[go: up one dir, main page]

JP4929461B2 - 高蛍光量子収率型疎水性蛍光プローブ、それを用いる生体高分子検出法ならびに生体高分子間相互作用検出法 - Google Patents

高蛍光量子収率型疎水性蛍光プローブ、それを用いる生体高分子検出法ならびに生体高分子間相互作用検出法 Download PDF

Info

Publication number
JP4929461B2
JP4929461B2 JP2006544825A JP2006544825A JP4929461B2 JP 4929461 B2 JP4929461 B2 JP 4929461B2 JP 2006544825 A JP2006544825 A JP 2006544825A JP 2006544825 A JP2006544825 A JP 2006544825A JP 4929461 B2 JP4929461 B2 JP 4929461B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
compound
fluorescent probe
detection method
group
probe molecule
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
JP2006544825A
Other languages
English (en)
Other versions
JPWO2006054426A1 (ja
Inventor
将彦 井上
和久 藤本
久夫 清水
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
University of Toyama NUC
Original Assignee
University of Toyama NUC
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by University of Toyama NUC filed Critical University of Toyama NUC
Priority to JP2006544825A priority Critical patent/JP4929461B2/ja
Publication of JPWO2006054426A1 publication Critical patent/JPWO2006054426A1/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP4929461B2 publication Critical patent/JP4929461B2/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D207/00—Heterocyclic compounds containing five-membered rings not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom
    • C07D207/02—Heterocyclic compounds containing five-membered rings not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom with only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom
    • C07D207/30—Heterocyclic compounds containing five-membered rings not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom with only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom having two double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D207/34—Heterocyclic compounds containing five-membered rings not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom with only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom having two double bonds between ring members or between ring members and non-ring members with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals, directly attached to ring carbon atoms
    • C07D207/36—Oxygen or sulfur atoms
    • C07D207/40—2,5-Pyrrolidine-diones
    • C07D207/404—2,5-Pyrrolidine-diones with only hydrogen atoms or radicals containing only hydrogen and carbon atoms directly attached to other ring carbon atoms, e.g. succinimide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D207/00—Heterocyclic compounds containing five-membered rings not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom
    • C07D207/02—Heterocyclic compounds containing five-membered rings not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom with only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom
    • C07D207/44—Heterocyclic compounds containing five-membered rings not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom with only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D207/444—Heterocyclic compounds containing five-membered rings not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom with only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having two doubly-bound oxygen atoms directly attached in positions 2 and 5
    • C07D207/448—Heterocyclic compounds containing five-membered rings not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom with only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having two doubly-bound oxygen atoms directly attached in positions 2 and 5 with only hydrogen atoms or radicals containing only hydrogen and carbon atoms directly attached to other ring carbon atoms, e.g. maleimide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D333/00—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one sulfur atom as the only ring hetero atom
    • C07D333/02—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one sulfur atom as the only ring hetero atom not condensed with other rings
    • C07D333/04—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one sulfur atom as the only ring hetero atom not condensed with other rings not substituted on the ring sulphur atom
    • C07D333/06—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one sulfur atom as the only ring hetero atom not condensed with other rings not substituted on the ring sulphur atom with only hydrogen atoms, hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals, directly attached to the ring carbon atoms
    • C07D333/14—Radicals substituted by singly bound hetero atoms other than halogen
    • C07D333/16—Radicals substituted by singly bound hetero atoms other than halogen by oxygen atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D409/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having sulfur atoms as the only ring hetero atoms
    • C07D409/02—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having sulfur atoms as the only ring hetero atoms containing two hetero rings
    • C07D409/06—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having sulfur atoms as the only ring hetero atoms containing two hetero rings linked by a carbon chain containing only aliphatic carbon atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D409/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having sulfur atoms as the only ring hetero atoms
    • C07D409/14—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having sulfur atoms as the only ring hetero atoms containing three or more hetero rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
    • C07F9/00—Compounds containing elements of Groups 5 or 15 of the Periodic Table
    • C07F9/02—Phosphorus compounds
    • C07F9/28—Phosphorus compounds with one or more P—C bonds
    • C07F9/48—Phosphonous acids [RP(OH)2] including [RHP(=O)(OH)]; Thiophosphonous acids including [RP(SH)2], [RHP(=S)(SH)]; Derivatives thereof
    • C07F9/4883—Amides or esteramides thereof, e.g. RP(NR'2)2 or RP(XR')(NR''2) (X = O, S)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials
    • G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
    • G01N33/533—Production of labelled immunochemicals with fluorescent label
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Plural Heterocyclic Compounds (AREA)
  • Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
  • Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Pyrrole Compounds (AREA)

Description

本発明は、高蛍光量子収率型疎水性蛍光プローブ分子の開発ならびに、該蛍光プローブ分子を用いる生体高分子検出法ならびに生体高分子間相互作用検出法に関する。
一般的な疎水性蛍光プローブ分子は、既存の蛍光性有機基にラベル化するための有機置換基を導入したものである。代表的な蛍光性有機基であるピレンは、モノマー発光だけでなくエキシマー発光も有するという特徴から、生体分子に対する疎水性蛍光プローブ分子として、広く応用されている［非特許文献２］。
また、フェニルエチニルピレン及びフェニルエチニルアントラセンで修飾したDNAが合成されている[非特許文献３]。該文献においては、ＤＮＡにヨウ化フェニル基を導入し、これにエチニルピレン、エチニルアントラセンを導入する手法をとっており、汎用性のラベル化試薬の開発を意図していない。
一方、本発明者は[非特許文献１]において、ピレン骨格にエチニル基を導入することで、その吸収波長や蛍光波長が長波長側へとシフトすることを認識した。この知見を元に、生体高分子の広範なラベル化試薬の開発を目指したものである。
J. Am. Chem. Soc. 1999, 121, 1452-1458 J. Biol. Chem. 1973, 248, 3173-3177 Tetrahedron 2004, 60, 4617-4626
代表的な疎水性プローブであるピレンは、励起波長が比較的短波長である、蛍光量子収率が低い、溶媒中の溶存酸素による消光が顕著であるといった問題が存在する。励起波長が300 nm付近の蛍光性有機基の場合、該励起光が生体化学種に一部吸収され、該蛍光性有機基の励起確率が低下する可能性がある。蛍光量子収率が低いことは高感度検出の妨げとなる。溶媒中の溶存酸素による消光を受けやすいということも、イン・ビボ(in vivo)条件化で使用する際には高感度検出の妨げとなる。
本研究の発明者は、上記の問題点を克服し、高蛍光量子収率型疎水性蛍光プローブ分子を開発するために鋭意研究を行った。その結果、ピレン骨格の１位にアリールエチニル基を導入した蛍光性有機分子を基に開発した各種高蛍光量子収率型疎水性蛍光プローブ分子が問題点を解決することを見出し、さらに研究を進めた結果、本発明を完成させた。
即ち、本発明は、第一の態様として、アリールエチニル基を有する高蛍光量子収率型疎水性蛍光プローブ分子、特にエキシマー形成可能な蛍光性有機基であることを特徴とする蛍光プローブ分子に係る。
本発明の第二の態様として、被検生体高分子を該蛍光プローブ分子でラベル化することで可能となる生体高分子検出法ならびに生体高分子間相互作用検出法に係る。
第１の発明は、置換基を有するアリールエチニル基を蛍光性有機分子に導入したことを特徴とする蛍光プローブ分子である。
アリールエチニル基は、フェニルエチニル基またはチエニルエチニル基であってよい。
置換基は以下の置換基から選ばれることを特徴とする。
Figure 0004929461
（式中、Ｘはハロゲン原子を；ｍは０または１〜５の整数を；ｎおよびｐは１〜５の整数
を意味する。）
第２の発明は、無置換のアリールエチニル基および式
Figure 0004929461
（ｒは６〜１０の整数を意味する）
で示される基を蛍光性有機分子に導入したことを特徴とする蛍光プローブ分子である。
アリールエチニル基はフェニルエチニル基またはチエニルエチニル基であってよい。
第１及び第２の発明において蛍光性有機分子はピレン、アントラセン、フルオレンまた
はペリレンであることを特徴とする。
第３の発明は、第１又は第２の発明に係る蛍光プローブ分子を用いたことを特徴とする生体高分子検出法である。
また上記蛍光プローブ分子のエキシマー形成能を用いた生体高分子間相互作用検出法である。
本発明の蛍光プローブ分子を用いることにより、被検生体高分子を溶存酸素存在下においても非常に高い感度で検出することが出来る。本発明の蛍光プローブ分子は、高い蛍光量子収率を持つので、DNAをはじめとするオリゴヌクレオチド鎖やタンパク質を該蛍光プローブ分子でラベル化することにより、また、細胞膜内へ導入することにより生体分子間相互作用の検出法に利用することが出来る。
本発明の蛍光プローブ分子の合成例（スキーム１−１）を示す。 本発明の蛍光プローブ分子の合成例（スキーム１−２）を示す。 本発明の蛍光プローブ分子の合成例（スキーム１−３）を示す。 本発明の蛍光プローブ分子の合成例（スキーム１−４）を示す。 本発明の蛍光プローブ分子の合成例（スキーム２）を示す。 市販のピレニルマレイミドとグルタチオンの構造を示す。 化合物１とピレニルマレイミドにより、グルタチオンをラベル化した際の蛍光強度の比較を示す。 試験例２のゲル電気泳動の写真Ａおよび写真Ｂ
本発明の蛍光プローブ分子は、溶存酸素存在下においても非常に高い感度でラベル化された生体高分子の検出を可能にする。その構造的特徴は、蛍光性有機分子にアミノ酸や核酸を修飾するための基を置換基として有するアリールエチニル基を導入しているところである。
アリールエチニル基として、フェニルエチニル基、ナフチルエチニル基、チエニルエチニル基が挙げられるが、フェニルエチニル基およびチエニルエチニル基が好ましい。
本発明の蛍光プローブ分子に使用できる蛍光性有機基の例としては、ピレン、アントラセン、フルオレン、ペリレンが挙げられるが、ピレン、アントラセンが好ましい。
アミノ酸や核酸を修飾するための基として、例えば、アミノ酸であるシステインを修飾するためのマレイミド基、リジンを修飾するためのスクシンイミジル基、DNA鎖に導入するためのホスホロアミダイト基などが挙げられる。これらの修飾基は、必ずしもスペーサーを介してアリールエチニル基に結合していなくてもよい。
具体的な基として、以下のものが挙げられる
・マレイミド基
Figure 0004929461
 （式中、ｍは、０または１〜５の整数を意味する）
・スクシンイミジル基
Figure 0004929461
 （式中、ｎは、１〜５の整数を意味する）
・ホスホロアミダイト基
Figure 0004929461
 （式中、ｐは、１〜５の整数を意味する）
・ハロゲン化アセトアミド基
Figure 0004929461
 （式中、Ｘは、ヨウ素、臭素などのハロゲン原子を意味する）
また、細胞膜に導入するための基として、例えば、オキシエチレン基などが挙げられる。
具体的な基として、以下のものが挙げられる
Figure 0004929461
 （式中、ｒは、６〜１０の整数を意味する）
本発明の蛍光プローブ分子の代表的化合物を表１−１〜表１−４に示す。
Figure 0004929461
Figure 0004929461
Figure 0004929461
Figure 0004929461
本発明の蛍光プローブ分子は、使用する蛍光性有機基の種類等に応じて、適用な出発物質、中間体、及び反応条件等を適宜選択し、当業者に公知の任意の方法で合成することができる。
例えば、ハロゲン化アリールとアセチレンとのカップリングである薗頭反応を利用して本発明化合物を製造することができる。
 式１
Figure 0004929461
「式中、Ａは、蛍光性有機基を；Ｂ１は、フェニル、ナフチルなどのアリール基を；Ｂ２はチエニル基を；Ｙは、ハロゲン原子またはトリフラート基を；Ｒは、上記したアミノ酸や核酸を修飾するための基または細胞膜に導入するための基を表す」
化合物ａと化合物ｂ１または化合物ｂ２とを反応させるには、例えば、テトラキストリフェニルホスフィンパラジウムなどのパラジウム触媒とヨウ化銅の組み合わせに、溶剤としてトリエチルアミンやモルホリンなどの塩基性溶媒を使用する。反応時間は1〜6時間、反応温度は10℃以上で溶剤が還流する温度までを上限とする。
本発明の代表的化合物の製造ルートを図１〜図５に示した。
本発明の蛍光プローブ分子による、生体高分子検出法ならびに生体高分子間相互作用検出法は、溶存酸素存在下においても高い感度で行うことが出来る。更に、該蛍光プローブ分子のエキシマー形成能を利用することにより、より効果的な検出法となる可能性を有する。
例えば、ＤＮＡをはじめとするオリゴヌクレオチド鎖の末端もしくは核酸塩基部分を該蛍光プローブ分子で修飾することで、該蛍光プローブ分子由来のエキシマー発光を利用した生体高分子の検出が可能となる。またタンパク質やその配位子（リガンド）となるペプチド鎖を該蛍光プローブ分子で修飾することで、生体高分子間相互作用の検出も可能となる。
以下本発明に係る化合物の合成例を説明するが、化合物の番号は図１〜図５中の番号を示す。
実施例1
・マレイミド誘導体（化合物1）の合成［合成スキーム１−１］
（１）１−ブロモピレン（化合物10）、テトラキストリフェニルホスフィンパラジウム、ヨウ化銅の混合物にトリエチルアミンを加え、均一な溶液になるまで50℃で加熱した。続いて、４−エチニルアニリン（化合物11）のトリエチルアミン溶液を加え4時間還流させた。室温まで戻した後、溶剤を回転式エバポレーターで除去した。残渣を飽和塩化アンモニウム水溶液に注ぎ、酢酸エチルで抽出した。酢酸エチル抽出物を回転式エバポレーターで処理した後、クロマトグラフ展開（シリカゲル；溶出液としてヘキサン：ジクロロメタン（1：1）を使用）すると、黄色固体の４−(１−ピレニルエチニル)アニリン（化合物12）が収率67％で得られた。
化合物12の物性データは以下のとおりである。
融点：152-153℃
（２）４−(１−ピレニルエチニル)アニリン（化合物12）のテトラヒドロフラン溶液に無水マレイン酸を0℃で加えた。反応溶液を徐々に室温に戻し、12時間攪拌した。析出した沈殿をろ別乾燥し、次の反応にそのまま使用した。得られた化合物13と酢酸ナトリウムの混合物に無水酢酸を加えて懸濁液とした。この懸濁液を100℃で1時間攪拌した後、0℃まで冷却し、さらに氷水を加えた。析出した沈殿物をろ取し、冷水ならびにヘキサンで洗浄を行った。得られた粗生成物をエタノール-クロロホルム混合溶媒から再結晶すると、橙黄色固体のマレイミド誘導体（化合物1）が収率68％で得られた。
化合物1の物性データは以下のとおりである。
融点：262-263℃
実施例２
・スクシンイミジルエステル誘導体（化合物3）の合成［合成スキーム１−３］
（１）１−ブロモピレン（化合物10）、テトラキストリフェニルホスフィンパラジウム、ヨウ化銅の混合物にトリエチルアミンを加え、均一な溶液になるまで70℃で加熱した。続いて、４−エチニルジヒドロ桂皮酸（化合物14）のトリエチルアミン溶液を加え3時間還流させた。室温まで戻した後、溶剤を回転式エバポレーターで除去した。残渣を希塩酸水溶液に注ぎ、酢酸エチルで抽出した。酢酸エチルで抽出した。酢酸エチル抽出物を回転式エバポレーターで処理した後、クロマトグラフ展開（シリカゲル；溶出液としてジクロロメタンに続いてジクロロメタン：メタノール（30：1）を使用）すると、黄色固体の４−(１−ピレニルエチニル)ジヒドロ桂皮酸（化合物15）が収率63％で得られた。
（２）化合物15、炭酸ジスクシンイミジルの混合物にアセトニトリル、テトラヒドロフラン、ピリジンを加え、6時間還流させた。室温まで戻した後、溶剤を回転式エバポレーターで除去した。残渣をクロマトグラフ展開（シリカゲル；溶出液としてジクロロメタンを使用）すると、黄緑色固体のスクシンイミジルエステル誘導体（化合物3）が収率76％で得られた。
実施例３
・ホスホロアミダイト誘導体（化合物7）の合成［合成スキーム１−２］
（１）水素化リチウムアルミニウムにテトラヒドログランを加え懸濁液とし、0℃に冷却した。続いて、化合物15のテトラヒドロフラン溶液を加え0℃で2時間攪拌した。希塩酸水溶液を加え不溶物をろ別した後、溶剤を回転式エバポレーターで除去した。残渣をクロマトグラフ展開（シリカゲル；溶出液としてジクロロメタンを使用）すると、淡黄色固体の３−(４−(１−ピレンエチニル)フェニル)プロパン−１−オール (化合物16）が収率85％で得られた。
（２）１Ｈ−テトラゾールおよび２−シアノエチルテトライソプロピルホスホロジアミダイトを含むアセトニトリル溶液に、化合物16のアセトニトリル溶液を0℃で加えた。室温で3時間攪拌させた後、溶剤を回転式エバポレーターで除去した。残渣をクロマトグラフ展開（ヘキサン：トリエチルアミン（50：1）で前処理したシリカゲル；溶出液としてヘキサン：ジクロロメタン（6：1）を使用）すると、黄緑色液体のホスホロアミダイト誘導体(化合物7)が収率79％で得られた。
実施例４
・（化合物8）の合成［合成スキーム１−４］
（１）１,６−ジヨードピレン、テトラキストリフェニルホスフィンパラジウム、ヨウ化銅の混合物にモルホリンを加え、均一な溶液になるまで100℃で加熱した。続いて、４,７,１０,１３,１６,１９,２２,２５,２８−ノナオキサ−１−ノナコサン（化合物18）のモルホリン溶液を加え120℃で5時間攪拌した。室温まで戻した後、溶剤を回転式エバポレーターで除去した。残渣にメタノールを加え、不溶物をろ過により除去した。メタノールを回転式エバポレーターで留去した後、クロマトグラフ展開（シリカゲル；溶出液としてジクロロメタンに続いてジクロロメタン：メタノール（60：1）を使用）すると、無色固体の１−ヨード−６−(４,７,１０,１３,１６,１９,２２,２５,２８−ノナオキサ−１−ノナコスニル)ピレン (化合物19)が収率44％で得られた。
（２）化合物19、テトラキストリフェニルホスフィンパラジウム、ヨウ化銅の混合物にテトラヒドロフランとトリエチルアミンを加え、均一な溶液になるまで70℃で加熱した。続いて、フェニルアセチレンを加え1時間還流させた。室温まで戻した後、溶剤を回転式エバポレーターで除去した。残渣をクロマトグラフ展開（シリカゲル；溶出液としてジクロロメタンに続いてジクロロメタン：メタノール（300：1）を使用）すると、黄色固体の１−(４,７,１０,１３,１６,１９,２２,２５,２８−ノナオキサ−１−ノナコスニル)−６− (フェニルエチニル)ピレン (化合物8)が収率88％で得られた。
実施例５
・（化合物27）の合成［合成スキーム２］
（１）(2-チエニルメチル)アミン（化合物20）に無水酢酸、トリエチルアミンを0℃で加え、室温で一時間攪拌した。溶剤を回転式エバポレーターで除去した後、残渣に水を加えジエチルエーテルで抽出した。ジエチルエーテル抽出物を回転式エバポレーターで処理することで、Ｎ−(２−チエニルメチル)アセトアミド(化合物21)を得た。
1H NMR (CDCl3)δ 2.01 (s, 3 H), 4.60 (d, J = 5.5 Hz, 2 H), 5.85 (brs, 1 H), 6.95-6.98 (m, 2 H), 7.23 (dd, J = 1.5 and 5.0 Hz, 1 H)
（２）Ｎ−(２−チエニルメチル)アセトアミドのジメチルホルムアミド溶液にＮ−ブロモスクシンイミドを0℃で加え、室温で12時間攪拌した。溶剤を回転式エバポレーターで除去した後、残渣にテトラヒドロフランを加え、不溶物をろ別した。溶液のテトラヒドロフランを回転式エバポレーターで除去した後、クロマトグラフ展開（シリカゲル；溶出液としてジクロロメタンを使用）すると、Ｎ−(５−ブロモ−２−チエニルメチル)アセトアミド(化合物22)が得られた。
1H NMR (CDCl3) δ 2.01 (s, 3 H), 4.50 (d, J = 5.5 Hz, 2 H), 5.88 (brs, 1 H), 6.72 (d, J = 4.0 Hz, 1 H), 6.88 (d, J = 4.0 Hz, 1 H)
（３）Ｎ−[(５−ブロモ−２−チエニル)メチル]アセトアミドのメタノール溶液に水酸化ナトリウム水溶液を室温で加え、60℃で二日間攪拌した。溶剤を回転式エバポレーターで除去した後、残渣に水を加えジクロロメタンで抽出した。ジクロロメタン抽出物を回転式エバポレーターで処理し、(５−ブロモ−２−チエニルメチル)アミン(化合物23)を得た。
1H NMR (CDCl3) δ 3.99 (s, 2 H), 6.67 (d, J = 4.0 Hz, 1 H), 6.88 (d, J = 4.0 Hz, 1 H)
（４）(５−ブロモ−２−チエニルメチル)アミンに飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、懸濁液とする。そこにＮ−(メトキシカルボニル)マレインイミド（化合物24）を0℃で加え、その温度で30分攪拌し、さらに室温で3時間攪拌する。反応終了後、濃硫酸を加え、pH3に調整する。その水溶液を酢酸エチルで洗浄した後、酢酸エチル層を回転式エバポレーターで処理した後、クロマトグラフ展開（シリカゲル；溶出液としてヘキサン：ジクロロメタン（1：1）を使用）すると、Ｎ−(５−ブロモ−２−チエニルメチル)マレインイミド(化合物25)が得られた。
1H NMR (CDCl3) δ 4.75 (s, 2 H), 6.72 (s, 2 H), 6.83 (d, J = 3.5 Hz, 1 H), 6.88 (d, J = 3.5 Hz, 1 H)
（５）化合物27の合成
Ｎ−(５−ブロモ−２−チエニルメチル)マレインイミド、１‐エチニルピレン(化合物26)、テトラキストリフェニルホスフィンパラジウム、ヨウ化銅にジメチルホルムアミドとトリエチルアミンを加え、60℃で12時間攪拌し、Ｎ−[５−(１−ピレニルエチニル)−２−チエニルメチル]マレインイミド(化合物27)が得られた。
参考例１
３−(４−ヨードフェニル)プロピオン酸、ビストリフェニルホスフィン塩化パラジウム、ヨウ化銅の混合物にトリエチルアミンを加え、均一な溶液になるまで70℃で加熱した。続いて、トリメチルシリルアセチレンを加え1時間還流させた。室温まで戻した後、溶剤を回転式エバポレーターで除去した。残渣を0.5Ｎ塩酸水溶液に注ぎ、酢酸エチルで抽出した。酢酸エチル抽出物を回転式エバポレーターで処理した後、得られた粗生成物を次の反応に使用した。この粗生成物をテトラヒドロフランに溶解させ、一滴の水を加え0℃に冷却した。続いて、フッ化テトラブチルアンモニウム塩のテトラヒドラフラン溶液を加え30分0℃で攪拌した。室温まで戻した後、溶剤を回転式エバポレーターで除去した。残渣をクロマトグラフ展開（シリカゲル；溶出液としてヘキサン：酢酸エチル（1：1）を使用）すると、無色固体の４−エチニルジヒドロ桂皮酸(化合物14)が収率97％で得られた。
参考例２
１−ブロモピレン、テトラキストリフェニルホスフィンパラジウム、ヨウ化銅のトリエチルアミン溶液を調整し、エチニルチオフェンを加え60℃で一日攪拌した。室温まで戻した後、溶剤を回転式エバポレーターで除去した。残渣にヘキサンを加え、不溶物をろ過により除去した。ヘキサンを回転式エバポレーターで留去した後、残渣をクロマトグラフ展開（シリカゲル；溶出液としてヘキサンを使用）すると、固体の１−(２−チエニルエチニル)ピレンが収率85％で得られた。ここで得られた化合物の蛍光スペクトルは、１-フェニルエチニルピレンより約10nm長波長側にシフトした。
融点：131-133℃
試験例１
実施例１で合成した化合物1と市販のピレニルマレイミド（化合物Ａ）を用いてペプチド鎖のシステイン側鎖のチオール基をラベル化し、それらの相対蛍光強度を比較した。被ラベル化分子としてグルタチオンを用いた。グルタチオンは、アミノ末端からグルタミン酸・システイン・グリシンの三つのアミノ酸から成る生理活性ペプチドである。
化合物１ならびに化合物Ａのシステインラベル化部位は、マレイミド基である。システインのチオール基とプローブ分子のマレイミド基上の炭素−炭素二重結合とが反応をする。市販品である化合物Ａそのもの（ラベル化反応前）は、ピレン由来の蛍光がほとんど消光されており（図７；点線）、チオール基と反応することでその蛍光が復活する。化合物１も化合物Ａと同様に、ラベル化反応前ではほとんど消光されていることが明らかとなった（図７；破線）。化合物１ならびに化合物Ａのジメチルスルオキシド溶液とグルタチオン水溶液を反応させた後の蛍光スペクトルを図７に示す。グルタチオンに対して、過剰量の化合物１と化合物Ａを用いた（化合物１と化合物Ａは等モル）。グルタチオンと反応した化合物Ａは、ピレン由来の蛍光発光を示した（図７；実線）。一方、化合物１はピレニルマレイミドに比べ約40 nm長波長側にシフトし、かつブロード化された発光が観測された（図７；太実線）。その蛍光強度を比較すると、化合物１は化合物Ａの２４倍以上である。
この結果より、グルタチオンをラベルした化合物１は非常に高い蛍光量子収率である。
試験例２
タンパク質である仔牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を用いて試験例１と同様の実験を行った。ＢＳＡは分子量が約67,000で３５個のシステイン残基を持つ。ラベル化反応を行った後、ゲル電気泳動で比較を行った。図８の写真Ａはクマシーブルー染色を行ったもので、写真Ｂは312nmの光を照射することによって観測された蛍光像を示す。写真Ａにおいては、分子量マーカーを含め全てのレーンにおいてバンドが観測されるが、写真Ｂにおいては化合物１でラベル化されたＢＳＡのみが明瞭にそのバンドが確認される。この結果より、試験例２と同様にＢＳＡをラベル化した化合物１は非常に高い蛍光量子収率であることが判明しただけでなく、化合物１は実際のタンパク質をラベル化する際にも非常に有用であることが示された。
本発明により、高蛍光量子型疎水性蛍光プローブ分子の開発ならびに生体高分子の高感度検出に成功した。該蛍光プローブ分子は、溶存酸素存在下においてもほとんど消光されないことや励起波長の長波長化が達成されていることから、非常に高い有用性を兼ね備えている。また、アリール基にラベル化部位を導入することで、さまざまな生体高分子に対する蛍光プローブ分子を供与することが可能となる。

Claims (3)

  1. 下記化学式にて表記される蛍光プローブ分子。
    Figure 0004929461
    ただしＲ １２ は下記化学式（１）又は（２）である。
    Figure 0004929461
    ［化学式（１），（２）中、ｍは０または１〜５の整数であり、ｎは１〜５の整数である。］
  2. 下記化学式にて表記される蛍光プローブ分子。
    Figure 0004929461
    ただしＲ ２ は下記化学式（５）である。
    Figure 0004929461
    ［化学式（５）中、ｒは６〜１０の整数である。］
  3. 下記化学式にて表記される蛍光プローブ分子。
    Figure 0004929461
    ただしＲ １２ は下記化学式（１）又は（２）である。
    Figure 0004929461
    ［化学式（１），（２）中、ｍは０または１〜５の整数であり、ｎは１〜５の整数である。］
JP2006544825A 2004-10-29 2005-10-24 高蛍光量子収率型疎水性蛍光プローブ、それを用いる生体高分子検出法ならびに生体高分子間相互作用検出法 Expired - Lifetime JP4929461B2 (ja)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2006544825A JP4929461B2 (ja) 2004-10-29 2005-10-24 高蛍光量子収率型疎水性蛍光プローブ、それを用いる生体高分子検出法ならびに生体高分子間相互作用検出法

Applications Claiming Priority (6)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2004315018 2004-10-29
JP2004315018 2004-10-29
JP2005118313 2005-04-15
JP2005118313 2005-04-15
JP2006544825A JP4929461B2 (ja) 2004-10-29 2005-10-24 高蛍光量子収率型疎水性蛍光プローブ、それを用いる生体高分子検出法ならびに生体高分子間相互作用検出法
PCT/JP2005/019514 WO2006054426A1 (ja) 2004-10-29 2005-10-24 高蛍光量子収率型疎水性蛍光プローブ、それを用いる生体高分子検出法ならびに生体高分子間相互作用検出法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JPWO2006054426A1 JPWO2006054426A1 (ja) 2008-08-07
JP4929461B2 true JP4929461B2 (ja) 2012-05-09

Family

ID=36406971

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2006544825A Expired - Lifetime JP4929461B2 (ja) 2004-10-29 2005-10-24 高蛍光量子収率型疎水性蛍光プローブ、それを用いる生体高分子検出法ならびに生体高分子間相互作用検出法

Country Status (2)

Country Link
JP (1) JP4929461B2 (ja)
WO (1) WO2006054426A1 (ja)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2939795B1 (fr) * 2008-12-17 2010-12-17 Sanofi Aventis Procede de preparation d'esters actives
DE102019106388A1 (de) * 2019-03-13 2020-09-17 Cynora Gmbh Organische moleküle für optoelektronische vorrichtungen
JP7510920B2 (ja) * 2019-03-29 2024-07-04 住友化学株式会社 着色組成物、化合物、カラーフィルタ及び表示装置
JP7641003B2 (ja) * 2021-06-02 2025-03-06 国立大学法人金沢大学 蛍光プローブ、液相の極性及び粘性を評価する方法、並びに化合物

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP4493899B2 (ja) * 2001-08-09 2010-06-30 輝行 長棟 細胞膜が修飾された細胞

Also Published As

Publication number Publication date
JPWO2006054426A1 (ja) 2008-08-07
WO2006054426A1 (ja) 2006-05-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP4790598B2 (ja) メソ置換シアニン色素標識化試薬
US6140494A (en) Squarate dyes and their use in fluorescent sequencing method
JP4942150B2 (ja) 電子欠乏窒素複素環で置換したフルオレセイン色素
US6156506A (en) Method for detecting a target substance in a sample, utilizing pyrylium compound
US8541555B2 (en) Hydrazone-based and oxime-based fluorescent and chromophoric/pro-fluorescent and pro-chromophoric reagents and linkers
JP2003192931A (ja) 非対称ベンゾキサンテン染料
US20110118438A1 (en) Cyanine-type compounds having an alkynyl linker arm
BR112013019503B1 (pt) composto quimioluminescente à base de irídio, conjugado, usos de um composto e método para medir um analito
CA2664649A1 (en) Compositions and methods for biodetection by nucleic acid-templated chemistry
Cory et al. Synthesis and fluorescent properties of some N-methyl-2-anilino-6-naphthalenesulfonyl derivatives
CN114591633B (zh) 一类氧杂蒽-半花菁近红外荧光染料，其合成方法及应用
JP2005532434A (ja) 蛍光色素、エネルギー転移ペア及び方法
CN101896491B (zh) 荧光发生分子
JP2006511581A (ja) 生体分子標識用複素環ｆｒｅｔ色素カセット並びにｄｎａ配列決定での使用
Jiao et al. Syntheses and spectroscopic properties of energy transfer systems based on squaraines
JP2001002951A (ja) 新規な蛍光色素およびその蛍光マーカーとしての使用
JP4929461B2 (ja) 高蛍光量子収率型疎水性蛍光プローブ、それを用いる生体高分子検出法ならびに生体高分子間相互作用検出法
JP5319130B2 (ja) ケイ光ソルバトクロミック色素及びその使用法
WO2008140452A1 (en) Novel hydrazone-based and oxime-based fluorescent and chromophoric/pro-fluorescent and pro-chromophoric reagents and linkers
WO2002068537A2 (en) Fluorescent dye
EP1163372A1 (en) Chemically reactive plane-rigidized cyanine dyes and their derivatives
CN107207480B (zh) 香豆素基化合物及相关方法
CN115433066A (zh) 一类碘取代的生物正交增强型荧光探针及其制备方法与应用
WO2006019105A1 (ja) 蛍光ラベル化剤
Fischer Synthesis and Photophysical Properties of Conjugates of Green Fluorescent Protein (GFP) Chromophore and 2'-Deoxy-Uridine Developed as Labelled Building Blocks for Oligonucleotide Probes

Legal Events

Date Code Title Description
A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20081015

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20111031

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20111210

TRDD Decision of grant or rejection written
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20120116

A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150

Ref document number: 4929461

Country of ref document: JP

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150

EXPY Cancellation because of completion of term