JP4769401B2 - Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ中のリガンド依存性塩素イオンチャネルをコードするＤＮＡ分子 - Google Patents

Description

【０００１】
関連出願の相互参照
該当せず。
【０００２】
米国政府支援研究開発に関する申立て
該当せず。
【０００３】
マイクロフィッシュ補遺の参照
該当せず。
【０００４】
発明の分野
本発明は、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒのリガンド依存性イオンチャネルをコードする分離核酸分子（ポリヌクレオチド）の一部分に関する。また、本発明は、ショウジョウバエのリガンド依存性イオンチャネルをコードするＤＮＡ断片を含む組換えベクターおよび組換え宿主、関連するショウジョウバエリガンド依存性イオンチャネルおよびこれらのタンパク質を含む組換え膜分画の実質的に純粋な形態、関連する突然変異タンパク質、および関連するＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒリガンド依存性イオンチャネルを調節し、殺虫剤として有用と思われる化合物の同定に関わる方法にも関する。
【０００５】
発明の背景
グルタミン酸依存性塩素イオンチャネル、またはＨ受容体は、節足動物の神経および筋肉において同定された（Ｌｉｎｇｌｅ ｅｔ ａｌ、１９８１、Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．２１２：４８１−４８８；Ｈｏｒｓｅｍａｎ ｅｔ ａｌ．、１９８８、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｌｅｔｔ．８５：６５−７０；Ｗａｆｆｏｒｄ ａｎｄ Ｓａｔｔｅｌｌｅ、１９８９、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏ．１４４：４４９−４６２；Ｌｅａ ａｎｄ Ｕｓｈｅｒｗｏｏｄ、１９７３、Ｃｏｍｐ．Ｇｅｎ．Ｐａｒｍａｃｏｌ．４：３３３−３５０；およびＣｕｌｌ−Ｃａｎｄｙ、１９７６、Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２５５：４４９−４６４）。
【０００６】
無脊椎動物のグルタミン酸依存性塩素イオンチャネルは、汎用されているアベルメクチン群の駆虫性および殺虫性化合物の重要な標的である。アベルメクチン類は、放線菌Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓから最初に分離された大環ラクトンの一群である。半合成アベルメクチン誘導体のイベルメクチン（２２，２３−ジヒドロアベルメクチン Ｂ_１ａ）は、人間や動物の寄生虫および害虫を駆除するために、世界中で使用されている。アベルメクチン類は、現在でも、宿主に対して毒性の低い最も有効な広範囲殺風土病虫剤である。多年にわたる野外使用の後でも、昆虫集団の中にアベルメクチンに対する耐性は殆ど残らない。治療指数が良好であり低い耐性が低いことから、グルタミン酸依存性塩素イオン（ＧｌｕＣｌ）チャネルは依然として殺虫剤開発の優れた標的であることが強く示唆される。
【０００７】
グルタミン酸依存性塩素イオンチャネルは、土壌線虫のＣａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ（Ｃｕｌｌｙ ｅｔ ａｌ．、１９９４，Ｎａｔｕｒｅ ３７１：７０７−７１１；米国特許第５５２７７０３号およびＡｒｅｎａ ｅｔ ａｌ．、１９９２，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ．１５：３３９−３４８も参照されたい）およびＣｔｅｎｏｃｅｐｈａｌｉｄｅｓ ｆｅｌｉｓ（ノミ；国際公開第９９／０７８２８号を参照されたい）からクローニングされた。
【０００８】
さらに、以前、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒから得られるグルタミン酸依存性塩素イオンチャネルをコードする遺伝子が同定された（Ｃｕｌｌｙ ｅｔ ａｌ．、１９９６，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：２０１８７−２０１９１；米国特許第５６９３４９２号も参照されたい）。
【０００９】
Ｏ’Ｔｏｕｓａ等（１９８９，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｇｅｎｅｔｉｃｓ ６：４１−５２）は、ショウジョウバエのゲノムにおけるＣｈＩＩＩ９２Ｂ領域に対する光受容体突然変異地図を作製している。
【００１０】
Ｓｔｕａｒｔ，１９９９，Ｎｅｕｒｏｎ ２２：４３１−４３３は、ヒスタミンが無脊椎動物の神経伝達物質であることを示唆する技術を概説している。
【００１１】
以前に同定されたショウジョウバエのＧｌｕＣｌ遺伝子（米国特許第５６９３４９２号を参照されたい）を含め、ＧｌｕＣｌをコードする前記の各ｃＤＮＡクローンは同定されているにもかかわらず、ヒスタミンによって活性化されるリガンド依存性イオンチャネル（ＬＧＩＣ）等の他のＧｌｕＣｌや他のリガンド依存性チャネルを含み、それらに限定されない無脊椎動物リガンド依存性イオンチャネルであって、効果的な殺虫剤に対する他の標的となり得るチャネルをコードする他の遺伝子を同定し、その結果、動物の健康や作物保護のために、殺虫性、殺ダニ性および／または殺線虫性を有し得る新規なＬＧＩＣモジュレーターを同定するためのスクリーニングが改良しうるならば、効果的であると思われる。本発明は、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒリガンド依存性イオンチャネルを発現する新規な遺伝子であって、各々のショウジョウバエの遺伝子でアフリカツメガエル卵母細胞や他の適当な宿主細胞において発現が活性となるＬＧＩＣを生じる遺伝子を開示することで、これらの必要性に対処し、それに合致させる。本発明の各ＬＧＩＣの異種発現によって、動物および人間の健康に関わる無脊椎寄生種に対して活性な化合物の薬理学的分析が可能になると思われる。このような種は、蠕虫、ノミ、マダニ、およびシラミを含む。活性なＬＧＩＣを発現する異種細胞系を、前記の生物種群の抑制に有用となり得る新規なＬＧＩＣモジュレーターを同定するための機能試験または結合試験を確立するために、使用することができる。
【００１２】
発明の概要
本発明は、ＬＧＩＣの少なくとも一部を含む、新規なＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ無脊椎動物リガンド依存性イオンチャネル（ＬＧＩＣ）タンパク質をコードする分離または精製された核酸分子（ポリヌクレオチド）に関する。本明細書に開示したＤＮＡ分子を選択した宿主細胞中にトランスフェクトしてもよく、その結果、その組換え宿主細胞は、実質量の単一の発現した機能的ホモ多量体またはヘテロ多量体ＬＧＩＣチャネルの供給源となる。本明細書に記載のｃＤＮＡクローンは、いずれもヒスタミンによって活性化される機能的で単一のチャネルタンパク質を発現する。したがって、これらのＤｍＬＧＩＣチャネルは、これらのチャネルのモジュレーター、動物や人間の健康および／または作物保護のために使用する有効な殺虫性、殺ダニ性および／または殺線虫性処理剤として作用し得るモジュレーターを同定するための他のスクリーニングの標的となる受容体を形成する。
【００１３】
更に、本発明は、新規なＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒＬＧＩＣタンパク質を発現するｍＲＮＡをコードする分離された核酸分子（ポリヌクレオチド）に関するものであって、このＤＮＡ分子は配列番号１、配列番号３、配列番号５および配列番号６と本明細書に開示したヌクレオチド配列を含む。
【００１４】
また、本発明は、新規なＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ無脊椎動物ＬＧＩＣタンパク質を発現するｍＲＮＡをコードする配列番号１、３、５および６の生物活性断片または突然変異体にも関する。任意のこのような生物活性断片または突然変異体は、配列番号２、配列番号４および配列番号７に示したショウジョウバエＬＧＩＣタンパク質を含むが、それらに限らず各ショウジョウバエＬＧＩＣタンパク質の薬理的性質を少なくとも実質的に模倣したタンパク質またはタンパク質断片をコードすると思われる。任意のこのようなポリヌクレオチドは、ヌクレオチドの置換、欠失、付加、アミノ末端切断およびカルボキシ末端切断が、アフリカツメガエル卵母細胞等の真核細胞中に機能的なショウジョウバエＬＧＩＣを発現するｍＲＮＡをコードすることによって、ショウジョウバエＬＧＩＣ活性の作動薬および／または拮抗薬のスクリーニングに有用となるように、これらの突然変異を含んでいるが、必ずしもこれらの変異に限るものではない。
【００１５】
本発明のこの部分の好ましい一態様は、新規なＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ ＬＧＩＣタンパク質をコードする図１（配列番号１；ＡＣ０５−１０と命名）、図３（配列番号３；ＡＣ０５−１１と命名）、図５（配列番号５；ＡＣ１５−４と命名）および図６（配列番号６）に開示されている。
【００１６】
本発明の分離核酸分子は、１本鎖（コード鎖または非コード鎖）または２本鎖であってもよいゲノムＤＮＡおよび相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、ならびに合成１本鎖ポリヌクレオチド等の合成ＤＮＡ等のデオキシリボ核酸分子（ＤＮＡ）を含み得る。また、本発明の分離核酸分子は、リボ核酸分子（ＲＮＡ）も含み得る。
【００１７】
また、本発明は、本明細書を通して開示される核酸分子を含んでいる組換えベクターおよび原核、真核を問わず組換え宿主細胞にも関している。
【００１８】
また、本発明は、図２（配列番号２）、図４（配列番号４）および図７（配列番号７）に開示したアミノ酸配列を含んだショウジョウバエＬＧＩＣタンパク質の実質的に精製された形態にも関している。
【００１９】
本発明のこの部分の好ましい態様は、図２（配列番号２）、図４（配列番号４）および図７（配列番号７）に開示したアミノ酸配列からなるショウジョウバエＬＧＩＣタンパク質である。
【００２０】
本発明の他の好ましい態様は、配列番号１、３、５および／または６に示したヌクレオチド配列を含み、かつ各々のＤｍＬＧＩＣタンパク質を発現するＤＮＡ発現ベクターを含んだ組換え宿主細胞から得られる、実質的に精製され、（タンパク質分解処理、グリコシル化および／またはリン酸化を含めて）十分に処理された成熟ＬＧＩＣタンパク質に関する。その組換え宿主細胞は、前記のように、哺乳動物細胞系またはアフリカツメガエル卵母細胞等の真核宿主細胞であることが、特に好ましい。
【００２１】
本発明の他の好ましい態様は、配列番号１、３、５および／または６に示した完全な読み取り枠を含み、かつ適切に発現することによって、機能的形態の各ＤｍＬＧＩＣを生じるＤＮＡ発現ベクターで形質転換またはトランスフェクトされた組換え宿主細胞から得た実質的に精製された膜調整物、部分的に精製された膜調整物または細胞溶解物に関する。（原核細胞および真核細胞、ならびに形質転換または一過性もしくは安定性のトランスフェクションの細胞の）組換え宿主細胞から得た細胞内膜分画および／または膜含有細胞溶解物は、本発明の核酸によってコードされた、機能的かつ合成されたタンパク質を含んでいる。組換え体に基づくこの膜調整物は、ショウジョウバエＬＧＩＣを含む可能性があり、かつＡＣ０５−１０（配列番号２）、ＡＣ０５−１１（配列番号４）および／またはＡＣ１５−４／ＡＣ１５−２５（配列番号７）のＬＧＩＣタンパク質を発現する組換え細胞から得られる他のショウジョウバエ由来のタンパク質や宿主タンパク質を含むが、これらのタンパク質に限らず汚染性タンパク質を本質的に含んでいない。したがって、本発明の好ましい一態様は、図２（配列番号２；ＡＣ０５−１０）、図４（配列番号４；ＡＣ０５−１１）および図７（配列番号７；ＡＣ１５−４／ＡＣ１４−２５）に開示した完全長ＬＧＩＣタンパク質の機能形を含むショウジョウバエＬＧＩＣを含んでいる膜調整物である。これらの細胞内膜分画は、内在量より実質的に多量のショウジョウバエＬＧＩＣの（単一のポリペプチドによって生成する各機能的チャネル、あるいはそれらの任意のホモ多量体またはヘテロ多量体チャネルの組合せを含むが、それらに限定されない）生物学的に機能的な形態である野生型および／または突然変異型を含むと思われる。任意のこのようなチャネルは、各ＬＧＩＣチャネルのモジュレーターを選択するために、本明細書を通して記載される様々な試験において有用であると思われる。本発明のＬＧＩＣを発現するために選択した好ましい真核宿主細胞は、哺乳動物細胞系またはアフリカツメガエル卵母細胞である。
【００２２】
また、本発明は、配列番号２、４および／または７に示したアミノ酸配列を含むショウジョウバエＬＧＩＣタンパク質の生物活性な断片および／または突然変異体であって、アミノ酸の置換、欠失、付加、アミノ末端切断およびカルボキシ末端切断が診断、治療または予防用途のタンパク質やタンパク質断片を提供し、かつショウジョウバエリガンド依存性イオンチャネルの薬理作用に対する作動薬および／または拮抗薬を含むが、それらに限らず選択的モジュレーターのスクリーニングに有用であるように、これらの突然変異を含むが、必ずしもそれらに限定されない突然変異体にも関する。
【００２３】
本発明の好ましい一態様は、本発明のショウジョウバエＬＧＩＣタンパク質を構成する各アミノ酸配列に関して、図２（配列番号２）、図４（配列番号４）および図７（配列番号７）に開示されている。これらのチャネルタンパク質の１以上を特定することによって、動物の健康または作物保護のために殺虫性、殺ダニ性および／または殺線虫性を有し得る新規なＬＧＩＣモジュレーターを同定するためのスクリーニングが可能となる。前記のように、本明細書に記載のＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ ＬＧＩＣの機能的単一チャネル、ホモ多量体および／またはヘテロ多量体の組合せの異種発現は、内在量より実質的に多量であると考えられ、それによって、動物や人間の健康に関わる無脊椎寄生種に対して活性な化合物の薬理分析が可能になると思われる。このような種は、蠕虫、ノミ、ダニおよびシラミを含む。前記の生物種群の抑制に有用となり得る新規なＬＧＩＣモジュレーターを同定するための機能試験または結合試験を確立するために、機能的ＤｍＬＧＩＣチャネル（例えば、配列番号２、４および／または７の機能形）を発現する異種細胞系を使用できる。
【００２４】
また、本発明は、各形態のＤｍＬＧＩＣ、またはその生物活性断片に反応して増加するポリクローナルおよびモノクローナル抗体にも関する。
【００２５】
また、本発明は、ＧＦＰ（グリーン蛍光タンパク質）、ＭＹＣエピトープ、およびＦＣを含むが、これらに全く限定されない様々な標識に結合したＤｍＬＧＩＣの一部を発現する融合構築体を含み、これらに限られずＤｍＬＧＩＣ融合構築体にも関する。このような任意の融合構築体を、所望の細胞系内で発現してもよいし、本明細書に開示するＤｍＬＧＩＣタンパク質の１以上のモジュレーターをスクリーニングするために使用してもよい。
【００２６】
本発明は、本明細書に開示するショウジョウバエＬＧＩＣタンパク質および生物学的同等物を発現する方法、これらの遺伝子産物を用いた試験、これらのタンパク質を発現するＤＮＡ構築体を含んだ組換え宿主細胞、およびこれらの試験によって同定され、ＬＧＩＣ活性の作動薬または拮抗薬として作用する化合物に関する。
【００２７】
本発明の一目的は、配列番号２、４および７で各々示したタンパク質である、ショウジョウバエＬＧＩＣの新規な形態、あるいはＤｍＬＧＩＣの断片、突然変異体または誘導体をコードする分離核酸分子（例えば、配列番号１、３、５および６）を提供することである。ヌクレオチドの置換、欠失、付加、アミノ末端切断およびカルボキシ末端切断が、診断、治療または予防用途のタンパク質やタンパク質断片を発現するｍＲＮＡをコードし、無脊椎動物リガンド依存性イオンチャネル薬理作用の選択的モジュレーターのスクリーニングに有用となるように、任意のこのようなポリヌクレオチドはこれらの突然変異を含んでいるが、必ずしもこれらの変異に限定されない。
【００２８】
本発明の更なる目的は、前段落で述べた核酸分子によってコードされるショウジョウバエＬＧＩＣタンパク質またはタンパク質断片を提供することである。
【００２９】
本発明の更なる目的は、ショウジョウバエＬＧＩＣタンパク質またはその生物学的同等物をコードする核酸配列を含む組換えベクターおよび組換え宿主細胞を提供することである。
【００３０】
本発明の一目的は、配列番号２、４および７で示したショウジョウバエＬＧＩＣタンパク質の実質的に精製された形態を提供することである。
【００３１】
本発明の他の目的は、配列番号１、３、５および６に示した完全な読み取り枠を含み、かつ適切に発現することによって、機能的かつ合成された形態の各ＤｍＬＧＩＣチャネルを生じるＤＮＡ発現ベクターで形質転換またはトランスフェクトされた組換え宿主細胞から得た、ショウジョウバエＬＧＩＣタンパク質の実質的に精製された組換え形態を提供することである。その組換え宿主細胞は、哺乳動物細胞系等の真核宿主細胞であることが特に好ましい。
【００３２】
本発明の一目的は、配列番号２、４および７に示したようなショウジョウバエＬＧＩＣタンパク質の生物活性な断片および／または突然変異体であって、アミノ酸の置換、欠失、付加、アミノ末端切断およびカルボキシ末端切断が診断、治療および／または予防用途のタンパク質やタンパク質断片を提供するように、これらの突然変異を含むが、必ずしもこれらの変異に限らないものを提供することである。
【００３３】
更に、本発明の一目的は、薬理作用があるショウジョウバエＬＧＩＣを含む組換え細胞から得た、実質的に精製された細胞内膜調整物、部分的に精製された細胞内膜調整物または未精製溶解物、特に、図２（配列番号２）、図４（配列番号４）および／または図７（配列番号７）に示したアミノ酸を含むタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含んだＤＮＡベクターでトランスフェクトまたは形質転換された宿主細胞から得た細胞内分画を提供することである。
【００３４】
本発明の他の目的は、配列番号１、３、５および／または６に示した完全な読み取り枠を含み、かつ適切に発現することによって、機能的かつ合成された形態の各ＤｍＬＧＩＣを生じるＤＮＡ発現ベクターで形質転換またはトランスフェクトされた組換え宿主細胞から得た、実質的に精製された膜調整物、部分的に精製された細胞内膜調整物、および／または未精製溶解物を提供することである。その組換え宿主細胞は、哺乳動物細胞系、またはアフリカツメガエル卵母細胞等の真核宿主細胞であることが、特に好ましい。
【００３５】
また、ショウジョウバエＬＧＩＣ活性のモジュレーター、好ましくは選択的モジュレーターをスクリーニングするために、ショウジョウバエＬＧＩＣタンパク質、またはショウジョウバエＬＧＩＣタンパク質や生物学的同等物を含んだ膜調整物を使用することも、本発明の一目的である。このような任意のタンパク質または膜結合タンパク質は、動物および人間の健康に関わる無脊椎寄生種に対して活性なこれらのモジュレーターをスクリーニングし、選択する際に有用となり得る。このような種は、蠕虫、ノミ、ダニおよびシラミを含む。これらの膜調整物は、これらのＬＧＩＣを発現する異種細胞系から創出されてもよく、完全長タンパク質、完全長タンパク質の生物活性断片を構成するか、または当分野で入手できる物質で構築し得る様々な融合構築体から発現される融合タンパク質に依存してもよい。
【００３６】
本明細書で使用する場合、「他の核酸を実質的に含まない」とは、少なくとも９０％、好ましくは９５％、より好ましくは９９％、一層より好ましくは９９．９％他の核酸を含まないことを意味する。用語を入れ換えて使用する場合、「他の核酸を実質的に含まない」、「実質的に精製された」、「分離された核酸」、「精製された核酸」のいずれも、他の細胞成分から分離・精製されたショウジョウバエＬＧＩＣタンパク質に対するコード領域を含むＤＮＡ分子を指す。したがって、他の核酸を実質的に含まないショウジョウバエＬＧＩＣ ＤＮＡ調整物は、全核酸に対するパーセント表示で、１０％以下、好ましくは５％以下、より好ましくは１％以下、一層より好ましくは０．１％以下の非ショウジョウバエＬＧＩＣ核酸を含むものと思われる。得られたショウジョウバエＬＧＩＣ ＤＮＡ調整物が他の核酸を実質的に含まないかどうかを、適当な染色法、例えば臭化エチジウム染色と組合せた、例えば、アガロースゲル電気泳動のような従来の核酸純度分析法、または配列決定によって決定することができる。
【００３７】
本明細書で使用する場合、「他のタンパク質を実質的に含まない」または「実質的に精製された」とは、少なくとも９０％、好ましくは９５％、より好ましくは９９％、一層より好ましくは９９．９％他のタンパク質を含まないことを意味する。したがって、他のタンパク質を実質的に含まないショウジョウバエＬＧＩＣタンパク質調整物は、全タンパク質に対するパーセント表示で、１０％以下、好ましくは５％以下、より好ましくは１％以下、一層より好ましくは０．１％以下の非ショウジョウバエＬＧＩＣタンパク質を含むものと思われる。得られたショウジョウバエＬＧＩＣタンパク質調整物が他のタンパク質を実質的に含まないかどうかを、適当な検出法、例えば銀染色またはイムノブロッティングと組合せた、例えば、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）のような従来のタンパク質純度分析法によって、決定することができる。「他のタンパク質を実質的に含まない」または「実質的に精製された」という用語と入れ換えて使用する場合、「分離されたショウジョウバエＬＧＩＣタンパク質」または「精製されたショウジョウバエＬＧＩＣタンパク質」という用語も、天然の供給源から分離されたショウジョウバエＬＧＩＣタンパク質を指す。「分離された」または「精製された」という用語の使用は、ショウジョウバエＬＧＩＣタンパク質が普通の細胞環境から取出されたことを示す。したがって、分離されたショウジョウバエＬＧＩＣタンパク質は、無細胞溶液中にあるか、または自然に生成する環境とは異なる細胞環境中に置かれてもよい。「分離された」という用語は、分離されたショウジョウバエＬＧＩＣタンパク質が存在する唯一のタンパク質であることを意味するのではなく、むしろ分離されたショウジョウバエＬＧＩＣタンパク質が、他のタンパク質やｉｎ ｖｉｖｏでショウジョウバエＬＧＩＣタンパク質と自然に結びつく非アミノ酸物質（例えば、核酸、脂質、炭水化物）を実質的に含んでいないことを意味している。したがって、原核または真核細胞中に組換えによって発現され、このＬＧＩＣタンパク質を自然に（即ち、介在なしには）発現しない宿主細胞から実質的に精製されたショウジョウバエＬＧＩＣタンパク質は、本明細書で言及する如何なる状況下でも、当然「分離されたショウジョウバエＬＧＩＣタンパク質」である。前記のように、分離または精製されたショウジョウバエＬＧＩＣタンパク質であるショウジョウバエＬＧＩＣタンパク質調整物は、他のタンパク質を実質的に含まず、全タンパク質に対するパーセント表示で、１０％以下、好ましくは５％以下、より好ましくは１％以下、一層より好ましくは０．１％以下の非ショウジョウバエＬＧＩＣタンパク質を含むものと思われる。
【００３８】
本明細書で入れ換えて使用する場合、「機能的同等物」または「生物活性同等物」とは、スプライシング、欠失、突然変異、置換、付加のいずれかのために、天然のショウジョウバエＬＧＩＣと正確には同じアミノ酸配列を有していないが、ショウジョウバエＬＧＩＣと実質的に同じ生物活性を保持しているタンパク質を意味する。このような機能的同等物は、天然のショウジョウバエＬＧＩＣと顕著なアミノ酸配列の同一性を有すると思われ、このような機能的同等物をコードする遺伝子およびｃＤＮＡは、天然のショウジョウバエＬＧＩＣをコードするＤＮＡ配列との低緊縮なハイブリッド形成によって、検出することができる。例えば、本明細書で開示する天然のショウジョウバエＬＧＩＣは、配列番号２に示したアミノ酸配列を含み、配列番号１によってコードされる。機能的同等物をコードする核酸は、ヌクレオチドのレベルで配列番号１と少なくとも約５０％の同一性を有する。
【００３９】
本明細書で使用する場合、「保存的アミノ酸置換」とは、１つのアミノ酸残基の他の化学的に類似したアミノ酸残基による置き換えを指す。このような保存的置換の例は、１つの疎水性残基（イソロイシン、ロイシン、バリン、またはメチオニン）による他の疎水性残基の置換、および１つの極性残基による同じ電荷の他の極性残基の置換（例えば、リジンの代わりにアルギニン、アスパラギン酸の代わりにグルタミン酸）である。
【００４０】
本明細書で使用する場合、「ＬＧＩＣ」とは、リガンド依存性イオンチャネルを指す。
【００４１】
本明細書で使用する場合、「ＤｍＬＧＩＣ」とは、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒリガンド依存性イオンチャネルを指す。
【００４２】
本明細書で使用する場合、「ＧｌｕＣｌ」とは、Ｌ−グルタミン酸依存性塩素イオンチャネルを指す。
【００４３】
本明細書で使用する場合、「ＤｍＧｌｕＣｌ」とは、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒＬ−グルタミン酸依存性塩素イオンチャネルを指す。
【００４４】
本明細書で使用する場合、「哺乳動物の」という用語は、人間を含めた任意の哺乳動物を指すことにする。
【００４５】
図面の簡単な説明
図１は、配列番号１に示した、ショウジョウバエＬＧＩＣクローン、ＡＣ０５−１０のヌクレオチド配列を示す図である。
【００４６】
図２は、配列番号２に示した、ショウジョウバエＬＧＩＣ ＡＣ０５−１０タンパク質のアミノ酸配列を示す図である。
【００４７】
図３は、配列番号３に示した、ショウジョウバエＬＧＩＣクローン、ＡＣ０５−１１のヌクレオチド配列を示す図である。
【００４８】
図４は、配列番号４に示した、ショウジョウバエＬＧＩＣ ＡＣ０５−１１タンパク質のアミノ酸配列を示す図である。
【００４９】
図５は、配列番号５に示した、ショウジョウバエＬＧＩＣクローン、ＡＣ１５−４のヌクレオチド配列を示す図である。
【００５０】
図６は、配列番号６に示した、ショウジョウバエＬＧＩＣクローン、ＡＣ１５−２５のヌクレオチド配列を示す図である。
【００５１】
図７は、配列番号７に示した、ショウジョウバエＬＧＩＣ ＡＣ１５−４／ＡＣ１５−２５タンパク質のアミノ酸配列を示す図である。
【００５２】
図８は、トランスフェクトしたアフリカツメガエル卵母細胞における、ヒスタミンによる組換えＤｍＬＧＩＣ（ＡＣ０５−１０）の活性化を示す図である。
【００５３】
発明の詳細な説明
本発明は、既知のＤｍＧｌｕＣｌタンパク質と系統的に関連するが、別の薬理作用を示し、したがって殺虫剤の新規な標的となる、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ無脊椎動物ＬＧＩＣタンパク質をコードする分離核酸分子（ポリヌクレオチド）に関する。本発明の分離または精製核酸分子は、他の核酸を実質的に含まない。大部分のクローニングのためには、ＤＮＡが好ましい核酸である。前記のように、本明細書に開示したＤＮＡ分子を選択した宿主細胞中にトランスフェクトしてもよく、その結果、その組換え宿主細胞は、発現した機能性の単一、ホモ多量体またはヘテロ多量体のＬＧＩＣチャネルの実質量の供給源となる。本明細書に記載のｃＤＮＡクローンは、いずれもヒスタミンによって活性化される機能的単一のチャネルタンパク質を発現する。したがって、これらのＤｍＬＧＩＣチャネルは、これらのチャネルのモジュレーター、動物や人間の健康および／または作物保護のために使用する有効な殺虫性、殺ダニ性および／または殺線虫性処理剤として作用し得るモジュレーターを同定するための他のスクリーニング標的となる受容体を形成する。本明細書に開示したＤＮＡ分子を選択した宿主細胞中にトランスフェクトし、その結果、その組換え宿主細胞は、発現した機能性の単一、ホモ多量体またはヘテロ多量体のＬＧＩＣチャネルの実質量の供給源となる。
【００５４】
本発明は、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒの新規な無脊椎動物ＬＧＩＣタンパク質を発現するｍＲＮＡをコードする分離された核酸分子（ポリヌクレオチド）に関するものであって、このＤＮＡ分子は配列番号１、配列番号３、配列番号５、および配列番号６と本明細書に開示したヌクレオチド配列を含む。本発明のＤｍＬＧＩＣ核酸分子の分離および特定は、実施例１節に詳述したように確認された。
【００５５】
無脊椎動物グルタミン酸依存性塩素イオンチャネル（ＧｌｕＣｌ）は、グリシン依存性およびＧＡＢＡ依存性塩素イオンチャネルと関係しており、興奮性グルタミン酸受容体（例えば、ＮＭＤＡまたはＡＭＰＡ受容体）とは異なる。ＧｌｕＣｌ一族の最初の２種の構成体が、駆虫薬イベルメクチンの受容体に対する機能性スクリーニングの後に、線虫（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）において確認された。今では、更に数種のＧｌｕＣｌが、他の無脊椎動物種においてクローニングされた。しかし、脊椎動物においてＧｌｕＣｌに相当するものが存在する証拠は未だない。このために、ＧｌｕＣｌおよび任意の関連するリガンド依存性チャネルは、駆虫剤、殺虫剤、殺ダニ剤等にとって優れた標的となり得る。ノジューリスポア酸（ｎｏｄｕｌｉｓｐｏｒｉｃ ａｃｉｄ）およびその誘導体のような特異的ＧｌｕＣｌモジュレーターは、脊椎動物において機構に基く毒性を欠いているので、理想的な安全性プロファイルを確実に有する。本発明は、以前に同定されたＤｍＧｌｕＣｌ１αおよびＣ．ｆｅｌｉｓ ＣｆＧｌｕＣｌ ＤＮＡに相同性を示す４種の新規なショウジョウバエＬＧＩＣクローン、ＡＣ０５−１０、ＡＣ０５−１１、ＡＣ１５−４およびＡＣ１５−２５の一部分に関するものである。
【００５６】
本発明は、図１（ＡＣ０５−１０）に記載し、配列番号１として示した分離または精製ＤＮＡ分子に関するもので、そのＤＮＡ分子は図２に記載し、配列番号２として示したショウジョウバエＬＧＩＣタンパク質をコードし、ＡＣ０５−１０のヌクレオチド配列は次のとおりである。
【００５７】
【化１】

【００５８】
本発明は、図３（ＡＣ０５−１１）に記載し、配列番号３として示した分離または精製ＤＮＡ分子にも関するもので、そのＤＮＡ分子は図４に記載し、配列番号４として示したショウジョウバエＬＧＩＣタンパク質をコードし、ＡＣ０５−１１のヌクレオチド配列は次のとおりである。
【００５９】
【化２】

【００６０】
本発明は、図５（ＡＣ１５−４）に記載し、配列番号５として示した分離または精製ＤＮＡ分子にも関するもので、そのＤＮＡ分子は図７に記載し、配列番号７として示したショウジョウバエＬＧＩＣタンパク質をコードし、ＡＣ１５−４のヌクレオチド配列は次のとおりである。
【００６１】
【化３】

【００６２】
本発明は、図６（ＡＣ１５−２５）に記載し、配列番号６として示した分離または精製ＤＮＡ分子にも関するもので、そのＤＮＡ分子も図７に記載し、配列番号７として示したショウジョウバエＬＧＩＣタンパク質をコードし、ＡＣ１５−２５のヌクレオチド配列は次のとおりである。
【００６３】
【化４】

【００６４】
各々図１、３および５に示し、前に例示した分離ＤＮＡ分子は、次の特性を有する。
【００６５】
ＡＣ０５−１０（配列番号１）：
１５１８ヌクレオチド残基：開始のＭｅｔ（ヌクレオチド残基１９９〜２０１位）および「ＴＧＡ」終止コドン（ヌクレオチド残基１４７７〜１４７９位）で、読み取り枠が、配列番号２に示したアミノ酸４２６個の発現タンパク質を生じる。
【００６６】
ＡＣ−０５−１１（配列番号３）：
１５０６ヌクレオチド残基：開始のＭｅｔ（ヌクレオチド残基１９９〜２０１位）および「ＴＧＡ」終止コドン（ヌクレオチド残基１４６５〜１４６７位）で、読み取り枠が、配列番号４に示したアミノ酸４２２個の発現タンパク質を生じる。
【００６７】
ＡＣ１５−４（配列番号５）：
２１３３ヌクレオチド残基：開始のＭｅｔ（ヌクレオチド残基３３０〜３３２位）および「ＴＡＡ」終止コドン（ヌクレオチド残基１７８５〜１７８７位）で、読み取り枠が、配列番号７に示したアミノ酸４８５個の発現タンパク質を生じる。
【００６８】
ＡＣ１５−２５（配列番号６）：
２０３４ヌクレオチド残基：開始のＭｅｔ（ヌクレオチド残基２７８〜２８０位）および「ＴＡＡ」終止コドン（ヌクレオチド残基１７３３〜１７３５位）で、読み取り枠が、配列番号７に示したアミノ酸４８５個の発現タンパク質を生じる。
【００６９】
Ａｃ５−１０およびＡｃ５−１１の読み取り枠は、Ａｃ０５−１０中のＭ３−Ｍ４細胞内ループ内の４個のアミノ酸挿入をコードするＡｃ５−１０内の１２個のヌクレオチド挿入を別とすれば、同一である（配列番号２に示した、アミノ酸残基３７５位からアミノ酸残基３７８位までのＳｅｒ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ挿入）。したがって、Ａｃ５−１０タンパク質の長さが４２６アミノ酸であるのに対して、Ａｃ５−１１タンパク質の長さは４２２アミノ酸である。アフリカツメガエルにおけるＡｃ５−１０の発現によって、ヒスタミンの添加に反応する機能性イオンチャネルが生成する。
【００７０】
Ａｃ１５の２個のクローンが開示されている。Ａｃ１５−４（２０７３ｂｐ）およびＡｃ１５−２５（２０３４ｂｐ）は、同じタンパク質配列を予測するが、ヌクレオチド１４５５個の読み取り枠内にある無作用ヌクレオチド１６個の変化が異なる。Ａｃ１５−４／Ａｃ１５−２５に由来する発現タンパク質の長さは４８５アミノ酸である。
【００７１】
また、本発明は、ＤｍＬＧＩＣを発現するｍＲＮＡをコードする配列番号１、３、５および６の生物活性な断片または突然変異体にも関する。任意のこのような生物活性な断片および／または突然変異体は、配列番号２、４および／または７に示した野生型形態を含むが、それらに限らない野生型タンパク質を少なくとも実質的に模倣したタンパク質またはタンパク質断片をコードすると思われる。任意のこのようなポリヌクレオチドは、ヌクレオチドの置換、欠失、付加、アミノ末端切断およびカルボキシ末端切断が、診断、治療または予防用途のタンパク質やタンパク質断片を発現するｍＲＮＡをコードすることによって、ＤｍＬＧＩＣ機能の作動薬および／または拮抗薬のスクリーニングに有用となるように、これらの突然変異を含んでいるが、必ずしもそれらに限定されるものではない。
【００７２】
本発明のこの部分の好ましい一態様は、ＤｍＬＧＩＣタンパク質の３形態をコードする４種の新規なＤＮＡ分子を記載する図１、３、５よび６に開示されている。
【００７３】
本発明の分離核酸分子は、１本鎖（コード鎖または非コード鎖）または２本鎖であってもよいゲノムＤＮＡおよび相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、ならびに合成１本鎖ポリヌクレオチド等の合成ＤＮＡ等のデオキシリボ核酸分子（ＤＮＡ）を含み得る。また、本発明の分離核酸分子は、リボ核酸分子（ＲＮＡ）も含み得る。
【００７４】
遺伝暗号の縮重は、２種以外の全てのアミノ酸に対して、複数のコドンが特定のアミノ酸をコードするようなものである。これによって、ＤｍＬＧＩＣタンパク質をコードする合成ＤＮＡであって、そのヌクレオチド配列が配列番号１、３、５および６のヌクレオチド配列と有意に異なるが、それでもなお配列番号１、３、５および６と同じＤｍＬＧＩＣタンパク質をコードする合成ＤＮＡの構築が可能となる。このような合成ＤＮＡは、本発明の範囲に入ることを意図している。このような合成ＤＮＡを特定の宿主細胞や生物において発現させることを所望する場合、このような合成ＤＮＡのコドン使用法をその特定の宿主のコドン使用法を反映するように調節することによって、宿主内でのＤｍＬＧＩＣタンパク質の発現量を増加させることができる。換言すれば、特定のアミノ酸をコードする様々なコドンのこの重複は、本発明の範囲に入る。したがって、本発明は、以下に示すように、最終的に同一のアミノ酸を翻訳するためにコードする代替コドンを含むＲＮＡをコードするＤＮＡ配列も対象としている。
【００７５】
Ａ＝Ａｌａ＝アラニン：コドン ＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧ、ＧＣＵ
Ｃ＝Ｃｙｓ＝システイン：コドン ＵＧＣ、ＵＧＵ
Ｄ＝Ａｓｐ＝アスパラギン酸：コドン ＧＡＣ、ＧＡＵ
Ｅ＝Ｇｌｕ＝グルタミン酸：コドン ＧＡＡ、ＧＡＧ
Ｆ＝Ｐｈｅ＝フェニルアラニン：コドン ＵＵＣ、ＵＵＵ
Ｇ＝Ｇｌｙ＝グリシン：コドン ＧＧＡ、ＧＧＣ、ＧＧＧ、ＧＧＵ
Ｈ＝Ｈｉｓ＝ヒスチジン：コドン ＣＡＣ、ＣＡＵ
Ｉ＝Ｉｌｅ＝イソロイシン：コドン ＡＵＡ、ＡＵＣ、ＡＵＵ
Ｋ＝Ｌｙｓ＝リジン：コドン ＡＡＡ、ＡＡＧ
Ｌ＝Ｌｅｕ＝ロイシン：コドン ＵＵＡ、ＵＵＧ、ＣＵＡ、ＣＵＣ、ＣＵＧ、ＣＵＵ
Ｍ＝Ｍｅｔ＝メチオニン：コドン ＡＵＧ
Ｎ＝Ａｓｐ＝アスパラギン：コドン ＡＡＣ、ＡＡＵ
Ｐ＝Ｐｒｏ＝プロリン：コドン ＣＣＡ、ＣＣＣ、ＣＣＧ、ＣＣＵ
Ｑ＝Ｇｌｎ＝グルタミン：コドン ＣＡＡ、ＣＡＧ
Ｒ＝Ａｒｇ＝アルギニン：コドン ＡＧＡ、ＡＧＧ、ＣＧＡ、ＣＧＣ、ＣＧＧ、ＣＧＵ
Ｓ＝Ｓｅｒ＝セリン：コドン ＡＧＣ、ＡＧＵ、ＵＣＡ、ＵＣＣ、ＵＣＧ、ＵＣＵ
Ｔ＝Ｔｈｒ＝スレオニン：コドン ＡＣＡ、ＡＣＣ、ＡＣＧ、ＡＣＵ
Ｖ＝Ｖａｌ＝バリン：コドン ＧＵＡ、ＧＵＣ、ＧＵＧ、ＧＵＵ
Ｗ＝Ｔｒｐ＝トリプトファン：コドン ＵＧＧ
Ｙ＝Ｔｙｒ＝チロシン：コドン ＵＡＣ、ＵＡＵ
したがって、本発明は、同一のタンパク質を発現する異なったＤＮＡ分子を生じ得るコドンの重複を開示する。本明細書のために、１個または複数の置換コドンを有する配列を縮重変異配列と定義することにする。他の配列変異源は、以下に考察するように、ＲＮＡ編集を介して起こり得る。このようなＲＮＡ編集は、読み取り枠の変化が発現タンパク質中のアミノ酸残基の変化を起こさない他の形式のコドン重複を生じ得る。生物学的理由が何であれ、一例を本開示中に見出すことができる。Ａｃ１５−４およびＡｃ１５−２５のｃＤＮＡクローンは、配列番号７に示した４８５アミノ酸タンパク質をコードするが、Ａｃ１５−２５の読み取り枠配列をＡｃ１５−４の読み取り枠配列と比較すると、無作用ヌクレオチド１６個の変化が起こっている。発現タンパク質の最終的物性を実質的に変化させないＤＮＡ配列中または翻訳タンパク質中の突然変異も、本発明の範囲内に含まれる。例えば、ロイシンの代わりにバリン、リジンの代わりにアルギニン、またはグルタミンの代わりにアスパラギンに置換しても、ポリペプチドの機能に変化が起こらないかもしれない。
【００７６】
あるペプチドをコードするＤＮＡ配列を、天然のヘプチドと異なる性質を有するペプチドをコードするように変化させ得ることは知られている。ＤＮＡ配列を変化させる方法は、部位特異的突然変異誘発を含むが、それに限らない。変化した性質の例は、酵素が基質に対して、または受容体がリガンドに対して示す親和性の変化を含むが、これらに限らない。
【００７７】
また、本発明は、本明細書を通して開示される実質的に精製された核酸分子を含んでいる組換えベクターおよび原核、真核を問わない組換え宿主にも関している。ＤｍＬＧＩＣタンパク質を全体として、または部分的にコードする本発明の核酸分子は、他のＤＮＡ分子、即ちＤｍＬＧＩＣコード配列が自然には連結されないＤＮＡ分子と連結されることによって、各ＤｍＬＧＩＣタンパク質をコードする「組換えＤＮＡ分子」を形成することができる。本発明の新規なＤＮＡ配列を、ＤｍＬＧＩＣをコードする核酸または機能的同等物を含むベクター中に挿入することができる。これらのベクターはＤＮＡまたはＲＮＡで構成されてもよいが、大抵のクローニングのためにはＤＮＡベクターが好ましい。典型的なベクターは、プラスミド、修飾ウィルス、バクテリオファージ、コスミド、酵母人工染色体、およびＤｍＬＧＩＣタンパク質をコードし得る他の形態のエピソームや組込み型ＤＮＡを含む。特定の遺伝子導入や他の用途のために適切なベクターを決定することは、当業者が十分に扱い得る範囲に入る。
【００７８】
中等度から高度に緊縮な条件下で配列番号１、３、５および６とハイブリッドを形成するＤＮＡ配列は、本発明に含まれる。制限するためでなく、例として、高緊縮条件を用いる手順は次のとおりである：ＤＮＡを含むフィルタの予備的ハイブリッド形成を、６×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、および変性サケ精子ＤＮＡ １００μｇ／ｍｌからなる緩衝液中、２時間から終夜の間６５℃で行う。フィルタを、変性サケ精子ＤＮＡ １００μｇ／ｍｌおよび^３２Ｐ標識プローブ５〜２０×１０^６ｃｐｍを含む予備ハイブリッド形成混合物中、１２時間から４８時間６５℃でハイブリッド形成させる。フィルタの洗浄は、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳを含む溶液中、３７℃で１時間行う。この後、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、５０℃で４５分間洗浄し、次いでオートラジオグラフィを行う。高緊縮条件を用いる他の手順は、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、５０％ホルムアミド中、４２℃で１２から４８時間行うハイブリッド形成段階、または０．２×ＳＳＰＥ、０．２％ＳＤＳ中、６５℃で３０から６０分間の洗浄段階のいずれかを含むと思われる。高緊縮なハイブリッド形成を行うための前記手順で述べた試薬は、当分野で周知である。これら試薬の組成の詳細は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．、１９８９、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋに見出すことができる。前記以外に使用し得る他の高緊縮条件は当分野で周知である。
【００７９】
「同一性」は、ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列の同一性の尺度である。一般に、最高次の一致が得られるように、各配列が配列される。「同一性」自体は、当業界で認識された意味を有し、公知技法を用いて計算できる。例えば、（Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．、ｅｄ．Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８８；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ、Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．、ｅｄ．、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９３；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ、Ｐａｒｔ Ｉ、Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．ａｎｄ Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．、ｅｄｓ．、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ、１９９４；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、１９８７；およびＳｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ、Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．ａｎｄ Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．、ｅｄｓ．、Ｍ Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９１）を参照されたい。ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの２個の配列間の同一性を測定する幾つかの方法があるが、「同一性」という用語は当業者に周知である（Ｃａｒｉｌｌｏ ａｎｄ Ｌｉｐｔｏｎ、１９８８、ＳＩＡＭ Ｊ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ ４８：１０７３）。２個の配列間の同一性または類似性を決定するために汎用される方法は、Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｈｕｇｅ Ｃｏｍｐｕｔｅｒｓ、Ｍａｒｔｉｎ Ｊ．Ｂｉｓｈｏｐ、ｅｄ．、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、１９９４およびＣａｒｉｌｌｏ ａｎｄ Ｌｉｐｔｏｎ、１９８８、ＳＩＡＭ Ｊ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ ４８：１０７３に開示されている方法を含むが、これらに限定されない。同一性や類似性を決定する方法は、コンピュータプログラム中に体系化されている。２個の配列間の同一性や類似性を決定する好ましいコンピュータプログラム法は、ＧＣＧプログラムパッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，ｅｔ ａｌ、１９８４、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １２（１）：３８７）、ＢＬＡＳＴＮおよびＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ、ｅｔ ａｌ．、１９９０、Ｊ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３）を含むが、これらに限定されない。
【００８０】
一例として、配列番号１の参照ヌクレオチド配列に、少なくとも例えば９５％の「同一性」を有するヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドとは、そのポリヌクレオチド配列が、配列番号１の参照ヌクレオチド配列のヌクレオチド各１００個当たり５点までの突然変異や代替ヌクレオチドを含み得ることを除けば、そのポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が参照配列と同一であることを意図している。換言すれば、参照ヌクレオチド配列に少なくとも９５％同一なヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを得るためには、参照配列中のヌクレオチドの５％までが欠失するか、または他のヌクレオチドで置換されてもよく、あるいは、参照配列中の全ヌクレオチドの５％までの数のヌクレオチドを参照配列中に挿入してもよい。参照配列のこれらの突然変異や代替ヌクレオチド置換は、参照ヌクレオチド配列の５’または３’末端で生じてもよく、あるいは、参照配列中のヌクレオチド間に個々に散在するか、または参照配列内の１以上の隣接グループ中に散在することによって、両末端位間のどこかで生じてもよい。１００％未満の同一性を生じるこのような「突然変異」または変化の一発生源は、ＲＮＡ編集を介して起こり得る。ＲＮＡ編集の過程は、修飾されたｍＲＮＡをクローニングされるｃＤＮＡを発生させる鋳型として使用したとき、コドン変化が起こる場合も起こらない場合もある１以上のヌクレオチド変化が起こるように、ｍＲＮＡ分子の修飾を起こす。このＲＮＡ編集は、ＲＮＡエディターゼによって触媒されることが知られている。このようなＲＮＡエディターゼはＲＮＡアデノシンデアミナーゼであり、それはシトシン残基を模倣する傾向のあるイノシン残基にアデノシン残基を変換する。この目的のために、ｍＲＮＡ残基のＡからＩへの変換が、クローニングされるｃＤＮＡのコードおよび非コード領域においてＡからＧへの転位を起こすと思われる（例えば、Ｈａｎｒａｈａｎ ｅｔ ａｌ、１９９９、Ａｎｎａｌｓ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８６８：５１−６６を参照されたい。総説としては、Ｂａｓｓ、１９９７、ＴＩＢＳ ２２：１５７−１６２を参照されたい）。同様に、配列番号２の参照アミノ酸配列に、少なくとも例えば９５％の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドとは、そのポリペプチド配列が、配列番号２の参照アミノ酸のアミノ酸各１００個当たり５個までのアミノ酸の修飾を含み得ることを除けば、そのポリペプチドのアミノ酸配列が参照配列と同一であることを意図している。換言すれば、参照アミノ酸配列に少なくとも９５％同一なアミノ酸配列を有するポリペプチドを得るためには、参照配列中のアミノ酸残基の５％までが欠失するか、または他のアミノ酸で置換されてもよく、あるいは、参照配列中の全アミノ酸残基の５％までの数のアミノ酸を参照配列中に挿入してもよい。参照配列のこれらの修飾は、参照アミノ酸配列のアミノまたはカルボキシ末端で起こってもよく、あるいは、参照配列中の残基間に個々に散在するか、または参照配列内の１個または複数の隣接グループ中に散在することによって、両末端間のどこかで起こってもよい。前記のように再び、ＲＮＡ編集が、ゲノム配列の読み取り枠に直接対応する「非ＲＮＡ編集」転写体から発現する他のタンパク質と、「同一性」の異なる発現タンパク質を生じるコドン変化を起こし得る。
【００８１】
また、本発明は、図２、図４および図６に開示し、配列番号２、４，および６で各々示したアミノ酸配列を含む、各ＤｍＬＧＩＣタンパク質の実質的に精製された形態にも関する。開示したＤｍＬＧＩＣタンパク質は、図２、４および６に示すように、長さがアミノ酸４２６個（配列番号２）、アミノ酸４２２個（配列番号４）、およびアミノ酸４８５個（配列番号６）の読み取り枠を含んでおり、次のとおりである。
【００８２】
【化５】

【００８３】
また、本発明は、配列番号２、４および７に示したようなアミノ酸配列を含むＤｍＬＧＩＣタンパク質の生物活性な断片および／または突然変異体であって、アミノ酸の置換、欠失、付加、アミノ末端切断およびカルボキシ末端切断が診断、治療または予防用途のタンパク質やタンパク質断片を提供し、ＤｍＬＧＩＣ機能の作動薬および／または拮抗薬のスクリーニングに有用となるように、これらの突然変異を含むが、必ずしもこれらの変異に限定されないものにも関する。
【００８４】
本発明の他の好ましい態様は、配列番号１、３、５および／または６に示したヌクレオチド配列を含み、各ＤｍＬＧＩＣ前駆体タンパク質を発現するＤＮＡ発現ベクターを含んだ組換え宿主細胞から得られる、実質的に精製され、十分に処理されたＬＧＩＣタンパク質に関する。その組換え宿主細胞は、前記のように、哺乳動物細胞系、またはアフリカツメガエル卵母細胞等の真核宿主細胞であることが、特に好ましい。
【００８５】
多くのタンパク質と同様に、ＤｍＬＧＩＣタンパク質のアミノ酸の多くを修飾し、それでも尚、野生型タンパク質と実質的に同じ生物活性を保持することが可能である。したがって、本発明は、アミノ酸の欠失、付加または置換を有するが、それでも尚、対応する各ＤｍＬＧＩＣと実質的に同じ生物活性を保持する修飾ＤｍＬＧＩＣポリペプチドを含む。単一のアミノ酸置換では、普通、タンパク質の生物活性は変化しないことが、一般に了知されている（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｇｅｎｅ，Ｗａｔｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｆｏｕｒｔｈ Ｅｄ．Ｔｈｅ Ｂｅｎｊａｍｉｎ／Ｃｕｍｍｉｎｇｓ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｉｎｃ．，ｐａｇｅ２２６およびＣｕｎｎｉｎｇｈａｍ ＆ Ｗｅｌｌｓ，１９８９，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１０８１−１０８５）。したがって、本発明は、配列番号２、４、および／または７で１個のアミノ酸置換がなされたが、それでも尚、対応するＤｍＬＧＩＣタンパク質と実質的に同じ生物活性を保持しているポリペプチドを含む。また、本発明は、配列番号２、４または７で２個以上のアミノ酸置換がなされたが、それでも尚、対応するＤｍＬＧＩＣタンパク質と実質的に同じ生物活性を保持しているポリペプチドも含む。特に本発明は、前記置換が保存的置換である実施形態を含む。
【００８６】
当業者であれば、ＤｍＬＧＩＣの機能的同等物であって、アミノ酸の小さな欠失または挿入をＤｍＬＧＩＣアミノ酸配列からの変化とするポリペプチドも、同じ指針に従うことによって、即ちＤｍＬＧＩＣと関連タンパク質とのアミノ酸配列の差を最小化することによって、産生し得ることを認める。小規模の欠失または挿入は、一般に約１個から５個のアミノ酸の範囲にある。このような小規模の欠失または挿入の修飾ＤｍＬＧＩＣポリペプチドの生物活性に対する効果は、そのポリペプチドを合成により生成するか、あるいは、ＤｍＬＧＩＣをコードするＤＮＡに必要な変化を起こした後、そのＤＮＡを組換えて発現させ、そのような組換え発現で生成したタンパク質を評価することによって、容易に試験することができる。
【００８７】
本発明は、酵素の活性部位を含む領域を含んだＤｍＬＧＩＣの末端切断形も含んでいる。このような末端切断タンパク質は、本明細書に記載の様々なアッセイ、結晶化研究、および構造−活性相関の研究において有用である。
【００８８】
また、本発明は、本発明の核酸分子を含んだ（原核細胞および真核細胞、ならびに形質転換の安定な細胞および一過性の細胞の）組換え宿主細胞から得た、膜含有未精製溶解物または実質的に精製された細胞内膜分画にも関する。これらの組換え宿主細胞は、翻訳後に生物活性な態様で細胞膜と結合するＤｍＬＧＩＣまたは機能的同等物を発現する。これらの細胞内膜分画は、内在量より実質的に多量のＤｍＬＧＩＣの野生型または突然変異体を含み、したがってＤｍＬＧＩＣタンパク質またはチャネルのモジュレーターを選択する試験において有用と思われる。換言すれば、このような細胞内膜分画の特定の用途には、組換え細胞内でＤｍＬＧＩＣを発現後、他の細胞成分からその膜を分離、実質的に精製し、その後、そのタンパク質あるいは本明細書に開示するそのタンパク質の１種または複数を含む生物活性なチャネルの作動薬や拮抗薬等のモジュレーターを選択する試験に使用することが必要である。あるいは、その膜を含む溶解細胞を、組換え発現した本明細書に開示するタンパク質のモジュレーターを選択する試験に直接使用してもよい。したがって、本発明の他の好ましい態様は、配列番号１、３、５および／または６に示す完全な読み取り枠を含み、かつ適切に発現するＤＮＡベクターで形質転換またはトランスフェクトした結果、機能的に処理された形態の各単一性、ホモ多量体またはヘテロ多量体ＤｍＬＧＩＣ受容体を生じる組換え宿主細胞から得られた膜を含む、実質的に精製された膜調整物または溶解組換え細胞成分に関する。その組換え宿主細胞は、前記のように、哺乳動物細胞系またはアフリカツメガエル卵母細胞等の真核宿主細胞であることが、特に好ましい。
【００８９】
この目的のための本発明の好ましい一態様は、単一のチャネルタンパク質か、または、本明細書でホモ多量体チャネルまたはヘテロ多量体チャネルと称し、多数のサブユニットを含むチャネルのいずれかからなる機能的ＤｍＬＧＩＣチャネル受容体である。したがって、単一のチャネルは、配列番号２、４または７に開示したタンパク質、またはその生物学的に活性な同等物（即ち、野生型チャネル受容体に類似の様式で尚も機能する修飾チャネルタンパク質）から構成され得る。ホモ多量体チャネル受容体複合体は、配列番号２、４、および７の開示群、ならびに生物学的に活性な同等物から選択される複数のポリペプチドを含んでいると思われる。ヘテロ多量体チャネル受容体複合体は多数のサブユニットを含んでいると思われ、その複合体中では、本明細書に開示した３種のタンパク質中の少なくとも２種がチャネル形成に寄与しているか、または、活性なチャネル受容体複合体を提供するために、それらのタンパク質の少なくとも１種が他のタンパク質またはチャネル成分と結合している。したがって、更に本発明は、本明細書に記載の実質的に精製されたチャネル、ならびに、実質的に精製された膜調整物、部分的に精製された膜調整物、または本明細書に記載の機能性の単一、ホモ多量体またはヘテロ多量体のチャネルを含む細胞溶解物にも関する。
【００９０】
また、本発明は、野生型ＤｍＬＧＩＣ活性を調節する化合物を同定する試験において有用な融合タンパク質を発現するばかりでなく、ＤｍＬＧＩＣに対する抗体も発生させる融合構築体の分離核酸分子に関する。本発明のこの部分の一態様は、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）−ＤｍＬＧＩＣ融合構築体を含むが、それに限らない。組換えＧＳＴ−ＲｓＧｌｕＣｌ融合タンパク質を、バキュロウィルス発現ベクター（ｐＡｃＧ２Ｔ、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を用いたＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（Ｓｆ２１）昆虫細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含む様々な発現系で発現させてもよい。他の態様は、ＧＦＰ（グリーン蛍光タンパク質）、ＭＹＣエピトープおよびＧＳＴを含むが、これらに限らない様々な標識に連結したＤｍＬＧＩＣ融合構築体に関する。前と同じように、このような任意の融合構築体を関心のある細胞系内で発現してもよいし、本明細書に開示するＤｍＬＧＩＣタンパク質の１種または複数のモジュレーターをスクリーニングするために使用してもよい。
【００９１】
ＤｍＬＧＩＣ活性のモジュレーターをスクリーニングする好ましい一態様は、Ｘｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓ卵母細胞中に本発明のＤＮＡ分子を注入することを含む、リガンド依存性イオンチャネル活性測定の電気生理学的試験用発現系である。イオンチャネル活性の研究におけるアフリカツメガエル卵母細胞の一般的使用は、当分野で公知である（Ｄａｓｃａｌ、１９８７、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２２：３１７−３１７；Ｌｅｓｔｅｒ、１９８８、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１：１０５７−１０６３；また、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ．２０７、１９９２、Ｃｈ．１４−２５、Ｒｕｄｙ ａｎｄ Ｉｖｅｒｓｏｎ、ｅｄ．、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）。チャネル活性、および作動薬および／または拮抗薬による調節を測定する改良法で、以前の技術より感度が７倍高い方法が存在する。アフリカツメガエル卵母細胞に、依存性チャネルをコードするＤＮＡ、ｍＲＮＡまたはｃＲＮＡを含むが、これらに限らない核酸物質を注入し、そのチャネルの活性ならびに様々なモジュレーターに対するチャネルの反応を測定する。塩素イオンに対する逆転電位より陽性の（即ち、−３０ｍＶより大きい）、好ましくは約０ｍＶの保持電位を利用することによって、イオンチャネル活性が測定される。試験測定条件のこの変化によって、リン酸イベルメクチンによる調節に対する試験感度が１０倍増加する。したがって、この改良試験は、以前には検出不能と考えられた水準のＬＧＩＣ活性を調節する化合物のスクリーニングおよび選択を可能とする。
【００９２】
ＤｍＬＧＩＣをクローニングするために、様々な手順のいずれを使用してもよい。これらの方法は以下の方法を含むが、それらに限らない。（１）ＲＡＣＥ ＰＣＲクローニング法（Ｆｒｏｈｍａｎ、ｅｔ ａｌ．、１９８８、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：８９９８−９００２）。完全長ｃＤＮＡ配列を作製するために、５’および／または３’ＲＡＣＥを行ってもよい。この戦略では、ＤｍＬＧＩＣ ｃＤＮＡのＰＣＲ増幅のために、遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプライマーの使用が必要である。これらの遺伝子特異的プライマーは、公然と入手し得る任意数の核酸およびタンパク質データベースを捜すことによって同定された、発現配列タグ（ＥＳＴ）ヌクレオチド配列の同定を経て設計される；（２）適切な発現ベクター系においてＤｍＬＧＩＣ含有ｃＤＮＡライブラリを構築した後の、ＤｍＬＧＩＣ ｃＤＮＡの直接的な機能性発現；（３）ＤｍＬＧＩＣタンパク質のアミノ酸配列から設計した標識縮重オリゴヌクレオチドプローブによる、バクテリオファージまたはプラスミドシャトルベクター中に構築したＤｍＬＧＩＣ含有ｃＤＮＡライブラリの検索；（４）ＤｍＬＧＩＣタンパク質をコードする部分的ｃＤＮＡによる、バクテリオファージまたはプラスミドシャトルベクター中に構築したＤｍＬＧＩＣ含有ｃＤＮＡライブラリの検索。この部分的ｃＤＮＡは、ＤｍＬＧＩＣタンパク質と関連する他のキナーゼに対して知られているアミノ酸配列からの縮重オリゴヌクレオチドプライマーの設計を介した、ＤｍＬＧＩＣ ＤＮＡ断片の特異的ＰＣＲ増幅によって得られる；（５）哺乳動物ＤｍＬＧＩＣタンパク質と相同性を有する部分的ｃＤＮＡまたはオリゴヌクレオチドによる、バクテリオファージまたはプラスミドシャトルベクター中に構築したＤｍＬＧＩＣ含有ｃＤＮＡライブラリの検索。この戦略には、前記のＥＳＴとして同定された、ＤｍＬＧＩＣ ｃＤＮＡのＰＣＲ増幅用遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプライマーの使用も必要となるかもしれない；あるいは、（６）鋳型として配列番号１、３および５を用いて５’および３’遺伝子特異的オリゴヌクレオチドを設計することによって、完全長ｃＤＮＡを公知のＲＡＣＥ法で作製するか、または、ＤｍＬＧＩＣをコードする全長型のヌクレオチド配列を分離することを目的として、ｃＤＮＡおよび／またはゲノムライブラリの多型のひとつを検索するプローブとして使用するコード化領域の一部を作製し、分離するために、同様に公知のＲＡＣＥ法でコード化領域の一部を作製すること。あるいは、ＤｍＬＧＩＣ ｃＤＮＡを、実施例１節に記載のようにクローニングしてもよい。簡潔には、２種の新規なリガンド依存性イオンチャネル遺伝子、ＡＣ０５およびＡＣ１５をコードすると思われる部分配列を、拡張Ｓｍｉｔｈ Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを用いたショウジョウバエゲノム配列決定プロジェクトにおいて同定した。参照配列は、線虫（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）グルタミン酸依存性イオンチャネルのａｖｒ−１５ａペプチド配列（登録番号ＡＪ０００５３８）であり、調査したＤＮＡデータベースは、公開されているショウジョウバエと高効率のゲノム配列であった。その調査は、Ｃｏｍｐｕｇｅｎ Ｂｉｏｃｅｌ ＸＬＰハードウェアサーチエンジン（Ｐｅｔａｃｈ Ｔｉｋｖａ，イスラエル）上で行った。データベース中に入力した両配列は、予測されたイントロンを含んでいた。Ａｃ０５またはＡｃ１５に特異的なプライマーを、そのデータベース配列に基いて設計した。これらのプライマーの組合せを用いて、全てのハエの全ＲＮＡ上でのＲＴ−ＰＣＲ、次いでＴＡクローニングを両遺伝子に対して行った。Ａｃ０５、Ａｃ１５の双方に対する長さが約５００ｂｐの断片を分離し、ＤＮＡ配列決定によって確認した。ポリＡ^＋ＲＮＡをＯｒｅｇｏｎ Ｒ Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａの全身から精製し、二本鎖ｃＤＮＡを作製するために使用した。両遺伝子に対する５’および３’ＲＡＣＥ断片を、第１回目のＰＣＲおよびｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲによって得た。生成した断片の大きさは、３’ＲＡＣＥではＡｃ０５に対して約１．３ｋｂ、Ａｃ１５に対して約１．８ｋｂであった。５’ＲＡＣＥでは、Ａｃ０５、Ａｃ１５は共に、大きさ約１ｋｂの断片を有している。そのＰＣＲ産物をｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯベクター中にクローニングした。スプライシングされたクローンとされていないクローンを分離するために、ＤＮＡ小試料を制限酵素で消化して検索した。５’および３’ＲＡＣＥ産物から得た配列を用いて、完全長クローンを作製するために、両遺伝子に対するＰＣＲプライマー設計した。第１回ＰＣＲに対してプライマーＡｃ０５ Ｆ１およびＲ１、第２回ＰＣＲに対してプライマーＡｃ０５ Ｆ１およびＲ２を用いて、ｃＤＮＡクローンＡｃ０５−１０およびＡｃ０５−１１を作製した。第１回ＰＣＲに対してプライマーＡｃ１５ Ｆ１およびＲ１を用いて、ｃＤＮＡクローンＡｃ１５−４およびＡｃ１５−２５を作製した。そのＰＣＲ産物をｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯベクター中にクローニングした。Ａｃ０５の２種のクローン、Ａｃ０５−１０（１５１８ｂｐ）およびＡｃ０５−１１（１５０６ｂｐ）が同定された。これらのクローンは、Ａｃ０５−１０中のＭ３−Ｍ４細胞内ループ内の４個のアミノ酸挿入を別とすれば、同一である（配列番号２に示した、アミノ酸残基３７５位からアミノ酸残基３７８位までのＳｅｒ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ挿入）。Ａｃ１５の２種のクローン、Ａｃ１５−４（２０７３ｂｐ）およびＡｃ１５−２５（２０３４ｂｐ）も同定され、それらは同じタンパク質配列を予測しているが、１４５５ヌクレオチドの読み取り枠内のヌクレオチド１６個が異なる。
【００９３】
他の型のライブラリ、ならびに他の細胞型や種型から構築したライブラリが、ＤｍＬＧＩＣコード化ＤＮＡまたはＤｍＬＧＩＣ相同体を分離するために有用であることは、当業者には自明である。他の型のライブラリは、他の細胞に由来するｃＤＮＡライブラリを含むが、それに限定されない。
【００９４】
ＤｍＬＧＩＣ活性を有する細胞や細胞系から適当なｃＤＮＡライブラリを調製し得ることは、当業者には自明である。このような目的に利用できる任意の既知の試験を用いて、細胞結合ＤｍＬＧＩＣ活性を最初に測定することでＤｍＬＧＩＣをコードするｃＤＮＡを分離するために、ｃＤＮＡライブラリの調製に使用する細胞や細胞系を選択しうる。
【００９５】
ｃＤＮＡライブラリの調製は、当分野で周知の標準的技法によって行いうる。周知のｃＤＮＡライブラリ構築法は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．、１９８９、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋに見出すことができる。相補的ＤＮＡライブラリを、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．およびＳｔｒａｔａｇｅｎｅを含み、これらに限定されない多数の市販源から得てもよい。
【００９６】
ＤｍＬＧＩＣをコードするＤＮＡを適当なゲノムＤＮＡライブラリから分離し得ることも、当業者には自明である。ゲノムＤＮＡライブラリの構築は、当分野で周知の標準的技法によって行いうる。周知のゲノムＤＮＡライブラリの構築法は、前記のＳａｍｂｒｏｏｋ等に見出すことができる。特に、Ｐ１人工染色体ベクター中にゲノムライブラリを調製し、そこから本明細書に開示するＤｍＬＧＩＣヌクレオチド配列に基くプローブを用いて、ＤｍＬＧＩＣを含むゲノムクローンを分離してもよい。このようなライブラリを調製する方法は、当分野で公知である（Ｉｏａｎｎｏｕ ｅｔ ａｌ．、１９９４、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．６：８４−８９）。
【００９７】
好ましい方法中の一法によってＤｍＬＧＩＣ遺伝子をクローニングするために、ＤｍＬＧＩＣまたは相同タンパク質のアミノ酸配列やＤＮＡ配列が必要となるかもしれない。これを実現するために、各ＤｍＬＧＩＣタンパク質を精製し、部分的アミノ酸配列を自動化した配列分析装置で決定してもよい。全アミノ酸配列を決定する必要はないが、部分的なＤｍＬＧＩＣ ＤＮＡ断片をＰＣＲ増幅するために、６から８アミノ酸の２領域の線状配列を決定することができる。適当なアミノ酸配列を同定してしまうと、それらをコードすることのできるＤＮＡ配列を合成する。遺伝暗号は縮重しているので、特定のアミノ酸をコードするために複数のコドンを使用してもよく、したがって、そのアミノ酸配列は、一組の類似したＤＮＡオリゴヌクレオチドのいずれによってもコードされ得る。その一組中の１種だけがＤｍＬＧＩＣ配列と同一であると思われるが、その一組中の他のものも、ミスマッチを有するＤＮＡオリゴヌクレオチドの存在下でさえ、ＤｍＬＧＩＣ ＤＮＡとハイブリッドを形成することができると思われる。ミスマッチを有するＤＮＡオリゴヌクレオチドは、それでも、ＤｍＬＧＩＣコード化ＤＮＡの同定および分離を可能とするのに十分なだけ、ＤｍＬＧＩＣ ＤＮＡとハイブリッドを形成するかもしれない。あるいは、発現された配列の一領域のヌクレオチド配列を、１個または複数の入手可能なゲノムデータベースを調査することによって同定してもよい。ｃＤＮＡライブラリとｃＤＮＡ集合体のいずれかから、関心のあるｃＤＮＡのＰＣＲ増幅を行うために、遺伝子特異的プライマーを使用してもよい。前記のように、ＤｍＬＧＩＣをコードする完全長配列を作製するために、重複する５’および３’ＲＡＣＥ産物を分離する目的で、あるいは、ＤｍＬＧＩＣまたはＤｍＬＧＩＣ様タンパク質をコードする完全長配列を分離するために、１種または複数のｃＤＮＡ系またはゲノム系ライブラリを検索するプローブとして用いる、ＲｓＧｌｕＣｌをコードするヌクレオチド配列の一部を分離する目的で、ＰＣＲ基準法に用いる適当なヌクレオチド配列を配列番号１、３、５または６から得てもよい。
【００９８】
本発明は、ＤｍＬＧＩＣ遺伝子を含むベクター、そのベクターを含む宿主細胞、およびＤｍＬＧＩＣ遺伝子を宿主細胞に導入する段階、およびＤｍＬＧＩＣの生成に適当な条件下で宿主細胞を培養する段階を含む実質的に純粋なＤｍＬＧＩＣタンパク質を生産する方法も含んでいる。このようにして生産したＤｍＬＧＩＣを従来の方法で宿主細胞から収穫してもよい。したがって、本発明は、ＤｍＬＧＩＣタンパク質および本明細書で開示する生物学的同等物を発現する方法、これらの遺伝子産物を用いる試験、これらのタンパク質を発現するＤＮＡ構築体を含む組換え宿主細胞、およびこれらの試験により、ＤｍＬＧＩＣ活性の作動薬や拮抗薬として作用することが確認された化合物にも関する。
【００９９】
前記の方法で得たクローニングしたＤｍＬＧＩＣ ｃＤＮＡを、適当なプロモーターおよび他の転写調節因子を含む（ｐｃＤＮＡ３．ｎｅｏ、ｐｃＤＮＡ３．１、ｐＣＲ２．１、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ、ｐＢｌｕｅＢａｃＨｉｓ２またはｐＬＩＴＭＵＳ２８、ならびに以下に列挙する他の例等の）発現ベクター中への分子クローニングによって組換えで発現させ、かつ原核または真核宿主細胞中に導入することによって、組換えＤｍＬＧＩＣを産生させてもよい。本明細書では、発現ベクターを、適当な宿主細胞において、クローニングしたＤＮＡを転写し、そのｍＲＮＡを翻訳するのに必要なＤＮＡ配列と定義する。このようなベクターの使用によって、細菌、藍藻、植物細胞、昆虫細胞、動物細胞等の様々な宿主細胞中に真核細胞ＤＮＡを発現することができる。特定の設計をされたベクターは、細菌−酵母、細菌−動物細胞等の宿主間でのＤＮＡの移動を可能にする。適切に構築した発現ベクターは、宿主細胞中における自律複製用複製源、選択可能なマーカー、限定数の有用な制限酵素部位、高コピー能、および活性なプロモーターを含むはずである。プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼがＤＮＡに結合し、ＲＮＡ合成を開始するように指示するＤＮＡ配列と定義される。強力なプロモーターは、高頻度でｍＲＮＡを開始させる。最適量のＤｍＬＧＩＣを産生するＤｍＬＧＩＣ ｃＤＮＡ配列を決定するために、次のものを含むが、それらに限らないｃＤＮＡ分子を構築できる：ＤｍＬＧＩＣに対する完全長読み取り枠を含むｃＤＮＡ断片、ならびにそのタンパク質の特異的ドメインまたはそのタンパク質の再配列ドメインのみをコードするｃＤＮＡ部分を含む様々な構築体。ＤｍＬＧＩＣ ｃＤＮＡの５’および／または３’非翻訳領域を全く含まないか、その全部または一部を含むように、全ての構築体を設計することができる。これらの構築体を適当な宿主細胞中に単独および組合せて導入した後、ＤｍＬＧＩＣの発現量および活性を決定することができる。暫定的試験で最適発現を生じるＤｍＬＧＩＣ ｃＤＮＡカセットを決定した後、このＤｍＬＧＩＣ ｃＤＮＡ構築体を、哺乳動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、卵母細胞、細菌、および酵母細胞用のものを含むが、それらに限らない（組換えウィルスを含む）様々な発現ベクターに導入する。該操作の技法は前記のＳａｍｂｒｏｏｋ等に記載されており、それらは当業者に周知であり、利用可能である。したがって、本発明の他の態様は、ＤｍＬＧＩＣをコードするＤＮＡ配列を含み、かつ／または発現するように処理された宿主細胞を含む。組換え宿主細胞中にＤｍＬＧＩＣを発現させるために、ＤｍＬＧＩＣ様タンパク質をコードするＤＮＡを含んだ発現ベクターを使用してもよい。ＤｍＬＧＩＣまたは生物学的等価形態を産生するために、このような組換え宿主細胞を適当な条件下で培養することができる。発現ベクターは、クローニングベクター、修飾クローニングベクター、特定の設計がなされたプラスミドまたはウィルスを含むが、それらに限らない。組換えＤｍＬＧＩＣの発現に適当と思われる市販の哺乳細胞用発現ベクターは、ｐｃＤＮＡ３．ｎｅｏ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＣＩ−ｎｅｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ｐＬＩＴＭＵＳ２８、ｐＬＩＴＭＵＳ２９、ｐＬＩＴＭＵＳ３８およびｐＬＩＴＭＵＳ３９（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌｏａｂｓ）、ｐｃＤＮＡＩ、ｐｃＤＮＡＩａｍｐ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＭＣ１ｎｅｏ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＸＴ１（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＳＧ５（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ＥＢＯ−ｐＳＶ２−ｎｅｏ（ＡＴＣＣ３７５９３）、ｐＢＰＶ−１（８〜２）（ＡＴＣＣ３７１１０）、ｐｄＢＰＶ−ＭＭＴｎｅｏ（３４２〜１２）（ＡＴＣＣ３７２２４）、ｐＲＳＶｇｐｔ（ＡＴＣＣ３７１９９）、ｐＲＳＶｎｅｏ（ＡＴＣＣ３７１９８）、ｐＳＶ２−ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣ３７１４６）、ｐＵＣＴａｇ（ＡＴＣＣ３７４６０）、およびｌＺＤ３５（ＡＴＣＣ３７５６５）を含むが、それらに限らない。また、細菌細胞中に組換えＤｍＬＧＩＣを発現させるために、様々な細菌用発現ベクターを用いてもよい。組換えＤｍＬＧＩＣの発現に適当と思われる市販の細菌用発現ベクターは、ｐＣＲ２．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＥＴ１１ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ）、ｌａｍｂｄａ ｇｔ１１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、およびｐＫＫ２２３−３（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を含むが、それらに限らない。その上、菌類細胞中に組換えＤｍＬＧＩＣを発現させるために、様々な菌類細胞用発現ベクターを用いてもよい。組換えＤｍＬＧＩＣの発現に適当と思われる市販の菌類細胞用発現ベクターは、ｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびＰｉｃｈｉａ発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含むが、それらに限らない。また、昆虫細胞中に組換えタンパク質を発現させるために、様々な昆虫細胞用発現ベクターを用いてもよい。組換えＤｍＬＧＩＣの組換え発現に適当と思われる市販の昆虫細胞用発現ベクターは、ｐＢｌｕｅＢａｃＩＩＩおよびｐＢｌｕｅＢａｃＨｉｓ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、およびｐＡｃＧ２Ｔ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を含むが、それらに限らない。
【０１００】
組換え宿主細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉ等の細菌、酵母等の菌類細胞、ウシ、ブタ、サルおよび齧歯類起源の細胞系を含むが、それらに限らない哺乳動物細胞、およびショウジョウバエや蚕由来の細胞系を含むが、それらに限らない昆虫細胞を含んでいるが、それらに限らない原核または真核細胞であってもよい。例えば、昆虫の一発現系は、バキュロウィルス発現ベクター（ｐＡｃＧ２Ｔ、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）と共に、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（Ｓｆ２１）昆虫細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を利用する。また、適当と思われ、市販されている哺乳細胞種は、Ｌ細胞Ｌ−Ｍ（ＴＫ⁻）（ＡＴＣＣ ＣＣＬ１．３）、Ｌ細胞Ｌ−Ｍ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ１．２）、Ｓａｏｓ−２（ＡＴＣＣ ＨＴＢ−８５）、２９３（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１５７３）、Ｒａｊｉ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ８６）、ＣＶ−１（ＡＴＣＣ ＣＣＬ７０）、ＣＯＳ−１（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６５０）、ＣＯＳ−７（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６５１）、ＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣ ＣＣＬ６１）、３Ｔ３（ＡＴＣＣ ＣＣＬ９２）、ＮＩＨ／３Ｔ３（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６５８）、ＨｅＬａ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ２）、Ｃ１２７Ｉ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６１６）、ＢＳ−Ｃ−１（ＡＴＣＣ ＣＣＬ２６）、ＭＲＣ−５（ＡＴＣＣ ＣＣＬ１７１）およびＣＰＡＥ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ２０９）を含むが、それらに限らない。
【０１０１】
ＤｍＬＧＩＣに対する親和性を示す化合物の結合特異性は、クローニングした受容体を発現する組換え細胞、またはこれらの細胞由来の膜に対する、その化合物の親和性を測定することによって示される。クローニングした受容体の発現、およびＤｍＬＧＩＣに結合するか、またはＤｍＬＧＩＣの既知の放射能標識リガンドのこれらの細胞やこれらの細胞由来の膜への結合を阻害する化合物のスクリーニングは、ＤｍＬＧＩＣに対する高い親和性を有する化合物を迅速に選択する効果的な方法を提供する。このようなリガンドは、必ずしも放射能標識する必要はなく、結合している放射能標識化合物に置換するために使用し得るか、機能性試験で活性剤として使用し得る非同位体性化合物であってもよい。前記方法によって確認される化合物は、ＤｍＬＧＩＣの作動薬か拮抗薬であると思われ、ペプチド、タンパク質、または非タンパク質性の有機分子であるかもしれない。
【０１０２】
したがって、本発明は、ＤｍＬＧＩＣタンパク質をコードするＤＮＡまたはＲＮＡの発現を調節する化合物、ならびにＤｍＬＧＩＣタンパク質の機能を変化させる化合物をスクリーニングする方法を対象とする。他の受容体の作動薬および拮抗薬を確認する方法は、当分野で周知であり、それらをＤｍＬＧＩＣチャネルの作動薬および拮抗薬を確認するように適合させることができる。例えば、Ｃａｓｃｉｅｒｉ等（１９９２、Ｍｏｌｅｃ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４１：１０９６〜１０９９）は、ラットのニューロキニン受容体に結合する作動薬を阻害し、したがってニューロキニン受容体の作動薬または拮抗薬となり得る物質を確認する方法を記載している。その方法では、ＣＯＳ細胞にラットのニューロキニン受容体を含む発現ベクターをトランスフェクトし、ニューロキニン受容体の発現を可能とするに十分な時間の間、トランスフェクトしたその細胞を成長させ、トランスフェクトしたその細胞を収穫し、ニューロキニン受容体の既知の放射活性標識作動薬を含む試験緩衝液中に、その物質の存在下または不在下のいずれかでその細胞を再懸濁し、次いでニューロキニン受容体の既知の放射活性標識作動薬のニューロキニン受容体への結合を測定する。公知の作動薬の結合量がその物質の不在下より存在下で少なければ、その場合、その物質はニューロキニン受容体の作動薬または拮抗薬となり得る。作動薬、拮抗薬等のその物質のＤｍＬＧＩＣへの結合を測定する場合、標識物質または作動薬を用いることによって、このような結合を測定することができる。当分野に公知られている任意の適当な方法で、例えば、放射活性、蛍光、酵素によって、物質または作動薬を標識することができる。
【０１０３】
関心のあるＤｍＬＧＩＣ遺伝子を発現させるためのアフリカツメガエル卵母細胞の使用に関して前記したように、本発明は、ＤｍＬＧＩＣタンパク質をコードするＤＮＡまたはＲＮＡの発現を調節する化合物をスクリーニングする方法を対象とする。これらの活性を調節する化合物は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ペプチド、タンパク質、あるいは非タンパク質性の有機であるかもしれない。化合物は、ＤｍＬＧＩＣをコードするＤＮＡまたはＲＮＡの発現、あるいはＤｍＬＧＩＣ系チャネルの機能を増加または減少させることによって、調節すると思われる。ＤｍＬＧＩＣをコードするＤＮＡまたはＲＮＡの発現、あるいはその生物学的機能（即ち、ヒスタミンまたは他のリガンド、および／または野生型チャネルを活性化する化合物によるチャネル活性化）を調節する化合物は、様々な試験によって検出し得る。その試験は、発現や機能の変化があるか否かを決定する単純な「肯定／否定」試験であってもよい。試験試料の発現や機能（即ち、チャネル活性の効果）を標準試料の発現や機能のレベルと比較することによって、その試験を定量化してもよい。ＤｍＬＧＩＣ、ＤｍＬＧＩＣに対する抗体、または修飾ＤｍＬＧＩＣを含むキットを、このような用途のために既知の方法で調製してもよい。
【０１０４】
この目的のために、本発明は、ＤｍＬＧＩＣ受容体活性を調節する物質を確認する方法に部分的に関するものであって、その方法では、
（ａ）配列番号４および／または７に示すアミノ酸配列を含むＤｍＬＧＩＣ受容体タンパク質の存在下、および不在下で試験物質を合わせ、かつ
（ｂ）ＤｍＬＧＩＣ受容体タンパク質の存在下および不在下で、その試験物質の作用を測定し、比較すること
が必要である。
【０１０５】
その上、ＤｍＬＧＩＣ受容体タンパク質の発現を指示する発現ベクターと共に、技術者が利用し得る多型のスクリーニングまたは選択試験を示すために、幾つかの特定の実施形態を本明細書に開示している。他の受容体の作動薬および拮抗薬を確認する方法は当分野で周知であり、それらをＤｍＬＧＩＣの作動薬および拮抗薬の確認に適合させることができる。したがって、これらの実施形態を例として提示するが、制限するためのものではない。この目的のために、本発明は、（作動薬、拮抗薬等の）ＤｍＬＧＩＣモジュレーターを確認し得る試験を含む。したがって、本発明は、ある物質がＤｍＬＧＩＣの作動薬または拮抗薬となり得るか否かを決定する方法であって、
（ａ）細胞中においてＤｍＬＧＩＣの発現を指示する発現ベクターで、その細胞をトランスフェクトまたは形質転換することによって、試験細胞を作製すること、
（ｂ）ＤｍＬＧＩＣの発現を可能にするのに十分な時間の間、かつ機能性チャネルが作製するように、その試験細胞を成長させること、
（ｃ）その物質の存在下、および不在下で、その細胞をＤｍＬＧＩＣの標識リガンドに曝すこと、
（ｄ）その標識リガンドのＤｍＬＧＩＣチャネルへの結合量を測定すること
を含み、その標識リガンドの結合量がその物質の不在下より存在下で少ない場合、その物質がＤｍＬＧＩＣの作動薬または拮抗薬となり得るとする方法を含む。
【０１０６】
この方法の段階（ｃ）を実施する条件は、タンパク質−リガンド相互作用を調べるために当分野で通常使用する条件：例えば、生理的ｐＨ；ＰＢＳ等の通常用いられる緩衝液で代表されるか、または組織培養培地中のような塩条件；約４℃から約５５℃の温度である。その試験細胞を収穫し、その物質およびその標識リガンドの存在下で再懸濁してもよい。前記方法の一改良法では、その細胞を収穫し、再懸濁するのではなく、細胞を基材、例えば組織培養皿に付着させた状態で、細胞に知られている放射能標識作動薬およびその物質を接触させるように、段階（ｃ）を改良する。
【０１０７】
また、本発明は、ある物質がＤｍＬＧＩＣと結合することができるか否か、即ちその物質がＤｍＬＧＩＣチャネル活性化の作動薬または拮抗薬となり得るか否かを決定する方法であって、
（ａ）細胞中においてＤｍＬＧＩＣの発現を指示する発現ベクターで、その細胞をトランスフェクトまたは形質転換することによって、試験細胞を作製すること、
（ｂ）その試験細胞をその物質に曝すこと、
（ｃ）その物質のＤｍＬＧＩＣへの結合量を測定すること、
（ｄ）その試験細胞におけるその物質のＤｍＬＧＩＣへの結合量を、ＤｍＬＧＩＣでトランスフェクトされていない対照細胞へのその物質の結合量と比較すること
を含み、その物質の結合量が、対照細胞と比較して試験細胞中で大きい場合、その物質はＤｍＬＧＩＣに結合することができるとする方法も含む。次いで、その物質が実際に作動薬または拮抗薬であるか否かの決定を、例えば、以下に記載の様々なＧタンパク質を用いる試験等の機能性試験の使用によって実現することができる。
【０１０８】
この方法の段階（ｂ）を実施する条件は、タンパク質−リガンド相互作用を調べるために当分野で常使用する条件：例えば、生理的ｐＨ；ＰＢＳ等の通常用いられる緩衝液で代表されるか、または組織培養培地中のような塩条件；約４℃から約５５℃の温度である。その試験細胞を収穫し、その物質の存在下で再懸濁する。
【０１０９】
前記試験は機能性試験であってよく、その場合、電気生理学的試験（例えば、実施例２を参照されたい）をトランスフェクトした哺乳動物細胞系、ならびにアフリカツメガエル卵母細胞中で行うことによって、試験化合物が（ヒスタミンまたはグルタミン酸等の）既知リガンドのチャネル活性化能力に及ぼす様々な効果を測定するか、あるいは、本質的に自然に活性を調節する（知られているＧｌｕＣｌチャネルに対するイベルメクチンの作用に類似した）試験化合物を探索してもよい。したがって、技術者であれば、本発明の機能性ＤｍＬＧＩＣチャネルを結合および／または活性化する化合物を選択する一次および二次スクリーニング用の公知の技法で、本発明のｃＤＮＡクローンを適合させうると思われる。
【０１１０】
ＤｍＬＧＩＣの量をスクリーニングし、測定するために、本発明のＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、組換えタンパク質および抗体を使用してもよい。組換えタンパク質、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子および抗体は、ＤｍＬＧＩＣの検出およびタイプ決定に適したキットの処方に有用である。このようなキットは、少なくとも１個の容器を緊密に閉じ込めるのに適した仕切り付き運搬具を含むと思われる。更に、その運搬具は、組換えＤｍＬＧＩＣまたはＤｍＬＧＩＣの検出に適した抗ＤｍＬＧＩＣ抗体のような試薬を含むと思われる。また、その運搬具は、標識抗原または酵素基質等のような検出手段を含み得る。
【０１１１】
上記の試験は、ＤｍＬＧＩＣで一時的または安定にトランスフェクトした細胞を用いて実行することができる。発現ベクターは、形質転換、トランスフェクション、プロトプラスト融合、およびエレクトロポレーションを含むが、それらに限らず多数の技術の任意の一法を介して、宿主細胞中に導入してもよい。トランスフェクションとは、試験細胞中にＤｍＬＧＩＣを導入するための、当分野で公知の任意の方法を含むことを意味している。例えば、トランスフェクションは、リン酸カルシウムまたは塩化カルシウム介在トランスフェクション、リポフェクション、ＤｍＬＧＩＣを含んだレトロウィルス構築体による感染、およびエレクトロポレーションを含む。発現ベクター含有細胞は、ＤｍＬＧＩＣタンパク質を産生するか否かを決定するために、個別に分析する。ＤｍＬＧＩＣ発現細胞の確認は、抗ＤｍＬＧＩＣ抗体を用いた免疫反応性、標識リガンド結合、および／または宿主細胞関連ＤｍＬＧＩＣ活性を含むが、それらに限らない幾つかの手段によってなし得る。
【０１１２】
ＤｍＬＧＩＣに対する親和性を示す化合物の結合特異性は、クローニングした受容体を発現する組換え細胞、またはこれらの細胞由来の膜に対するその化合物の親和性を測定することによって示される。クローニングした受容体の発現、およびＤｍＬＧＩＣに結合するか、またはＤｍＬＧＩＣの放射能標識した既知リガンドのこれら細胞やこれら細胞から調製した膜への結合を阻害する化合物のスクリーニングは、ＤｍＬＧＩＣに対する高い親和性を有する化合物を迅速に選択する効果的な方法を提供する。このようなリガンドは、必ずしも放射能標識する必要はなく、結合中の放射能標識化合物に置き換わるために使用し得るか、あるいは機能性試験で活性化剤として使用し得る非同位体性化合物であってもよい。前記方法によって確認される化合物は、ＤｍＬＧＩＣの作動薬か拮抗薬であると思われ、ペプチド、タンパク質、あるいは非タンパク質性の有機分子であるかもしれない。
【０１１３】
したがって、本発明は、ＤｍＬＧＩＣをコードするＤＮＡまたはＲＮＡの発現を調節する化合物、ならびにＤｍＬＧＩＣタンパク質の機能を変化させる化合物をスクリーニングする方法を対象としている。他の受容体の作動薬および拮抗薬を確認する方法は当分野で周知であり、それらをＤｍＬＧＩＣの作動薬および拮抗薬を同定するのに適合させることができる。例えば、Ｃａｓｃｉｅｒｉ等（１９９２，Ｍｏｌｅｃ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４１：１０９６−１０９９）は、ラットのニューロキニン受容体に結合する作動薬を阻害し、したがってニューロキニン受容体の作動薬または拮抗薬となり得る物質を同定する方法を記載している。その方法では、ＣＯＳ細胞にラットのニューロキニン受容体を含む発現ベクターをトランスフェクトし、ニューロキニン受容体の発現を可能とするに十分な時間、トランスフェクトしたその細胞を培養し、トランスフェクトしたその細胞を回収し、ニューロキニン受容体の既知の放射能標識作動薬を含む試験緩衝液中に、その物質の存在下または不在下のいずれかでその細胞を再懸濁し、次いでニューロキニン受容体の既知のその放射能標識作動薬のニューロキニン受容体への結合を測定する。既知作動薬の結合量がその物質の不在下より存在下で少なければ、その場合、その物質はニューロキニン受容体の作動薬または拮抗薬となり得る。作動薬、拮抗薬等のその物質の結合量を測定する場合、標識した物質または作動薬を用いることによって、このような結合を測定することができる。その物質または作動薬を、当分野に公知の任意の適当な方法で、例えば放射能、蛍光、酵素によって標識することができる。
【０１１４】
したがって、ＤｍＬＧＩＣに対する親和性を示す化合物の結合特異性は、クローニングした受容体を発現する組換え細胞、またはこれらの細胞由来の膜に対するその化合物の親和性を測定することによって示される。クローニングした受容体の発現、およびＤｍＬＧＩＣに結合するか、またはＤｍＬＧＩＣの（グルタミン酸、イベルメクチンまたはノジューリスポア酸等の）放射能標識した既知リガンドのこれら細胞やこれら細胞から調製した膜への結合を阻害する化合物のスクリーニングは、ＤｍＬＧＩＣに対する高い親和性を有する化合物を迅速に選択する効果的な方法を提供する。このようなリガンドは、必ずしも放射能標識する必要はなく、結合中の放射能標識化合物に置換するために使用し得るか、あるいは機能性試験で活性剤として使用し得る非同位体性化合物であってもよい。前記方法によって同定される化合物は、やはりＤｍＬＧＩＣの作動薬か拮抗薬であると思われ、ペプチド、タンパク質、あるいは非タンパク質性の有機分子であるかもしれない。本明細書の他の部分に記したように、化合物は、ＤｍＬＧＩＣをコードするＤＮＡまたはＲＮＡの発現を増加または減少させることによって、あるいはＤｍＬＧＩＣ受容体タンパク質の作動薬または拮抗薬として作用することによって、調節すると思われる。この場合もＤｍＬＧＩＣをコードするＤＮＡまたはＲＮＡの発現、あるいはその生物学的機能を調節するこれらの化合物は、様々な試験によって検出し得る。その試験は、発現や機能の変化があるか否かを決定する単純な「肯定／否定」試験であってもよい。試験試料の発現や機能を標準試料の発現や機能のレベルと比較することによって、その試験を定量化してもよい。
【０１１５】
ＤｍＬＧＩＣ ＤＮＡの発現を、ｉｎ ｖｉｔｒｏで生成した合成ｍＲＮＡを用いて行ってもよい。合成ｍＲＮＡは、小麦の麦芽抽出物および網状赤血球抽出物を含むが、それらに限らず様々な無細胞系において効果的に翻訳できるだけでなく、カエル卵母細胞中へのマイクロインジェクションを含むが、それに限らず細胞に基く系においても効果的に翻訳することができるが、後者の場合、カエル卵母細胞中へのマイクロインジェクションが好ましい。
【０１１６】
宿主細胞中でのＤｍＬＧＩＣの発現後、ＤｍＬＧＩＣタンパク質を回収することによって活性体のＤｍＬＧＩＣタンパク質を提供してもよい。ＤｍＬＧＩＣタンパク質の幾つかの精製手順が利用でき、使用に適している。塩分画、イオン交換クロマトグラフィ、サイズ排除クロマトグラフィ、ヒドロキシアパタイト吸着クロマトグラフィおよび疎水性相互作用クロマトグラフィの様々な組合せや個々の適用によって、組換えＤｍＬＧＩＣタンパク質を細胞溶解物および抽出物から精製してもよい。その上、完全長ＤｍＬＧＩＣタンパク質、またはＤｍＬＧＩＣタンパク質のポリペプチド断片に特異的なモノクローナル抗体やポリクローナル抗体で作製したイムノ親和性カラムを用いて、組換えＤｍＬＧＩＣタンパク質を他の細胞タンパク質から分離することができる。
【０１１７】
ＤｍＬＧＩＣ、あるいは配列番号２、４、および／または７に開示したＤｍＬＧＩＣの一部に由来する（普通、長さが約９個から約２５個のアミノ酸の）合成ペプチドに対する、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を産生してもよい。ＤｍＬＧＩＣに対する単一特異性抗体は、ＤｍＬＧＩＣに対して反応性の抗体を含む哺乳動物抗血清から精製されるか、またはＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５、Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５〜４９７）の技法を用いて、ＤｍＬＧＩＣと反応性のモノクローナル抗体として調製される。本明細書で使用する単一特異性抗体とは、ＤｍＬＧＩＣに対する均一結合特性を有する単一の抗体種または多数の抗体種と定義する。本明細書で使用する均一結合は、その抗体種が、前記のＤｍＬＧＩＣと結合する種のように、特異的な抗原やエピトープと結合する能力を指す。ヒトのＤｍＬＧＩＣ特異的抗体は、免疫アジュバントと共に、またはそれなしに、ＤｍＬＧＩＣタンパク質、またはＤｍＬＧＩＣの一部分から作製した合成ペプチドの適当な濃度で、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ヤギ、ウマ等の動物を免疫することによって産生する。
【０１１８】
一次免疫の前に、免疫前血清を収集する。許容し得る免疫アジュバントと共に、ＤｍＬＧＩＣタンパク質を約０．１ｍｇから約１０００ｍｇ各動物に投与する。このような許容し得るアジュバントは、フロイントの完全アジュバント、フロイントの不完全アジュバント、ミョウバン沈降物、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍを含む油中水乳濁液およびｔＲＮＡを含むが、それらに限らない。初回免疫は、皮下（ＳＣ）、腹腔内（ＩＰ）またはその両径路による多部位における、好ましくはフロイントの完全アジュバント中のＤｍＬＧＩＣタンパク質またはそのペプチド断片からなる。各動物から一定の間隔、好ましくは毎週採血することによって、抗体価を決定する。動物には、初回免疫後、他免疫注射を行ってもよく行わなくてもよい。他免疫注射を受けるそれらの動物には、一般に、フロイントの不完全アジュバント中の等量のＤｍＬＧＩＣを同じ径路によって与えられる。最大の力価が得られるまで、約３週間隔で他免疫注射を与える。各他免疫から約７日後、または単回免疫から約１週後に、各動物から採血し、血清を収集し、その各分量を約−２０℃で保存する。
【０１１９】
ＤｍＬＧＩＣと反応性のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、同系交配のマウス、好ましくはＢａｌｂ／ｃをＤｍＬＧＩＣタンパク質で免疫することによって調製される。約０．５ｍｌの緩衝液または塩水を、前記のような同量の許容し得るアジュバント中に導入し、その中のＤｍＬＧＩＣタンパク質約１ｍｇから約１００ｍｇ、好ましくは約１０ｍｇでＩＰまたはＳＣ径路によりマウスを免疫する。フロイントの完全アジュバントが好ましい。初回免疫を０日にマウスに与え、約３週から約３０週の間休息を与える。免疫マウスに、リン酸緩衝塩水等の緩衝液中、ＤｍＬＧＩＣ約１ｍｇから約１００ｍｇの他免疫を１回または複数回、静脈内（ＩＶ）径路により与える。抗体陽性のマウスのリンパ球、好ましくは脾臓リンパ球は、当分野で知られている標準的手順で、免疫マウスから脾臓を除去することによって得られる。ハイブリドーマ細胞は、脾臓リンパ球を適当な融合相手の細胞、好ましくは骨髄腫細胞と、安定なハイブリドーマの形成を可能にすると思われる条件下で混合することによって産生される。融合相手の細胞は、各マウス骨髄腫Ｐ３／ＮＳ１／Ａｇ４−１、ＭＰＣ−１１、Ｓ−１９４およびＳｐ２／０を含んでもよいが、それらに限らず、好ましくはＳｐ２／０である。抗体産生細胞および骨髄腫細胞を、分子量約１０００、濃度約３０％から約５０％のポリエチレングリコール中で融合する。融合ハイブリドーマ細胞は、ヒポキサンチン、チミジンおよびアミノプテリン添加ダルベッコの改良イーグル培地（ＤＭＥＭ）中での増殖によって、当分野で公知の手順により選択される。上清液を約１４、１８および２１日に増殖陽性ウェルから収集し、抗原としてＤｍＬＧＩＣを用いて、固相イムノラジオアッセイ（ＳＰＩＲＡ）等のイムノアッセイにより産生した抗体をスクリーニングする。培養液もオクタロニー沈降検定で試験することによって、そのｍＡｂのアイソタイプを決定する。抗体陽性ウェルから得たハイブリドーマ細胞を、ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ、１９７３、Ｓｏｆｔ Ａｇａｒ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、ｉｎ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｋｒｕｓｅ ａｎｄ Ｐａｔｅｒｓｏｎ、Ｅｄｓ．、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓの軟寒天法等の技法によってクローニングした。
【０１２０】
モノクローナル抗体は、元の感作Ｂａｌｂ／ｃマウスに、感作後約４日に約２×１０^６から約６×１０^６のハイブリドーマ細胞を１匹当たり約０．５ｍｌで注入することによって、ｉｎ ｖｉｖｏで産生される。細胞導入後約８〜１２日に腹水を収集し、モノクローナル抗体を当分野で知られている技法で精製する。
【０１２１】
抗ＤｍＬＧＩＣ ｍＡｂのｉｎ ｖｉｔｒｏでの産生は、十分な量の特異的ｍＡｂを得るために、約２％のウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ中でハイブリドーマを増殖させることによって行われる。そのｍＡｂを当分野で公知の技法で精製する。
【０１２２】
腹水またはハイブリドーマ培養液の抗体価は、沈降、受動凝集、酵素連結イムノソルベント抗体（ＥＬＩＳＡ）法およびラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）法を含むが、それらに限らない様々な血清学的または免疫学的試験によって決定される。体液または組織および細胞抽出液中のＤｍＬＧＩＣの存在を検出するために、同様の試験を用いる。
【０１２３】
ＤｍＬＧＩＣペプチド断片、または各完全長ＤｍＬＧＩＣに対する特異抗体を産生するために、単一特異性抗体を産生する前記方法を利用し得ることは、当業者には容易に明らかである。
【０１２４】
ＤｍＬＧＩＣ抗体親和性カラムを、例えば、抗体がアガロースゲルビーズ支持体と共有結合を形成するように、Ｎ−ヒドロキシスクシニミドエステルで予備活性化したゲル支持体のＡｆｆｉｇｅｌ−１０（Ｂｉｏｒａｄ）にその抗体を添加することによって作製する。次いで、スペーサーアームを有するアミド結合を介して、抗体をゲルに連結する。次いで、残っている活性化エステルを１Ｍ エタノールアミンＨＣｌ（ｐＨ８）で消失させる。そのカラムを水、次いで０．２３Ｍ グリシンＨＣｌ（ｐＨ２．６）で洗浄することによって、非複合抗体や異物タンパク質を除去する。次いで、カラムをリン酸緩衝塩水（ｐＨ７．３）中で平衡化し、完全長ＤｍＬＧＩＣまたはＤｍＬＧＩＣタンパク質断片を含む細胞培養液上清または細胞抽出液を、ゆっくりとカラム中に通過させる。次いで、光学密度（Ａ_２８０）がバックグランド値に下がるまで、カラムをリン酸緩衝塩水で洗浄し、次にタンパク質を０．２３Ｍ グリシンＨＣｌ（ｐＨ２．６）で溶出する。次いで、精製ＤｍＬＧＩＣをリン酸緩衝塩水に対して透析する。
【０１２５】
また、本発明は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの培養に細胞を提供することによって、ＤｍＬＧＩＣまたは機能性ＤｍＬＧＩＣの任意の代替チャネルのモジュレーターとして、ｉｎ ｖｉｖｏで作用する様々な化合物の能力を調べるために有用な、ヒト以外のトランスジェニック動物にも関する。本発明のトランスジェニック動物に言及するに当たって、導入遺伝子および遺伝子に言及する。本明細書で使用する場合、導入遺伝子とは遺伝子を含んだ遺伝的構築体である。導入遺伝子は、当分野で公知の方法によって、動物の細胞中の１個または複数の染色体の中に組込まれる。一旦組込まれると、導入遺伝子は、トランスジェニック動物の各染色体中の少なくとも一箇所で担持される。当然ながら、遺伝子は、本明細書に記載のｃＤＮＡクローンの１種または組合せのように、タンパク質をコードするヌクレオチド配列である。遺伝子および／または導入遺伝子も、当分野で知られている遺伝調節因子および／または構造因子を含み得る。遺伝子導入のための標的細胞は、胚性幹細胞（ＥＳ）である。ｉｎ ｖｉｔｒｏで培養した着床前の胚からＥＳ細胞を得ることができ、それを胚と融合することができる（Ｅｖａｎｓ ｅｔ ａｌ．、１９８１、Ｎａｔｕｒｅ ２９２：１５４〜１５６；Ｂｒａｄｌｅｙ ｅｔ ａｌ．、１９８４、Ｎａｔｕｒｅ ３０９：２５５〜２５８；Ｇｏｓｓｌｅｒ ｅｔ ａｌ．、１９８６、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８３：９０６５〜９０６９；およびＲｏｂｅｒｔｓｏｎ ｅｔ ａｌ．、１９８６、Ｎａｔｕｒｅ ３２２：４４５〜４４８）。ＤＮＡトランスフェクション、マイクロインジェクション等の多様な標準技法、またはレトロウィルス介在形質導入によって、導入遺伝子をＥＳ細胞中に効果的に導入することができる。次いで、生成した形質転換ＥＳ細胞をヒト以外の動物由来の胚盤胞と結合することができる。次いで、導入ＥＳ細胞はその胚にコロニーを形成し、生成するキメラ動物の胚系に寄与する（Ｊａｅｎｉｓｃｈ、１９８８、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：１４６８〜１４７４）線虫ＬＧＩＣサブユニットの一方または両方をノックアウトされた線虫突然変異体において、野生型線虫のＬＧＩＣバックグランド中にＲｓＧｌｕＣｌ導入遺伝子をも発現するトランスジェニックまたはノックアウト無脊椎動物（例えば、線虫）を作製することも、当業者の範囲内にあると思われる。
【０１２６】
薬剤として許容し得る担体の混合物のような知られている方法により、ＤｍＬＧＩＣのモジュレーターを含む薬剤として有用な組成物を処方し得る。このような担体の例および処方の方法を、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ中に見出し得る。効果的投与に適した、薬剤として許容し得る組成物を形成するために、このような組成物は、有効量のタンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、修飾ＤｍＬＧＩＣ、あるいは、チロシンキナーゼ活性化剤または阻害剤を含むＤｍＬＧＩＣ作動薬または拮抗薬のいずれかを含むと思われる。
【０１２７】
本発明の治療または診断用組成物は、障害を治療または診断するのに十分な量で個体に投与される。有効量は、個体の状態、体重、性別、年齢等の様々な要因に応じて変化し得る。他の要因には投与方式が含まれる。
【０１２８】
その薬剤組成物を、皮下、局所、経口、筋肉内等の多様な径路によって個体に供してよい。
【０１２９】
「化学的誘導体」という用語は、普通は基本分子の一部でない他の化学的部分を含んだ分子を指す。このような部分は、基本分子の溶解性、半減期、吸収等を改良し得る。あるいは、その部分が、基本分子の好ましくない副作用を弱めるか、または基本分子の毒性を減少させるかもしれない。このような部分の例は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ等の様々なテキスト中に記載されている。
【０１３０】
本明細書に開示した方法に従って確認した化合物は、単独で適当な投与量で使用してもよい。あるいは、他の剤の同時投与または逐次投与が望ましいかもしれない。
【０１３１】
本発明は、本発明の新規な治療法に使用する適当な局所用、経口用、全身用および非経口用薬剤処方を提供する目的も有している。本明細書に従って確認した化合物を活性成分として含む組成物は、従来の投与用媒体中の非常に多様な治療剤形で投与することができる。例えば、錠剤、カプセル剤（適時放出および持続的放出処方を各々含む）、丸剤、散在、顆粒剤、エリキシール剤、チンキ剤、溶液剤、懸濁剤、シロップ剤、乳剤等の経口剤形で、または注射によって、それらの化合物を投与することができる。同様に、静脈内（ボーラスでも輸液でも）、腹腔内、皮下、閉塞を伴っているか、または伴っていない局所、または筋肉内の剤形で、全て製剤技術者によく知られた剤形を用いて、それらを投与することもできる。
【０１３２】
本発明の化合物を１日１回の用量で投与するか、または１日の全投薬量を１日２回、３回または４回の分割用量で投与するのが有利であるかもしれない。更にまた、適当な鼻腔内媒体の局所使用を介して鼻腔内剤形で、または、当業者によく知られた経皮性皮膚パッチの形態を用いて経皮径路で、本発明の化合物を投与することができる。経皮送達系の形態で投与するためには、投薬プログラムを通して、投薬は当然間欠的ではなく連続的になると思われる。
【０１３３】
投薬が別々に処方されている複数の活性剤を用いる併用療法に対しては、各活性剤を同時に投与するか、または時間をずらしてそれらを投与することができる。
【０１３４】
本発明の化合物を利用する投薬プログラムは、患者の型、種、年齢、体重、性別および医学的状態；治療すべき状態の重度；投与径路；患者の腎、肝および心血管機能；および使用する特定の化合物を含む様々な要因に応じて選択される。平均的技量の医師または獣医であれば、病状の進行を防止、阻止または抑止するのに必要な有効量の薬物を容易に決定し、処方することができる。毒性なしに効力を示す範囲内に、薬物濃度を最適な精度で実現するためには、標的部位に対するその薬物のアベイラビリティーの動態学に基く投薬プログラムが必要である。これには、薬物の分布、平衡、および消失に関する考察が必要である。
【０１３５】
以下の実施例を、本発明を例示するために提供するが、制限するために提供するものではない。
【０１３６】
実施例１
ＤｍＬＧＩＣをコードするＤＮＡ分子の分離および特定
分子手順を、Ａｕｓｕｂｅｌ等（１９９２．Ｓｈｏｒｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．、−２ｎｄ．ｅｄ．（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ）、およびＳａｍｂｒｏｏｋ等（１９８９．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ．Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ．Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ、ａｎｄ Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ−２ｎｄ ｅｄ．（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）等の参考文献で入手できる当該技術分野で周知の標準手順に従って行った。
【０１３７】
Ａｃ０５およびＡｃ１５のデータベース探索−２種の新規リガンド依存性イオンチャネル遺伝子、Ａｃ０５およびＡｃ１５を潜在的にコードする部分配列は、拡張Ｓｍｉｔｈ Ｗａｒｅｍａｎのアルゴリズムを用いてショウジョウバエゲノム配列決定プロジェクトにおいて同定された。疑問の配列は、線虫グルタミン酸依存性イオンチャネルａｖｒ−１５ａペプチド配列（取得番号−ＡＪ０００５３８）であり、探索されたＤＮＡデータベースは、公的に入手できるショウジョウバエ高処理能配列であった。この探索は、Ｃｏｍｐｕｇｅｎ Ｂｉｏｃｅｌ ＸＬＰハードウェアサーチエンジン（イスラエル、Ｐｅｔａｃｈ Ｔｉｋｖａ）上で実施された。
【０１３８】
該データベースに入った両配列は、予想イントロンを含有した。０５または１５のいずれかに特異的なプライマーは、該データベース配列に基づいて設計され、合成された。それらは以下のとおりである：
１．ａｃ０５Ｆ１：５’−ＣＴＴＧＣＡＣＡＡＡＧＣＴＧＧＣＧＴＧ−３’［配列番号８］、（ａｃ００７８０５）；
２．ａｃ０５Ｆ２：５’−ＧＴＧＡＧＣＡＧＴＡＴＣＧＣＡＴＡＴＴＧ−３’［配列番号９］、（ａｃ００７８０５）；
３．ａｃ０５Ｒ１：５’−ＧＴＡＧＴＴＡＴＴＴＧＡＴＡＴＧＴＣＴＡＧＣ−３’［配列番号１０］、（ａｃ００７８０５）；
４．ａｃ０５Ｒ２：５’−ＡＣＣＴＧＴＴＧＡＧＴＡＣＴＣＴＡＴＡＧ−３’［配列番号１１］、（ａｃ００７８０５）；
５．ａｃ１５Ｆ１ ５’−ＴＴＴＧＣＡＣＡＧＡＣＧＴＧＧＡＡＧＧ−３’［配列番号１２］、（ａｃ００７８１５）；
６．ａｃ１５Ｆ２ ５’−ＡＣＡＧＧＡＡＴＡＣＣＧＣＣＴＧＣＴＣ−３’［配列番号１３］、（ａｃ００７８１５）；および
７．ａｃ１５Ｒ１ ５’−ＴＴＣＡＴＴＴＣＧＧＡＴＧＡＧＧＧＣＣＡＣ−３’［配列番号１４］、（ａｃ００７８１５）。
これらプライマーを組合せて、ハエ全体の全ＲＮＡ上のＲＴ−ＰＣＲ、次いでＴＡクローン化を、両遺伝子に関して実施した。Ａｃ０５とＡｃ１５の双方について凡そ５００ｂｐの断片を単離し、配列決定により確かめた。
【０１３９】
Ａｃ０５とＡｃ１５に対する５’および３’ＲＡＣＥ−Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ）のＭａｒａｔｈｏｎ（登録商標）ｃＤＮＡ増幅キットを、両５’−および３’−ＲＡＣＥ反応の主要手段として用いた。ポリＡ^＋ＲＮＡを、Ｏｌｉｇｏｔｅｘ（登録商標）ｍＲＮＡ Ｍｉｄｉキット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒｉｔａ、ＣＡ）によりＯｒｅｇｏｎ Ｒ Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ全体から精製し、製造元のプロトコルに従って２本鎖ｃＤＮＡを生成するために使用した。以下のプライマー類をＲＡＣＥ反応に用いた：
３’−ＲＡＣＥ ｆｏｒｗａｒｄプライマー類：
Ａｃ０５：
１．Ａｃ０５ＧＳＰＦ１−５’−ＣＡＴＣＴＴＣＣＴＴＧＣＡＣＡＡＡＧＣＴＧＧＣＧＴＧ−３’［配列番号１５］、（ａｃ００７８０５）；
２．Ａｃ０５ＮＧＳＰＦ２−５’−ＣＡＴＧＡＧＴＧＡＧＣＡＧＴＡＴＣＧＣＡＴＡＴＴＧ−３’［配列番号１６］、（ａｃ００７８０５）；
Ａｃ１５：
１．Ａｃ１５ＧＳＰＦ１−５’−ＴＧＴＧＴＴＣＴＴＴＧＣＡＣＡＧＡＣＧＴＧＧＡＡＧＧ−３’［配列番号１７］（ａｃ００７８１５）；
２．Ａｃ１５ＮＧＳＰＦ２ ５’−ＴＡＴＧＡＣＡＣＡＧＧＡＴＡＣＣＧＣＣＴＧＣＴＣ−３’［配列番号１８］、（ａｃ００７８１５）；
Ａｃ０５：
１．Ａｃ０５ＧＳＰＲ１：５’−ＧＴＣＴＡＧＣＴＧＣＧＧＣＡＡＣＴＣＡＡＴＣＴＣＣＧＴＧ−３’［配列番号１９］、（ａｃ００７８０５）；
２．Ａｃ０５ＧＳＰＲ２：５’−ＣＴＣＧＡＴＣＡＴＧＧＡＧＣＡＧＡＴＴＴＧＣＧＴＧ−３’［配列番号２０］、（ａｃ００７８０５）；
Ａｃ１５：
１．Ａｃ１５ＧＳＰＲ１：５’−ＣＧＣＣＧＴＴＴＣＡＴＴＴＣＧＧＡＴＧＡＧＧＧＣＣＡＣ−３’［配列番号２１］（ａｃ００７８１５ ８４９５８ｂｐ−８４９８４ｂｐ）；
２．Ａｃ１５ＮＧＳＰＲ２：５’−ＣＡＧＧＣＴＴＴＣＣＡＴＴＴＧＣＡＧＣＴＴＣＴＣＣ−３’［配列番号２２］、（ａｃ００７８１５）。このプライマーはスプライス接合に架かり、この連続配列の存在は、上記Ａｃ１５断片の配列データからのみ利用できた。
【０１４０】
５’および３’ＲＡＣＥ断片は、第１ラウンドのＰＣＲにより双方の遺伝子に関して得られ、Ｍａｒａｔｈｏｎ（登録商標）キットのプロトコルに基づき５’ＲＡＣＥ ＰＣＲサイクルを変更させて、すなわち９４℃で１分の１サイクル；９４℃で１分および７２℃で４分の５サイクル；および９４℃で１分、６８℃で１分および７２℃で３分の２５サイクルによりＰＣＲを重ね合わせた。生じた断片の大きさは、３’−ＲＡＣＥにおいてＡｃ０５では約１．３ｋｂ、Ａｃ１５では約１．８ｋｂであった。５’−ＲＡＣＥにおいて、Ａｃ０５およびＡｃ１５の両者は約１ｋｂの断片サイズを有する。該ＰＣＲ産物を、ＴＯＰＯ（登録商標）ＴＡクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌａｂａｄ、ＣＡ）を用いてｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯベクターにクローン化した。ＭｉｎｉｐｒｅｐＤＮＡサンプルを制限消化によりスクリーンして未スプライシングクローンからスプライシングクローンを分離した。３’末端については、Ａｃ０５およびＡｃ１５の６個および８個のサンプルをそれぞれ配列決定した。５’末端については、Ａｃ０５およびＡｃ１５の５個および８個のサンプルを配列決定した。
【０１４１】
完全長クローンの生成−５’および３’ＲＡＣＥ産物から得られた配列を用いて、両遺伝子に対するＰＣＲプライマーを、完全長クローンを生成するために設計した。Ａｃ０５およびＡｃ１５の双方に関する正方向プライマーと逆方向プライマーを以下のとおり設計した：
Ａｃ０５ＦｕｌｌＦ１：５’−ＣＡＡＴＣＧＴＣＧＣＧＡＴＡＡＣＴＣＴＧＣＣＧ−３’［配列番号２３］；Ａｃ０５ＦｕｌｌＲ１：５’−ＣＣＴＴＴＡＴＴＴＡＴＡＣＡＣＴＡＣＡＴＧＧＴＡＡＴＣ−３’［配列番号２４］；Ａｃ０５ＦｕｌｌＲ２：５’−ＴＧＴＴＴＡＣＧＣＴＣＴＡＴＴＣＣＴＴＣＧＧＡＧ−３’［配列番号２５］；Ａｃ１５ＦｕｌｌＦ１：５’−ＡＡＣＴＧＣＣＡＡＧＡＣＧＴＴＴＡＧＡＡＣＧＧ−３’［配列番号２６］；Ａｃ１５ＦｕｌｌＦ２：５’−ＣＧＡＧＴＡＡＡＣＴＧＴＴＡＡＡＴＧＣＴＧＡＡＧＴＧ−３’［配列番号２７］；Ａｃ１５ＦｕｌｌＲ２：５’−ＴＡＣＡＡＴＴＣＡＣＴＴＡＧＧＣＴＡＣＡＴＣＡＧＣ−３’［配列番号２８］；およびＡｃ１５ＦｕｌｌＲ２：５’−ＧＧＣＴＡＣＡＴＣＡＧＣＴＡＣＴＡＣＧＴＣＡＣ−３’［配列番号２９］。
【０１４２】
Ａｄｖａｎｔａｇｅ（登録商標）２ＰＣＲキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ）を、第１および第２ラウンドのＰＣＲに用いた。ｃＤＮＡクローンのＡｃ０５−１０およびＡｃ０５−１１を、第１ラウンドＰＣＲではプライマーＡｃ０５Ｆ１およびＲ１、第２ラウンドＰＣＲではプライマーＡｃ０５Ｆ１およびＲ２を用いて生成した。ｃＤＮＡクローンのＡｃ１５−４およびＡｃ１５−２５を、第１ラウンドＰＣＲに対してプライマーＡｃ１５Ｆ１およびＲ１を用いて生成した。第１ラウンドＰＣＲの条件は以下のとおりであった：９４℃で２分の１サイクル；９４℃で３０秒および７２℃で２分３０秒の５サイクル；および９４℃で３０秒、６８℃で１分および７２℃で１分３０秒の２５サイクル；および７２℃で５分の１サイクル。第２ラウンドのＰＣＲでは、プライマーＡｃ１５Ｆ１およびＲ２が、クローンＡｃ１５−４に用いられ、プライマーＡｃ１５Ｆ２およびＲ１は、クローンＡｃ１５−２５に用いられた。２μｌの第１ＰＣＲ産物を、５０μｌの全反応容量におけるテンプレートとして用いた。第２ラウンドのＰＣＲ条件は、以下のとおりであった：９４℃で２分の１サイクル；９４℃で３０秒、６８℃で１分および７２℃で１分３０秒の５サイクル；９４℃で３０秒、６５℃で１分および７２℃で１分３０秒の５サイクル；９４℃で３０秒、６０℃で１分および７２℃で１分３０秒の２０サイクル；および７２℃で５分の１サイクル。Ａｃ０５には１本の主要バンドの〜１．５ｋｂが、Ａｃ１５には〜２ｋｂが単離された。該ＰＣＲ産物を、ＴＯＰＯ（登録商標）ＴＡクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎｅ、Ｃａｒｌａｂａｄ、ＣＡ）を用いてｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯベクターにクローン化した。
【０１４３】
Ａｃ０５の２種のクローンは、Ａｃ０５−１０（１５１８ｂｐ）およびＡｃ０５−１１（１５０６ｂｐ）として同定された。これらのクローンは、Ａｃ０５−１０においてＭ３−Ｍ４細胞内ループ内の４個のアミノ酸挿入を除いては同一である。Ａｃ１５の２種のクローンは、Ａｃ１５−４（２０７３ｂｐ）およびＡｃ１５−２５（２０３４ｂｐ）として同定され、これらは１６個のヌクレオチドが異なること以外同一のタンパク質配列であると予想される。
【０１４４】
転写キャップ化ＲＮＡのインビトロ合成−クローンＡｃ０５−１０、Ａｃ０５−１１およびＡｃ１５−４、Ａｃ１５−２５の読み取り枠（ＯＲＦ）開始メチオニン（ＡＴＧ）の上流にあるＴ７プロモーターおよび終止コドン（Ａｃ０５およびＡｃ１５ではＴＧＡおよびＴＡＡ）に続くポリＡ^＋テールの双方を加えるためにＰＣＲ法を用いた。使用したプライマーは、
Ａｃ０５：
Ａｃ０５Ｔ７：５’−ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＧＧＴＧＴＴＣＡＴＡＡＴＧＣＡＡＡＧＣＣ−３’［配列番号３０］；およびＡｃ０５ｄＴ、５’−ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＣＡＴＡＧＧＡＡＣＧＴＴＧＴＣＣＡＡＴＡＧＡＣ−３’［配列番号３１］
Ａｃ１５：
ＡＣ１５Ｔ７：５’−ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＧＣＡＣＡＴＴＡＡＡＡＴＧＧＴＧＴＴＣ−３’［配列番号３２］；およびＡＣ１５ｄＴ：５’−ＴＴＴ ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＣＣＴＴＡＴＡＧＡＴＡＣＴＣＧＴＡＧＡＡＣ−３’［配列番号３３］。
Ｔ７プロモーターおよびポリＡ^＋テールの両方を含んだ増幅ＯＲＦｓを、ＱｕｉａｑｕｉｃｋＰＣＲ精製キット（Ｑｕｉａｇｅｎ、ドイツ）を用いて精製し、製造元のプロトコルに従ってインビトロ転写反応（ｍＭｅｓｓａｇｅ ｍＭａｃｈｉｎｅ（商標）、Ａｍｂｉｏｎ、Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ）のテンプレートとして直接用いた。ＤＮＡテンプレートの除去後、ＲＮＡをフェノール／ＣＨＣｌ_３で抽出し、ＬｉＣｌで沈殿させ、０．５μｇ／μｌの保存濃度でヌクレアーゼの無い水に再度懸濁した。
【０１４５】
実施例２
アフリカツメガエル卵母細胞におけるＤｍＬＧＩＣｓクローンの機能性発現
選択されたＲＴ−ＰＣＲ配列に対応する完全長ｃＤＮＡクローンを、インビトロ転写ＲＮＡ合成（Ａｍｂｉｏｎ Ｉｎｃ．）の鋳型として用いた。キャップ化ｃＲＮＡ転写体を、適当なオリゴヌクレオチドプライマーおよびＡｍｂｉｏｎのｍＭｅｓｓａｇｅ ｍＭａｃｈｉｎｅインビトロＲＮＡ転写キットを用いて合成した。Ｘｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓ卵母細胞を調製し、記載の標準的方法（Ａｒｅｎａ ｅｔ ａｌ．、１９９１、Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４０：３６８〜３７４；Ａｒｅｎａ ｅｔ ａｌ．、１９９２、Ｍｏｌ．Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．１５：３３９〜３４８）を用いて注入した。成体雌Ｘｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓを０．１７％トリカインメタンスルホン酸で麻酔し、その卵巣を外科的に取り出し、次の成分（ｍＭ）からなるディッシュに入れた：ＮａＣｌ ８２．５、ＫＣｌ ２、ＭｇＣｌ_２ １、ＣａＣｌ_２ １．８、ＨＥＰＥＳ ５、ＮａＯＨでｐＨ７．５に調整（ＯＲ−２）。卵巣葉を開き破り、数回濯ぎ、０．２％コラゲナーゼ（Ｓｉｇｍａ、１Ａ型）を含有するＯＲ−２中で２〜５時間軽く振とうした。約５０％の卵胞層を取り出して、Ｖ期およびＶＩ期の卵母細胞を選択し、次の成分（ｍＭ）を含んだ媒体中に入れてから２４〜４８時間後注入した：ＮａＣｌ ８６、ＫＣｌ ２、ＭｇＣｌ_２ １、ＣａＣｌ_２ １．８、ＨＥＰＥＳ ５、ピルビン酸ナトリウム ２．５、テオフィリン ０．５、ゲンタマイシン ０．１、ＮａＯＨでｐＨ７．５に調整（ＮＤ−９６）。ほとんどの実験では、５０ｎｌのＲＮａｓｅの無い水中、１０ｎｇのｃＲＮＡを卵母細胞に注入した。対照卵母細胞には、５０ｎｌの水を注入した。卵母細胞を、５０ｍｇ／ｍｌゲンタマイシン、２．５ｍＭピルビン酸ナトリウムおよび０．５ｍＭテオフィリンで補足されたＮＤ−９６中、１〜５日間インキュベートした後、記録をとった。インキュベーションおよびコラゲナーゼ消化は１８℃で実施した。
【０１４６】
電位固定試験を、Ｄａｇａｎ ＣＡ１増幅器（Ｄａｇａｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）を用いて二微小電極電位固定法により実施した。電流通過微小電極は０．７Ｍ ＫＣｌプラス１．７Ｍ クエン酸Ｋ_３で満たし、電位記録微小電極は１．０Ｍ ＫＣｌで満たした。たいていの実験での細胞外溶液は、次の成分（ｍＭ）からなる生理食塩水であった：ＮａＣｌ ９６、ＢａＣｌ_２ ３．５、ＭｇＣｌ_２ ０．５、ＣａＣｌ_２ ０．１、ＨＥＰＥＳ ５、ＮａＯＨでｐＨ７．５に調整。細胞外塩化物濃度を、ＮａＣｌを指定されたアニオンのナトリウム塩と等モル交換することにより減じた。実験は２１℃〜２４℃で実施した。データは、パルスプログラムを用いて獲得し、ほとんどの分析を、コンパニオンプログラムＰｕｌｓｅｆｉｔ（Ｉｎｓｔｒｕｔｅｃｈ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｇｒｅａｔ Ｎｅｃｋ、ＮＹ）またはＩｇｏｒ Ｐｒｏ（Ｗａｖｅｍｅｔｒｉｃｓ、Ｌａｋｅ Ｏｓｗｅｇｏ、ＯＲ）により実施した。他に指定しない限り、データは１ｋＨｚで濾波した（ｆ_ｃ、−３ｄｂ）。図８は、クローンＤｍＬＧＩＣ ＡＣ０５クローンをアフリカツメガエル卵母細胞において発現させた実験結果を示す。測定は、二微小電極電位固定法により本実施例に記載されたとおり行い、膜電位は０ｍＶに保持された。最上部の棒線は、ヒスタミン適用の持続時間を示す。これにより、このタンパク質の発現が、ヒスタミン添加に応答する機能性イオンチャネルを再構築することが示される。
【０１４７】
アフリカツメガエル卵母細胞におけるＡＣ１５クローンの発現はまた、ＡＣ０５と共にヒスタミン添加に応答する機能性単独チャネルタンパク質を形成する。
【０１４８】
実施例３
哺乳動物細胞におけるＤｍＬＧＩＣクローンの機能性発現
ＤｍＬＧＩＣを哺乳動物発現ベクター中にサブクローニングし、選択した哺乳動物細胞にトランスフェクトするために使用することができる。Ｇ４１８の存在下での増殖によって、安定な細胞クローンを選択する。Ｇ４１８耐性単一種クローンを分離し、無傷のＤｍＬＧＩＣ遺伝子の存在を確認するために試験をする。次いで、ＤｍＬＧＩＣを含んだクローンを、ＤｍＬＧＩＣタンパク質特異抗体を用いた免疫沈降、ウェスタンブロット、免疫蛍光等の免疫学的技法を用いて、発現について分析した。抗体は、ＤｍＬＧＩＣ配列から予測されるアミノ酸配列から合成したペプチドを接種したウサギから得られる。パッチクランプ電気生理学法および陰イオンフラックスアッセイによっても、発現は分析される。
【０１４９】
活性なチャネルタンパク質の発現を試験するために、ＤｍＬＧＩＣを安定に、または一時的に発現している細胞が使用される。これらの細胞は、各チャネルを調節、阻害または活性化する他の化合物の能力を確認し、調べるために、使用される。
【０１５０】
プロモーターに対してポジティブな方位にＤｍＬＧＩＣ ｃＤＮＡを含むカセットは、プロモーターの３’に対して適当な制限部位中に連結され、制限部位地図作製および／または配列決定によって確認される。これらのｃＤＮＡ発現ベクターを、繊維芽細胞性宿主細胞、例えば、ＣＯＳ−７（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ１６５１）、およびＣＶ−１ｔａｔ（Ｓａｃｋｅｖｉｔｚ ｅｔ ａｌ．、１９８７，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３８：１５７５）、２９３、Ｌ（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ６３６２）中に、エレクトロポレーションまたは化学的手順（陽イオンリポソーム、ＤＥＡＥデキストラン、リン酸カルシウム）を含むが、それらに限らず標準的方法で導入してもよい。トランスフェクトした細胞および細胞培養液上清を収穫し、本明細書に記載のＤｍＬＧＩＣ発現の分析をすることができる。
【０１５１】
哺乳動物細胞での一時的発現に使用するベクターは全て、ＤｍＬＧＩＣを発現する安定な細胞系を樹立するために使用することができる。発現ベクター中にクローニングされた未修飾のＤｍＬＧＩＣ ｃＤＮＡ構築体は、宿主細胞がＤｍＬＧＩＣタンパク質を産生するようにプログラムすると予想される。その上、分泌タンパク質のシグナル配列をコードするＤＮＡにＤｍＬＧＩＣ ｃＤＮＡ構築体を連結することによって、ＤｍＬＧＩＣは分泌タンパク質として細胞外で発現する。トランスフェクション宿主細胞は、ＣＶ−１−Ｐ（Ｓａｃｋｅｖｉｔｚ ｅｔ ａｌ．、１９８７，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３８：１５７５）、ｔｋ−Ｌ（Ｗｉｇｌｅｒ，ｅｔ ａｌ．、１９７７，Ｃｅｌｌ １１：２２３）、ＮＳ／０およびｄＨＦｒ−ＣＨＯ（Ｋａｕｆｍａｎ ａｎｄ Ｓｈａｒｐ，１９８２，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５９：６０１）を含むが、それらに限らない。
【０１５２】
Ｇ４１８、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ；ハイグロマイシン、ハイグロマイシン−Ｂ ホスホトランスフェラーゼ；ＡＰＲＴ、キサンチン−グァニン ホスホリボシルトランスフェラーゼを含むが、それらに限らない薬物選択プラスミドによる、ＤｍＬＧＩＣ ｃＤＮＡを含んだベクターの同時トランスフェクションは、安定にトランスフェクトされるクローンの選択を可能にすると思われる。ＤｍＬＧＩＣのレベルは、本明細書に記載の試験によって定量化される。可能な限り多量のＤｍＬＧＩＣを合成する哺乳細胞クローンを作製するために、ＤｍＬＧＩＣ ｃＤＮＡ構築体を、増幅可能な薬物耐性マーカーを含んだベクター中に連結してもよい。これらの構築体を細胞に導入後、プラスミドを含むクローンを適当な作用剤で選択し、その作用剤の用量増加による選択によって、高コピー数のプラスミドを有する過剰発現クローンの分離が実現する。組換えＤｍＬＧＩＣの発現は、完全長ＤｍＬＧＩＣ ｃＤＮＡの哺乳動物宿主細胞へのトランスフェクションによって実現される。
【０１５３】
実施例４
昆虫細胞中での発現を目的とした、バキュロウィルス発現ベクター中へのＤｍＬＧＩＣ ｃＤＮＡのクローニング
ＡｃＮＰＶウィルスのゲノム由来のバキュロウィルスベクターを、昆虫細胞のＳｆ９系（ＡＴＣＣ ＣＲＬ＃１７１１）内で高水準のｃＤＮＡ発現量をもたらすように設計する。ＤｍＬＧＩＣ ｃＤＮＡを発現する組換えバキュロウィルスは、次の標準的方法（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ Ｍａｘｂａｃマニュアル）によって作製される。ＤｍＬＧＩＣ ｃＤＮＡ構築体を、ｐＡＣ３６０およびＢｌｕｅＢａｃベクター（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ）を含む多様なバキュロウィルス移入ベクター中のポリヘドリン遺伝子中に連結する。組換えバキュロウィルスは、バキュロウィルス移入ベクターおよび線状化ＡｃＮＰＶゲノムＤＮＡ（Ｋｉｔｔｓ，１９９０，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．１８：５６６７）の、Ｓｆ９細胞中への同時トランスフェクション後に起こる相同的組換えによって作製される。組換えｐＡＣ３６０ウィルスは、感染細胞中に封入体がないことによって確認され、組換えｐＢｌｕｅＢａｃウィルスは、ｂ−ガラクトシダーゼの発現に基いて確認される（Ｓｕｍｍｅｒｓ，Ｍ．Ｄ．ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ，Ｇ．Ｅ．，Ｔｅｘａｓ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ Ｅｘｐ．Ｓｔａｔｉｏｎ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ Ｎｏ．１５５５）。プラークの精製後、本明細書に記載の試験によってＤｍＬＧＩＣ発現を測定する。
【０１５４】
ＤｍＬＧＩＣに対する読み取り枠全体をコードするｃＤＮＡを、ｐＢｌｕｅＢａｃＩＩのＢａｍＨＩ部位中に挿入する。ポジティブ方位の構築体を配列分析で確認し、線状ＡｃＮＰＶのマイルドタイプＤＮＡの存在下、Ｓｆ９細胞にトランスフェクトするために使用する。
【０１５５】
真正の活性ＤｍＬＧＩＣは、感染細胞の細胞質に見出される。活性ＤｍＬＧＩＣは、低張性または界面活性剤による溶菌により感染細胞から抽出される。
【０１５６】
実施例５
酵母発現ベクター中へのＤｍＬＧＩＣ ｃＤＮＡのクローニング
異種タンパク質の細胞内または細胞外発現を指示するように設計した発現ベクター中に、最適なＤｍＬＧＩＣ ｃＤＮＡシストロンを挿入した後、組換えＤｍＬＧＩＣが酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ中に産生される。細胞内発現の場合には、ＥｍＢＬｙｅｘ４やその類似体等のベクターをＤｍＬＧＩＣシストロンに連結する（Ｒｉｎａｓ，ｅｔ ａｌ．、１９９０，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８：５４３〜５４５；Ｈｏｒｏｗｉｔｚ Ｂ．ｅｔ ａｌ．、１９８９，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：４１８９〜４１９２）。細胞外発現の場合は、分泌シグナル（酵母または哺乳動物ペプチド）をＤｍＬＧＩＣタンパク質のＮＨ_２末端に融合する酵母発現ベクター中に、ＤｍＬＧＩＣシストロンを連結する（Ｊａｃｏｂｓｅｎ，１９８９，Ｇｅｎｅ ８５：５１１〜５１６；Ｒｉｅｔｔ ａｎｄ Ｂｅｌｌｏｎ，１９８９，Ｂｉｏｃｈｅｍ．２８：２９４１〜２９４９）。
【０１５７】
これらのベクターは、ヒト血清アルブミンシグナルを発現するｃＤＮＡに融合するｐＡＶＥ１−６（Ｓｔｅｅｐ，１９９０，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８：４２〜４６）、およびヒトリゾチームシグナルを発現するｃＤＮＡに融合するベクターｐＬ８ＰＬ（Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．２８：２７２８〜２７３２）を含むが、それらに限らない。その上、ベクターｐＶＥＰを利用して、ＤｍＬＧＩＣはユビキチンと複合した融合タンパク質として酵母中に発現する（Ｅｃｋｅｒ，１９８９，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：７７１５〜７７１９；Ｓａｂｉｎ，１９８９，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７：７０５〜７０９；ＭｃＤｏｎｎｅｌｌ，１９８９，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．９：５５１７〜５５２３（１９８９））。ＤｍＬＧＩＣの発現量は、本明細書に記載の試験によって決定される。
【０１５８】
実施例６
組換えＤｍＬＧＩＣの精製
抗体アフィニティークロマトグラフィによって、組換え産生ＤｍＬＧＩＣを精製し得る。ＤｍＬＧＩＣ抗体アフィニティーカラムは、抗ＤｍＬＧＩＣ ＧｌｕＣｌ抗体がアガロースゲルビーズ支持体と共有結合を形成するように、Ｎ−ヒドロキシスクシニミドエステルで予備活性化したゲル支持体のＡｆｆｉｇｅｌ−１０（Ｂｉｏｒａｄ）に、その抗体を添加することによって作製される。次いで、スペーサーアームを有するアミド結合を介して、抗体をゲルに連結する。次いで、残っている活性化エステルを１Ｍ エタノールアミンＨＣｌ（ｐＨ８）で消失させる。そのカラムを水、次いで０．２３Ｍ グリシンＨＣｌ（ｐＨ２．６）で洗浄することによって、非複合抗体や異物タンパク質を除去する。次いで、洗剤等の適当な膜溶解剤と共に、カラムをリン酸緩衝塩水（ｐＨ７．３）中で平衡化し、可溶化ＤｍＬＧＩＣを含む細胞培養液上清または細胞抽出液を、ゆっくりとカラム中に通過させる。次いで、光学密度（Ａ２８０）がバックグランド値に下がるまで、カラムを洗剤と共にリン酸緩衝塩水で洗浄し、次にタンパク質を洗剤と共に０．２３Ｍ グリシンＨＣｌ（ｐＨ２．６）で溶出する。次いで、精製ＤｍＬＧＩＣタンパク質をリン酸緩衝塩水に対して透析する。
【０１５９】
実施例７
組換え型ＤｍＬＧＩＣの精製
ショウジョウバエゲノム配列決定プロジェクトに従って、Ａｃ００７８１５［Ａｃ１５］並びにＡｃ００７８０５［Ａｃ０５］は染色体ＩＩＩに対して、具体的にはＡｃ１５はＣｈＩＩＩ９２Ｂに対して、またＡｃ０５はＣｈＩＩＩ８７Ｂに対して地図化される。Ａｃ１５で行われるとおり、ＤｒｏｓＧｌｕＣｌａｌｐｈａ１（ｇｌｃ−１）はＣｈＩＩＩ９２Ｂに対して地図化される。Ｏ’Ｔｏｕｓａら（１９８９、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｇｅｎｅｔｉｃｓ ６：４１〜５２）は、光受容体変異をショウジョウバエゲノムのＣｈＩＩＩ９２Ｂ領域に対し地図化している。さらに、Ｓｔｕａｒｔ（１９９９、Ｎｅｕｒｏｎ２２：４３１〜４３３）は、ヒスタミンが無脊椎動物の潜在的網膜神経伝達物質であることを特記している。したがって、Ａｃ１５の染色体位置と組み合わせてここの実施例２節で生じたデータは、ここで開示されたＬＧＩＣがヒスタミンに応答して少なくとも部分的に有効であることを示唆している。
【図面の簡単な説明】
【図１】 配列番号１に示した、ショウジョウバエＬＧＩＣクローン、ＡＣ０５−１０のヌクレオチド配列を示す図である。
【図２】 配列番号２に示した、ショウジョウバエＬＧＩＣ ＡＣ０５−１０タンパク質のアミノ酸配列を示す図である。
【図３】 配列番号３に示した、ショウジョウバエＬＧＩＣクローン、ＡＣ０５−１１のヌクレオチド配列を示す図である。
【図４】 配列番号４に示した、ショウジョウバエＬＧＩＣ ＡＣ０５−１１タンパク質のアミノ酸配列を示す図である。
【図５】 配列番号５に示した、ショウジョウバエＬＧＩＣクローン、ＡＣ１５−４のヌクレオチド配列を示す図である。
【図６】 配列番号６に示した、ショウジョウバエＬＧＩＣクローン、ＡＣ１５−２５のヌクレオチド配列を示す図である。
【図７】 配列番号７に示した、ショウジョウバエＬＧＩＣ ＡＣ１５−４／ＡＣ１５−２５タンパク質のアミノ酸配列を示す図である。
【図８】 トランスフェクトしたアフリカツメガエル卵母細胞における、ヒスタミンによる組換えＤｍＬＧＩＣ（ＡＣ０５−１０）の活性化を示す図である。
【配列表】

Claims (41)

1. ショウジョウバエＬＧＩＣタンパク質であって、配列番号２に示すアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする精製された核酸分子。
2. 単離された組換え宿主細胞においてショウジョウバエＬＧＩＣタンパク質を発現する発現ベクターであって、請求項１に記載の核酸分子を含む発現ベクター。
3. 組換えショウジョウバエＬＧＩＣタンパク質を発現する宿主細胞であって、請求項２に記載の発現ベクターを含む単離された宿主細胞。
4. 単離された組換え宿主細胞においてショウジョウバエＬＧＩＣタンパク質を発現する方法であって、
   （ａ）請求項２に記載の発現ベクターを適当な宿主細胞中にトランスフェクトすること、および
   （ｂ）前記発現ベクターから前記ショウジョウバエＬＧＩＣタンパク質の発現を可能にする条件下で段階（ａ）の宿主細胞を培養すること
   を含む方法。
5. ショウジョウバエＬＧＩＣタンパク質をコードし、配列番号１に示すヌクレオチド配列を含む精製された核酸分子。
6. 配列番号１の１９９位ヌクレオチドから１４７９位ヌクレオチドまでを含む請求項５に記載の核酸分子。
7. ショウジョウバエＬＧＩＣタンパク質であって、配列番号４に示すアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする精製された核酸分子。
8. 組換え宿主細胞においてショウジョウバエＬＧＩＣタンパク質を発現する発現ベクターであって、請求項７に記載の核酸分子を含む発現ベクター。
9. 組換えショウジョウバエＬＧＩＣタンパク質を発現する宿主細胞であって、請求項８に記載の発現ベクターを含む単離された宿主細胞。
10. 単離された組換え宿主細胞においてショウジョウバエＬＧＩＣタンパク質を発現する方法であって、
    （ａ）請求項８に記載の発現ベクターを適当な宿主細胞中にトランスフェクトすること、および
    （ｂ）前記発現ベクターから前記ショウジョウバエＬＧＩＣタンパク質の発現を可能にする条件下で段階（ａ）の宿主細胞を培養すること
    を含む方法。
11. ショウジョウバエＬＧＩＣタンパク質をコードし、配列番号３に示すヌクレオチド配列を含む精製された核酸分子。
12. 配列番号３の１９９位ヌクレオチドから１４６７位ヌクレオチドまでを含む請求項１１に記載の核酸分子。
13. ショウジョウバエＬＧＩＣタンパク質であって、配列番号７に示すアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする精製された核酸分子。
14. 単離された組換え宿主細胞においてショウジョウバエＬＧＩＣタンパク質を発現する発現ベクターであって、請求項１３に記載の核酸分子を含む発現ベクター。
15. 組換えショウジョウバエＬＧＩＣタンパク質を発現する宿主細胞であって、請求項１４に記載の発現ベクターを含む単離された宿主細胞。
16. 単離された組換え宿主細胞においてショウジョウバエＬＧＩＣタンパク質を発現する方法であって、
    （ａ）請求項１４に記載の発現ベクターを適当な宿主細胞中にトランスフェクトすること、および
    （ｂ）前記発現ベクターから前記ショウジョウバエＬＧＩＣタンパク質の発現を可能にする条件下で段階（ａ）の宿主細胞を培養すること
    を含む方法。
17. ショウジョウバエＬＧＩＣタンパク質をコードし、配列番号５および配列番号６に示すヌクレオチド配列からなる群から選択されたヌクレオチド配列を含む精製されたＤＮＡ分子。
18. 配列番号５の３３０位ヌクレオチドから１７８７位ヌクレオチドまでを含む請求項１７に記載のＤＮＡ分子。
19. 配列番号６の２７８位ヌクレオチドから１７３５位ヌクレオチドまでを含む請求項１７に記載のＤＮＡ分子。
20. 他のタンパク質を実質的に含まず、配列番号２に示すアミノ酸配列を含むショウジョウバエＬＧＩＣタンパク質。
21. 単離された組換え宿主細胞内に含まれるＤＮＡ発現ベクターの産物である請求項２０に記載のショウジョウバエＬＧＩＣタンパク質。
22. 請求項２１に記載の組換え宿主細胞から精製されたショウジョウバエＬＧＩＣタンパク質を含む実質的に純粋な膜調整物。
23. 他のタンパク質を実質的に含まず、配列番号４に示すアミノ酸配列を含むショウジョウバエＬＧＩＣタンパク質。
24. 単離された組換え宿主細胞内に含まれるＤＮＡ発現ベクターの産物である請求項２３に記載のショウジョウバエＬＧＩＣタンパク質。
25. 請求項２４に記載の組換え宿主細胞から精製されたショウジョウバエＬＧＩＣタンパク質を含む実質的に純粋な膜調整物。
26. 他のタンパク質を実質的に含まず、配列番号７に示すアミノ酸配列を含むショウジョウバエＬＧＩＣタンパク質。
27. 単離された組換え宿主細胞内に含まれるＤＮＡ発現ベクターの産物である請求項２６に記載のショウジョウバエＬＧＩＣタンパク質。
28. 請求項２７に記載の単離された組換え宿主細胞から精製されたショウジョウバエＬＧＩＣタンパク質を含む実質的に純粋な膜調整物。
29. 配列番号２、配列番号４、および配列番号７に示す各アミノ酸配列からなる群から選択されたアミノ酸配列からなり、他のタンパク質を実質的に含まないショウジョウバエＬＧＩＣタンパク質。
30. 他のタンパク質を実質的に含まず、配列番号２、配列番号４、および配列番号７からなる群から選択されたアミノ酸配列を含むショウジョウバエＬＧＩＣチャネル受容体。
31. 単離された組換え宿主細胞内に含まれるＤＮＡ発現ベクターの産物である請求項３０に記載のショウジョウバエＬＧＩＣタンパク質。
32. 請求項３１に記載の組換え宿主細胞から精製されたショウジョウバエＬＧＩＣチャネルを含む実質的に純粋な膜調整物。
33. ＬＧＩＣタンパク質の作動薬または拮抗薬を同定する方法であって、
    （ａ）標識リガンドを、配列番号２、配列番号４および配列番号７からなる群から選択されたアミノ酸配列を含むショウジョウバエＬＧＩＣタンパク質と試験化合物の存在下で接触させること、および
    （ｂ）標識リガンドのＬＧＩＣタンパク質に対する結合を測定すること
    を含み、試験化合物の存在下での標識リガンドの結合量の試験化合物の非存在下での量との差異が、該試験化合物がＬＧＩＣタンパク質の作動薬または拮抗薬であることを示し、前記標識リガンドがヒスタミンである前記方法。
34. 段階（ａ）のショウジョウバエＬＧＩＣタンパク質が、単離された組換え宿主細胞内に含まれるＤＮＡ発現ベクターの産物である請求項３３に記載の方法。
35. 標識リガンドの結合量が、試験化合物の存在下で減少する、請求項３３に記載の方法。
36. 標識リガンドの結合量が、試験化合物の存在下で増加する、請求項３３に記載の方法。
37. ＬＧＩＣのイオンチャネル活性を調節する化合物を同定する方法であって、
    ａ）配列番号２、配列番号４および配列番号７からなる群から選択されたアミノ酸配列を含むショウジョウバエＬＧＩＣタンパク質を、前記ＬＧＩＣタンパク質の発現によって、活性なヒスタミン依存性チャネルが生じるように、単離された組換え宿主細胞にて発現させること、
    ｂ）前記チャネルを試験化合物と共に培養すること、および
    ｃ）該宿主細胞膜の電位を測定すること
    を含み、該宿主細胞膜の電位における、試験化合物の存在下と試験化合物の非存在下との差異が、該試験化合物がＬＧＩＣのイオンチャネル活性を調節する化合物であることを示す前記方法。
38. 該宿主細胞が、アフリカツメガエル卵母細胞である請求項３７に記載の方法。
39. 該電位の測定が、電位固定技術を含む請求項３７に記載の方法。
40. 該電位の測定が、試験化合物の存在下で膜電流の増加を示す、請求項３７に記載の方法。
41. 該電位の測定が、試験化合物の存在下で膜電流の減少を示す、請求項３７に記載の方法。

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