JP5052009B2 - 走査型顕微鏡および標本画像取得方法 - Google Patents

Description

本発明は、生物標本の研究ツールとして用いられる走査型顕微鏡および標本画像取得方法に関する。

従来、生物標本の研究ツールとして用いられる走査型顕微鏡として、例えば、特開平１０−１０４３６号公報に開示されるようにレーザ光を標本上の１点に収束させ、この収束点を標本上で２次元方向に走査して標本の２次元輝度情報を取得する走査型レーザ顕微鏡が知られている。

走査型レーザ顕微鏡には、シングルビームからなるレーザ光が用いられるが、かかるレーザ光は、収束性がよいので、標本のＸＹ平面上での微細な１点の光学的情報を取得するのに効果的である。また、標本からの検出光を、標本上の収束点と光学的に共役な位置に配置したピンホールを介して検出する共焦点光学系により検出するので、焦点のずれた位置からの光を排除することができ、さらに精度高い光学的情報を取得できる。

従って、共焦点レーザ顕微鏡によれば、標本の３次元空間の中の１点の光学的情報を取得でき、また、レーザ光をＸＹ平面、ＸＺ平面、その他の２次元平面に沿って走査し、上述した１点ごとの情報を走査した位置に応じて並べることができるので、光学的なスライス像を形成することもできる。また、レーザビームの走査には、一般的にガルバノミラーが使用される。ＸＹ方向にそれぞれ走査する２枚のガルバノミラーを組み合わせて動かすことにより、画像化領域がテレビのラスター走査のように１ラインずつＸＹ走査される。ラスター走査ではＸ方向に隣り合う一点に順次レーザ光が照射され、そのときに得られる標本からの光（蛍光、反射光など）が検出器で検出される。この場合、ある点（Ｘｎ，Ｙｎ）にレーザ光を照射して蛍光を検出してから隣接する次の点（Ｘｎ＋１，Ｙｎ＋１）に移るまでの時間差は、マイクロ秒のオーダーである。

ところで、共焦点レーザ顕微鏡は、蛍光観察に用いられるＣａｇｅｄ手法等に有効とされている。ここで、Ｃａｇｅｄ手法とは、標本内にケージド試薬とカルシウムイオン濃度に感受性を有する蛍光指示薬を注入し、標本のある部分に刺激用レーザ光を照射することで、ケージド試薬のケージド基を開裂させて、内部に包含された物質を放出させ、その時のカルシウムイオン濃度の経時変化を、観察用励起レーザ光を標本に照射することにより蛍光観察する方法である。この方法によれば、例えば、標本に、カルシウムイオンを結合させたＣａｇｅｄ化合物を導入した場合、点（Ｘｎ，Ｙｎ）にＣａｇｅｄ化合物を解除するＵＶレーザを照射すると、その位置にあるＣａｇｅｄ化合物が開裂され、保持されていたＣａ^２＋イオンが放出される。このカルシウムイオンに対して観察標本がある反応を起こす。この反応によって発生した蛍光を検出器により検出することにより、カルシウムイオンの刺激に対する標本の反応の様子が観察される。

しかし、点（Ｘｎ，Ｙｎ）から放出されたカルシウムイオンの影響は、点（Ｘｎ，Ｙｎ）だけにとどまらず、その周囲（例えば、次の点（Ｘｎ＋１，Ｙｎ））にまで及ぶ可能性がある。また、放出されたカルシウムイオンが点（Ｘｎ，Ｙｎ）にだけとどまっていたとしても、その刺激による観察標本の反応挙動は、点（Ｘｎ，Ｙｎ）にとどまらず、その周囲に及ぶ可能性もある。

このことは、点（Ｘｎ，Ｙｎ）のデータ取得を行った直後に隣り合う次の点（Ｘｎ＋１，Ｙｎ）のデータ取得を行うと、前の点（Ｘｎ，Ｙｎ）に対する刺激の反応挙動の影響が合わさったデータになってしまうおそれがある。これは、個々の点（Ｘｎ，Ｙｎ）（Ｘｎ＋１，Ｙｎ）それぞれの反応挙動のデータを独立して取得したいという研究者の要求に反する。

また、刺激を行わず単に標本内に導入した蛍光色素をレーザ光で励起して蛍光観察を行う場合も、観察する蛍光の寿命が短ければ、さほど問題にならないが、例えば、マイクロ秒オーダーの長い寿命を持つ場合は、隣り合う点を順に走査して行くと、やはり、ある点（Ｘｎ＋１，Ｙｎ）のデータが前の点（Ｘｎ，Ｙｎ）の影響を受けてしまうという問題が生じる。

本発明の目的は、データ取得を行う標本の点相互の影響を排除して個々の点の輝度を正しく検出する走査型顕微鏡を提供することである。

本発明は走査型顕微鏡に向けられている。本発明による走査型顕微鏡は、レーザ光を射出する光源手段と、標本上のデータ取得点に前記レーザ光を収束して照射する照射手段と、隣り合うデータ取得点が連続しないデータ取得順序を決定するデータ取得順序決定手段と、前記データ取得順序に従って前記レーザ光を走査する走査手段と、各データ取得点において複数回のサンプリングを連続して行うことにより各データ取得点からの光の複数の輝度情報を検出する検出手段と、前記検出手段により検出される各データ取得点からの光の複数の輝度情報を前記データ取得点の位置情報に対応付けして保存する記憶手段と、前記検出手段により検出される各データ取得点からの光の複数の輝度情報のうち、各データ取得点において同じ順位で検出された輝度情報同士をそれぞれの前記データ取得点の前記位置情報と対応付けて１枚の２次元画像を生成し、これを各取得順位について行うことにより複数の２次元画像を形成する画像形成手段とを備えている。

また本発明は標本画像取得方法に向けられている。本発明による標本画像取得方法は、標本上のデータ取得点にレーザ光を収束して照射し、前記データ取得点が隣り合わない順序に従って前記レーザ光を走査し、各データ取得点において複数回のサンプリングを連続して行うことにより各データ取得点からの光の複数の輝度情報を検出し、検出した各データ取得点からの光の複数の輝度情報を前記データ取得点の位置情報に対応付けして保存し、各データ取得点からの光の複数の輝度情報のうち、各データ取得点において同じ順位で検出された輝度情報同士をそれぞれの前記データ取得点の前記位置情報と対応付けて１枚の２次元画像を生成し、これを各取得順位について行うことにより複数の２次元画像を形成する。

本発明によれば、データ取得を行う標本の点相互の影響を排除して、個々の点の輝度を正しく検出する走査型顕微鏡が提供される。

以下、本発明の実施の形態を図面に従い説明する。

＜第１の実施の形態＞
図１は、本発明の第１の実施の形態にかかる共焦点レーザ顕微鏡の概略構成を示している。

図１に示されるように、共焦点レーザ顕微鏡は、レーザ光（励起光）を射出するための光源手段としてのレーザ光源ユニット１と、レーザ光の光路を曲げる反射ミラー７と、レーザ光を２次元走査するための走査手段としての走査光学ユニット９と、レーザ光を標本１１上のデータ取得点に収束させる対物レンズ１０と、レーザ光と蛍光とを分離するダイクロイックミラー８と、蛍光を検出するための検出手段としての検出器１２とを有している。

レーザ光源ユニット１は、レーザ光源２、３と、反射ミラー４と、ダイクロイックミラー５と、音響光学可変フィルタ（ＡＯＴＦ）６とを含んでいる。レーザ光源２、３は、波長の異なるレーザ光を発する。反射ミラー４は、レーザ光源２からのレーザ光の光路上に配置されている。ダイクロイックミラー５は、レーザ光源３からのレーザ光の光路上で、反射ミラー４で反射されるレーザ光との交点上に配置されている。ダイクロイックミラー５は、これら２つのレーザ光路を合成する。ダイクロイックミラー５は、レーザ光源３からのレーザ光を透過し、反射ミラー４で反射されるレーザ光を反射する。ＡＯＴＦ６は、ダイクロイックミラー５により合成されたレーザ光の光路上に配置されている。ＡＯＴＦ６は、レーザ光の強度、レーザ光の波長成分、レーザ光照射のオンオフなどの制御を可能にしている。

反射ミラー７はＡＯＴＦ６の射出光路上に配置されている。ダイクロイックミラー８は反射ミラー７の反射光路上に配置されている。ダイクロイックミラー８は、反射ミラー７で反射されるレーザ光（励起光）を透過し、後述する標本１１から発せられる検出光（蛍光）を反射する。

走査光学ユニット９はダイクロイックミラー８の透過光路上に配置されている。走査光学ユニット９は、直交する２方向に光を偏向するためのＹ方向スキャナ９ａとＸ方向スキャナ９ｂを有し、これらのＹ方向スキャナ９ａとＸ方向スキャナ９ｂにより標本１１上に収束されるレーザ光を２次元平面の任意の点に照射可能にしている。

対物レンズ１０は走査光学ユニット９から射出されるレーザ光の光路上に配置されている。走査光学ユニット９から射出されたレーザ光は、対物レンズ１０によって標本１１上のデータ取得点に収束して照射される。言い換えれば、対物レンズ１０は、レーザ光を標本１１上のデータ取得点に収束して照射する照射手段としての光学系を構成している。

標本１１は、レーザ光（励起光）の照射に反応して、検出光（蛍光）を発する。標本１１から発せられた検出光（蛍光）は、上述した光路を逆行し、対物レンズ１０と走査光学ユニット９を経てダイクロイックミラー８まで戻る。

検出器１２は、ダイクロイックミラー８によって選択的に反射される検出光の光路上に配置されている。検出器１２は、これに限らないが、例えばフォトマルチプライヤで構成される。検出器１２は、標本１１からの検出光の輝度を反映したアナログ電気信号を出力する。

共焦点レーザ顕微鏡はさらに、信号処理手段としてのＡ／Ｄ変換器１３、制御手段としてのパーソナルコンピュータ（ＰＣ）１４、Ｙ方向スキャナ９ａとＸ方向スキャナ９ｂを駆動するための駆動手段としてのスキャナ駆動部２１と、情報入力手段としての入力装置２２、表示手段としてのモニタ２３とを有している。

入力装置２２は、これに限らないが、例えばキーボードで構成される。あるいは入力装置２２は、マウスなどのポインティングデバイスとＧＵＩ（グラフィカルユーザーインターフェース）とで構成されてもよい。モニタ２３は、これに限らないが、例えばＣＲＴで構成される。

パーソナルコンピュータ（ＰＣ）１４はＡ／Ｄ変換器１３を介して検出器１２に接続されている。Ａ／Ｄ変換器１３は、検出器１２からのアナログの電気信号をデジタル信号に変換してＰＣ１４に出力する。

ＰＣ１４は、制御プログラム部１５、レーザ出力制御部１６、フレームメモリ１７、Ｘ方向スキャナ駆動波形メモリ１８、Ｙ方向スキャナ駆動波形メモリ１９およびクロック生成部２０を有している。

フレームメモリ１７は、検出器１２で検出されＡ／Ｄ変換器１３を介してデジタル信号に変換された輝度データを画像化領域内の各ポイント座標（データ取得点の位置情報）に対応付けして保存する。フレームメモリ１７は、検出光の輝度情報をデータ取得点の位置情報に対応付けして保存する記憶手段を構成している。

制御プログラム部１５は、図２に示すように、走査条件入力部１５１、走査ポイント配列生成部１５２およびＸＹ、ＸＹＴ画像生成部１５３を有している。走査条件入力部１５１は、入力装置２２から、ＸＹスキャンサイズ、サンプリングスピード、画像化領域内の１ポイント当たりのデータ取得時間などの走査条件が入力される。走査ポイント配列生成部１５２は、画像化領域内の隣り合う２点を連続してデータ取得しないランダムな走査ポイント配列を作成する。走査ポイント配列生成部１５２は、隣り合うデータ取得点が連続しないデータ取得順序を決定するデータ取得順序決定手段を構成している。このランダムな走査ポイント配列の作成には、例えば乱数を用いる。そして、生成された配列の中に隣り合うポイントがないかをチェックし、隣り合うポイントがあった場合には他のポイントと入れ替えるなどの処理を行う。ＸＹ、ＸＹＴ画像生成部１５３は、フレームメモリ１７に書き込まれる輝度データと画像化領域内の各ポイント座標（データ取得点の位置情報）の対応付けに基づいて画像データを生成する。ＸＹ、ＸＹＴ画像生成部１５３は、検出光の輝度情報とデータ取得点の位置情報の対応付けに基づいて２次元画像を形成する画像形成手段を構成している。

レーザ出力制御部１６は、走査条件入力部１５１に設定される１ポイント当たりのデータ取得時間に応じてレーザ光源ユニット１のレーザ光の出力を制御する。

Ｘ方向スキャナ駆動波形メモリ１８およびＹ方向スキャナ駆動波形メモリ１９は、走査ポイント配列生成部１５２で生成されたランダムな走査ポイント配列から変換されるＸ方向スキャナ９ｂおよびＹ方向スキャナ９ａを走査するための駆動波形データ（スキャナ駆動部２１のＤ／Ａコンバータに与える波形ＤＡＣデータ）を保存する。

スキャナ駆動部２１は、Ｘ方向スキャナ駆動波形メモリ１８およびＹ方向スキャナ駆動波形メモリ１９に接続されている。スキャナ駆動部２１は、クロック生成部２０のクロックパルスに同期して読み出されるＸ方向スキャナ駆動波形メモリ１８およびＹ方向スキャナ駆動波形メモリ１９からの波形データ（波形ＤＡＣデータ）に従って、Ｙ方向スキャナ９ａとＸ方向スキャナ９ｂを駆動する。

クロック生成部２０は、制御プログラム部１５、レーザ出力制御部１６、フレームメモリ１７、Ｘ方向スキャナ駆動波形メモリ１８、Ｙ方向スキャナ駆動波形メモリ１９の動作タイミングを決定するクロックパルスを生成する。

次に、第１の実施の形態の作用を説明する。

まず、入力装置２２から、ＰＣ１４の走査条件入力部１５１に対して走査条件が入力される。入力される走査条件は、画像化領域（例えば、５１２×５１２ポイント）を決定するためのＸＹスキャンサイズ、Ａ／Ｄ変換器１３における検出信号のサンプリング間隔を決めるサンプリングスピード、画像化領域内の１ポイント当たりのデータ取得時間などである。すると、走査ポイント配列生成部１５２により、画像化領域内の隣り合う２点を連続してデータ取得しないランダムな走査ポイント配列が作成され、データ取得点が隣り合わないデータ取得順序が決定される。また、サンプリングスピードと１ポイント当たりのデータ取得時間により、１ポイント当たりのサンプリング回数が算出される。この第１の実施の形態では、１ポイント当たりのサンプリング回数は１回に設定されている。

次に、走査ポイント配列生成部１５２により生成されたランダムな走査ポイント配列（座標データ）がＸ方向スキャナ９ｂとＹ方向スキャナ９ａを走査するための駆動波形データ（波形ＤＡＣデータ）に変換され、Ｘ方向スキャナ駆動波形メモリ１８およびＹ方向スキャナ駆動波形メモリ１９に保存される。

ランダムな走査ポイント配列は、例えば、図３Ａに示すように、（１０）、（２５０）、（１２０）…のＸ位置データ配列３０１と、（２０）、（４０）、（２００）、…のＹ位置データ配列３０２の５１２×５１２ポイントの座標データとして与えられる。これらの座標データは、図３Ｂに示すように、（２５００）、（１０００）…のＸＤＡＣデータ配列４０１と（１０００）、（５００）…のＹＤＡＣデータ配列４０２に変換される。そして、これらＸＤＡＣデータ配列４０１およびＹＤＡＣデータ配列４０２のそれぞれのＤＡＣデータは、それぞれＸ方向スキャナ駆動波形メモリ１８およびＹ方向スキャナ駆動波形メモリ１９に保存される。

Ｘ方向スキャナ駆動波形メモリ１８およびＹ方向スキャナ駆動波形メモリ１９の駆動波形データはクロック生成部２０のクロックパルスに同期してスキャナ駆動部２１に読み出され、スキャナ駆動部２１はＹ方向スキャナ９ａとＸ方向スキャナ９ｂを駆動する。これと同時に、レーザ出力制御部１６の指示によりレーザ光源ユニット１はレーザ光を射出する。レーザ光は、Ｙ方向スキャナ９ａとＸ方向スキャナ９ｂにより偏向され、対物レンズ１０を介して標本１１上の各データ取得ポイントに順番に照射される。

レーザ光の照射に反応して、標本１１上の各データ取得ポイントから検出光（蛍光）が発せられる。検出光（蛍光）は、対物レンズ１０と走査光学ユニット９を経てダイクロイックミラー８に入射し、ダイクロイックミラー８で反射され、検出器１２により検出される。検出器１２は検出光の輝度を反映したアナログ信号を出力する。検出器１２から出力されるアナログ信号は、Ａ／Ｄ変換器１３によってデジタル信号に変換され、フレームメモリ１７に書き込まれる。検出器１２により取得される画像化領域内の各ポイントの輝度データは、走査ポイント配列生成部１５２により生成されたランダムな走査ポイント（図３Ａに示すＸ位置データ配列３０１とＹ位置データ配列３０２）に対応付けされてフレームメモリ１７に書き込まれる。

そして、ＸＹ、ＸＹＴ画像生成部１５３は、フレームメモリ１７に書き込まれた輝度データと画像化領域内の各ポイント座標の対応付けに基づいてＸＹ画像データを生成する。そのＸＹ画像データに対応する画像はモニタ２３に表示される。

従来のラスター走査による蛍光観察では、ある点（Ｘｎ，Ｙｎ）のデータが取得された直後に隣り合う次の点（Ｘｎ＋１，Ｙｎ）のデータが取得される。例えばケージド手法による観察においては、点（Ｘｎ，Ｙｎ）から放出されたカルシウムイオンの影響は、点（Ｘｎ，Ｙｎ）だけにとどまらず、その周囲（例えば、次の点（Ｘｎ＋１，Ｙｎ））にまで及ぶ可能性がある。従って、点（Ｘｎ＋１，Ｙｎ）のデータは前の点（Ｘｎ，Ｙｎ）に対する刺激の反応挙動の影響を受けたものになってしまうおそれがある。また刺激を行わない蛍光観察においても、蛍光が例えばマイクロ秒オーダーの長い寿命を持つ場合、やはり、ある点（Ｘｎ＋１，Ｙｎ）のデータが前の点（Ｘｎ，Ｙｎ）の影響を受けてしまうという問題が生じる。

これに対して、本実施の形態では、画像化領域（例えば、５１２×５１２ポイント）について、隣り合う２点を連続してデータ取得しないランダムな走査ポイント配列を作成してデータ取得順序を決定し、この決定した取得順序にあわせてＹ方向スキャナ９ａとＸ方向スキャナ９ｂの駆動信号を生成し、駆動信号によりポイント走査を行い、各データ取得ポイントからの検出光を検出して輝度データを取得し、取得した各ポイントの輝度データをランダムな走査ポイント配列に対応付けしてフレームメモリ１７に保存し、最終的にすべてのポイントの輝度データを取得して２次元画像を完成させる。このため、各ポイントからの取得データは、隣り合う２点が連続して取得されたものを含まず、他のポイントの光の影響を受けていない。つまり、データ取得を行う際の点相互の影響が確実に排除される。従って、個々の点の輝度が他の点の影響を受けることなく正しく検出される
なお、上述した実施の形態では、データ取得点を移動する間、レーザ光が射出され続けているが、Ｙ方向スキャナ９ａおよびＸ方向スキャナ９ｂの動作に同期させてＡＯＴＦ６を制御し、データ取得点を次のデータ取得点に移動する間はレーザ光の射出を停止してもよい。こうすれば、データ取得点の移動の際にレーザ光が与えるすべての影響が排除される。また、画像化領域は、定まった矩形でなく、標本の存在する領域に限ってもよい。

＜第２の実施の形態＞
第２の実施の形態にかかる共焦点レーザ顕微鏡の概略構成は、図１と同様なので、同図を援用する。

第１の実施の形態では、１ポイント当たりのデータ取得時間をサンプリング１回分に設定することで、標本１１上の１枚のＸＹ画像を取得するが、この第２の実施の形態では、１ポイント当たりのデータ取得時間の中でサンプリングを複数回行うことで、時間的に連続した複数枚のＸＹ画像のスタック（束）であるＸＹＴ画像を取得する。

サンプリングスピードと１ポイント当たりのデータ取得時間により算出される１ポイント当たりのサンプリング回数が、複数、例えば５０サンプリングに設定されたものとする。また、フレームメモリ１７は、１ポイント当たりのサンプリング回数に対応して５０枚用意される。

走査ポイント配列生成部１５２により生成されたランダムな走査ポイント配列は、例えば、上述の図３Ａに示すＸ位置データ配列３０１とＹ位置データ配列３０２が画像化領域の座標データとして与えられる。これらＸ位置データ配列３０１およびＹ位置データ配列３０２より変換される駆動波形データ（波形ＤＡＣデータ）は、図３Ａに示す最初のＸ位置データ（１０）に対して５０データ分のＸＤＡＣデータ（２５００）が生成され、同様に、最初のＹ位置データ（２０）に対しても５０データ分のＹＤＡＣデータ（１０００）が生成される。以下、同様にして、各データ取得ポイントのＸＹ位置データに対して５０データずつのＸＤＡＣデータとＹＤＡＣデータが生成される。図４Ａと図４Ｂは、このようにして生成されるＸＤＡＣデータ配列５０１とＹＤＡＣデータ配列５０２をそれぞれ示している。

これらＸＤＡＣデータ配列５０１とＹＤＡＣデータ配列５０２は、Ｘ方向スキャナ駆動波形メモリ１８およびＹ方向スキャナ駆動波形メモリ１９にそれぞれ保存される。

これらＸ方向スキャナ駆動波形メモリ１８およびＹ方向スキャナ駆動波形メモリ１９の駆動波形データはクロック生成部２０のクロックパルスに同期してスキャナ駆動部２１に読み出され、スキャナ駆動部２１はＹ方向スキャナ９ａとＸ方向スキャナ９ｂを駆動する。

この状態で、レーザ光源ユニット１から射出されるレーザ光は、Ｙ方向スキャナ９ａとＸ方向スキャナ９ｂにより偏向され、対物レンズ１０を介して標本１１上の各データ取得ポイントに照射される。レーザ光の照射に反応して、標本１１上の各データ取得ポイントから検出光（蛍光）が発せられる。検出光（蛍光）は検出器１２によって検出される。検出器１２は検出光の輝度を反映したアナログ信号を出力する。検出器１２から出力されるアナログ信号は、Ａ／Ｄ変換器１３によってデジタル信号に変換され、フレームメモリ１７に書き込まれる。

この場合、ＸＤＡＣデータ配列５０１の１番目のＸＤＡＣデータとＹＤＡＣデータ配列５０２の１番目のＹＤＡＣデータに対応した輝度データは、走査ポイント配列生成部１５２により生成されたランダムな走査ポイント（図３Ａに示すＸ位置データ配列３０１およびＹ位置データ配列３０２）に対応付けされた＃１のフレームメモリ１７に書き込まれる。また、ＸＤＡＣデータ配列５０１の２番目のＸＤＡＣデータとＹＤＡＣデータ配列５０２の２番目のＹＤＡＣデータに対応した輝度データは、走査ポイント配列生成部１５２により生成されたランダムな走査ポイントに対応付けされた＃２のフレームメモリ１７に書き込まれる。以下、同様にしてＸＤＡＣデータ配列５０１の３番目から５０番目のＸＤＡＣデータ、ＹＤＡＣデータ配列５０２の３番目から５０番目のＹＤＡＣデータに対応した輝度データについても同じ順位のものが、＃３から＃５０のフレームメモリ１７に書き込まれる。この動作は、ランダムな走査ポイントに対応するＸＤＡＣデータ配列５０１のＸＤＡＣデータとＹＤＡＣデータ配列５０２のＹＤＡＣデータに対応して取得されるすべての輝度データについて繰り返され、図５に示すように＃１から＃５０のフレームメモリ１７に書き込まれる。

そして、ＸＹ、ＸＹＴ画像生成部１５３は、＃１から＃５０のフレームメモリ１７に書き込まれた輝度データと画像化領域内の各データ取得ポイント座標の対応付けに基づいてＸＹＴ画像データを生成する。そのＸＹ画像データに対応する画像はモニタ２３に個別に表示される。

本実施の形態では、ランダムに設定されたデータ取得ポイントのそれぞれについて所定の時間間隔をおいて複数回ずつ繰り返してデータ取得（サンプリング）を行い、これら取得される各ポイントの複数個（ｔ＝Ｔ１、Ｔ２、…Ｔｎ）（ｎ＝５０）の輝度データのうち同じ順位で検出されたものについて＃１から＃５０のフレームメモリ１７に個別に書き込むので、各ポイントの検出データが他のポイントの影響を受けないとともに、各フレームメモリ１７に書き込まれた輝度データに基づいて、ＸＹ、ＸＹＴ画像生成部１５３で生成される複数のＸＹＴ画像により標本１１の刺激に対する反応挙動の動的変化を観察できる。

＜第３の実施の形態＞
第３の実施の形態にかかる共焦点レーザ顕微鏡の概略構成は、図１と同様なので、同図を援用する。

第３の実施の形態では、１ポイント当たりのデータ取得時間の中でサンプリングを複数回行い、さらに、これら１ポイント当たりの複数のサンプリングに対応させてレーザ光強度、レーザ光の波長成分、レーザ光照射のオンオフなどのレーザ条件を設定する。

サンプリングスピードと１ポイント当たりのデータ取得時間により算出される１ポイント当たりのサンプリング回数が、例えば１０サンプリングに設定されたものとする。

走査ポイント配列生成部１５２により生成されたランダムな走査ポイント配列は、例えば、上述の図３Ａに示すＸ位置データ配列３０１とＹ位置データ配列３０２が画像化領域の座標データとして与えられる。第２の実施の形態で述べたと同様な手順により、Ｘ位置データ配列３０１およびＹ位置データ配列３０２の最初の位置データに対して１０データ分の駆動波形データ（Ｘ（Ｙ）ＤＡＣデータ）Ａ１、Ａ２、…Ａ１０が生成され、以下、同様にして、続く各位置データに対しても１０データ分ずつのＸ（Ｙ）ＤＡＣデータＢ１、Ｂ２、…、Ｃ１、Ｃ２、…が生成される。図６の上段は、このようにして生成されるＸ（Ｙ）ＤＡＣデータ配列６０１を示している。

また、それぞれの１０データ分のＸ（Ｙ）ＤＡＣデータＡ１、Ａ２、…、Ｂ１、Ｂ２、…、Ｃ１、Ｃ２、…に対応させて、図６の下段に示すようにレーザ条件が書き込まれたレーザ設定データ配列７０１が生成される。レーザ設定データは、Ｘ（Ｙ）ＤＡＣデータＡ３、Ｂ３、Ｃ３、…に対してのみレーザ光照射のオンデータＯＮが設定され、その他のＸ（Ｙ）ＤＡＣデータに対してレーザ光照射のオフデータＯＦＦが設定されている。

レーザ設定データ配列７０１は、レーザ出力制御部１６のメモリ１６ａに保存される。レーザ出力制御部１６は、メモリ１６ａに保存したレーザ設定データ配列７０１をデータ取得時のサンプリングタイミングに同期して読み出し、ＡＯＴＦ６によりレーザ光照射のオンオフを制御する。

この構成によると、クロック生成部２０のクロックパルスに同期して読み出されるＸ（Ｙ）ＤＡＣデータ配列６０１のＸ（Ｙ）ＤＡＣデータＡ１、Ａ２、…、Ｂ１、Ｂ２、…、Ｃ１、Ｃ２、…に応じて標本１１上のデータ取得ポイントが設定される。同時にレーザ設定データ配列７０１のレーザ設定データに基づいてレーザ光照射のオンオフが制御される。この場合、レーザ設定データ配列７０１には、それぞれ１０データ分のＸ（Ｙ）ＤＡＣデータＡ、Ｂ、Ｃ、…のうち、Ａ３、Ｂ３、Ｃ３、…に対してのみレーザ光照射のオンデータＯＮが設定されるので、これらのタイミングでのみＡＯＴＦ６がＯＮになり、標本にレーザ光が照射される。

本実施の形態では、各データ取得点からの光を所定の時間間隔をおいて複数回ずつ検出し、これら複数回の検出のそれぞれの検出タイミングに対応させて異なるレーザ条件を設定できる。ここでは、データ取得ポイントでの複数回のデータ取得（サンプリング）によって取得される複数個（ｔ＝Ｔ１、Ｔ２、・・・Ｔｎ）（ｎ＝１０）の輝度データに対して、ｔ＝Ｔ３（Ａ３、Ｂ３、Ｃ３、…）のときのみレーザ光照射をオンにし、その他のｔ＝Ｔ１、Ｔ２、Ｔ４…Ｔｎではレーザ光照射をオフにするので、刺激を与える前からの標本１１の状態を観察できるとともに、刺激を与えた時点および刺激をやめた後の標本１１の動的挙動を観察できる。

なお、データ取得ポイントでの複数回のデータ取得時に設定するデータ条件は、レーザ光照射のオンオフに限らず、レーザ光の強度と波長成分の一方または両方を異ならせて設定することも可能である。例えば多重染色された蛍光標本の観察において、それぞれの蛍光色素に対応する励起波長のレーザ光をひとつずつ順に照射するようにしてもよい。

＜第４の実施の形態＞
図７は、本発明の第４の実施の形態にかかる共焦点レーザ顕微鏡の概略構成を示している。図７において、図１に示された部材と同一の参照符号で指示された部材は同様の部材であり、その詳しい説明は省略する。

本実施の形態の共焦点レーザ顕微鏡は、図７に示すように、図１の装置構成に加えて、標本１１からの電流値を検出するための電流検手段としての電流検出器２４をさらに有している。電流検出器２４は、検出した電流値を反映したアナログ電気信号を出力する。

電流検出器２４から出力される電流値のアナログ信号は、検出器１２からの検出光の輝度と同様に、Ａ／Ｄ変換器１３に入力されてデジタル信号に変換される。その電流値データは輝度情報としてフレームメモリ１７に書き込まれる。つまり、電流値は、蛍光検出のサンプリングタイミングと同じタイミングで取得される。電流値データは、走査ポイント配列生成部１５２により生成されたランダムな走査ポイント（図３Ａに示されるＸ位置データ配列３０１とＹ位置データ配列３０２）に対応付けされてフレームメモリ１７に書き込まれる。

そして、ＸＹ、ＸＹＴ画像生成部１５３はフレームメモリ１７に書き込まれた電流データと画像化領域内の各ポイント座標の対応付けに基づいてＸＹ画像データを生成する。そのＸＹ画像データに対応する画像はモニタ２３に表示される。

本実施の形態では、直前のレーザ照射影響を排除して電流値を計測できる。従って、標本１１の各データ取得点にレーザ光を照射した際の標本１１の電気的反応を正確に視覚化できる。本実施の形態を第１〜第３の実施の形態と組み合わせて実施してもよい。

第４の実施の形態の応用例
図８に示されるように、神経細胞２５のスパイン２５ａを含む領域２６にランダムスキャン方式で刺激光を照射し、この刺激に対する神経細胞２５の反応を部位２５ｂに挿入した電流検出器２４によって測定する。

電流値の計測は複数の部位に対して行われてもよい。その場合、それぞれの計測部位に電流検出器２４が挿入される。

＜第５の実施の形態＞
第１の実施の形態では、隣り合うデータ取得点が連続しないデータ取得順序をランダムに決定している。これに対して本実施の形態では、規則性をもって隣り合うデータ取得点が連続しないデータ取得順序を決定する。

第５の実施の形態にかかる共焦点レーザ顕微鏡の概略構成は、図１と同様なので、同図を援用する。

本実施形態では、走査ポイント配列生成部１５２が、例えば図９、図１０のような照射順序の走査ポイント配列を生成する。ＸＹ、ＸＹＴ画像生成部１５３は、第１実施形態と同じように、取得した輝度データと各走査ポイントの対応付けに基づいて画像データを生成する。

図９の例では、ひとつの走査領域を同じ大きさの８つの領域Ａ〜Ｈに分割する。そして、ＡＣＥＧＢＤＦＨの順に各分割領域の左上ポイントを照射する。一巡したらＸライン方向にひとつ隣のポイントを同じようにＡＣＥＧＢＤの順序で照射する。１ライン分が完了したら各領域の２ライン目を同じように照射する。つまり、領域Ａ〜Ｈを一定の順序で同じ規則に従ってレーザ光を照射する。図９は、６４×６４ピクセルの走査領域における照射順序を示している。各マスの数字が照射順序を示す。この例では、１番目に照射されたポイントの隣は９番目に照射されるので、隣同士のポイントのレーザ照射の時間間隔はピクセル８個分のデータ取得時間となる。

図１０の例では、ひとつの走査領域を同じ大きさの４つの領域Ａ〜Ｄに分割する。そして、ＡＢＤＣの順で、各分割領域を上記と同じように照射していく。この例では、１番目に照射されたポイントの隣は５番目に照射されるので、隣同士のポイントのレーザ照射の時間間隔はピクセル４個分の取得時間となる。また、ＡＢＣＤの順で照射するとＢ→ＣおよびＤ→Ａの移動距離が他と比べて大きくなるが、本実施の形態ではＡＢＤＣの順に照射するので、領域間の移動距離をほぼ均一にできる。従って、ピクセル単位の非連続的走査において走査の安定性を高めるのに有利である。

図９と図１０のほかにも分割領域をＸ方向やＹ方向に適宜に設定することにより、隣り合う照射ポイントの照射時間間隔を調整してもよい。また照射順序も、例えばＹ方向に順に照射していくなど、適宜変更してもよい。

このような照射順序（ポイント配列）は、あらかじめメモリに保存しておいて使用時に呼び出してもよいし、配列を決定するための算出式を用いてそのつど決定してもよい。またこのような走査方法を、前述の第２〜第４の実施の形態に組み合わせて用いてもよい。

その他、本発明は、上記実施の形態に限定されるものでなく、実施段階では、その要旨を変更しない範囲で種々変形されてよい。

例えば、始めに１フレームの画像を取得して（通常のＸＹ走査でも本発明のランダム走査でもよい）、標本の存在する位置を検出あるいはモニタ上で指定し、標本の存在する位置だけに対して、隣り合うデータ取得点が連続しないデータ取得順序を決定してレーザ走査を行うようにしてもよい。こうすれば、標本の存在しない位置は走査されないので、画像取得時間が大幅に短縮される。また、画像取得を行う平面は、ＸＹ平面でなく、ＸＺ平面またはレーザ光軸に対して傾斜した平面であってもよい。この場合、Ｚ方向に収束点を高速に移動させるには、デフォーマブルミラーなどの光学素子を光路中に設ければよい。

さらに、上記実施の形態には、種々の段階の発明が含まれており、開示されている複数の構成要件における適宜な組み合わせにより種々の発明が抽出できる。例えば、実施の形態に示されている全構成要件から幾つかの構成要件が削除されても、実施形態中で述べられている利点が得られる場合には、この構成要件が削除された構成が発明として抽出できる。

本発明の第１の実施の形態にかかる共焦点レーザ顕微鏡の概略構成を示している。 第１の実施の形態に用いられる制御プログラム部の概略構成を示している。 第１の実施の形態のＸ位置データ配列とＹ位置データ配列を示している。 図３ＡのＸ位置データ配列とＹ位置データ配列にそれぞれ対応するＸＤＡＣデータ配列とＹＤＡＣデータ配列を示している。 本発明の第２の実施の形態のＸＤＡＣデータ配列を示している。 本発明の第２の実施の形態のＹＤＡＣデータ配列を示している。 第２の実施の形態に用いられるフレームメモリの概略構成を示している。 本発明の第３の実施の形態にかかるレーザ設定データ配列を示している。 本発明の第４の実施の形態にかかる共焦点レーザ顕微鏡の概略構成を示している。 第４の実施の形態の共焦点レーザ顕微鏡による電流計測の応用例を示している。 本発明の第４の実施の形態にかかる共焦点レーザ顕微鏡におけるデータ取得順序の一例を示している。 本発明の第４の実施の形態にかかる共焦点レーザ顕微鏡におけるデータ取得順序の別の例を示している。

符号の説明

１…レーザ光源ユニット、２…レーザ光源、３…レーザ光源、４…反射ミラー、５…ダイクロイックミラー、６…音響光学可変フィルタ、７…反射ミラー、８…ダイクロイックミラー、９…走査光学ユニット、９ａ…Ｙ方向スキャナ、９ｂ…Ｘ方向スキャナ、１０…対物レンズ、１１…標本、１２…検出器、１３…Ａ／Ｄ変換器、１４…パーソナルコンピュータ、１５…制御プログラム部、１６…レーザ出力制御部、１６ａ…メモリ、１７…フレームメモリ、１８…Ｘ方向スキャナ駆動波形メモリ、１９…Ｙ方向スキャナ駆動波形メモリ、２０…クロック生成部、２１…スキャナ駆動部、２２…入力装置、２３…モニタ、２４…電流検出器、２５…神経細胞、２５ａ…スパイン、２５ｂ…部位、２６…領域、１５１…走査条件入力部、１５２…走査ポイント配列生成部、１５３…ＸＹＴ画像生成部、３０１…Ｘ位置データ配列、３０２…Ｙ位置データ配列、４０１…ＸＤＡＣデータ配列、４０２…ＹＤＡＣデータ配列、５０１…ＸＤＡＣデータ配列、５０２…ＹＤＡＣデータ配列、６０１…ＸＤＡＣデータ配列、７０１…レーザ設定データ配列。

Claims (8)

1. レーザ光を射出する光源手段と、
   標本上のデータ取得点に前記レーザ光を収束して照射する照射手段と、
   隣り合うデータ取得点が連続しないデータ取得順序を決定するデータ取得順序決定手段と、
   前記データ取得順序に従って前記レーザ光を走査する走査手段と、
   各データ取得点において複数回のサンプリングを連続して行うことにより各データ取得点からの光の複数の輝度情報を検出する検出手段と、
   前記検出手段により検出される各データ取得点からの光の複数の輝度情報を前記データ取得点の位置情報に対応付けして保存する記憶手段と、
   前記検出手段により検出される各データ取得点からの光の複数の輝度情報のうち、各データ取得点において同じ順位で検出された輝度情報同士をそれぞれの前記データ取得点の前記位置情報と対応付けて１枚の２次元画像を生成し、これを各取得順位について行うことにより複数の２次元画像を形成する画像形成手段とを備えている、走査型顕微鏡。
2. 前記検出手段は、前記データ取得点にレーザ光が照射された際の、データ取得点からの光を検出するのと同期して、前記標本の反応を電流値として検出する、請求項１に記載の走査型顕微鏡。
3. 前記光源手段から出射されるレーザ光の波長および強度の少なくとも一方を制御するレーザ光制御手段をさらに備え、前記レーザ光制御手段は各データ取得点における前記複数回の連続したサンプリングの各タイミングに対応させて前記レーザ光の照射変更を設定する、請求項１または２に記載の走査型顕微鏡。
4. 前記レーザ光の照射条件は、レーザ光照射のオンオフ、レーザ光の強度、波長成分の少なくとも１つである、請求項３に記載の走査型顕微鏡。
5. 前記データ取得順序決定手段は、前記データ取得順序をランダムに決定する、請求項１〜４のいずれかひとつに記載の走査型顕微鏡。
6. 前記データ取得順序決定手段は、規則性をもって前記データ取得順序を決定する、請求項１〜４のいずれかひとつに記載の走査型顕微鏡。
7. 前記データ取得順序決定手段は、走査領域を複数の領域に分割し、それらの領域を一定の順序で同じ規則に従ってレーザ光を照射する順序を決定する、請求項６に記載の走査型顕微鏡。
8. 標本上のデータ取得点にレーザ光を収束して照射し、
   前記データ取得点が隣り合わない順序に従って前記レーザ光を走査し、
   各データ取得点において複数回のサンプリングを連続して行うことにより各データ取得点からの光の複数の輝度情報を検出し、
   検出した各データ取得点からの光の複数の輝度情報を前記データ取得点の位置情報に対応付けして保存し、
   各データ取得点からの光の複数の輝度情報のうち、各データ取得点において同じ順位で検出された輝度情報同士をそれぞれの前記データ取得点の前記位置情報と対応付けて１枚の２次元画像を生成し、これを各取得順位について行うことにより複数の２次元画像を形成する、標本画像取得方法。

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