JP4830545B2 - 細胞電気生理センサの製造方法 - Google Patents

Description

本発明は、細胞の電気生理的活動の測定に用いられる細胞電気生理センサの製造方法に関するものである。

従来、電気生理学におけるパッチクランプ法は、細胞膜に存在するイオンチャンネルを測定する方法として知られており、このパッチクランプ法によってイオンチャンネルの様々な機能が解明されてきた。そして、イオンチャンネルの働きは細胞学において重要な関心ごとであり、これは薬剤の開発にも応用されている。

しかし、一方でパッチクランプ法は測定技術に微細なマイクロピペットを１個の細胞に高い精度で挿入するという極めて高い能力を必要としているため、熟練作業者が必要であり、高いスループットで測定を必要とする場合には適切な方法でない。

このため、微細加工技術を利用した平板型プローブの開発がなされており、これらは個々の細胞についてマイクロピペットの挿入を必要としない自動化システムに適している。例えば、基板の上に設けられた細胞保持手段を備えたウエルと、このウエルの電気信号を検出する測定用電極と、基準電極とを備えた細胞外電位測定用デバイスによって細胞外電位を測定する技術を開示している（例えば特許文献１参照）。

図１３はこの従来の細胞電気生理センサのウエル構造を模式断面図で示したものであり、ウエル２６の内部に培養液２７が入れられ、被験体細胞２５は基板２１に設けられた細胞保持手段によって捕捉または保持されている。細胞保持手段は基板２１に形成された窪み２２および開口部を介してこの窪み２２に連絡する貫通孔２３を備えた構成となっている。

さらに貫通孔２３の内部にはセンサ手段である測定電極２４が配置されており、この電極２４は配線を経て信号検出部に連結されている。

そして、測定の際には被験体細胞２５を貫通孔２３から吸引ポンプなどの手段により、この被験体細胞２５が窪み２２に密着保持される。このようにして被験体細胞２５の活動により発生する電気信号はウエル２６の内部の培養液２７に漏れることなく、貫通孔２３に設けた測定電極２４と参照電極２８によって電位の変化あるいは電流の変化を検出することによって測定することができる。

このように、基板２１に形成された貫通孔２３はガラスピペットにおける先端穴と同様の役割を果たし、高精度な細胞の電気生理現象を記録できるとともに、基板２１の裏面側からの吸引によって細胞が自動的に引きつけられ、被験体細胞２５を容易に保持できるという利点を有している。

ここで測定される電位の変化あるいは電流の変化は、細胞膜が保有するチャネルを通じて各種イオンを放出あるいは吸収した結果、検出されるものであり、非常に微小な変化である。そのため、本来検出されるべき電気信号以外の要因によりノイズが発生した際には、Ｓ／Ｎを劣化させ、正確に且つ高精度に測定することが困難となる。このため、ノイズを抑制するために様々な取組みがなされており、例えばウエル２６の壁面の形状をテーパー状とすることで、被験体細胞の周辺における揺らぎを低減し、ノイズを抑制する技術を開示している（例えば特許文献２参照）。
国際公開第０２／０５５６５３号パンフレット 特開２００５−１５６２３４号公報

しかしながら、前記従来の技術においては、ウエル２６の壁面の形状をテーパー状とするために、等方性のドライエッチング技術を用いている。また、ウエル２６の壁面を容易にテーパー状にするためには、例えば基板に（１００）面配向の単結晶シリコン基板を用い、緩衝液を加えたフッ化水素酸による異方性エッチング技術により実現することも可能である。しかしながら、上記のエッチング技術によりウエル２６の壁面をテーパー状とする際には、細胞電気生理センサの外形切り出しをダイシングにより行う必要があり、センサ形状の自由度が低くなるとともに、生産性においてもチッピングが発生しやすいという課題を有していた。

本発明は、生産性に優れ、チッピングなどの発生の少ない細胞電気生理センサの製造方法を提供することを目的とする。

前記従来の課題を解決するために、本発明は、ウエルの壁面をダイアフラム側へテーパー状とした細胞電気生理センサの製造方法であって、基板の裏面側からレジストマスクを形成する第一の工程と、その後に第一のエッチングガスと第二のエッチングガスを導入して所望の形状の貫通孔を形成する第二の工程と、前記基板の表面側からウエルの壁面がテーパー状となるようにレジストマスクを形成する第三の工程と、その後、第一のエッチングガスと第二のエッチングガスを導入してウエルを形成する第四の工程を含み、且つこの４つの工程のいずれかで外形切り出しを同時に行う構成とするものである。

本発明の細胞電気生理センサの製造方法は、ウエルの壁面がテーパー状であるセンサでありながら、センサ形状の自由度が高く、生産性においてもチッピングが発生しない細胞電気生理センサの製造方法として有用である。

（実施の形態１）
以下、本発明の実施の形態１における細胞電気生理センサの製造方法について、図面を参照しながら説明する。

まず、本発明の実施の形態１における細胞電気生理センサの構成について説明する。

図１は本発明の実施の形態１における細胞電気生理センサの構成を示す斜視図であり、図２はその断面図である。また、図３はその動作を説明するための要部拡大断面図である。

図１および図２において、基板１はシリコン基板で形成しており、基板表面１ａ側にはウエル２が形成されており、このウエル２は細胞を含んだ培養液あるいは薬液などの液体を貯留するためのものである。そして、基板裏面１ｂ側にはダイアフラム３を形成し、前記ウエル２の壁面はダイアフラム３側へ徐々に小さくなるテーパー状に形成している。そして、このダイアフラム３の厚みは約２０μｍの薄板形状としている。また、このダイアフラム３にはウエル２と基板裏面１ｂ側を連結する微小の貫通孔４を例えば複数個形成している。この微小の貫通孔４の最小開口径は３μｍとしており、貫通孔４の最小開口径は測定する被験体細胞５の大きさ、形状、性質によって決定することができる。例えば、被験体細胞５の大きさが５〜５０μｍ程度の場合、被験体細胞５が高い密着性をもって保持されるには貫通孔４の最小開口径を３μｍ以下とすることが望ましい。

また、本実施の形態１における細胞電気生理センサの外周部は円形状としており、細胞電気生理センサ全体の形状は円柱形状である。このように円形状とすることで、細胞電気生理センサの大きさを極力小さくすることができることから、ウエハー状の１枚の基板１からより多くの細胞電気生理センサを形成することが可能となり、基板材料を効率的に利用できるという効果が得られる。さらに、このような形状を有する細胞電気生理センサにはエッジ部を有さないことから、チッピング、欠けなどの破損を低減するといった効果も得られる。

なお、細胞電気生理センサの表面の外周部は、円形状に限らず楕円などの曲線を有する形状とすることで、センサ形状の自由度を高めることが可能となる。

次に、本発明の細胞電位測定デバイスの動作について説明する。

図３はダイアフラム３において微小の貫通孔４が形成された箇所の拡大断面図である。図３に示すように、ウエル２の内部に被験体細胞５を含んだ細胞外液６ａを満たした後に、ダイアフラム３のウエル２側から加圧するか、基板裏面１ｂ側から減圧することによって被験体細胞５と細胞外液６ａは、貫通孔４に引き込まれ、被験体細胞５は貫通孔４を塞ぐように保持される。このとき、基板裏面１ｂは細胞内液６ｂによって満たしておく。

通常、細胞内液６ｂは、哺乳類筋細胞の場合、代表的にはＫ⁺イオンが１５５ｍＭ程度、Ｎａ⁺イオンが１２ｍＭ程度、Ｃｌ^-イオンが４．２ｍＭ程度添加された電解液であり、細胞外液６ａは、Ｋ⁺イオンが４ｍＭ程度、Ｎａ⁺イオンが１４５ｍＭ程度、Ｃｌ^-イオンが１２３ｍＭ程度添加された電解液である。

次に、基板裏面１ｂ側から吸引、もしくは薬剤（例えばナイスタチン）を投入して被験体細胞５に微細小孔を形成する。

その後、被験体細胞５への刺激となりうる行為をウエル２内に施す。この刺激の種類としては、例えば化学薬品、毒物などの化学的な刺激に加え、機械的変位、光、熱、電気、電磁波などの物理的な刺激なども含む。

そして、被験体細胞５がこれらの刺激に対して活発に反応する場合、例えば被験体細胞５は細胞膜が保有するチャネルを通じて各種イオンを放出あるいは吸収する。この結果として、細胞内外の電位勾配が変化し、その変化を検出することができる。この電位勾配の変化を細胞外液６ａに設けた電極７と細胞内液６ｂに設けた電極８によって測定する。

次に、ウエル２の壁面がダイアフラム３側へ小さくなるテーパー状に形成されていることについて述べる。

上述のように、本発明の細胞電気生理センサで検出される電気信号は、極めて微小な変化であるため、本来検出されるべき電気信号以外の要因によってノイズが発生した際にはＳ／Ｎを劣化させ、正確に且つ高精度に測定することが困難となる。例えば、ウエル２の内部に化学薬品や毒物などの刺激を注入した際には、被験体細胞５の周辺の細胞外液６ａに揺らぎが発生する。この揺らぎの変化が大きい場合にはノイズが発生する。しかしながら、前記ウエル２の壁面をテーパー状にすることで揺らぎを低減することが可能となり、微小な電気信号の変化を高精度に測定することができる。

また、ウエル２の内部の細胞外液６ａに気泡が発生した際にも、ノイズ発生の原因となり、特に被験体細胞５の周辺の細胞外液６ａと電極７の周辺の細胞外液６ａとの間が気泡により絶縁された際には、電気信号の検出が不可能となる。

また、ウエル２の内部に鋭角部が存在すると気泡がトラップされやすくなるが、ウエル２の壁面がテーパー状であることにより気泡がトラップされやすい部位がなくなり、気泡の発生を抑制するといった効果も得られる。

さらに、ダイアフラム３は、厚みが２０μｍ程度であることから、僅かな衝撃であっても容易に破壊される。しかしながら、ウエル２の壁面がテーパー状であることにより、ダイアフラム３の面積が減少し、衝撃による破壊を低減するといった効果も得られる。

このように、ウエル２の壁面がダイアフラム３側へ小さくなるテーパー状に形成されることによって、様々な効果が得られる。

次に、本発明の実施の形態１における細胞電気生理センサの製造方法について説明する。

図４〜図９は本発明の細胞電気生理センサの製造工程を説明するための断面図である。

この細胞電気生理センサの製造方法は、図４に示すように基板１としてシリコンウエハーを用意し、基板裏面１ｂに所定のパターンでレジストマスク１１を形成する。このとき、レジストマスク１１のエッチングホールの形状は、必要とする貫通孔４の形状とほぼ同じになるように設計すると同時に、細胞電気生理センサの外形切り出し（エッチング）の際に所望の形状となるように設計する。

次に、図５に示すように、基板裏面１ｂからドライエッチングによって貫通孔４を所定のエッチング深さに達するまで形成する。このときのエッチング法は、ドライエッチングによる方法が最適であり、ドライエッチングの際にはエッチングを促進するガスと、エッチングを抑制するガスを用いる。このエッチングを促進するガスとしては、ＸｅＦ₂、ＣＦ₄、ＳＦ₆などがある。また、エッチングを抑制するガスとしてはＣＨＦ₃、Ｃ₄Ｆ₈などがある。これらのガスを混合してエッチングすることにより、エッチングされた壁面にＣＦ₂のポリマーである保護膜を作製していくことができることから、ドライエッチングによる貫通孔４の形成をレジストマスク１１の下方のみに進行させることが可能となる。

ここで、ドライエッチングが下方のみに進行する仕組みを、さらに詳しく説明する。

まず、エッチングを促進するガスによってエッチングを少しだけ行った後、エッチングを抑制するガスによって保護膜を少しだけ形成する工程を繰り返すことによって、ほぼ垂直なエッチング形状とすることができるのである。この工程では、エッチングを促進するガスによるドライエッチングの際に外部コイルによる誘導結合法によって生成されたプラズマ中で高周波を基板１に加えることで基板１にマイナスのバイアス電圧が発生することにより、プラズマ中のプラスイオンであるＳＦ₅ ⁺やＣＦ₃ ⁺が基板１に向かって衝突するのでドライエッチングは垂直下方方向に進むことになり、ドライエッチングを抑制させる際には基板１に高周波を加えなければ基板１にはバイアス電圧が全く発生しないので、保護膜の材料となるＣＦ⁺が偏向を受けなくなり、基板１のエッチングホールの壁面に対して均一な保護膜の形成ができることになる。

このようにして貫通孔４を形成した後に、図６に示すように、レジストマスク１１を除去する。

次に、図７に示すように、基板表面１ａに所定のパターンでレジストマスク１２を形成する。このとき、レジストマスク１２は、ウエル２の壁面がダイアフラム３側へ小さくなるテーパー状となるように設計すると同時に、センサの外形切り出し（エッチング）の際に所望の形状となるように設計する。そのため、図７では、ウエル２の壁面がダイアフラム３側へ小さくなるテーパー状となるように加工するために、ウエル２の端部から中央部にむけて小さくなるテーパー形状となるレジストマスク１２を示した。なお、図７ではエッチング後に形成されるウエル２の形状を破線で示した。

そして、このようなテーパー形状となるレジストマスク１２の作製方法としては、ポジ型レジスト材料を基板１の上に厚み１０μｍになるように塗布し、その後ＵＶ光の透過率が連続的に増大（あるいは減少）するようにＣｒ膜にグラデーションを形成したマスクを作製し、そのマスクを所定の位置に配置して露光する。

次に、現像、エッチングをすることによってテーパー形状を有するレジストマスク１２を作製することができる。このような方法によって、例えば厚み；１０μｍ、突起部の長さ；１００μｍのテーパー形状を有するレジストマスク１２を形成することができる。

その後、図８に示すように、基板表面１ａからドライエッチングによってウエル２を所定のエッチング深さに達するまで、即ちダイアフラム３を所定の厚みに達するまで形成する。このときのエッチング法も、エッチングを促進するガスと、エッチングを抑制するガスを用いるドライエッチングによる方法が最適である。

ここで、ウエル２の壁面がダイアフラム３側へ小さくなるテーパー状となるように、テーパー形状を有するレジストマスク１２を用いることのエッチングの作用について説明する。エッチングを促進するガスと、エッチングを抑制するガスを用いたドライエッチングによる方法では、前述のようにレジストマスク１１の下方のみにエッチングを進行させることが可能である。なお、このときレジストマスク１２にもＣＦ₂のポリマーである保護膜が少しだけ形成され、その後にプラスイオンであるＳＦ₅ ⁺やＣＦ₃ ⁺が保護膜およびレジストマスク１２を物理的にエッチングする工程が繰り返される。ここで、保護膜の形成速度が保護膜のエッチング速度と比較して小さい場合には、徐々にレジストマスク１２もエッチングされ、徐々に薄い部分のレジストマスク１２の先端から消滅していく。この現象を利用することで、テーパー形状を有するレジストマスク１２によりウエル２の壁面をダイアフラム３側へ小さくなるテーパー状とすることがエッチング加工によって可能となる。

このような方法によって、例えば深さ；４００μｍ、最大外径；５００μｍ、最小外径；３００μｍのテーパー形状を有する逆台形状のウエル２を形成することができる。

そして、最後に、図９に示すようにレジストマスク１２を除去する。

ここで、細胞電気生理センサの外形をエッチングによって同時に切り出すことができる。この外形の切り出しは基板表面１ａ側から行う、あるいは基板表面１ａおよび基板裏面１ｂ側の両方から行うことも可能であり、寸法形状によって適宜選択することによって、細胞電気生理センサの外形の切り出しをエッチングによって同時に行うことができる。

このような構成とすることによって、ウエハー状の１枚の基板１からウエル２の壁面がテーパー状である細胞電気生理センサを複数、一括して大量に作製することが可能となり、またレジストマスク１２の設計により、センサ形状に容易に自由度をもたせられることから細胞電気生理センサの大きさを極力小さくすることで、１枚の基板１からより多くの細胞電気生理センサを作製することが可能となるとともに、ダイシングを用いることなく細胞電気生理センサの外形をエッチング加工によって形成することが可能となることから、工程の削減およびチッピング不良による歩留まりの低減を抑制する効果も得られる。

なお、ここでは基板１としてシリコンウエハーを用いたが、中間層に酸化シリコン層を有するシリコンウエハー（ＳＯＩウエハー）を用いてよい。ＳＯＩウエハー基板を用いた際には、酸化シリコン層がウエル２を形成するときのエッチングトップ層となることから、より高精度で且つ生産性に優れた細胞電気生理センサを実現することが可能となる。このとき、貫通孔４は他方のシリコン層と酸化シリコン層に形成することになる。

次に、別の製造方法について図面を用いて説明する。

図１０〜図１１は別の細胞電気生理センサの製造方法を説明するための断面図である。

まず、図１０に示すように、レジストマスク１２をウエル２の中央部から同心縞状に、且つレジストマスク１２の開口幅がウエル２の中央部から端部にむけて段階的に狭くなるように形成する。なお、図１０においてエッチング後に形成される形状を破線で示した。例えば、中心部の開口幅を５μｍとし、端部の開口幅を１μｍとし、５０ステップで徐々に開口幅を中心から端部に向かって小さくなるようにレジストマスク１２を加工する。

その後、図１１に示すようにエッチングを促進するガスとエッチングを抑制するガスを用いたドライエッチングを行うとき、レジストマスク１２の開口幅の微小化に伴い、垂直方向へのエッチング速度が低下する傾向を利用して、開口幅の大きな箇所では時間あたりのエッチングレートは大きくなり、開口幅の小さな箇所ではエッチングレートが小さくなることを利用して段階的にエッチングレートを制御することによって、ウエル２の壁面がダイアフラム３側へ小さくなる階段状のテーパー形状を形成することが可能である。

そして、エッチングを促進するガスとエッチングを抑制するガスを用いたドライエッチングにおいて、保護膜の形成速度がシリコンのエッチング速度と比較して小さい場合には、エッチングの進行方向に向かって大きくなる逆テーパー形状を形成することが可能である。この現象を利用することにより、レジストマスク１２を同心縞状に、且つ開口幅がウエル中央部から段階的に狭くなるように形成することで、ウエル２の壁面をダイアフラム３側へ小さくなるテーパー状とすることが可能となる。これは、例えばレジストマスク１２の開口幅を５μｍとしたとき、底面におけるエッチング幅を５．５μｍ程度の逆テーパー形状となるようにドライエッチングすることが好ましい。

なお、これらの方法によりウエル２の壁面をテーパー状としたときには、ウエル２の内壁表面の粗度が高くなる場合があり、この際にはウエル２内に気泡がトラップされやすい部位が存在することになる。このような場合には、図１２に示すように、基板表面１ａからプラズマを用いたエッチングにより、ウエル２の内壁表面を平滑にすることが可能である。このとき、エッチングガスとして例えばアルゴンを用いると、アルゴンプラズマがウエル２の端部および貫通孔４の端部に集中する効果があり、それぞれの端部の形状を丸め形状とするといった効果も得られる。

また、細胞電気生理センサをエッチング水溶液中に入れて所定の時間エッチングを行うことによっても、ウエル２の内壁表面を平滑にすることが可能である。これにより、貫通孔４の内壁表面も同時に平滑化され、被験体細胞５と細胞外液６ａを貫通孔４へ容易に引き込めるといった効果も得られる。

本発明の細胞電気生理センサの製造方法は、ウエルの壁面がテーパー状でありながら、センサ形状に自由度をもたせることを可能とし、チッピングレス、基板材料の効率的利用の効果が得られる製造方法として有用である。

本発明の実施の形態１における細胞電気生理センサの斜視図 同断面図 同動作を説明するための要部拡大断面図 同製造方法を示すための断面図 同断面図 同断面図 同断面図 同断面図 同断面図 別の製造方法を説明するための断面図 同断面図 別の製造方法を説明するための断面図 従来の細胞電位測定デバイスの断面図

符号の説明

１ 基板
１ａ 基板の表面
１ｂ 基板の裏面
２ ウエル
３ ダイアフラム
４ 貫通孔
５ 被験体細胞
６ａ 細胞外液
６ｂ 細胞内液
７ 電極
８ 電極
１１ レジストマスク
１２ レジストマスク

Claims (5)

1. 基板の一面に少なくとも一つ以上のウエルを設け、このウエルの底面には少なくとも一つ以上の貫通孔を有するダイアフラムを設け、前記ウエルの壁面をダイアフラム側へテーパー状とした細胞電気生理センサの製造方法であって、
   基板の片面にレジストマスクを形成する第一の工程と、
   その後エッチングを促進するガスとエッチングを抑制するガスを導入して前記レジストマスクを利用して所望の形状の貫通孔を形成する第二の工程と、
   前記基板の他面にウエルを形成する端部から中央部に向かってテーパー状に薄くしたレジストマスクを形成する第三の工程と、
   エッチングを促進するガスとエッチングを抑制するガスを導入してエッチングによってウエルを形成する第四の工程を含み、且つ前記第二の工程および／または第四の工程で外形のエッチングによる切り出しを同時に行う細胞電気生理センサの製造方法。
2. 前記第四の工程の後に、化学エッチングによって、センサ全体の表面を平滑にする工程を含む請求項１に記載の細胞電気生理センサの製造方法。
3. 基板の一面に少なくとも一つ以上のウエルを設け、このウエルの底面には少なくとも一つ以上の貫通孔を有するダイアフラムを設け、前記ウエルの壁面をダイアフラム側へテーパー状とした細胞電気生理センサの製造方法であって、
   基板の片面にレジストマスクを形成する第一の工程と、
   その後エッチングを促進するガスとエッチングを抑制するガスを導入して前記レジストマスクを利用して所望の形状の貫通孔を形成する第二の工程と、
   前記基板の他面にウエルの中央部から同心縞状に、且つレジストマスクの開口幅がウエルの中央部から端部にかけて段階的に狭くなる縞状に第二のレジストマスクを形成する第三の工程と、
   エッチングを促進するガスとエッチングを抑制するガスを導入して基板の貫通孔が形成された片面側に向かうように第二のレジストマスクが形成された他面側からエッチングすることによってウエルを形成する第四の工程を含み、且つ前記第二の工程および／または第四の工程で外形のエッチングによる切り出しを同時に行う細胞電気生理センサの製造方法。
4. 前記第四の工程の後に、アルゴンガスを用いたプラズマエッチングによって、ウエルの壁面を平滑にする工程を含む請求項３に記載の細胞電気生理センサの製造方法。
5. 前記第四の工程の後に、化学エッチングによって、表面を平滑にする工程を含む請求項３に記載の細胞電気生理センサの製造方法。

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