JP4889641B2

JP4889641B2 - 微生物によるｎ−アセチル−ｄ−グルコサミンの醗酵生産方法

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Publication number: JP4889641B2
Application number: JP2007525994A
Authority: JP
Inventors: 哲也森; 稚子市川; 雄一北; 保行手塚
Original assignee: Hokko Chemical Industry Co Ltd
Current assignee: Hokko Chemical Industry Co Ltd
Priority date: 2005-07-19
Filing date: 2006-07-14
Publication date: 2012-03-07
Anticipated expiration: 2026-07-14
Also published as: US8383368B2; US20110059489A1; US7998723B2; EP1908847A4; WO2007010855A1; EP1908847B1; US20100055746A1; JPWO2007010855A1; CN101223282A; KR101348124B1; CA2615511A1; CA2615511C; CN101223282B; EP1908847A1; KR20080036612A

Description

本発明は、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンの生産能を有する新規微生物および該微生物を用いるＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンの製造方法に関する。Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンは、医薬品、健康食品、食品などの分野で有用である。

Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンは、カニやエビなどの甲殻類の外殻に含まれるキチンを構成する単糖であり、食品の中にごく少量含まれている栄養素で、体内でも軟骨細胞から作り出される。グルコサミンと同様の効果があるとされ、摂取することにより、新しい軟骨の生成を促進し、変形関節症の進行を食い止め、場合によって治癒に向かう効果があるといわれている（新薬と臨牀Ｖｏｌ．５２，Ｎｏ．３，ｐ．３０１−３１２，２００３年）。グルコサミンは苦味を呈するのに対し、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンは蔗糖（シュークロース）の約５０％の甘味を有するので、摂取しやすいという利点があるため、グルコサミンに代替する物質としてＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンが注目されている。

従来のＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンの製造方法は、カニやエビなどの甲殻類の殻を原料として製造されている。その製造法を概略すると、甲殻類の殻を破砕し、これを稀酸で脱灰し、アルカリで除タンパクを行い、精製されたキチンを得たのち、このキチンを酸で加水分解してグルコサミンを生成させ、次に生成したグルコサミンを無水酢酸でアセチル化するという工程によりＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを得る方法である。

また、精製されたキチンを酸で部分加水分解する方法（例えば、特許文献１参照）、あるいはキチンを原料とし、微生物の生産する酵素により分解し、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを製造する方法がある（例えば、特許文献２、特許文献３参照）。さらに、キチンを酸による部分加水分解後、酵素を作用させる方法がある（例えば、特許文献４参照）。

また一方、その他の製造方法として、クロロウイルスに感染したクロレラ細胞またはクロロウイルス由来の遺伝子を導入した組換え大腸菌のいずれかを培養してＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを生産する方法（例えば、特許文献５参照）、遺伝子組換え微生物、具体的には遺伝子組み換え大腸菌を用いてＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを醗酵生産する方法がある（例えば、特許文献６参照）。
特開２０００−２８１６９６号公報特表２０００−５１３９２５号公報特開２００４−４１０３５号公報特開昭６３−２７３４９３号公報特開２００４−２８３１４４号公報国際公開第２００４／００３１７５号パンフレット

以上のようなカニやエビの甲羅や殻を原料とし、化学的に加水分解してＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを製造する方法では高濃度の酸溶液あるいはアルカリ溶液を使用するため多量の廃液が出るという問題がある。また、カニやエビの甲羅や殻由来のキチンを微生物で、あるいは微生物の生産する酵素で分解してＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを作る方法では収率が悪く、コスト高になるという問題がある。

また、カニやエビの甲羅や殻が原料の場合、甲殻類アレルギーを持っている人が摂取したときにアレルギーを起こすという懸念がある。さらに原料であるキチンを水産資源に頼っているため、漁獲量によって供給量が変動するという問題があり、近年では乱獲による環境破壊が懸念されている。

一方、クロロウイルスに感染したクロレラ細胞を用いる培養生産方法では、細胞を破砕してＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを得るため、操作が煩雑になる問題があり、また遺伝子組換え微生物を用いてＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを作る方法では、設備上拡散防止処置をとらねばならず、操作が煩雑になることや食品の安全性に関する社会通念上問題がある。

したがって、本発明の目的は、菌体外にＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを生産する能力を有する新規微生物、およびＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン生産能を有する微生物を用いるＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンの安定かつ安価でさらに安全な製造方法を提供することにある。

本発明者らは、上記の目的を達成すべく鋭意研究を行った。その結果、本発明者らにより、天然より単離されたある種の糸状菌またはその変異株が、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンのポリマーであるキチンやそのオリゴマーであるキチンオリゴ糖以外の炭素源を含む培地中で、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを生産することを初めて見出した。またこの糸状菌を液体培地で培養することにより、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを培地中に高濃度に生産させ、かつ効率よく分離することに成功し、本発明を完成した。

すなわち、本発明の要旨とするところは、以下のとおりである。
（１）Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンの生産能を有する糸状菌の非遺伝子組換え株を、キチンおよびキチンオリゴ糖以外の炭素源および窒素源を含む培地に培養し、培地中にＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを生成、蓄積させ、これを採取することを特徴とする、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンの醗酵生産方法。
（２）前記炭素源および窒素源を追加しながら培養を行うことを特徴とする、（１）のＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンの醗酵生産方法。
（３）Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンの生産能を有する糸状菌の非遺伝子組換え株が、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）に属する糸状菌の非遺伝子組換え株であることを特徴とする、（１）または（２）のＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンの醗酵生産方法。
（４）Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンの生産能を有する糸状菌の非遺伝子組換え株が、トリコデルマハマタム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｈａｍａｔｕｍ）、トリコデルマハルジアナム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｈａｒｚｉａｎｕｍ）、トリコデルマリーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｒｅｅｓｅｉ）あるいはトリコデルマビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｖｉｒｉｄｅ）のいずれかの非遺伝子組換え株であることを特徴とする、（３）のＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンの醗酵生産方法。
（５）Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンの生産能を有する糸状菌の非遺伝子組換え株が、トリコデルマハマタムＡＢ１０２８２株（ＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｈａｍａｔｕｍＡＢ１０２８２ＦＥＲＭＢＰ−１０６２３）あるいはトリコデルマハルジアナムＡＢ１０２８３株（ＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｈａｒｚｉａｎｕｍＡＢ１０２８３ＦＥＲＭＢＰ−１０６２４）のいずれかであることを特徴とする、（４）のＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンの醗酵生産方法。
（６）Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンの生産能を有する、トリコデルマハマタム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｈａｍａｔｕｍ）ＦＥＲＭＢＰ−１０６２３株あるいはトリコデルマハルジアナム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｈａｒｚｉａｎｕｍ）ＦＥＲＭＢＰ−１０６２４株。
（７）トリコデルマハマタム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｈａｍａｔｕｍ）ＦＥＲＭＢＰ−１０６２３株あるいはトリコデルマハルジアナム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｈａｒｚｉａｎｕｍ）ＦＥＲＭＢＰ−１０６２４株に変異を導入することにより得られる、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンの生産能を有する変異株。

次に、本発明を詳細に説明する。
本発明のＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンの製造法は、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンの生産能を有する糸状菌の非遺伝子組換え株をキチンおよびキチンオリゴ糖以外の炭素源と窒素源を含む培地で培養し、培地中にＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを生成、蓄積させ、培地から分離・精製し、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを得ることよりなる。

本発明の方法で用いられるＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンの生産能を有する糸状菌の非遺伝子組換え株としては、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを生産する能力を有する非遺伝子組み換え糸状菌であればいかなるものでもよいが、天然よりＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン生産能を指標に単離された糸状菌またはその変異株などが挙げられる。ここで、「Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを生産する能力」とは、糸状菌をキチンおよびキチンオリゴ糖以外の炭素源と窒素源を含む培地で培養したときに培地中に十分な量、好ましくは０．０１ｍｇ／ｍＬ以上（振とう培養時）、より好ましくは０．１ｍｇ／ｍＬ以上（振とう後、静置培養時）のＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを蓄積することができる能力をいう。このような糸状菌としては、例えば、具体的には、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンの生産能を有するトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属に属する糸状菌が挙げられる。

Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンの生産能を有する糸状菌は、好適な培地、好ましくは液体培地で培養し、該培地中に蓄積されたＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンの有無を調べることによって、探索することができる。培地中のＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンの検出は、例えば、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いた分析により、標準品のＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンと比較して行なうことができる。

本発明に用いる糸状菌の具体的な例としては、標準菌株であるトリコデルマハマタム（ＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｈａｍａｔｕｍＮＢＲＣ３１２９１）、トリコデルマハルジアナム（ＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｈａｒｚｉａｎｕｍＮＢＲＣ３１２９２）、トリコデルマリーセイ（ＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｒｅｅｓｅｉＡＴＣＣ２４４４９）、トリコデルマビリデ（ＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｖｉｒｉｄｅＮＢＲＣ３１１３７）や本発明者らが神奈川県厚木市より採取した土壌試料から新たに分離したＡＢ１０２８２株およびＡＢ１０２８３株がある。この新たに分離したＡＢ１０２８２株およびＡＢ１０２８３株は、不完全糸状菌綱（Ｈｙｐｈｏｍｙｃｅｔｅｓ）、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属）に属する菌株であり、本発明の方法に好適に用いられるＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン生産菌の一例である。

このＡＢ１０２８２およびＡＢ１０２８３株の菌学的性質を以下に記載する。

１．ＡＢ１０２８２株の菌学的性質
（１）培養的・形態的性質
（ａ）ＡＢ１０２８２株をコーンミール寒天培地において２５℃で培養したとき、集落の直径は２日目で５６〜５８ｍｍに達する。培養７日目の集落は平坦で気生菌糸は少ない。集落表面および裏面は無色を呈する。
（ｂ）麦芽エキス寒天培地を用いて２５℃で培養したとき、集落の直径は２日目で６８〜７０ｍｍに達する。集落ははじめ、気生菌糸は少なく白色を呈するが、しだいに羊毛状の気生菌糸を生じる。培養７日目の集落は羊毛状を呈し、集落表面は淡白色を呈する。裏面は淡白色を呈する。
（ｃ）ポテト・デキストロース寒天培地を用いて２５℃で培養したとき、集落の直径は２日目で６８〜７０ｍｍに達する。集落は綿毛状〜羊毛状を呈し、集落表面は淡白色〜淡黄白色で、裏面は淡白色〜淡黄白色を呈する。
（ｄ）ツアペック寒天培地を用いて２５℃で培養したとき、集落の直径は２日目で２９〜３１ｍｍに達する。集落ははじめ、気生菌糸は少なく白色を呈するが、しだいに綿毛状〜羊毛状を呈する。集落表面は薄い白色で、裏面は薄い白色を呈する。
（ｅ）コーンミール寒天培地で２５℃、７日間培養したときのＡＢ１０２８２株の光学顕微鏡による観察結果を以下に記載する。
菌糸は隔壁を有し、培地中および培地上に伸長する。菌糸は幅２．０〜６．０μｍで、無色、平滑で隔壁を有する。分生子柄は、平滑で、隔壁を有し、先端がしばしば不稔を呈し、短く丸みをおびたフィアライドを密生する。フィアライドは、分生子柄にほぼ直角に生じ、短く丸みをおびたボーリングのピン状を呈し、無色、平滑で、長さ４．０〜６．０μｍ、幅は最も広い部位において２．５〜３．５μｍである。分生子はフィアライド先端から多数形成され、単細胞で、無色、平滑、だ円形〜長だ円形を呈し、大きさが３．０〜４．５×２．４〜２．８μｍである。
（２）生理学的性質
（ａ）生育温度
麦芽エキス寒天培地を用いて、５℃、１０℃、１５℃、２０℃、２５℃、３０℃、３５℃、３７℃および４０℃の各温度で培養した結果、ＡＢ１０２８２株は１０℃〜３０℃まで何れの温度でも生育し、最適生育温度は２０〜２５℃付近である。
（ｂ）生育ｐＨ
ｐＨを３、４、５、６、７、８、９および１０に調整した麦芽エキス寒天培地を用いて、２５℃で培養した結果、ＡＢ１０２８２株はｐＨ３〜１０まで生育し、最適生育ｐＨは、５〜６である。

２．ＡＢ１０２８３株の菌学的性質
（１）培養的・形態的性質
（ａ）ＡＢ１０２８３株をコーンミール寒天培地において２５℃で培養したとき、集落の直径は２日目で６３〜６５ｍｍに達する。集落は平坦でのち綿毛状〜羊毛状を呈する。集落表面は灰緑色〜暗緑色で、裏面は薄い灰緑色〜薄い暗緑色を呈する。
（ｂ）麦芽エキス寒天培地を用いて２５℃で培養したとき、集落の直径は２日目で７６〜７８ｍｍに達する。集落ははじめ、気生菌糸は少なく白色を呈するが、しだいに綿毛状〜羊毛状の気生菌糸を生じる。培養７日目の集落は綿毛状〜羊毛状を呈し、分生子形成に伴い集落表面は黄緑色〜暗緑色を呈する。分生子形成は中心部を除いて集落全体で認められるが、分生子形成体が周辺部および中間部で輪状を呈する。裏面は黄緑色〜暗緑色を呈する。
（ｃ）ポテト・デキストロース寒天培地を用いて２５℃で培養したとき、集落の直径は２日目で６３〜６５ｍｍに達する。培養７日目の集落は綿毛状〜羊毛状を呈し、気生菌糸は豊富で中心部がやや隆起し、分生子形成に伴い中心部は黄緑色〜薄い緑色を呈する。集落表面は中心部が黄緑色〜薄い緑色で、裏面は淡白色〜淡黄白色を呈する。
（ｄ）ツアペック寒天培地を用いて２５℃で培養したとき、集落の直径は２日目で３５〜３７ｍｍに達する。集落は中心部が平坦で、周辺部は綿毛状を呈する。分生子形成は周辺部で輪状を呈し、分生子形成に伴い集落表面は灰緑色〜暗緑色を呈する。集落表面は灰緑色〜暗緑色で、裏面は薄い灰緑色〜薄い緑色を呈する。
（ｅ）コーンミール寒天培地で２５℃、７日間培養したときのＡＢ１０２８３株の光学顕微鏡による観察結果を以下に記載する。
菌糸は隔壁を有し、培地中および培地上に伸長する。菌糸は幅２．０〜８．０μｍで、無色、平滑で隔壁を有する。分生子形成に伴い集落表面は無色からのち灰緑色〜暗緑色を呈する。分生子形成は集落全体で認められるが、分生子形成体が輪状を呈する。分生子柄は、平滑で、隔壁を有し、フィアライドを分生子柄にほぼ直角に生じ、あまり密に形成されない。フィアライドは短く丸みをおびたボーリングのピン状を呈し、無色、平滑で、長さ５．０〜８．０μｍ、幅は最も広い部位において２．５〜３．５μｍである。分生子はフィアライド先端から多数形成され、単細胞で、無色、平滑、球形〜亜球形を呈する。大きさは２．４〜３．０×２．４〜２．８μｍで、長さと幅の比は１．００〜１．１５である。
（２）生理学的性質
（ａ）生育温度
麦芽エキス寒天培地を用いて、５℃、１０℃、１５℃、２０℃、２５℃、３０℃、３５℃、３７℃および４０℃の各温度で培養した結果、ＡＢ１０２８３株は１０℃〜３５℃まで何れの温度でも生育し、最適生育温度は２５〜３０℃付近である。
（ｂ）生育ｐＨ
ｐＨを３、４、５、６、７、８、９および１０に調整した麦芽エキス寒天培地を用いて、２５℃で培養した結果、ＡＢ１０２８３株はｐＨ３〜１０まで生育し、最適生育ｐＨは、５〜７と思われる。

以上の菌学的性質からＡＢ１０２８２株およびＡＢ１０２８３株の分類学上の位置をジェイ・エイ・フォン・アークス著、ザ・ジェネラ・オブ・ファンジャイ・スポルレイティング・イン・ピュア・カルチャー、第３版、ジェイ・クレイマー社、バダッツ、１９８１年（Ｊ．Ａ．ｖｏｎＡｒｘ，ＴｈｅＧｅｎｅｒａｏｆＦｕｎｇｉＳｐｏｒｕｌａｔｉｎｇｉｎＰｕｒｅＣｕｌｔｕｒｅ，３ｒｄｅｄ．，Ｊ．Ｃｒａｍｅｒ，Ｖａｄｕｚ，１９８１）に従って検索した。その結果、ＡＢ１０２８２株およびＡＢ１０２８３株はトリコデルマ属に属することが認められた。さらに、種の同定を奥田徹、防菌防黴、Ｖｏｌ．２０、ｐ．１５７−１６６、１９９２年に従って検索した結果、ＡＢ１０２８２株はトリコデルマハマタム、ＡＢ１０２８３株はトリコデルマハルジアナムに属することが認められた。本発明者らは、ＡＢ１０２８２株をトリコデルマハマタムＡＢ１０２８２（ＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｈａｍａｔｕｍＡＢ１０２８２）、ＡＢ１０２８３株をトリコデルマハルジアナムＡＢ１０２８３（ＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｈａｒｚｉａｎｕｍＡＢ１０２８３）と命名した。

なお、ＡＢ１０２８２株は、平成１７年５月２０日に、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（〒305-8566 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に受託番号ＦＥＲＭＰ−２０５４３として寄託され、その後、ブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、ＦＥＲＭＢＰ−１０６２３の受託番号で寄託されている。
また、ＡＢ１０２８３株は、平成１７年５月２０日に独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号ＦＥＲＭＰ−２０５４４として寄託され、その後、ブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、ＦＥＲＭＢＰ−１０６２４の受託番号で寄託されている。

本発明に使用されるトリコデルマハマタム、トリコデルマハルジアナム、トリコデルマリーセイ、トリコデルマビリデ、トリコデルマハマタムＡＢ１０２８２（ＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｈａｍａｔｕｍＡＢ１０２８２）およびトリコデルマハルジアナムＡＢ１０２８３（ＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｈａｒｚｉａｎｕｍＡＢ１０２８３）株は、例えば、ポテト・デキストロース寒天培地のスラント上で保存することができる。しかし、スラント上では継代することで自然変異する可能性があるため、凍結乾燥保存を行うことにより、安定に保存することができる。

以上、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン生産菌の一例であるトリコデルマハマタム、トリコデルマハルジアナム、トリコデルマリーセイ、トリコデルマビリデ、ＡＢ１０２８２株およびＡＢ１０２８３株について説明したが、一般的には糸状菌類はその菌学的性状が極めて変化しやすく、安定したものではない。糸状菌類は、自然的あるいは通常行われている紫外線照射、Ｘ線照射、変異誘発剤（例えば、Ｎ−メチル−Ｎ−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジンなど）を用いた人為的変異手段により変異誘発することは周知の事実である。このような自然変異株ならびに人工変異株も含め、糸状菌に属しＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを生産する能力を有する菌株はすべて本発明に使用することができる。
なお、人為的に変異を導入する場合、変異導入前の親株に対し、それ以上、好ましくは1.5倍以上のＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン生産能を有する変異株を選択することが好ましい。

その他、トリコデルマに属する糸状菌としては、トリコデルマアウレオビリデ（Ｔ．ａｕｒｅｏｖｉｒｉｄｅ）、トリコデルマコニンギ（Ｔ．ｋｏｎｉｎｇｉ）、トリコデルマピルリフェラム（Ｔ．ｐｉｌｕｌｉｆｅｒｕｍ）などが挙げられるが、すべてＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンの生産に使用できる。

本発明の方法を実施するに当っては、糸状菌に属するＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン生産能を有する菌を、用いる糸状菌に好適な培地、例えば、通常の微生物が利用しうる栄養物を含有する培地、好ましくは液体培地中において培養するのが好ましい。該生産菌の培養には、微生物の培養に用いられる通常の培養方法が適用される。栄養源としては、使用された糸状菌が資化しうる炭素源、窒素源および無機塩などを程よく含有する培地であれば天然培地、合成培地のいずれでも利用できる。

本発明のＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンの醗酵生産方法では、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンのポリマーであるキチンやそのオリゴマーであるキチンオリゴ糖を原料として培地に含み、それを分解してＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを生成するという分解反応ではなく、糸状菌の細胞壁成分であるキチンの生合成反応を利用し、その中間体であるＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを生産する。したがって、炭素源および窒素源としては、キチンやキチンオリゴ糖以外の炭素源および窒素源を用いる。
原料として用いる炭素源としては、グルコース、フルクトース、シュークロース、ガラクトース、デキストリン、グリセロール、澱粉、水飴、糖蜜、動・植物油などが利用できる。また、窒素源としては、魚粉、大豆粉、小麦胚芽、コーンステイープリカー、綿実かす、肉エキス、ペプトン、酵母エキス、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、硝酸ナトリウム、尿素などを使用できる。そのほか必要に応じ、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、コバルト、マンガン、塩素、燐酸、硫酸あるいはその他のイオンを生成することができる無機塩類を培地中に添加することもできる。また、使用するＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン生産菌の生育を助け、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンの生産を促進するような無機物質および（または）有機物質を添加することもできる。

なお、炭素源および窒素源は培養開始時の培地に加えるだけでなく、培養中に追加することが好ましい。具体的には、炭素源、窒素源はその培養液中の濃度を測定し、完全に消費される前に添加することが望ましい。

トリコデルマ属糸状菌、トリコデルマハマタムＡＢ１０２８２（ＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｈａｍａｔｕｍＡＢ１０２８２）および、トリコデルマハルジアナムＡＢ１０２８３（ＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｈａｒｚｉａｎｕｍＡＢ１０２８３）株の生育に好適な培地としては、ポテト・デキストロース寒天培地、麦芽エキス寒天培地、あるいはＶ−８ジュース寒天培地が挙げられる。Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンの生産に好適な培地としては、実施例に示した培地のほか、ツアペック（改変）培地などが挙げられる。

Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン生産菌の培養方法は、好気的条件下での培養法が適しており、通気下の深部液体培養法も適している。培養温度は、１５〜３０℃が好適であり、２５〜３０℃がより好適である。Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンの蓄積量は、用いた培地の種類や培養条件によって異なるが、通常、振とう培養、静置培養、タンク培養とも３〜２０日間の培養で最高に達する。

Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを効率よく生産させる培養条件は、前記培地成分の組成、培養温度、撹拌速度、ｐＨ、通気量、種母の培養時間、種母の接種量などを、使用する生産菌株の種類および外部条件などに応じて、適宜に調節あるいは選択して設定する。液体培養において発泡がある場合は、シリコーン油、植物油あるいは界面活性剤などの消泡剤を単独または混合して適宜に培地に配合することができる。

培養の終了するためには、培養物中に生産されたＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンの蓄積量が最高に達した時点で培養を停止することが好ましい。Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンの単離はその培養物から、醗酵生産物を得る一般的な方法に準じてＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンの単離を行うのがよい。具体的には、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、活性炭処理、結晶化あるいは膜分離などにより、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを培地から単離することができる。

本発明を実施例により更に具体的に説明する。ただし、本発明は以下の態様に限定されない。

グルコース４．０％、硫酸アンモニウム０．１％、酵母エキス０．４％、硫酸マグネシウム０．０１％、リン酸二水素カリウム０．０２％、リン酸水素二カリウム０．１８％、ｐＨ無調整の培地１００ｍｌをバッフル付き５００ｍｌ容三角フラスコに入れ、トリコデルマ属糸状菌をスラントから一白金耳接種し、５日間、２７℃で回転数１８０ｒｐｍのロータリーシェーカーで好気培養した後、２日間２７℃で静置培養した。培養上清をＨＰＬＣで分析し、標準品のＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンと比較した結果、生産物質はすべての菌株においてＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンと同定された。
ＨＰＬＣ条件
カラム；Ｗａｋｏｓｉｌ５ＮＨ２カラム（φ４．６ｍｍ×２５０ｍｍ）、
移動相；アセトニトリル：水＝８０：２０、
流速；２ｍｌ／分、
カラム温度；２０℃、
検出；ＲＩ

培養を行ったトリコデルマ属糸状菌の菌株ごとのＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンの生産量を表１に示す。

紫外線照射による変異導入
トリコデルマハマタムＡＢ１０２８２ (ＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｈａｍａｔｕｍＡＢ１０２８２)の分生胞子を１０ｍｌのリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）に懸濁した。この胞子液をシャーレに移し、回転子を入れ、スターラーで回転させながら、２０Ｗ紫外線ランプを使用し、距離２０ｃｍ、３分間照射させた。紫外線照射後、胞子液を稀釈し、コーンスターチ４.０％、塩化アンモニウム０．１％、酵母エキス０．４％、硫酸マグネシウム０．１％、リン酸二水素カリウム０．０２％、リン酸水素二ナトリウム・１２水和物０．０８％、寒天１．５％、ｐＨ７．０の平板培地に広げ、生育したコロニーを分離した。分離したコロニーはコーンスターチ４.０％、塩化アンモニウム０．１％、酵母エキス０．４％、硫酸マグネシウム０．１％、リン酸二水素カリウム０．０２％、リン酸水素二ナトリウム・１２水和物０．０８％、ｐＨ７．０の培地５ｍｌを入れた試験管に接種し、２７℃で７日間振盪培養し、ＡＢ１０２８２株と比較してＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンの生産量が増加した変異株を選抜した。

Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンの生産
コーンスターチ４．０％、塩化アンモニウム０．１％、酵母エキス０．４％、硫酸マグネシウム０．１％、リン酸二水素カリウム０．０２％、リン酸水素二ナトリウム・１２水和物０．０８％、ｐＨ７．０の培地２００ｍｌをバッフル付き５００ｍｌ容三角フラスコに入れ、紫外線照射の変異処理によりＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンの生産量が増加した上記トリコデルマハマタム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｈａｍａｔｕｍ）変異株をスラントから一白金耳接種し、２７℃で回転数１８０ｒｐｍのロータリーシェーカーで好気培養し、６、７、８、１０および１２日目のそれぞれに５０％グルコース／５％酢酸アンモニウム溶液を２ｍｌずつ添加し、１５日間培養した。培養上清をＨＰＬＣで分析し、標準品のＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンと比較した結果、生産物質はＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンと同定された。前記培養により５ｍｇ／ｍｌのＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを含む培養液が得られた。

変異誘発剤による変異導入
トリコデルマハルジアナムＡＢ１０２８３（ＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｈａｒｚｉａｎｕｍＡＢ１０２８３）の分生胞子を４ｍｌのクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）に懸濁した。この胞子液にＮ−メチル−Ｎ−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジンを加え（最終濃度５０μｌ／ｍｌ）、３７℃で３０分間保温した。その後、遠心分離（３５００×ｇ）を行い、上澄み液を捨て、再度クエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）に懸濁、遠心操作により、胞子を洗浄した。Ｎ−メチル−Ｎ−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン処理した胞子液を稀釈し、コーンスターチ４．０％、塩化アンモニウム０．１％、酵母エキス０．４％、硫酸マグネシウム０．１％、リン酸二水素カリウム０．０２％、リン酸水素二ナトリウム・１２水和物０．０８％、寒天１．５％、ｐＨ７．０の平板培地に広げ、生育したコロニーを分離した。分離したコロニーはコーンスターチ４．０％、塩化アンモニウム０．１％、酵母エキス０．４％、硫酸マグネシウム０．１％、リン酸二水素カリウム０．０２％、リン酸水素二ナトリウム・１２水和物０．０８％、ｐＨ７．０の培地５ｍｌを入れた試験管に接種し、２７℃で７日間振盪培養し、ＡＢ１０２８３株と比較してＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンの生産量が増加した変異株を選抜した。

Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンの生産
コーンスターチ４．０％、塩化アンモニウム０．１％、酵母エキス０．４％、リン酸二水素カリウム０．０２％、リン酸水素二ナトリウム・１２水和物０．０８％、ｐＨ７．０の培地２００ｍｌをバッフル付き５００ｍｌ容三角フラスコに入れ、Ｎ−メチル−Ｎ−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジンの変異処理により、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンの生産量が増加した上記トリコデルマハルジアナム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｈａｒｚｉａｎｕｍ）変異株をスラントから一白金耳接種し、２７℃で回転数１８０ｒｐｍのロータリーシェーカーで好気培養し、６、７、８、１０および１２日目のそれぞれに５０％グルコース／５％塩化アンモニウム溶液を２ｍｌずつ添加し、１５日間培養した。培養上清をＨＰＬＣで分析し、標準品のＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンと比較した結果、生産物質はＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンと同定された。前記培養により３ｍｇ／ｍｌのＮ−ア
セチル−Ｄ−グルコサミンを含む培養液が得られた。

グルコース６.０％、塩化アンモニウム０．１％、酵母エキス０．６％、リン酸二水素カリウム０．０２％、リン酸水素二ナトリウム・１２水和物０．０８％、ｐＨ７．０の培地７５ｍｌをバッフル付き５００ｍｌ容三角フラスコに入れ、実施例２で得られた紫外線照射の変異処理によりＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンの生産量が増加したトリコデルマハマタム (Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｈａｍａｔｕｍ) 変異株をスラントから一白金耳接種し、２７℃で回転数１８０ｒｐｍのロータリーシェーカーで好気培養し、４、７、９、１１、１３日目に５０％グルコース／５％酢酸アンモニウム溶液を３ｍｌずつ添加した後、１５日間培養した。培養上清をＨＰＬＣで分析し、標準品のＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンと比較した結果、生産物質はＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンと同定された。前記培養により１３ｍｇ／ｍｌのＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを含む培養液が得られた。

グルコース６．０％、塩化アンモニウム０．１％、酵母エキス０．６％、リン酸二水素カリウム０．０２％、リン酸水素二ナトリウム・１２水和物０．０８％、ｐＨ７．０の培地２．０Ｌを４Ｌ容ジャーファーメンターに入れ滅菌後、あらかじめ前培養した、実施例２で得られた紫外線照射の変異処理によりＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンの生産量が増加したトリコデルマハマタム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｈａｍａｔｕｍ）変異株を接種し、培養温度２７℃、攪拌回転数４５０ｒｐｍ、通気量２Ｌ／ｍｉｎで３、５、７および９日目のそれぞれに５０％グルコース／５％酢酸アンモニウム溶液を２０ｍｌずつ添加し、２７℃で１０日間培養した。

培養上清のＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンをＨＰＬＣで測定した結果、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン濃度は１５ｍｇ／ｍｌであった。その培養液２．０Ｌの遠心上清を活性炭２００ｍｌ充填したカラムに通過させ、その後このカラムに２００ｍｌのイオン交換水を通過させた。その通過液を強酸性陽イオン交換樹脂デュオライト（登録商標）Ｃ−２０（Ｈ⁺型）２００ｍｌを充填したカラムに通過させ、その後このカラムに２００ｍｌのイオン交換水を通過させた。さらにその通過液を弱塩基性陰イオン交換樹脂デュオライト（登録商標）Ａ３７８Ｄ（ＯＨ^-型）２００ｍｌを充填したカラムに通過させ、その後このカラムに２００ｍｌのイオン交換水を通過させた。

通過液を減圧下濃縮乾固し、２０ｇの固形物を得た。これを蒸留水２０ｍｌに溶解した水溶液にアセトンを５０ｍｌ添加し、結晶化操作を行なったところ、純度９５％のＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンの結晶様粉末として１２ｇ得られた。このようにして得られた結晶様粉末のＮＭＲ分析を行なったところ、その¹Ｈ−ＮＭＲケミカルシフト値及び¹³Ｃ−ＮＭＲケミカルシフト値が、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンの文献値と一致した。

本発明のＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンの製造法は、安定したＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンの生産・供給を実現するものであり、該製造法を用いればＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを効率よく、安全で安価に製造することが可能となる。また、本発明の微生物は、上記Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンの製造法に、好適に使用することができる。

Claims

Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンの生産能を有するトリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）に属する糸状菌の非遺伝子組換え株を、キチンおよびキチンオリゴ糖以外のトリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）に属する糸状菌が資化しうる炭素源および窒素源を含む培地に培養し、培地中にＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを生成、蓄積させ、これを採取することを特徴とする、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンの醗酵生産方法。
前記炭素源および窒素源を追加しながら培養を行うことを特徴とする、請求項１に記載のＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンの醗酵生産方法。
Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンの生産能を有するトリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）に属する糸状菌の非遺伝子組換え株が、トリコデルマハマタム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｈａｍａｔｕｍ）、トリコデルマハルジアナム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ
ｈａｒｚｉａｎｕｍ）、トリコデルマリーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｒｅｅｓｅｉ）あるいはトリコデルマビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｖｉｒｉｄｅ）のいずれかの非遺伝子組換え株であることを特徴とする、請求項２に記載のＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンの醗酵生産方法。
Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンの生産能を有するトリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）に属する糸状菌の非遺伝子組換え株が、トリコデルマハマタムＡＢ１０２８２株（ＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｈａｍａｔｕｍＡＢ１０２８２ＦＥＲＭＢＰ−１０６２３）あるいはトリコデルマハルジアナムＡＢ１０２８３株（ＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｈａｒｚｉａｎｕｍＡＢ１０２８３ＦＥＲＭＢＰ−１０６２４）のいずれかであることを特徴とする、請求項３に記載のＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンの醗酵生産方法。
Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンの生産能を有する、トリコデルマハマタム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｈａｍａｔｕｍ）ＦＥＲＭＢＰ−１０６２３株あるいはトリコデルマハルジアナム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｈａｒｚｉａｎｕｍ）ＦＥＲＭＢＰ−１０６２４株。
トリコデルマハマタム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｈａｍａｔｕｍ）ＦＥＲＭＢＰ−１０６２３株あるいはトリコデルマハルジアナム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｈａｒｚｉａｎｕｍ）ＦＥＲＭＢＰ−１０６２４株に変異を導入することにより得られる、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンの生産能を有する変異株。