JP4804031B2 - 間葉系幹細胞の培養方法および生体組織補填体の製造方法 - Google Patents
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Description
この発明は、間葉系幹細胞の培養方法および生体組織補填体の製造方法に関するものである。
骨髄液等に含まれている間葉系幹細胞は、骨、軟骨、脂肪等に分化可能な多分化能を有しているため、細胞治療や再生医療の細胞ソースとして注目を集めている。しかしながら、骨髄液等に含まれている間葉系幹細胞はごく微量であるため、臨床治療に用いる場合には、骨髄液内から集めた間葉系幹細胞を短期間で大量に増殖させることが重要である。
従来、間葉系幹細胞を効率よく増殖させる方法として、例えば、特許文献１および特許文献２に開示されている方法が知られている。
これらの方法は、間葉系幹細胞の増殖能刺激物質として繊維芽細胞増殖因子を培地に添加するものである。
また、間葉系幹細胞を培養する場合に用いられる培地には、牛胎児血清あるいはヒト血清が用いられるのが一般的である。
国際公開第ＷＯ０２／２２７８８Ａ１号公報
国際公開第ＷＯ０１／４８１４７Ａ１号公報
これらの方法は、間葉系幹細胞の増殖能刺激物質として繊維芽細胞増殖因子を培地に添加するものである。
また、間葉系幹細胞を培養する場合に用いられる培地には、牛胎児血清あるいはヒト血清が用いられるのが一般的である。
しかしながら、牛胎児血清がヒトの体に移植される生体組織前駆細胞中に含まれることは好ましくなく、また、患者の採血量の観点から、十分な量のヒト血清を使用することが制限される場合も多い。その一方で、患者から採取した微量の間葉系幹細胞を十分な細胞数まで増殖させるには、培地内における牛胎児血清あるいはヒト血清の使用は必要不可欠である。
本発明は上述した事情に鑑みてなされたものであって、生体に移植される生体組織前駆細胞中に含有される血清量を低減しながら、十分な増殖を図り、かつ、生体組織前駆細胞に効率的に分化させることのできる間葉系幹細胞の培養方法および生体組織補填体の製造方法を提供することを目的としている。
上記目的を達成するために、本発明は、以下の手段を提供する。
本発明は、血清およびデキサメタゾンを含有する培地内で間葉系幹細胞を増殖させる第１の培養ステップと、デキサメタゾンを含有し前記第１の培養ステップにおける培地よりも血清の濃度の低い培地内で間葉系幹細胞を骨芽細胞に分化させる第２の培養ステップとを備える間葉系幹細胞の培養方法を提供する。
本発明は、血清およびデキサメタゾンを含有する培地内で間葉系幹細胞を増殖させる第１の培養ステップと、デキサメタゾンを含有し前記第１の培養ステップにおける培地よりも血清の濃度の低い培地内で間葉系幹細胞を骨芽細胞に分化させる第２の培養ステップとを備える間葉系幹細胞の培養方法を提供する。
本発明によれば、第１の培養ステップにおいて、血清を含む培地内において、血清の作用により間葉系幹細胞が必要細胞数まで増殖させられた後に、第２のステップにおいて、血清の濃度の低い培地内において骨芽細胞への分化が行われる。
発明者は、研究の結果、間葉系幹細胞の骨芽細胞への分化段階においては、むしろ血清が存在しない方が効率的な分化を行うことができることを見いだした。したがって、間葉系幹細胞が必要細胞数まで増殖した後には、培地として血清濃度の低いものを採用することにより、従来行われていたような増殖時と同様の濃度の血清を含む培地を用いて培養するよりも、間葉系幹細胞を効率的に骨芽細胞に分化させることができる。
発明者は、研究の結果、間葉系幹細胞の骨芽細胞への分化段階においては、むしろ血清が存在しない方が効率的な分化を行うことができることを見いだした。したがって、間葉系幹細胞が必要細胞数まで増殖した後には、培地として血清濃度の低いものを採用することにより、従来行われていたような増殖時と同様の濃度の血清を含む培地を用いて培養するよりも、間葉系幹細胞を効率的に骨芽細胞に分化させることができる。
上記発明においては、第２の培養ステップにおける培地内の血清の濃度がほぼゼロであることが好ましい。
このようにすることで、第２の培養ステップにおいて、血清の影響をなくすことができ、骨芽細胞への分化をさらに効率的に行うことができる。
このようにすることで、第２の培養ステップにおいて、血清の影響をなくすことができ、骨芽細胞への分化をさらに効率的に行うことができる。
また、上記発明においては、第２の培養ステップにおける培地内の血清の濃度がゼロより大きいこととしてもよい。
このようにすることで、第２の培養ステップにおいて、血清の影響を残すことができる。その結果、骨芽細胞への分化の効率が濃度ゼロの場合よりも若干低下することとなるが、その分、血清の作用により間葉系幹細胞の増殖を継続させることができる。したがって、継続的に骨芽細胞を供給し続ける用途においては、間葉系幹細胞を増殖させつつ、骨芽細胞への分化を行わせることができるので、効果的である。
このようにすることで、第２の培養ステップにおいて、血清の影響を残すことができる。その結果、骨芽細胞への分化の効率が濃度ゼロの場合よりも若干低下することとなるが、その分、血清の作用により間葉系幹細胞の増殖を継続させることができる。したがって、継続的に骨芽細胞を供給し続ける用途においては、間葉系幹細胞を増殖させつつ、骨芽細胞への分化を行わせることができるので、効果的である。
上記発明においては、前記血清が牛胎児血清であることとしてもよく、また、前記血清がヒト血清であることとしてもよい。
牛胎児血清を使用する場合に、第２の培養ステップにおける培地内の血清濃度をゼロにすることにより、生体に移植される骨芽細胞内に牛胎児血清が含まれることを防止できる。
また、ヒト血清を使用する場合に、第２の培養ステップにおける培地内の血清濃度を少なくすることにより、患者からの血清の採取量を低減し、患者に係る負担を低減できる。
また、上記発明においては、前記第２の培養ステップにおける培地のデキサメタゾンの添加濃度は、前記第１の培養ステップにおけるデキサメタゾンの添加濃度よりも大きくてもよい。
牛胎児血清を使用する場合に、第２の培養ステップにおける培地内の血清濃度をゼロにすることにより、生体に移植される骨芽細胞内に牛胎児血清が含まれることを防止できる。
また、ヒト血清を使用する場合に、第２の培養ステップにおける培地内の血清濃度を少なくすることにより、患者からの血清の採取量を低減し、患者に係る負担を低減できる。
また、上記発明においては、前記第２の培養ステップにおける培地のデキサメタゾンの添加濃度は、前記第１の培養ステップにおけるデキサメタゾンの添加濃度よりも大きくてもよい。
また、本発明は、上記いずれかの間葉系幹細胞の培養方法の第２の培養ステップにおいて、間葉系幹細胞を生体適合性の材料からなる生体組織補填材に播種して培養する生体組織補填体の製造方法を提供する。
本発明によれば、血清の含有濃度を低減した生体組織補填体を製造することができる。
本発明によれば、血清の含有濃度を低減した生体組織補填体を製造することができる。
本発明によれば、生体に移植される生体組織前駆細胞中に含有される血清量を低減しながら、十分な増殖を図り、かつ、生体組織前駆細胞に効率的に分化させることのできるという効果を奏する。
以下、本発明の第１の実施形態に係る間葉系幹細胞の培養方法について説明する。
本実施形態に係る間葉系幹細胞の培養方法は、第１の培養ステップと第２の培養ステップとから構成され、患者から採取した間葉系幹細胞を培養して、生体組織前駆細胞、例えば、骨芽細胞に分化させる方法である。
本実施形態に係る間葉系幹細胞の培養方法は、第１の培養ステップと第２の培養ステップとから構成され、患者から採取した間葉系幹細胞を培養して、生体組織前駆細胞、例えば、骨芽細胞に分化させる方法である。
第１の培養ステップは、牛胎児血清を含有する第１の培地内に間葉系幹細胞を投入し、所定の培養条件下で培養することにより、間葉系幹細胞を必要細胞数まで増殖させるステップである。
第２の培養ステップは、牛胎児血清を含有しない第２の培地内に、第１の培養ステップで培養した間葉系幹細胞を投入し、骨芽細胞に分化させるステップである。
第２の培養ステップは、牛胎児血清を含有しない第２の培地内に、第１の培養ステップで培養した間葉系幹細胞を投入し、骨芽細胞に分化させるステップである。
本実施形態に係る間葉系幹細胞の培養方法によれば、牛胎児血清を含有する第１の培地内における第１の培養ステップにおいて、間葉系幹細胞が牛胎児血清の作用により、効率的に増殖させられて、早期に必要細胞数まで到達させることができる。その後、牛胎児血清を含有しない第２の培地内における第２の培養ステップにおいて、間葉系幹細胞の骨芽細胞への分化が牛胎児血清によって阻害されることなく効率的に行われることになる。
また、第１の培養ステップにおいて増殖させられた間葉系幹細胞は、洗浄により培地を除去され、トリプシン等の蛋白質分解酵素により培養容器から剥離された後に遠心分離されて集められ、第２の培地内に投入される。したがって、第２の培地内に投入される際に間葉系幹細胞に付着していた第１の培地内の牛胎児血清は取り除かれており、第２の培養ステップにおいては、牛胎児血清が存在しない第２の培地内において間葉系幹細胞の骨芽細胞への分化が効率的に行われることになる。
その結果、第２の培養ステップを経て得られる骨芽細胞には牛胎児血清が付着しておらず、そのまま患者の体内に移植することができる。
なお、本実施形態においては、第２の培地内の牛胎児血清の濃度をゼロに設定したが、これに代えて、第１の培地内の牛胎児血清濃度よりも低くゼロより大きい濃度の範囲内において牛胎児血清を含んでいる場合においても、骨芽細胞への分化誘導を促進できる効果があるとともに、患者に移植される骨芽細胞内の牛胎児血清濃度を低減できる効果がある。
なお、本実施形態においては、第２の培地内の牛胎児血清の濃度をゼロに設定したが、これに代えて、第１の培地内の牛胎児血清濃度よりも低くゼロより大きい濃度の範囲内において牛胎児血清を含んでいる場合においても、骨芽細胞への分化誘導を促進できる効果があるとともに、患者に移植される骨芽細胞内の牛胎児血清濃度を低減できる効果がある。
次に、本実施形態に係る間葉系幹細胞の培養方法の一実施例について説明する。
本実施例においては、第１の培地は、初代培養用培地および第１回目培地交換用培地として、ＤＭＥＭ（Dulbecco's Modified Eagle Medium）、１０％ＦＢＳ（Fetal Bovine Serum ）、ｂＦＧＦ（１０ｎｇ／ｍＬ）、ＶＣ（５０μｇ／ｍＬ）、Ｄｅｘ（１０ｎＭ）、gentamicin（５０μｇ／ｍＬ）およびamphotercinＢ（０．２５μｇ／ｍＬ）からなる培地（以下、ＶＦＤ培地と略す。）を用い、第２回目以降の培地交換用培地および継代用培地として、ＤＭＥＭ、１０％ＦＢＳ、ｂＦＧＦ（１０ｎｇ／ｍＬ）、ＶＣ（５０μｇ／ｍＬ）、gentamicin（５０μｇ／ｍＬ）およびamphotercinＢ（０．２５μｇ／ｍＬ）からなる培地（以下、ＶＦ培地と略す。）を用いた。
本実施例においては、第１の培地は、初代培養用培地および第１回目培地交換用培地として、ＤＭＥＭ（Dulbecco's Modified Eagle Medium）、１０％ＦＢＳ（Fetal Bovine Serum ）、ｂＦＧＦ（１０ｎｇ／ｍＬ）、ＶＣ（５０μｇ／ｍＬ）、Ｄｅｘ（１０ｎＭ）、gentamicin（５０μｇ／ｍＬ）およびamphotercinＢ（０．２５μｇ／ｍＬ）からなる培地（以下、ＶＦＤ培地と略す。）を用い、第２回目以降の培地交換用培地および継代用培地として、ＤＭＥＭ、１０％ＦＢＳ、ｂＦＧＦ（１０ｎｇ／ｍＬ）、ＶＣ（５０μｇ／ｍＬ）、gentamicin（５０μｇ／ｍＬ）およびamphotercinＢ（０．２５μｇ／ｍＬ）からなる培地（以下、ＶＦ培地と略す。）を用いた。
第２の培地としては、ＤＭＥＭ、ＶＣ（５０μｇ／ｍＬ）、Ｄｅｘ（１０−７Ｍ）、ＧＰ（１０ｍＭ）、gentamicin（５０μｇ／ｍＬ）およびamphotercinＢ（０．２５μｇ／ｍＬ）からなる培地（以下、ＦＢＳ０％ＯＳ培地と略す。）を用いた。
なお、比較例として、ＤＭＥＭ、１０％ＦＢＳ、ＶＣ（５０μｇ／ｍＬ）、Ｄｅｘ（１０−７Ｍ）、ＧＰ（１０ｍＭ）、gentamicin（５０μｇ／ｍＬ）およびamphotercinＢ（０．２５μｇ／ｍＬ）からなる培地（以下、ＦＢＳ１０％ＯＳ培地と略す。）を用いた場合について検討した。
なお、比較例として、ＤＭＥＭ、１０％ＦＢＳ、ＶＣ（５０μｇ／ｍＬ）、Ｄｅｘ（１０−７Ｍ）、ＧＰ（１０ｍＭ）、gentamicin（５０μｇ／ｍＬ）およびamphotercinＢ（０．２５μｇ／ｍＬ）からなる培地（以下、ＦＢＳ１０％ＯＳ培地と略す。）を用いた場合について検討した。
第１の培養ステップは、以下の要領で行った。
１． 患者から採取した骨髄液を遠心分離機（１５００ｒｐｍ、５分間）を用いて遠心分離し、上清を除去する。
２． ピペットで骨髄溶液をよく混合して、１５０ｍＬストレージボトルに移し、ＶＦＤ培地を加えて１２０ｍＬにする。
３． ピペッティングにより攪拌し、１５ｍＬずつ８枚の７５ｃｍ２フラスコに分注し、フラスコの蓋を閉める。
４． フラスコを３７℃に設定したＣＯ２インキュベータに入れて３〜４日間培養する。
５． 各フラスコ中の培地を１０．５ｍＬ（７０％）取り除き、新たなＶＦＤ培地１０．５ｍＬを加えることで第１回目の培地交換を行う。
６． フラスコを３７℃に設定したＣＯ２インキュベータに入れて３〜４日間培養する。
７． 各フラスコ中の培地を１５ｍＬ（全量）取り除き、新鮮なＶＦ培地１５ｍＬを加えることで第２回目の培地交換を行う。
８． フラスコを３７℃に設定したＣＯ２インキュベータに入れて３〜４日間行う培養と、培地交換とを繰り返す。
１． 患者から採取した骨髄液を遠心分離機（１５００ｒｐｍ、５分間）を用いて遠心分離し、上清を除去する。
２． ピペットで骨髄溶液をよく混合して、１５０ｍＬストレージボトルに移し、ＶＦＤ培地を加えて１２０ｍＬにする。
３． ピペッティングにより攪拌し、１５ｍＬずつ８枚の７５ｃｍ２フラスコに分注し、フラスコの蓋を閉める。
４． フラスコを３７℃に設定したＣＯ２インキュベータに入れて３〜４日間培養する。
５． 各フラスコ中の培地を１０．５ｍＬ（７０％）取り除き、新たなＶＦＤ培地１０．５ｍＬを加えることで第１回目の培地交換を行う。
６． フラスコを３７℃に設定したＣＯ２インキュベータに入れて３〜４日間培養する。
７． 各フラスコ中の培地を１５ｍＬ（全量）取り除き、新鮮なＶＦ培地１５ｍＬを加えることで第２回目の培地交換を行う。
８． フラスコを３７℃に設定したＣＯ２インキュベータに入れて３〜４日間行う培養と、培地交換とを繰り返す。
第１の培養ステップにおいて必要細胞数が得られた時点で第２の培養ステップを行う。
第２の培養ステップは、以下の要領で行った。
１． 第１の培養ステップにおいて得られた間葉系幹細胞は、フラスコ内の培地を取り除き、洗浄した後に、トリプシン溶液によって剥離し、遠心分離によって回収する。その後、第２の培地に投入して細胞懸濁液を作成する。
２． １２ｗｅｌｌプレートに、培地量２ｍＬ／ｗｅｌｌ、播種密度１×１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２となるように播種する。
３． ３７℃に設定したＣＯ２インキュベータに入れて培養し、３〜４日ごとに培地交換を行う。
第２の培養ステップは、以下の要領で行った。
１． 第１の培養ステップにおいて得られた間葉系幹細胞は、フラスコ内の培地を取り除き、洗浄した後に、トリプシン溶液によって剥離し、遠心分離によって回収する。その後、第２の培地に投入して細胞懸濁液を作成する。
２． １２ｗｅｌｌプレートに、培地量２ｍＬ／ｗｅｌｌ、播種密度１×１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２となるように播種する。
３． ３７℃に設定したＣＯ２インキュベータに入れて培養し、３〜４日ごとに培地交換を行う。
この場合において、間葉系幹細胞の接着後における牛胎児血清の影響を観察するために、ＦＢＳ０％ＯＳ培地を用いる第２の培養ステップにおいては、培養初期に４時間程度、ＦＢＳ１０％ＯＳ培地を用いて、間葉系幹細胞を接着させてから、ＦＢＳ０％ＯＳ培地に切り替える場合と、第２の培養ステップの最初はＦＢＳ１０％ＯＳ培地を用い、培養７日目にＦＢＳ０％ＯＳ培地に切り替える場合の２つの場合について検討した。
また、比較例としては、第２の培養ステップの最初からＦＢＳ１０％ＯＳ培地を用い続ける従来の場合を例示した。
また、比較例としては、第２の培養ステップの最初からＦＢＳ１０％ＯＳ培地を用い続ける従来の場合を例示した。
分析は、ＡＬＰ活性測定、ＤＮＡ濃度測定およびカルシウム濃度測定により行った。
ＡＬＰ活性測定は、以下の要領で行った。
１． 得られた細胞を生理食塩水で３回洗浄する。
２． ０．２％Ｔｒｉｔｏｎを４００μＬ／ｗｅｌｌで添加する。
３． セルスクレーパで細胞を剥離する。
４． 全細胞を回収する。
５． ホモジナイザで細胞を破砕する。
６． 遠心分離を行い（８０００ｒｐｍ、５分）、上清をサンプルとする。
７． ＡＬＰ活性測定キット（ラボアッセイＡＬＰ：和光純薬工業製）を用いて、ＡＬＰ活性を測定する。
ＡＬＰ活性測定は、以下の要領で行った。
１． 得られた細胞を生理食塩水で３回洗浄する。
２． ０．２％Ｔｒｉｔｏｎを４００μＬ／ｗｅｌｌで添加する。
３． セルスクレーパで細胞を剥離する。
４． 全細胞を回収する。
５． ホモジナイザで細胞を破砕する。
６． 遠心分離を行い（８０００ｒｐｍ、５分）、上清をサンプルとする。
７． ＡＬＰ活性測定キット（ラボアッセイＡＬＰ：和光純薬工業製）を用いて、ＡＬＰ活性を測定する。
ＤＮＡ濃度測定は、以下の要領で行った。
１． 得られた細胞を生理食塩水で３回洗浄する。
２． ０．２％Ｔｒｉｔｏｎを４００μＬ／ｗｅｌｌで添加する。
３． セルスクレーパで細胞を剥離する。
４． 全細胞を回収する。
５． ホモジナイザで細胞を破砕する。
６． 遠心分離を行い（８０００ｒｐｍ、５分）、上清をサンプルとする。
７． ＤＮＡ濃度測定キット（Fluorescent DNA Quantitiation Kit：ＢＩＯ ＲＡＤ社製）を用いて、ＤＮＡ濃度を測定する。
１． 得られた細胞を生理食塩水で３回洗浄する。
２． ０．２％Ｔｒｉｔｏｎを４００μＬ／ｗｅｌｌで添加する。
３． セルスクレーパで細胞を剥離する。
４． 全細胞を回収する。
５． ホモジナイザで細胞を破砕する。
６． 遠心分離を行い（８０００ｒｐｍ、５分）、上清をサンプルとする。
７． ＤＮＡ濃度測定キット（Fluorescent DNA Quantitiation Kit：ＢＩＯ ＲＡＤ社製）を用いて、ＤＮＡ濃度を測定する。
カルシウム濃度測定は、以下の要領で行った。
１． 得られた細胞を生理食塩水で３回洗浄する。
２． ０．２％Ｔｒｉｔｏｎを４００μＬ／ｗｅｌｌで添加し、室温で１８０分間抽出する。
３． 各サンプルを回収し、カルシウム濃度測定キット（カルシウムＣ−テストワコー：和光純薬工業製）を用いて、カルシウム濃度を測定する。
１． 得られた細胞を生理食塩水で３回洗浄する。
２． ０．２％Ｔｒｉｔｏｎを４００μＬ／ｗｅｌｌで添加し、室温で１８０分間抽出する。
３． 各サンプルを回収し、カルシウム濃度測定キット（カルシウムＣ−テストワコー：和光純薬工業製）を用いて、カルシウム濃度を測定する。
図１にＡＬＰ活性測定結果を示す。
これによれば、第２の培養ステップの最初からＦＢＳ１０％ＯＳ培地を用いた場合には、ＦＢＳ１０％ＯＳ培地のまま培養し続けた場合および開始後７日目にＦＢＳ０％ＯＳ培地に切り替えた場合のいずれもが、同等のパターンでＡＬＰ活性が変化していることがわかる。一方、第２の培養ステップの最初からＦＢＳ０％ＯＳ培地を用いた場合には、全体的にＡＬＰ活性が低いことがわかる。
これによれば、第２の培養ステップの最初からＦＢＳ１０％ＯＳ培地を用いた場合には、ＦＢＳ１０％ＯＳ培地のまま培養し続けた場合および開始後７日目にＦＢＳ０％ＯＳ培地に切り替えた場合のいずれもが、同等のパターンでＡＬＰ活性が変化していることがわかる。一方、第２の培養ステップの最初からＦＢＳ０％ＯＳ培地を用いた場合には、全体的にＡＬＰ活性が低いことがわかる。
図２にカルシウム濃度測定結果を示す。
これによれば、第２の培養ステップの最初からＦＢＳ１０％ＯＳ培地を用い、ＦＢＳ１０％ＯＳ培地のまま培養し続ける従来の培養方法の場合には、培養時間の経過とともにカルシウム蓄積量が飽和していることがわかる。一方、第２の培養ステップの開始後７日目にＦＢＳ１０％ＯＳ培地からＦＢＳ０％ＯＳ培地に切り替えた場合、および、第２の培養ステップの最初からＦＢＳ０％ＯＳ培地を用いた本実施形態の場合のいずれもが、特に培養期間の経過とともに、従来の培養方法よりも、カルシウム蓄積量が大幅に増加していることがわかる。
これによれば、第２の培養ステップの最初からＦＢＳ１０％ＯＳ培地を用い、ＦＢＳ１０％ＯＳ培地のまま培養し続ける従来の培養方法の場合には、培養時間の経過とともにカルシウム蓄積量が飽和していることがわかる。一方、第２の培養ステップの開始後７日目にＦＢＳ１０％ＯＳ培地からＦＢＳ０％ＯＳ培地に切り替えた場合、および、第２の培養ステップの最初からＦＢＳ０％ＯＳ培地を用いた本実施形態の場合のいずれもが、特に培養期間の経過とともに、従来の培養方法よりも、カルシウム蓄積量が大幅に増加していることがわかる。
図３にＤＮＡ濃度測定結果を示す。
これによれば、第２の培養ステップの最初からＦＢＳ１０％ＯＳ培地を用いた場合には、ＦＢＳ１０％ＯＳ培地のまま培養し続けた場合および開始後７日目にＦＢＳ０％ＯＳ培地に切り替えた場合のいずれもが、同等のパターンでＤＮＡ濃度が変化していることがわかる。一方、第２の培養ステップの最初からＦＢＳ０％ＯＳ培地を用いた場合には、全体的にＤＮＡ濃度が低いことがわかる。
これによれば、第２の培養ステップの最初からＦＢＳ１０％ＯＳ培地を用いた場合には、ＦＢＳ１０％ＯＳ培地のまま培養し続けた場合および開始後７日目にＦＢＳ０％ＯＳ培地に切り替えた場合のいずれもが、同等のパターンでＤＮＡ濃度が変化していることがわかる。一方、第２の培養ステップの最初からＦＢＳ０％ＯＳ培地を用いた場合には、全体的にＤＮＡ濃度が低いことがわかる。
ＤＮＡ濃度測定結果により、牛胎児血清の使用条件によって細胞増殖速度が異なっていることがわかったので、ＡＬＰ活性とカルシウム蓄積量について正確な比較を行うために、図１のＡＬＰ活性と図２のカルシウム濃度測定結果を図３のＤＮＡ濃度測定結果で割ることにより、細胞１個当たりのＡＬＰ活性とカルシウム蓄積量を求め、それぞれ図４および図５に示した。
図４に示すように、ＤＮＡ濃度で補正したＡＬＰ活性によれば、第２の培養ステップの最初からＦＢＳ０％ＯＳ培地を用いた場合、および培養７日目からＦＢＳ０％ＯＳ培地に切り替えた場合のいずれもが、従来のＦＢＳ１０％ＯＳ培地を用いた場合と比較して、ＡＬＰ活性が１１日目まで同じ傾向で増加している。また、ＤＮＡ濃度で補正したＡＬＰ活性は、その後、牛胎児血清の条件によって変化している。
図１に比べ、ＤＮＡ濃度で補正したＦＢＳ０％ＯＳ培地のＡＬＰ活性が高くなり、１１日目まで他の条件と同じであった。１１日目以降、他の条件よりＡＬＰ活性が低いものの、一定レベルに維持された。これが次のカルシウム蓄積（石灰化）に寄与していると考えられる。
図１に比べ、ＤＮＡ濃度で補正したＦＢＳ０％ＯＳ培地のＡＬＰ活性が高くなり、１１日目まで他の条件と同じであった。１１日目以降、他の条件よりＡＬＰ活性が低いものの、一定レベルに維持された。これが次のカルシウム蓄積（石灰化）に寄与していると考えられる。
図５にＤＮＡ濃度で補正したカルシウム濃度を示す。
これによれば、第２の培養ステップにおいて、最初からＦＢＳ０％ＯＳ培地を用いた場合、および開始７日目からＦＢＳ０％ＯＳ培地に切り替えた場合のいずれもが、従来のＦＢＳ１０％ＯＳ培地による培養方法と比較して、培養時間の経過とともに、細胞１個当たりのカルシウム蓄積量が大幅に増大していることがわかる。
これによれば、第２の培養ステップにおいて、最初からＦＢＳ０％ＯＳ培地を用いた場合、および開始７日目からＦＢＳ０％ＯＳ培地に切り替えた場合のいずれもが、従来のＦＢＳ１０％ＯＳ培地による培養方法と比較して、培養時間の経過とともに、細胞１個当たりのカルシウム蓄積量が大幅に増大していることがわかる。
以上の結果から、間葉系幹細胞を骨芽細胞に分化誘導する際に、牛血清培地を含有しない無血清培地に切り替えることにより、牛血清培地を使用し続ける従来の培養方法と同等以上の骨芽細胞を効率的に得ることができる。しかも、得られた骨芽細胞における牛血清培地の含有量が低減されるので好ましい。特に、培養時間が長時間になるほど、多くの骨芽細胞を得ることができる。
したがって、第２の培養ステップにおいて、間葉系幹細胞を生体適合性の材料、例えば、βリン酸三カルシウム多孔体等のリン酸カルシウム多孔体からなる生体組織補填材に播種して培養する培養骨の製造方法によれば、牛血清培地を含まない培養骨を効率的に製造することができる。
次に、本発明の第２の実施形態に係る間葉系幹細胞の培養方法について説明する。
本実施形態に係る間葉系幹細胞の培養方法は、ヒト自己血清を使用したケースを想定したものである。第１の実施形態では牛胎児血清を使用したため、牛胎児血清を取り除く目的で第２の培養ステップにおいて牛胎児血清濃度をゼロに切り替える方策をとった。しかし、ヒト自己血清を使用した場合、その濃度をゼロにする必要はない。逆に、血清が存在した方が細胞増殖に効果があるという観点から、血清を残した方がよいと考えられた。そこで、どのくらい血清があれば、細胞の増殖と分化に影響を及ぼさないかを検討した。
本実施形態に係る間葉系幹細胞の培養方法は、ヒト自己血清を使用したケースを想定したものである。第１の実施形態では牛胎児血清を使用したため、牛胎児血清を取り除く目的で第２の培養ステップにおいて牛胎児血清濃度をゼロに切り替える方策をとった。しかし、ヒト自己血清を使用した場合、その濃度をゼロにする必要はない。逆に、血清が存在した方が細胞増殖に効果があるという観点から、血清を残した方がよいと考えられた。そこで、どのくらい血清があれば、細胞の増殖と分化に影響を及ぼさないかを検討した。
本実施形態に係る間葉系幹細胞の培養法法によれば、１０〜１５％ヒト自己血清を含有する第１の培地内における第１の培養ステップにおいて、間葉系幹細胞が高濃度の自己血清により効率的に増殖させられる。その結果間葉系幹細胞を早期に必要細胞数まで到達させることができる。その後、低濃度の自己血清を含有する第２の培地内における第２の培養ステップにおいて、間葉系幹細胞の細胞数を維持しながら骨芽細胞への分化を行うことになる。
また、第１の培養ステップにおいて増殖させられた間葉系幹細胞は、洗浄により培地を除去され、トリプシン等の蛋白質分解酵素により培養容器から剥離された後に遠心分離されて集められ、第２の培地内に投入される。第２の培養ステップにおいては、ヒト血清濃度が低い第２の培地内において間葉系幹細胞の骨芽細胞への分化が効率的に行われることになる。
その結果、第２の培養ステップにおいて使用するヒト血清の採取量を削減することができ、患者に係る負担を低減できるという利点がある。
また、本実施形態においては、第２の培地内のヒト血清濃度をゼロより大きい濃度の範囲内で第１の培地内のヒト血清濃度よりも低くすることとしたため、最終的に患者に移植される骨芽細胞にヒト血清が含有されることとなるが、間葉系幹細胞のソースである患者と同一人から採取したヒト血清を用いるので何ら問題はない。
また、本実施形態においては、第２の培地内のヒト血清濃度をゼロより大きい濃度の範囲内で第１の培地内のヒト血清濃度よりも低くすることとしたため、最終的に患者に移植される骨芽細胞にヒト血清が含有されることとなるが、間葉系幹細胞のソースである患者と同一人から採取したヒト血清を用いるので何ら問題はない。
逆に、ヒト血清濃度がゼロとならない範囲で第２の培地内に含有されていた方がよい場合もある。すなわち、第２の培養ステップにおいて間葉系幹細胞を完全に骨芽細胞に分化させるのではなく、一部の間葉系幹細胞を増殖させつつ、他の一部の間葉系幹細胞を骨芽細胞に分化させることで、骨芽細胞を継続的に提供し続けることが可能となる。したがって、骨芽細胞を継続的に提供し続けることが必要な用途においては、ヒト血清濃度がゼロとならない範囲で第２の培地内に含有されていることが好ましい。
次に、本実施形態に係る間葉系幹細胞の培養方法の一実施例について説明する。
本実施例においては、２種類の間葉系幹細胞Ａ，Ｂを用いる。
第１の培地は、第１の実施形態における第１の培地中の１０％ＦＢＳの代わりに１５％ヒト自己血清を用いたものと同じである。
本実施例においては、２種類の間葉系幹細胞Ａ，Ｂを用いる。
第１の培地は、第１の実施形態における第１の培地中の１０％ＦＢＳの代わりに１５％ヒト自己血清を用いたものと同じである。
第２の培地としては、ＤＭＥＭ、５％ヒト血清、ＶＣ（５０μｇ／ｍＬ）、Ｄｅｘ（１０−７Ｍ）、ＧＰ（１０ｍＭ）、gentamicin（５０μｇ／ｍＬ）およびamphotercinＢ（０．２５μｇ／ｍＬ）からなる培地（以下、ＨＳ５％ＯＳ培地と略す。）と、ヒト血清の濃度を１０％としたＨＳ１０％ＯＳ培地の２種類を用意した。また、比較例としてヒト血清の濃度を１５％とした従来のＨＳ１５％ＯＳ培地を用意した。
第１の培養ステップ、第２の培養ステップは、第１の実施形態と同様である。
ただし、第２の培養ステップにおいては、異なる濃度のヒト自己血清の３種類の第２の培地を継続して使用した。
ＡＬＰ活性測定方法、カルシウム濃度測定方法およびＤＮＡ濃度測定方法はいずれも上述した通りである。
ただし、第２の培養ステップにおいては、異なる濃度のヒト自己血清の３種類の第２の培地を継続して使用した。
ＡＬＰ活性測定方法、カルシウム濃度測定方法およびＤＮＡ濃度測定方法はいずれも上述した通りである。
図６、図８および図１０に、間葉系幹細胞ＡのＡＬＰ活性測定結果、カルシウム濃度測定結果およびＤＮＡ濃度測定結果を示す。また、図７、図９および図１１に間葉系幹細胞ＢのＡＬＰ活性測定結果、カルシウム濃度測定結果およびＤＮＡ濃度測定結果を示す。
これらの図６〜図１１によれば第２の培地中のヒト血清濃度の大小にかかわらず、いずれの間葉系幹細胞Ａ，Ｂの場合にも、ほぼ同様なＡＬＰ活性、カルシウム濃度およびＤＮＡ濃度の傾向を示すことがわかった。
これらの図６〜図１１によれば第２の培地中のヒト血清濃度の大小にかかわらず、いずれの間葉系幹細胞Ａ，Ｂの場合にも、ほぼ同様なＡＬＰ活性、カルシウム濃度およびＤＮＡ濃度の傾向を示すことがわかった。
すなわち、間葉系幹細胞を増殖させる第１の培養ステップにおいては、比較的高い濃度のヒト血清が必要であり、従来は、第２の培養ステップにおいても同様の濃度のヒト血清を含有する培地を用いていたが、本実施形態に係る間葉系幹細胞の培養方法によれば、より少ない量のヒト血清を用いて、従来と同等の骨芽細胞を得ることができる。したがって、患者から採取するヒト血清の採取量を低く抑えて患者の負担を大幅に低減しつつ、従来と同等の骨芽細胞を得ることができるという効果がある。
また、本実施形態に係る間葉系幹細胞の培養方法を用いて培養骨を製造する場合においても、上記と同様に、少ないヒト血清で従来と同等の培養骨を効率的に製造することができる。
なお、上記各実施形態においては、第２の培養ステップにおいて間葉系幹細胞から骨芽細胞への分化誘導する場合について説明したが、これに限定されるものではなく、他の任意の生体組織前駆細胞への分化誘導に適用することにしてもよい。同様に、生体組織補填体としては培養骨に限定されるものではなく、他の任意の生体組織補填体の製造に適用することができる。
また、上記実施形態においては、ヒト血清の濃度をゼロより大きい濃度の範囲で低減する場合について説明したが、これに代えて、第２の培地内のヒト血清濃度をゼロにしても、所定の効果を得ることができることが予想される。
Claims (7)
- 血清およびデキサメタゾンを含有する培地内で間葉系幹細胞を増殖させる第１の培養ステップと、
デキサメタゾンを含有し前記第１の培養ステップにおける培地よりも血清の濃度の低い培地内で間葉系幹細胞を骨芽細胞に分化させる第２の培養ステップとを備える間葉系幹細胞の培養方法。 - 第２の培養ステップにおける培地内の血清の濃度がほぼゼロである請求項１に記載の間葉系幹細胞の培養方法。
- 第２の培養ステップにおける培地内の血清の濃度がゼロより大きい請求項１に記載の間葉系幹細胞の培養方法。
- 前記血清が、牛胎児血清である請求項２に記載の間葉系幹細胞の培養方法。
- 前記血清が、ヒト血清である請求項１から請求項３のいずれかに記載の間葉系幹細胞の培養方法。
- 前記第２の培養ステップにおける培地のデキサメタゾンの添加濃度は、前記第１の培養ステップにおけるデキサメタゾンの添加濃度よりも大きい請求項１から請求項５のいずれかに記載の間葉系幹細胞の培養方法。
- 請求項１から請求項６のいずれかに記載の間葉系幹細胞の培養方法の第２の培養ステップにおいて、間葉系幹細胞を生体適合性の材料からなる生体組織補填材に播種して培養する生体組織補填体の製造方法。
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