JP4791551B2

JP4791551B2 - 塩素イオン輸送の調節における活性に関する化合物のスクリーニング

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Publication number: JP4791551B2
Application number: JP2008546411A
Authority: JP
Inventors: ランゲ，フィリップ・エフ; フーアマン，イェンス・シー; イェンチュ，トーマス・ジェイ
Original assignee: ファーモス・バイオサイエンス・アクティーゼルスカブ
Priority date: 2005-12-20
Filing date: 2006-12-18
Publication date: 2011-10-12
Anticipated expiration: 2026-12-18
Also published as: ATE451620T1; DE602006011054D1; GB0525898D0; US20090170127A1; WO2007071645A1; US7851165B2; JP2009520196A; EP1963864A1; EP1963864B1

Description

本発明は、ＣｌＣ−７によって塩素イオン輸送を調節する上での活性またはＯｓｔｍ１の細胞内局在を調節する上での活性に関して、化合物をスクリーニングするための方法に関する。そのような塩素イオン輸送を成功裏に調節する化合物は、骨粗しょう症、およびパジェット病、ステロイド誘発性骨粗しょう症および骨転移などのがん亜型のような他の破骨細胞代謝性疾患などの、破骨細胞関連疾患の試験または治療における使用のための候補物質である。骨粗しょう症は、骨折の増加を導く、骨量の減少と骨微細構造の劣化によって特徴付けられる骨格脆弱性と定義される。骨粗しょう症性骨折の大部分は、閉経後の高齢女性において起こる（１）。

２つの細胞型、骨形成性骨芽細胞と骨分解性破骨細胞が、骨リモデリング過程の責任を担う（２、３）。破骨細胞は、骨基質に結合し、リソソームのエキソサイトーシスによって骨吸収区画および波状縁を形成する（４）。吸収区画の酸性化による骨の溶解は、破骨細胞Ｖ型Ｈ^＋ＡＴＰアーゼを通したプロトンの能動輸送によって媒介される（５〜８）。同時に、塩素イオンコンダクタンス（チャネルおよび／または起電性共役輸送体）を通した塩素イオンの受動輸送が電気的中性を保持する（９）。塩素輸送の防止は、迅速な膜の過分極を導き、さらなるプロトンの分泌を妨げ、従ってさらなる骨吸収の阻害を生じさせる（１０、１１）。酸性化を阻害する薬剤は、骨代謝性疾患のための既存の治療とは異なる作用機構を用いる。

塩素チャネルおよび輸送体は、形質膜および細胞内小胞に位置する膜貫通タンパク質の大きな群を含む。それらの役割は、塩の分泌と吸収の制御から膜電位、細胞小器官の酸性化および細胞容積ホメオスタシスの調節まで様々である（１２、１３）。塩素チャネルの３つの異なる構造ファミリー、すなわち、ＣＬＣ電位依存性塩素イオンチャネルおよび塩素イオンプロトン交換体、グリシン受容体およびγ−アミノ酪酸受容体を含有するリガンド依存性塩素イオンチャネル、およびＣＦＴＲ（嚢胞性線維症膜貫通コンダクタンスタンパク質）が特性決定されている。さらに、推定上の塩素チャネルの２つの付加的なファミリー、すなわち、ＣＬＩＣ（塩素イオン細胞内チャネル）およびＣＬＣＡカルシウム活性化塩素イオンチャネルが同定された。容積調節性陰イオンチャネル（ＶＲＡＣ）と呼ばれ、その分子同一性はまだ確立されていない、もう１つの塩素チャネルが、破骨細胞（１５〜１７）を含む大部分の哺乳動物細胞（１４）における電気生理学によって同定された。

ＣＬＩＣ、ＣＬＣＡおよびＶＲＡＣの機能はまだあまりよく理解されていないが、ＣＬＣチャネルおよび輸送体は、遺伝性疾患を導く突然変異の分析とノックアウトマウスの作製を通して特性決定された（１３）。ＣＬＣＮ７遺伝子内の突然変異は様々な形態の大理石骨病、例えば、常染色体優性大理石骨病ＩＩ（ＡＤＯＩＩ）、常染色体劣性大理石骨病（ＡＲＯ）および中間形態のＡＲＯ（ＩＡＲＯ）の症例（１８−２２）の原因である。さらに、Ｃｌｃｎ７の破壊はマウスにおいて重症の大理石骨病を導き、約７００％多い骨を有した（２２）。ＣｌＣの中で、ＣｌＣ−０、ＣｌＣ−１、ＣｌＣ−２およびＣｌＣ−Ｋは適切な塩素チャネルであることが示されたが（２３〜２５）、ＣｌＣ−４およびＣｌＣ−５は塩素プロトン交換体であることが示され（２３、２６）、塩素プロトン交換体の場合、ＣｌＣは２個の塩素に対して１個のプロトンを輸送すると提示されている（２７）。これは、電気生理学および酸性化測定によって示された。

ＣｌＣ−７（ＣＬＣＮ７遺伝子の発現産物）ならびにＣｌＣ−６は、電気生理学によって特性決定されず、従ってそれらが塩素チャネルまたは塩素プロトン交換体であるのかどうかは明らかにされていない。どちらの場合も、ＣｌＣ−７の役割は同じであり（吸収窩の酸性化）、その阻害は骨密度上昇を導く。

ＣｌＣ−７による塩素イオンの輸送を調節する能力に関して化合物をスクリーニングするための方法は、ＷＯ０２／０５９６１２およびＷＯ０２／０５９３５６において提案されている。これらの方法は、細胞または小器官における塩素イオン輸送についての代用物としての酸性化の測定に基づくものであった。しかし、ＣｌＣ−７による輸送の阻害剤の多くは、他の塩素チャネルまたは輸送体も阻害すると考えられる。従って、選択的阻害剤を見出そうとするには他の塩素チャネルに対してカウンタースクリーニングする必要がある。ＣｌＣ−７への直接の作用の選択性は、ＣＬＣタンパク質の配列相同性と構造的保存のために達成することが困難であると考えられる。

本発明は、塩素の機能的輸送のための、新たに発見されたＣｌＣ−７のもう１つ別のタンパク質（Ｏｓｔｍ１−大理石骨病関連膜貫通タンパク質１、Osteopetrosis-associated transmembrane protein 1, ＯＳＴＭ１遺伝子の産物）への依存性を利用する新しいアプローチに関する。この依存性は、ＣｌＣ−７とＯｓｔｍ１の間の相互作用（直接または間接的）によって媒介される。そこで、今や、付加的な分子、中でも特にタンパク質Ｏｓｔｍ１が、ＣｌＣ−７機能を調節し、従ってＯｓｔｍ１はまた、正常な破骨細胞機能のためにも必要であることが発見された。

従って、Ｏｓｔｍ１阻害剤（例えばＯｓｔｍ１発現を阻害する化合物）、またはＯｓｔｍ１とＣｌＣ−７の相互作用を撹乱させる化合物は、破骨細胞関連疾患の治療または予防のための適切な医薬化合物であり得る。

Ｏｓｔｍ１は、これまで機能が知られていなかった膜貫通タンパク質である。ＯＳＴＭ１遺伝子内の突然変異は、「ｇｒｅｙｌｅｔｈａｌ」と呼ばれるマウス自然突然変異体（２８）およびヒト患者（２８、２９）に関して示されたように、重症大理石骨病症候群を引き起こす。

同様に、塩素チャネルおよび輸送体のＣｌＣファミリーの後期エンドソーム／リソソームメンバーである（１２、２５）ＣｌＣ−７内の突然変異は、ヒトおよびマウスにおいて大理石骨病（２２）およびリソソーム蓄積症（３０）を引き起こす。

本発明者らは今や、両方のタンパク質が、様々な組織の後期エンドソームおよびリソソーム内、ならびに骨吸収破骨細胞の波状縁に共局在することを見出した。共免疫沈降法は、ＣｌＣ−７とＯｓｔｍ１が分子複合体を形成することを明らかにし、Ｏｓｔｍ１をＣｌＣ−７の新規βサブユニットとして示唆する。Ｏｓｔｍ１は、リソソームに達するためにＣｌＣ−７を必要とし、リソソームで、その高度にグリコシル化された内腔ドメインが切断される。ＣｌＣ−７のタンパク質レベルは、Ｏｓｔｍ１を欠くｇｒｅｙｌｅｔｈａｌマウスでは大きく低下し（ＲＮＡレベルは低下しない）、逆もまた同様であって、それらの相互作用がタンパク質の安定性にとって重要であることを示唆する。ＣｌＣ−７タンパク質のレベルは、破骨細胞を含むＯｓｔｍ１欠損組織および細胞では１０％未満に低下するので、Ｏｓｔｍ１突然変異は、今や、ＣｌＣ−７に依存する破骨細胞吸収窩の酸性化を低下させることによって大理石骨病を引き起こすことが分かる（２２）。ｇｒｅｙｌｅｔｈａｌマウスが、ＣｌＣ−７ノックアウトマウスとちょうど同じように（３０）、大理石骨病に加えてリソソーム蓄積と神経変性を示すという所見は、ＣｌＣ−７／Ｏｓｔｍ１複合体のより一般的な重要性を示唆する。

本発明は今や、試験化合物がＣｌＣ−７へのＯｓｔｍ１の結合を妨げるまたは阻害するかどうか、あるいは妨げるまたは阻害する程度を測定することを含む、ＣｌＣ−７によって塩素輸送を調節する上での活性に関して試験化合物をスクリーニングするための方法を提供する。

別の実施形態では、本発明は、試験化合物がＣｌＣ−７へのＯｓｔｍ１の結合を妨げるかどうかまたは妨げる程度を測定することを含む、Ｏｓｔｍ１の細胞内局在を調節する上での活性に関して、試験化合物をスクリーニングするための方法を提供する。Ｏｓｔｍ１の細胞内局在は、ＣｌＣ−７とのその相互作用によって影響され、ＣｌＣ−７の安定性を調節するので、ＣｌＣ−７とＯｓｔｍ１の相互結合への干渉は、試験化合物によって変化した局在化行動を生じさせる可能性が高い。

さらなる態様では、本発明は、試験化合物がＣｌＣ−７へのＯｓｔｍ１の結合を妨げるかどうかまたは妨げる程度を測定することを含む、ＣｌＣ−７とＯｓｔｍ１の相互作用を調節する上での活性に関して試験化合物をスクリーニングするための方法を提供する。

いずれの態様においても、本発明は、所望の性質に関して数多くの化合物をスクリーニングするように実施され得る。

他の塩素チャネルはＯｓｔｍ１と相互作用することが知られていない（および本発明者らは、それぞれＯｓｔｍ１とＣｌＣ−３およびＣｌＣ−６との間に相互作用が存在しないことを明らかにした）ので、Ｏｓｔｍ１とＣｌＣ−７の相互作用の遮断薬は、単にＣｌＣ−７単独へのその直接作用のために選択された化合物よりも、他の塩素チャネルおよび輸送体に対するＣｌＣ−７の機能活性を低下させる上で選択性を提供する可能性がより高い。ＣｌＣ−７とＯｓｔｍ１の間の相互作用は、何らかの中間体タンパク質または他の分子を通してではなく直接的であると思われ、それについての証拠を以下に提示する。しかし、相互作用が間接的である場合でも有効なはずである、細胞に基づく方法を本明細書で述べる。

そのような方法は、前記試験化合物の存在下で、ＣｌＣ−７、またはＯｓｔｍ１に結合することができるそのフラグメントを、Ｏｓｔｍ１またはＣｌＣ−７に結合することができるそのフラグメントに暴露すること、およびＣｌＣ−７またはそのフラグメントとＯｓｔｍ１またはそのフラグメントの間の結合が妨げられるまたは破壊されるかどうか、あるいは妨げられるまたは破壊される程度を測定することによって実施され得る。

Ｏｓｔｍ１およびＣｌＣ−７はどちらも、非常に多くの生物において発現され、機能性である。本発明を実施するとき、Ｏｓｔｍ１とＣｌＣ−７の両方が発現される生物、特に哺乳動物、例えばげっ歯動物（特にマウス）またはヒトのものから選択されるＯｓｔｍ１およびＣｌＣ−７を使用し得る。好ましくは、使用されるＯｓｔｍ１および使用されるＣｌＣ−７は同じ生物に由来するべきであるが、互いに結合する異なる起源のものも満足し得る。ヒトであるＯｓｔｍ１およびＣｌＣ−７の使用が好ましい。非ヒトＯｓｔｍ１およびＣｌＣ−７の中で、ヒトタンパク質により密接に相同であるものが好ましい。

以下では、Ｏｓｔｍ１に結合することができるＣｌＣ−７のフラグメントおよびＣｌＣ−７に結合することができるＯｓｔｍ１のフラグメントを「結合フラグメント」と称する。

前記暴露工程において、前記ＣｌＣ−７またはその結合フラグメントおよびＯｓｔｍ１またはその結合フラグメントの一方は固体支持体に固定化され得、他方および前記試験化合物は溶液中に存在し得る。そのような固体支持体は、マルチウェルプレート、テストストリップ、ビーズ、あるいは当分野で公知のまたは従来の他の支持体またはその等価物であり得る。

溶液中に存在するＣｌＣ−７またはその結合フラグメントあるいはＯｓｔｍ１またはその結合フラグメントは、放射性標識、酵素標識、例えば蛍光として、光を発するように刺激され得る標識などの、検出可能な標識を担持し得る。

スクリーニング方法はまた、前記暴露工程において、ＣｌＣ−７またはその結合フラグメント、Ｏｓｔｍ１またはその結合フラグメント、および試験化合物の全てが溶液中に存在するように実施され得る。

場合により、均一系または非均一系において、前記ＣｌＣ−７またはその結合フラグメントおよび前記Ｏｓｔｍ１またはその結合フラグメントは各々標識を担持し、前記標識の近接性は検出可能であり得る。

あるいは、ＣｌＣ−７およびＯｓｔｍ１は、リソソーム、エンドソーム、小胞体、ゴルジ装置、吸収窩に面した破骨細胞形質膜または他の細胞型における形質膜であり得る、細胞または細胞内小器官内にインサイチューで存在する。やはり、ＣｌＣ−７およびＯｓｔｍ１の各々は標識を担持し、前記標識の近接性は検出可能であり得る。

そのようなスクリーニング方法において、試験化合物の濃度は、適切には１０ｐＭ〜１０μＭ、例えば１００ｐＭ〜１０ｎＭ、例えば約１ｎＭであり得る。

本発明によれば、今や、Ｏｓｔｍ１がＣｌＣ−７機能にとって重要であることが発見された。従って、この相互作用を撹乱させ、それによってＣｌＣ−７を阻害する医薬様式は、骨粗しょう症および他の破骨細胞関連疾患などの、破骨細胞関連骨疾患を含む疾患に関する潜在的治療または予防薬として興味深い。上述したスクリーニング方法は、薬剤開発においてまたは公知の治療薬の作用機構を確認するときに使用され得る。

さらなる態様では、本発明は、被験者での破骨細胞関連骨疾患の治療、予防または緩和における、前記スクリーニング方法によりＣｌＣ−７とＯｓｔｍ１の間の相互作用の遮断薬として同定された化合物の使用に関する。

本発明の他の目的および用途は、以下の詳細な説明および実施例から当業者に明らかである。

場合により、Ｏｓｔｍ１と何らかの他の選択分子の間の相互作用をブロックしないまたはＣｌＣ−７と何らかの他の選択分子の間の相互作用をブロックしない化合物を選択するためにさらにスクリーニングし得る。

場合により、例えばＣｌＣ−Ｋとｂａｒｔｔｉｎ（Ｏｓｔｍ１に関連しない塩素チャネルβサブユニット）のようなタンパク質対へのブロック作用の欠如に関してスクリーニングすることにより、一般にタンパク質間の相互作用をブロックしない化合物を選択するためにさらにスクリーニングし得る（６１）。

ＣｌＣ−７／Ｏｓｔｍ１相互作用を阻害し、従ってＣｌＣ−７レベルまたは活性の下方調節によって骨吸収を阻害する化合物を同定するために、数多くのスクリーニング方法が使用され得る。アッセイは、この相互作用を潜在的に阻害し得る試験化合物の存在下でのＣｌＣ−７とＯｓｔｍ１の間の結合試験からなり得る。

あるいは、アッセイは、完全長形態でまたは相互作用に関与するそのようなタンパク質の部分（結合フラグメント）としてのみ存在するタンパク質（ＣｌＣ−７またはＯｓｔｍ１）の一方に結合する化合物を同定する予備スクリーニングアッセイ、およびそれに続く、２番目のパートナーとの相互作用の妨害についてのさらなる試験を含み得る。

あるいは、アッセイは、以下の図２に示すようにＯｓｔｍ１がリソソーム局在化のためにＣｌＣ−７を必要とするという所見に基づき、Ｏｓｔｍ１を後期エンドソーム／リソソームに標的することならびにＣｌＣ−７およびｌａｍｐ−１（リソソーム関連膜タンパク質）との共局在を阻害する化合物を同定するインビボスクリーニングアッセイを含み得る。これは、野生型細胞（内因性Ｏｓｔｍ１を検査する）またはＣｌＣ−７^−／−欠損線維芽細胞（エピトープタグＣｌＣ−７およびＯｓｔｍ１の過剰発現に関して）で実施され得る。

適切な方法は、完全長タンパク質を使用して、または相互作用に関与するタンパク質のフラグメントを使用して、または一方のタンパク質を完全長形態でおよび他方を結合フラグメントとして使用して適用できる。

以下に例示するように（実施例１〜３参照）、適切な試験化合物の存在下でタンパク質または適切なフラグメントの相互作用を試験するために、免疫沈降法およびＨｉｓタグ精製が使用できる。すなわち、免疫沈降スクリーニングアッセイでは、ＣｌＣ−７とＯｓｔｍ１（独立して、全長タンパク質としてまたは結合フラグメントとして）を試験化合物と共にインキュベートし、次にＣｌＣ−７またはＯｓｔｍ１に特異的な抗体を使用して免疫沈降させ得る。共免疫沈降は様々な方法で検出し得る。沈殿物をゲルにロードし、移動させて、前記タンパク質の他方に対する標識抗体でのウエスタンブロット法によって検出し得る。沈殿物を洗浄し、その後他方のタンパク質に対する標識抗体で染色し得る。あるいは、相互作用パートナーを放射性標識し、ＳＤＳ−ｐａｇｅまたは放射能計数によって検出することができる。

Ｈｉｓタグ沈降は以下のように実施され得る。ＣｌＣ−７、Ｏｓｔｍ１あるいはそれらの１つの結合フラグメントを、Ｈｉｓアミノ酸、例えばＨｉｓ_６の配列によりＣ末端またはＮ末端で適切に伸長された修飾形態で組換え発現させる。これは、Ｈｉｓタグタンパク質をＮｉ−ＮＴＡビーズなどのビーズにより捕捉することを可能にする。次に、ロードされたビーズを、他方のタンパク質または結合フラグメントおよび試験化合物に暴露させることによって、（試験化合物が有効でない場合）両方のタンパク質のビーズへの結合を生じさせる。適切な洗浄ステップ後に、ビーズ上の両方のタンパク質の存在を、ビーズを標識抗体で直接染色することによって、または結合タンパク質をビーズから除去し、その後前記の他方のタンパク質またはフラグメントの存在を検出するためにウエスタンブロット法（または上記のような放射能検出）を実施することによって、測定することができる。

スクリーニングのためのハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）適合形式が、参考文献６２（Ｚｈａｏｅｔａｌ．）に述べられているＥＬＩＳＡシステムとして提供され得る。タンパク質の一方（またはその結合フラグメント）を、精製タンパク質とＭａｘｉｐｒｏｐ（商標）プレートを使用することなどにより、プレートまたは等価固体支持体に直接固定するか、あるいはＯｓｔｍ１またはＣｌＣ−７に対する抗体（ビオチニル化すればストレプトアビジンプレートに結合できる）を使用することなどにより、間接的に固定する。それぞれ相互作用パートナーＣｌＣ−７またはＯｓｔｍ１による抽出物と選択試験化合物をプレートの各々のウェルでインキュベートする。洗浄後、酵素標識（例えばペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）標識）特異性抗体あるいは抗特定種、例えば抗ウサギまたは抗マウスＰＯＤ抗体によって認識される特異性抗体を用いて相互作用パートナーを検出するために二次抗体を使用する。標識抗体の存在を検出する、例えばＰＯＤ抗体を３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質で検出する。着色は相互作用パートナーの存在を指示する。化合物がこの相互作用を妨害することができる場合、着色は失われる。光学密度は９６ウェルプレートにおいてＥＬＩＳＡリーダーで検出でき、このアッセイはＨＴＳ用に最適化することができる。

同様のアッセイがＦｌａｓｈｐｌａｔｅｓと放射性標識を用いて開発できる（３１）。Ｆｌａｓｈｐｌａｔｅｓ（商標）（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）は、シンチラントの薄層で永続的に被覆された９６ウェルマイクロプレートである。その原理は上述したＥＬＩＳＡアッセイと同様である。タンパク質（またはその結合フラグメント）の１つをウェルに固定する。グリコシル化タンパク質に結合する特異的ＷＧＡＦｌａｓｈｐｌａｔｅを、Ｏｓｔｍ１を固定するために使用できる。２番目のタンパク質は放射性標識される必要がある。これは、タンパク質を過剰発現する細胞を、Ｓ^３５メチオニンおよびＳ^３５システインを含む媒質中で培養することによって達成できる。あるいは、放射性標識抗体と結合させ得る。化合物とのインキュベーションおよび洗浄後、Ｗａｌｌａｃ計数器などのシステムを用いて放射能を測定する。化合物が相互作用を妨げる場合、放射性タンパク質はシンチラントから離れすぎてそれを活性化することができない。

放射能と近接性を用いるもう１つの適切な方法は、ＳＰＡシステム（３２、３３）：シンチレーション近接アッセイである。抗マウスまたは抗ウサギ抗体を有するビーズならびにＨｉｓタグタンパク質を固定できるニッケルキレートビーズが入手可能である。これらのビーズを、一方のタンパク質またはその結合フラグメントを固定するために使用する。例えばタンパク質を、マウスにおいて作製されたそのタンパク質についての抗体に結合し、その複合体を抗マウス抗体によってビーズに結合し得る。２番目のタンパク質またはその結合フラグメントを上述したように放射性標識し、ビーズおよび試験する化合物と共にインキュベートする。Ｆｌａｓｈｐｌａｔｅｓアッセイと同様に、ビーズ内に含有されるシンチラントは放射性標識タンパク質の結合後にのみ活性化される。

タンパク質／タンパク質相互作用の他の検出方法も使用可能であり、化合物が相互作用を妨げ得るかどうかを検出するために使用できる。それらは、一連の無標識相互作用スクリーニング方法（３４）を含む。これらは、光学バイオセンサー（ＡｆｆｉｎｉｔｙＳｅｎｓｏｒｓ，Ｂｉａｃｏｒｅ，ＨＴＳｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＩＢＩＳ，ＳＲＵＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、アコースティックバイオセンサー（Ａｋｕｂｉｏ）または微小熱量測定法（ＭｉｃｏＣａｌ，Ｔｈｅｒｍｏｍｅｔｒｉｃ，ＣａｌｏｒｉｍｅｔｒｙｓｃｉｅｎｃｅｓＣｏｒｐ．，３ＤＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｖｉｖａｃｔｉｓｓ）に基づく方法を使用する。

Ｂｉａｃｏｒｅ（表面プラスモン共鳴）システムだけを本明細書で詳細に説明するが、その他の方法も適用できる。一方のタンパク質またはその結合フラグメントを金属表面、好ましくはプリズム上の金に固定する。結合タンパク質を試験化合物および他方のタンパク質またはその結合フラグメントに暴露する。偏光をプリズムに入射することにより、表面の後ろ側からの反射の臨界角を記録する。この反射光の角度は表面層の分子の質量に依存するので、前記方法は、２番目のタンパク質の結合および化合物によるこの結合の置換または防止を検出することができる。

完全長タンパク質の間の相互作用に関与するそれぞれのタンパク質の部分はまだ決定されていない。しかし、この情報は、ＣｌＣ−７のフラグメントとＯｓｔｍ１の間の相互作用またはＣｌＣ−７とＯｓｔｍ１のフラグメントの間の相互作用を検出するために上述した技法のいずれかを実施することによって獲得できる。一方または両方のタンパク質のコード配列の部分だけを（例えば細胞内ドメインまたは細胞外ドメインまたは様々な膜貫通ドメインだけを単独でまたは組み合わせて）組換え発現させ得る。上述した相互作用試験は、どのフラグメントが相互作用を維持するために必要であるかを同定するためにこれらのフラグメントに関して実施し得る。また、酵母ツーハイブリッド技法においてＣｌＣ−７およびＯｓｔｍ１のフラグメントを試験することによっても相互作用ドメインを検出し得る。

蛍光偏光アッセイ（３５、３６）は、完全長タンパク質（Ｏｓｔｍ１またはＣｌＣ−７）と、発蛍光団（例えばフルオレセイン）に融合される相互作用パートナー（それぞれＣｌＣ−７またはＯｓｔｍ１）の適切に小さなフラグメントの間で実施し得る。小フラグメントが結合せず、偏光で励起されるときは、発蛍光団の回転のために偏光を消失させる。小フラグメントが完全長相互作用パートナーに結合するときは、光は偏光したままである。従って、相互作用を妨害する化合物をこのアッセイでスクリーニングすることができる。発せられる光は、偏光フィルターを通して検出する必要がある。ＨＴＳ適合性リーダーは、Ｔｅｃａｎ，ＢＭＧＬａｂＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＬＪＬＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓａｎｄＪｏｌｌｅｙＣｏｎｓｕｌｔｉｎｇａｎｄＲｅｓｅａｒｃｈＩｎｃ．において入手可能である。

濾過アッセイは、参考文献（３１）で一般的に述べられているように使用し得る。

濾過アッセイはまた、完全長タンパク質（Ｏｓｔｍ１ｓまたはＣｌＣ−７）と、発蛍光団（例えばフルオレセイン）に融合されるまたは放射性標識される相互作用パートナー（それぞれＣｌＣ−７またはＯｓｔｍ１）の結合フラグメントの間での相互作用アッセイからなり得る。相互作用パートナーを試験化合物と共に緩衝液中でインキュベートした後、小さなフラグメントは通過させるが完全長タンパク質は通さない膜上で調製物を遠心分離する。フラグメントが完全長タンパク質と相互作用する場合は、どちらも膜を通過せず、上清は蛍光性または放射性のままである。

蛍光（またはＦｏｅｒｓｔｅｒ）共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）は、供与体と受容体の間の非放射性エネルギー転移に基づく（３７、３８、３９、４０、４１）。供与体は、タンパク質（または結合フラグメント）の１つに、その相互作用部位に近接して固定する。前記タンパク質は、組換え発現ＣｌＣ−７または第一発蛍光団（例えばシアン蛍光タンパク質−ＣＦＰ）に融合したＯｓｔｍ１との相互作用部位を保持するフラグメントであり得る。２番目のタンパク質は、その相互作用部位に近接して受容体に融合するか、またはタンパク質と相互作用するフラグメントだけを使用する。２番目のタンパク質は、ＣｌＣ−７と相互作用するＯｓｔｍ１のドメインであり得る。Ｏｓｔｍ１またはその結合フラグメントは、黄色蛍光タンパク質−ＹＦＰなどの受容体に融合し得る。多くの異なる受容体と供与体対が広く使用され、全てがこのアッセイにおいて使用できる。受容体は蛍光であるかまたは蛍光でなくてもよく、ＦＲＥＴは、受容体の感作蛍光の出現によって、供与体／受容体の強度比の変化によって、供与体の蛍光低下によって、または供与体の蛍光寿命の変化によって検出される。両方の融合タンパク質を組換え発現させ、抽出物を調製して、それらを試験する化合物と共にまたは試験化合物なしで（対照）インキュベートする。あるいは、アッセイは、生細胞または固定細胞において実施し得る。より好ましくないが、インビトロ法を実施するために非タンパク質発色団をタンパク質に化学結合してもよい。

ＣＦＰを４５２ｎｍで励起するとき、ＹＦＰの励起波長である５０５ｎｍの蛍光波長を発する。ＹＦＰは次に、ＣＦＰに近接している場合、従ってＣｌＣ−７とＯｓｔｍ１のフラグメントが相互作用するときにのみ、５２７ｎｍで発光する。化合物が相互作用を妨げる場合、同時にＹＦＰの励起および５２７ｎｍでの発光も妨害する（３５）。

非蛍光受容体は、ＥＤＡＮＳ／ダブシルまたはピナシアノール／ＥＧＦＰなどの他の対の供与体−受容体において認められる（４２）。この場合、ＥＧＦＰへのピナシアノールの近接（どちらも１つの相互作用パートナーに融合している）を導く相互作用後、５１０ｎｍでのＥＧＦＰ蛍光がそれに応じて低下する。

供与体または受容体の蛍光の変化は、強度測定としてまたは時間分解的に測定し得る。記録は分光蛍光計（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅｓ）で実施でき、ＨＴＳ形式として設定できる。

上記技法は、蛍光相関分光法（Ｅｖｏｔｅｃ）（４３）を使用して生細胞に適用できる。本方法は共焦点顕微鏡検査を使用し、標識リガンドが細胞内でその受容体に結合し得るかどうかを検出できる。これはまた、上述したＦＲＥＴ法を用いてタンパク質間相互作用のインサイチュー検出に適合させ得る。Ｏｓｔｍ１を後期エンドソーム／リソソームに標的することならびにそこでのＣｌＣ−７およびｌａｍｐ１との共局在を阻害する化合物を同定するため、以下の方法や他の方法が適用できる。内因性または過剰発現されるＣｌＣ−７およびＯｓｔｍ１タンパク質を、抗ＣｌＣ−７および抗Ｏｓｔｍ１抗体と共に生細胞または固定細胞をインキュベートし、その後蛍光色素または酵素に結合したマッチする二次抗体と共にインキュベートすることにより、間接的に観測することができる。あるいは、ＣｌＣ−７またはＯｓｔｍ１に融合した蛍光タンパク質を、細胞における過剰発現後に直接観測できる。ＣｌＣ−７への結合に依存することが本明細書で示される、後期エンドソーム／リソソームへのＯｓｔｍ１の適切な標的を阻害する所与の化合物の潜在能は、ｌａｍｐ１などのリソソームタンパク質とＯｓｔｍ１の共局在の量として測定できる。データの獲得は、マクロタイタープレートでの生細胞または固定細胞の顕微鏡検査または共焦点顕微鏡検査を用いて実施できる。

添付の図面を参照しながら本発明をさらに説明し、例示する。

図１ｃは、Ｏｓｔｍ１プロモーターおよびエクソン１の欠失を担持する（２８）大理石骨病マウス突然変異体（４５）である、ｇｒｅｙ−ｌｅｔｈａｌ（ｇｌ）マウスでは存在しない、約８０ｋＤのＯｓｔｍ１バンド（黒い矢じり）と約３５〜４５ｋＤの二重項（白い矢じり）を明らかにする脳膜タンパク質のウエスタンブロットを示す。

Ｏｓｔｍ１に対する抗体（ペプチドＣ−ＬＫＳＳＴＳＦＡＮＩＱＥＮＡＴ）をモルモットおよびウサギにおいて惹起し、ＫＯ組織への特異性に関して試験した

図１ｄにおいて、ロイペプチンとの線維芽細胞のインキュベーションは大型Ｏｓｔｍ１種の割合を増大させた。同様の結果が、カテプシンＢ、ＬおよびＳの阻害剤であるＥ６４に関して得られた（データは示していない）。従って、細胞をプロテアーゼ阻害剤と共にインキュベートすることは、より小さなものを代償にして大きなバンドの割合を上昇させ（図１ｄ）、小型形態が約８０ｋＤタンパク質のタンパク質分解切断によって生産されることを指示した。Ｏｓｔｍ１種の見掛けの大きさは、タンパク質のほぼ中央での切断を示唆する（図１ｂ）。

図１ｅにおいて、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離した脳タンパク質のウエスタンブロットは、還元条件下で認められた大型と小型形態に対し、１つの大きなＯｓｔｍ１特異的バンドを示した。従って、切断されたフラグメントは、Ｏｓｔｍ１の内腔ドメインに豊富に存在するシステインの一部の間でのジスルフィド結合によって連結されると考えられる（図１ａ）。

最近の研究で、Ｏｓｔｍ１（ＧＩＰＮとして独立してクローン化された）のためのＥ３ユビキチンリガーゼ機能が提案された（４４）。Ｏｓｔｍ１のアミノ末端とカルボキシ末端疎水性領域の間のストレッチ（図１ａ）は、ＲＩＮＧ−フィンガータンパク質に弱い相同性を示し、サイトゾルであることが示唆された（４４）。しかし、このストレッチは、Ｎ結合型グリコシル化のためのいくつかのコンセンサス部位を含有する（タンパク質の他のいかなる部分も前記コンセンサス部位を含まない）。図１ｆのウエスタンブロットにおいて、ＰＮＧアーゼＦによる脱グリコシル化は、還元条件下で検出される全てのＯｓｔｍ１種の大きさを低減させ、これらの部位のいくつかまたは全部が使用されることを明らかにした。認められたグリコシル化は、仮説上のＲＩＮＧ−フィンガードメイン（４４）を、ユビキチンリガーゼのサイトゾル／核質活性（４６）と一致させることが難しい局在である、小胞体（ＥＲ）の内腔に位置づけた。トランスフェクトした細胞における、アミノ末端に付加したＨＡエピトープの消失は、切断可能なシグナルペプチドの存在を指示した（データは示していない）。図１ｆはまた、最大の脱グリコシル化バンドの見掛け分子量がＯｓｔｍ１リーディングフレームからの予測とほぼ一致する（約３７ｋＤａ）ことを明らかにした。小型種の脱グリコシル化は単一バンドを生じたので、二重項は不均一なグリコシル化によるものである。

本発明者らはまた、膜貫通ドメインとして機能すると予測される、２番目の疎水性ストレッチの前でトランケートされたＯｓｔｍ１突然変異体を検討した。図１ｇでは、Ｏｓｔｍ１を発現するＨＥＫ２９３細胞（レーン１＋３）またはヒト突然変異を模倣する（４４）トランケート形態（レーン２＋４）の細胞（レーン１＋２）および上清（レーン３＋４）のウエスタンブロットが示されている。両方のタンパク質は、検出に関してＣ末端ＨＡエピトープを有する。この突然変異体はトランスフェクト細胞の上清中に分泌されたが、野生型Ｏｓｔｍ１は分泌されなかった（図１ｇ）。従って１番目と２番目の疎水性ドメインは、Ｖａｃｈｅｒｅｔａｌ．（２８）のＩ型膜貫通タンパク質モデルと一致して、それぞれ切断可能なシグナルペプチドおよび膜貫通ドメインとして働く（図１ｂ）。

次に図２に示す結果を見ると、培養した一次線維芽細胞において、Ｏｓｔｍ１は、後期エンドソームおよびリソソームについてのマーカーであるｌａｍｐ−１と共局在したことが分かる（図２ａ）。この局在は、同じくその喪失が大理石骨病を引き起こす、ＣｌＣ−７のものと類似していた（２２）。しかし、線維芽細胞をＯｓｔｍ１で一過性にトランスフェクトしたとき（図２ｂ）、ｌａｍｐ−１との有意の共局在は認められず、Ｏｓｔｍ１染色はむしろＥＲを示唆した。ＣｌＣ−７とのコトランスフェクションは、主としてｌａｍｐ−１（図２ｃ）およびＣｌＣ−７（図２ｄ）について共染色される点状のＯｓｔｍ１パターンを回復した。どちらもエンドソーム／リソソーム経路で発現される（１２、４７）、ＣｌＣ−３（示していない）またはＣｌＣ−６（図２ｅ）とのコトランスフェクションはそのような変化を生じさせなかったので、ＣｌＣ−７の作用は特異的であった。

ＣｌＣ−７はＯｓｔｍ１の局在を変化させたので、本発明者らはＣｌＣ−７ノックアウト（Ｃｌｃｎ７^−／−）マウスにおいてＯｓｔｍ１を検討した。ウエスタンブロット法は、驚くべきことに、Ｃｌｃｎ７^−／−脳において３５〜４５ｋＤのＯｓｔｍ１二重項の排他的喪失を指示した（図３ａ）。野生型脳の細胞分画は、小さなＯｓｔｍ１形態がリソソームマーカーと共富化されたことを明らかにしたが（底部画分、１〜２）、８０ｋＤａ形態はエンドソームおよびＥＲについてのマーカーを含有する画分９〜１２においてのみ検出可能であった（図３ｂ）。そのような実験は、脱グリコシル化のために使用される小型（リソソームを含有する野生型画分）または大型（エンドソーム／ＥＲを含有するＣｌｃｎ７^−／−画分）Ｏｓｔｍ１形態だけを含む試料を提供した。ＰＮＧアーゼＦは両方の種の大きさを低減したが（図３ｃ、レーン２および４）、３５〜４５ｋＤ形態だけはＥｎｄｏＨに対して部分的に抵抗性であった（図３ｃ、レーン２と６を比較する）。これは、小型種はＥＲから出て行ったが、大型種はＥＲから出なかったことを示唆した。本発明者らの結果は、従って、ＣｌＣ−７はＯｓｔｍ１をＥＲからリソソームへと移動させるために必要であること、およびＯｓｔｍ１の内腔ドメインはこの最終区画への途中でまたは最終区画内で切断されることを示す。

ＣｌＣ−７は、Ｏｓｔｍ１で脳から効率よく共免疫沈降することができ、逆もまたは同様であった（図３ｄ）。この相互作用は、関連するエンドソームＣｌＣ−３およびＣｌＣ−６タンパク質、あるいはｌａｍｐ−２では認められなかったので、特異的であった。ＣｌＣ−７のリソソーム局在から予想されるように（３０）、ＣｌＣ−７に対する抗体は、脳からの切断されたリソソームＯｓｔｍ１フラグメントをほとんど排他的に沈降させた。トランスフェクトした細胞に関して実施した共免疫沈降法は、大型形態だけが検出できたが、この推定上のＥＲ形態もＣｌＣ−７と相互作用することを示した（図６）。驚くべきことに、図３ｄはまた、ｇｌ脳の抽出物においてＣｌＣ−７レベルが大幅に低下していることを明らかにした（レーン３）。

ＣｌＣ−７およびＯｓｔｍ１はどちらも、脳、肝臓、腎臓および破骨細胞を含む多くの組織で発現される（２２、２８、３０、４４、４８）。脳切片の免疫組織化学は、両方のタンパク質が、おそらく後期エンドソーム／リソソームである構造の神経細胞体に共局在することを明らかにした（３０）（図４ａ）。ｇｒｅｙ−ｌｅｔｈａｌ（ｇｌ）ニューロンでは（図４ｂ）、両方のタンパク質が検出不能であった。両タンパク質はまた、「波状縁」を表わすパターンで破骨細胞に共局在した（図４ｃ）。この酸分泌性形質膜ドメインは、同じくその中での突然変異が大理石骨病の基礎となる（５０〜５４）、ａ３プロトンポンプサブユニットについての共染色によって同定された（図４ｄ）（４９）。

本発明者らのウエスタンブロット分析と一致して（図３ａ、ｂ、ｄ）、Ｏｓｔｍ１染色はＣｌｃｎ７^−／−マウスにおいて非常に弱く、一方ＣｌＣ−７レベルはｇｒｅｙ−ｌｅｔｈａｌ細胞において大幅に低かった。これらの細胞はニューロン（図４ｂ）および破骨細胞（図４ｅ）を含み、それらにおいては、ＣｌＣ−７の残りの部分はまだ波状縁に局在した。ウエスタンブロット法は、ｇｌ脳においてＣｌＣ−７の強い低下を明らかにしたが、ＣｌＣ−３、ＣｌＣ−６、ｌａｍｐ−１およびｌａｍｐ−２の低下を示さなかった（図４ｆ）。脳、腎臓、肝臓および骨からのウエスタンブロットの定量は、ｇｌマウスにおけるＣｌＣ−７の低下を示したが、試験した他の後期エンドソーム／リソソームタンパク質（ＣｌＣ−３、ＣｌＣ−６、ｌａｍｐ−１／−２、Ｈ^＋−ＡＴＰアーゼａ３、図４ｇ）の低下を示さなかった。骨における対照タンパク質の中等度の低下は、ｇｌマウスの大理石骨病によって説明され得る。このウエスタンブロット分析は、ＣｌＣ−７がｇｌマウスでは１０％未満に低下することを明らかにした（図４ｆ、ｇ）。ｇｌ組織におけるＣｌＣ−７の転写産物レベルまたはＣｌｃｎ７^−／−マウスにおけるＯｓｔｍ１の転写産物レベルはいずれも変化しなかった（データは示していない）。

ＣｌＣ−７は、破骨細胞の吸収窩を酸性化するＨ^＋−ＡＴＰアーゼを電気的にシャントすることによって（２２）、または同様に、Ｃｌｃｎ７^−／−およびｇｌ破骨細胞の両方において十分に発達していない（２２、４５）、プロトンポンプを含有する小胞の波状縁への挿入を促進することによって、骨吸収を支持し得る。この機構はまた、ＣｌＣ−７が、これまで信じられてきたように（２２、４８）、Ｃｌ⁻チャネルではなく、ＣｌＣ−ｅｃ１（２７）、ＣｌＣ−４およびＣｌＣ−５（２３、２６）のような起電性Ｃｌ⁻／Ｈ^＋交換体であるとしても、実施可能である（２３）。ＣｌＣ−７の細胞内局在は生物物理学的分析を不可能にするので、これらの選択肢は試験されないままである。本発明者らの研究は、Ｏｓｔｍ１の喪失が、ＣｌＣ−７の量を病原性レベルまで低下させることによって大理石骨病を引き起こす（２８、２９、５５）ことを示唆する。ドミナントネガティブ突然変異によるＣｌＣ−７機能の７５％低下が既に、ヒトにおいて軽度の大理石骨病を生じさせる（２０、５３）。ｇｌマウスにおけるさらに一層低レベルのＣｌＣ−７は、ＯＳＴＭ１突然変異に関して認められた重症大理石骨病を引き起こすのに十分であると考えられる（２８、２９、５５）。

ヒトＯＳＴＭ１遺伝子における公知の疾患を引き起こす突然変異（２８、２９）は、Ｏｓｔｍ１ポリペプチドを膜貫通ドメインの前で短い無関係な配列１４３または２１残基によって置換する（２８、２９）フレームシフトを導入する。後者の突然変異をモデルとするエピトープ標識構築物（２８）（図１ａ）を細胞にトランスフェクトしたとき、ＣｌＣ−７との共発現はトランケート型Ｏｓｔｍ１をリソソームに差し向けることができず（データは示していない）、トランケート型タンパク質は上清中に分泌された（図１ｇ）。従って、この突然変異体はもはやＣｌＣ−７と相互作用しないので、疾患を導き得る。

Ｃｌｃｎ７^−／−およびｇｌマウスの表現型は著しく類似する。アグーチのバックグラウンドで、ＣｌＣ−７ノックアウトマウスの毛皮は、ｇｒｅｙ−ｌｅｔｈａｌマウスの毛の色とまさに同じように（２８、５６）、灰色である（データは示していない）。ＣｌＣ−７の破壊は大理石骨病を引き起こすだけでなく（２２）、リソソーム蓄積症（２２、３０）に関連する網膜（２２、３０）およびＣＮＳ（２２、３０）変性を生じさせる。本発明者らは、ｇｒｅｙ−ｌｅｔｈａｌマウスにおいて同様の網膜および海馬変性を検出した（図４ｈ−ｉ）。Ｃｌｃｎ７^−／−マウス（３０）と同様に、それらはニューロンおよび腎近位尿細管細胞内に電子密度の高い蓄積物質を示し、おそらくリソソーム形成の間の変化した酸性化、またはリソソーム塩素イオンの役割を指摘する（２３、２８）。合わせて考慮すると、ＣｌＣ−７／Ｏｓｔｍ１複合体はまた、メラノサイトおよびリソソームの機能にとっても重要である。ＯＳＴＭ１突然変異を有する患者は、大理石骨病に加えてリソソーム蓄積症を発現し得る。

本発明者らの研究は、これまで未知であったＣｌＣ−７の補助βサブユニットとしてＯｓｔｍ１を同定した。Ｏｓｔｍ１はリソソームに移動するためにＣｌＣ−７を必要とするが、ＣｌＣ−７はＯｓｔｍ１なしでその目的地に到達できる。ＣｌＣ−７の安定性はＯｓｔｍ１とのその結合に依存する。著明なグリコシル化はリソソーム膜タンパク質を分解から保護すると考えられるので（５７、５８）、高度グリコシル化Ｏｓｔｍ１タンパク質は、Ｎ結合型グリコシル化部位を欠く唯一の哺乳動物ＣＬＣであるＣｌＣ−７をリソソームプロテアーゼから保護すると推測し得る。Ｏｓｔｍ１の喪失に伴って認められる大理石骨病、リソソーム蓄積および神経変性は、ＣｌＣ−７タンパク質レベルの著しい低下によって完全に説明され得る。

本発明を以下の実施例によってさらに説明し、例示する。

免疫沈降法
ＣｌＣ−７およびＯｓｔｍ１は、内因性物質（図３ｄ）または過剰発現タンパク質（図６）を使用して共免疫沈降させ得る。図３ｄで見られるように、ＣｌＣ−７はＯｓｔｍ１で脳から効率よく共免疫沈降され、逆もまた同様であった。共免疫沈降法はＣｌＣ−７／Ｏｓｔｍ１複合体を明らかにする。表示されている遺伝子型からの可溶化脳膜をゲルの直接負荷するか（投入、レーン１〜３）、または最初にＣｌＣ−７（レーン４、５）またはＯｓｔｍ１抗体（レーン６、７）で免疫沈降させた。

Ｏｓｔｍ１またはＣｌＣ−７抗体を、ジメチルピメリミデートによってプロテインＡセファロースに架橋した。脳膜をペレット化し、溶解緩衝液（ＭＥＳ緩衝食塩水、ｐＨ６．５、１％トリトンＸ−１００、２．５ｍＭＣａＣｌ_２、２．５ｍＭＭｇＣｌ_２）に可溶化した。非可溶化物質を７０，０００×ｇでの遠心分離によって除去した。試料をプロテインＡセファロース抗体複合体と共に４℃で２時間インキュベートし、溶解緩衝液で４回洗浄した。０．１Ｍグリシン／Ｃｌ１００μｌ、ｐＨ２．８での溶出後、試料を中和し、ＳＤＳ試料緩衝液を用いて変性した。等しい量の溶解産物と沈殿物をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離した。

生じたウエスタンブロットを、右側に示すタンパク質に関してプローブした。矢じり、特異的Ｏｓｔｍ１バンド；^＊、非特異的バンド。等しい量の溶解産物と沈殿物を負荷した。

試験化合物の存在下でのこの工程の反復は、ＣｌＣ−７のＯｓｔｍ１への結合を妨げる能力に関してそのような化合物をスクリーニングする。

図６を参照して、Ｏｓｔｍ１を、リン酸カルシウム沈殿法を用いてＨＥＫ２９３細胞において指示されているＣｌＣタンパク質と一過性に共発現させた。２４〜４８時間後、細胞をＨＢＳ、ｐＨ７．４中で採集し、１０００×ｇでペレット化して、１％トリトンＸ−１００、ＭｇＣｌ_２およびＣａＣｌ_２各々２．５ｍＭおよびｃｏｍｐｌｅｔｅ（Ｒｏｃｈｅ）プロテアーゼ阻害剤を含有するＨＢＳに溶解した。２００００×ｇでの遠心の上清を共免疫沈降法のために使用した。Ｏｓｔｍ１に対する抗体を、ＰＢＳ中のプロテインＡセファロースと共に攪拌しながら室温で１時間インキュベートした。それらを０．２Ｍホウ酸ナトリウムｐＨ９で２回洗浄し、次いでホウ酸緩衝液中の５．２ｍｇ／ｍｌジメチルピメリミデート（Ｐｉｅｒｃｅ）で３０分間、抗体をプロテインＡセファロースに架橋した。０．２Ｍグリシン／Ｃｌ、ｐＨ２．５で洗浄することによって反応を停止させた。タンパク質試料を架橋抗体と共に４℃で２時間インキュベートし、溶解緩衝液１ｍｌで４回洗浄して非結合物質を除去した。結合タンパク質を０．１Ｍグリシン／Ｃｌ、ｐＨ２．８１００ｍｌで溶出し、中和して、ＳＤＳ試料緩衝液を用いて編成した。試料をＯｓｔｍ１および様々なＣｌＣに対するウエスタンブロット法によって分析した。

Ｏｓｔｍ１が免疫沈降したとき、ＣｌＣ−７は共沈降したが、ＣｌＣ−３およびＣｌＣ−６はＯｓｔｍ１と共沈降しなかった。

Ｈｉｓタグ沈降法：抗体による検出
ａ．タンパク質の生産：
完全長ＣｌＣ−７ｃＤＮＡ（ＲＴ−ＰＣＲによってＮＢでクローニングし、配列決定して確認し、ｇｉ１３９７２５６７２と比較した）を、ＡＴＧおよび終結コドンを除去するためにＰＣＲによってＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）ベクターにクローニングした。ｍｙｃおよびｈｉｓタグを、ｐｉｃＺαＡベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）へのＥｃｏＲＩクローニングによってそのＣ末端で融合した。

新たなＰＣＲによってＡＴＧを再導入し、ＰＣＲフラグメントをＴＯＰＯｂｌｕｎｔベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングした。ＣｌＣ−７−ｍｙｃ−Ｈｉｓ構築物を含有するこのクローンからのＥｃｏＲＶ−ＳｐｅＩフラグメントをＰＶＬ１３９３（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）ＳｍａＩ−ＸｂａＩ部位にクローニングし、全てのＯＲＦの配列を確認した（ＡＴＧ−ＣｌＣ−７−ｍｙｃ−Ｈｉｓ−終結コドン）。

ＰＶＬ１３９３−ＣｌＣ−７−ｍｙｃ−Ｈｉｓ構築物を使用して、ＢａｃｕｌｏｖｉｒｕｓＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒｓ，Ａｍａｎｕａｌ，ＯＲｅｉｌｌｙｅｔａｌ，ＯｘｆｏｒｄＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＰｒｅｓｓ１９９４の本に述べられているように組換えバキュロウイルスを構築した。抗ＣｌＣ−７抗体（２２、５９）および抗Ｈｉｓ抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の両方を使用するウエスタンブロット法を用いてタンパク質の発現を確認した。

Ｏｓｔｍ１の組換え発現をバキュロウイルスにおいて同様に確立する。完全長Ｏｓｔｍ１（ＧＩ：５６６９９４８９）をＲＴ−ＰＣＲによってＮＢでＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングし、その後ＰＶＬ１３９３（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）にクローニングした。

図５は、Ｓｆ９細胞において発現される組換えＣｌＣ−７がどのようにしてＮｉ−ＮＴＡビーズに捕獲され得るかを例示する。２０・１０^６Ｓｆ９細胞をバキュロウイルス１ｍｌに７２時間感染させた。細胞を、５０ｍＭのトリスＨＣｌ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ、プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ａｍｅｒｓｈａｍ）および０．１％（Ａ）または１％（ＢおよびＣ）ＳＤＳを含有する緩衝液５ｍｌに溶解した。溶解産物１ｍｌをＮｉ−ＮＴＡビーズ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）（Ａ、Ｂおよび１×ビーズＣ）２００μｌまたはＮｉ−ＮＴＡビーズ（５×ビーズＣ）５００μｌと共に室温（ＲＴ）で１時間（指示されているときはＡおよびＢ）または４℃で一晩（Ａ、Ｂ、および指示されているときはＣ）インキュベートした。細胞デブリを２００００ｒｐｍでの遠心分離によって除去する。樹脂に結合した最も高い量のＣｌＣ−７は、インキュベーションを４℃で一晩実施したときおよび１％ＳＤＳ溶解緩衝液を使用したときに得られた（Ａ、Ｂ）。さらに、より多くの樹脂を使用したとき、より多くのＣｌＣ−７が樹脂に結合した（Ｃ）。

ｂ．沈降法
Ｎｉ−ＮＴＡ精製（ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＭａｎｕａｌ０２１２０２）を、Ｎｉ−ＮＴＡビーズを使用して実施する。製造者によって推奨されているようにビーズを作製した後、Ｎｉ−ＮＴＡビーズ２００μｌにつきＣｌＣ−７Ｓｆ９細胞抽出物１ｍｌを４℃で一晩インキュベートする。上清を取り除き、Ｏｓｔｍ１抽出物１ｍｌを、１ｎＭの濃度の様々な試験化合物と共に４℃で２時間添加する。非結合物質を、ＰＢＳ２ｍｌ、０．２ｍＭＮａＣｌ−２％ＣＨＡＰＳで３回洗うことによって洗浄する。

ＳＤＳ試料変性緩衝液をビーズに添加し、それを煮沸して、試料をゲル上で泳動させる。

Ｏｓｔｍ−１に対するウエスタンブロット法を実施する。試験化合物がＣｌＣ−７とＯｓｔｍ１の相互作用を妨害することができる場合、シグナルは生じない。

Ｈｉｓタグ沈降法：放射能による検出
ａ．タンパク質の生産
完全長ＣｌＣ−７ｃＤＮＡ（ＲＴ−ＰＣＲによってＮＢでクローニングし、配列決定して確認し、ｇｉ１３９７２５６７２と比較した）を、ＡＴＧおよび終結コドンを除去するためにＰＣＲによってＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）ベクターにクローニングした。ｍｙｃおよびｈｉｓタグを、ｐｉｃＺαＡベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）へのＥｃｏＲＩクローニングによってそのＣ末端で融合した。

ＰＶＬ１３９３−ＣｌＣ−７−ｍｙｃ−Ｈｉｓ構築物を使用して、ＢａｃｕｌｏｖｉｒｕｓＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒｓ，Ａｍａｎｕａｌ，ＯＲｅｉｌｌｙｅｔａｌ，ＯｘｆｏｒｄＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＰｒｅｓｓ１９９４の本に述べられているように組換えバキュロウイルスを構築した。ＣｌＣ−７抗体（２２、５９）およびＨｉｓ抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の両方を使用するウエスタンブロット法を用いてタンパク質の発現を確認した。

１７５ｃｍ^３フラスコ中２０．１０^６細胞に対してウイルス１ｍｌで、Ｓｆ９細胞をＣｌＣ−７およびＯｓｔｍ１バキュロウイルスに４８時間または７２時間感染させる。溶解の４時間前に、メチオニンおよびシステインを含まない媒質をＳ^３５ＭｅｔおよびＳ^３５Ｃｙｓ２０ｍＣｉ／ｍｌと共に添加する。

細胞を、トリスＨＣｌ５０ｍＭ、ｐＨ７．５１ｍｌ、１５０ｍＭ、ＳＤＳ０．１％、プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ａｍｅｒｓｈａｍ）に溶解し、抽出物を１ｍｇ／ｍｌに希釈する。細胞デブリを２００００ｒｐｍでの遠心分離によって除去する。

ｂ．沈降法
Ｎｉ−ＮＴＡ精製（ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＭａｎｕａｌ０２１２０２）を、Ｎｉ−ＮＴＡビーズを使用して実施する。製造者によって推奨されているようにビーズを作製した後、Ｎｉ−ＮＴＡビーズ２００μｌにつきＣｌＣ−７Ｓｆ９細胞抽出物１ｍｌを、１ｎＭの濃度の様々な試験化合物と共に４℃で一晩インキュベートする。非結合物質を、ＰＢＳ２ｍｌ、０．２ｍＭＮａＣｌ−２％ＣＨＡＰＳで３回洗うことによって洗浄する。

ＳＤＳ試料変性緩衝液をビーズに添加し、煮沸して、試料をＳＤＳ−ｐａｇｅによって分析し、オートラジオグラフィーによって視覚化する。この方法は他のタンパク質に関して以前に使用されている（６０）。

Ｏｓｔｍ１とＣｌＣ−７以外の塩素チャネルの間の相互作用の欠如
図６を参照して、Ｏｓｔｍ１を、ＨＥＫ２９３細胞において指示されているＣＬＣタンパク質と一過性に共発現させた。そのような過剰発現後、約８０ｋＤ（矢じり）のＯｓｔｍ１種だけがウエスタンブロットにおいて検出されたが、３５〜４５ｋＤのＯｓｔｍ１種は検出されなかった。Ｏｓｔｍ１を、Ｏｓｔｍ１のカルボキシ末端に対するモルモット抗体を用いてトランスフェクト細胞溶解産物から免疫沈降させたとき、ＣｌＣ−７は共沈降した。従って、ＣｌＣ−７はまた、切断されていないＯｓｔｍ１種とも相互作用する。これに対し、ＣｌＣ−６またはＣｌＣ−３は共沈降することができず、ＣｌＣ−７／Ｏｓｔｍ１相互作用の特異性を明らかにした。

本明細書において、明白に異なる指示がない限り、「または」という語は、言明される条件のいずれかまたは両方が満たされるとき真価を回復する演算子（ｏｐｅｒａｔｏｒ）の意味で使用され、これに対し演算子「排他的または」は、条件の１つだけが満たされることを必要とする。「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という語は、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇｏｆ）」を意味するのではなく、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」という意味で使用される。

［参考文献］

マウスＯｓｔｍ１タンパク質の注釈付の概略図であり、記号は以下を表わす。黒い箱、疎水性ストレッチ；Ｙ、Ｎ結合型グリコシル化のためのコンセンサス部位；^＊、システイン；矢印、予測上のシグナルペプチド切断部位；ダッシュ、提案されているＲＩＮＧ−フィンガードメイン（４４）；ＡＢ、抗体結合部位；直線、ヒトＯＳＴＭ１突然変異から予測されるトランケート型タンパク質（２８、２９）。Ｏｓｔｍ１タンパク質のトポロジーモデルを示し、矢印はリソソームＯｓｔｍ１内のほぼ切断部位を指し示す。以下で述べるようにして得られたウエスタンブロットを示す。以下で述べるようにして得られたウエスタンブロットを示す。以下で述べるようにして得られたウエスタンブロットを示す。以下で述べるようにして得られたウエスタンブロットを示す。Ｏｓｔｍ１、ＣｌＣ−およびｌａｍｐ−１タンパク質に関する染色線維芽細胞からの共焦点顕微鏡検査画像を示す。列は以下の通りである。列（ａ）：内因性Ｏｓｔｍ１およびｌａｍｐ−１に関して染色した線維芽細胞。３番目のパネルはオーバーレイを示し、４番目のパネルではより高い倍率の画像を示している。列（ｂ）：Ｏｓｔｍ１でトランスフェクトした線維芽細胞は、ｌａｍｐ−１とほとんど共局在していない小胞体および核周辺のＯｓｔｍ１染色を示した。列（ｃ）および（ｄ）：Ｏｓｔｍ１およびＣｌＣ−７とコトランスフェクトした線維芽細胞において、Ｏｓｔｍ１はｌａｍｐ−１（ｃ）およびＣｌＣ−７（ｄ）と共局在した。列（ｅ）：Ｏｓｔｍ１をＣｌＣ−６とコトランスフェクトすることは、Ｏｓｔｍ１のリソソーム局在または有意の共局在を導かなかった。（ｂ〜ｅ）では、内因性ＣｌＣ−７の影響を回避するためにＣｌｃｎ７^−／−線維眼細胞を使用したが、ＨｅＬａ細胞でも同様の結果が認められた。縮尺バーは、（ａ）については８．５μｍ、（ｂ〜ｅ）については１０μｍ、および拡大図（右側）については１．７μｍを表わす。以下のようなウエスタンブロットを示す。（ａ）野生型、Ｃｌｃｎ７^−／−およびｇｒｅｙ−ｌｅｔｈａｌ（ｇｌ）の脳におけるＯｓｔｍ１についてのウエスタンブロット。（ｂ）野生型およびＣｌｃｎ７^−／−マウスにおけるＯｓｔｍ１の細胞内分布。（ｃ）野生型リソソームおよびＣｌｃｎ７^−／−ＥＲ／エンドソーム分画の脱グリコシル化。（ｄ）ＣｌＣ−７／Ｏｓｔｍ１複合体の共免疫沈降。パネル（ａ）および（ｂ）では小脳プルキンエ細胞および（ｃ）〜（ｅ）ではインサイチューの破骨細胞の免疫蛍光画像を示す。（ａ〜ｅ）では、核酸についてのＴＯＴＯ染色（青色）に関するオーバーレイ（右側）が示されている。（ａ）の縮尺バーは、（ａ−ｅ）に関して１０μｍを表わす。パネル（ｆ）は、パネル（ｇ）で定量されるウエスタンブロットを示す−年齢、Ｐ１１−Ｐ２３。誤差バー、ＳＥＭ。骨におけるＣｌＣ−３（ｎ＝２）を除き、ｎ＝３−９。「ｈ」および「ｉ」は、Ｐ３１日齢のｇｌ（ｈ）では網膜変性を示すが、野生型（ｉ）マウスでは変性を示さない、メチレンブルー染色した組織切片である。抗ＮｅｕＮ染色によって明らかにされたＰ４７ｇｌマウスのＣＡ３領域（矢印）における神経変性を示す海馬の切片（縮尺バー、１００μｍ）がパネル（ｊ）に認められる。実施例２で実施したＣｌＣ−７に対するウエスタンブロットの結果を示し、Ｓｆ９細胞において発現された組換えＣｌＣ−７が、ＨｉｓタグによってＮｉ−ＮＴＡビーズに結合できることを明らかにする。約８０ｋＤａのＯｓｔｍ１種は、トランスフェクトしたＨＥＫ細胞においてＣｌＣ−７と相互作用するが、ＣｌＣ−３およびＣｌＣ−６はＯｓｔｍ１と相互作用しないことを明らかにするウエスタンブロットである。

Claims

ＣｌＣ−７による塩素輸送の調節における活性に関してまたはＯｓｔｍ１の細胞内局在の調節における活性に関して、試験化合物をスクリーニングするための方法であって、試験化合物がＯｓｔｍ１によるＣｌＣ−７への結合を妨げるかどうかまたは妨げる程度を測定するステップを含む、方法。
前記試験化合物の存在下で、ＣｌＣ−７またはＯｓｔｍ１に結合することができるＣｌＣ−７のフラグメントを、Ｏｓｔｍ１またはＣｌＣ−７に結合することができるＯｓｔｍ１のフラグメントに暴露するステップと、ＣｌＣ−７またはＣｌＣ−７のフラグメントとＯｓｔｍ１またはＯｓｔｍ１のフラグメントの間の結合が妨げられるかどうかまたは妨げられる程度を測定するステップとを含む請求項１に記載の方法。
前記暴露ステップにおいて、前記ＣｌＣ−７またはＣｌＣ−７のフラグメントおよびＯｓｔｍ１またはＯｓｔｍ１のフラグメントの一方が固体支持体に固定化され、他方および前記試験化合物が溶液中に存在する請求項２に記載の方法。
溶液中に存在するＣｌＣ−７またはＣｌＣ−７のフラグメントあるいはＯｓｔｍ１またはＯｓｔｍ１のフラグメントが、検出可能な標識を担持する請求項３に記載の方法。
前記検出可能な標識が、放射性標識、酵素標識、発光するように刺激され得る標識である請求項４に記載の方法。
前記暴露ステップにおいて、ＣｌＣ−７またはＣｌＣ−７のフラグメント、Ｏｓｔｍ１またはＯｓｔｍ１のフラグメント、および試験化合物の全てが、溶液中に存在する請求項２に記載の方法。
前記ＣｌＣ−７またはＣｌＣ−７のフラグメントおよび前記Ｏｓｔｍ１またはＯｓｔｍ１のフラグメントが、各々標識を担持し、前記標識の近接性が検出可能である請求項６に記載の方法。
ＣｌＣ−７とＯｓｔｍ１が、細胞または細胞内小器官内にインサイチューで存在する請求項２に記載の方法。
ＣｌＣ−７およびＯｓｔｍ１が、各々標識を担持し、前記標識の近接性が検出可能である請求項８に記載の方法。
Ｏｓｔｍ１またはＯｓｔｍ１のフラグメントが、哺乳動物Ｏｓｔｍ１であるかまたは哺乳動物Ｏｓｔｍ１に由来する請求項２〜９のいずれか一項に記載の方法。
Ｏｓｔｍ１またはＯｓｔｍ１のフラグメントが、マウスＯｓｔｍ１またはヒトＯｓｔｍ１であるか、あるいはマウスＯｓｔｍ１またはヒトＯｓｔｍ１に由来する、請求項１０に記載の方法。
ＣｌＣ−７またはＣｌＣ−７のフラグメントが、哺乳動物ＣｌＣ−７であるかまたは哺乳動物ＣｌＣ−７に由来する、請求項２〜９のいずれかに記載の方法。
ＣｌＣ−７またはＣｌＣ−７のフラグメントが、マウスＣｌＣ−７またはヒトＣｌＣ−７であるか、あるいはマウスＣｌＣ−７またはヒトＣｌＣ−７に由来する、請求項１０に記載の方法。