JP4911575B2 - Ａｇｅを認識するリフォールディングされた分子 - Google Patents

Description

本発明は、ＡＧＥを認識するリフォールディングされた分子の製造方法に関する。

近年、糖尿病患者数は増加の一途を辿っている。それに伴い、糖尿病血管障害に罹患する患者人口も増加の一途を辿っいる。糖尿病患者の生活の質「QOL: Quality of Life」を損ねる元凶は血管合併症であり、全身の様々な組織傷害がそれによって起こるからである。これら全身での組織障害の中でも、眼、神経、および腎臓の障害は、それぞれ、糖尿病性網膜症、神経症、腎症（あわせて、三大合併症）とよばれ、特に、糖尿病において特徴的な疾患である。網膜症は、最終的には失明に至る疾患である。現在、後天性の失明原因の第１位が糖尿病によるものであり、日本においては年間約３０００人の糖尿病患者が失明している。腎症は最終的には腎不全に至り、透析療法が必要となる、透析導入原疾患の第１位であり、年間約１０００人が透析導入されている現状にある。現在では、このような合併症患者数が急激に増加し続けていることが、社会問題化しており、また、医学経済的にみても、これら合併症は、早期に解決すべき課題となっている。従って、これら合併症を早期に確実に検出する方法が求められている。

糖尿病状態で加速的に生成が亢進する物質としては、後期糖化反応生成物（ＡＧＥ：Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｇｌｙｃａｔｉｏｎ Ｅｎｄ Ｐｒｏｄｕｃｔ）が公知である。従って、ＡＧＥを高感度で検出する方法／キットを提供することによって、糖尿病血管障害の早期診断が可能となる。ＡＧＥの特異的受容体としては、ＲＡＧＥ（Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｆｏｒ ＡＧＥ）が公知であり、ＡＧＥ−ＲＡＧＥの、糖尿病血管障害の発生・進展における役割が注目され、多くの研究が行われてきている。（例えば、非特許文献１）
しかしながら、ＲＡＧＥを高発現する細胞は、後期の糖尿病患者の細胞でありそのため、天然の供給源は、限られている。ＡＧＥを検出する物質（センサー）としてＲＡＧＥを用いる場合には、ＲＡＧＥを組換え発現する必要がある。

ＲＡＧＥは糖鎖修飾された分子であり、ＡＧＥ以外に、アンフォテリンにも結合することが公知である。レセプター分子の糖鎖修飾によって、そのレセプター分子の表面の形状が変化することから、一般的に、天然の状態で糖鎖修飾されているレセプターとリガンドとの結合には、レセプターの糖鎖部分が重要であると考えられている。ＲＡＧＥとアンフォテリンとの結合の場合も、ＲＡＧＥのＮ−グリカンが結合に重要であることが報告されている（例えば、非特許文献２）。そのため、ＲＡＧＥの組換え発現には、真核生物宿主細胞を用いることが必須であると考えられていた。

その一方で、真核生物細胞を宿主として用いた場合には、原核生物細胞と比較して、操作がより煩雑であり、また、細胞の増殖に多大な費用および時間が必要とされるという欠点もある。

この出願の発明に関連する先行技術文献情報としては、次のものがある。
山本 靖彦、外４名、「ＡＧＥ−ＲＡＧＥ系を標的とした糖尿病血管障害抑制の可能性」、日薬理誌、日本薬理学会、２００３年、１２１、４９〜５６ GeethaSrikrishna、外６名、N-Glycans on the receptor for advanced glycation end productsinfluence amphoterin binding and neurite outgrowth、Journal of Neurochemistry、InternationalSociety for Neurochemistry、２００２、８０、９９８−１００８

ＲＡＧＥまたはそのホモログを細菌細胞で組換え発現させて、ＡＧＥと高い特異性で結合する分子を、簡便かつ大量に提供すること、およびそのような分子の調製方法を提供することが、本願発明の課題である。

従来、当業者は、（１）ＲＡＧＥがＡＧＥと結合するためには、糖鎖修飾が必須であること、および、（２）リフォールディングは条件設定が複雑なため、高純度かつ高比活性を有するリフォールディングポリペプチド得ることは一般に試行錯誤を要し困難であること、を認識していた。しかしながら、従来からの当業者の予測に反して、大腸菌などの細菌を宿主細胞として用い、封入体を産生させ、その封入体をリフォールディングした場合に、高い特異性でＡＧＥに結合するＲＡＧＥ分子およびＲＡＧＥ分子のフラグメントを得ることができた。さらに、特定の配列を特異的にビオチン化する細菌細胞を宿主細胞として用い、ビオチン化される配列を含む組換えＲＡＧＥを発現することによって、ビオチン化組換えＲＡＧＥの封入体を産生し、リフォールディングした後、アビジンまたはストレプトアビジンを固定化した固相に組換えＲＡＧＥを固定化することによって、簡便に、高感度ＡＧＥ検出用チップを生成することができた。

したがって、本発明は、以下を提供する。

（項目１） レセプター由来の配列およびビオチン化配列を含むビオチン化ポリペプチドの製造方法であって、ここで、該ポリペプチドは、ＡＧＥと結合し、ここで、該レセプター由来の配列は、以下：
（ａ）配列番号２に記載されるアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号２に記載されるアミノ酸配列を有するタンパク質のフラグメントの配列；
（ｃ）配列番号２に記載されるアミノ酸配列を参照配列として、マトリクスとしてＢＬＯＳＵＭ−６２を使用し、フィルターとしてＬｏｗ−ｃｏｍｐｌｅｘｉｔｙのみを使用するＢｌａｓｔ解析を行った場合に、Ｅ値が１ｅ−２０以下であるポリペプチドのアミノ酸配列；
（ｄ）配列番号２に記載されるアミノ酸配列に対して、少なくとも１つの保存的置換を有するポリペプチドのアミノ酸配列；
（ｅ）配列番号２に記載されるアミノ酸配列に対して、１または数個の置換、付加、欠失を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドのアミノ酸配列；
（ｆ）配列番号２に記載されるアミノ酸配列に対して、少なくとも１つの保存的置換、および、１または数個の置換、付加、欠失を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドのアミノ酸配列；ならびに、
（ｇ）配列番号１に記載される核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸にコードされるポリペプチドのアミノ酸配列；
からなる群から選択され、
ここで、ビオチン化配列は、配列番号７に記載されるアミノ酸配列によってビオチン化され、以下：
（ｉ）配列番号３に記載されるアミノ酸配列、配列番号４に記載されるアミノ酸配列、配列番号５に記載されるアミノ酸配列、配列番号６に記載されるアミノ酸配列、アミノ酸配列ＫＩＧ、アミノ酸配列ＫＩ、アミノ酸配列ＫＩＡ、アミノ酸配列ＫＩＥ、アミノ酸配列ＫＬＧ、または、アミノ酸配列ＫＶＧ
（ｊ）配列番号３に記載されるアミノ酸配列、配列番号４に記載されるアミノ酸配列、配列番号５に記載されるアミノ酸配列、または、配列番号６に記載されるアミノ酸配列を有するタンパク質のフラグメントの配列；
（ｋ）配列番号３に記載されるアミノ酸配列、配列番号４に記載されるアミノ酸配列、配列番号５に記載されるアミノ酸配列、または、配列番号６に記載されるアミノ酸配列を参照配列として、マトリクスとしてＢＬＯＳＵＭ−６２を使用し、フィルターとしてＬｏｗ−ｃｏｍｐｌｅｘｉｔｙのみを使用するＢｌａｓｔ解析を行った場合に、Ｅ値が１ｅ−２０以下であるポリペプチドのアミノ酸配列；
（ｌ）配列番号３に記載されるアミノ酸配列、配列番号４に記載されるアミノ酸配列、配列番号５に記載されるアミノ酸配列、または、配列番号６に記載されるアミノ酸配列に対して、少なくとも１つの保存的置換を有するポリペプチドのアミノ酸配列；
（ｍ）配列番号３に記載されるアミノ酸配列、配列番号４に記載されるアミノ酸配列、配列番号５に記載されるアミノ酸配列、または、配列番号６に記載されるアミノ酸配列に対して、１または数個の置換、付加、欠失を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドのアミノ酸配列；
（ｎ）配列番号３に記載されるアミノ酸配列、配列番号４に記載されるアミノ酸配列、配列番号５に記載されるアミノ酸配列、または、配列番号６に記載されるアミノ酸配列に対して、少なくとも１つの保存的置換、および、１または数個の置換、付加、欠失を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドのアミノ酸配列；
からなる群から選択され、
該方法は、以下の工程：
（ｉ）該ビオチン化ポリペプチドを、細菌宿主内で封入体として組換え発現する工程；および
（ｉｉ）該封入体を、環状糖質サイクロアミロースとポリオキシエチレン系界面活性剤を含有する溶液中でリフォールディングして、可溶性ビオチン化ポリペプチドを調製する工程；
を包含する、方法。

（項目２） 前記環状糖質サイクロアミロースの重合度が、１７〜５０または４０〜１５０である、項目１記載の方法。

（項目３） 前記環状糖質サイクロアミロースの重合度が、４０〜１５０である、項目２記載の方法。

（項目４） 前記ポリオキシエチレン系界面活性剤が、ポリオキシエチレンソルビタンエステル、ポリオキシエチレンドデシルエーテル、ポリオキシエチレンヘプタメチルヘキシルエーテル、ポリオキシエチレンイソオクチルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル、ポリオキシエチレン脂肪酸エステルまたはスクロース脂肪酸エステルである、項目１に記載の方法。

（項目５） レセプター由来の配列およびビオチン化配列を含むビオチン化ポリペプチドの製造方法であって、ここで、該ポリペプチドは、ＡＧＥと結合し、ここで、該レセプター由来の配列は、以下：
（ａ）配列番号２に記載されるアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号２に記載されるアミノ酸配列を有するタンパク質のフラグメントの配列；
（ｃ）配列番号２に記載されるアミノ酸配列を参照配列として、マトリクスとしてＢＬＯＳＵＭ−６２を使用し、フィルターとしてＬｏｗ−ｃｏｍｐｌｅｘｉｔｙのみを使用するＢｌａｓｔ解析を行った場合に、Ｅ値が１ｅ−２０以下であるポリペプチドのアミノ酸配列；
（ｄ）配列番号２に記載されるアミノ酸配列に対して、少なくとも１つの保存的置換を有するポリペプチドのアミノ酸配列；
（ｅ）配列番号２に記載されるアミノ酸配列に対して、１または数個の置換、付加、欠失を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドのアミノ酸配列；
（ｆ）配列番号２に記載されるアミノ酸配列に対して、少なくとも１つの保存的置換、および、１または数個の置換、付加、欠失を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドのアミノ酸配列；ならびに、
（ｇ）配列番号１に記載される核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸にコードされるポリペプチドのアミノ酸配列；
からなる群から選択され、
ここで、ビオチン化配列は、配列番号７に記載されるアミノ酸配列によってビオチン化され、以下：
（ｉ）配列番号３に記載されるアミノ酸配列、配列番号４に記載されるアミノ酸配列、配列番号５に記載されるアミノ酸配列、配列番号６に記載されるアミノ酸配列、アミノ酸配列ＫＩＧ、アミノ酸配列ＫＩ、アミノ酸配列ＫＩＡ、アミノ酸配列ＫＩＥ、アミノ酸配列ＫＬＧ、または、アミノ酸配列ＫＶＧ
（ｊ）配列番号３に記載されるアミノ酸配列、配列番号４に記載されるアミノ酸配列、配列番号５に記載されるアミノ酸配列、または、配列番号６に記載されるアミノ酸配列を有するタンパク質のフラグメントの配列；
（ｋ）配列番号３に記載されるアミノ酸配列、配列番号４に記載されるアミノ酸配列、配列番号５に記載されるアミノ酸配列、または、配列番号６に記載されるアミノ酸配列を参照配列として、マトリクスとしてＢＬＯＳＵＭ−６２を使用し、フィルターとしてＬｏｗ−ｃｏｍｐｌｅｘｉｔｙのみを使用するＢｌａｓｔ解析を行った場合に、Ｅ値が１ｅ−２０以下であるポリペプチドのアミノ酸配列；
（ｌ）配列番号３に記載されるアミノ酸配列、配列番号４に記載されるアミノ酸配列、配列番号５に記載されるアミノ酸配列、または、配列番号６に記載されるアミノ酸配列に対して、少なくとも１つの保存的置換を有するポリペプチドのアミノ酸配列；
（ｍ）配列番号３に記載されるアミノ酸配列、配列番号４に記載されるアミノ酸配列、配列番号５に記載されるアミノ酸配列、または、配列番号６に記載されるアミノ酸配列に対して、１または数個の置換、付加、欠失を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドのアミノ酸配列；
（ｎ）配列番号３に記載されるアミノ酸配列、配列番号４に記載されるアミノ酸配列、配列番号５に記載されるアミノ酸配列、または、配列番号６に記載されるアミノ酸配列に対して、少なくとも１つの保存的置換、および、１または数個の置換、付加、欠失を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドのアミノ酸配列；
からなる群から選択され、
該方法は、以下の工程：
（ｉ）該ビオチン化ポリペプチドを、細菌宿主内で封入体として組換え発現する工程；および
（ｉｉ）該封入体を、環状糖質サイクロアミロースとイオン性界面活性剤を含有する溶液中でリフォールディングして、可溶性ビオチン化ポリペプチドを調製する工程；
を包含する、方法。

（項目６） 前記環状糖質サイクロアミロースの重合度が、１７〜５０または４０〜１５０である、項目５記載の方法。

（項目７） 前記環状糖質サイクロアミロースの重合度が、４０〜１５０である、項目６記載の方法。

（項目８） 前記イオン性界面活性剤が、セチルトリメチルアンモニウムブロミド、ドデシル硫酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム、３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホン酸、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロマイドまたはミリスチルサルホオベタインである、項目５に記載の方法。

本発明に従って、ＲＡＧＥ由来ポリペプチドを封入体として組換え発現させてリフォールディングさせた場合、糖鎖修飾がされていないにも関わらず、ＡＧＥと高い特異性で結合するポリペプチドを、簡便かつ大量に提供することが可能となった。このポリペプチドをチップ等に固定化することにより、ＡＧＥ検出のための受容体チップを製造することができる。

さらに、ＲＡＧＥは、糖尿病血管障害以外の疾患において特異的に発現するタンパク質、例えば、アルツハイマー症などと関連のあるβアミロイド、ならびに種々の疾患（例えば、神経疾患、癌、および炎症）に関連したマーカーを認識し得るため、神経性疾患、癌、炎症など多くの病態の検出および早期診断に利用可能である。従って、本発明の方法によって製造されたタンパク質、受容体チップ、およびキットは、糖尿病血管障害のみならず、神経性疾患、癌、炎症など多くの病態の検出および早期診断に利用可能である。

（発明の実施の形態）
以下、本発明を説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。

以下に本明細書において特に使用される用語の定義を列挙する。

本明細書において使用される用語「受容体」とは、１個以上のリガンドと可逆的、かつ特異的に複合体化する１個以上の結合ドメインを備える生物学的な構造であって、ここで、この複合体化は生物学的な構造を有する。受容体は、完全に細胞の外部（細胞外の受容体）、細胞膜の中（しかし、受容体の部分を細胞外部の環境および細胞質ゾルに向けている）、または完全に細胞の中（細胞内の受容体）に存在し得る。これらはまた、細胞と独立的に機能し得る。細胞膜中の受容体は、細胞を、その境界の外部の空間と連絡（例えば、シグナル伝達）させ、そして細胞の内側および外側への分子およびイオンの輸送において機能させることを可能とする。本明細書において使用する場合、受容体は、受容体全長であっても、受容体のフラグメントであってもよい。

受容体フラグメントを用いる場合には、受容体タンパク質のリガンド認識に関係する部位を用いる。受容体タンパク質のリガンド認識に関係する部位は、以下のように同定することができる。ホモロジーやドメイン検索により相同性や機能上の類似点の高いタンパク質の構造からリガンド認識領域を推定することができる。例えば、同一のリガンドに特異的に結合する、異なる受容体分子のアミノ酸配列をＢＬＡＳＴのデフォルトパラメータを用いて算出した場合、５０％以上、好ましくは５５％以上、より好ましくは６０％以上、さらに好ましくは６５％以上の相同性を示す領域が、リガンド認識領域として推定される。好ましくは、マトリクスとしてＢＬＯＳＵＭ−６２を使用し、フィルターとしてＬｏｗ−ｃｏｍｐｌｅｘｉｔｙのみを使用する。

例えば、配列番号２のフラグメントのアミノ酸配列；配列番号２のアミノ酸配列に１つの保存的置換を有するアミノ酸配列；配列番号２のアミノ酸配列に１または数個の置換、付加、欠失を有するアミノ酸配列；ならびに、配列番号２のアミノ酸配列に少なくとも１つの保存的置換、および、１または数個の置換、付加、欠失を有するアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドもまた、本発明のＲＡＧＥ由来ポリペプチドとして利用可能である。

さらに欠損変異やアミノ酸置換などを導入した変異受容体をコードする遺伝子を動物細胞などに一過性発現させ、その機能に必須の領域を決定することも、当業者は容易になし得る。

好ましくは、上記条件でＢＬＡＳＴ検索を行い、配列番号２に記載されるアミノ酸を参照配列とした場合、Ｅ値が、１ｅ−２０以下、１ｅ−２５以下、１ｅ−３０以下、１ｅ−３５以下、１ｅ−４０以下、１ｅ−４５以下、１ｅ−５０以下または１ｅ−５５以下であり、かつ、少なくとも２００アミノ酸残基、少なくとも２５０アミノ酸残基、少なくとも３００アミノ酸残基、少なくとも３５０アミノ酸残基、少なくとも４００アミノ酸残基、少なくとも４５０アミノ酸残基を有するポリペプチドも、本明細書のＲＡＧＥ由来ポリペプチドに包含される。

本明細書において使用される用語「リガンド」とは、特異的な受容体または受容体のファミリーに対する結合パートナーである。リガンドは、受容体に対する内因性のリガンドであるか、またはその代わりに、薬剤、薬剤候補、もしくは薬理学的手段のような受容体に対する合成リガンドであり得る。本発明において代表的なリガンドは、ＡＧＥである。

本明細書において使用する場合、「ＡＧＥ」とは、後期糖化反応生成物（ａｄｖａｎｃｅｄ ｇｌｙｃａｔｉｏｎ ｅｎｄｐｒｏｄｕｃｔｓ）の略称であり、非酵素的に糖化を受けたタンパク質、脂質などの総称である。グルコースなどの還元糖は、タンパク質やアミノ酸のアミノ基と非酵素的に反応し（可逆的な反応であり前期反応と呼ばれる）、糖化産物を形成する（シッフ塩基やアマドリ転移化合物）。さらに縮合、開裂、架橋形成などの不可逆的な反応を経てＡＧＥを形成する。ＡＧＥは上述の過程を経て生成された構造物の総称であり、生体に存在するＡＧＥ構造としてはカルボキシメチルリジン(ＣＭＬ)、カルボキエチルリジン(ＣＥＬ)、ペントシジン、ピラリン、イミダゾリン、メチルグリオキサール、クロスリンなどがが挙げられるが、これに限定されない。血漿中に存在するアルブミン、イムノグロブリン、オボアルブミンなどが上記の糖化を受けた産物もＡＧＥであり、ＡＧＥとして実験系に汎用されている。血糖コントロールの指標として用いられているヘモグロビンＡ１ｃはアマドリ転移化合物であるが、ＡＧＥに包含される。また、任意のタンパク質も、ＡＧＥに変換可能である。例えば、ＡＧＥに包含されるＣＭＬアルブミンおよびＣＥＬアルブミンは、いずれもアルブミンが糖化を受けたＡＧＥである。

本明細書において使用される用語「タンパク質」「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」および「ペプチド」は、本明細書において同じ意味で使用され、任意の長さのアミノ酸のポリマーをいう。このポリマーは、直鎖であっても分岐していてもよく、環状であってもよい。アミノ酸は、天然のものであっても非天然のものであってもよく、改変されたアミノ酸であってもよい。この用語はまた、複数のポリペプチド鎖の複合体へとアセンブルされ得る。この用語はまた、天然または人工的に改変されたアミノ酸ポリマーも包含する。そのような改変としては、例えば、ジスルフィド結合形成、脂質化、アセチル化、リン酸化または任意の他の操作もしくは改変（例えば、標識成分との結合体化）。この定義にはまた、例えば、アミノ酸の１または２以上のアナログを含むポリペプチド（例えば、非天然のアミノ酸などを含む）、ペプチド様化合物（例えば、ペプトイド）および当該分野において公知の他の改変が包含される。

本明細書において使用される用語「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」および「核酸」は、本明細書において同じ意味で使用され、任意の長さのヌクレオチドのポリマーをいう。この用語はまた、「誘導体オリゴヌクレオチド」または「誘導体ポリヌクレオチド」を含む。「誘導体オリゴヌクレオチド」または「誘導体ポリヌクレオチド」とは、ヌクレオチドの誘導体を含むか、またはヌクレオチド間の結合が通常とは異なるオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドをいい、互換的に使用される。そのようなオリゴヌクレオチドとして具体的には、例えば、２’−Ｏ−メチル−リボヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がホスホロチオエート結合に変換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がＮ３’−Ｐ５’ホスホロアミデート結合に変換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のリボースとリン酸ジエステル結合とがペプチド核酸結合に変換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５プロピニルウラシルで置換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５チアゾールウラシルで置換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のシトシンがＣ−５プロピニルシトシンで置換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のシトシンがフェノキサジン修飾シトシン（ｐｈｅｎｏｘａｚｉｎｅ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｃｙｔｏｓｉｎｅ）で置換された誘導体オリゴヌクレオチド、ＤＮＡ中のリボースが２’−Ｏ−プロピルリボースで置換された誘導体オリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド中のリボースが２’−メトキシエトキシリボースで置換された誘導体オリゴヌクレオチドなどが例示される。他にそうではないと示されなければ、特定の核酸配列はまた、明示的に示された配列と同様に、その保存的に改変された改変体（例えば、縮重コドン置換体）および相補配列を包含することが企図される。具体的には、縮重コドン置換体は、１またはそれ以上の選択された（または、すべての）コドンの３番目の位置が混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換された配列を作成することにより達成され得る（Ｂａｔｚｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１９：５０８１（１９９１）；Ｏｈｔｓｕｋａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：２６０５−２６０８（１９８５）；Ｒｏｓｓｏｌｉｎｉら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ ８：９１−９８（１９９４））。用語「核酸」はまた、本明細書において、遺伝子、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、およびポリヌクレオチドと互換可能に使用される。特定の核酸配列はまた、「スプライス改変体」を包含する。同様に、核酸によりコードされた特定のタンパク質は、その核酸のスプライス改変体によりコードされる任意のタンパク質を暗黙に包含する。その名が示唆するように「スプライス改変体」は、遺伝子のオルタナティブスプライシングの産物である。転写後、最初の核酸転写物は、異なる（別の）核酸スプライス産物が異なるポリペプチドをコードするようにスプライスされ得る。スプライス改変体の産生機構は変化するが、エキソンのオルタナティブスプライシングを含む。読み過し転写により同じ核酸に由来する別のポリペプチドもまた、この定義に包含される。スプライシング反応の任意の産物（組換え形態のスプライス産物を含む）がこの定義に含まれる。

本明細書において「遺伝子」とは、遺伝形質を規定する因子をいう。通常染色体上に一定の順序に配列している。タンパク質の一次構造を規定する遺伝子を構造遺伝子といい、その発現を左右する調節遺伝子という。本明細書では、「遺伝子」は、「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」および「核酸」ならびに／あるいは「タンパク質」「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」および「ペプチド」をさすことがある。本明細書において遺伝子の「相同性」とは、２以上の遺伝子配列の、互いに対する同一性の程度をいう。従って、ある２つの遺伝子の相同性が高いほど、それらの配列の同一性または類似性は高い。２種類の遺伝子が相同性を有するか否かは、配列の直接の比較、または核酸の場合ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーション法によって調べられ得る。２つの遺伝子配列を直接比較する場合、その遺伝子配列間でＤＮＡ配列が、代表的には少なくとも５０％同一である場合、好ましくは少なくとも７０％同一である場合、より好ましくは少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である場合、それらの遺伝子は相同性を有する。

本明細書において使用する場合、「ストリンジェントな条件」とは、当該分野で慣用される周知の条件をいう。本発明の配列番号１に記載の核酸配列を有する核酸をプローブとして、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより、そのような核酸を得ることができる。具体的には、例えば、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡを固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０ＭのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍濃度のＳＳＣ（ｓａｌｉｎｅ−ｓｏｄｉｕｍ ｃｉｔｒａｔｅ）溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ 塩化ナトリウム、１５ｍＭ クエン酸ナトリウムである）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるポリヌクレオチドを意味する。ハイブリダイゼーションは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２ｎｄ ｅｄ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ １〜３８、ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ １：Ｃｏｒｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９５）等の実験書に記載されている方法に準じて行うことができる。

本明細書中では、「レセプター由来の配列」とは、レセプターポリペプチドのアミノ酸配列およびこのアミノ酸配列をコードする核酸配列、ならびにレセプターポリペプチドのアミノ酸配列／核酸配列を改変することによって得られる配列であって、レセプター自体のリガンド結合能を保持する配列をいう。レセプター由来の配列としては、例えば、ＲＡＧＥ由来の核酸配列／アミノ酸配列が挙げられるが、これに限定されない。本明細書において、ＲＡＧＥ配列を改変することによって得られるポリペプチドであって、リガンドであるＡＧＥに対する結合能を保持するポリペプチドを、ＲＡＧＥの「ホモログ」という。ＲＡＧＥ由来の配列としては、代表的には、ＡＧＥに対する結合する能力を有するポリペプチドの発現に使用可能な配列であり、かつ：
（ａ）配列番号２に記載されるアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号２に記載されるアミノ酸配列を有するタンパク質のフラグメントの配列；
（ｃ）配列番号２に記載されるアミノ酸配列を参照配列として、マトリクスとしてＢＬＯＳＵＭ−６２を使用し、フィルターとしてＬｏｗ−ｃｏｍｐｌｅｘｉｔｙのみを使用するＢｌａｓｔ解析を行った場合に、Ｅ値が１ｅ−２０以下であるポリペプチドのアミノ酸配列；
（ｄ）配列番号２に記載されるアミノ酸配列に対して、少なくとも１つの保存的置換を有するポリペプチドのアミノ酸配列；
（ｅ）配列番号２に記載されるアミノ酸配列に対して、１または数個の置換、付加、欠失を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドのアミノ酸配列；
（ｆ）配列番号２に記載されるアミノ酸配列に対して、少なくとも１つの保存的置換、および、１または数個の置換、付加、欠失を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドのアミノ酸配列；ならびに、
（ｇ）配列番号１に記載される核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸にコードされるポリペプチドのアミノ酸配列；
からなる群から選択される配列、あるいは、これらアミノ酸配列をコードする核酸配列が挙げられるが、これに限定されない。。

本明細書では塩基配列の同一性の比較および相同性の算出は、配列分析用ツールであるＢＬＡＳＴを用いてデフォルトパラメータを用いて算出される。

本明細書において遺伝子、ポリヌクレオチド、ポリペプチドなどの「発現」とは、その遺伝子などがインビボで一定の作用を受けて、別の形態になることをいう。好ましくは、遺伝子、ポリヌクレオチドなどが、転写および翻訳されて、ポリペプチドの形態になることをいうが、転写されてｍＲＮＡが作製されることもまた発現の一態様であり得る。

本明細書において、「アミノ酸」は、天然のものでも非天然のものでもよい。「誘導体アミノ酸」または「アミノ酸アナログ」とは、天然に存在するアミノ酸とは異なるがもとのアミノ酸と同様の機能を有するものをいう。そのような誘導体アミノ酸およびアミノ酸アナログは、当該分野において周知である。用語「天然のアミノ酸」とは、天然のアミノ酸のＬ−異性体を意味する。天然のアミノ酸は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、メチオニン、トレオニン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、システイン、プロリン、ヒスチジン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン酸、グルタミン、γ−カルボキシグルタミン酸、アルギニン、オルニチン、およびリジンである。特に示されない限り、本明細書でいう全てのアミノ酸はＬ体である。用語「非天然アミノ酸」とは、タンパク質中で通常は天然に見出されないアミノ酸を意味する。非天然アミノ酸の例として、ノルロイシン、パラ−ニトロフェニルアラニン、ホモフェニルアラニン、パラ−フルオロフェニルアラニン、３−アミノ−２−ベンジルプロピオン酸、ホモアルギニンのＤ体またはＬ体およびＤ−フェニルアラニンが挙げられる。「アミノ酸アナログ」とは、アミノ酸ではないが、アミノ酸の物性および／または機能に類似する分子をいう。アミノ酸アナログとしては、例えば、エチオニン、カナバニン、２−メチルグルタミンなどが挙げられる。アミノ酸模倣物とは、アミノ酸の一般的な化学構造とは異なる構造を有するが、天然に存在するアミノ酸と同様な様式で機能する化合物をいう。

アミノ酸は、その一般に公知の３文字記号か、またはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎにより推奨される１文字記号のいずれかにより、本明細書中で言及され得る。ヌクレオチドも同様に、一般に受け入れられた１文字コードにより言及され得る。

本明細書中において、「対応する」アミノ酸とは、あるタンパク質分子またはポリペプチド分子において、比較の基準となるタンパク質またはポリペプチドにおける所定のアミノ酸と同様の作用を有するか、または有することが予測されるアミノ酸をいい、特に酵素分子にあっては、活性部位中の同様の位置に存在し触媒活性に同様の寄与をするアミノ酸をいう。

本明細書において「ヌクレオチド」は、天然のものでも非天然のものでもよい。「誘導体ヌクレオチド」または「ヌクレオチドアナログ」とは、天然に存在するヌクレオチドとは異なるがもとのヌクレオチドと同様の機能を有するものをいう。そのような誘導体ヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログは、当該分野において周知である。そのような誘導体ヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログの例としては、ホスホロチオエート、ホスホルアミデート、メチルホスホネート、キラルメチルホスホネート、２−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、ペプチド−核酸（ＰＮＡ）が含まれるが、これらに限定されない。

本明細書において、「フラグメント」とは、全長のポリペプチドまたはポリヌクレオチド（長さがｎ）に対して、１〜ｎ−１までの配列長さを有するポリペプチドまたはポリヌクレオチドをいう。フラグメントの長さは、その目的に応じて、適宜変更することができ、例えば、その長さの下限としては、ポリペプチドの場合、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５，２０、２５、３０、４０、５０およびそれ以上のアミノ酸が挙げられ、ここの具体的に列挙していない整数で表される長さ（例えば、１１など）もまた、下限として適切であり得る。また、ポリヌクレオチドの場合、５、６、７、８、９、１０、１５，２０、２５、３０、４０、５０、７５、１００およびそれ以上のヌクレオチドが挙げられ、ここの具体的に列挙していない整数で表される長さ（例えば、１１など）もまた、下限として適切であり得る。本明細書において使用する場合、好ましくは、受容体「フラグメント」は、全長受容体が特異的に結合し得るリガンドに特異的に結合する。ＲＡＧＥ由来ポリペプチドの好ましいフラグメントは、ＡＧＥに対する結合能を有するポリペプチドフラグメントである。

本発明のポリペプチドを製造する方法としては、例えば、そのポリペプチドを産生する原核生物である細菌を培養し、細菌中に組換え受容体タンパク質を封入体として蓄積させ、その宿主細菌を破壊することによって、そのポリペプチドを得る方法を用いてもよい。この場合は、後述するように、環状糖質サイクロアミロースとポリオキシエチレン系界面活性剤を含有する溶液中、または環状糖質サイクロアミロースとイオン性界面活性剤を含有する溶液中で、封入体として発現したタンパク質をリフォールディングすることが可能である。

本発明において使用するビオチン化配列としては、例えば、「ＭＫＬＫＶＴＶＮＧＴＡＹＤＶＤＶＤＶＤＫＳＨＥＮＰＭＧＴＩＬＦＧＧＧＴＧＧＡＰＡＰＡＡＧＧＡＧＡＧＫＡＧＥＧＥＩＰＡＰＬＡＧＴＶＳＫＩＬＶＫＥＧＤＴＶＫＡＧＱＴＶＬＶＬＥＡＭＫＭＥＴＥＩＮＡＰＴＤＧＫＶＥＫＶＬＶＫＥＲＤＡＶＱＧＧＱＧＬＩＫＩＧＤＬＥＬ」（配列番号３）が挙げられる。アミノ酸配列「ＧＬＮＤＩＦＥＡＱＫＩＥＷＨＥ」（配列番号４）もまたビオチン化モチーフとして利用可能である。これら配列において、実際にビオチン化を受けるＫ（リジン）残基以外に変異を導入しても、ビオチン化活性に大きな影響はないので、リジン残基以外を置換した配列もまた、ビオチン化モチーフとして使用することができる。また、実際にビオチン化を受けるＫを含んだ「ＫＩＧ，ＫＩ，ＫＩＡ，ＫＩＥ，ＫＩＧＤＰ（配列番号５），ＫＬＷＳＩ（配列番号６），ＫＬＧ，ＫＶＧ」などをＣ末側に付加することによるビオチン化も可能である。さらに、これら配列のフラグメントのアミノ酸配列；これら配列に１つの保存的置換を有するアミノ酸配列；これら配列に１または数個の置換、付加、欠失を有するアミノ酸配列；ならびに、これら配列に少なくとも１つの保存的置換、および、１または数個の置換、付加、欠失を有するアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドもまた、本発明のビオチン化配列として利用可能である。

デフォルトパラメーターを用い、これらの配列を参照配列として用いて、Ｅ値が、１ｅ−２０以下、１ｅ−２５以下、１ｅ−３０以下、１ｅ−３５以下、１ｅ−４０以下、１ｅ−４５以下、１ｅ−５０以下または１ｅ−５５以下であり、かつ、少なくとも２００アミノ酸残基、少なくとも２５０アミノ酸残基、少なくとも３００アミノ酸残基、少なくとも３５０アミノ酸残基、少なくとも４００アミノ酸残基、少なくとも４５０アミノ酸残基を有するポリペプチドも、本明細書のビオチン化配列に包含される。本発明のビオチン化配列は、配列番号７に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドによってビオチン化される。

なお、エンドプロテイナーゼであるＦａｃｔｏｒＸａの認識配列「ＩＥＧＲ」（配列番号８）、エンテロキナーゼの認識配列「ＤＤＤＤＫ」（配列番号９）、またはトロンビンの認識配列「ＬＶＰＲＧＳ」（配列番号１０）などをこれらビオチン化モチーフと発現されるＲＡＧＥ配列／ＲＡＧＥ由来配列との間に挿入し、ＦａｃｔｏｒＸａまたはエンテロキナーゼによる切断によりＲＡＧＥ由来配列を精製することも可能である。例えば、配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドを発現する場合、これらビオチン化モチーフと配列番号２のアミノ酸配列との間にアミノ酸配列「ＩＥＧＲ」を挿入し、ＲＡＧＥ由来ポリペプチドのみの精製をすることも可能である。

「形質転換体」とは、宿主細胞を形質転換することによって作製された細胞などの生命体の全部または一部をいう。形質転換体としては、原核細胞が例示される。形質転換体は、その対象に依存して、形質転換細胞、形質転換組織、形質転換宿主などともいわれ、本明細書においてそれらの形態をすべて包含するが、特定の文脈において特定の形態を指し得る。

形質転換体を得るための宿主細菌細胞は、生理活性を保持するポリペプチドを発現するものであれば、特に限定されず、従来から遺伝子操作において利用される各種の宿主細菌細胞を用いることができる。原核細胞としては、エシェリヒア属、セラチア属、バチルス属、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属、ミクロバクテリウム属、シュードモナス属等に属する原核細胞、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＸＬ１−Ｂｌｕｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＸＬ２−Ｂｌｕｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
ｃｏｌｉ ＤＨ１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＭＣ１０００、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＫＹ３２７６、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｗ１４８５、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ
ＨＢ１０１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｎｏ．４９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｗ３１１０、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＮＹ４９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｆｉｃａｒｉａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｆｏｎｔｉｃｏｌａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｍｍａｒｉｏｐｈｉｌｕｍ ＡＴＣＣ１４０６８、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍＡＴＣＣ１４０６６、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＡＴＣＣ１３０３２、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ
ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＡＴＣＣ１４０６７、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＡＴＣＣ１３８６９、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ ＡＴＣＣ１３８７０、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｐｈｉｌｕｍ ＡＴＣＣ１５３５４、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．Ｄ−０１１０などが例示される。

ＲＡＧＥ遺伝子の発現にＴ７プロモーターを用いる場合は、好ましくは、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼが宿主細胞ゲノム中に組み込まれたλＤＥ３溶原菌を用いる。λＤＥ３溶原菌としては、例えば、ＡＤ４９４（ＤＥ３）、ＡＤ４９４（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ、ＢＬ２１（ＤＥ３）、ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ、ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＥ、ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐｌａｃＩ、ＢＬ２１ ｔｒｘＢ（ＤＥ３）、ＢＬ２１ ｔｒｘＢ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ、ＢＬＲ（ＤＥ３）、ＢＬＲ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ、Ｂ８３４（ＤＥ３）、Ｂ８３４（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ、ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）、ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ、ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）ｐＬｙｓＥ、Ｏｒｉｇａｍｉ（ＤＥ３）、Ｏｒｉｇａｍｉ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ、Ｏｒｉｇａｍｉ Ｂ（ＤＥ３）、Ｏｒｉｇｍｉ Ｂ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ、Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）、Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ、Ｒｏｓｅｅｔｔａ−ｇａｍｉ（ＤＥ３）、Ｒｏｓｅｔｔａ−ｇａｍｉ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ、ＲｏｓｅｔｔａＢｌｕｅ（ＤＥ３）、ＲｏｓｅｔｔａＢｌｕｅ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ、Ｔｕｎｅｒ（ＤＥ３）、およびＴｕｎｅｒ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳが挙げられるが、これに限定されない。（Ｎｏｖａｇｅｎ社、Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）
ＲＡＧＥ遺伝子の発現にＴ７プロモーターを用いる場合、Ｔ７ ＲＮＡの天然のインヒビターであるＴ７ リゾチウムを欠損する宿主細胞株を用いることが、好ましい。このような宿主細胞としては、例えば、ＡＤ４９４（ＤＥ３）、ＢＬ２１（ＤＥ３）、ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐｌａｃＩ、ＢＬ２１ ｔｒｘＢ（ＤＥ３）、ＢＬＲ（ＤＥ３）、Ｂ８３４（ＤＥ３）、ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）、Ｏｒｉｇａｍｉ（ＤＥ３）、Ｏｒｉｇａｍｉ Ｂ（ＤＥ３）、Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）、Ｒｏｓｅｅｔｔａ−ｇａｍｉ（ＤＥ３）、ＲｏｓｅｔｔａＢｌｕｅ（ＤＥ３）、およびＴｕｎｅｒ（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ社、Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）が挙げられるが、これに限定されない。

上記を考慮すると、本発明において使用するのに好ましい宿主細菌細胞は、例えば、Ｏｒｉｇａｍｉ（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ社、Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）である。

本発明において得られた細胞に由来するポリペプチドは、天然型のポリペプチドと実質的に同一の作用を有する限り、アミノ酸配列中の１以上のアミノ酸が置換、付加および／または欠失していてもよい。

あるアミノ酸は、相互作用結合能力の明らかな低下または消失なしに、例えば、リガンド分子の結合部位のようなタンパク質構造において他のアミノ酸に置換され得る。あるタンパク質の生物学的機能を規定するのは、タンパク質の相互作用能力および性質である。従って、特定のアミノ酸の置換がアミノ酸配列において、またはそのＤＮＡコード配列のレベルにおいて行われ得、置換後もなお、もとの性質を維持するタンパク質が生じ得る。従って、生物学的有用性の明らかな損失なしに、種々の改変が、本明細書において開示されたペプチドまたはこのペプチドをコードする対応するＤＮＡにおいて行われ得る。

上記のような改変を設計する際に、アミノ酸の疎水性指数が考慮され得る。タンパク質における相互作用的な生物学的機能を与える際の疎水性アミノ酸指数の重要性は、一般に当該分野で認められている（Ｋｙｔｅ．ＪおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ，Ｒ．Ｆ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７（１）：１０５−１３２，１９８２）。アミノ酸の疎水的性質は、生成したタンパク質の二次構造に寄与し、次いでそのタンパク質と他の分子（例えば、酵素、基質、受容体、ＤＮＡ、抗体、抗原など）との相互作用を規定する。各アミノ酸は、それらの疎水性および電荷の性質に基づく疎水性指数を割り当てられる。それらは：イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（−０．４）；スレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタミン酸（−３．５）；グルタミン（−３．５）；アスパラギン酸（−３．５）；アスパラギン（−３．５）；リジン（−３．９）；およびアルギニン（−４．５））である。

あるアミノ酸を、同様の疎水性指数を有する他のアミノ酸により置換して、そして依然として同様の生物学的機能を有するタンパク質（例えば、リガンド結合能において等価なタンパク質）を生じさせ得ることが当該分野で周知である。このようなアミノ酸置換において、疎水性指数が±２以内であることが好ましく、±１以内であることがより好ましく、および±０．５以内であることがさらにより好ましい。疎水性に基づくこのようなアミノ酸の置換は効率的であることが当該分野において理解される。米国特許第４、５５４、１０１号に記載されるように、以下の親水性指数がアミノ酸残基に割り当てられている：アルギニン（＋３．０）；リジン（＋３．０）；アスパラギン酸（＋３．０±１）；グルタミン酸（＋３．０±１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；スレオニン（−０．４）；プロリン（−０．５±１）；アラニン（−０．５）；ヒスチジン（−０．５）；システイン（−１．０）；メチオニン（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１．８）；イソロイシン（−１．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン（−２．５）；およびトリプトファン（−３．４）。アミノ酸が同様の親水性指数を有しかつ依然として生物学的等価体を与え得る別のものに置換され得ることが理解される。このようなアミノ酸置換において、親水性指数が±２以内であることが好ましく、±１以内であることがより好ましく、および±０．５以内であることがさらにより好ましい。

本発明において、「保存的置換」とは、アミノ酸置換において、元のアミノ酸と置換されるアミノ酸との親水性指数または／および疎水性指数が上記のように類似している置換をいう。保存的置換の例は、当業者に周知であり、例えば、次の各グループ内での置換：アルギニンおよびリジン；グルタミン酸およびアスパラギン酸；セリンおよびスレオニン；グルタミンおよびアスパラギン；ならびにバリン、ロイシン、およびイソロイシン、などが挙げられるがこれらに限定されない。

本明細書において、「改変体」とは、もとのポリペプチドまたはポリヌクレオチドなどの物質に対して、一部が変更されているものをいう。そのような改変体としては、置換改変体、付加改変体、欠失改変体、短縮（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）改変体、対立遺伝子変異体などが挙げられる。対立遺伝子（ａｌｌｅｌｅ）とは、同一遺伝子座に属し、互いに区別される遺伝的改変体のことをいう。従って、「対立遺伝子変異体」とは、ある遺伝子に対して、対立遺伝子の関係にある改変体をいう。「種相同体またはホモログ（ｈｏｍｏｌｏｇ）」とは、ある種の中で、ある遺伝子とアミノ酸レベルまたはヌクレオチドレベルで、相同性（好ましくは、６０％以上の相同性、より好ましくは、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上の相同性）を有するものをいう。そのような種相同体を取得する方法は、本明細書の記載から明らかである。「オルソログ（ｏｒｔｈｏｌｏｇ）」とは、オルソロガス遺伝子（ｏｒｔｈｏｌｏｇｏｕｓ ｇｅｎｅ）ともいい、二つの遺伝子がある共通祖先からの種分化に由来する遺伝子をいう。例えば、多重遺伝子構造をもつヘモグロビン遺伝子ファミリーを例にとると、ヒトとマウスのαヘモグロビン遺伝子はオルソログであるが，ヒトのαヘモグロビン遺伝子とβヘモグロビン遺伝子はパラログ（遺伝子重複で生じた遺伝子）である。オルソログは、分子系統樹の推定に有用であることから、オルソログもまた、本発明において有用であり得る。

「保存的（に改変された）改変体」は、アミノ酸配列および核酸配列の両方に適用される。特定の核酸配列に関して、保存的に改変された改変体とは、同一のまたは本質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸をいい、核酸がアミノ酸配列をコードしない場合には、本質的に同一な配列をいう。遺伝コードの縮重のため、多数の機能的に同一な核酸が任意の所定のタンパク質をコードする。例えば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧ、およびＧＣＵはすべて、アミノ酸アラニンをコードする。したがって、アラニンがコドンにより特定される全ての位置で、そのコドンは、コードされたポリペプチドを変更することなく、記載された対応するコドンの任意のものに変更され得る。このような核酸の変動は、保存的に改変された変異の１つの種である「サイレント改変（変異）」である。ポリペプチドをコードする本明細書中のすべての核酸配列はまた、その核酸の可能なすべてのサイレント変異を記載する。当該分野において、核酸中の各コドン（通常メチオニンのための唯一のコドンであるＡＵＧ、および通常トリプトファンのための唯一のコドンであるＴＧＧを除く）が、機能的に同一な分子を産生するために改変され得ることが理解される。したがって、ポリペプチドをコードする核酸の各サイレント変異は、記載された各配列において暗黙に含まれる。好ましくは、そのような改変は、ポリペプチドの高次構造に多大な影響を与えるアミノ酸であるシステインの置換を回避するようになされ得る。

本明細書中において、機能的に等価なポリペプチドを作製するために、アミノ酸の置換のほかに、アミノ酸の付加、欠失、または修飾もまた行うことができる。アミノ酸の置換とは、もとのペプチドを１つ以上、例えば、１〜１０個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個のアミノ酸で置換することをいう。アミノ酸の付加とは、もとのペプチド鎖に１つ以上、例えば、１〜１０個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個のアミノ酸を付加することをいう。アミノ酸の欠失とは、もとのペプチドから１つ以上、例えば、１〜１０個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個のアミノ酸を欠失させることをいう。アミノ酸修飾は、アミド化、カルボキシル化、硫酸化、ハロゲン化、アルキル化、リン酸化、水酸化、アシル化（例えば、アセチル化）などを含むが、これらに限定されない。置換、または付加されるアミノ酸は、天然のアミノ酸であってもよく、非天然のアミノ酸、またはアミノ酸アナログでもよい。天然のアミノ酸が好ましい。

このような核酸は、周知のＰＣＲ法により得ることができ、化学的に合成することもできる。これらの方法に、例えば、部位特異的変位誘発法、ハイブリダイゼーション法などを組み合わせてもよい。

本明細書において、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの「置換、付加または欠失」とは、もとのポリペプチドまたはポリヌクレオチドに対して、それぞれアミノ酸もしくはその代替物、またはヌクレオチドもしくはその代替物が、置き換わること、付け加わることまたは取り除かれることをいう。このような置換、付加または欠失の技術は、当該分野において周知であり、そのような技術の例としては、部位特異的変異誘発技術などが挙げられる。置換、付加または欠失は、１つ以上であれば任意の数でよく、そのような数は、その置換、付加または欠失を有する改変体において目的とする機能（例えば、ＡＧＥとの結合能など）が保持される限り、多くすることができる。例えば、そのような数は、１または数個であり得、そして好ましくは、全体の長さの２０％以内、１０％以内、または１００個以下、５０個以下、２５個以下などであり得る。

高分子構造（例えば、ポリペプチド構造）は種々のレベルの構成に関して記述され得る。この構成の一般的な議論については、例えば、Ａｌｂｅｒｔｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｅｌｌ（第３版、１９９４）、ならびに、ＣａｎｔｏｒおよびＳｃｈｉｍｍｅｌ、Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｐａｒｔ
Ｉ：Ｔｈｅ Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ（１９８０）を参照。「一次構造」とは、特定のペプチドのアミノ酸配列をいう。「二次構造」とは、ポリペプチド内の局所的に配置された三次元構造をいう。これらの構造はドメインとして一般に公知である。ドメインは、ポリペプチドの緻密単位を形成し、そして代表的には５０〜３５０アミノ酸長であるそのポリペプチドの部分である。代表的なドメインは、βシート（βストランドなど）およびα−ヘリックスのストレッチ（ｓｔｒｅｔｃｈ）のような、部分から作られる。「三次構造」とは、ポリペプチドモノマーの完全な三次元構造をいう。「四次構造」とは、独立した三次単位の非共有的会合により形成される三次元構造をいう。異方性に関する用語は、エネルギー分野において知られる用語と同様に使用される。

本発明において利用され得る一般的な分子生物学的手法としては、Ａｕｓｕｂｅｌ Ｆ．Ａ．ら編（１９８８）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、 Ｗｉｌｅｙ、 Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、 ＮＹ；Ｓａｍｂｒｏｏｋ
Ｊら （１９８７） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹなどを参酌して当業者であれば容易に実施をすることができる。

本明細書において遺伝子について言及する場合、「ベクター」とは、目的のポリヌクレオチド配列を目的の細胞へと移入させることができるものをいう。そのようなベクターとしては、細菌宿主細胞において自律複製が可能である、本発明のポリヌクレオチドの転写に適した位置にプロモーターを含有しているものが例示される。

「発現ベクター」は、構造遺伝子およびその発現を調節するプロモーターに加えて種々の調節エレメントが宿主の細胞中で作動し得る状態で連結されている核酸配列をいう。調節エレメントは、好ましくは、ターミネーターおよび、選択マーカーを含み得る。発現ベクターのタイプおよび使用される調節エレメントの種類が、宿主細菌細胞に応じて変わり得ることは、当業者に周知の事項である。

「組換えベクター」とは、目的のポリヌクレオチド配列を目的の細胞へと移入させることができるベクターをいう。そのようなベクターとしては、原核宿主細胞において自立複製が可能で、本発明のポリヌクレオチドの転写に適した位置にプロモーターを含有しているものが例示される。

原核細胞に対する「組換えベクター」としては、ｐＢＴｒｐ２、ｐＢＴａｃ１、ｐＢＴａｃ２（いずれもＲｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓより市販）、ｐＫＫ２３３−２（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ｐＳＥ２８０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＧＥＭＥＸ−１（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ｐＱＥ−８（ＱＩＡＧＥＮ）、ｐＫＹＰ１０（特開昭５８−１１０６００）、ｐＫＹＰ２００（Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４８，６６９（１９８４））、ｐＬＳＡ１（Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５３，２７７（１９８９））、ｐＧＥＬ１（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２，４３０６（１９８５））、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ＋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＴｒｓ３０（ＦＥＲＭ ＢＰ−５４０７）、ｐＴｒｓ３２（ＦＥＲＭ ＢＰ−５４０８）、ｐＧＨＡ２（ＦＥＲＭ ＢＰ−４００）、ｐＧＫＡ２（ＦＥＲＭ Ｂ−６７９８）、ｐＴｅｒｍ２（特開平３−２２９７９、ＵＳ４６８６１９１、ＵＳ４９３９０９４、ＵＳ５１６０７３５）、ｐＥＧ４００［Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７２，２３９２（１９９０）］、ｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ｐＥＴシステム（Ｎｏｖａｇｅｎ）、ｐＳｕｐｅｘ、ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、ｐＣ１９４、ｐＴｒｘＦｕｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＭＡＬ−ｃ２（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、ｐＵＣ１９［Ｇｅｎｅ，３３，１０３（１９８５）］、ｐＳＴＶ２８（宝酒造）、ｐＵＣ１１８（宝酒造）、ｐＰＡ１（特開昭６３−２３３７９８）、Ｐｉｎｐｏｉｎｔ Ｘａ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）、ＰＡＮ，ＰＡＣ（ａｖｉｄｉｔｙ社製）などが例示される。

本明細書において用いられる「プロモーター」とは、遺伝子の転写の開始部位を決定し、またその頻度を直接的に調節するＤＮＡ上の領域をいい、ＲＮＡポリメラーゼが結合して転写を始める塩基配列である。推定プロモーター領域は、構造遺伝子ごとに変動するが、通常構造遺伝子の上流にあるが、これらに限定されず、構造遺伝子の下流にもあり得る。代表的なプロモーターとしては、Ｔ７プロモーターが挙げられるがこれに限定されない。

本明細書において使用される「固相」とは、抗体のような分子が固定され得る平面状の支持体をいう。本発明において表面プラズモン共鳴の原理を用いて検出する場合、固相は、金、銀またはアルミニウムを含む金属薄膜を片面に持つガラス基板の基材であることが好ましい。本発明において水晶発振子マイクロバランスの原理を用いて検出する場合は、周波数変換素子（例えば水晶発振子、表面弾性波素子）を固相として用い、直接受容体を結合させる。水晶板の片面はシリコーンで被覆し、もう一方の面は金電極を施したものを固相として用いる。

本明細書において使用される「基板」とは、本発明のチップまたはアレイが構築される材料（好ましくは固体）をいう。したがって、基板は固相の概念に包含される。基板の材料としては、共有結合かまたは非共有結合のいずれかで、本発明において使用される生体分子に結合する特性を有するかまたはそのような特性を有するように誘導体化され得る、任意の固体材料が挙げられる。

固相および基板として使用するためのそのような材料としては、固体表面を形成し得る任意の材料が使用され得るが、例えば、ガラス、シリカ、シリコーン、セラミック、二酸化珪素、プラスチック、金属（合金も含まれる）、天然および合成のポリマー（例えば、ポリスチレン、セルロース、キトサン、デキストラン、およびナイロン）以下が挙げられるがそれらに限定されない。基板は、複数の異なる材料の層から形成されていてもよい。例えば、ガラス、石英ガラス、アルミナ、サファイア、フォルステライト、炭化珪素、酸化珪素、窒化珪素などの無機絶縁材料を使用できる。また、ポリエチレン、エチレン、ポリプロピレン、ポリイソブチレン、ポリエチレンテレフタレート、不飽和ポリエステル、含フッ素樹脂、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデン、ポリ酢酸ビニル、ポリビニルアルコール、ポリビニルアセタール、アクリル樹脂、ポリアクリロニトリル、ポリスチレン、アセタール樹脂、ポリカーボネート、ポリアミド、フェノール樹脂、ユリア樹脂、エポキシ樹脂、メラミン樹脂、スチレン・アクリロニトリル共重合体、アクリロニトリルブタジエンスチレン共重合体、シリコーン樹脂、ポリフェニレンオキサイド、ポリスルホン等の有機材料を用いることができる。本発明においてはまた、ナイロン膜、ニトロセルロース膜、ＰＶＤＦ膜など、ブロッティングに使用される膜を用いることもできる。高密度のものを解析する場合は、ガラスなど硬度のあるものを材料として使用することが好ましい。基板として好ましい材質は、測定機器などの種々のパラメータによって変動し、当業者は、上述のような種々の材料から適切なものを適宜選択することができる。

本明細書において「チップ」または「マイクロチップ」は、互換可能に用いられ、多様の機能をもち、システムの一部となる超小型集積回路をいう。本明細書において、ビオチン化受容体を固定化した固相を、受容体チップおよび／または受容体マイクロチップと呼ぶ。

本明細書において「アレイ」とは、１以上（例えば、１０００以上）の受容体が整列されて配置されたパターンまたはパターンを有する基板（例えば、チップ）そのものをいう。アレイの中で、小さな基板（例えば、１０×１０ｍｍ上など）上にパターン化されているものはマイクロアレイというが、本明細書では、マイクロアレイとアレイとは互換可能に使用される。従って、上述の基板より大きなものにパターン化されたものでもマイクロアレイと呼ぶことがある。例えば、アレイはそれ自身固相表面または膜に固定されている所望の受容体のセットで構成される。アレイは好ましくは同一のまたは異なる受容体を少なくとも１０^２個、より好ましくは少なくとも１０^３個、およびさらに好ましくは少なくとも１０^４個、さらにより好ましくは少なくとも１０^５個を含む。これらの受容体は、好ましくは表面が１２５×８０ｍｍ、より好ましくは１０×１０ｍｍ上に配置される。形式としては、９６ウェルマイクロタイタープレート、３８４ウェルマイクロタイタープレートなどのマイクロタイタープレートの大きさのものから、スライドグラス程度の大きさのものが企図される。固定される受容体は、１種類であっても複数種類であってもよい。そのような種類の数は、１個〜スポット数までの任意の数であり得る。例えば、約１０種類、約１００種類、約５００種類、約１０００種類の受容体が固定され得る。

基板のような固相表面または膜には、上述のように任意の数の生体分子（例えば、受容体）が配置され得るが、通常、基板１つあたり、１０^８個の生体分子まで、他の実施形態において１０^７個の生体分子まで、１０^６個の生体分子まで、１０^５個の生体分子まで、１０^４個の生体分子まで、１０^３個の生体分子まで、または１０^２個の生体分子までの個の生体分子が配置され得るが、１０^８個の生体分子を超える生体分子が配置されていてもよい。これらの場合において、基板の大きさはより小さいことが好ましい。特に、生体分子である受容体のスポットの大きさは、単一の生体分子のサイズと同じ小さくあり得る（これは、１−２ｎｍの桁であり得る）。最小限の基板の面積は、いくつかの場合において基板上の生体分子の数によって決定される。本発明では、細胞と特異的に結合する因子は、通常、０．０１ｍｍ〜１０ｍｍのスポット状に共有結合あるいは物理的相互作用によって配列固定されている。

アレイ上には、生体分子の「スポット」が配置され得る。本明細書において「スポット」とは、生体分子の一定の集合をいう。本明細書において「スポッティング」とは、ある生体分子のスポットをある基板または固相に作製することをいう。スポッティングはどのような方法でも行うことができ、例えば、ピペッティングなどによって達成され得、あるいは自動装置で行うこともでき、そのような方法は当該分野において周知である。本明細書において、生体分子は、受容体、受容体のフラグメント、または受容体の改変体である。

本明細書において使用される用語「アドレス」とは、基板上のユニークな位置をいい、他のユニークな位置から弁別可能であり得るものをいう。アドレスは、そのアドレスを伴うスポットとの関連づけに適切であり、そしてすべての各々のアドレスにおける存在物が他のアドレスにおける存在物から識別され得る（例えば、光学的）、任意の形状を採り得る。アドレスを定める形は、例えば、円状、楕円状、正方形、長方形であり得るか、または不規則な形であり得る。したがって、「アドレス」は、抽象的な概念を示し、「スポット」は具体的な概念を示すために使用され得るが、両者を区別する必要がない場合、本明細書においては、「アドレス」と「スポット」とは互換的に使用され得る。

各々のアドレスを定める大きさは、とりわけ、その基板の大きさ、特定の基板上のアドレスの数、分析物の量および／または利用可能な試薬、微粒子の大きさおよびそのアレイが使用される任意の方法のために必要な解像度の程度に依存する。大きさは、例えば、１−２ｎｍから数ｃｍの範囲であり得るが、そのアレイの適用に一致した任意の大きさが可能である。

アドレスを定める空間配置および形状は、そのマイクロアレイが使用される特定の適用に適合するように設計される。アドレスは、密に配置され得、広汎に分散され得るか、または特定の型の分析物に適切な所望のパターンへとサブグループ化され得る。

マイクロアレイについては、秀潤社編、細胞工学別冊「ＤＮＡマイクロアレイと最新ＰＣＲ法」、Ｍ．Ｆ．Ｔｅｍｐｌｉｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｔｏｄａｙ、７（１５）、８１５−８２２（２００２）に広く概説されている。

マイクロアレイから得られるデータは膨大であることから、クローンとスポットとの対応の管理、データ解析などを行うためのデータ解析ソフトウェアが重要である。そのようなソフトウェアとしては、各種検出システムに付属のソフトウェアが利用可能である（Ｅｒｍｏｌａｅｖａ Ｏら（１９９８）Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．２０：１９−２３）。また、データベースのフォーマットとしては、例えば、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘが提唱しているＧＡＴＣ（ｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ）と呼ばれる形式が挙げられる。

微細加工については、例えば、Ｃａｍｐｂｅｌｌ，Ｓ．Ａ．（１９９６）．Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ Ｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ；Ｚａｕｔ，Ｐ．Ｖ．（１９９６）．Ｍｉｃｒｏｍｉｃｒｏａｒｒａｙ Ｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ：ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｓｅｍｉｃｏｎｄｕｃｔｏｒ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ，Ｓｅｍｉｃｏｎｄｕｃｔｏｒ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ；Ｍａｄｏｕ，Ｍ．Ｊ．（１９９７）．Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ，ＣＲＣ１ ５ Ｐｒｅｓｓ；Ｒａｉ−Ｃｈｏｕｄｈｕｒｙ，Ｐ．（１９９７）．Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｌｉｔｈｏｇｒａｐｈｙ，Ｍｉｃｒｏｍａｃｈｉｎｉｎｇ，＆ Ｍｉｃｒｏｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ：Ｍｉｃｒｏｌｉｔｈｏｇｒａｐｈｙなどに記載されており、これらは本明細書において関連する部分が参考として援用される。

マイクロアレイの作製には、マイクロコンタクトプリンティング法、光リソグラフィー法などの種々の方法を用いることが可能であるが、望ましくは、アルカンチオール単分子膜のマイクロパターン化表面を利用する方法である。この場合、まず、片面に金薄膜を蒸着したガラス基板に、メチル基、フルオロメチル基のような疎水性官能基をもつアルカンチオールの単分子膜を形成させる。この単分子膜に、直径数μｍから１ｍｍ程度の多数の光透過性スポットを配列させたフォトマスクを重ね、紫外線を照射する。これによって、照射部のアルカンチオールをスポット状に分解除去することができる。スポット内に導入された反応性官能基を使ってストレプトアビジン、アビジンなどのビオチンと特異的に結合するタンパク質を固定化する。最後に受容体タンパク質のビオチン化部位を介して受容体タンパク質を固定化することにより、化学的処理を経ずに穏やかな条件下で方向性を保った状態での、受容体タンパク質の固定化が完了する。例えば、カルボキシル基含有スポットの場合には、カルボキシル基をＮ−ヒドロキシスクシンイミドを用いて活性エステルに変換し、アビジンやストレプトアビジンなどを固定化させた後、微量の生体分子含有溶液を各スポットに滴下することで、固定化を行うことができる。スポット周囲に形成させた疎水性の単分子膜は、溶液の拡散を抑えるために有効である。スポット周囲のバックグラウンド領域と分析物との非特異的な相互作用を抑えるため、ウシ血清アルブミンのような不活性タンパク質、ポリエチレングリコールのような親水性高分子でブロッキングを行う。

ＤＮＡマイクロアレイ、プロテインチップなどを使った分析技術の進歩を見ても明らかなように、マイクロアレイは、一枚の基板上で多数の検体に対してハイスループット分析が可能であるため、きわめて有効な分析手段である。本発明は、このようなマイクロアレイの考え方を、多種類の生体分子−細胞間相互作用を迅速に計測するために応用する。この場合、きわめて多くの検体を同時に分析したり、分析に必要な生体分子および細胞の量をできる限り少なくするためには、マイクロアレイの集積化が重要である。しかし一方で、マイクロアレイ上の細胞に関する情報を取得する場合、ある程度以上の細胞数からなる集団を対象とした測定を行わない限り、誤差の大きいデータしか得ることができない。このような観点から、マイクロアレイを構成する各スポットの大きさは、少なくとも数十〜数千個程度の細胞が相互作用することのできる大きさであることが望ましく、例えば、円形のスポットの場合、その直径はおおよそ数μｍから１ｍｍ程度である。

マイクロアレイの作製には、マイクロコンタクトプリンティング法、光リソグラフィー法などの種々の方法を用いることが可能であるが、望ましくは、アルカンチオール単分子膜のマイクロパターン化表面を利用する方法である。

本明細書において使用される用語「生体分子」とは、生体に関連する分子をいう。本明細書において「生体」とは、生物学的な有機体をいい、動物、植物、菌類、ウイルスなどを含むがそれらに限定されない。生体分子は、生体から抽出される分子を包含するが、それに限定されず、生体に影響を与え得る分子であれば生体分子の定義に入る。そのような生体分子には、タンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチド、ペプチド、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、核酸（例えば、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡのようなＤＮＡ、ｍＲＮＡのようなＲＮＡを含む）、ポリサッカリド、オリゴサッカリド、脂質、低分子（例えば、ホルモン、リガンド、情報伝達物質、有機低分子、コンビナトリアルライブラリ化合物など）、これらの複合分子などが包含されるがそれらに限定されない。本明細書において好ましい生体分子は、受容体および受容体フラグメント、ならびにそれらのリガンドである。

本明細書において使用される場合、「ビオチンと特異的に結合する因子」とは、ビオチンと特異的に結合し得る任意の因子をいう。ビオチンと特異的に結合する因子とビオチンとの結合は、可逆的であっても、不可逆的であってもよい。ビオチンと特異的に結合する因子としては、アビジン、およびストレプトアビジン、ならびにこれらの改変体が挙げられるが、これらに限定されない。

表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）は、金属表面に生じた表面プラズモン（弾性波）と、全反射した電磁波によって発生するエバネッセント波（光波）との間で起こる相互作用である。プラズモン波とエバネッセント波の波数と波動ベクトルが近似的に一致する条件を与える光の入射角θにおいて共鳴が起こり、エバネッセント波が表面プラズモンの励起に使われるため反射光強度が低下する。表面プラズモン共鳴を得るためには、高屈折率媒体からなるプリズムを配置し（Ｋｒｅｔｓｃｈｍａｎｎ配置）、レーザー光およびＬＥＤ光を入射する方法がとられる。ここで、プリズムとは反対側の金属表面に接触する媒体の誘電率の変化によって、プラズモン波の波数が変化する。すなわち、金属表面上に物質が接近することによって、表面プラズモン共鳴を与える光の入射角がシフトする。このことを利用して、金属表面の物質による被覆をセンシングすることが可能となる。この測定法は、表面鉛直方向の分解能に優れており（０．１ｎｍのオーダー）、表面に存在する物質量をｎｇ〜ｐｇ／ｃｍ^２のオーダーでリアルタイムに観測することが可能である。また、水媒体中で測定できることもタンパク質のような生体分子の挙動を調べる上で大きな利点である。これを利用した測定装置が生体分子間相互作用測定装置として開発され、タンパク質およびＤＮＡなどの相互作用の分析に応用されている。

水晶発振子マイクロバランスは、周波数変換素子の電極上に化学的に結合対の一方を結合・固定化し、その周波数変換素子を水中に浸漬し、その結合対と対応する結合対との特異的に結合により生じる質量変化に伴う周波数変換素子の周波数変化を測定して、結合の有無を検出するものである（例えば、特開平６−９４５９１）。この周波数変換素子としては、例えば水晶発振子、表面弾性波素子（ＳＡＷ）などが挙げられる。

本発明の受容体チップはまた、質量分析計のための質量分析チップとしても使用され得る。一般的に、質量分光測定による分析は、レーザービームを含む、レーザーなどの高エネルギー源を用いた少量のサンプルの気化およびイオン化を伴っている。物質はレーザービームによって、質量分析チップ先端の表面からガスあるいは気相に気化され、このプロセス中に、個々の分子の一部は陽子を取り込んで、イオン化される。これら正の電荷にイオン化された分子は、次に、短い高圧電界で加速され、高真空度チェンバーに導かれ（ドリフト）、その先で、感度の高い検出装置の表面に衝突する。飛行時間はイオン化された分子の質量の関数であるから、イオン化と衝突との間に経過する時間は、その分子の質量の判定に用いることができ、その分子質量は、次に特定の質量の既知の分子が存在しているかどうかの判定に用いることができる（飛行時間質量分光測定（ＴＯＦ））。また、イオン化されたサンプルに含まれる特定の質量／電荷数（ｍ／Ｚ）のイオンだけが安定な振動状態になることを利用して、直流成分と高周波の交流成分の電圧を加えることにより、特定の質量／電荷数（ｍ／Ｚ）を有するイオンのみを通過させる質量フィルターを用いて（必要であれば、フラグメントイオンを生成させて）、サンプル（またはサンプルのフラグメントイオン）の質量／電荷数（ｍ／Ｚ）を検出することもできる（タンデム質量分析法）。

気相イオンの生成方法としては、粒子のサンプルへの衝撃から得られる脱着／イオン化法などがある。この方法には、高速原子衝撃法（ＦＡＢ−揮発性マトリクスに懸濁したサンプルに中性粒子（neutral）を衝撃する）、二次イオン質量分析法（ＳＩＭＳ−ｋｅＶ
一次イオンが表面に衝撃して二次イオンを発生する）、液体ＳＩＭＳ（ＬＳＩＭＳ−一次種がイオンであることを除いてＦＡＢと同様）、プラズマ脱着質量分析法（ＭｅＶ一次イオンを用いることを除いてＳＩＭＳと同様）、大量クラスタ衝撃法（ＭＣＩ−大きいクラスタの一次イオンを用いてＳＩＭＳと同様）、レーザ脱着／イオン化法（ＬＤＩ−レーザ光を用いて、表面から種を脱着／イオン化する）、マトリクス補助型レーザ脱着／イオン化法（ＭＡＬＤＩ−脱着およびイオン化の事象を補助することができるマトリクスから種を脱着／イオン化することを除いてＬＤＩと同様）などがある。代表的な質量分析法としては、レーザー脱着／イオン化、飛行時間質量分光測定（ＴＯＦ）を用いる方法が挙げられる。

質量分析計において、受容体のような親和性結合を行う分子を結合した質量分析チップを用いる測定方法は、例えば以下のように、特表平９−５０１４８９に開示される：
受容体を固定化した質量分析チップ面を、前記分析対象物分子（例えば、リガンドを含む混合物）の源にさらし、前記分析対象物分子が結合するようにするステップと；前記分析対象物分子が結合している質量分析チップ先端を、飛行時間質量分光測定器の一方の端に置き、真空および電場を与えて分光測定器内に加速電位を作るステップと；前記先端より前記分析対象物分子のイオンを脱着させるために、分光測定器内の、誘導された質量分析チップ先端面に結合している分析対象物の少なくとも一部分を、１つあるいはそれ以上のレーザーパルスを用いて、打つステップと；前記質量分光測定器内で、飛行時間によってイオンの質量を検出するステップと；このように検出された質量を表示するステップとから成る、方法。この方法において、質量分析チップに結合した分子（例えば、受容体に特異的に結合するリガンド）のイオンの質量を検出することができる。

上記の方法において、レーザー脱着／イオン化、飛行時間質量分光測定法により、分析対象物分子の質量を測定することが可能であり、この方法においては、分析対象物の脱着およびイオン化を容易にするために、前記分析対象物と一緒にエネルギー吸収物質（例えば、シナピン酸、シンナムアミド、シンナミル臭化物、２，５−ジヒドロキシ安息香酸、およびα−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸）を用いることができる。

質量分析計において、受容体のような親和性結合を行う分子を固定化した質量分析チップを用いるさらなる測定方法は、特表平１１−５１２５１８に開示される。この開示される方法においては、一般にヒドロゲル、およびさらに詳細には、カルボキシメチル化デキストランなどの多糖のヒドロゲルを有する支持体表面に受容体のような親和性結合分子をチップに固定化し、その分析物（例えば、リガンド）をその支持体と接触させた後、親和性結合分子に結合した分析物の有無およびその質量等について解析する。

本明細書において使用するＡＧＥの受容体としては、ＲＡＧＥおよびその改変体であＲＡＧＥ由来の配列が挙げられるが、これに限定されない。ＲＡＧＥ由来の配列とは、ＲＡＧＥ自体の核酸／アミ酸配列のみならず、ＲＡＧＥ自体の核酸／アミノ酸配列を改変した配列をも包含する。ＲＡＧＥ由来の配列としては、代表的には、ＡＧＥに結合する能力を有するポリペプチドの発現に使用可能な配列であり、かつ：
（ａ）配列番号２に記載されるアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号２に記載されるアミノ酸配列を有するタンパク質のフラグメントの配列；
（ｃ）配列番号２に記載されるアミノ酸配列を参照配列として、マトリクスとしてＢＬＯＳＵＭ−６２を使用し、フィルターとしてＬｏｗ−ｃｏｍｐｌｅｘｉｔｙのみを使用するＢｌａｓｔ解析を行った場合に、Ｅ値が１ｅ−２０以下であるポリペプチドのアミノ酸配列；
（ｄ）配列番号２に記載されるアミノ酸配列に対して、少なくとも１つの保存的置換を有するポリペプチドのアミノ酸配列；
（ｅ）配列番号２に記載されるアミノ酸配列に対して、１または数個の置換、付加、欠失を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドのアミノ酸配列；
（ｆ）配列番号２に記載されるアミノ酸配列に対して、少なくとも１つの保存的置換、および、１または数個の置換、付加、欠失を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドのアミノ酸配列；ならびに、
（ｇ）配列番号１に記載される核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸にコードされるポリペプチドのアミノ酸配列；
からなる群から選択される配列、あるいは、これらアミノ酸配列をコードする核酸配列が挙げられるが、これに限定されない。

（ＡＧＥ結合能を有するポリペプチドの発現）
大腸菌などの細菌宿主細胞を用いて、外来タンパク質を多量に発現すると、封入体を形成する場合が多い。封入体は、ポリペプチドの折り畳みが異常であり、そのため、ポリペプチドが本来有する機能を失っている場合が多い。そこで、（１）封入体を形成しない（または少量のみの封入体を形成する）宿主細菌細胞の使用、（２）封入体を形成しない条件での宿主細菌細胞の培養、（３）形成された封入体のリフォールディング、または、（４）これら（１）〜（３）の組合せを用いる必要がある。これら各々について、限定されることはないが、例えば、以下のように実施することが可能である。

（１．封入体のリフォールディング）
本明細書において、封入体として発現された受容体タンパク質のリフォールディングは、環状糖質サイクロアミロースとポリオキシエチレン系界面活性剤を含有する溶液中、または環状糖質サイクロアミロースとイオン性界面活性剤を含有する溶液中で行われる。本明細書において使用される環状糖質サイクロアミロース（ＣＡと略す）の重合度の下限は１７以上、好ましくは２５以上、より好ましくは４０以上であり、重合度の上限は１５０以下、好ましくは１００以下、より好ましくは５０以下である。

上記リフォールディング法に使用されるポリオキシエチレン系界面活性剤としては、一般式Ｃ_ｎＨ_２ｎ＋１（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｘＯＨと表され、通常Ｃ_ｎＥ_ｘと略記されるポリオキシエチレン系界面活性剤、好ましくはポリオキシエチレンソルビタンエステル、ポリオキシエチレンドデシルエーテル、ポリオキシエチレンヘプタメチルヘキシルエーテル、ポリオキシエチレンイソオクチルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル、ポリオキシエチレン脂肪酸エステルまたはスクロース脂肪酸エステルが挙げられるが、これらに限定されない。

上記リフォールディング法に使用されるイオン性界面活性剤としては、セチルトリメチルアンモニウムブロミド、ドデシル硫酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム、３−[(３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ]−１−プロパンスルホン酸、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロマイド（以下、ＣＴＡＢと略記することもある。）、ミリスチルサルフォベタイン（以下、ＳＢ３−１４と略記することもある。）などが挙げられ、特に、ＣＴＡＢ、ＳＢ３−１４などのカチオン系、ないしは両性界面活性剤が望ましいが、これらに限定されない。

正しい高次構造にリフォールディングする際に使用する特に好ましい界面活性剤としては、ポリオキシエチレンソルビタンエステル、ポリオキシエチレンドデシルエーテル、ポリオキシエチレン脂肪酸エステルまたはスクロース脂肪酸エステル、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムプロマイド（ＣＴＡＢ）、デオキシコール酸ナトリウム、ミリスチルサルフォベタイン（ＳＢ３−１４）等が挙げられる。

界面活性剤を過剰量に添加することにより、ビオチン化タンパク質などを変性状態にしている物質を希釈すると共に、受容体同士の凝集を防ぐことができる。また、環状糖質としては、前記したように、重合度が１７以上の環状α−１，４−グルカンなどを挙げることができる。

また、リフォールディングしたビオチン化受容体をアビジンもしくはストレプトアビジンを介して方向性を保った状態で固相上に固定し、例えば表面プラズモン共鳴や水晶発振子マイクロバランスなどの原理を利用した検出機器のセンサー部位として利用し、ＡＧＥなどを簡便に検出することが可能である。

上記リフォールディング法に従って、変性状態にあるビオチン化受容体に過剰量の界面活性剤を添加することにより、受容体を変性状態にしている物質を希釈すると共に、ビオチン化受容体同士の凝集を防ぎ、次いで重合度が１７以上の環状α−１，４−グルカンを添加し、その包接能を利用して前記界面活性剤を除き、ビオチン化受容体を正しい高次構造に戻し、リガンド認識能を有する正しい高次構造に戻し、センサーとして利用することも可能である。

大腸菌内に蓄積したＲＡＧＥのような受容体のリガンド認識に関係する領域の再構成は、第１段階として、不溶性画分に回収された受容体の細胞外領域またはリガンド認識領域を、最終濃度で４０ｍＭのＤＴＴを含む６Ｍのグアニジン塩酸塩中で１時間処理し、間違った構造を解きほぐすことにより行う。続いて、第２段階として、７０倍容量の０．０５〜０．１％界面活性剤溶液（最終濃度で２ｍＭのＤＬ−ｃｙｓｔｉｎｅを含むＰＢＳ（−）（リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）から、ＣａＣｌ_２，ＭｇＳＯ_４を除いたもの））を添加し、室温で１時間反応させる。

この過程で、変性剤が希釈されると同時に、変性剤の希釈に伴う受容体同士の凝集は、添加した界面活性剤が受容体・界面活性剤複合体を形成することにより防止される。さらに、最終段階として、最終濃度で０．６％になるように３％のＣＡ保存溶液を添加し、室温で１時間反応させる。ＣＡは、受容体・界面活性剤複合体から界面活性剤を剥離する。この過程で受容体は正しい立体構造にリフォールディングされ、再構成受容体を得ることができる。

上記リフォールディング法に用いる変性剤としては、グアニジン塩酸塩、尿素などがあるが、間違った構造を完全に解きほぐす目的で、最終濃度で６Ｍのグアニジン塩酸塩を一般に用いる。また、間違って形成されているＳ−Ｓ結合を切断する目的で、変性剤溶液中には最終濃度で４０ｍＭのＤＴＴを添加する。処理するタンパク質濃度は、１０〜２５ｍｇ／ｍ１程度である。封入体をＰＢＳ（−）（リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）から、ＣａＣｌ２，ＭｇＳＯ_４を除いたもの）に懸濁した後、最終濃度で４０ｍＭのＤＴＴを含む最終濃度６Ｍのグアニジン塩酸塩を加え、室温で１時間反応させる。

発現させたビオチン化タンパク質例えばＲＡＧＥを封入体として大腸菌内に蓄積させた後、上記したように、グアニジン塩酸塩などの変性剤を用いて間違った高次構造を解きほぐす。続いて、変性状態にあるビオチン化細胞外領域、並びにＲＡＧＥを過剰量の界面活性剤を添加することにより、ビオチン化タンパク質を変性状態にしている物質を希釈すると共に、受容体分子同士の凝集を防ぐ。

次いで、環状糖質、例えば重合度が１７以上の環状α−１，４−グルカンを添加し、その包接能を利用して前記界面活性剤を除き、正しい高次構造にリフォールディングし、リガンド認識能を有した状態に変換する。発現させたタンパク質を利用してＡＧＥなどを検出する。必要に応じて精製の過程を経た後、アビジンもしくはストレプトアビジン等を介して方向性を保った状態でチップ、キュベット等の固相上に固定し、これをセンサー（すなわち、受容体チップ）として使用する。

上記リフォールディングを用いることによって、封入体として発現されたＲＡＧＥポリペプチドをリフォールディングして、正常なＡＧＥ結合活性を有するタンパク質とすることが可能であった。

（実施例１：組換え宿主細胞の培養）
宿主細菌細胞としてＯｒｉｇａｍｉ（ＤＥ３）を用いた。図１に記載のように、目的ＲＡＧＥ遺伝子クローニングサイトとして、５’側はＮｄｅＩ，３’側にはＸｈｏＩ（ＢａｍＨＩ，ＳｍａＩ，ＨｉｎｄＩＩＩもまた使用可能）を使用する。その結果、目的タンパク質のＣ末側にビオチンリガーゼによって認識されるビオチン化アミノ酸配列が付加される。ＲＡＧＥの場合、Ｎ末側が細胞外領域でありＡＧＥの認識に必須な領域であるため、チップ化などに際してＣ末側で固定化が可能なように、Ｃ末側にビオチン化アミノ酸配列を付加した。この手順を用いて、配列番号１のアミノ酸配列のＣ末端側にビオチン化アミノ酸配列「ＧＬＮＤＩＦＥＡＱＫＩＥＷＨＥ」（配列番号４）をコードする核酸配列を連結し、Ｔ７プロモーターの制御下に配置したプラスミドを作製した。用いたプラスミドのクローニング部位を図１に示す。図１中、「ＦＸａ」は第Ｘａ因子の切断部位を示し、「ｒｂｓ」はリボゾーム結合部位を示す。このプラスミドと、ビオチンリガーゼ遺伝子を発現するプラスミド（ＣｏｌＥ１系であるｐＥＴベクターと不和合性グループが異なるため同一細胞内で安定に共存しうるｐ１５Ａ系プラスミドであるｐＡＣベクターにビオチンリガーゼ遺伝子を挿入したプラスミド）の両方を用いて宿主細菌細胞を形質転換した。この形質転換した宿主細胞の培養に使用した培地は、５０μｇ／ｍｌアンピシリン、３４μｇ／ｍｌクロラムフェニコール、１５μｇ／ｍｌカナマイシン、１２．５μｇ／ｍｌテトラサイクリンを添加した、改変ＬＢ培地（０．５％ ＮａＣｌ、０．５％酵母エキス、１％トリプトン）である。

３７℃で一晩培養した前培養液を、５％の最終濃度になるように培地に添加し、３７℃で攪拌培養した。なお、本培養への添加量を５％以上にして、誘導開始までの培養時間を短縮することも可能である。

培養後に、Ａ_６００での吸光度が０．５〜０．７に達した段階で、１ｍＭ ＩＰＴＧ、５０μＭ ｄ−ｂｉｏｔｉｎ（Ｄ型［（＋）−ｃｉｓ−ヘキサヒドロ−２−オキソ−１Ｈ−チエノ−（３，４）−イミダゾール−４−吉草酸）］（いずれも最終濃度）を添加し、目的タンパク質の誘導とビオチン化を開始し、さらに４時間攪拌培養をすることにより、目的とするタンパク質を可溶性ビオチン化タンパク質として発現させることができた。

目的タンパク質は、１００％近く不溶性となった。不溶性画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析し、ＲＡＧＥが封入体として発現していることを確認した。

（実施例２：封入体からのリフォールディング）
大腸菌で発現させたビオチン化ＲＡＧＥは、可溶性画分には存在せず、ほとんどが封入体として蓄積されていることが明らかとなった。そこで、封入体からビオチン化ＲＡＧＥを人工シャペロン法によりリフォールディングすることを試みた。

封入体を最終濃度４０ｍＭのＤＴＴを含む６Ｍのグアニジン塩酸塩溶液で室温にて１時間処理し、間違った構造を完全に解きほぐした。続いて、７０倍容量の界面活性剤溶液（０．１％ＣＴＡＢもしくはＳＢ３−１４、最終濃度で２ｍＭのＤＬ−ｃｙｓｔｉｎｅを含むＰＢＳ（−）溶液）を添加し、室温で１時間反応させた後、反応液２４ｍ１を取り出し
、３％ＣＡ溶液６ｍ１を加えさらに１時間室温で反応させた。

この溶液を２０，０００ｇで１０分間遠心し、得られた上清（可溶性画分）をリフォールディング溶液とした。ビオチン化ＲＡＧＥの存在を確認したところ、８０％以上が可溶性面分に回収されていることが確認され、効率的にリフォールディングされていることが示された。

次に、Ｎ末端に存在するＨｉｓタグを利用しＮｉアガロースカラムに結合させ、イミダゾールにより溶出したフラクションを１２％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけた後、クマシーブリリアントブルーにより染色した。その結果を図２に示す。Ｍ：分子量マーカー、Ｅ１，２，３はフラクション番号である。青く染まっているのがタンパク質である。矢印で示したｓＲＡＧＥの分子量の位置にのみタンパク質のシグナルが得られ、リフォールディング溶液から一回のカラム操作で簡便に純度の高いｓＲＡＧＥが得られることがわかる。１Ｌ当たりの培養から２０〜３０ｍｇのｓＲＡＧＥが得られ、リフォールディングによらない場合の１０倍の収率であった。この結果は、リフォールディングされた分子自体の純度も高かったが、Ｎ末端に存在するＨｉｓタグを利用しＮｉアガロースカラムに結合させた後イミダゾールによる溶出することで、さらに高純度のＡＧＥを認識する分子が大量に得られたことを示す。

（実施例３：リフォールディングしたＲＡＧＥの安定性）
リフォールディングされたポリペプチドを４℃にて一週間保存した後にＣＤスペクトルを測定し、その安定性について評価した。

ＣＤスペクトルは日本分光 Ｊ−８２０を用いて測定した。光路長１ｍｍの石英セルを用いリン酸緩衝液に透析した後に、４℃にて１週間保存したリフォールディングしたｓＲＡＧＥ（リフォールディングしたヒト可溶性ＲＡＧＥ）１０μＭを２５℃、波長範囲：２００〜２５０ｎｍ、スキャン速度：１０ｎｍ／ｍｉｎ、積算回数５回の条件で測定した。緩衝液のみのＣＤスペクトルとの差スペクトルをリフォールディングしたｓＲＡＧＥのＣＤスペクトルとし、分子楕円率［θ］（ｄｅｇ・ｃｍ^２／ｄｍｏｌ）に換算した。結果を図３に示す。

リフォールディングにより得られた受容体分子にしばしば観察される保存中の再凝集によるタンパク量の減少が少なく、２１６〜２１８ｎｍにβシート構造に特有な負の極大を示す精製時と同様のＣＤスペクトルが得られた。このことは、ＲＡＧＥの認識能に必須なＲＡＧＥの細胞外領域に存在する３ヶの免疫グロブリン領域が、正しい高次構造を、保存の後であっても、安定して形成していることを示している。

（実施例４：組換えＲＡＧＥのＡＧＥ結合能）
実施例２に従って調製した組換えＲＡＧＥのＡＧＥ結合能を確認した。

（１：ＡＧＥの調製）
ＡＧＥとしては、糖化ＢＳＡを用いた。糖化ＢＳＡは、以下の手順によって調製した。

糖化ＢＳＡとしては、実施例中ではフルクトースにより糖化したＢＳＡを使用（グルコース、リボースなどによる糖化処理をした糖化ＢＳＡも類似の手法で準備）した。

エタノール殺菌した薬匙を使用し、ガンマー線滅菌済みの５０ｍｌ コニカルチューブ中へ４．５１ｇのフルクトース（Ｓｉｇｍａ社製， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ， ＵＳＡ）を計量した。２０ ｍｌの滅菌１Ｍ リン酸緩衝液（ｐＨ ７．４）を加え、キャップをした後、ボルテックスによりフルクトースを完全に溶解させた。次に８．３ｍｌの３０％ＢＳＡ溶液（ＢＳＡはＳｉｇｍａ社製， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ， ＵＳＡ）を添加し、転倒混和により穏やかに溶液を混合した。最後に２１ｍｌの滅菌蒸留水を添加し、最終濃度５０ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ， ５００ｍＭ フルクトース ／ ４００ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）の溶液とした。この溶液（Ｆｒｕｃ ５００ ＢＳＡ）を０．２２μｍのフィルターにより無菌ろ過した後、遮光条件下において３７℃で６もしくは１２週間反応させた（実験に使用したのは１２週間反応させたもの）。毎週、少量の反応液を無菌的に採取し、ｐＨを確認した。ｐＨに変化が認められる場合は、滅菌水で調製した１０Ｎ ＮａＯＨを添加し、ｐＨを常に７．４に保つようにした。糖化反応の進行の検証と糖化ＢＳＡの特性解析用の試料として１週間目、６週間目に５ｍｌの反応産物を無菌的に採取し、−８０℃にて凍結保存した。１２週目に糖化反応を終了させるために、未反応のフルクトースを透析により除去した。透析は、オートクレーブ滅菌したＰＢＳ（１ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４， １０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４， １３７ ｍＭ ＮａＣｌ， ２．７ｍＭ ＫＣＬ， ｐＨ ７．４）に対して４℃で行なった。透析後の試料は可能な限り無菌的に扱い、０．２２μｍのフィルターにより無菌ろ過した後、冷蔵保存した。１週目、６週目の糖化ＢＳＡも溶解後同様の透析処理により未反応のフルクトースを除去し、０．２２μｍのフィルターにより無菌ろ過した後、冷蔵保存し、１，６，１２週目の各試料に関して、糖化反応の進行とＡＧＥとしての特性を評価し、１２週目のものを糖化ＢＳＡ（ＡＧＥ−ＢＳＡ）として使用した。

コントロール用の糖化処理を受けていないＢＳＡとして、フルクトースを添加しない条件下で全く同様の処理をしたＢＳＡを使用した。

糖化ＢＳＡは、励起波長が３３５ｎｍであり、放出波長が４２０ｎｍである蛍光特性を有する。

（２：ＡＧＥ結合能の測定）
１．５ｍｌの遠心用チューブに粗精製ｓＲＡＧＥ溶液（Ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ：１０ｍＭ イミダゾール、１００ｍＭ ＮａＨ_２ＰＯ_４， １５０ｍＭ ＮａＣｌ；タンパク濃度は、２．５〜５ｍｇ／ｍｌ）３００μｌを分注した。次に２０μｌのストレプトアビジン−ムテインマトリックス５０％スラリーを添加し、室温で回転混和により１０分間反応させた。スイングローターにより５００ｇ×５ 分間の遠心処理を行い、上清を除去し、ｓＲＡＧＥが固定化されたストレプトアビジン−ムテインマトリックス（ＳＡ−Ｍｕｔｅｉｎ）を沈澱画分として回収した。３００μｌのＬｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒを添加し、転倒混和、遠心処理によるｓＲＡＧＥ固定化ＳＡ−Ｍｕｔｅｉｎの回収を２回繰り返すことにより、非特異的にＳＡ−Ｍｕｔｅｉｎに吸着しているタンパク質などを除去した。続いて、３００μｌのＡＧＥ−ＢＳＡ（１２週間糖化処理を行なったＡＧＥ−ＢＳＡ、４ｍｇ／ｍｌ）を添加し、室温で回転混和により１時間反応させた。上述の遠心処理によりＡＧＥ−ＢＳＡ−ｓＲＡＧＥ−ＳＡ−Ｍｕｔｅｉｎ複合体が回収された。この複合体を０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０を含むＰＢＳ（１ｍＭ ＫＨ_２ＰＯ_４， １０ｍＭ Ｎａ_２ＨＰＯ_４， １３７ ｍＭ ＮａＣｌ， ２．７ｍＭ ＫＣＬ， ｐＨ ７．４）を３００μｌ添加し、転倒混和、遠心処理を２回繰り返す洗浄の作業を行ない、非特異的に吸着していた分子を除去した。最終的に回収されたＡＧＥ−ＢＡＳ−ｓＲＡＧＥ− ＳＡ−Ｍｕｔｅｉｎ複合体を２００μｌのＰＢＳに懸濁した後、９６ウェルの無蛍光のマイクロタイタープレートに添加し、３３５ｎｍで励起し、４２０ｎｍの吸収波長で蛍光強度を測定した。コントロールとしてＦｒｕｃ−５００−ＢＳＡの代わりにフルクトース非存在下で糖化処理区と同条件で３７℃に放置したＢＳＡを使用した。独立した３回の測定を行なった結果を以下の表に記す。

従来、ＲＡＧＥのＮグリカンを除去した場合に、リガンドに対する結合能が顕著に減少したことを考慮すると、糖鎖修飾されない細菌細胞宿主を用いて発現した上記ＲＡＧＥの結合能は、予想外に高いものであると評価できる。

（実施例５：ドットブロット分析）
（実験条件）０．２２μｍのポアサイズのニトロセルロース膜上に１μｌのリガンド溶液（２０ｎｇ〜８μｇの濃度勾配）を直接スポットすることにより吸着させる。リガンド溶液としては１２週間反応のＡＧＥ−ＢＳＡ、フルクトース非存在下で調製したＢＳＡ（コントロール）を用いる。スポットを完全に乾燥させた後、タンパク質の結合していない部分をブロックするため、ブロッキング緩衝液：５％ スキムミルクを含むＴＢＳ−Ｔ（０．１％ Ｔｗｅｅｎ ２０， ２０ ｍＭ Ｔｒｉｓ， １５０ｍＭ ＮａＣｌ， ｐＨ ８．０）中で、室温で１時間反応させた。続いて１０μｇ／ｍｌもしくは１μｇ／ｍｌの濃度のｓＲＡＧＥ、コントロールとして１０μｇ／ｍｌ（いずれも最終濃度）ＢＳＡを含むＴＢＳ−Ｔ中で室温にて１時間反応させた。反応後のニトロセルロース膜をＴＢＳ−Ｔ中にて１５分間振とうする洗浄の過程、さらに同様の洗浄を１．５分で３回繰り返し、非特異的な結合を除去する。続いて室温にて１時間、一次抗体との反応を行なう。抗体は、抗ＲＡＧＥ抗体ウサギＩｇＧ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕａ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ， ＣＡ， ＵＳＡ ）をＴＢＳ−Ｔにて１：１０００に希釈して使用する。反応後の膜をＴＢＳ−Ｔにて上記同様に洗浄した。次に二次抗体との反応を行なう。抗体は、西洋ワサビペルオキシダーゼで標識した抗ウサギＩｇＧ抗体（Ｂｉｏ Ｒａｄ， Ｈｅｒｃｕｌｅｓ， ＣＡ， ＵＳＡ）をＴＢＳ−Ｔにて１：１０００に希釈して使用した。室温で１時間振とう反応させた後、上述の洗浄の過程を経て、最後の検出の段階に進む。検出はＥＣＬ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ， Ｕｐｐｓａｌａ， Ｓｗｅｄｅｎ ）キットにより、Ｘ線フィルムへの露光により、各ドットに由来する発光を可視化する。

結果を図４に示す。コントロールは、ｓＲＡＧＥを添加しなかった対照実験である。図４のブロッティングの結果で確認できる黒い点が、ｓＲＡＧＥが膜上のリガンドを認識し、結合したことを意味する。リガンドの濃度が同一の場合、ドットの濃さと反応の強さは比例関係にある。また、ｓＲＡＧＥは、アンフォテリン（ＲＳＤ、ＭＮ、ＵＳＡ）にも結合することが確認された。

ｓＲＡＧＥがＡＧＥ−ＢＳＡのみと反応し、コントロールのＢＳＡとは反応していないことから、大腸菌を宿主として調製したｓＲＡＧＥが、天然型ＲＡＧＥ同様の特異的なＡＧＥ認識能を有していることが分かる。

またその結合能であるが、ＡＧＥ−ＢＳＡの濃度勾配から１０μｇ／ｍｌのｓＲＡＧＥ溶液を使用した場合、０．０２μｇ／ドットで十分検出可能、０．００４μｇ／ドットが検出限界に近いと推定される。１ドットが１μｌであることから、検出限界は４μｇ／ｍｌ（約６００ｎＭ）と計算される。細胞上に発現している糖鎖付加のなされた天然型ＲＡＧＥによるＡＧＥの認識によって引き起こされる細胞の種々の機能変化を引き起こすＡＧＥの濃度として、５０μｇ／ｍｌが使用されている（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．， ２７４， ３１７４０−３１７４９， １９９９）。実験系と評価基準の違いから厳密な比較とはいえないが、大腸菌で発現させたｓＲＡＧＥが予想に反して、天然型ＲＡＧＥに匹敵するＡＧＥ認識能を有していることを示唆している。

（実施例６：受容体チップの作製）
ＡＧＥなどを検出するセンサーとして使用する目的で、表面プラズモン共鳴により検出が可能な機器のセンサー部位へビオチン化ＲＡＧＥを固定化し、実際のリガンドの結合を検討する。表面プラズモン共鳴装置としては、ＢＩＡＣＯＲＥ杜製のＢＩＡＣＯＲＥ、並びに株式会社日立ハイテクノロジーズ製のＩＡｓｙｓを使用する。

（１）再構成ビオチン化細胞外領域をＢＩＡＣＯＲＥのストレプトアビジンセンサーチップ上に、リガンド認識に関わる部分が外側を向くように固定化する。これをＢＩＡＣＯＲＥ本体に挿入後、ＡＧＥ（例えば、糖化ＢＳＡ）との結合を測定する。表面プラズモン共鳴の原理を利用した機器の場合、リガンドの結合をレゾナンスユニット：ＲＵの増加として検出することになる。

（２）再構成ビオチン化受容体をＩＡｓｙｓのビオチンキュベット上に、ストレプトアビジンを介してリガンド認識に関わる部分が外側を向くように固定化する。これをＩＡｓｙｓ本体に挿入後、ＡＧＥ（例えば、糖化ＢＳＡ）との結合を測定する。

（実施例７：ＢＩＡＣＯＲＥを用いた受容体チップの性能評価）
リフォールディングにより得られたｓＲＡＧＥをＢＩＡＣＯＲＥのセンサーチップＳＡ上に固定化した。実施例４に従って調製された、異なった濃度のフルクトースにより糖化処理を行なったＡＧＥ−ＢＳＡをインジェクションした。その結合と解離を測定したセンサーグラムを図５に示す。０秒でＡＧＥ−ＢＳＡを添加し、１８０秒後に緩衝液による洗浄を開始した。流速を２０μｌ／分とした。ｓＲＡＧＥを固定化していないフローセルをリファレンスセルとし、リファレンスセルの値との差を応答（ＲＵ）として示した。図５中、応答（ＲＵ）値の大きい順に、１２８μｇ／ｍｌ、６４μｇ／ｍｌ、３２μｇ／ｍｌ、１６μｇ／ｍｌ、８μｇ／ｍｌ、４μｇ／ｍｌの糖化処理ＡＧＥ−ＢＳＡを用いたセンサーグラムの結果が示されている。

反応速度論的解析は、ＢＩＡＣＯＲＥの解析ソフトＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ３．０によった。解析は、センサーグラムを非線形最小二乗法により直接、カーブフィッティングさせ、解析する非線形解析によった。さらに非線形解析の内、結合相と解離相のグラフに対して同時にカーブフィッティングする同時解析（Ｓｉｍｕｌｔｅｎｅｏｕｓ ｆｉｔｔｉｎｇ）により、結合速度定数と解離速度定数を算出した。さらに、フィッティングに際して、ＲＡＧＥとＡＧＥ−ＢＳＡの結合反応様式のモデルとして、１対１の反応を前提とした１：１ラングミュア結合（ｌａｎｇｕｍｕｉｒ ｂｉｎｄｉｎｇ）を採用した。

その結果得られた、結合定数Ｋｄ（Ｍ）は、１０^−７〜１０^−８であり、また、細胞アッセイにより算出した天然ＲＡＧＥの^１２５Ｉ標識ＡＧＥに対するＫｄは、１００ｎＭ以上と報告されている（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．， ２６７， １４９８７−１４９９７，１４９９８−１５００４， １９９２）。この報告と比較しても大腸菌を宿主として調製された本発明のｓＲＡＧＥは、天然のＲＡＧＥと同程度の十分な結合能を有していることが示されている。

また、使用したモデルの正しさやフィッティングの良好さの指標となり得るＣｈｉ^２は、２以下であった。Ｃｈｉ^２は、２０以下で良好とされることから、フィッティングは良好であると判断された。

（実施例８：水晶発振子マイクロバランスへの応用）
ＲＡＧＥポリペプチドまたはそのホモログを、ＡＧＥなどを検出するセンサーとして使用する目的で、水晶発振子マイクロバランスにより検出が可能な機器のセンサー部位へ各ビオチン化タンパク質を固定化し、実際のリガンドの結合を測定する。装置としては、Ｉｎｔｉｕｍ社製のＡｆｆｉｎｉｘＱを使用する。

再構成ビオチン化受容体を水晶発振子上に、ストレプトアビジンを介してリガンド認識に関わる部分が外側を向くように固定化する。これを装置に挿入後、ＡＧＥ（例えば、糖化ＢＳＡ）との結合を測定する。水晶発振の原理を利用した機器の場合、リガンドが結合すると、重量負荷が増加するため、振動数（Ｈｚ）の減少として検出される。

本発明のポリペプチド、ポリペプチドを含むチップを用いることによって、糖尿病血管障害についての高感度な診断方法、および、予防効果評価手法が提供される。

図１は、ビオチン化ＲＡＧＥの発現に使用したベクター（ｐＥＴ１６−ａｖｉＴａｇ）のクローニング部位を示す図である。 図２は、リフォールディングし、Ｎｉアガロースカラムで精製したｓＲＡＧＥの電気泳動の結果を示す写真である。 図３は、リフォールディングしたｓＲＡＧＥの保存後のＣＤの結果である。 図４は、リフォールディングしたｓＲＡＧＥを用いたドットブロットの結果である。 図５は、リフォールディングしたＲＡＧＥをセンサーチップに固定化して製造した受容体チップを用いた結合実験の結果である。応答（ＲＵ）値の大きい順に、１２８μｇ／ｍｌ、６４μｇ／ｍｌ、３２μｇ／ｍｌ、１６μｇ／ｍｌ、８μｇ／ｍｌ、４μｇ／ｍｌの糖化処理ＡＧＥ−ＢＳＡを用いたセンサーグラムの結果が示されている。

配列番号１ ＲＡＧＥタンパク質の細胞外領域の核酸配列
配列番号２ ＲＡＧＥタンパク質の細胞外領域のアミノ酸配列
配列番号３ ビオチン化モチーフのアミノ酸配列
配列番号４ ビオチン化モチーフのアミノ酸配列
配列番号５ ビオチン化モチーフのアミノ酸配列
配列番号６ ビオチン化モチーフのアミノ酸配列
配列番号７ ビオチンリガーゼのアミノ酸配列
配列番号８ ＦａｃｔｏｒＸａの認識配列
配列番号９ エンテロキナーゼの認識配列
配列番号１０ トロンビンの認識配列
配列番号１１ ｐＥＴ１６−ａｖｉＴａｇのクローニング部位

Claims (8)

1. レセプター由来の配列およびビオチン化配列を含むビオチン化ポリペプチドの製造方法であって、ここで、該ポリペプチドは、ＡＧＥと結合し、ここで、該レセプター由来の配列は、以下：
   （ａ）配列番号２に記載されるアミノ酸配列；
   （ｂ）配列番号２に記載されるアミノ酸配列を有するタンパク質のフラグメントの配列であって、ここで、該フラグメントの長さが２００アミノ酸残基以上である、配列；
   （ｃ）配列番号２に記載されるアミノ酸配列に対して、１または数個の、置換、付加、もしくは、欠失、または、これらの組合せを有するアミノ酸配列を有するポリペプチドのアミノ酸配列；
   （ｄ）配列番号２に記載されるアミノ酸配列に対して、１または数個の保存的置換、および、１または数個の、置換、付加、もしくは、欠失、または、これらの組合せを有し、かつ、配列番号２に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドのアミノ酸配列であって、ここで、該保存的置換は、以下：
   アルギニンおよびリジン；
   グルタミン酸およびアスパラギン酸；
   セリンおよびスレオニン；
   グルタミンおよびアスパラギン；ならびに、
   バリン、ロイシン、およびイソロイシン；
   の各グループ内での置換である、アミノ酸配列；ならびに、
   （ｅ）配列番号２に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドのアミノ酸配列；
   からなる群から選択され、
   ここで、ビオチン化配列は、配列番号７に記載されるアミノ酸配列によってビオチン化され、以下：
   （ｆ）配列番号３に記載されるアミノ酸配列、または、配列番号４に記載されるアミノ酸配列；
   （ｇ）配列番号３に記載されるアミノ酸配列に対して、リジン残基以外において、１または数個の、置換、付加、もしくは、欠失、または、これらの組合せを有するアミノ酸配列を有するポリペプチドのアミノ酸配列；ならびに、
   （ｈ）配列番号４に記載されるアミノ酸配列に対して、リジン残基以外において、１または数個の、置換、付加、もしくは、欠失、または、これらの組合せを有するアミノ酸配列を有するポリペプチドのアミノ酸配列；
   からなる群から選択され、
   該方法は、以下の工程：
   （１）該ビオチン化ポリペプチドを、細菌宿主内で封入体として組換え発現する工程；
   および
   （２）該封入体を、環状糖質サイクロアミロースとポリオキシエチレン系界面活性剤を含有する溶液中でリフォールディングして、可溶性ビオチン化ポリペプチドを調製する工程；
   を包含する、方法。
2. 前記環状糖質サイクロアミロースの重合度が、１７〜５０または４０〜１５０である、請求項１記載の方法。
3. 前記環状糖質サイクロアミロースの重合度が、４０〜１５０である、請求項２記載の方法。
4. 前記ポリオキシエチレン系界面活性剤が、ポリオキシエチレンソルビタンエステル、ポリオキシエチレンドデシルエーテル、ポリオキシエチレンヘプタメチルヘキシルエーテル、ポリオキシエチレンイソオクチルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル、ポリオキシエチレン脂肪酸エステルまたはスクロース脂肪酸エステルである、請求項１に記載の方法。
5. レセプター由来の配列およびビオチン化配列を含むビオチン化ポリペプチドの製造方法であって、ここで、該ポリペプチドは、ＡＧＥと結合し、ここで、該レセプター由来の配列は、以下：
   （ａ）配列番号２に記載されるアミノ酸配列；
   （ｂ）配列番号２に記載されるアミノ酸配列を有するタンパク質のフラグメントの配列であって、ここで、該フラグメントの長さが２００アミノ酸残基以上である、配列；
   （ｃ）配列番号２に記載されるアミノ酸配列に対して、１または数個の、置換、付加、もしくは、欠失、または、これらの組合せを有するアミノ酸配列を有するポリペプチドのアミノ酸配列；
   （ｄ）配列番号２に記載されるアミノ酸配列に対して、１または数個の保存的置換、および、１または数個の、置換、付加、もしくは、欠失、または、これらの組合せを有し、かつ、配列番号２に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドのアミノ酸配列であって、ここで、該保存的置換は、以下：
   アルギニンおよびリジン；
   グルタミン酸およびアスパラギン酸；
   セリンおよびスレオニン；
   グルタミンおよびアスパラギン；ならびに、
   バリン、ロイシン、およびイソロイシン；
   の各グループ内での置換である、アミノ酸配列；ならびに、
   （ｅ）配列番号２に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドのアミノ酸配列；
   からなる群から選択され、
   ここで、ビオチン化配列は、配列番号７に記載されるアミノ酸配列によってビオチン化され、以下：
   （ｆ）配列番号３に記載されるアミノ酸配列、または、配列番号４に記載されるアミノ酸配列；
   （ｇ）配列番号３に記載されるアミノ酸配列に対して、リジン残基以外において、１または数個の、置換、付加、もしくは、欠失、または、これらの組合せを有するアミノ酸配列を有するポリペプチドのアミノ酸配列；ならびに、
   （ｈ）配列番号４に記載されるアミノ酸配列に対して、リジン残基以外において、１または数個の、置換、付加、もしくは、欠失、または、これらの組合せを有するアミノ酸配列を有するポリペプチドのアミノ酸配列；
   からなる群から選択され、
   該方法は、以下の工程：
   （１）該ビオチン化ポリペプチドを、細菌宿主内で封入体として組換え発現する工程；および
   （２）該封入体を、環状糖質サイクロアミロースとイオン性界面活性剤を含有する溶液中でリフォールディングして、可溶性ビオチン化ポリペプチドを調製する工程；
   を包含する、方法。
6. 前記環状糖質サイクロアミロースの重合度が、１７〜５０または４０〜１５０である、請求項５記載の方法。
7. 前記環状糖質サイクロアミロースの重合度が、４０〜１５０である、請求項６記載の方法。
8. 前記イオン性界面活性剤が、セチルトリメチルアンモニウムブロミド、ドデシル硫酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム、３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホン酸、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロマイドまたはミリスチルサルホオベタインである、請求項５に記載の方法。