(50Tg/ml、10Tg/ml、2Tg/mlおよび0.4Tg/ml)をパルスした。DCを標的細胞として用い、一方、E7特異的CD8+T細胞はエフェクター細胞として機能した。CTLアッセイを、E/T比率(9/1)を固定して実施した。図７に示すように、CRT/E7 DNAでトランスフェクトした293DbKb細胞の溶解物をパルスしたDCは、他のDNA構築物でトランスフェクトした293DbKb細胞の溶解物をパルスしたDCおよび無傷のDCと比較して有意により高い割合の特異的溶解を誘導した(P<0.001)。これらの結果は、CRT/E7融合タンパク質(トランスフェクトした293DbKb細胞の細胞溶解物中に存在)をパルスした樹状細胞は、野生型E7タンパク質コード構築物のみでトランスフェクトした293DbKb細胞の溶解物をパルスした樹状細胞よりも効率的な方法でMHCクラスI経路を介してE7抗原を提示できることを示した。このデータは、E7へのCRTの融合、すなわちカルレティキュリンとの融合タンパク質としてのE7ポリペプチドの発現が、直接的およびクロスプライミング効果の双方を経てE7特異的CD8+T細胞免疫応答を増強することを示すものである。
【０１２７】
CRT もしくはキメラ CRT/E7 DNA ワクチンを用いた処置はヌードマウスの肺において確立される腫瘍を根絶する：
上記で論じたように、野生型CRT DNAで処置したマウスは、野生型E7 DNAのみを受けたマウスまたはワクチン接種していないマウスよりも肺結節の低い平均数を示した(one-way ANOVA, P<0.001)。CRTでワクチン接種したマウスは、E7特異的T細胞免疫応答を誘導しなかったので(図２を参照されたい)、CRTを単独で発現する構築物を投与した場合に観察される治療的効果(転移性肺結節数の低減)は、抗腫瘍免疫応答(すなわち、抗原特異的CTLの増大)に関連しないと考えられる。いずれの免疫エフェクター細胞も存在しない肺におけるTC-1腫瘍転移の処置において、E7もしくはCRTポリペプチド単独と比較したCRT/E7融合ポリペプチドの役割を評価するために、まずヌード(BALB/c nu/nu)マウス(Tヘルパーおよびキラー(CTL)リンパ球の双方を欠き、体液性もしくは細胞性免疫応答のいずれも誘導することできない動物)を、上記で論じたように静脈内尾静脈注射を介してマウス1匹あたり1 x 104のTC-1腫瘍細胞でチャレンジした。TC-1腫瘍細胞を用いたチャレンジの2日後、マウスに遺伝子銃を介して16TgのCRTコードDNA、E7コードDNAもしくはCRT/E7コードDNAまたはインサートを含まない空のプラスミドを与えた。9日目と16日目に、これらのマウスを最初のワクチン接種と同じ処方計画で追加免疫した。マウスを21日目に屠殺した。各マウスの肺結節を評価および計数した。図８に示すように、CRTを単独で発現する構築物もしくはCRT/E7融合タンパク質を発現する構築物で処置したヌードマウスは、野生型E7 DNAのみ(36.0+2.8)、ベクターのみ(35.5+12.0)でワクチン接種したマウスまたは無傷の群(47.5+2.1)と比較して、肺結節のより低い平均数(CRTについては6.0+2.8、CRT/E7については2.5+0.7)を示した(one-way ANOVA、P<0.001)。これらのデータより、CRTもしくはCRT/E7 DNAワクチンによって誘導される抗腫瘍効果は、抗腫瘍免疫応答に非依存的であったことが示された。
【０１２８】
CRT もしくはキメラ CRT/E7 DNA ワクチンを用いた処置はヌードマウスの肺における腫瘍の微小血管密度を有意に低減した：
免疫エフェクター不在下でのCRTもしくはCRT/E7 DNAのこの抗腫瘍効果は抗脈管形成経路を介するものか否かを決定するために、様々なDNAワクチンで処置したヌードマウスの肺腫瘍における微小血管密度(MVD)を測定した。内皮細胞を、上記したように抗CD31抗体で染色した。全ての測定は、計数前には処置データを何も知らない1人の病理学者によって実施された。CRTもしくはCRT/E7 DNAワクチンのいずれかでワクチン接種したヌードマウス(機能的免疫系を欠く)は、野生型E7で処置したヌードマウスまたは対照ベクター群よりも肺腫瘍において非常に小さいMVDを示した(one-way ANOVA、P<0.001)。これらのデータより、CRT発現ワクチンもしくはCRT/E7融合タンパク質発現ワクチンで処置したマウスは腫瘍において抗脈管形成効果を導くことができたことが示された。
【０１２９】
実施例２
自己複製 RNA ウイルスは抗原特異的 CTL 応答の増強を誘導する
一実施形態において、本発明は本発明のキメラタンパク質(小胞体(ER)シャペロンポリペプチドを含む第1ポリペプチドドメインと少なくとも1種の抗原性ペプチドを含む第2ポリペプチドドメインとを含むタンパク質)を発現することができる自己複製RNAレプリコンを提供する。以下の実施例は、本発明の方法を用いて、これらの構築物がin vivoで抗原特異的細胞傷害性Tリンパ球(CTL)応答を増強するのに効果的であることを示す研究を説明するものである。モデル系として、HPV-16 E7とマイコバクテリウム・ツベルクローシスHSP70とを含む融合タンパク質を、シンドビスウイルス自己複製RNAベクター、SINrep5においてin vivoで発現させた。このベクターによって誘導される抗原特異的免疫の効力を決定した。またこれらの結果は、in vivoでシンドビスウイルス自己複製RNAベクターにおいて発現させたERシャペロンポリペプチドと抗原性ペプチドとを含む融合タンパク質がin vivoで抗原特異的CTL応答を増強するのに効果的であることを示す。
【０１３０】
これらの実験により、E7/HSP70融合遺伝子を含むRNAレプリコンワクチンは野生型E7遺伝子を含むワクチンよりもワクチン接種したマウスにおいて有意に高いE7特異的T細胞媒介免疫応答を誘導したことが示された。さらに、in vitro研究により、E7/HSP70 RNAレプリコンでトランスフェクトしたアポトーシス細胞に由来するE7抗原は骨髄由来樹状細胞によって取り込まれ、野生型E7 RNAレプリコンでトランスフェクトしたアポトーシス細胞よりも効率的にMHCクラスI経路を介して提示されうることが示された。より重要なことには、E7へのHSP70の融合は、あまり効果的でないワクチンをE7発現腫瘍に対する有意な効力を有するワクチンへと変えたことであった。この抗腫瘍効果は、NK細胞およびCD8+T細胞に依存的であった。これらの結果より、抗原遺伝子へのHSP70の融合が自己複製RNAワクチンの効力を大いに増強したことが示された。これらの結果より、HSP70にE7を連結するシンドビスRNAワクチンはE7特異的CD8+T細胞およびNK細胞の拡大と活性化を劇的に増大し、CD4力を完全に回避し、E7発現腫瘍に対する強力な抗腫瘍免疫を生じたことが示された。
【０１３１】
さらに抗腫瘍効果を促進するシンドビスRNAワクチンの機構を調査した。シンドビスE7/HSP70 RNAワクチンは宿主細胞のアポトーシス死を誘導し、これらの細胞を貪食するように樹状細胞を促進することができ、E7特異的CD8+T細胞の拡大と活性化を劇的に増大したことを見出した。このCD8応答の増強により、E7発現腫瘍細胞系に対する有力な抗腫瘍免疫が生じた。
【０１３２】
HPV-16 E7をワクチン開発におけるモデル抗原として選択した。なぜならば、HPV、特にHPV-16は、上記で論じたようにほとんどの子宮頸癌と関連するからである。
【０１３３】
プラスミド DNA 構築物と調製：
ベクターpcDNA3-HSP70、pcDNA3-E7およびpcDNA3-E7/HSP70を、Chen (2000)前掲に記載のように作製した。シンドビスウイルスRNAレプリコンベクター、SINrep5はBredenbeek,前掲に記載されている。ベクターSINrep5-HSP70、SINrep5-E7およびSINrep5-E7/HSP70を、pcDNA3-HSP70、pcDNA3-E7およびpcDNA3-E7/HSP70をそれぞれXba IおよびPme I制限酵素で切断することでマイコバクテリウム・ツベルクローシスHSP70、HPV-16 E7およびキメラE7/HSP70をコードするDNA断片を単離することによって作製した。消化産物を、ゲルを用いて単離した。さらにこれらの単離されたDNA断片をSINrep5ベクターの対応するXabIおよびPml I部位にクローニングして、SINrep5-HSP70、SINrep5-E7およびSINrep5-E7/HSP70構築物を誘導した。これらの構築物の精度を、DNA配列決定分析によって確認した。
【０１３４】
in vitro RNA 調製：
SINrep5-HSP70、SINrep5-E7、SINrep5-E7/HSP70およびSINrep5に由来するRNA転写産物の生成を、Mandl (1998) Nature Med 4：1438-1440に記載のプロトコールを用いて実施した。SpeIは、SINrep5-HSP70、SINrep5-E7、SINrep5-E7/HSP70およびSINrep5に由来するRNAレプリコン合成のためのDNA鋳型を線状化するために用いられた。RNAワクチンをin vitroで転写し、販売業者のマニュアルに従って、標準的in vitro転写キット(Life Technologies, Rockville, MD)からのSP6 RNAポリメラーゼおよびキャッピング類似体を用いてキャッピングした。合成後、DNAをDNアーゼIを用いた消化によって除去した。合成されたRNAを定量化し、変性ホルムアルデヒドアガロースゲルを用いて分析した(Mandl (1998)前掲)。精製RNAをアリコートに分け、動物におけるワクチン接種とBHK21細胞系のトランスフェクションに用いた。転写産物のタンパク質発現を、エレクトロポレーションを用いたBHK21細胞へのRNAのトランスフェクションによって評価した。
【０１３５】
細胞系：
ベビーハムスター腎(BHK21)細胞をATCC(Rockville, MD)から入手し、5％のFBS、10％のトリプトースホスフェートブロス(tryptose phosphate broth)、2mM グルタミンおよび抗生物質を補足したGlasgow MEMで増殖させた。細胞を加湿した5％のCO2空気下中37℃で維持し、2日ごとに継代した。TC-1細胞の生産と維持は、Lin (1996) Cancer Res. 56：21-26に記載のように行われた。腫瘍チャレンジの日に、TC-1細胞をトリプシン処理によって回収し、1X Hanks緩衝塩溶液(HBSS)で2回洗浄し、最後に1X HBSS中に再懸濁して、指定された注射用濃度にした。
【０１３６】
SINrep5 RNA ワクチンの E7 タンパク質発現に対する ELISA ：
SINrep5-E7およびSINrep5-E7/HSP70 RNAからのE7タンパク質の発現を、間接的ELISA方法によって測定した。E7タンパク質量を、SINrep5-E7もしくはSINrep5-E7/HSP70でトランスフェクトしたBHK21細胞由来の細胞溶解物を用いて測定した。簡単に言えば、1000万個のBHK21細胞を、Liljestrom (1991) J. Virol. 65：4107-4113に記載のようにエレクトロポレーションを介してそれぞれ4μgのSINrep5、SINrep5-E7、SINrep5-HSP70もしくはSINrep5-E7/HSP70のRNA転写産物でトランスフェクトした。トランスフェクトしたBHK21細胞を、エレクトロポレーションの16〜20時間後に回収した。96マイクロウエルプレートを、様々なSINrep5 RNAでトランスフェクトしたBHK21細胞の溶解物で、最終容量100μlにおいてコーティングし、4℃で一晩インキュベートした。細菌に由来するHPV-16 E7タンパク質を、陽性対照として用いた。次いで、ウエルを20％のウシ胎児血清を含有するPBSでブロッキングした。希釈した抗E7Ab(Zymed, San Francisco, CA)をELISAウエルに添加し、37℃で2時間インキュベートした。0.05％のTween-20を含有するPBSで洗浄した後、プレートをペルオキシダーゼ-コンジュゲートウサギ抗マウスIgG抗体(Zymed, San Francisco, CA)の1/2000希釈物とともに、室温(RT)で1時間インキュベートした。プレートを洗浄し、1-Step（商標） Turbo TMB-ELISA(Pierce, Rockford, IL)で顕色し、1M H2SO4で停止させた。ELISAプレートを、標準的ELISAリーダーを用いて450nmで読み取った。次いで、細胞溶解物のE7タンパク質量を標準化したE7タンパク質と比較することによって計算し、決定した。
【０１３７】
マウス：
6〜8週齢のメスC57BL/6マウスをNational Cancer Institute(Frederick, MD)から購入し、Johns Hopkins Hospital(Baltimore, MD)の腫瘍学動物施設で飼育した。全ての動物手順は、認可されたプロトコールおよび実験室動物の適切な使用と注意についての推奨に従って実施された。
【０１３８】
RNA ワクチン接種：
全てのSINrep5 RNAワクチンを、上記のようにin vitro転写を用いて生成した。RNA濃度を、260nmで測定する光学密度によって決定した。さらにRNA転写産物の完全性と量を変性ゲル電気泳動を用いてチェックした。マウスを、SINrep5-E7/HSP70(これは、0.1、1および10μgの量で投与された)を除いて様々なSINrep5 RNA 10μgで右後脚の筋内にワクチン接種した。
【０１３９】
E7 抗体に対する ELISA ：
血清中の抗HPV 16 E7抗体を、Wu (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92：11671-1165に記載のように直接的ELISAによって測定した。96マイクロウエルプレートを、5μg/mlの細菌に由来するHPV-16 E7タンパク質100μlでコーティングし、4℃で一晩インキュベートした。次いで、ウエルを20％のウシ胎児血清を含有するPBSでブロッキングした。血清を、免疫感作後14日目にマウスから調製し、PBS中に連続希釈し、ELISAウエルに添加し、37℃で2時間インキュベートした。0.05％のTween-20を含有するPBSで洗浄した後、プレートをペルオキシダーゼ-コンジュゲートウサギ抗マウスIgG抗体(Zymed, San Francisco, CA)の1/2000希釈物とともにRTで1時間インキュベートした。プレートを洗浄し、1-Step（商標） Turbo TMB-ELISA(Pierce, Rockford, IL)で顕色し、1M H2SO4で停止させた。ELISAプレートを、標準的ELISAリーダーを用いて450nmで読み取った。
【０１４０】
INF- γに対する酵素免疫測定法 (ELISA) ：
脾細胞をワクチン接種の2週間後に回収し、MHCクラスIエピトープを含むE7ペプチド(aa49-57)(Feltkamp (1993) Eur. J. Immunol. 23：2242-2249)とともに、またはMHCクラスIIペプチドを含むE7ペプチド(aa30-67)(Tindle,前掲)とともに、24ウエル組織培養プレートにおいて、10％(vol/vol)のウシ胎児血清、50ユニット/mlのペニシリンおよびストレプトマイシン、2mM L-グルタミン、1mM ピルビン酸ナトリウム、2mM非必須アミノ酸を補足したRPMI 1640 2mlの全容量中で6日間培養した。上清を回収し、製造業者のプロトコールに従ってELISAキット(Endogen, Woburn, MA)を用いてIFN-γの存在についてアッセイした。
【０１４１】
細胞傷害性 T リンパ球 (CTL) アッセイ：
CTLアッセイを、Corr (1999) J. Immunol. 163：4721-4727に記載のように96ウエル丸底プレート中で実施した。細胞溶解を、乳酸脱水素酵素(LDH)の定量的測定によって測定した(Corr (1999) 前掲)。脾細胞をRNAワクチン接種の2週間後に回収し、E7ペプチド(aa49-57)とともに、24ウエル組織培養プレートにおいて、10％(vol/vol)のウシ胎児血清、50ユニット/mlのペニシリン/ストレプトマイシン、2mM L-グルタミン、1mM ピルビン酸ナトリウム、2mM非必須アミノ酸を補足したRPMI 1640 2mlの全容量中で6日間培養し、エフェクター細胞とした。TC-1腫瘍細胞を標的細胞として用いた。TC-1細胞は、様々なエフェクター/標的(E/T)比率で脾細胞と混合した。37℃で5時間のインキュベーション後、培養培地50μlを回収し、CytoTox（商標）アッセイキット(Promega, Madison, WI)の製造業者のプロトコールに従って培養培地中のLDH量を評価した。溶解の割合を以下の等式から計算した：100 X (A-B)/(C-D)(式中、Aは実験のエフェクターシグナル値の読み取り値であり、Bはエフェクターの自発的なバックグラウンドシグナル値であり、Cは標的細胞からの最大シグナル値であり、Dは標的の自発的なバックグラウンドシグナル値である)。
【０１４２】
細胞質内サイトカイン染色およびフローサイトメトリー分析：
無傷のマウス群またはワクチン接種したマウス群由来の脾細胞を、E7特異的CD4+Tヘルパー細胞前駆体を検出するためにMHCクラスIIペプチドを含むE7ペプチド(aa30-67)(Tindle (1999) 前掲)とともにインキュベートした。E7ペプチドは、10μg/mlの濃度で20時間添加された。Golgistop（商標）(PharMingen, San Diego, CA)を培養物から細胞を回収する6時間前に添加した。次いで細胞をFACScan（商標）バッファー中で1回洗浄して、フィコエリトリン(PE)-コンジュゲートモノクローナルラット抗マウスCD4抗体(PharMingen, San Diego, CA)で染色した。細胞を、製造業者の使用説明書(PharMingen)に従ってCytofix/Cytoperm（商標）キットを用いて細胞内サイトカイン染色に供した。FITC-コンジュゲート抗IFN-γ抗体および免疫グロブリンアイソタイプ対照抗体(ラットIgG1)は、全てPharMingenから購入した。分析は、CELLQuest（商標）ソフトウエアを用いるBecton Dickinson FACScan（商標）(Becton Dickinson Immunocytometry System, Mountain View, CA)において行われた。
【０１４３】
in vivo 腫瘍防御実験：
腫瘍防御実験において、マウス(1群あたり5匹)に異なる用量のSINrep5-HSP70、SINrep5-E7、SINrep5-E7/HSP70および空のSINrep5 RNAワクチンを筋内に(IM)免疫感作した。免疫感作の14日後に、マウスに、1 x 104 細胞/マウスのTC-1腫瘍細胞を尾静脈に静脈内(IV)注射した。3週間後、マウスを安楽死させた。各マウスにおける肺重量および肺結節数は、分からない様式にある実験者によって評価および計数された。
【０１４４】
in vivo 抗体枯渇実験：
in vivo抗体枯渇の手順は、例えばLin (1996) 前掲；Wu (1995) J. Exp. Med. 182：1415-1421に既に記載されている。簡単に言えば、マウスを自己複製SINrep5-E7/HSP70 RNA 1μgで筋内にワクチン接種し、尾静脈注射を介して1 x 104細胞/マウスのTC-1腫瘍細胞でチャレンジした。腫瘍チャレンジの1週間前に枯渇を開始させた。MAb GK1.5(Dialynas (1983) J. Immunol. 131：2445)をCD4枯渇に使用し、MAb 2.43(Sarmiento (1980) J. Immunol. 125：2665)をCD8枯渇に使用し、そしてMAb PK136(Koo (1986) J. Immunol. 137：3742)をNK1.1枯渇に使用した。フローサイトメトリー分析により、適切なリンパ球サブセットの＞95％が枯渇され、他のサブセットは正常レベルであったことが明らかとなった。枯渇を腫瘍チャレンジ後21日目に終了した。
【０１４５】
細胞表面マーカー染色およびフローサイトメトリー分析：
無傷のマウス群またはワクチン接種したマウス群から取り出した脾細胞を直接細胞表面マーカー染色で、Ji (1999) Human Gene Therapy 10：2727-2740に記載のように処理した。次いで細胞をFACSCAN（商標）バッファー中で1回洗浄して、PE-コンジュゲートモノクローナルラット抗マウスNK1.1抗体およびFITC-コンジュゲートモノクローナルラット抗マウスCD3抗体(Pharmingen, San Diego, CA)で染色した。NK細胞集団は、抗NK1.1抗体で染色されるが、抗CD3抗体では染色されなかった。様々な自己複製RNAワクチンで免疫感作したマウス中のNK細胞の割合をフローサイトメトリーを用いて分析した。
【０１４６】
骨髄からの樹状細胞 (DC) の生成と培養：
DCを、Lu (2000) J. Exp. Med. 191：541-550に記載のようにGM-CSFの存在下で骨髄細胞を培養することによって生成した。簡単に言えば、骨髄をマウスの脛骨から回収した。赤血球を溶解し、残りの細胞をナイロンメッシュを通過させることで小片の骨およびデブリを除去した。細胞を回収し、そして1 X 106細胞/mlを、5％のFCS、2mM β-メルカプトエタノール、1％の非必須アミノ酸、100U/mlペニシリンおよび100μg/mlストレプトマイシン(Life Technologies, Rockville, MD)および100U/ml GM-CSF(PharMingen, San Diego, CA)を補足したRMPI 1640を含む24ウエルプレートに配置した。培地の3/2を2日ごとに入れ替え、非接着細胞を7日目に回収した。回収した細胞を、DCマーカーについてのフローサイトメトリー分析(FACS)によって特性付けた。
【０１４７】
E7 特異的 CD8 + T 細胞系の生成：
E7特異的CD8+細胞系の生成を、Sig/E7/LAMP-1ワクシニアの腹腔内(IP)注射によってメスC57BL/6(H-2b)マウスを免疫感作することによって行った。脾細胞を8日目に回収した。最初のin vitro刺激については、脾細胞を20U/ml濃度のIL-2および1μM E7ペプチド(アミノ酸49-57)で6日間パルスした。E7特異的CTL細胞系の増殖を、E7特異的CTLを含む1 x 106脾細胞と3 x 106の放射線照射した脾細胞とを混合し(2ml/ウエル)、それらに20U/ml濃度のIL-2および1μM E7ペプチド(アミノ酸49-57)をパルスすることによって、24ウエルプレート中で実施した。この方法を6日ごとに繰り返した。E7 CTL系の特異性を、CTLアッセイによって特性付けた。フローサイトメトリーを実施して、CD8マーカーの発現を示した。
【０１４８】
in vitro 細胞死分析：
1000万個のBHK21細胞を、初期に述べたように4μgのSINrep5、SINrep5-E7、SINrep5-HSP70もしくはSINrep5-E7/HSP70 RNA転写産物でトランスフェクトした。無傷のBHK21細胞またはSINrep5 RNAなしでエレクトロポレーションを行ったBHK21細胞を対照として用いた。BHK21細胞を回収し、24時間ごとに72時間まで評価した。アポトーシスおよびネクローシスBHK21細胞の割合を、製造業者のプロトコールに従ってアネキシンVアポトーシス検出キット(PharMingen, San Diego, CA)を用いて分析し、次いでフローサイトメトリー分析を行った。
【０１４９】
アポトーシス細胞をパルスした DC を標的細胞として用いた CTL アッセイ：
アポトーシス細胞をパルスしたDCを標的細胞として用いたCTLアッセイを、Albert (1998) Nature 392：86-89；Albert (1998) J. Exp. Med. 188：1359-1368に記載のプロトコールに類似し、改変を加えたプロトコールを用いて実施した。簡単に言えば、まず1000万個のBHK21細胞を、エレクトロポレーションを介して様々な自己複製SINrep5 RNA 4μgでトランスフェクトした。BHK21細胞をエレクトロポレーションの16〜20時間後に回収した。SINrep5-E7もしくはSINrep5-E7/HSP70 RNA転写産物でトランスフェクトしたBHK21細胞中のE7タンパク質発現レベルは、ELISAで測定した場合には類似していた。次いで3 x 105のトランスフェクトしたBHK21細胞を、1 x 105の骨髄由来DCとともに37℃で48時間同時インキュベートした。次いでこれらの調製したDCを標的細胞として用い、Db制限E7特異的CD8+T細胞をエフェクター細胞として用いた。CTLアッセイを、様々な比率(1：1、3：1、9：1および27：1)で一緒に混合したエフェクター細胞と標的細胞(1ウエルあたり1 x 104)を用いて最終容量200μl中で実施した。37℃で5時間のインキュベーション後、培養培地50μlを回収し、上記のように培養培地中のLDH量を評価した。トランスフェクトしていないBHK21細胞、トランスフェクトしたBHK21細胞単独、未処理のDC単独、およびCD8+T細胞系単独を陰性対照として含めた。
【０１５０】
自己複製 RNA 構築物の構築と特性付け：
プラスミドDNA構築物の生成と続く自己複製SINrep5 RNA構築物の調製は、上記のように実施された。SINrep5ベクターは、シンドビスウイルスRNAレプリカーゼをコードする遺伝子およびSP6プロモーターを含む(Bredenbeek (1993) 前掲)。SINrep5、SINrep5-HSP70、SINrep5-E7、SINrep5-E7/HSP70のDNA構築物の概略図を図９Aに示した。さらに、SP6 RNAポリメラーゼを用いてこれらのDNA構築物から誘導されたRNA転写産物の概略図を図９Bに示した。メチル化M7G「キャップ」はmRNAの5'末端に位置し、自己複製において機能する配列(レプリカーゼ)、目的の遺伝子(すなわち、MHCクラスIペプチドエピトープ、E7、HSP70、E7/HSP70など)およびポリアデニル化テイル(tail)(AAAA)が続く。ELISAを実施して、様々な自己複製RNA構築物でトランスフェクトしたBHK21細胞によるE7タンパク質の発現を示した。SINrep5-E7およびSINrep5-E7/HSP70は、類似した量のE7タンパク質を発現させた。
【０１５１】
自己複製 SINrep5-E7/HSP70 RNA を用いたワクチン接種は E7 特異的細胞傷害性免疫応答を増強する：
CD8+Tリンパ球は、抗腫瘍免疫の誘導において最も重要なエフェクターの1つである。SINrep5-E7/HSP70 RNAワクチンによって誘導されるE7特異的CD8+T細胞応答の量を決定するために、CTLアッセイを用いた。マウスを、筋内注射を介して様々なSINrep5自己複製RNAワクチンで免疫感作した。脾細胞および血清サンプルを14日後に回収した。細胞傷害性アッセイを実施するために、様々な自己複製SINrep5 RNAワクチンにより誘導された脾細胞を、MHCクラスIエピトープを含むE7ペプチド(aa49-57)とともに6日間培養し、エフェクター細胞とした。TC-1腫瘍細胞を標的細胞とした。様々なE/T(エフェクター/標的比率)でTC-1細胞を脾細胞と混合した。細胞溶解をLDHの定量的測定によって決定した。本明細書で示すCTLアッセイは、実施された2回のうちの1回の代表的実験からのものである。
【０１５２】
自己複製RNA E7/HSP70ワクチンは、他のRNAワクチンと比較して、有意により高い割合の特異的溶解を誘導した(*：P<0.001、one-way ANOVA)。自己複製SINrep5-E7/HSP70は、他のSINrep5 RNAワクチンでワクチン接種したマウスと比較して、有意により高い割合の特異的溶解を誘導した(P<0.001、one-way ANOVA)。特異的溶解を誘導するSINrep5-E7/HSP70 RNAの能力は、自己複製SINrep5-E7 RNAの約4倍であることが見出された(32.7％ 対 8.8％、E/T比率45/1、P<0.001)。
【０１５３】
自己複製 SINrep5-E7/HSP70 RNA を用いたワクチン接種は E7 特異的 CD8 + T 細胞を増強することで高いレベルの INF- γを分泌させる：
自己複製SINrep5-E7/HSP70 RNAによって誘導されるE7特異的CD8+T細胞の免疫学的応答の程度を決定するために、ELISAを用いて、脾細胞の培養上清中のINF-γ濃度を検出した。マウスを、筋内注射を介して様々な自己複製RNAワクチンで免疫感作した。脾細胞および血清サンプルを14日後に回収した。様々な自己複製RNAワクチンにより誘導された脾細胞を、in vitroでMHCクラスIエピトープを含むE7ペプチド(aa49-57)とともに(またはいずれのペプチドも含まずに)6日間培養した。また陰性対照として、ペプチドを含まずにELISAを実施した。培養培地中の上清を回収し、ELISAを用いてINF-γ濃度を検出した。
【０１５４】
E7ペプチド(aa49-57)で刺激した自己複製E7/HSP70 RNA群に由来する脾細胞は、他のRNAワクチンと比較して、最も高いINF-γ濃度を分泌した(P<0.001、one-way ANOVA)。またこれらの結果により、E7へのHSP70の融合はINF-γ分泌E7特異的CD8+T細胞活性を有意に増強することが示された。従って、CD8+T細胞をE7のMHCクラスIエピトープによって誘導することができた。注釈：E7ペプチド(aa49-57)で刺激した自己複製E7/HSP70 RNA群に由来する脾細胞は、他のRNAワクチンと比較して、最も高いINF-γ濃度を分泌した(*：P<0.001、one-way ANOVA)。
【０１５５】
自己複製 SINrep5-E7/HSP70 RNA を用いたワクチン接種は有意な E7 特異的 CD4 + T 細胞媒介免疫応答を誘導しない：
これらの各RNAワクチンによるE7特異的CD4+T前駆体細胞の生成およびサイトカインプロフィールを調べるために、本発明者らは免疫感作したマウスから得た脾細胞におけるCD4表面マーカーおよび細胞内IFN-γに対する二重染色を実施し、次いでフローサイトメトリー分析を行った。脾細胞を、in vitroでE7ペプチド(aa30-67)とともに一晩培養し、CD4および細胞内IFN-γの双方について染色した。E7ペプチド(aa30-67)は、HPV-16のE7オープンリーディングフレームタンパク質中の主要なTヘルパーエピトープを含む(Tindle (1991)前掲)。IFN-γ分泌CD4+T細胞の割合を、フローサイトメトリーを用いて分析した。
【０１５６】
SINrep5-E7/HSP70 RNAでワクチン接種したマウスは、SINrep5-E7 RNA (15/3 x 105脾細胞 対 12/3 x 105脾細胞、p>0.05)または他のRNA群でワクチン接種したマウスと比較して、類似のCD4+IFN-γ+二重陽性細胞数を誘導した。フローサイトメトリー染色を用いて観察されたE7特異的CD4+IFN-γ+細胞数に、無傷のマウスまたは空のプラスミド、E7、HSP70もしくはE7/HSP70 RNAでワクチン接種したマウスの間に有意な差異はなかった。Sig/E7/LAMP-1 DNAでワクチン接種したマウス由来の脾細胞(Ji (1999)前掲)を、この研究の細胞内IFN-γ染色に対する陽性対照として用いた。
【０１５７】
ワクチン接種したマウスの血清中の抗HPV 16 E7抗体量を、ワクチン接種の2週間後に様々な希釈物(1：100、1：500、1：1000)で直接的酵素免疫測定法(ELISA)を用いて測定した。SINrep5-E7/HSP70は、他のRNAワクチン構築物によって誘導された力価と比較して、ワクチン接種したマウスの血清におけるより高い力価のE7特異的抗体を誘導しなかった。
【０１５８】
自己複製 SINrep5-E7/HSP70 RNA を用いたワクチン接種は TC-1 腫瘍の増殖に対してマウスを防御する：
自己複製SINrep5-E7/HSP70 RNAを用いたワクチン接種はE7発現腫瘍に対してマウスを防御するか否かを決定するために、in vivo腫瘍防御実験を、右後脚に筋内投与される異なる用量の自己複製SINrep5-E7/HSP70 RNAを用いて実施した。マウスを、10μgの自己複製SINrep5、 SINrep5-HSP70およびSINrep5-E7 RNAで同様にワクチン接種した。また0.1μg、1μgおよび10μgを含む異なる用量の自己複製SINrep5-E7/HSP70 RNAをマウスに注射した。ワクチン接種の1週間後に、マウスを、静脈内尾静脈注射を介して2 x 104 細胞/マウスの用量のTC-1腫瘍細胞でチャレンジした。マウスを1週間に2回モニターし、腫瘍チャレンジ後21日目に屠殺した。肺結節を、腫瘍チャレンジの21日後に評価した。肺をマウスから、空のSINrep5(10μg)、 SINrep5-HSP70(10μg)、SINrep5-E7(10μg)およびSINrep5-E7/HSP70 RNA(0.1μg、1μgもしくは10μg)を用いたワクチン接種の35日後に切断した。肺病巣の平均数を、HPV-16 E7発現腫瘍増殖を制御する上での様々な自己複製RNAワクチンの有効性の測定値として用いた。
【０１５９】
自己複製E7/HSP70 RNAワクチン(0.1μg、1μgおよび10μg)でワクチン接種したマウスの平均肺結節は、他のRNAワクチンでワクチン接種したマウスと比較して非常により小さかった(P<0.001、one-way ANOVA)。これらの結果より、自己複製RNA SINrep5-E7/HSP70ワクチンは0.1μgの低い用量でさえも静脈内腫瘍チャレンジからマウスを防御し、一方、インサートなしのSINrep5 10μg、SINrep5-E7 10μgまたはSINrep5-HSP70 10μg由来のRNAでワクチン接種したマウスはTC-1腫瘍チャレンジから多数の肺結節を生じたことが示された。
【０１６０】
CD8 + T 細胞および NK 細胞が SINrep5-E7/HSP70 RNA ワクチンを用いたワクチン接種によって誘導される抗腫瘍効果に重要である：
E7発現腫瘍細胞に対する防御に重要なリンパ球タイプを決定するために、(CD8+T細胞およびNK細胞の)in vivo抗体枯渇実験を実施した(自己複製RNAワクチンで免疫感作したマウスの脾細胞に由来するNK細胞の割合は免疫感作なしのマウスよりも高く、様々な自己複製RNAワクチン間でNK細胞の割合に有意な差異はなかった)。抗体枯渇を腫瘍チャレンジの1週間前に開始し、腫瘍チャレンジ後21日目に終了した。
【０１６１】
CD8+T細胞およびNK1.1細胞を枯渇したマウスに由来する平均肺結節は、枯渇していない群のマウスよりも有意に高かった。さらに、NK1.1細胞の枯渇により、CD8+枯渇マウスよりも腫瘍肺結節の平均数が高かった。
【０１６２】
比較すると、CD4+T細胞を枯渇したマウスに由来する平均肺結節は、枯渇していないマウスから得られた結果と似ており、このことによりCD4+T細胞がこの効果の発生に重要ではなかったことが示された。これらの結果は、CD8+T細胞がSINrep5-E7/HSP70 RNAワクチンによって誘導される抗原特異的抗腫瘍免疫に必須であり、E7/HSP70 RNAワクチンに限定されないが、NK細胞も同様に重要な役割を果たすことを示唆する。
【０１６３】
またNK細胞効果はE7/HSP70ワクチンに限定されたものか否か、またはそれは用いるベクターの結果であるかを調査した。CD3(-),NK1.1(+)細胞のフローサイトメトリー分析により、それらの存在が無傷のマウスに対して全ての構築物(E7/HSP70、E7、HSP70および対照プラスミド)において著しく増大したことが明らかになり、このことにより、NK細胞はE7/HSP70ワクチンに限定されない抗腫瘍効果の重要なエフェクターであったことが示された。
【０１６４】
自己複製 RNA ワクチンはアポトーシスを誘導する：
様々なプラスミドSINrep5 RNAワクチンからin vitroで転写されたRNAを、エレクトロポレーションを介してBHK21細胞にトランスフェクトした。RNAなしでエレクトロポレーションを行ったBHK21細胞および未処理BHK21細胞を対照として用いた。アポトーシスおよびネクローシスBHK21細胞の割合を、アネキシンV-FITCおよびヨウ化プロピジウム(PI)によって染色し、次いでフローサイトメトリー分析を行った。
【０１６５】
SINrep5 RNAワクチンでトランスフェクトした場合には、24〜72時間後にはアポトーシスBHK21細胞の割合は統計的下降を示した(SINrep5-E7/HSP70を例にとると、24時間で70.3±3.6％、48時間で49.3±4.2％、72時間で18.0±3.1％、P<0.001、one-way ANOVA)。SINrep5 RNAワクチンでトランスフェクトしたBHK21細胞は、他の2つの対照群と比較すると24時間、48時間または72時間後にはより高い割合を誘導した。様々なSINrep5 RNAワクチンのアポトーシス割合には統計的差異を見出すことができなかった。
【０１６６】
SINrep5-E7/HSP70 RNA でトランスフェクトした細胞をパルスした樹状細胞における MHC クラス I 経路を介した E7 の提示の増強：
in vivoでE7特異的CD8+T細胞免疫応答を増強する潜在的な機構は、様々なE7構築物を発現する細胞からのアポトーシス小体の取込みによるMHCクラスI経路を介したE7の提示であり、「クロスプライミング」とも呼ばれる。クロスプライミング実験は、様々な自己複製RNAでトランスフェクトしたBHK21細胞からのアポトーシス小体をパルスした樹状細胞におけるE7のMHCクラスI提示を特性付けるために実施された。既に述べたように、BHK21細胞は安定した高いトランスフェクション効率、および異なるE7含有自己複製RNAでトランスフェクトした細胞間で類似したE7発現を有することが示されている。トランスフェクトしたBHK21細胞を、骨髄由来DCとともに同時インキュベートした。DCを標的細胞として用い、一方、E7特異的CD8+T細胞はエフェクター細胞として機能した。様々なE/T比率でのCTLアッセイを実施した。
【０１６７】
SINrep5-E7/HSP70 RNAでトランスフェクトしたBHK21細胞とともに同時インキュベートしたDC標的細胞は、SINrep5-E7 RNAでトランスフェクトしたBHK21細胞とともに同時インキュベートしたDCと比較して有意により高い割合の特異的溶解を誘導した(P<0.001)。これらの結果は、E7/HSP70融合タンパク質を含有するアポトーシス小体をパルスした樹状細胞は、野生型E7タンパク質を含有するアポトーシス小体をパルスした樹状細胞よりも効率的にMHCクラスI経路を介してE7抗原を提示したことを示唆した。従って、E7へのHSP70の融合はE7特異的CD8+T細胞免疫応答を増強し；そして、本発明はいずれの特定の機構によっても限定されないが、この増強は「クロスプライミング」を介するものであると考えられた。
【０１６８】
多数の本発明の実施形態が記載されている。それにもかかわらず、様々な改変が本発明の精神と範囲から逸脱することなく行われうることが理解されるだろう。従って、他の実施形態は以下の特許請求の範囲内にある。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、実施例１で論じるように、カルレティキュリン(CRT)、HPVポリペプチドE7および本発明の融合タンパク質カルレティキュリン/E7(CRT/E7)をコードする組換えDNA構築物の概略図を示す。
【図２】 図２Aは、実施例１で論じるように、陰性対照、ならびにCRTを単独で発現するDNA、E7を単独で発現するDNAおよび本発明のCRT/E7融合タンパク質を発現するDNAでワクチン接種したマウス由来の脾細胞を、CD8およびINF-γに対する抗体で染色したFACS(フローサイトメトリー)分析を要約する二次元ヒストグラムを示す。図２Bは、ヒストグラムデータの要約図を示す。
【図３】 図３は、実施例１で論じるように、構築物単独、およびCRTを単独でコードする構築物、E7を単独でコードする構築物、CRT/E7融合タンパク質をコードする構築物、ならびにCRTとE7を個別に発現する2種の構築物の混合物を用いた最後のワクチン接種の2週間後に直接的ELISAによって測定した、ワクチン接種したマウスの血清中の抗HPV16 E7抗体量を示すデータの要約図を示す。
【図４】 図４は、実施例１で論じるように、マウスを様々なDNAワクチン構築物でワクチン接種し、その後にE7発現腫瘍でチャレンジした、in vivo腫瘍防御実験データの要約図を示す。
【図５】 図５は、実施例１で論じるように、まずマウスに腫瘍細胞を注射し、次いで様々な裸のDNA構築物でワクチン接種し(ワクチン接種1日目の後の1週間の追加免疫を含む);その後に肺結節の平均数を評価した実験からのデータの要約図を示す。データは、腫瘍細胞チャレンジ後の日数との相関関係として肺転移性腫瘍結節の平均数+SEMとして表している。
【図６】 図６は、実施例１で論じるように、様々な裸のDNA構築物でトランスフェクトした293DbKb標的細胞に対するエフェクター細胞としてDb制限E7特異的CD8+T細胞を用いたCTLアッセイのデータの要約図を示す。
【図７】 図７は、様々な裸のDNA構築物でトランスフェクトした293DbKb細胞の細胞溶解物をパルスした樹状細胞におけるE7のMHCクラスI提示を特性付けるためのクロスプライミング実験からのデータの要約図を示す。E7特異的CD8+T細胞は、エフェクター細胞として機能した；骨髄由来のDCに、トランスフェクトした293DbKb細胞の溶解物の連続希釈物をパルスした(50 mg/ml、10 mg/ml、2 mg/mlおよび0.4 mg/ml)；実施例１で論じるように、E7特異的CD8+T細胞がエフェクター細胞として機能する一方、DCは標的細胞として使用された。
【図８】 図８は、いずれの免疫エフェクター細胞も含まない肺への(すなわち、ヌードマウスへの）TC-1腫瘍転移処置における、E7もしくはCRTポリペプチド単独と比較したCRT/E7融合ポリペプチドの役割を評価するために設計した実験からのデータの要約図を示す。まずヌードマウスを腫瘍細胞でチャレンジし、2日後にTC-1腫瘍細胞でチャレンジした；その後に、マウスに様々な裸のDNA構築物をワクチン接種した。9日目および16日目に、これらのマウスを最初のワクチン接種と同じ処方計画で追加免疫した。実施例１で論じるように、マウスを21日目に屠殺し、各マウスの肺結節を評価および計数した。
【図９】 図９Aは、SINrep5、SINrep5-HSP70、SINrep5-E7、SINrep5-E7/HSP70のDNA構築物の概略図を示す。図９Bは、実施例２に詳細に説明するように、SP6 RNAポリメラーゼを用いてこれらのDNA構築物から誘導されたRNA転写産物の概略図を示す。
Claims (25)
- ワクチン組成物として有用な融合ポリペプチドをコードする核酸分子であって、
(a)カルレティキュリンポリペプチドを含む第1ポリペプチドをコードする第1核酸配列；
(b)場合によっては、第1核酸配列とインフレームで融合された、リンカーペプチドをコードするリンカー核酸配列；および
(c)前記第1核酸配列とインフレームで連結されるか、または前記リンカー核酸配列とインフレームで連結され、かつ抗原性ポリペプチドもしくはペプチドをコードする第2核酸配列、
を含む前記核酸分子。 - 抗原性ペプチドがMHCクラスIタンパク質に結合するエピトープを含む、請求項１に記載の核酸分子。
- 前記エピトープが8アミノ酸残基〜11アミノ酸残基の長さである、請求項２に記載の核酸分子。
- シャペロンポリペプチドが、以下のいずれかを含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の核酸分子：
（a）カルレティキュリン；
（b）ヒトカルレティキュリン；
（c）配列番号１の配列；
（d）配列番号１の第1残基〜第180残基の配列からなるカルレティキュリンポリペプチド；または
（e）配列番号１の第181残基〜第417残基の配列からなるカルレティキュリンポリペプチド。 - 以下のいずれかである請求項１〜４のいずれか１項に記載の核酸分子：
（a）抗原が病原性生物、細胞もしくはウイルスに存在するか、または病原性生物、細胞もしくはウイルスのエピトープと交差反応性を有する抗原である；
（b）抗原がHPV-16のE7ポリペプチドまたはその抗原性断片である；
（c）病原性生物が細菌である；
（d）病原性細胞が腫瘍細胞である；または
（e）抗原が腫瘍特異的抗原もしくは腫瘍関連抗原またはそれらの抗原性エピトープである。 - プロモーターに機能的に連結された、請求項１〜５のいずれか１項に記載の核酸分子。
- プロモーターが抗原提示細胞(APC)において発現されるプロモーターである、請求項６に記載の核酸分子。
- (a)プロモーター；および
(b)場合によっては、真核細胞において核酸の発現を調節する付加的調節配列、
に機能的に連結された請求項１〜７のいずれか１項に記載の核酸分子を含む発現ベクターもしくはカセット。 - 以下のいずれかである請求項８に記載の発現ベクターまたはカセット：
（a）ウイルスベクターもしくはプラスミド；または
（b）自己複製RNAレプリコン。 - 自己複製RNAレプリコンがシンドビスウイルスの自己複製RNAレプリコンである、請求項９に記載の発現ベクターもしくはカセット。
- 請求項１〜１０のいずれか１項に記載の核酸分子または発現ベクターもしくはカセットを含むように改変された細胞。
- （a）前記核酸分子を発現する；
（b）APCである；および／または
（c）樹状細胞、ケラチノサイト、マクロファージ、単球、Bリンパ球、小膠細胞、星状細胞もしくは活性化内皮細胞である、請求項１１に記載の細胞。 - 請求項１〜１０のいずれか１項に記載の核酸分子または発現ベクターもしくはカセットを含む粒子。
- パーティクルボンバードメントによる細胞もしくは動物への導入に好適な物質を含む、請求項１３に記載の粒子。
- 物質が金である、請求項１４に記載の粒子。
- (a)カルレティキュリンポリペプチドを含む第1ポリペプチド；および
(b)抗原性ペプチドもしくはポリペプチドを含む第2ポリペプチド、
を含む、ワクチン組成物として有用な融合もしくはキメラポリペプチド。 - 抗原性ペプチドもしくはポリペプチドがMHCクラスIタンパク質に結合し、かつMHCクラスIタンパク質によって細胞表面上に提示されるエピトープを含む、請求項１６に記載の融合もしくはキメラポリペプチド。
- カルレティキュリンポリペプチドおよび抗原性ポリペプチドもしくはペプチドが化学的リンカーによって連結されている、請求項１６または１７に記載の融合もしくはキメラポリペプチド。
- （a）第1ポリペプチドが第2ポリペプチドに対してN末端側にある；
または
（b）第2ポリペプチドが第1ポリペプチドに対してN末端側にある、請求項１６、１７または１８に記載の融合ポリペプチド。 - 抗原特異的免疫応答を誘導または増強することができる医薬組成物であって、
(a)(b)の組成物と組み合わせる製薬上および免疫学上許容される賦形剤；
(b) (i)請求項１〜１０のいずれか1項に記載の核酸分子または発現ベクターもしくはカセット；
(ii)請求項１１または１２に記載の細胞；
(iii)請求項１３〜１５のいずれか１項に記載の粒子；
(iv)請求項１６〜１９のいずれか１項に記載の融合もしくはキメラポリペプチド；および
(v)(i)〜(iv)の任意の組合せ、
からなる群から選択される組成物、
を含む前記医薬組成物。 - 被験者において抗原特異的免疫応答を増強する医薬の製造における、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の核酸分子、または発現ベクターもしくはカセット、請求項１１もしくは１２に記載の細胞、請求項１３〜１５のいずれか1項に記載の粒子、あるいは請求項１６〜１９のいずれか1項に記載の融合もしくはキメラポリペプチドの使用。
- 医薬が筋内、皮内または皮下経路によって、バイオリスティックインジェクションによって、または腫瘍内投与もしくは腫瘍周辺投与によって投与される、請求項２１に記載の使用。
- 被験者において選択した抗原に特異的なCD8+CTLの数または溶解活性を増大するための医薬の製造における、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の核酸分子、または発現ベクターもしくはカセット、請求項１１もしくは１２に記載の細胞、請求項１３〜１５のいずれか1項に記載の粒子、あるいは請求項１６〜１９のいずれか1項に記載の融合もしくはキメラポリペプチドの使用。
- 細胞において抗原特異的免疫応答を誘導または増強するex vivo方法であって、前記細胞に請求項２０に記載の医薬組成物の有効量をex vivoにて投与し、それによって前記応答を誘導または増強することを含む、前記方法。
- （a）細胞がヒト細胞である；
（b）細胞がAPCを含む；
（c）細胞が樹状細胞であるAPCを含む；および／または
（d）細胞が生きた被験者から単離されたAPCを含む、
請求項２４に記載の方法。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US22290200P | 2000-08-03 | 2000-08-03 | |
| US60/222,902 | 2000-08-03 | ||
| PCT/US2001/024134 WO2002012281A2 (en) | 2000-08-03 | 2001-08-02 | Molecular vaccine linking an endoplasmic reticulum chaperone polypeptide to an antigen |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2008197856A Division JP2009017883A (ja) | 2000-08-03 | 2008-07-31 | 抗原に小胞体シャペロンポリペプチドを連結した分子ワクチン |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2004527213A JP2004527213A (ja) | 2004-09-09 |
| JP2004527213A5 JP2004527213A5 (ja) | 2008-09-18 |
| JP5087201B2 true JP5087201B2 (ja) | 2012-12-05 |
Family
ID=22834209
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2002518253A Expired - Lifetime JP5087201B2 (ja) | 2000-08-03 | 2001-08-02 | 抗原に小胞体シャペロンポリペプチドを連結した分子ワクチン |
| JP2008197856A Pending JP2009017883A (ja) | 2000-08-03 | 2008-07-31 | 抗原に小胞体シャペロンポリペプチドを連結した分子ワクチン |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2008197856A Pending JP2009017883A (ja) | 2000-08-03 | 2008-07-31 | 抗原に小胞体シャペロンポリペプチドを連結した分子ワクチン |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| US (3) | US7342002B2 (ja) |
| EP (1) | EP1363938B1 (ja) |
| JP (2) | JP5087201B2 (ja) |
| AU (1) | AU2001278117A1 (ja) |
| CA (1) | CA2417214C (ja) |
| DK (1) | DK1363938T3 (ja) |
| ES (1) | ES2454640T3 (ja) |
| WO (1) | WO2002012281A2 (ja) |
Families Citing this family (44)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20050100928A1 (en) * | 1999-09-16 | 2005-05-12 | Zycos Inc., A Delaware Corporation | Nucleic acids encoding polyepitope polypeptides |
| US8128922B2 (en) | 1999-10-20 | 2012-03-06 | Johns Hopkins University | Superior molecular vaccine linking the translocation domain of a bacterial toxin to an antigen |
| US7318928B2 (en) * | 2000-08-01 | 2008-01-15 | The Johns Hopkins University | Molecular vaccine linking intercellular spreading protein to an antigen |
| JP5087201B2 (ja) | 2000-08-03 | 2012-12-05 | ジョンズ・ホプキンス・ユニバーシティ | 抗原に小胞体シャペロンポリペプチドを連結した分子ワクチン |
| US7557200B2 (en) | 2001-02-01 | 2009-07-07 | Johns Hopkins University | Superior molecular vaccine based on self-replicating RNA, suicidal DNA or naked DNA vector, that links antigen with polypeptide that promotes antigen presentation |
| US20070026501A1 (en) * | 2003-04-18 | 2007-02-01 | Joe Chiba | Immunogen, composition for immulogical use and process for producing antibody using the same |
| EP1644048B1 (en) | 2003-05-05 | 2015-04-29 | Johns Hopkins University | Anti-cancer dna vaccine employing plasmids encoding signal sequence, mutant oncoprotein antigen, and heat shock protein |
| CA2526720C (en) | 2003-05-22 | 2013-10-22 | Fraunhofer Usa, Inc. | Recombinant carrier molecule for expression, delivery and purification of target polypeptides |
| WO2005081716A2 (en) * | 2003-11-24 | 2005-09-09 | The Johns Hopkins University | DNA VACCINES TARGETING ANTIGENS OF THE SEVERE ACUTE RESPIRATORY SYNDROME CORONAVIRUS (SARS-CoV) |
| EP1699479A1 (en) * | 2003-12-24 | 2006-09-13 | Leiden University Medical Center | Synthetic protein as tumor-specific vaccine |
| EP1811026B1 (en) | 2004-10-15 | 2015-01-28 | Sekisui Chemical Co., Ltd. | Method of immunizing animal, composition for immunization, method of producing antibody, method of producing hybridoma and method of producing monoclonal antibody |
| WO2006073970A2 (en) | 2005-01-06 | 2006-07-13 | The Johns Hopkins University | Rna interference that blocks expression of pro-apoptotic proteins potentiates immunity induced by dna and transfected dendritic cell vaccines |
| CA2595726A1 (en) * | 2005-01-26 | 2006-08-03 | The Johns Hopkins University | Anti-cancer dna vaccine employing plasmids encoding mutant oncoprotein antigen and calreticulin |
| US8962278B2 (en) * | 2005-08-03 | 2015-02-24 | Ibio Inc. | Compositions and methods for production of immunoglobulins |
| CA2642056A1 (en) * | 2006-02-13 | 2007-08-23 | Fraunhofer Usa, Inc. | Hpv antigens, vaccine compositions, and related methods |
| US8277816B2 (en) * | 2006-02-13 | 2012-10-02 | Fraunhofer Usa, Inc. | Bacillus anthracis antigens, vaccine compositions, and related methods |
| WO2008024844A2 (en) * | 2006-08-22 | 2008-02-28 | The Johns Hopkins University | Anticancer combination therapies |
| WO2008046251A1 (fr) * | 2006-10-19 | 2008-04-24 | Sunbio Biotech Pharmaceuticals(Tianjin) Co., Ltd. | Protéines hybrides contenant un domaine n de la calréticuline humaine et des protéines e6 ou e7 du papillomavirus humain de type 16, et utilisations associées |
| US9085638B2 (en) | 2007-03-07 | 2015-07-21 | The Johns Hopkins University | DNA vaccine enhancement with MHC class II activators |
| US20080260765A1 (en) * | 2007-03-15 | 2008-10-23 | Johns Hopkins University | HPV DNA Vaccines and Methods of Use Thereof |
| US20100291683A1 (en) * | 2007-03-27 | 2010-11-18 | Lung-Ji Chang | Modified Antigen Presenting Cells and Methods of Use |
| US8404252B2 (en) | 2007-07-11 | 2013-03-26 | Fraunhofer Usa, Inc. | Yersinia pestis antigens, vaccine compositions, and related methods |
| KR20110011595A (ko) * | 2008-01-28 | 2011-02-08 | 탭이뮨, 인크. | 면역 반응 증진을 위한 타파신 증대 |
| AU2009223838B2 (en) | 2008-03-03 | 2012-07-26 | The University Of Miami | Allogeneic cancer cell-based immunotherapy |
| CN102036677A (zh) | 2008-03-20 | 2011-04-27 | 迈阿密大学 | 热休克蛋白gp96的疫苗接种及其使用方法 |
| US20090285861A1 (en) * | 2008-04-17 | 2009-11-19 | Tzyy-Choou Wu | Tumor cell-based cancer immunotherapeutic compositions and methods |
| WO2010030861A2 (en) * | 2008-09-11 | 2010-03-18 | Calretex, Llc | Compositions and methods for purifying calreticulin |
| US8734803B2 (en) | 2008-09-28 | 2014-05-27 | Ibio Inc. | Humanized neuraminidase antibody and methods of use thereof |
| EP2483307A1 (en) | 2009-09-29 | 2012-08-08 | Fraunhofer USA, Inc. | Influenza hemagglutinin antibodies, compositions, and related methods |
| US10487332B2 (en) * | 2010-07-06 | 2019-11-26 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Immunisation of large mammals with low doses of RNA |
| EP2678031A4 (en) * | 2011-02-23 | 2015-09-02 | Univ Miami | COMBINED VACCINATION WITH CELL-BASED GP96-IG-SIV / HIV AND THE RECOMBINANT PROTEIN GP120 FOR PROTECTION AGAINST SIV / HIV |
| RU2670745C9 (ru) | 2011-05-24 | 2018-12-13 | Бионтех Рна Фармасьютикалс Гмбх | Индивидуализированные противоопухолевые вакцины |
| JP5981921B2 (ja) * | 2011-09-02 | 2016-08-31 | 株式会社カネカ | 小胞体シャペロンプロモータを用いた外来遺伝子を発現するトランスジェニック鳥類 |
| WO2013093629A2 (en) * | 2011-12-20 | 2013-06-27 | Netherlands Cancer Institute | Modular vaccines, methods and compositions related thereto |
| AU2013351542B2 (en) | 2012-11-28 | 2018-08-09 | BioNTech SE | Individualized vaccines for cancer |
| WO2014164727A1 (en) | 2013-03-12 | 2014-10-09 | Wisconsin Alumni Research Foundation | A method of treating fungal infection |
| US10676723B2 (en) | 2015-05-11 | 2020-06-09 | David Gordon Bermudes | Chimeric protein toxins for expression by therapeutic bacteria |
| US20170252417A1 (en) * | 2016-03-07 | 2017-09-07 | Massachusetts Institute Of Technology | Protein-chaperoned t-cell vaccines |
| US11180535B1 (en) | 2016-12-07 | 2021-11-23 | David Gordon Bermudes | Saccharide binding, tumor penetration, and cytotoxic antitumor chimeric peptides from therapeutic bacteria |
| US11129906B1 (en) | 2016-12-07 | 2021-09-28 | David Gordon Bermudes | Chimeric protein toxins for expression by therapeutic bacteria |
| WO2018224166A1 (en) | 2017-06-09 | 2018-12-13 | Biontech Rna Pharmaceuticals Gmbh | Methods for predicting the usefulness of disease specific amino acid modifications for immunotherapy |
| ES3013993T3 (en) | 2017-07-04 | 2025-04-16 | CureVac SE | Cancer rna-vaccine |
| CN109182339A (zh) * | 2018-09-06 | 2019-01-11 | 青岛农业大学 | 一种许氏平鮋钙网蛋白基因及应用 |
| EP4061405A1 (en) | 2019-11-18 | 2022-09-28 | Janssen Biotech, Inc. | Vaccines based on mutant calr and jak2 and their uses |
Family Cites Families (78)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5744133A (en) * | 1986-08-13 | 1998-04-28 | Transgene S.A. | Expression of a tumor-specific antigen by a recombinant vector virus and use thereof in preventitive or curative treatment of the corresponding tumor |
| US4898730A (en) * | 1987-03-13 | 1990-02-06 | The University Of British Columbia | Method to stimulate the immune response to specific antigens |
| US5582831A (en) * | 1991-11-26 | 1996-12-10 | Yeda Research And Development Co., Ltd. | Anti-tumor vaccines |
| CA1338778C (en) | 1988-06-15 | 1996-12-10 | Richard A. Young | Stress proteins and uses therefor |
| US5217879A (en) * | 1989-01-12 | 1993-06-08 | Washington University | Infectious Sindbis virus vectors |
| DE3907721A1 (de) * | 1989-03-10 | 1990-09-20 | Behringwerke Ag | Immunogene regionen auf dem e7-protein des humanen papillomvierus typ 16 |
| US5545727A (en) * | 1989-05-10 | 1996-08-13 | Somatogen, Inc. | DNA encoding fused di-alpha globins and production of pseudotetrameric hemoglobin |
| US5348945A (en) * | 1990-04-06 | 1994-09-20 | Wake Forest University | Method of treatment with hsp70 |
| US5821088A (en) * | 1990-05-11 | 1998-10-13 | Siga Pharmaceuticals, Inc. | Use of gram-positive bacteria to express recombinant proteins |
| AU8762991A (en) | 1990-09-26 | 1992-04-15 | Bristol-Myers Squibb Company | Human papilloma viral protein expression for use in vaccine compositions |
| US5674486A (en) * | 1991-06-25 | 1997-10-07 | San Diego Regional Cancer Center | Cancer immunotherapy with carrier cells |
| ES2193133T3 (es) * | 1991-07-13 | 2003-11-01 | Dade Behring Marburg Gmbh | Uso de peptidos derivados de los genes e6 y e7 de hpv-16 para fines. |
| GB9207701D0 (en) | 1992-04-08 | 1992-05-27 | Cancer Res Campaign Tech | Papillomavirus e7 protein |
| IL106760A (en) | 1992-08-25 | 1999-12-31 | Miles Inc | Protein-nucleic acid hybrid construct for translocating an exogenous nucleic acid into a target cell and nucleus |
| US5618536A (en) * | 1992-09-03 | 1997-04-08 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Chimeric papillomavirus-like particles |
| US5997869A (en) * | 1993-03-15 | 1999-12-07 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Peptides containing a fusion joint of a chimeric protein encoded by DNA spanning a tumor-associated chromosomal translocation and their use as immunogens |
| GB9306731D0 (en) * | 1993-03-31 | 1993-05-26 | Cancer Res Campaign Tech | Vaccines |
| US5426097A (en) * | 1993-04-06 | 1995-06-20 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Calreticulin: a novel antithrombotic agent |
| ES2171454T3 (es) | 1993-06-04 | 2002-09-16 | Whitehead Biomedical Inst | Proteinas de estres y sus usos. |
| US5646008A (en) | 1993-06-22 | 1997-07-08 | The Regent Of The University Of Michigan | Vertebrate apoptosis gene: compositions and methods |
| US5591716A (en) * | 1993-11-19 | 1997-01-07 | New York University | Beneficial wound healing applications of calreticulin and other hyaluronan-associated proteins |
| EP0659438A1 (en) | 1993-12-23 | 1995-06-28 | Boehringer Mannheim Gmbh | Conjugates consisting of peptidic T cell antigens and cell binding groups, and their use for therapy |
| US5750119A (en) * | 1994-01-13 | 1998-05-12 | Mount Sinai School Of Medicine Of The City University Of New York | Immunotherapeutic stress protein-peptide complexes against cancer |
| AUPM566794A0 (en) * | 1994-05-17 | 1994-06-09 | University Of Queensland, The | Process and product |
| US5854202A (en) | 1995-01-24 | 1998-12-29 | Dedhar; Shoukat | Peptide fragments of calreticulin, peptide mimetics thereof, and pharmaceutical compostions comprising same |
| AU5512096A (en) | 1995-05-17 | 1996-11-29 | University Of Alberta | Method of inhibiting restenosis using calreticulin |
| US5792462A (en) * | 1995-05-23 | 1998-08-11 | University Of North Carolina At Chapel Hill | Alphavirus RNA replicon systems |
| AU6504596A (en) | 1995-07-21 | 1997-02-18 | Rhone-Poulenc Rorer Pharmaceuticals Inc. | Adeno-associated viral liposomes and their use in transfecting dendritic cells to stimulate specific immunity |
| AU724399B2 (en) | 1995-08-18 | 2000-09-21 | Sloan-Kettering Institute For Cancer Research | Heat shock protein-based vaccines and immunotherapies |
| US5935576A (en) * | 1995-09-13 | 1999-08-10 | Fordham University | Compositions and methods for the treatment and prevention of neoplastic diseases using heat shock proteins complexed with exogenous antigens |
| US5837251A (en) * | 1995-09-13 | 1998-11-17 | Fordham University | Compositions and methods using complexes of heat shock proteins and antigenic molecules for the treatment and prevention of neoplastic diseases |
| DE19534348C2 (de) | 1995-09-15 | 1997-07-10 | Wieland Heinrich Prof Dr Med | Verfahren zur Bestimmung von Autoimmunphänomenen |
| US5824309A (en) * | 1995-12-05 | 1998-10-20 | University Of Massachusetts | Recombinant gas vesicles and uses thereof |
| EP0921816A4 (en) * | 1996-03-28 | 2004-09-22 | Whitehead Biomedical Inst | CELLS WITH INCREASED OPSONINE CONTENT AND METHOD FOR REGULATING AN IMMUNE RESPONSE TO ANTIQUE |
| JP4108126B2 (ja) | 1996-04-26 | 2008-06-25 | リュクスウニヴェルシテート テ レイデン | Ｔ細胞ペプチド・エピトープの選択と産生方法および選択したエピトープを組込むワクチン |
| US5951975A (en) * | 1996-06-28 | 1999-09-14 | University Of Pittsburgh | Induction of CTLs specific for natural antigens by cross priming immunization |
| IN183280B (ja) * | 1996-09-20 | 1999-10-30 | Univ New Mexico | |
| US5962318A (en) * | 1996-11-15 | 1999-10-05 | St. Jude Children's Research Hospital | Cytotoxic T lymphocyte-mediated immunotherapy |
| DK0941315T3 (da) | 1996-11-26 | 2006-05-15 | Stressgen Biotechnologies Corp | Fusionsproteiner indeholdende stressproteiner til induktion af immunreaktioner |
| US6046158A (en) * | 1996-12-20 | 2000-04-04 | Board Of Regents The University Of Texas Systems | Unique dendritic cell-associated C-type lectins, dectin-1 and dectin-2; compositions and uses thereof |
| US6017735A (en) | 1997-01-23 | 2000-01-25 | Marie Curie Cancer Care | Materials and methods for intracellular transport and their uses |
| US5830464A (en) * | 1997-02-07 | 1998-11-03 | Fordham University | Compositions and methods for the treatment and growth inhibition of cancer using heat shock/stress protein-peptide complexes in combination with adoptive immunotherapy |
| US6017540A (en) * | 1997-02-07 | 2000-01-25 | Fordham University | Prevention and treatment of primary and metastatic neoplastic diseases and infectious diseases with heat shock/stress protein-peptide complexes |
| AU7022898A (en) | 1997-04-23 | 1998-11-13 | Ontario Cancer Treatment & Research Foundation | Calreticulin-deficient cells |
| US6319503B1 (en) | 1998-02-19 | 2001-11-20 | Proteinix Company | Heat shock fusion-based vaccine system |
| WO1999007869A1 (en) | 1997-08-05 | 1999-02-18 | University Of Florida | Live recombinant vaccine comprising inefficiently or non-replicating virus |
| KR20060111731A (ko) * | 1997-08-05 | 2006-10-27 | 스트레스젠 바이오테크놀러지스 코포레이션 | 사람 유두종 바이러스 항원과 스트레스 단백질을 포함하는융합 단백질을 포함하는 조성물에 의해 유도된 사람 유두종바이러스 항원에 대한 면역 반응 |
| US6007821A (en) * | 1997-10-16 | 1999-12-28 | Fordham University | Method and compositions for the treatment of autoimmune disease using heat shock proteins |
| US6331388B1 (en) * | 1997-10-17 | 2001-12-18 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Immune response enhancer |
| US5948646A (en) * | 1997-12-11 | 1999-09-07 | Fordham University | Methods for preparation of vaccines against cancer comprising heat shock protein-peptide complexes |
| US6534482B1 (en) | 1998-05-13 | 2003-03-18 | Epimmune, Inc. | Expression vectors for stimulating an immune response and methods of using the same |
| WO1999065940A1 (en) | 1998-06-17 | 1999-12-23 | Beth Israel Deaconess Medical Center | Anti-angiogenic proteins and methods of use thereof |
| WO2000014244A2 (en) * | 1998-09-04 | 2000-03-16 | Connaught Laboratories Limited | Treatment of cervical cancer |
| US7001995B1 (en) * | 1999-08-25 | 2006-02-21 | Merck & Co., Inc. | Synthetic human papillomavirus genes |
| US8128922B2 (en) * | 1999-10-20 | 2012-03-06 | Johns Hopkins University | Superior molecular vaccine linking the translocation domain of a bacterial toxin to an antigen |
| US6734173B1 (en) * | 1999-10-20 | 2004-05-11 | Johns Hopkins University | HSP DNA vaccines |
| JP2004500047A (ja) | 1999-10-20 | 2004-01-08 | ザ ジョンズ ホプキンス ユニバーシティー スクール オブ メディシン | キメラ免疫原性組成物およびこれらをコードする核酸 |
| US20010034042A1 (en) * | 2000-01-20 | 2001-10-25 | Srivastava Pramod K. | Complexes of peptide-binding fragments of heat shock proteins and their use as immunotherapeutic agents |
| US6967075B2 (en) * | 2000-04-07 | 2005-11-22 | Schering Corporation | HCV replicase complexes |
| US7030219B2 (en) * | 2000-04-28 | 2006-04-18 | Johns Hopkins University | B7-DC, Dendritic cell co-stimulatory molecules |
| PL359930A1 (en) | 2000-06-26 | 2004-09-06 | Stressgen Biotechnologies Corporation | Human papilloma virus treatment |
| US7318928B2 (en) * | 2000-08-01 | 2008-01-15 | The Johns Hopkins University | Molecular vaccine linking intercellular spreading protein to an antigen |
| JP5087201B2 (ja) * | 2000-08-03 | 2012-12-05 | ジョンズ・ホプキンス・ユニバーシティ | 抗原に小胞体シャペロンポリペプチドを連結した分子ワクチン |
| JP3930243B2 (ja) * | 2000-11-06 | 2007-06-13 | 本田技研工業株式会社 | マグネットポンプ |
| DE60130583T3 (de) * | 2000-12-01 | 2018-03-22 | Europäisches Laboratorium für Molekularbiologie | Kleine rns moleküle, die rns-interferenz vermitteln |
| US7892730B2 (en) * | 2000-12-22 | 2011-02-22 | Sagres Discovery, Inc. | Compositions and methods for cancer |
| US7557200B2 (en) * | 2001-02-01 | 2009-07-07 | Johns Hopkins University | Superior molecular vaccine based on self-replicating RNA, suicidal DNA or naked DNA vector, that links antigen with polypeptide that promotes antigen presentation |
| AU2002306736A1 (en) | 2001-03-16 | 2002-10-03 | Johns Hopkins University | A replication-defective alphavirus vaccine linking antigen with an immunogenicity-potentiating polypeptide and a method of delivery the same |
| US20030144221A1 (en) | 2001-07-17 | 2003-07-31 | Isis Pharmaceuticals Inc. | Antisense modulation of BCL2-associated X protein expression |
| US7410758B2 (en) * | 2001-07-20 | 2008-08-12 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Methods and compositions relating to HPV-associated pre-cancerous and cancerous growths, including CIN |
| US20060040262A1 (en) | 2002-12-27 | 2006-02-23 | Morris David W | Novel compositions and methods in cancer |
| AU2003224732A1 (en) | 2002-03-25 | 2003-10-13 | The Trustees Of Boston University | Method of using anti-apoptotic factors in gene expression |
| AU2003282731B2 (en) | 2002-10-03 | 2009-01-08 | Wyeth Holdings Corporation | Human papillomavirus polypeptides and immunogenic compositions |
| US20070026076A1 (en) * | 2003-02-24 | 2007-02-01 | Tzyy-Choou Wu | Molecular vaccines employing nucleic acid encoding anti-apoptotic proteins |
| EP1644048B1 (en) | 2003-05-05 | 2015-04-29 | Johns Hopkins University | Anti-cancer dna vaccine employing plasmids encoding signal sequence, mutant oncoprotein antigen, and heat shock protein |
| WO2005081716A2 (en) | 2003-11-24 | 2005-09-09 | The Johns Hopkins University | DNA VACCINES TARGETING ANTIGENS OF THE SEVERE ACUTE RESPIRATORY SYNDROME CORONAVIRUS (SARS-CoV) |
| WO2006073970A2 (en) | 2005-01-06 | 2006-07-13 | The Johns Hopkins University | Rna interference that blocks expression of pro-apoptotic proteins potentiates immunity induced by dna and transfected dendritic cell vaccines |
| CA2595726A1 (en) | 2005-01-26 | 2006-08-03 | The Johns Hopkins University | Anti-cancer dna vaccine employing plasmids encoding mutant oncoprotein antigen and calreticulin |
-
2001
- 2001-08-02 JP JP2002518253A patent/JP5087201B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 2001-08-02 EP EP01956081.2A patent/EP1363938B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2001-08-02 DK DK01956081.2T patent/DK1363938T3/en active
- 2001-08-02 US US10/343,448 patent/US7342002B2/en not_active Expired - Lifetime
- 2001-08-02 WO PCT/US2001/024134 patent/WO2002012281A2/en not_active Ceased
- 2001-08-02 ES ES01956081.2T patent/ES2454640T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2001-08-02 AU AU2001278117A patent/AU2001278117A1/en not_active Abandoned
- 2001-08-02 CA CA2417214A patent/CA2417214C/en not_active Expired - Lifetime
-
2008
- 2008-01-15 US US12/014,541 patent/US8007781B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2008-07-31 JP JP2008197856A patent/JP2009017883A/ja active Pending
-
2012
- 2012-05-03 US US13/463,250 patent/US20130203961A1/en not_active Abandoned
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US7342002B2 (en) | 2008-03-11 |
| JP2004527213A (ja) | 2004-09-09 |
| CA2417214C (en) | 2016-06-21 |
| ES2454640T3 (es) | 2014-04-11 |
| DK1363938T3 (en) | 2014-03-24 |
| CA2417214A1 (en) | 2002-02-14 |
| WO2002012281A2 (en) | 2002-02-14 |
| US20130203961A1 (en) | 2013-08-08 |
| AU2001278117A1 (en) | 2002-02-18 |
| EP1363938B1 (en) | 2013-12-11 |
| US8007781B2 (en) | 2011-08-30 |
| US20050054820A1 (en) | 2005-03-10 |
| US20090148471A1 (en) | 2009-06-11 |
| EP1363938A2 (en) | 2003-11-26 |
| JP2009017883A (ja) | 2009-01-29 |
| WO2002012281A3 (en) | 2003-07-10 |
| WO2002012281A9 (en) | 2003-03-06 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP5087201B2 (ja) | 抗原に小胞体シャペロンポリペプチドを連結した分子ワクチン | |
| EP1222289B1 (en) | Chimeric immunogenic compositions and nucleic acids encoding them | |
| AU2021232660B2 (en) | HPV vaccines | |
| Velders et al. | Defined flanking spacers and enhanced proteolysis is essential for eradication of established tumors by an epitope string DNA vaccine | |
| US7318928B2 (en) | Molecular vaccine linking intercellular spreading protein to an antigen | |
| US10166276B2 (en) | Compositions and methods for treatment of non-hodgkins lymphoma | |
| Cheng et al. | Enhancement of sindbis virus self-replicating RNA vaccine potency by targeting antigen to endosomal/lysosomal compartments | |
| KR20020068040A (ko) | 키메라 면역원성 조성물 및 그들을 암호화하는 핵산 | |
| WO2009002418A2 (en) | T-cell peptide epitopes from carcinoembryonic antigen, immunogenic analogs, and uses thereof | |
| EP1644048B1 (en) | Anti-cancer dna vaccine employing plasmids encoding signal sequence, mutant oncoprotein antigen, and heat shock protein | |
| US20080260765A1 (en) | HPV DNA Vaccines and Methods of Use Thereof | |
| Fissolo | Priming polyvalent immunity by DNA vaccines expressing chimeric antigens with a stress protein-capturing, viral J-domain | |
| WO2019101062A9 (zh) | 重组疫苗及其应用 | |
| JP2008528004A (ja) | 突然変異癌タンパク質抗原およびカルレティキュリンをコードするプラスミドを用いる抗癌ｄｎａワクチン | |
| US20080095789A1 (en) | Vaccine | |
| Gérard et al. | Recombinant human papillomavirus type 16 E7 protein as a model antigen to study the vaccine potential in control and E7 transgenic mice | |
| JP2007505601A (ja) | ワクチン | |
| Li | Development of multiple formulations of heat shock protein based vaccines for cancer immunotherapy | |
| MXPA02003986A (en) | Chimeric immunogenic compositions and nucleic acids encoding them |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20080731 |
|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20080731 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20110426 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20110725 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20120117 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20120517 |
|
| A911 | Transfer to examiner for re-examination before appeal (zenchi) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911 Effective date: 20120724 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20120814 |
|
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20120910 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 Ref document number: 5087201 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20150914 Year of fee payment: 3 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |